JP2018118997A - Ｆｏｌｒ１がん治療の有効性を増加させるための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト葉酸受容体１を標的とするがん治療の成功を向上させる方法を提供すること。【解決手段】本方法に有用な試薬を含むキットがさらに提供される。本発明は、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）標的抗がん剤に対し、好都合に応答する傾向がある対象を特定するための方法を提供し、その方法は、対象から得た組織試料において、ＦＯＬＲ１発現を検出することを含む。本発明は、がん治療が有効である可能性を増加させるための方法をも提供し、その方法は、治療有効量のＦＯＬＲ１標的抗がん剤を、対象に投与することを含み、該対象から得た組織試料におけるＦＯＬＲ１発現は増加していることが判明しているものとする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４７１，００７号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする。

発明の分野は、概して、ヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の過剰発現によって特徴付けられるがんの、治療の有効性を増加させることに関する。より具体的には、本発明は、がんに罹患し易い、またはがんと診断された患者の、より有効な治療に関し、そのがんにおいて、腫瘍細胞は、ＦＯＬＲ１拮抗薬（例えば、ＦＯＬＲ１免疫複合体）を用いる遺伝子発現アッセイによって決定されるように、ＦＯＬＲ１を過剰発現している。

がんは、先進国世界における主な死因の一つであり、米国だけで、年間１，０００，０００人以上ががんと診断され、５００，０００人が死亡している。全体的に見て、３人のうち１人を超える人数が、生涯を通じて、ある種のがんを発症すると推定されている。２００種超の、異なる種類のがんが存在し、それらのうち４種、乳房、肺、結腸直腸、および前立腺は、全新患のうちの半分超を占める（非特許文献１）。

葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）は、葉酸受容体αまたは葉酸結合タンパク質としても知られており、細胞の原形質膜上に発現される、Ｎ−グリコシル化タンパク質である。ＦＯＬＲ１は、葉酸に対して、およびいくつかの還元型葉酸誘導体に対して、高い親和性を有する。ＦＯＬＲ１は、生理的な葉酸塩である５−メチルテトラヒドロ葉酸の、細胞内部への輸送を仲介する。

ＦＯＬＲ１は、卵巣がんの大部分において、並びに、多くの、子宮がん、子宮内膜がん、膵がん、腎がん、肺がん、および乳がんにおいて過剰発現されており、一方、正常組織でのＦＯＬＲ１の発現は、腎近位尿細管における上皮細胞の頂端膜、肺の肺胞細胞（alveolar pneumocyte）、膀胱、精巣、脈絡叢、および甲状腺に限定されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。このＦＯＬＲ１発現パターンは、ＦＯＬＲ１を標的としたがん治療のための、望ましい標的となる。
卵巣がんは、典型的には進行期まで無症状であるため、しばしば後期において診断され、現在利用可能な処置、典型的には外科的減量後の化学療法剤、で治療された場合に、予後が不良である（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。従って、卵巣がんに対するより有効な治療への、明らかな、未だ対処されていない、医学的ニーズが存在する。

Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26 Weitman SD, et al., Cancer Res 52: 3396-3401 (1992) Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996) Kalli KR, et al. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008) von Gruenigen V et al., Cancer 112: 2221-2227 (2008) Ayhan A et al., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007) Harry VN et al., Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)

本発明は、腫瘍組織におけるＦＯＬＲ１の発現の動的な範囲（dynamic range）の発見、および、上昇したＦＯＬＲ１発現レベルを有する腫瘍は抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対して感受性がより高いという発見に基づいている。本発明は、治療薬、すなわち、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を、上昇したＦＯＬＲ１発現レベルを有することが判明している患者に投与することによって、治療に対する応答の見込みがより大きな患者の治療を有利に可能にする。

本発明は、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）標的抗がん剤に対し、好都合に応答する傾向がある対象を特定するための方法を提供し、その方法は、対象から得た組織試料において、ＦＯＬＲ１発現を検出することを含む。

本発明は、がん治療が有効である可能性を増加させるための方法をも提供し、その方法は、治療有効量のＦＯＬＲ１標的抗がん剤を、対象に投与することを含み、該対象から得た組織試料におけるＦＯＬＲ１発現は増加していることが判明しているものとする。

本発明は、低用量がん治療の有効性を予測するための方法をも提供し、その方法は、治療有効量のＦＯＬＲ１標的抗がん剤を、対象に投与することを含み、上記対象は試料におけるＦＯＬＲ１発現が増加していることが判明しているものとする。

一実施形態では、本方法は、卵巣癌、非小細胞肺癌（細気管支肺胞上皮癌を含む）、腎癌、および子宮内膜癌を対象としている。

一実施形態では、ＦＯＬＲ１発現の程度および均一性は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、または核酸ハイブリダイゼーションによって検出される。別の実施形態では、ＦＯＬＲ１発現のレベルは、免疫組織化学によって検出される。ＩＨＣの非制限的な例としては、本明細書に記載されるもの等の、様々なレベルのＦＯＬＲ１を識別するＩＨＣ法、および較正（calibrated）ＩＨＣ法が挙げられる。ＦＯＬＲ１発現は、適切な採点法を用いてスコア化することができ、適切な採点法としては、例えば、これに限定はされないが、本明細書に記載のスコア化法が挙げられる。例えば、ＦＯＬＲ１発現は、０、１、２、３、および３＋の染色強度範囲を含み、０が最も低い染色強度レベルであり、３＋が最も高い染色強度レベルである、較正ＩＨＣ法を用いてスコア化することができる。あるいは、または、加えて、ＦＯＬＲ１発現は、局所的（２５％未満の染色細胞）から、不均一（２５〜７５％の染色細胞）、均一（７５％超の染色細胞）にまでわたる染色均一性を含む、較正ＩＨＣ法を用いてスコア化することができ、局所的な染色とは均一性が最も小さな染色であり、均一な染色とは均一性が最も大きな染色である。

更なる実施形態では、試料（例えば、腫瘍組織試料）におけるＦＯＬＲ１発現は、測定されて、一つまたは複数の参照試料に対して比較され、対象の腫瘍、異種移植片腫瘍、または細胞株から得た組織試料におけるＦＯＬＲ１発現は、一つまたは複数の参照試料と比較した場合の発現の程度および均一性に相関する、ＦＯＬＲ１特有のスコアを有する。様々な例において、均一な染色パターンでレベル１、２、３または３＋のＦＯＬＲ１染色強度を有する組織試料または細胞は、ＦＯＬＲ１発現が増加していると見なされ、不均一または局所的な染色パターンでレベル３のＦＯＬＲ１染色強度を有する組織試料または細胞は、ＦＯＬＲ１発現が増加していると見なされる。別の実施形態では、試料におけるＦＯＬＲ１発現は、測定され、一つまたは複数の参照試料と比較されて、同程度の染色レベルが特定される。一実施形態では、参照試料は、予め割り当てられたＩＨＣスコアおよび／または予め決定された細胞あたりの抗原（またはＡＢＣ）数を有し、試料組織の抗原またはＡＢＣ数は、比較に基づいて決定することができる。

一実施形態では、試料（例えば、腫瘍組織試料）中のＦＯＬＲ１発現は、測定され、一つまたは複数の対照試料と比較され、対象の腫瘍、異種移植片腫瘍、または細胞株から得た組織試料におけるＦＯＬＲ１発現は、一つまたは複数の対照試料と比較した場合に発現の程度および均一性に相関性がある、ＦＯＬＲ１特有のスコアを有する。一実施形態では、試料中のＦＯＬＲ１発現は、検出可能なＦＯＬＲ１発現をほとんどまたは全く示さない、陰性対照試料と比較される。別の実施形態では、試料中のＦＯＬＲ１発現は、増加したＦＯＬＲ１発現（レベル１、２、３または３＋）を有する、陽性対照試料と比較される。一部の実施形態では、対照試料としては、限定はされないが、Ｎａｍａｌｗａ、ＳＷ２、ＳＷ６２０、Ｔ４７Ｄ、ＩＧＲＯＶ−１、３００．１９ＦＲ１、ＨｅＬａ、またはＫＢ細胞が挙げられる。特定の実施形態では、対照試料には、葉酸受容体を形質移入された細胞（例えば、３００．１９ＦＲ１）から得られる細胞または細胞ペレットが含まれる。

一実施形態では、ＦＯＬＲ１標的抗がん剤は、ＦＯＬＲ１免疫複合体である。一実施形態では、免疫複合体は、抗ＦＯＬＲ１抗体、リンカー、および細胞毒を含む。

更なる実施形態では、抗ＦＯＬＲ１抗体は、ｈｕＭＯＶ１９である。別の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性のリンカー、およびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群から選択される。別の実施形態では、リンカーは、以下からなる群から選択される：Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノアート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）。別の実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）である。別の実施形態では、細胞毒は、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体またはその薬剤のプロドラッグからなる群から選択される。別の実施形態では、細胞毒はメイタンシノイドである。別の実施形態では、細胞毒は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン、またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシンである。別の実施形態では、細胞毒は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。更なる実施形態では、免疫複合体は、ＨＵＭＯＶ１９抗体、スルホ−ＳＰＤＢ、およびＤＭ４（ＩＭＧＮ８５３）を含む。

本発明は、ＦＯＬＲ１検出試薬、および使用のための説明書を含む、対象におけるＦＯＬＲ１発現を測定するためのキットをも対象としている。一実施形態では、ＦＯＬＲ１検出試薬は、ＦＯＬＲ１結合性のペプチド、タンパク質または分子プローブ（すなわち核酸）を含む。別の実施形態では、ＦＯＬＲ１検出試薬は、抗ＦＯＬＲ１抗体である。別の実施形態では、キットはさらに、抗ＦＯＬＲ１抗体と結合する二次抗体を含む。一実施形態では、抗体は、０．５〜７．５μｇ／ｍｌ、望ましくは０．９〜３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌの濃度で含まれる。様々な実施形態では、抗体は、１．０＋／−０．５μｇ／ｍｌ、１．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、１．９＋／−０．５μｇ／ｍｌ、２．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．０＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌ、または最大４．２μｇ／ｍｌの濃度で含まれる。別の実施形態では、抗体は、濃縮液の状態で、０．９〜３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するための希釈のための説明書と一緒に、含まれる。別の実施形態では、キットはさらに、以下からなる群から選択される検出試薬を含む：酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団。別の実施形態では、検出試薬は、以下からなる群から選択される：ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミン。

キットは、ＦＯＬＲ１発現の検出およびスコア化に関する説明書も含み得る。キットは、対照または参照試料も含み得る。対照または参照試料の非制限的な例としては、組織試料、細胞ペレットまたは細胞が挙げられる。対照または参照試料は、組織培養細胞株（正常または腫瘍）、正常組織（正常対照）または腫瘍組織（陽性対照）試料に由来するものであってもよい。細胞株の例としては、ＳＷ６２０、Ｔ４７Ｄ、ＩＧＲＯＶ−１、ＨＥＬＡ、ＫＢ、ＪＥＧ−３およびＦＯＬＲ１を発現する発現ベクターを安定に、または一過性に形質移入された細胞株（例えば、３００．１９ＦＲ１）が挙げられる。ＦＯＬＲ１発現検出法において正常参照組織として使用することができる組織の例は、本明細書に記載されており、例えば、正常な肺、唾液腺、および膵臓が挙げられる。

本発明は、抗ＦＯＬＲ１抗体、または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いがんを特定するための方法をも対象としており、その方法は、（ａ） 上記がんから得た細胞を含む生物試料を、細胞表面上のＦＯＬＲ１タンパク質と結合する薬剤と接触させることと、（ｂ） （ａ）の前記生物試料の細胞表面上のＦＯＬＲ１タンパク質と結合する上記薬剤の結合を検出することと、（ｃ） ステップ（ｂ）の上記結合に対しスコアを割り当てることであって、上記スコアは一つまたは複数の参照試料との比較に基づいて割り当てられる、スコアを割り当てることと（ｄ） ステップ（ｃ）における上記スコアを、参照組織または参照細胞のスコアと比較すること、とを含み、ＦＯＬＲ１を正常発現もしくは低発現する参照試料のスコアよりも大きな、上記がんのＦＯＬＲ１レベルのスコア、またはＦＯＬＲ１を高発現する参照試料のスコアと等しい、もしくはそれよりも大きな上記がんのＦＯＬＲ１レベルのスコアによって、上記がんは、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いとみなされる。ある実施形態では、がんは卵巣がんまたは肺がんである。

本発明は、腫瘍を、抗ＦＯＬＲ１抗体、または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に感受性であるものと特定する方法をも対象とし、上記方法は、（ａ） 上記腫瘍から得られた腫瘍組織試料におけるＦＯＬＲ１発現のレベルを測定することであって、上記測定は、一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１発現がん試料における染色強度または染色均一性を識別する検出法の使用を含む、測定することと、（ｂ） 上記腫瘍組織試料のＦＯＬＲ１染色強度スコアを決定することと、（ｃ） ステップ（ｂ）において決定されたＦＯＬＲ１染色強度スコアを、少なくとも１つの参照試料におけるＦＯＬＲ１タンパク質発現を測定することにより決定される相対値と比較すること、とを含み、上記少なくとも１つの参照試料は、抗ＦＯＬＲ１抗体、または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いた治療に対し感受性でない組織、細胞、または細胞ペレット試料であり、上記相対値よりも高い、ステップ（ｂ）において決定された上記試料のＦＯＬＲ１染色強度スコアによって、上記腫瘍は、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対し感受性であるものと見なされる。ある実施形態では、検出法は、手動で、または自動化された系を用いて、実行される。一実施形態では、検出法はＩＨＣである。別の実施形態では、ＩＨＣは、レベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる、較正ＩＨＣである。

本発明は、肺がんまたは卵巣がんを有する対象に対する、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる最適治療計画を最適化する方法をも対象とし、上記方法は、（ａ） 上記対象から得た上記試料を、細胞表面のＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体と接触させることと、（ｂ） 一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１発現がん試料における染色強度または染色均一性を識別することができる検出法を用いて、（ａ）における上記抗体の、上記試料中の前記細胞表面ＦＯＬＲ１に対する結合を測定すること、および上記試料に染色スコアを割り当てることと、（ｃ） ステップ（ｂ）におけるスコアが、ＦＯＬＲ１を正常発現または低発現する参照試料のスコア未満またはそれに等しい場合は、高用量の抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を投与すること、あるいは、スコアがＦＯＬＲ１を正常発現または低発現する参照試料のスコアよりもより大きい場合は、低用量の抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を投与すること、とを含む。

本発明は、対象から得た腫瘍組織試料におけるがん細胞上の細胞表面ＦＯＬＲ１の発現を検出する方法をも対象とし、上記方法は、（ａ） 腫瘍組織試料を入手することであって、上記がん試料はホルマリン固定され、パラフィン包埋される、入手することと（ｂ） 上記試料を、細胞表面ＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体と接触させることと、（ｃ）一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１発現がん試料における染色強度または染色均一性を識別することができる検出法を用いて、（ｂ）における上記抗体の、上記腫瘍組織試料における上記細胞表面ＦＯＬＲ１への結合を測定することと、（ｄ） 上記腫瘍組織試料における細胞表面ＦＯＬＲ１の染色強度または染色均一性のレベルを、一つまたは複数の参照試料と比較した後に、ＦＯＬＲ１発現スコアを上記ＦＯＬＲ１に割り当てること、とを含む。

本発明は、低用量の抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療計画に応答する可能性が高い、肺がんまたは卵巣がんを有する対象を特定する方法をも対象とし、上記方法は、（ａ） 上記卵巣がんまたは肺がんから得た細胞を含む生物試料を、細胞表面のＦＯＬＲ１タンパク質と結合する薬剤と接触させることと、（ｂ）（ａ）の上記生物試料に対する上記薬剤の結合を検出することと、（ｃ）ステップ（ｂ）の上記結合に対してスコアを割り当てることであって、上記スコアは一つまたは複数の参照試料との比較に基づいて割り当てられる、スコアを割り当てることと（ｄ）ステップ（ｃ）における上記スコアを、参照の組織または細胞のスコアと比較すること、とを含み、ＦＯＬＲ１を正常発現もしくは低発現する参照試料のスコアよりもより大きな、上記卵巣がんもしくは肺がんのＦＯＬＲ１レベルのスコア、またはＦＯＬＲ１を高発現する参照試料のスコアと等しいもしくはそれより大きな、上記卵巣がんもしくは肺がんのＦＯＬＲ１レベルのスコアによって、上記卵巣がんまたは肺がんは、低用量の抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いと見なされる。ある実施形態では、本方法はさらに、治療有効量の、ヒト化した、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を、上記対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
抗葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いるがん治療の有効性を増加させるための方法であって、前記方法は、がんを有する対象に、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を投与することを含み、前記対象から得られたがん試料におけるＦＯＬＲ１遺伝子またはタンパク質の発現増加が、一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度または染色均一性を識別する検出法を用いて検出されている、上記方法。
（項目２）
前記検出法が免疫組織化学（ＩＨＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＩＨＣが、レベルの異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる較正ＩＨＣである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記検出法が、低いＦＯＬＲ１細胞表面発現、中間のＦＯＬＲ１細胞表面発現、または高いＦＯＬＲ１細胞表面発現を有する試料に対して、ある範囲の染色強度をもたらす、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記検出法が、参照試料と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度および染色均一性を識別する、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記がん試料が、免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、１より大きい染色強度スコアを有する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記がん試料が、免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記がん試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料に対する免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記がん試料が、均一であるＦＯＬＲ１発現について、ある染色均一性を有する、項目６〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記がん試料が、ＦＯＬＲ１について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有し、不均一または均一である染色均一性を有する、項目６〜８に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫組織化学が手動で行われる、項目２〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記免疫組織化学が自動化された系を用いて行われる、項目２〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記参照試料が陽性参照試料または陰性参照試料である、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
参照試料が細胞、細胞ペレット、または組織を含む、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記検出法が、細胞表面ＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体を用いてＦＯＬＲ１発現を検出することを含む、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記抗体がｈｕＭｏｖ１９抗体（Ｍ９３４６Ａ）である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体が、酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記抗体の濃度が約０．９〜約３．８μｇ／ｍｌである、項目１５〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体、容器、およびＩＨＣにより測定された２、３、または３＋のレベルでのＦＯＬＲ１の発現によって特徴付けられるがんを治療するのに前記抗体または前記免疫複合体を使用することができることを示す添付文書またはラベル、を含む製品。
（項目２１）
前記ＩＨＣが、レベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる較正ＩＨＣである、項目２０に記載の製品。
（項目２２）
前記がんから得られるがん試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料に対する免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目２０または２１に記載の製品。
（項目２３）
前記がんから得られるがん試料が、ＦＯＬＲ１について２、３、または３＋の染色強度スコアを有し、不均一または均一である染色均一性を有する、項目２０〜２２のいずれかに記載の製品。
（項目２４）
免疫組織化学が手動で行われる、項目２０〜２３のいずれかに記載の製品。
（項目２５）
前記免疫組織化学が自動化された系を使用して行われる、項目２０〜２３のいずれかに記載の製品。
（項目２６）
前記ＦＯＬＲ１免疫複合体が抗ＦＯＬＲ１抗体、リンカー、および細胞毒を含む、項目２０〜２５のいずれかに記載の製品。
（項目２７）
前記抗ＦＯＬＲ１抗体がｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）である、項目２６に記載の製品。
（項目２８）
前記リンカーが、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性のリンカー、およびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群から選択される、項目２６または２７に記載の製品。
（項目２９）
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノアート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択される、項目２８に記載の製品。
（項目３０）
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）である、項目２９に記載の製品。
（項目３１）
前記細胞毒が、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体またはその薬剤のプロドラッグからなる群から選択される、項目２６〜３０のいずれか一項に記載の製品。
（項目３２）
前記細胞毒がメイタンシノイドである、項目３１に記載の製品。
（項目３３）
前記細胞毒が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンまたはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシンである、項目３２に記載の製品。
（項目３４）
前記細胞毒が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、項目３３に記載の製品。
（項目３５）
前記免疫複合体が、ｈｕＭｏｖ１９抗体（Ｍ９３４６Ａ）、スルホ−ＳＰＤＢ抗体、およびＤＭ４抗体（ＩＭＧＮ８５３）を含む、項目２６〜３４のいずれかに記載の製品。
（項目３６）
診断用のマウス抗ＦＯＬＲ１抗体、および治療用のヒト化抗ＦＯＬＲ１抗体またはヒト化抗ＦＯＬＲ１抗体を含んでなる抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を含む、診断および医薬品を組み合わせたキット。
（項目３７）
診断用抗体が、ＩＨＣによりＦＯＬＲ１発現を検出することができる、項目３６に記載のキット。
（項目３８）
前記ＩＨＣが、レベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる較正ＩＨＣである、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
前記較正ＩＨＣが、低いＦＯＬＲ１細胞表面発現、中間のＦＯＬＲ１細胞表面発現、または高いＦＯＬＲ１細胞表面発現を有する試料に対して、ある範囲の染色強度をもたらす、項目３８に記載のキット。
（項目４０）
前記較正ＩＨＣが、参照試料と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度および染色均一性を識別する、項目３６〜３９のいずれかに記載のキット。
（項目４１）
一つまたは複数の参照試料をさらに含む、項目３６〜４０のいずれかに記載のキット。
（項目４２）
前記参照試料が陽性参照試料または陰性参照試料である、項目４１に記載のキット。
（項目４３）
前記参照試料が細胞、細胞ペレット、または組織を含む、項目４１または４２に記載のキット。
（項目４４）
前記検出抗体が、酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む、項目３６〜４３のいずれかに記載のキット。
（項目４５）
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される、項目４４に記載のキット。
（項目４６）
前記検出抗体の濃度が約０．９〜約３．８μｇ／ｍｌである、項目３６〜４５のいずれかに記載のキット。
（項目４７）
前記ヒト化抗ＦＯＬＲ１抗体がｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）である、項目３６〜４６のいずれかに記載のキット。
（項目４８）
前記抗ＦＯＬＲ１免疫複合体が、抗ＦＯＬＲ１抗体、リンカー、および細胞毒を含む、項目３６〜４７のいずれかに記載のキット。
（項目４９）
前記抗ＦＯＬＲ１抗体がｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）である、項目４８に記載のキット。
（項目５０）
前記リンカーが、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性のリンカー、およびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群から選択される、項目４８または４９に記載のキット。
（項目５１）
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノアート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択される、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）である、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
前記細胞毒が、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリチアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体またはその薬剤のプロドラッグからなる群から選択される、項目４８〜５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目５４）
前記細胞毒がメイタンシノイドである、項目５３に記載のキット。
（項目５５）
前記細胞毒が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンまたはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシンである、項目５４に記載のキット。
（項目５６）
前記細胞毒が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、項目５５に記載のキット。
（項目５７）
前記免疫複合体が、ｈｕＭｏｖ１９抗体（Ｍ９３４６Ａ）、スルホ−ＳＰＤＢ抗体、およびＤＭ４抗体（ＩＭＧＮ８５３）を含む、項目４８〜５６のいずれかに記載のキット。
（項目５８）
診断用キットであって、細胞表面ＦＯＬＲ１に特異的に結合する抗ＦＯＬＲ１抗体、免疫組織化学のための試薬、および参照のための一つまたは複数の標準対照を含み、前記標準対照が、細胞、細胞ペレット、またはホルマリン固定パラフィン包埋組織試料を含み、前記一つまたは複数の標準対照が、ＦＯＬＲ１非発現、ＦＯＬＲ１低発現、またはＦＯＬＲ１高発現細胞、細胞ペレット、または組織から得られる、上記診断用キット。
（項目５９）
前記ＦＯＬＲ１を低発現する対照が、唾液腺組織、肺組織、ＯＶＣＡＲ３細胞、およびＴ４７Ｄ細胞からなる群から選択される、項目５８に記載のキット。
（項目６０）
前記ＦＯＬＲ１を高発現する対照が、膵臓組織、ＫＢ細胞、ＩＧＲＯＶ１細胞、および葉酸受容体１を安定にまたは一過性に形質移入された細胞株からなる群から選択される、項目５８に記載のキット。
（項目６１）
葉酸受容体１を安定にまたは一過性に形質移入された前記細胞株が３００．１９／ＦＲ１である、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いがんを特定するための方法であって、前記方法は、
（ａ） 前記がんから得られた細胞を含む生物試料を、細胞表面上のＦＯＬＲ１タンパク質と結合する薬剤と接触させることと、
（ｂ） （ａ）の前記生物試料の細胞表面上のＦＯＬＲ１タンパク質と結合する前記薬剤の結合を検出することと、
（ｃ） ステップ（ｂ）の前記結合にスコアを割り当てることであって、前記スコアは一つまたは複数の参照試料との比較に基づいて割り当てられる、スコアを割り当てることと（ｄ） ステップ（ｃ）における前記スコアを、参照の組織または細胞のスコアと比較すること、とを含み、
ＦＯＬＲ１を正常発現もしくは低発現する参照試料に対するスコアよりも大きな、前記がんのＦＯＬＲ１レベルに対するスコア、またはＦＯＬＲ１を高発現する参照試料に対するスコアと等しいもしくはそれより大きな、前記がんのＦＯＬＲ１レベルに対するスコアによって、前記がんが、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いと特定される、上記方法。
（項目６３）
前記がんが卵巣がんまたは肺がんである、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
ある腫瘍が、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対して感受性であることを確認する方法であって、前記方法は、
（ａ） 前記腫瘍から得られた腫瘍組織試料におけるＦＯＬＲ１発現レベルを測定することであって、前記測定が、一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度または染色均一性を識別する検出法の使用を含む、測定することと、
（ｂ） 前記腫瘍組織試料のＦＯＬＲ１染色強度スコアを決定することと、
（ｃ） ステップ（ｂ）で決定されたＦＯＬＲ１染色強度スコアを、少なくとも１つの参照試料におけるＦＯＬＲ１タンパク質発現を測定することによって決定された相対値と比較すること、とを含み、前記少なくとも１つの参照試料は、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対し感受性ではない組織、細胞、または細胞ペレット試料であり、前記相対値よりも高い、ステップ（ｂ）で決定された前記試料のＦＯＬＲ１染色強度スコアによって、前記腫瘍が、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対し感受性であることが確認される、上記方法。
（項目６５）
前記検出法が手動で、または自動化された系を使用して行われる、項目６２〜６４のいずれかに記載の方法。
（項目６６）
前記検出法が自動化されている、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記検出法がＩＨＣである、項目６２〜６６のいずれかに記載の方法。
（項目６８）
前記ＩＨＣが、レベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる較正ＩＨＣである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記検出法が、低いＦＯＬＲ１細胞表面発現、中間のＦＯＬＲ１細胞表面発現、または高いＦＯＬＲ１細胞表面発現を有する試料に対して、ある範囲の染色強度をもたらす、項目６２〜６８のいずれかに記載の方法。
（項目７０）
前記検出法が、参照試料と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度および染色均一性を識別する、項目６２〜６９のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
前記試料が、免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、１よりも大きな染色強度スコアを有する、項目６２〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記試料が、免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料に対する免疫組織化学によるＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記試料が、均一であるＦＯＬＲ１発現の染色均一性を有する、項目６２〜７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
前記試料が、ＦＯＬＲ１について２、３、または３＋の染色強度スコアを有し、不均一または均一である染色均一性を有する、項目６２〜７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
ＦＯＬＲ１発現レベルが、細胞表面ＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体を用いて測定される、項目６２〜７５のいずれかに記載の方法。
（項目７７）
前記抗体がｈｕＭｏｖ１９抗体（Ｍ９３４６Ａ）である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記抗体が、酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む、項目６２〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目７９）
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記抗体の濃度が約０．９〜約３．８μｇ／ｍｌである、項目６２〜７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
肺がんまたは卵巣がんを有する対象に対する、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる最適治療計画を最適化する方法であって、前記方法は、
（ａ） 前記対象から得られた前記試料を、細胞表面ＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体抗体と接触させることと、
（ｂ） 一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度または染色均一性を識別することができる検出法を用いて、（ａ）における前記抗体の、前記試料における前記細胞表面ＦＯＬＲ１に対する結合を測定すること、および前記試料に対して染色スコアを割り当てることと、
（ｃ） ステップ（ｂ）におけるスコアが、ＦＯＬＲ１を正常発現もしくは低発現する参照試料のスコア未満もしくはそれに等しい場合は、高用量の抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を投与すること、または前記スコアがＦＯＬＲ１を正常発現または低発現する参照試料のスコアよりも大きな場合、低用量の抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を投与すること、とを含む、上記方法。
（項目８２）
対象から得られた腫瘍組織試料におけるがん細胞上における細胞表面ＦＯＬＲ１の発現を検出する方法であって、前記方法は、
（ａ） 腫瘍組織試料を得ることであって、前記がん試料をホルマリン固定してパラフィン包埋する、得ることと、
（ｂ） 前記試料を、細胞表面ＦＯＬＲ１と特異的に結合する抗体と接触させることと、（ｃ） ＦＯＬＲ１を発現するがん試料における染色強度または染色均一性を識別することができる検出法を使用し、一つまたは複数の参照試料における染色強度または染色均一性と比較して、前記腫瘍組織試料における前記細胞表面ＦＯＬＲ１に対する、（ｂ）における前記抗体の結合を測定することと、
（ｄ） 前記腫瘍組織試料における細胞表面ＦＯＬＲ１の染色強度または染色均一性のレベルを、一つまたは複数の参照試料に対して比較した後に、前記ＦＯＬＲ１に対してＦＯＬＲ１発現スコアを割り当てること、とを含む、上記方法。
（項目８３）
肺がんまたは卵巣がんを有する対象が、低用量の抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体による治療計画に応答する可能性が高いことを確認する方法であって、前記方法は、
（ａ） 前記卵巣がんまたは肺がんから得られた細胞を含む生物試料を、細胞表面ＦＯＬＲ１タンパク質と結合する薬剤と接触させることと、
（ｂ） （ａ）の前記生物試料に対する、前記薬剤の結合を検出することと、
（ｃ） ステップ（ｂ）の前記結合に対してスコアを割り当てることであって、前記スコアは一つまたは複数の参照試料に対する比較に基づいて割り当てられる、スコアを割り当てることと、
（ｄ） ステップ（ｃ）における前記スコアを、参照の組織または細胞のスコアと比較すること、とを含み、
ＦＯＬＲ１を正常発現もしくは低発現する参照試料に対するスコアよりも大きな、前記卵巣がんもしくは肺がんのＦＯＬＲ１レベルに対するスコア、または、ＦＯＬＲ１を高発現する参照試料に対するスコアと等しいもしくはそれよりも大きな、前記卵巣がんもしくは肺がんのＦＯＬＲ１レベルに対するスコアによって、前記卵巣がんまたは肺がんが、低用量の抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体に応答する可能性が高いと確認される、上記方法。
（項目８４）
前記がんが卵巣がんまたは肺がんである、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記検出法が、低いＦＯＬＲ１発現、中間のＦＯＬＲ１発現、または高いＦＯＬＲ１発現を有する試料に対して、ある範囲の染色強度をもたらす、項目８１〜８４のいずれかに記載の方法。
（項目８６）
前記試料が、ＦＯＬＲ１発現について、２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記試料が、ＦＯＬＲ１発現について、均一な染色均一性を有する、項目８１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目８８）
前記試料が、ＦＯＬＲ１について２、３、または３＋の染色強度スコアを有し、不均一または均一である染色均一性を有する、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記方法が手動で行われる、項目８１〜８８のいずれかに記載の方法。
（項目９０）
前記方法が自動化された系を使用して行われる、項目８１〜８８のいずれかに記載の方法。
（項目９１）
前記参照試料が、陽性参照試料または陰性参照試料である、項目８１〜９０のいずれかに記載の方法。
（項目９２）
前記参照試料が細胞、細胞ペレット、または組織を含む、項目８１〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９３）
前記薬剤または抗体が、酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む、項目８１〜９２のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記薬剤または抗体の濃度が、約０．９〜約３．８μｇ／ｍｌの濃度である、項目８１〜９４のいずれかに記載の方法。
（項目９６）
治療有効量のヒト化抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を、前記対象に投与することをさらに含む、項目８１〜９５のいずれかに記載の方法。

手動による染色法：抗ＦＯＬＲ１抗体は、形質移入細胞におけるＦＯＬＲ１発現を検出する。３００．１９細胞に、ヒトＦＯＬＲ１をコードするポリヌクレオチドを形質移入した。ＦＯＬＲ１タンパク質発現を、マウス抗体ＢＮ３．２を用いて検出した。（Smith AE et al, Hybridoma (Larchmt). 2007 Oct;26(5):281-8） 手動による染色法：抗ＦＯＬＲ１抗体は、レベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる。抗体ＢＮ３．２を用いて、種々の異種移植片細胞におけるＦＯＬＲ１発現を検出した。ＢＮ３．２抗体に対する検出限界は、およそ４０００の、細胞あたりの結合抗体（antibodies bound per cell）（ＡＢＣ）である。 手動による染色法：抗ＦＯＬＲ１抗体は、組織試料におけるレベルが異なるＦＯＬＲ１発現を識別することができる。ＢＮ３．２を用いて、卵巣腫瘍（Ａ）、並びに非小細胞肺がん腫瘍（Ｂ）の両方におけるＦＯＬＲ１発現を検出した。 手動による染色法：卵巣腫瘍およびＮＳＣＬＣ腫瘍における均一なＦＯＬＲ１発現。ＦＯＬＲ１発現は、試験された卵巣癌並びに肺腺癌および細気管支肺胞上皮癌の多くで高かった。卵巣癌試料の大部分は、漿液細胞または類内膜細胞において、最も高い強度の染色を有した。ＮＳＣＬＣ腫瘍では、最も高いＡＢＣ値は、細気管支肺胞上皮癌および乳頭状腺癌で見出された。 手動による染色法：ＦＯＬＲ１発現は通常、ＮＳＣＬＣ細胞の膜に限定されている。高分解能顕微鏡観察によって、ＦＯＬＲ１染色の大部分が、ＮＳＣＬＣ腫瘍における膜に限定されていたことを明らかにした。 手動による染色法：ＦＯＬＲ１発現は通常、卵巣がん細胞の膜に限定されている。高分解能顕微鏡観察によって、ＦＯＬＲ１染色の大部分が、卵巣腫瘍における膜に限定されていたことを明らかにした。 ＫＢ異種移植モデルにおける、ｈｕＭｏｖ１９標的化複合体の、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。ＦＯＬＲ１非標的ｈｕＣ２４２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（Ｄ）との比較における、ＦＯＬＲ１標的切断可能複合体ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（Ｂ）、および非標的ｈｕＣ２４２−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４（Ｅ）との比較における、切断不可複合体ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４（Ｃ）を、ＳＣＩＤマウスにＫＢ細胞が皮下移植された確立された異種移植モデルを用いて試験した。ｈｕＭｏｖ１９によるＦＯＬＲ１の標的化により、平均腫瘍容積に有意な減少がもたらされた。 ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。 ＩＧＲＯＶ−１ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。 ＯＶ−９０ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。 ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。 ＫＢヒト子宮頸部腺癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。マウスを、１．０、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。 自動染色法：ＩＨＣおよびフローサイトメトリーによる、株化細胞におけるＦＯＬＲ１発現を示す代表的な写真およびヒストグラム。ＳＷ６２０細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、Ｉｇｒｏｖ−１細胞、３００．１９／ＦＲ１細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＫＢ細胞を、ＦＯＬＲ１の染色強度および均一性に関して、全てスコア化した。ＳＷ６３０およびＩＧＲＯＶ−１は１〜３不均一とスコア化され、Ｔ４７Ｄは１〜２不均一とスコア化され、ＨｅＬａは２〜３不均一とスコア化され、一方、３００．１９／ＦＲ１およびＫＢは３均一とスコア化された。 自動染色法：漿液性卵巣がんにおける代表的なＦＯＬＲ１染色。ＩＨＣによって、漿液性卵巣がんから得られた組織切片について、３均一、２〜３均一、２均一、および２不均一染色を示す染色パターンが示された。 自動染色法：卵巣類内膜がん（endometrioid ovarian cancer）における代表的なＦＯＬＲ１染色。ＩＨＣによって、類内膜がんから得られた組織切片について、３均一、２〜３均一、３局所的、および１〜２不均一染色を示す染色パターンが示された。 自動染色法：腺癌亜型（細気管支肺胞上皮癌を除く）のＮＳＣＬＣにおける代表的なＦＯＬＲ１染色。ＩＨＣによって、非小細胞肺がん、腺癌亜型から得られた組織切片について、３均一、２〜３均一、２不均一、２均一、および１〜２不均一染色を示す染色パターンが示された。 自動染色法：子宮内膜腺癌における代表的なＦＯＬＲ１染色。ＩＨＣによって、子宮内膜腺癌から得られた組織切片について、３不均一、２不均一、および１不均一染色を示す染色パターンが示された。 自動染色法：腎明細胞癌における代表的なＦＯＬＲ１染色。ＩＨＣによって、腎細胞がんから得られた組織切片について、２均一、２不均一、および１不均一染色を示す染色パターンが示された。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩＭＧＮ８５３の細胞障害活性。５種のＦＯＬＲ１陽性細胞株（ＫＢ、ＩＧＲＯＶ−１、ＪＥＧ−３、ＳＫＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３）および２種のＦＯＬＲ１陰性細胞株（ＮａｍａｌｗａおよびＳＷ２）を、ＩＭＧＮ８５３の細胞毒性効果に対するそれらの感受性について分析した。細胞を、ＩＭＧＮ８５３（実線）またはＩＭＧＮ８５３＋０．５μＭの非複合体化ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）（点線）に５日間暴露し、ＷＳＴ−８をベースとしたアッセイによって細胞生存を決定した。代表的なデータを示す。生存細胞の割合を、１０を底とするＩＭＧＮ８５３の濃度の対数に対してプロットした。 ＦＯＬＲ１陽性細胞株のＩＭＧＮ８５３に対する感受性対ＦＯＬＲ１発現のレベル。ＩＭＧＮ８５３の作用強度および特異性を、広範囲のＦＯＬＲ１発現を有するＦＯＬＲ１陽性細胞株に対して、分析した。株化細胞をＩＭＧＮ８５３と共にインキュベートしたところ、ＫＢ、Ｉｇｒｏｖ−１、およびＪｅｇ−３が、ＩＭＧＮ８５３に対して特に感受性が高く、一方、非複合体化ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）は、複合体活性の減少を示した。Ｓｋｏｖ−３およびＯｖｃａｒ−３は、ＩＭＧＮ８５３に対して感受性ではなく、非複合体化ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）は、複合体活性を変化させなかった。 自動染色法：ＦＯＬＲ１について染色された、卵巣癌異種移植片有効性モデル。ＩＨＣによって、卵巣がん異種移植片から得られた組織切片について、１〜３不均一（Ｏｖｃａｒ３）、１〜３均一（Ｉｇｒｏｖ１）、１〜２不均一（Ｏｖ９０）および陰性（ＳＫＯＶ３）を示す染色パターンが示された。 自動染色法：マウス異種移植片モデル。ＮＳＣＬＣ（Ａ）、子宮内膜癌（Ｂ）、および子宮頚癌（Ｃ）の株化細胞について、異種移植片におけるＦＯＬＲ１の染色パターンを示した。ＮＳＣＬＣ試料は２〜３均一または２均一染色を示し、子宮内膜癌は２不均一／３局所的染色を示し、子宮頸癌は３均一染色を示した。 アッセイ対照組織の自動染色ガイド。自動ＩＨＣによって決定された、陰性（食道０）および陽性対照試料（唾液腺１〜２不均一、肺２均一、膵臓３均一）の染色パターンを示す。 腫瘍組織の自動染色ガイド。自動ＩＨＣによって決定された、対照組織に対する、レベル３、レベル２、およびレベル１染色の代表的な染色パターンを示す。 腫瘍組織の自動染色ガイド。自動ＩＨＣによって決定された、対照組織に対する、レベル３、レベル２、およびレベル１／陰性染色の代表的な染色パターンを示す。

本発明は、ＦＯＬＲ１の過剰発現によって特徴付けられるがんの治療の有効性、またはそれに応答する可能性を増加させるための方法を提供する。本発明は、正常組織と比較された場合の、腫瘍組織におけるＦＯＬＲ１の発現の動的な範囲（dynamic range）の発見、および、上昇したＦＯＬＲ１発現レベルを有する腫瘍は抗ＦＯＬＲ１抗体または抗ＦＯＬＲ１免疫複合体を用いる治療に対して感受性がより高いという発見に基づいている。自動化された方法と手動の方法の間にある、感受性（sensitity）および動的な範囲（dynamic range）の検出における差異も発見された。さらに、本発明の方法を実施するのに有用な一つまたは複数の試薬を含むキットが提供される。

Ｉ． 定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および言い回しを下記に定義する。

「ヒト葉酸受容体１」または「ＦＯＬＲ１」という用語は、本明細書で使用される場合、特に明記しない限りは、あらゆる未変性ヒトＦＯＬＲ１をも意味する。「ＦＯＬＲ１」という用語は、「完全長の」、プロセシングされていないＦＯＬＲ１、および細胞内のプロセシングによりもたらされるあらゆる形態のＦＯＬＲ１を包含する。前記用語は、ＦＯＬＲ１の自然発生的な変異体（例えば、スプライスバリアント、対立遺伝子多型およびアイソフォーム）も包含する。本明細書に記載のＦＯＬＲ１ポリペプチドは、種々の源から（ヒト組織型から等）、もしくは別の源から単離することができ、または組換え法もしくは合成法によって調製することができる。ＦＯＬＲ１配列の例としては、限定はされないが、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ１５３２８、ＮＰ＿００１０９２２４２．１、ＡＡＸ２９２６８．１、ＡＡＸ３７１１９．１、ＮＰ＿０５７９３７．１、およびＮＰ＿０５７９３６．１、並びに配列番号１および配列番号２に示されるものが挙げられる。

ＦＯＬＲ１の「発現増加」という用語は、ＦＯＬＲ１発現レベルの上昇を含む試料を意味する。一例では、ＦＯＬＲ１発現は、ＩＨＣによって測定され、定義されたスコアを示す対照（例えば、較正対照）との比較によって、染色強度スコアまたは染色均一性スコアを与えられる（例えば、強度がレベル３の較正対照に匹敵する場合は、３の強度スコアが試験試料に与えられ、または、強度がレベル２の較正対照に匹敵する場合は、２の強度が試験試料に与えられる）。例えば、免疫組織化学による１、２、３、もしくは３＋またはそれより大きいスコアは、ＦＯＬＲ１の発現増加を示す。不均一または均一な染色均一性も、ＦＯＬＲ１の発現増加を示すものである。染色強度および染色均一性のスコアは、単独で、または組み合わせて（例えば、２均一、２不均一、３均一、３不均一等）、使用することができる。別の例では、ＦＯＬＲ１の発現増加は、対照値（例えば、がんに罹患していない対象、または上昇したＦＯＬＲ１値を有さないがんに罹患している対象から得られた組織または細胞における発現レベル）と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍）の増加を検出することによって、決定することができる。

「参照試料」は、試験試料から本発明の方法で得られた結果を相互に関連付け、比較するために使用することができる。参照試料は、細胞（例えば、細胞株、細胞ペレット）または組織であり得る。「参照試料」におけるＦＯＬＲ１レベルは、絶対量もしくは相対量、ある範囲の量、最小量および／もしくは最大量、平均量、並びに／またはＦＯＬＲ１の中央値量であってよい。本発明の診断法は、試験試料におけるＦＯＬＲ１の発現レベルと、「参照値」を比較することを含む。一部の実施形態では、参照値は、参照試料におけるＦＯＬＲ１の発現レベルである。参照値は、前もって決定された値であってよく、試験試料と並行して試験された参照試料（例えば、対照生物試料）から決定されてもよい。参照値は、単一のカットオフ値（例えば中央値または平均値）またはある範囲の値（例えば信頼区間）であり得る。参照値は、がんに罹患し易い個体、早期がんもしくは後期がんを有する個体、雄および／もしくは雌の個体、またはがん治療を受けている個体等の、種々の個体亜群に対して確立することができる。正常参照試料または正常参照値、および陽性参照試料または陽性参照値の例は、本明細書に記載されている。

一部の実施形態では、参照試料は、健全な組織、具体的にはがんに罹患していない対応する組織から得られた試料である。これらのタイプの参照試料は、陰性対照試料と称される。他の実施形態では、参照試料は、ＦＯＬＲ１を発現する腫瘍組織から得られた試料である。これらのタイプの参照試料は、陽性対照試料と称される。陽性対照試料は、均一性（不均一対均一）および／または染色強度の程度（１、２、３、３＋）についての比較指標としても使用することができ、これは、ＦＯＬＲ１発現レベルと相関関係を持つ。陽性対照比較試料は、染色強度または均一性の動的な範囲（dynamic range）を示す、較正参照試料（calibrated reference sample）とも称される。実施例１〜９に示されるように、ＦＯＬＲ１を発現しない参照試料としては、ヒト食道組織が挙げられ、低ＦＯＬＲ１参照としては、唾液腺（具体的には介在導管）組織および肺（具体的には呼吸上皮）組織が挙げられ、高ＦＯＬＲ１発現組織としては、膵臓（具体的には、導管細胞）が挙げられる。細胞株について、低発現体（expressor）としては、限定はされないが、ＯＶＣＡＲ３およびＴ４７Ｄが挙げられ、中程度の発現体（expresser）としては、限定はされないが、ＳＷ６２０、ＩＧＲＯＶ−１、ＪＥＧ３が挙げられ、高発現体としては、限定はされないが、ＫＢおよびＩＧＲＯＶ１が挙げられる。特に望ましい、高ＦＯＬＲ１陽性参照は、葉酸受容体１を安定にまたは一過性に形質移入された細胞株（例えば、３００．１９／ＦＲ１）である。特定のがんについての、ＦＯＬＲ１の適切な陽性基準レベルおよび陰性基準レベルは、一つまたは複数の適切な対象におけるＦＯＬＲ１のレベルを測定することによって決定してもよく、そのような基準レベルは、対象の特定の集団に合わせてもよい（例えば、基準レベルは、ある年齢の対象から得られた試料におけるＦＯＬＲ１レベル間、およびある年齢群における特定の病状、表現型、またはそれらの欠如についての基準レベル間の比較ができるように、年齢を適合させてもよい）。そのような基準レベルは、生物試料におけるＦＯＬＲ１のレベルを測定するのに使用される特定の技術（例えば、イムノアッセイ等）に合わせてもよく、ＦＯＬＲ１のレベルは使用される特定の技術によって異なり得る。

「一次抗体」という用語は、本明細書では、組織試料における標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を意味する。一次抗体は、通常、免疫組織化学（ＩＨＣ）の手順で使用される、最初の抗体である。一実施形態では、一次抗体は、ＩＨＣ手順で使用される唯一の抗体である。「二次抗体」という用語は、本明細書では、一次抗体に特異的に結合することによって、一次抗体と、仮にあれば後の試薬との間に、橋を形成する、抗体を意味する。二次抗体は、通常、免疫組織化学の手順で使用される、２番目の抗体である。

本発明の「試料」または「生物試料」は、生体起源のものであり、特定の実施形態では、真核生物由来のもの等である。好ましい実施形態では、試料はヒト試料であるが、動物試料も本発明の実施に使用することができる。本発明で使用するための試料の源としては、限定はされないが、例えば、固形組織、生検吸引液（biopsy aspirate）、腹水、流体抽出物（fluidic extract）、血液、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側部分（external section）、気道、腸管、および尿生殖路、涙、唾液、乳汁、腫瘍、器官、細胞培養物および／または細胞培養成分が挙げられる。本発明は、固形組織試料を通常含むがん試料、または利用可能な物質の量が少ない、腹水等の他の体液にとって、特に有用である。本方法は、ＦＯＬＲ１の発現の様相（aspect）または試料の状態を試験するのに使用することができ、限定はされないが、種類の異なる細胞または組織を比較すること、異なる発生段階を比較すること、並びに疾患または異常の存在および／または種類を検出または決定することを含む。

本明細書における目的のために、組織試料の「切片」とは、組織試料の単一の部分または断片（例えば組織の薄切片、または組織試料から切り取られた細胞）を意味する。組織試料の複数枚の切片（section）をとって、本発明に従って分析にかけてもよいことは理解されよう。いくつかの場合では、組織の選択された部分（portion）または切片（section）は、均一な細胞集団を含む。他の場合では、選択された部分は、組織の一領域（例えば、非限定例として管腔）を含む。選択された部分は、例えば、１個の細胞または２個の細胞程の大きさであってもよく、または何千個もの細胞を表し得る。ほとんどの場合、細胞の収集が重要となるが、本発明は、細胞成分の検出での使用のために記述されている一方で、本方法は生物体の非細胞成分（例えば非限定例として血液中の可溶性成分）を検出することにも使用することができる。

「相関させる」または「相関させること」とは、方法は何であれ、第一の分析の成績および／または結果を、第二の分析の成績および／または結果と比較することを意味する。例えば、第二の分析を実行する際に第一の分析の結果を使用してもよく、および／または、第二の分析が実行されるべきかどうかを決定するために第一の分析の結果を使用してもよく、および／または、第一の分析の結果を、第二の分析の結果と比較してもよい。一実施形態では、ＦＯＬＲ１の発現増加は、ＦＯＬＲ１を標的とする抗がん治療の有効性の可能性の増大と相関する。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組み合わせ等の標的を認識し特異的に結合する、免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント等）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作製された、二重特異性抗体等の多特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部位を含む融合タンパク質、並びに抗体が所望の生物活性を示せばよい、抗原認識部位を含む、その他全ての改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかであり得、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される、それらの重鎖の定常領域のアイデンティティに基づいている。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、よく知られたサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、裸の状態でもよいし、トキシン、放射性同位元素等の他の分子に結合していてもよい。

「阻止」抗体または「拮抗」抗体は、それが結合する、ＦＯＬＲ１等の抗原の生物活性を阻害または低減する抗体である。ある実施形態では、阻止抗体または拮抗抗体は、実質的にまたは完全に、抗原の生物活性を阻害する。生物活性が、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低減されることが望ましい。

「抗ＦＯＬＲ１抗体」または「ＦＯＬＲ１に結合する抗体」という用語は、ＦＯＬＲ１を標的とする際、抗体が診断薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＦＯＬＲ１と結合することが可能な抗体を意味する。無関係な、非ＦＯＬＲ１タンパク質に対する抗ＦＯＬＲ１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定された場合、ＦＯＬＲ１に対するその抗体の結合の約１０％未満である。ある実施形態では、ＦＯＬＲ１に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。抗ＦＯＬＲ１抗体の例は、当該技術分野において周知であり、米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に記載されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部分を意味し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を意味する。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体、および抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。

「モノクローナル抗体」とは、単一の抗原決定基、またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関わる、均質な抗体集団を意味する。これは、異なる抗原決定基を対象とする異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトな、完全長のモノクローナル抗体、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含むその他全ての改変された免疫グロブリン分子を両方とも包含する。さらに、「モノクローナル抗体」とは、多くの方法、例えば、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、および遺伝子導入動物によって作成された抗体を意味する。

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書では同義的に使用され、特定の抗体により認識され、特異的に結合されることが可能な抗原の部分を意味する。抗原がポリペプチドであるとき、エピトープは、タンパク質の三次元的折り畳み（tertiary folding）によって並置された、近接アミノ酸および非近接アミノ酸の両方から形成され得る。近接アミノ酸から形成されたエピトープは通常、タンパク質変性時に保持されるが、一方で、三次元的折り畳みによって形成されたエピトープは通常、タンパク質変性時に失われる。エピトープは典型的に、独特な空間的高次構造で、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含んでいる。

「結合親和性」とは、通常、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）の間の、非共有相互作用の合計の強度を意味する。特に指示のない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有結合親和性を意味する。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野において周知の、共通の方法によって測定することができる。低親和性抗体は通常、ゆっくりと抗原と結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は通常、より急速に抗原と結合し、より長く結合状態のままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は、当該技術分野では周知であり、そのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。具体的な、説明を目的とする実施形態を、以下に記載する。

「〜未満（or better）」とは、結合親和性を言及するために本明細書で使用される場合、分子とその結合パートナーの間のより強力な結合を意味する。「〜未満（or better）」とは、本明細書で使用される場合、より強力な結合を意味し、より小さな数値のＫｄ値によって表される。抗原に対して「０．６ｎＭ未満（or better）」の親和性を有する抗体を例にすると、その抗原に対するその抗体の親和性は０．６ｎＭ未満（すなわち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ等）、または０．６ｎＭ未満のあらゆる数値である。

「実質的に同様な」または「実質的に同一の」という言い回しは、本明細書で使用される場合、２つの数値（通常、一方は本発明の抗体に関連し、もう一方は参照／比較抗体に関連する）間の類似度が、当業者によって、その２つの値の間の差異が上記値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特性の文脈の中で生物学的および／または統計的な有意性がほとんどまたは全くないと見なされる程度に、十分に高いことを表す。上記２つの値の間の差異は、参照／比較抗体についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満である。

「単離された」、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然には存在しない状態にある、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物には、それらが自然において存在する状態ではもはやない程度にまで精製されたものも含まれる。一部の実施形態では、単離された、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物なし）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である物質を意味する。

「免疫複合体」または「複合体」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞結合剤（すなわち、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片）に連結した化合物またはその誘導体を意味し、一般式（generic formula）：Ｃ−Ｌ−Ａによって定義され、式中、Ｃ＝細胞毒、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤または抗ＦＯＬＲ１抗体もしくは抗体断片である。免疫複合体は、順序を逆にした一般式：Ａ−Ｌ−Ｃによっても定義することができる。

「リンカー」は、化合物、通常はメイタンシノイド等の薬剤を、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片等の細胞結合剤に、安定な共有結合性様式で連結することが可能である、あらゆる化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性のままである条件下で、酸による開裂、光による開裂、ペプチダーゼによる開裂、エステラーゼによる開裂、およびジスルフィド結合の開裂をし易くてもよいし、それに対し実質的に抵抗性であり得る。適切なリンカーは、当該技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。リンカーとしては、本明細書に記載され、当該技術分野で既知の、荷電リンカー、およびその親水性形態も挙げられる。

「がん」および「がんの」という用語は、細胞集団が制御されない細胞成長によって特徴づけられる哺乳動物における生理的条件を表しているか、または記述している。がんの例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵がん、グリア芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、および各種頭頸部がんが挙げられる。

「腫瘍」および「新生物」とは、前がん病変を含む、良性（非がん性）または悪性（がん性）いずれかの、過剰な細胞成長または増殖からもたらされた、いかなる組織塊をも意味する。

用語「がん細胞」、「腫瘍細胞」、および文法的等価物（grammatical equivalent）は、腫瘍または前がん病変に由来する全細胞集団を意味し、腫瘍細胞集団の大部分を成す非腫瘍形成性細胞、および腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の両方を含む。本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」という用語は、それらの腫瘍細胞をがん幹細胞から区別するための再生および分化する能力を欠く腫瘍細胞を単に意味する場合は、「非腫瘍形成性の」という用語によって修飾される。

「対象」という用語は、特定の処置の受容者となるあらゆる動物（例えば、哺乳動物）、例えば、限定はされないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を意味する。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関連して、本明細書では同義的に使用される。

一つまたは複数のさらなる治療薬「と組み合わせての」投与には、同時（simultaneous、concurrent）投与および任意の順番での連続投与が含まれる。

「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性が効果的であることを可能にするような形態にあり、その製剤が投与されるであろう対象に対して、許容できないほど毒性がある追加成分を含有しない、調製物を意味する。そのような製剤は無菌であり得る。

本明細書に記載されるような抗体の「有効量」は、具体的に定められた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、定められた目的との関連で、経験的に、および通例の方法で、決定することができる。

「治療有効量」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療」するのに効果的な、抗体または他の薬剤の量を意味する。がんの場合では、薬剤の治療有効量によって、がん細胞の数の減少、腫瘍サイズの減少、周辺臓器へのがん細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度の速度減少、そしてある実施形態では停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の速度減少、そしてある実施形態では停止）、腫瘍増殖のある程度の阻害、および／またはがんに関連する症状のうちの一つまたは複数のある程度の軽減が可能となる。本明細書における「治療」の定義を参照されたい。薬剤が、増殖を阻止する、および／または既存のがん細胞を殺傷することが可能な程度にまで、薬剤は細胞増殖抑制性および／または細胞殺傷性であり得る。ある実施形態では、ＦＯＬＲ１レベルが増加したと見なされることによって、ＦＯＬＲ１標的治療薬の量を減少させて投与して、より大きな投与量でみられたのと同じ治療効果を達成することができる。「予防有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の予防的成果を達成するのに有効な、量を意味する。必ずしもではないが典型的に、予防的用量は疾患初期の前またはその時点で対象に使用されるため、予防有効量は治療有効量未満となる。

「好都合に応答する」という用語は、通常、対象において有益な状態を引き起こすことを意味する。がん治療に関して、本用語は、対象に対して治療効果を与えることを意味する。がんにおける好ましい治療効果は、いくつかの方法（W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)を参照）で測定することができる。例えば、腫瘍増殖阻害、分子マーカー発現、血清マーカー発現、および分子イメージング技術は全て、抗がん剤の治療効果を評価するのに使用することができる。腫瘍増殖阻害に関して、ＮＣＩ基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が、抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は、高い抗腫瘍活性レベルであるとみなされ、Ｔ／Ｃ（％）＝処置群の腫瘍容積中央値／対照群の腫瘍容積中央値×１００である。

「標識」という単語は、本明細書で使用される場合、「標識された」抗体を作製するために、抗体に直接的または間接的に結合している、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体が検出可能であり得るか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出が可能な基質化合物または基質組成物の化学的変質を触媒することができる。

「化学療法剤」は、作用機序を問わず、がんの治療に有用な化学物質である。化学療法剤のクラスとしては、限定はされないが、アルキル化剤（alkyating agent）、代謝拮抗剤、紡錘体毒植物性アルカロイド（spindle poison plant alkaloid）、細胞障害性（cytoxic）／抗癌性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、およびキナーゼ阻害剤が挙げられる。化学療法剤には、「標的療法」および従来の化学療法で使用される化合物が含まれる。

「治療すること（treating）」または「治療（treatment）」または「治療すること（to treat）」または「軽減すること（alleviating）」または「軽減すること（to alleviate）」等の用語は、１）診断された病的状態もしくは障害の症状を治癒、鈍化、軽減し、および／またはその進行を停止させる治療的処置、並びに、２）標的とされた病的状態または障害の発生を予防および／または緩徐化する予防的（prophylactic or preventative）処置の両方を意味する。従って、治療を必要としている者には、既に障害を有している者、障害に罹患し易い者、および障害が予防されるべき者が含まれる。ある実施形態では、患者が以下のうちの一つまたは複数を示すならば、対象は、本発明の方法に従って、首尾よくがんの「治療を受けた」ことになる：それぞれ、新薬の承認のための、国立がん研究所および米国食品医薬品局による、一連の基準によって測定される、悪液質の減少、生存期間の増加、腫瘍進行までの期間の延長、腫瘍体積の減少、腫瘍量の減少、および／または腫瘍転移までの期間の延長、腫瘍再発までの期間の延長、腫瘍反応、完全寛解、部分寛解、安定疾患、進行性疾患、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）。Johnson et al, (2003) J. Clin. Oncol. 21(7):1404-1411を参照。

「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、「腫瘍進行までの期間」（ＹＩＰ）とも称され、処置中および処置後の、がんが増殖しない期間の長さを示す。無増悪生存期間には、患者が完全寛解または部分寛解を経験した時間の量、並びに患者が安定疾患を経験した時間の量が含まれる。

「無病生存期間」（ＤＦＳ）とは、患者が、疾患がないままである、処置中および処置後の期間の長さを意味する。

「全生存」（ＯＳ）とは、未処置または無処置の個体または患者と比較した場合の、平均余命における延長を意味する。

本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって特に明示されない限りは、複数形も含む。

実施形態が、本明細書において、「〜を含む（comprising）」という言葉を用いて記述される場合は常に、「〜から成る」および／または「〜から実質的に成る」という言葉で記述されている類似の実施形態も提供されることを理解されたい。

本明細書で、「Ａおよび／またはＢ」等の言い回しにおいて使用される、「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」の両方、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」等の言い回しにおいて使用される「および／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

ＩＩ． 生体試料
生体試料はしばしば、固定液で固定される。ホルマリン（ホルムアルデヒド）およびグルタルアルデヒド等のアルデヒド系固定液が典型的に使用される。アルコール浸漬（Battifora and Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095）等の他の固定法を用いて固定された組織試料も、適切である。使用される試料は、パラフィン中に包埋されていてもよい。一実施形態では、組織試料は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の両方をされる。別の実施形態では、ＦＦＰＥブロックは、ＦＦＰＥコア試料用の特定の領域（単数または複数）を選択するために、分析用の一つまたは複数の部分を選択する前に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色される。これらの粒状（particulate）標本から組織ブロックを調製する方法は、以前の、種々の予後因子のＩＨＣ研究において使用されており、および／または、当業者に周知である（例えば、Abbondanzo et al., Am J Clin Pathol. 1990 May;93(5):698-702、Allred et al., Arch Surg. 1990 Jan;125(1):107-13を参照）。

簡潔に説明すると、任意の無処置の器官または組織は、かなり小さな断片に切断され、組織が「固定」されるまで、様々な期間の間、様々な固定液（例えばホルマリン、アルコール等）中でインキュベートされ得る。試料は、実質的に、身体から摘出されたいかなる無傷組織でもあり得る。試料は、組織病理学研究所で通常使用される装置に適合する、適度に小さな断片（単数または複数）に切断され得る。切断断片のサイズは、通常、数ミリメートルから数センチメートルの範囲である。

ＩＩＩ． 検出抗体複合体
本発明はさらに、少なくとも１つの薬剤に連結して検出抗体複合体を形成する、モノクローナルタイプの、抗ＦＯＬＲ１抗体を提供する。診断薬としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分と連結または共有結合または複合体化することが従来の方法である。そのような分子または部分は、限定はされないが、少なくとも１つのレポーター分子であり得る。レポーター分子は、アッセイを用いて検出し得るあらゆる部分と定義される。抗体に結合されているレポーター分子の非制限的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光性分子（phosphorescent molecule）、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子および／またはビオチン等のリガンドが挙げられる。

十分な選択性、特異性または親和性を有するいかなる細胞結合剤（例えば、抗体またはポリペプチド）も、ＦＯＬＲ１ポリペプチドを検出するための基礎として使用することができる。そのような特性は、当業者に知られている従来の免疫学的スクリーニング法を用いて評価することができる。生物学的に活性な分子に結合するための、抗体分子における部位には、標準的な抗原結合部位に加えて、抗原と結合することができる可変領域に存在する部位が含まれる。さらに、可変領域は抗体の自己結合（antibody self-binding）に関わっており（Kang et al., 1988）、抗抗体によって認識されるエピトープ（イディオタイプ抗原決定基）を含有する（Kohler et al., 1989）。

タンパク質結合（例えば、抗体）複合体のある例は、タンパク質結合剤（例えば、抗体）が検出可能な標識に連結している、複合体である。「検出可能な標識」は、それら特有の機能特性、および／または化学的特徴によって検出することができる化合物および／または元素であり、それを使用することによって、それらが結合している抗体の検出、および／または、必要であればさらには定量化までが可能となる。

多くの適切な造影剤（imaging agent）が、当該技術分野において周知であり、それらを抗体に結合するための方法も同様である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号、および同第４，４７２，５０９号を参照、それぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。使用される造影部分（imaging moiety）は、例えば、常磁性イオン、放射性同位元素、蛍光色素、ＮＭＲで検出可能な物質、および／またはＸ線画像化であり得る。

タンパク質結合（例えば、抗体）複合体としての使用が企図されている蛍光標識の例としては、例えば、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８、フルオレセインイソチオシアナート、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、フィコエリトリン、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、レノグラフィン（Renographin）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、およびそれら標識の誘導体（例えば、イソチオシアナートまたは複合体化のための他のリンカーで修飾されたハロゲン化誘導体等）が挙げられる。放射標識の例はトリチウムである。

本発明において企図されるタンパク質結合（例えば、抗体）検出複合体には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用のものも含まれ、その抗体は、第二の結合リガンドに、および／または、発色基質との接触時に有色の生成物を生じる酵素（酵素タグ）に連結している。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（セイヨウワサビ）水素ペルオキシダーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい第二の結合リガンドは、ビオチンおよび／またはアビジン並びにストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号に記載されており、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。

アジド基を含有する分子も、低強度の紫外線によって生じる反応性ナイトレン中間体を介して、タンパク質への共有結合を形成するのに使用することができる（Potter & Haley, 1983）。具体的には、プリンヌクレオチドの２−アジド類似体および８−アジド類似体は、未精製細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を確認するための部位特異的な光プローブとして使用されている（Owens & Haley, 1987、Atherton et al., 1985）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドも、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインを位置付けるために使用されており（Khatoon et al., 1989、King et al., 1989、およびDholakia et al., 1989）、抗体結合剤として使用する
ことができる。

抗体の、その結合部分への結合または接合のための、いくつかの方法が当該技術分野において周知である。いくつかの結合法は、例えば、抗体に結合した、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）等の有機キレート化剤、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコールウリル−３を使用している金属キレート錯体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号、それぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩等のカップリング剤の存在下で、酵素と反応もし得る。フルオレセインマーカーとのタンパク質結合（例えば、抗体）複合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアン酸塩との反応により、作製される。米国特許第４，９３８，９４８号では、乳腺腫瘍のイメージングは、例えば、モノクローナル抗体を用いて達成されており、検出可能なイメージング部分は、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミダートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオナート等のリンカーを用いて、抗体に結合されている。

他の実施形態では、抗体結合部位を変化させない反応条件を用いて、免疫グロブリンのＦｃ領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによって、免疫グロブリンを誘導体化することが企図される。この方法に従って作製された抗体複合体が開示され、寿命、特異性および感受性の向上を示している（米国特許第５，１９６，０６６号、参照によって本明細書に組み込まれる）。レポーターまたはエフェクター分子がＦｃ領域中の炭水化物残基に結合している、エフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合は、文献（O’Shannessy et al., 1987）にも開示されている。

本発明の他の実施形態では、免疫グロブリンは、トリチウム等の核種で放射性標識される。さらなる実施形態では、ナノゴールド（nanogold）粒子（約０．５ｎｍ〜４０ｎｍのサイズ等）および／または粒子ドット（Quantum Dot）（カリフォルニア州ヘイワード）が使用される。

ＩＶ． 酵素および基質（色素原（chromagen））
基質および指示薬の使用が、ＦＯＬＲ１の検出に企図され、例えば、以下で提供される例示的な実施形態等である。

西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、最初に過酸化水素との複合体を形成し、次にそれの分解を引き起こし、結果として水および原子状酸素を生じさせる、酵素である。他の多くの酵素と同様、ＨＲＰおよびいくつかのＨＲＰ様活性は、過剰な基質によって阻害され得る。ＨＲＰと過剰な過酸化水素の間で形成された複合体は、触媒的には不活性であり、電子供与体（例えば発色物質）が存在しない場合、可逆的に阻害される。内在性ＨＲＰ活性の反応停止をを引き起こすのは、過剰な過酸化水素および電子供与体の欠如である。

アッセイ系で使用される場合、ＨＲＰは、規定の基質をその活性型色素原（chromagen）に変換し、それにより色の変化を生じさせることにも使用することができる。ＨＲＰ酵素は、いくつかの方法によって、抗体、タンパク質、ペプチド、ポリマー、または他の分子に結合され得る。そのような方法は、当該技術分野において周知である。グルタルアルデヒドを、ＨＲＰと抗体の混合物を含有する溶液に添加することによって、酵素に対してよりも、互いに結合している、より多くの抗体分子が生じる。二段階手順では、ＨＲＰは最初に、二機能性試薬と反応する。第二段階では、活性型ＨＲＰのみが抗体と混合され、それによって、さらにより効率的な標識がもたらされ、重合は起こらない。ＨＲＰは、二段階のグルタルアルデヒド手順を用いて（ストレプト）アビジンにも結合される。この形態は、例えば、ＬＡＢおよびＬＳＡＢが基質である手順で使用される。ビオチンとの結合は２つのステップを含み、ビオチンはまずビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに、またはビオチンヒドラジドに誘導体化されなければならず、その後、ＨＲＰ酵素のεアミノ基と反応することができる。

３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、アルコールおよび他の有機溶剤にかなり難溶性の褐色の最終産物を生じる、ＨＲＰ等の酵素に対する基質である。ＤＡＢの酸化は重合も引き起こし、四酸化オスミウムと反応する能力がもたらされ、それによって、その染色強度および電子密度が増加する。重合ＤＡＢの光学濃度を強めるのに使用されるいくつかの金属および方法の中で、硫化銀と組み合わせた塩化金が、最も好結果であると思われる。

３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、ＨＲＰ等の酵素に対する基質である。酸化されると、アルコール溶性である深紅色の最終産物が形成される。従って、ＡＥＣで処理された試料は、アルコールまたはアルコール溶液（例えば、ハリスヘマトキシリン）に浸漬されてはならない。代わりに、水性の対比染色および封入剤を使用するべきでる。ＡＥＣは都合が悪いことにさらなる酸化を受けやすく、過剰な光に曝された場合、退色する。従って、暗所での貯蔵が推奨される。

４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）は、ＨＲＰ等の酵素に対する基質であり、青色の最終産物として沈殿する。ＣＮはアルコールおよび他の有機溶剤に可溶であるため、試料は、脱水してはならず、アルコール性対比染色剤へ暴露してはならず、または有機溶剤を含有する封入剤と一緒にカバーガラスを被せてはならない。ＤＡＢと異なり、ＣＮは、沈殿の場所から拡散する傾向がある。

ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩／ピロカテコール（ハンカー−イェーツ試薬（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ ｒｅａｇｅｎｔ））は、ＨＲＰ等の酵素に対する電子供与体基質であり、アルコールおよび他の有機溶剤に難溶な、暗青色の反応産物を生じる。重合ＤＡＢと同様、この反応産物はオスミウムで処理することができる。免疫ペルオキシダーゼ法においてハンカー−イェーツ試薬を用いて、様々な結果が得られている。

子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（分子量１００ｋＤ）は、Ｐ−０結合を切断することによって有機酸エステルからリン酸基を除去（加水分解によって）および移動させる酵素であり、中間体の酵素−基質結合が短時間に形成される。ＡＰに対する主要な金属活性化因子は、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋およびＣａ＋＋である。

ＡＰは、非標識アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）法が公開されるまで、免疫組織化学で広くは用いられていなかった。この方法で利用される可溶性の免疫複合体は、およそ５６０ｋＤの分子量を有する。ＰＡＰ法と比較した場合のＡＰＡＡＰ法の主な利点は、内在性ペルオキシダーゼ活性によって受ける干渉がないことである。ＰＡＰ染色では内在性ぺルオキシダーゼ活性が破壊される恐れがあるため、ＡＰＡＡＰ法は、血液および骨髄のなすりつけ標本に使用されることが推奨される。骨、腎臓、肝臓およびいくつかの白血球からの内在性アルカリホスファターゼ活性は、基質溶液への１ｍＭレバミゾールの添加により、阻害され得るが、５ｍＭがより有効であることが判明している。腸アルカリホスファターゼはレバミゾールによって十分には阻害されない。

免疫アルカリホスファターゼ染色法では、酵素が、ナフトールリン酸塩エステル（基質）を、フェノール化合物およびリン酸塩に加水分解する。フェノールは無色のジアゾニウム塩（色素原）にカップリングして、難溶性の、有色アゾ染料を生成する。基質および色素原のいくつかの異なる組み合わせが首尾よく使用されている。

ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩は、その酸形態で、またはナトリウム塩として、使用され得る。色素原であるＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲおよびＦａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢは、それぞれ、明赤色または明青色の最終産物を生じる。両方ともアルコール性有機溶剤および他の有機溶剤に可溶であり、そのため、水性の封入剤が使用されなければならない。Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲは、染色細胞がなすりつけ標本である場合に好ましい。

基質のさらなる例としては、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸塩、ナフトールＡＳ−ＴＲリン酸塩、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ＢＣＩＰ）が挙げられる。他の可能な色素原としては、 例えば、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＬＢ、Ｆａｓｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣ、ニトロブルーテトラゾリウム（Nitro Blue Tetrazolium）（ＮＢＴ）ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（iodonitrotetrazolium Violet）（ＩＮＴ）、およびそれら構造体の誘導体が挙げられる。

Ｖ． 免疫検出法
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明により企図されているリガンド等の生物学的成分に対して、結合、精製、除去、定量化および／または、他に通常の検出を行うための免疫検出法に関する。本発明に従って作製された抗体は、野生型および／または変異型のリガンドタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを検出するために使用され得る。本出願の全体にわたって記述されているように、野生型および／または変異型リガンド特異的抗体の使用が企図されている。いくつかの免疫検出法には、少し例を挙げるだけでも、フローサイトメトリー、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線測定法、フルオロイムノアッセイ、化学発光法、生物発光分析法、およびウエスタンブロットが含まれる。種々の有用な免疫検出法のステップは、例えば、Doolittle M H and Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37、Gulbis B and Galand P, Hum Pathol. 1993 Dec;24(12):1271-85、およびDe Jager R et al., Semin Nucl Med. 1993 Apr;23(2):165-79等の科学文献に記載されており、それぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。

一般的に、免疫結合法（immunobinding method）は、リガンドタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含むとされる試料を入手し、本発明に従って、場合によっては免疫複合体を形成させるのに効率的な条件下で、その試料を第一のリガンド結合ペプチド（例えば、抗リガンド抗体）と接触させることを含む。

抗原検出の点から、分析される生物試料は、組織切片または検体等の野生型もしくは変異型のリガンドタンパク質−特異的抗原を含むとされるあらゆる試料、ホモジナイズされた組織抽出物、生検吸引液（biopsy aspirate）、細胞、上記野生型もしくは変異型のＦＯＬＲ１含有組成物のいずれかの分離されたおよび／もしくは精製された形態、または血液および／もしくは血清を含む、組織と接触するあらゆる生体液であり得るが、組織試料または抽出物が好ましい。

効率的な条件下で、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるのに十分な時間、選択された生物試料を抗体と接触させるには、単に、抗体組成物を試料に添加し、抗体が、存在する任意のリガンドタンパク質抗原と、免疫複合体を形成する、すなわち、それに結合するのに、十分な長さの期間、その混合物をインキュベートするだけでよい。この後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロット等の試料−抗体組成物は、通常洗浄されて、あらゆる非特異的に結合した抗体種を取り除かれ、それによって、一次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみが検出可能となる。

一般的に、免疫複合体形成の検出は、当該技術分野において周知であり、多数の手法の適用を通じて達成することができる。これらの方法は、通常、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素タグ等の標識またはマーカーの検出に基づいている。そのような標識の使用に関する米国特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号が含まれ、それぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。当然ながら、当該技術分野において周知の通り、二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置等の、第二の結合リガンドの使用を通じたさらなる利点を見出すことができる。

検出に使用される抗リガンド抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結していてもよく、この標識をただ検出するだけで、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能となる。あるいは、一次免疫複合体内で結合する一次抗体は、その抗体に対し結合親和性を有する第二の結合剤を使用して検出され得る。これらの場合、第二の結合剤は、検出可能な標識に連結していてもよい。第二の結合剤はしばしば、それ自体が抗体であるので、「二次」抗体、または高分子検出系と称し得る。一次免疫複合体を、効率的な条件下で、二次免疫複合体を形成させるのに十分な時間だけ、標識された二次結合剤または抗体／高分子検出系に接触させる。次に、二次免疫複合体を、通常は洗浄し、あらゆる、非特異的に結合した、標識された二次抗体またはリガンドを除去し、次に二次免疫複合体中の残りの標識を検出する。

さらなる方法には、二段階手法による、一次免疫複合体の検出が含まれる。抗体に対して結合親和性を有する、抗体等の第二の結合剤は、上記のように、二次免疫複合体を形成するのに使用される。洗浄後、二次免疫複合体を、再度、効率的な条件下で、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるのに十分な時間だけ、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の結合剤または抗体と接触させる。第三のリガンドまたは抗体は検出可能な標識に連結しており、それによって、このように形成された三次免疫複合体の検出が可能となる。この系は、所望であれば、シグナル増幅を提供し得る。

別の実施形態では、ビオチン化されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体が、標的抗原（単数または複数）を検出するのに使用され、次に、第二段階の抗体が、複合体化したビオチンに結合したビオチンを検出するのに使用される。その方法では、試験される試料は、最初に、第一段階の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、抗体のいくつかは抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次に、抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的なビオチン化ＤＮＡの連続的溶液中でのインキュベーションによって増幅する。各ステップにより、追加のビオチン部位が抗体／抗原複合体に付加される。適切な増幅レベルが達成されるまで、増幅ステップは繰り返され、その時点で、試料はビオチンに対する第二段階の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。この第二段階の抗体は、例えば、色素原基質を用いる組織酵素学により抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用され得る酵素で、標識されている。適切な増幅により、肉眼で見えるタンパク質結合（例えば、抗体）複合体を生成することができる。

免疫検出の別の既知の方法では、免疫ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が利用される。ＰＣＲ方法は、抗体を遊離する低ｐＨまたは高塩濃度の緩衝液で洗い流しされる、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を使用する。次に、得られた洗浄液は、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実行するのに、適切な対照と一緒に使用される。特定の実施形態では、ＰＣＲの極端な増幅能および特異性は、単一の抗原分子を検出するのに利用され得る。そのような検出は、リアルタイムでも行われ得る。例えば、定量的リアルタイムＰＣＲの使用が企図される。

種々の形態の疾患を有する患者の臨床診断および／またはモニタリングにおいて、ＦＯＬＲ１変異体の検出、および／または正常な対象から得られた対応する生物試料におけるレベルと比較した場合のＦＯＬＲ１レベルの変化は、患者がその疾患に罹患していることを示すものである。しかし、当業者に知られているように、そのような臨床診断は、単独で、この方法に基づいて、必ずしも行われない。当業者は、生物マーカーの種類および／または量における有意差を識別することを熟知しており、それによって生物マーカーの、陽性同定（positive identification）、および／または低レベルおよび／またはバックグラウンドでの変化が示される。実際に、バックグラウンド発現レベルはしばしば「カットオフ」を形成するのに使用され、それより上に増加された検出は有意および／または陽性としてスコア化される。

一実施形態では、ＦＯＬＲ１の免疫学的検出（免疫組織化学による）は、強度および均一性（染色細胞−膜のみの割合）の両方についてスコア化される。強度についてのＦＯＬＲ１発現の比較スケールは、０−陰性、０〜１−非常に弱い、１−弱い、１〜２−弱い〜中程度、２−中程度、２〜３−中程度〜強い、３−強いとして、相関する。定量的に、スコア０は、膜染色が腫瘍細胞で観察されないことを表す。スコア１は、腫瘍細胞における、かすかな／かろうじて認知できる膜染色を表す。スコア２については、中程度の膜染色が腫瘍細胞において観察される。最後に、スコア３または３＋は、腫瘍細胞における中から強の膜染色を表す。ＦＯＬＲ１発現について０または１のスコアを有する試料は、ＦＯＬＲ１を過剰発現していないと特徴付けることができ、一方、２または３のスコアを有する試料は、ＦＯＬＲ１を過剰発現していると特徴付けることができる。ＦＯＬＲ１を過剰発現している試料は、細胞あたりで発現されるＦＯＬＲ１分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによっても等級分けすることができ、生化学的に決定されている：０＝０〜１０，０００コピー／細胞、１＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞、２＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞、および３＝少なくとも約２，０００，０００コピー／細胞。ＦＯＬＲ１パーセント細胞膜染色均一性についての比較スケールは、以下の通りに相関する：０−陰性、局所的−２５％未満、不均一（hetero）−２５〜７５％、および均一（homo）−７５％超。

ＶＩ． 核酸ハイブリダイゼーション
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、通常、スライドに固定された細胞または組織切片上で行われる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、いくつかの従来法で行われ得る（例えば、Leitch et al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v. 27 (1994)を参照）。一つのｉｎ ｓｉｔｕ法では、蛍光色素（アルゴンイオンレーザーによって励起されたときに緑色の蛍光を発するフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）等）が、細胞中の標的ヌクレオチド配列に相補的な核酸配列プローブを標識するのに使用される。標的ヌクレオチド配列を含む各細胞は、標識されたプローブと結合し、使用される特定の蛍光色素を励起するのに適切な波長の光源に細胞を暴露すると、蛍光シグナルを生じる。

様々な程度のハイブリダイゼーションの厳密性が使用され得る。ハイブリダイゼーションの条件がより厳密になるにつれて、安定な二重鎖を形成および維持するために、プローブと標的の間により程度の大きな相補性が必要となる。厳密性は、温度上昇、塩濃度低下、またはホルムアミド濃度上昇によって増加する。デキストラン硫酸の添加またはその濃度の上昇によっても、ハイブリダイゼーションの速度および最終シグナル強度を増加させるための標識プローブの有効濃度は増加し得る。ハイブリダイゼーション後、スライドを、ハイブリダイゼーション液中に見出されるものと同様の試薬を通常含んでいる溶液中で、必要な厳密性に応じて数分から数時間に変動する洗浄時間で、洗浄する。より長い、またはより厳密な洗浄は、通常、非特異的バックグラウンドを低下させるが、全体的な感受性を減少させるリスクがある。

核酸ハイブリダイゼーション（nucleic hybridization）分析で使用されるプローブは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのいずれかであり得、自然発生のヌクレオチドだけでなく、例えば、ジゴキシゲニン（digoxygenin）ｄＣＴＰ、ビオチンｄｃＴＰ７−アザグアノシン、アジドチミジン、イノシン、またはウリジンの様なそれらの類似体も含有し得る。他の有用なプローブとしては、例えば、ペプチドプローブおよびその類似体、分岐遺伝子ＤＮＡ（branched gene DNA）、ペプチド模倣薬（peptidometics）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）並びに／または抗体が挙げられる。

プローブは、標的核酸配列とプローブとの間に安定で特異的な結合が生じるように、目的の標的核酸配列に対し十分な相補性を有するべきである。安定なハイブリダイゼーションに必要とされる相同性の度合いは、ハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地の厳密性によって異なる。完全相同であるプローブが本発明で使用されることが好ましいが、当業者は、より小さいが十分な相同性を示すプローブを、本発明で使用することができることを、容易に理解するだろう（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)を参照）。

プローブは、いくつかの手段、例えば、限定はされないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、体細胞雑種パネル、もしくは分取された染色体のスポットブロットによるマッピング、染色体連鎖分析によって生成および選択することができ、または、ヒト細胞株もしくはヒト染色体を有する体細胞雑種、放射線体細胞雑種（radiation somatic cell hybrid）、染色体領域の顕微解剖（microdissection）から、もしくはユニークな染色体遺伝子座に特異的なＰＣＲプライマーもしくは隣接性ＹＡＣクローンの様な他の適切な手段によって特定された、酵母人工染色体（ＹＡＣ）由来の分取染色体ライブラリーから、クローン化および単離することができる。プローブは、プラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスベクター、または他の適切なあらゆるベクター中にクローン化された、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。プローブは、従来の方法によって、クローン化されてもよいし、化学合成されてもよい。クローン化の場合、単離されたプローブ核酸断片は、典型的には、λファージ、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３、またはＳＰ６もしくはＴ７プロモーターを含有するベクター等のベクターに挿入され、細菌の宿主中でライブラリーとしてクローン化される（例えばSambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)を参照）。

プローブは、例えば蛍光物質を用いる等して、標識されていることが好ましい。蛍光物質の例としては、限定はされないが、希土類キレート（ユウロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン（Lissamine）、ウンベリフェロン、フィコエリトリン（phycocrytherin）、フィコシアニン、もしくはＳＰＥＣＴＲＵＭ ＯＲＡＮＧＥ（商標）およびＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ（商標）等の市販の蛍光物質、並びに／または上記のうちのいずれか一つまたは複数の誘導体が挙げられる。アッセイで使用される複数のプローブは、２つ以上の識別可能な蛍光色または色素色で標識され得る。これらの色の違いによって、特定のプローブのハイブリダイゼーション位置を特定する手段がもたらされる。さらに、空間的に分けられていないプローブは、２種の別の色（例えば、薄赤色＋緑色＝黄色）色素（例えば、青色＋黄色＝緑色）を混合することによって生じる異なる色の光または色素によって、または、一度に一色のみを通過させるフィルターセットを用いることによって、特定することができる。

プローブは、当業者に知られている従来の方法を用いて、蛍光物質で直接的または間接的に標識することができる。

ＶＩＩ． 検出キットおよび構成
本明細書に記載されるような、本発明の実施に使用するためのキットも、本発明によって提供される。そのようなキットは、本方法の中で使用される種々の試薬（通常、濃縮された形態で）のうちの一つまたは複数をそれぞれ含む容器を含み得、例えば、マーカーに既に結合されている、または結合剤を抗体もしくは核酸分子にカップリングさせるための試薬を所望により含む、一つまたは複数の結合剤（抗体）（並びにマーカーそれ自体）；増幅による核酸分子の検出に使用される、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および一つまたは複数の配列特異的または縮重プライマー；ならびに／または単離（所望により顕微解剖による）のための試薬および器具が、本発明の実施を補助するために含まれる。本発明のリガンド検出法におけるキット構成物について記述している標識もしくは表示、またはそれを使用するための一連の説明書も通常含まれ、その説明書は、添付文書および／またはキットもしくはその構成物の包装を伴っていてもよい。

さらに別の実施形態では、本発明は、上記免疫検出法を用いて使用するための免疫検出キットに関する。抗体は、野生型および／または変異型のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを検出するために一般的に使用されるため、抗体がキットに含まれることが好ましい。従って、免疫検出キットは、適切な含有手段（container means）中に、野生型および／もしくは変異型のタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドに結合する第一抗体、並びに／または、所望により、免疫検出試薬、並びに／または、さらに所望により、野生型および／もしくは変異型のタンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドを含む。

キットの免疫検出試薬は、所与の抗体と会合および／または連結している検出可能な標識を含む、種々の形態のうちのいずれか１つをとり得る。第二の結合リガンドと会合および／または結合している検出可能な標識も企図される。第二のリガンドの例は、第一抗体に対して結合親和性を有する第二の抗体または高分子である。

本キット用のさらに適切な免疫検出試薬としては、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の抗体または高分子と共に、第一抗体に対して結合親和性を有する第二の抗体を含み、第三の抗体が検出可能な標識に連結している二成分試薬が挙げられる。上記で言及したように、いくつかの例示的な標識は当該技術分野において周知であり、および／またはそのような標識は全て、本発明と関連して適切に使用され得る。

キットは、検出アッセイ用の検量線を作成するために使用され得るように、野生型および／または変異型のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはポリペプチドの適切に分注された構成物をさらに含み得、標識型および／または非標識型のいずれであってもよい。キットは、完全に複合体化した形態で、中間体の形態で、および／またはキットの使用者によって複合体化される別個の部分として、抗体標識複合体または高分子標識複合体を含み得る。キットの構成要素は、水媒体および／または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。

キットの包含手段（container means）としては、通常、抗体が中に配置され得る、および／または好ましくは適切に分注され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器および／または他の包含手段（container means）が挙げられる。本発明のキットは、通常、商業販売用に厳重に閉じ込められた、抗体、抗原、および／またはあらゆる他の試薬容器を含有するための手段も含む。そのような容器には、所望のバイアルがその中に保持される、射出成形および／または中空成形のプラスチック容器が含まれ得る。

キットは、ＦＯＬＲ１免疫複合体および／または化学療法剤等の、がんの治療のための一つまたは複数の治療薬をさらに含み得る。

キットは、ＦＯＬＲ１検出試薬を含む、対象におけるＦＯＬＲ１発現を測定するために使用されるＦＯＬＲ１検出試薬、および使用のための説明書をさらに含み得る。一実施形態では、ＦＯＬＲ１検出試薬は、ＦＯＬＲ１結合ペプチド、タンパク質または分子プローブ（すなわち核酸）を含む。別の実施形態では、ＦＯＬＲ１検出試薬は抗ＦＯＬＲ１抗体である。別の実施形態では、キットは、抗ＦＯＬＲ１抗体と結合する二次抗体をさらに含む。一実施形態では、ＦＯＬＲ１特異的抗体は、０．５〜７．５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．９〜３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌの濃度で含まれる。別の実施形態では、抗体は、１．０＋／−０．５μｇ／ｍｌ、１．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、１．９＋／−０．５μｇ／ｍｌ、２．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．０＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．５＋／−０．５μｇ／ｍｌ、３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌ、または最大４．２μｇ／ｍｌの濃度で含まれる。別の実施形態では、抗体は、０．９〜３．８＋／−０．５μｇ／ｍｌの最終濃度を達成するための希釈に関する説明書と共に、濃縮液の状態で含まれる。別の実施形態では、キットは、酵素、蛍光物質、放射性標識、および発光団からなる群から選択される検出試薬をさらに含む。別の実施形態では、検出試薬は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群から選択される。

キットは、ＦＯＬＲ１発現の検出およびスコア化に関する説明書も含み得る。キットは、対照試料または参照試料も含み得る。対照試料または参照試料の例としては、限定はされないが、正常（正常対照）試料または腫瘍（陽性対照）試料に由来する細胞ペレットまたは組織培養細胞株が挙げられる。細胞株の例としては、ＫＢ、ＮＣＩ−Ｈ２１１０、Ｉｇｒｏｖ−１、Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｊｅｇ−３、Ｓｋｏｖ−３、Ｈｅｌａ、Ｔ４７Ｄ、Ｃａｃｏ２、ＳＷ６２０、ＯＡＷ２８、ＨＣＣ８２７、Ｏｖｃａｒ−８、およびＯｖｃａｒ−３、Ｏｖ−９０、ＦＯＬＲ１を発現することが知られている他の腫瘍細胞株、並びにＦＯＬＲ１を発現する発現ベクターを安定にまたは一過性に形質移入された細胞株が挙げられる。陽性対照組織の追加の例は、実施例９〜１１にも見出すことができる。キットは、染色の強度および均一性に関して陽性参照試料および正常参照試料を視覚的に描写する、染色の手引きも含み得る。そのような染色の手引きは、正常な肺、膵臓、および／または唾液腺、並びに標準化スコアを有する染色された腫瘍（例えば、卵巣がん、肺がん、腎臓がん、および子宮内膜がん、並びに実施例および図２３〜２５に記載のもの）から得られた参照試料を有し得る。

ＶＩＩＩ． ＦＯＬＲ１結合剤
ＦＯＬＲ１と結合するいかなる抗体も、本発明の検出法で使用することができる。治療効果のある抗ＦＯＬＲ１抗体の例としては、米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に見出すことができ、これは参照によって本明細書に組み込まれる。ＦＯＬＲ１の完全長のアミノ酸（ａａ）およびヌクレオチド（ｎｔ）配列は、当該技術分野において周知であり、それぞれ配列番号１および２によって表されて、本明細書で提供もされる。ＦＯＬＲ１の検出に特に有用な抗体は、マウス抗ｈｕＦＯＬＲ１モノクローナル抗体クローンＢＮ３．２（ライカ社＃ＮＣＬ−Ｌ−ＦＲα）である。治療効果のある抗ＦＯＬＲ１抗体の一例は、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）である。配列番号３〜５のポリペプチドは、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）の重鎖の可変領域、およびｈｕＭｏｖ１９の、可変領域軽鎖バージョン１．００、可変領域軽鎖バージョン１．６０をそれぞれ含む。ある実施形態では、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体は、１０８０１ ユニバーシティ・ブルーバード（University Boulevard）、マナサス、バージニア州 ２０１１０に位置するアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、２０１０年４月７日に、ブダペスト条約の条項に従って寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２およびＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有する、プラスミドによってコードされる。本発明の治療法に有用なＦＯＬＲ１免疫複合体の例が以下に提供される。

ＩＸ． ＦＯＬＲ１免疫複合体
本発明には、細胞毒（薬剤）またはプロドラッグに連結または複合体化された、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗体断片、機能的等価物、改良抗体およびそれらの本明細書に記載されるような態様を含む、複合体（本明細書では免疫複合体とも称される）の有効性を増加させるための方法も含まれる。ＦＯＬＲ１免疫複合体の例は、米国特許出願公開第２０１２／０００９１８１号に見出すことができ、これは参照によって本明細書に組み込まれる。特に効果的な、本発明の治療的免疫複合体は、上記のｈｕＭｏｖ１９抗体を含む。

適切な薬剤またはプロドラッグは、当該技術分野において周知である。ある実施形態では、薬剤またはプロドラッグは、細胞毒である。本発明の細胞傷害性複合体に使用される細胞毒は、細胞の死滅をもたらす、または細胞死を誘導する、または何らかの方法で細胞生存率を減少させるあらゆる化合物であり得、例えば、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン等のエンジイン、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体、例えばアウリスタチン、トマイマイシン誘導体（derivaties）、レプトマイシン誘導体（derivaties）、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルおよびモルホリノドキソルビシンが挙げられる。ある実施形態では、細胞毒は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体である。

薬剤またはプロドラッグは、例えば、ｈｕＭｏｖ１９等の抗ＦＯＬＲ１抗体、またはその断片に、ジスルフィド結合を介して連結できる。リンカー分子または架橋剤は、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片と反応し得る反応性化学基を含む。ある実施形態では、細胞結合剤との反応用の反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらにリンカー分子は反応性化学基を含み、ある実施形態では、薬剤と反応してジスルフィド結合を形成することができるジチオピリジル基を含む。ある実施形態では、リンカー分子には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（例えば、Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978）を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国特許出願公開第２００９０２７４７１３号を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６を参照）、２−イミノチオラン、またはアセチル無水コハク酸が含まれる。

切断不可能な連結を有する抗体−メイタンシノイド複合体を調製することもできる。そのような架橋剤は当該技術分野において記載されており（サーモサイエンティフィック・ピアス社Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋおよび米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号を参照）、例えば、限定はされないが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボンキシラート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」類似体であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸塩）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、β−マレイミドプロパン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＢＭＰＳ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸塩（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−酪酸塩（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアン酸塩（ＰＭＰＩ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨード酢酸塩（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモ酢酸塩（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオナート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。ある実施形態では、抗体は、文献に記載されるように、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジル−ヨード酢酸塩等の架橋剤で改変されて、１〜１０個の反応性基を導入する（Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979)、Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984)、および Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)）。

本発明は、約２〜約８個の薬剤分子（「薬物負荷」）、例えばメイタンシノイドが、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片に連結しており、同じ細胞結合剤に連結したより少ないまたはより多い数の薬剤の薬物負荷と比較して、該複合体の抗腫瘍効果がさらにより効果的である、態様を含む。「薬物負荷」とは、本明細書で使用される場合、細胞結合剤（例えば、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片）に結合することができる薬剤分子（例えば、メイタンシノイド）の数を意味する。一つの態様では、細胞結合剤に結合することができる薬剤分子の数は、平均して、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１）であり得る。ある実施形態では、薬剤は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）である。従って、ある実施形態では、ｈｕＭｏｖ１９抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。別の実施形態では、ＦＲ−１−２１抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。別の実施形態では、ＦＲ−１−４８抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。別の実施形態では、ＦＲ−１−４９抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。別の実施形態では、ＦＲ−１−５７抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。別の実施形態では、ＦＲ−１−６５抗体は、ＤＭ１またはＤＭ４と複合体化する。

Ｘ． ＦＯＬＲ１発現および治療効果の相関関係
ある実施形態では、本発明は、ＦＯＬＲ１標的化抗がん治療に対して応答する可能性が増加した対象を特定するための方法を提供する。本発明は、ＦＯＬＲ１の発現レベル上昇が、ＦＯＬＲ−１標的化抗がん剤の有効性と相関しているという発見に、部分的に基づいている。

異種移植モデルを用いた、患者試料の評価およびｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性への相関付けによって、治療に応答する可能性がより高い対象を選択するための発現分析の有効性（power）が示される。ＩＨＣにより、腫瘍細胞上のＦＯＬＲ１発現に関するスコアが提供される：０（発現なし）〜３＋（非常に高レベルの発現）。異種移植モデルを用いるｉｎ ｖｉｖｏデータによって、ＦＯＬＲ１発現について１、２、３、または３＋、好ましくは２、３、または３＋のスコアを獲得した試料は、臨床的に意義のある用量のＦＯＬＲ１免疫複合体で、ＦＯＬＲ−１標的抗がん治療に対して応答する可能性が増加していることが示される（例えば、５ｍｇ／ｋｇ異種移植片の用量のＦＯＬＲ１免疫複合体は、患者において１８５ｍｇ／ｍ^２に達し得る）。従って、上昇したＦＯＬＲ１スコアを有する個体の特定は、臨床的に意義のある投与量に応答し得る個体の特定を促進するだろう。以下でより詳細に記載されるが、ＦＯＬＲ１治療薬に対する感受性は、２以上のＦＯＬＲ１スコアリング、特にレベル３のスコアリングと相関した。さらに、より均一なレベルのＦＯＬＲ１発現は、治療効果とのより良い相関関係を与えた。従って、均一な染色均一性は好ましいが、染色強度の増加と不均一な染色均一性の組み合わせも、FOLR１の発現増加を示す。例えば、２不均一よりも大きなスコアは、ＦＯＬＲ１治療薬を用いた治療に関する、患者の選択基準である。

ＦＯＬＲ１発現分析によって、減少したレベルのＦＯＬＲ１標的化抗がん治療（「低用量治療」）が、抗腫瘍反応を引き起こすのに効果的であり得る患者も特定される。当該技術分野において理解されるように、化合物は、通常、所望の治療反応を達成する、最も少ない投与量で投与される。これは、臨床的な、しばしば望ましくない副作用を引き起こす治療薬にとって、特に重要である。ＦＯＬＲ１発現レベルが上昇している対象を認識する能力によって、ＦＯＬＲ−１標的化治療薬の投与量の最小化が可能となり、それによって、治療効果を維持しつつ起こり得る副作用を減少させることが可能となる。

本明細書で示されるように、２不均一またはそれより大きなＦＯＬＲ１発現スコアは、抗ＦＯＬＲ１免疫複合体への応答性増加と相関している。ある実施形態では、応答性増加は、悪液質、生存期間の増加、腫瘍進行までの期間の延長、腫瘍体積の減少、腫瘍量の減少、および／または腫瘍転移までの期間の延長、腫瘍再発までの期間の延長、腫瘍反応、完全寛解、部分寛解、安定疾患、進行性疾患、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）である。ある実施形態では、２不均一またはそれより大きなＦＯＬＲ１発現スコアは、増加するＰＦＳ、ＤＦＳ、またはＯＳと相関している。

検出法および参照／対照試料に対する相関付けで使用するためのキットは、対照試料（陽性および／または陰性）または参照試料を含み得る。陽性対照または陽性参照試料は、組織培養細胞株、正常組織または腫瘍組織に由来し得る。陽性参照試料および陰性参照試料は、ＳＷ６２０、Ｔ４７Ｄ、ＩＧＲＯＶ−１、ＨｅＬａ、ＫＢ、ＪＥＧ−３、他の腫瘍細胞株、およびＦＯＬＲ１をコードする発現ベクターを安定にまたは一過性に形質移入された細胞株を含む細胞株に由来し得る。正常組織試料または腫瘍組織試料および組織培養細胞株は、陰性対照参照試料としても使用され得る。さらなる試料については、実施例９〜１１および図２３〜２５を参照されたい。

ＸＩ． 医薬組成物および治療法
ＦＯＬＲ１結合剤（抗体、免疫複合体、およびポリペプチドを含む）は、種々の応用において有用であり、例えば、限定はされないが、がんの治療等の治療的処置（therapeutic treatment）方法が挙げられる。ある実施形態では、薬剤は、腫瘍増殖の阻害、分化の誘導、腫瘍容積の減少、および／または腫瘍の腫瘍形成性の低減に有用である。使用法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの方法であり得る。ある実施形態では、ＦＯＬＲ１−結合剤または抗体または免疫複合体、またはポリペプチドは、それが結合するヒトＦＯＬＲ１の拮抗薬である。

ある実施形態では、ＦＯＬＲ１−結合剤または拮抗薬（例えば、ｈｕＭｏｖ１９抗体または免疫複合体）で治療される疾患は、がんである。ある実施形態では、がんは、ＦＯＬＲ１−結合剤（例えば、抗体）が結合する葉酸受容体１を発現する腫瘍によって特徴付けられる。

本発明は、治療有効量のＦＯＬＲ１−結合剤を、対象（例えば、治療を必要としている対象）に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。ある実施形態では、がんは、結腸直腸がん、膵がん、肺がん、卵巣がん、肝がん、乳がん、脳がん、腎がん、前立腺がん、胃腸がん、メラノーマ、子宮頸がん、膀胱がん、グリア芽腫、および頭頸部がんからなる群から選択されるがんである。ある実施形態では、がんは卵巣がんである。ある実施形態では、がんは肺がんである。ある実施形態では、対象はヒトである。

本発明は、本明細書に記載の抗体または他の薬剤を用いて、腫瘍増殖を阻害するための方法をさらに提供する。ある実施形態では、腫瘍増殖を阻害する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞を、ＦＯＬＲ１−結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。例えば、ＦＯＬＲ１を発現する不死化細胞株または癌細胞株は、腫瘍増殖を阻害するための抗体または他の薬剤を添加される培地中で培養される。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、例えば、組織生検、胸水、または血液試料等の患者試料から単離され、腫瘍増殖を阻害するためのＦＯＬＲ１−結合剤を添加される培地中で培養される。

一部の実施形態では、腫瘍増殖を阻害する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、腫瘍または腫瘍細胞を、ＦＯＬＲ１結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。ある実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞を、ＦＯＬＲ１結合剤と接触させることは、動物モデルにおいて行われる。例えば、ＦＯＬＲ１結合剤は、免疫不全マウス（例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において増殖された、一つまたは複数のＦＯＬＲ１を発現している異種移植片に投与して、腫瘍増殖を阻害することができる。一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１結合剤は、動物への瘍原性細胞の導入と同時またはその直後に投与されて、腫瘍増殖を防止する。一部の実施形態では、ＦＯＬＲ１結合剤は、腫瘍原性細胞が特定の大きさに成長した後に、治療薬として投与される。

ある実施形態では、腫瘍増殖を阻害する方法は、対象に、治療有効量のＦＯＬＲ１結合剤を投与することを含む。ある実施形態では、対象はヒトである。ある実施形態では、対象は腫瘍を有するか、または腫瘍を除去されたことがある。

ある実施形態では、腫瘍は、脳腫瘍、大腸腫瘍、膵腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝腫瘍、乳腺腫瘍、腎腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、メラノーマ、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、グリア芽腫、および頭頚部腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。ある実施形態では、腫瘍は卵巣腫瘍である。

ある実施形態では、本発明は、低用量のＦＯＬＲ１結合剤を用いて腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。「低用量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療効果を生むのに必要とされる通常または従来の用量未満である、ＦＯＬＲ１結合剤の治療有効量を意味する。

従って、ある実施形態では、本発明は、ｈｕＭｏｖ１９抗体およびｈｕＭｏｖ１９免疫複合体を用いてがんを治療する方法を提供する。ある実施形態では、ｈｕＭｏｖ１９免疫複合体は、ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕＭｏｖ１９−スルホ−ＳＰＰ−ＤＭ１、ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＰ−ＤＭ１、またはｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４である。ある実施形態では、ｈｕＭｏｖ１９免疫複合体（immunconjuage）は、ｈｕＭ
ｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４であり、ＩＭＧＮ８５３とも称される。

ある実施形態では、製剤は、本発明の精製された抗体または薬剤を、薬剤的に許容できるビヒクル（例えば、担体、賦形剤）と混合することによって、貯蔵および使用用に調製される（Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000）。適切な薬剤的に許容できるビヒクルとしては、限定はされないが、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の無毒性の緩衝液；塩化ナトリウム等の塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化アンモニウムオクタデシルジメチルベンジル；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ‐クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば約１０アミノ酸残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリン等の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩を形成する対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びにＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、局所療法または全身療法のための様々な方法で投与することができる。投与は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤（liquids）および散剤等の局所投与（経腟送達および経直腸送達を含む、粘膜に対して等）；経肺投与（例えば、散剤またはエアロゾルの吸入またはガス注入による、例えば噴霧器による；気管内投与、鼻腔内投与、上皮投与（epidermal）および経皮投与）；経口投与；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは点滴を含む非経口投与；または頭蓋内投与（例えば、くも膜下腔内投与または脳室内投与）であり得る。

本発明の抗体または免疫複合体は、医薬品複合製剤（pharmaceutical combination formulation）において、または併用療法としての投与計画において、抗がん特性を有する第二化合物と混合され得る。医薬品複合製剤または投与計画の第二化合物は、それらが互いに悪影響を及ぼし合わないように、組み合わせのＡＤＣに対して相補的な活性を有することが好ましい。ＦＯＬＲ１結合剤および第二の抗がん剤を含む医薬組成物も提供される。

疾患の治療に関して、本発明の抗体または薬剤の適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、抗体または薬剤が治療または予防のどちらを目的にして投与されるか、薬歴、患者の臨床歴等に応じて、全て治療医の自由裁量で決まる。抗体または薬剤は、一度に、もしくは数日から数カ月まで続く一連の処置に亘って、または治癒が達成されるまで、もしくは病状の低減が達成されるまで（例えば腫瘍サイズの減少）、投与され得る。最適な用量スケジュールは、患者体内の薬物蓄積の測定から算出することができ、個々の抗体または薬剤の相対的な作用強度に応じて変化する。投与医師は、最適投与量、投与方法、および反復の速度（repetition rate）を、容易に決定することができる。ある実施形態では、投与量は、０．０１μｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年、１回または複数回与えられ得る。ある実施形態では、抗体または他のＦＯＬＲ１結合剤は、二週間毎に一回または三週間毎に１回与えられる。ある実施形態では、抗体または他のＦＯＬＲ１結合剤の投与量は、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／体重ｋｇである。治療医は、体液または組織内で測定された薬剤の滞留時間および濃度に基づいて、投与の反復速度を推定することができる。

併用療法は、「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」であることを示す、すなわち、活性成分が一緒に使用されたときに達成される効果が、これらの化合物を別々に使用することによりもたらされる効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）一緒に製剤化されて、混合された単位投与剤形で同時に投与もしくは送達された場合に、（２）別々の製剤として交互に、もしくは同時に送達された場合に、または（３）いくつかの他の投与計画による場合に、達成され得る。交互治療において送達される場合、相乗効果は、化合物が、順次に、例えば別々の注射器中の異なる注射剤によって、投与または送達された場合に、達成され得る。通常、交互治療の間、有効投与量の各活性成分は順次すなわち連続的に投与され、一方、併用療法では、２つ以上の活性成分の有効投与量が一緒に投与される。

本開示の実施形態は、以下の非限定例を参照することによりさらに定義することができ、それらは、本開示の特定の抗体の調製、および本開示の抗体を使用するための方法を詳細に記述している。材料および方法の両方に対する多くの改変が、本開示の範囲を逸脱することなく実施可能であることは、当業者には明らかである。
実施例

本明細書に記載の実施例および実施形態が説明のみを目的としており、それに照らし合わせて種々の改変または変更が当業者に示唆され、それが本願の精神および範囲内に含まれることは、理解されるべきである。

葉酸受容体−１（ＦＯＬＲ１）は、卵巣腫瘍では高発現し、脳癌、乳癌、膀胱癌、類内膜癌、肺癌、膵癌、および腎癌では高〜中程度のレベルで発現することが報告されている。しかし、ＦＯＬＲ１の発現は、正常組織に限定されており、例えば腎臓、肺、脈絡叢、膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、前立腺、および肺が挙げられる。

新鮮凍結組織ホモジネートを用いてＦＯＬＲ１を定量化する方法が報告されている。全組織ホモジネートは細胞質内発現と膜関連発現とを区別することができず、新鮮凍結試料は臨床の現場では受け入れられない。しかし、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料は、臨床における患者に対して達成され得る。

細胞試料中のＦＯＬＲ１の免疫組織化学染色−手動の方法
ホルマリン固定およびパラフィン包埋した細胞ペレットおよび組織を、以下の染色試薬および染色条件を用いて、試験試料として使用した。

ホルマリン固定およびパラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）患者卵巣腫瘍生検および卵巣異種移植片腫瘍を、マウス抗ＦＯＬＲ１抗体クローンＢＮ３．２、（ライカ社、カタログ番号ＮＣｌ−Ｌ−ＦＲα）およびコールター社から得た対照のｍｕＩｇＧ１を用いて、染色した。ｐＨ９．５の緩衝液中での抗原回復の後、スライドを、２％ウマ血清＋アビジンを用いてブロッキングした。スライドをＰＢＳで洗浄し、抗ＦＯＬＲ１抗体または対照ｍｕＩｇＧ１抗体と一緒に室温で６０分間インキュベートし、その後、ビオチン化抗マウスＩｇＧと一緒に３０分間、結合した二次抗体を検出するためのアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体と一緒に４０分間インキュベートした。ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩）と一緒に５分間インキュベートすることによって、色のシグナルが得られた。スライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。

ＦＯＬＲ１の染色強度および分布パターンを、対照ＩｇＧ染色（非特異的）と比較してスコア化した。強度を０〜３（０＝染色無し、１＝弱い、２＝中程度、および３＝強い）の段階でスコア化し、分布を、局所的（染色された細胞が２５％未満）、不均一（染色された細胞が２５〜７５％）および均一（染色された細胞が７５％超）としてスコア化した。

下記の通り、ＦＦＰＥ試料は腫瘍マイクロアレイから得られたものであり、ヒト組織ブロックは７種の異なる腫瘍から得られたものである。

ＦＯＬＲ１被験物質であるマウス抗ＦＯＬＲ１クローンＢＮ３．２を試験して、ｈｕＦＯＬＲ１抗原に対する結合特異性を決定した。報告されたＩＨＣ染色法を用いて、３００−１９およびｈｕＦＯＬＲ１を形質移入された３００−１９（３００−１０／ＦＯＬＲ１）の細胞ペレットのＦＦＰＥ切片を染色し、ＦＯＬＲ１について評価した。ＦＯＬＲ１被験物質は３００−１９／ＦＯＬＲ１＋細胞を特異的に染色し、３００−１９細胞（それぞれ３均一および陰性）では染色無しという結果が返された。これらの結果は、クローンＢＮ３．２がｈｕＦＯＬＲ１抗原を特異的に標的とすることを示している（図１）。

ＢＮ３．２抗体は、組織試料上のＦＯＬＲ１発現を検出するのにも使用された。各被験物質および対照物質の、組織および細胞ペレットとの免疫反応性を、顧問病理学者（consulting pathologist）であるＤａｖｉｄ Ｄｏｒｆｍａｎ博士が決定した。細胞ペレット対照を最初に評価し、その後に組織試料を評価した。評価された各組織について、染色強度および染色均一性の説明が報告された。染色強度スコアおよび均一性尺度を以下に記載する。評価された各組織試料についての最終的な報告スコアは、被験物質のスコアから、それぞれの対照物質のスコアを引いたものである。染色スコアを、較正した細胞ペレット対照に対し比較することによって、各試料のＡＢＣレベルを評価した。

細胞あたりの結合抗体（antibodies bound per cell）（ＡＢＣ）値を、ＦＯＬＲ１陽性腫瘍細胞株（ＫＢ、ＩＧＲＯＶ１、ＪＥＧ３、およびＯＶＣＡＲ３）について、抗ＦＯＬＲ１−フィコエリトリン（phycoerythyrin）、ＢＤ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ Ｂｅａｄｓ、およびフローサイトメトリーを用いて決定し、異なるＡＢＣ値を有することが示された（図２）。ＦＯＬＲ１陽性腫瘍細胞株から調製された細胞ペレットがＩＨＣによって異なるレベルの染色強度を示すように、染色条件をＦＯＬＲ１に対して最適化した。ＫＢ細胞ペレットは高強度の非常に強い（３＋）均一な染色を示し、ＩＧＲＯＶ１細胞ペレットは強い（３）染色を示し、ＪＥＧ３細胞ペレットは中程度の（２〜３）不均一な染色を示し、一方で、ＯＶＣＡＲ３細胞ペレットの染色は、低強度の（１〜２）不均一な染色を示した。細胞ペレットから観察されたＦＯＬＲ１染色強度の傾向は、報告されたＡＢＣ値に一致し、ＫＢ細胞は１，７００，０００という最も高いＡＢＣ値を示し、ＩＧＲＯＶ−１細胞は２６０，０００という２番目に最も高いＡＢＣ値を示し、ＪＥＧ−３はより低いＡＢＣ値または４１，０００ＡＢＣを示し、一方で、ＯＶＣＡＲ３細胞は４，０００という最も低いＡＢＣ値を示した。染色結果およびそれぞれのＡＢＣ値を下の表に列挙する。

ＩＨＣ法が、卵巣癌および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の組織試料におけるＦＯＬＲ１発現を正確に検出できることが、特に重要であった。図３に示すように、ＦＯＬＲ１発現は、２不均一〜３均一のスコアを得た卵巣癌およびＮＳＣＬＣの試料において、正確に検出され得た。これらの試料のＡＢＣ値は、２不均一のスコアを得た試料のおよそ４１，０００から、３均一のスコアを得た試料の２６０，０００超まで及んだ。図４に示すように、高い染色強度および染色均一性は、卵巣癌、肺腺癌、および細気管支肺胞上皮癌（bronchioloalveloar carcinoma）においても観察された。さらに、ＮＳＣＬＣ試料（図５）および卵巣癌（図６）におけるＦＯＬＲ１の発現は、組織試料の膜に主に局在化していることがさらに判明した。同一の腫瘍試料並びに異なる腫瘍試料から得られた複数の試料の全般で、発現が検出された。興味深いことに、大腸腫瘍、乳腺腫瘍、または小細胞肺腫瘍から得られた試料のいずれも、２不均一より大きなスコアを得なかった。

ＫＢ異種移植モデルにおいて、同様の標的を持たない（non-targeting）複合体と比較した場合の、ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４複合体およびｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性
標的を持たないｈｕＣ２４２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と比較した場合の、ＦＯＬＲ１を標的とする切断可能な複合体ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、および標的を持たないｈｕＣ２４２−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４と比較した場合の切断不可能な複合体ｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４を、ＫＢ細胞（手動のＩＨＣにより、非常に高いＦＯＬＲ１発現、３＋均一）がＳＣＩＤマウスに皮下移植される確立された異種移植モデルを用いて、試験した。マウスを体重によって処置群に無作為抽出し、細胞接種の３日後に単独で（ＳＰＤＢ複合体）、または細胞接種の３日、１０日、および１７日後の３回、毎週、それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの複合体で、処置した。異なる処置群の中央値腫瘍体積を図７にプロットする。ｈｕＭｏｖ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｈｕＭｏｖ１９−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ４のいずれかを用いた処置によって、ＰＢＳ対照と比較して中央値腫瘍体積の減少がもたらされたが、一方、それぞれの、標的を持たない複合体のいずれを用いた治療も、いかなる有意な作用も生じなかった。

ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性
確立された卵巣癌皮下異種移植モデルにおいて、ＩＭＧＮ８５３の抗腫瘍効果を評価した。ＳＣＩＤマウスに、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞（１×１０^７細胞／動物）を、右側腹部に皮下注射して、移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさに達したら（腫瘍細胞接種から２１日後）、マウスを無作為に４つの群（群あたり６匹の動物）に分けた。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。腫瘍サイズを週に２回測定することにより腫瘍成長をモニターした。腫瘍サイズを、式：長さ×幅×高さ×１／２を用いて算出した。

ＩＭＧＮ８５３は、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇの両方の服用レベルで、腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ＝０％）の点で、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍に対して高活性であった（手動のＩＨＣ法を用いて３均一のＩＨＣスコア）（図８）。５．０ｍｇ／ｋｇのＩＭＧＮ８５３で処置された、６匹中６匹のマウスで、完全な腫瘍縮小（ＣＲ）が認められた。２．５ｍｇ／ｋｇの服用レベルでＩＭＧＮ８５３を処置された、６匹中６匹のマウスで部分的な腫瘍縮小（ＰＲ）が認められ、６匹中４匹のマウスでＣＲが認められた。ＩＭＧＮ８５３は１．２ｍｇ／ｋｇ服用レベルで活性であったが、結果として、６匹中２匹のＰＲおよび６匹中１匹のＣＲにより、１８％のＴ／Ｃがもたらされた。ＮＣＩ基準によれば、１０％〜４２％の範囲のＴ／Ｃ値は活性であると見なされ、１０％未満のＴ／Ｃは高活性であると見なされる。

ＩＧＲＯＶ−１ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。
確立された卵巣癌皮下異種移植モデルにおいて、ＩＭＧＮ８５３の抗腫瘍効果を評価した。ＳＣＩＤマウスに、ＩＧＲＯＶ−１卵巣癌細胞（１×１０^７細胞／動物）を、右側腹部に皮下注射して、移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさに達したら（腫瘍細胞接種から７日後）、マウスを無作為に４つの群（群あたり６匹の動物）に分けた。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。腫瘍サイズを週に２回測定することにより腫瘍成長をモニターした。腫瘍サイズを、式：長さ×幅×高さ×１／２を用いて算出した。

ＩＭＧＮ８５３は、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇの服用レベルで、ＩＧＲＯＶ−１腫瘍に対して高活性であり（手動の方法により３均一のＩＨＣスコア）、結果として、両方の服用レベルについて５％のＴ／Ｃ値が得られた（図９）。２．５ｍｇ／ｋｇ群および５．０ｍｇ／ｋｇ群の、それぞれ、６匹中５匹のマウスおよび６匹中６匹のマウスにおいて、部分的腫瘍縮小が認められた。ＩＭＧＮ８５３は、１．２ｍｇ／ｋｇの用量では不活性であった（Ｔ／Ｃ＝４７％）。

ＯＶ−９０ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。
確立された卵巣癌皮下異種移植モデルにおいて、ＩＭＧＮ８５３の抗腫瘍効果を評価した。ＳＣＩＤマウスに、ＯＶ−９０卵巣癌細胞（１×１０７細胞／動物）を、右側腹部に皮下注射して、移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさに達したら（腫瘍細胞接種から１３日後）、マウスを無作為に４つの群（群あたり６匹の動物）に分けた。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。対照群の動物は同じスケジュールでＰＢＳを静脈内投与された。腫瘍サイズを週に２回測定することにより腫瘍成長をモニターした。腫瘍サイズを、式：長さ×幅×高さ×１／２を用いて算出した。

ＩＭＧＮ８５３は、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇの服用レベルで、ＯＶ−９０腫瘍に対して活性を有し（手動の方法により３不均一〜均一のＩＨＣスコア）、結果として、それぞれ３６％および１８％のＴ／Ｃ値が得られた（図１０）。５．０ｍｇ／ｋｇ群において２匹の動物に部分的腫瘍縮小が認められ、処置群のいずれにおいても、他の腫瘍縮小は認められなかった。ＩＭＧＮ８５３は、１．２ｍｇ／ｋｇの用量で不活性であった（Ｔ／Ｃ＝７７％）。

ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。
確立された卵巣癌皮下異種移植モデルにおいて、ＩＭＧＮ８５３の抗腫瘍効果を評価した。ＳＣＩＤマウスに、ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞（１×１０^７細胞／動物）を、右側腹部に皮下注射して、移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさに達したら（腫瘍細胞接種から２６日後）、マウスを無作為に４つの群（群あたり６匹の動物）に分けた。マウスを、１．２、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。腫瘍サイズを週に２回測定することにより腫瘍成長をモニターした。腫瘍サイズを、式：長さ×幅×高さ×１／２を用いて算出した。

ＩＭＧＮ８５３は、全ての用量においてＳＫＯＶ−３腫瘍に対して不活性であり（手動の方法により１〜３局所的のＩＨＣスコア）、ＩＭＧＮ８５３で処置された腫瘍の成長は、ＰＢＳ対照群と同等であった（図１１）。データ解析は行っておらず、このモデルにおいてＩＭＧＮ８５３が不活性であることを踏まえて試験を早期に終了させた。

ＫＢヒト子宮頸部腺癌異種移植片におけるＩＭＧＮ８５３処置の用量反応抗腫瘍活性。
確立された子宮頸部腺癌皮下異種移植モデルにおいて、ＩＭＧＮ８５３の抗腫瘍効果を評価した。ＳＣＩＤマウスに、ＫＢ子宮頸部腺癌細胞（１×１０^７細胞／動物）を、右側腹部に皮下注射して、移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の大きさに達したら（腫瘍細胞接種から７日後）、マウスを無作為に４つの群（群あたり６匹の動物）に分けた。マウスを、１．０、２．５または５．０ｍｇ／ｋｇの、ＩＭＧＮ８５３の単回静脈内注射で処置した。対照動物群には、ＰＢＳの単回静脈内注射を与えた。腫瘍サイズを週に２回測定することにより腫瘍成長をモニターした。腫瘍サイズを、式：長さ×幅×高さ×１／２を用いて算出した。

ＩＭＧＮ８５３は、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇの両方の服用レベルで、腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ＝０％）の点で、ＫＢ腫瘍に対して高活性であった（図１２）。５．０ｍｇ／ｋｇ処置群における６匹中６匹のマウス、および２．５ｍｇ／ｋｇ処置群における６匹中５匹のマウスにＣＲが認められ、試験終了（１２０日後）まで腫瘍が存在しないままであった。１．０ｍｇ／ｋｇの用量は活性であり、３７％のＴ／Ｃが得られたが、部分的縮小も完全縮小も認められなかった。

ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料におけるＦＯＬＲ１の免疫組織化学染色−自動化法。
ＩＨＣ染色アッセイは、被験物質として、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ ＦＯＬＲ１抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ／ライカ社カタログ番号ＮＣＩ−Ｌ−ＦＲα、クローンＢＮ３．２）を含むＩＶＤクラスＩ試薬、およびライカ社製Ｂｏｎｄ ＲＸ自動染色機（stainer）を使用する。結合した被験物質または対照物質は、一次抗体後試薬（post primary reagent）（ウサギ抗マウスＩｇＧ）、続いて高分子試薬（polymer reagent）（ヤギ抗ウサギ高分子）、および３，３−ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩（ＤＡＢ）色素原を含むライカ社製Ｂｏｎｄ Ｒｅｆｉｎｅ検出系と一緒にインキュベートすることによって検出された。ＦＦＰＥ試料を、下記のように、特定の一次抗体濃度（単数または複数）（ライカ社製希釈剤ＦＯＬＲ１中で希釈することにより調製）で染色した。

全ての染色試料を評価し、スコア化した。最初に対照試料を評価し、続いて試験試料を評価した（全体切片および個々のコアはＴＭＡから得た）。評価されたそれぞれの腫瘍組織または細胞ペレットについて、染色された腫瘍細胞の染色強度の説明およびそれぞれの割合を報告した。膜関連染色は全ての試料について記録された。重複スコアが１人の患者から評価された場合、より高い方のスコアのみを分析に含めた。スコアが細胞質染色のみを記載している場合は、最終スコアをゼロ（０）と報告した。強度および均一性を、下の表に記載されるように、各試料に与えた。染色強度および分布パターンを、対照ＩｇＧ染色（非特異的）と比較してスコア化した。強度を０〜３（０＝染色無し、１＝弱い、２＝中程度、および３＝強い）の段階でスコア化し、分布を、局所的（２５％未満の染色細胞）、不均一（２５〜７５％の染色細胞）および均一（７５％超の染色細胞）としてスコア化した。正常組織では、強度および割合を算出するときに、定義済みの株構造のみを評価した。

下記の通り、ＦＦＰＥ腫瘍試料は腫瘍マイクロアレイ（tumor micro array）から得られたものであり、ヒト組織ブロックは７種の異なる腫瘍から得られたものである。

細胞（腫瘍細胞または形質移入細胞）をホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した。フローサイトメトリーにより様々な範囲のＦＯＬＲ１発現を示すことが示されたＦＦＰＥ細胞ペレット試料、および正常ヒト組織を、本試験に使用して、陽性対照および陰性対照を特徴付け、特異性を分析した。様々なレベルのＦＯＬＲ１を示す細胞ペレットおよびそれぞれのスコアを、以下に報告する。細胞ペレットにおける、染色スコアと各ＦＯＬＲ１発現レベル（細胞あたりの結合抗体、ＡＢＣ、較正フローサイトメトリーにより決定された）の間の相関性は低い。例えば、１〜３不均一のスコアが、それぞれ４０，０９８および５６５，４８１のＡＢＣ値を示すＳＷ６２０およびＩＧＲＯＶ−１に与えられた。さらに、１，５００，０００のＡＢＣ値を示すＨｅｌａ細胞は２〜３不均一のスコアを得て、一方、８３０，００３ＡＢＣを示す３００．１９／ＦＲ１は３均一というより高いスコアを生んだ。

フローサイトメトリーヒストグラムは、細胞の分布対細胞あたりに結合した抗ＦＯＬＲ１の数（ＦＯＬＲ１発現レベル）を表す。ヒストグラムおよび各ＩＨＣ染色結果は、共に、これらの各細胞株が多様なＦＯＬＲ１発現を有する細胞の不均一な集団を含有することを示している。例外は、均一なフローサイトメトリーヒストグラムおよびＩＨＣ染色スコアの両方を示す３００．１９／ＦＲ１細胞株である。このデータは、より均一なレベルのＦＯＬＲ１をそれぞれ発現している細胞株は、ＡＢＣ値と各染色スコアの間により良い相関関係を与え得ることを示している。前記アッセイは全てのＦＯＬＲ１陽性細胞ペレット対照において陽性染色を示したが、これらの細胞ペレットの大部分から得られた染色スコアと各ＦＯＬＲ１発現レベルの間の相関は乏しい。従って、この群から得られた細胞ペレットは、高発現対照、中発現対照、および低発現対照と特定され得なかった。ＩＨＣおよびフローサイトメトリーによる、細胞株におけるＦＯＬＲ１発現を示す代表的な写真およびヒストグラムを図１３に示す。

アッセイ条件を決定するため、ある範囲に希釈した被験物質および対照物質を試験して、適切な感受性レベルを示す条件を選択した。ＦＯＬＲ１陽性および陰性正常組織（副腎（皮質／髄質）、乳房（管および小葉／結合組織）、ファロピウス管（表面上皮／筋肉壁）、腎臓（尿細管／糸球体）、肺（Ｉ型／ＩＩ型肺細胞／肺胞間結合組織）、膵臓（管／ランゲルハンス島）、唾液腺（管／間質）、皮膚（エクリン腺／表皮）、胃（表面上皮／粘膜下層））、および腫瘍組織の全体切片（１０個の卵巣腫瘍試料および１０個の肺腫瘍試料））から成る、ＦＯＬＲ１陽性細胞ペレットおよびＴＭＡを含む、一連のＦＦＰＥ試料に対して実験を行った。各試料を、連続希釈した被験物質濃度（０．２５、０．５、０．９、１．９、３．８、および７．５μｇ／ｍＬ）または１．９μｇ／ｍＬまたは３．８μｇ／ｍＬの対照物質濃度で染色した。各希釈における相対的な染色強度を、各試料において比較して、最適希釈を特定した。最適希釈の判定基準は、１）アイソタイプ対照で染色された試料においてバックグラウンド染色を引き起こさず、２）被験物質で染色された陰性組織対照において染色を引き起こさず、３）目的のしるし（indication）を示す試験試料（卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、ＮＳＣＬＣ腫瘍、および腎腫瘍のＦＦＰＥ組織）間の膜関連ＦＯＬＲ１発現の変動するレベルを識別する、希釈であった。評価された、被験物質の５種の希釈物のうち、１．９μｇ／ｍＬの濃度が、ライカ社製Ｂｏｎｄ ＲＸ自動プロトコール（ベーキング（Bake）および脱ろう（Dewax）プロトコール、２０分間ＥＲ２を用いるＨＩＥＲプロトコール、および追加のすすぎがある染色プロトコールＩＨＣ Ｆ）を用いる染色結果において、最も良好な動的範囲（dynamic range）を示した。

アッセイ自動化染色法の動的範囲（dynamic range）を特徴付ける対照の特定および特徴付け
品質管理：ヒト正常の唾液腺、肺および膵臓を各アッセイで使用されるべき陽性組織対照と見なして、染色手順が期待通りに行われていることを確認した。ヒト正常食道を陰性対照と見なした。これらの対照を以下のように特徴付けした：アッセイの動的な範囲をカバーする対照を確立するために、アッセイの動的範囲を示すことが予期されるいくつかのＦＯＬＲ１陽性および陰性正常組織試料からなる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、最適化段階および検証段階の間に、アッセイ検証対照として使用した。このＴＭＡにおける特定された構造を有する、以下のような４種の正常組織を、適切なアッセイ対照と見なした：正常ヒト肺の呼吸上皮（２均一のスコア）、正常ヒト膵臓の管（３均一先端（apical）のスコア）、正常ヒト唾液腺の介在導管（１〜２不均一のスコア）、および正常ヒト食道（０のスコア）。合計４回のアッセイの実行にわたって、このＴＭＡから得られた、特定済みの適切なアッセイ対照は、同一の結果を与えた。これらの結果は、選択された対照が一貫した結果を与え、アッセイの動的範囲をカバーしたことを示している。

自動染色法の機能解析。
このアッセイの用途は、再現性よく、且つ卵巣、子宮内膜、ＮＳＣＬＣ、および腎臓のＦＦＰＥ腫瘍組織における、様々なレベルおよび様々な均一性の膜関連ＦＯＬＲ１発現（最適な動的範囲）を区別するだけの適切な感度を以て、ＦＯＬＲ１を特異的に検出することである。従って、特異性、再現性、および感度を性能基準と見なした。

本試験アッセイでの正常組織染色と既に報告された結果との比較によって、本試験アッセイの特異性および感度を評価した。この試験より得られた染色結果を、ＦＦＰＥ正常組織を用いる、Scorer et al 2010 (A Full Immunohistochemical Evaluation of a Novel Monoclonal Antibody to Folate Receptor − alpha. The Novocastra Journal of Histopathology, REAGENTS: 2010(3):8-12、同一の抗体クローンＢＮ３．２について記述）から、および新鮮凍結正常組織（イミュノジェン社報告ＩＭＨ２８−００３）に対してＩＭＧＮ８５３（ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体）を用いる組織交差反応性（ＴＣＲ）試験から得られた、対応する染色結果と比較した。各方法から得られた染色結果の比較は、３つのアッセイが、異なる相対感度で概して類似した正常組織染色プロファイルを示し、Ｓｃｏｒｅｒのアッセイが最小の感度であり、本試験アッセイ（ＩＭＨ２８−０１１）が中間の感度を有し、ＴＣＲ試験法が最も感度が高かったことを示している。いくつかの構造は、２つのより感度が高い方法（本試験アッセイおよびＴＣＲアッセイ）のみで、陽性染色を示した。Ｓｃｏｒｅｒにより使用された最も感度が低いアッセイにおける陽性染色の例で、本試験アッセイおよびＴＣＲ方法においても陽性ではなかったものは存在しなかった。これらの結果は、本試験アッセイの特異性および感度が、正常組織におけるＦＯＬＲ１発現の評価に適切であることを示している。

本試験アッセイの特異性および感受性を、卵巣腫瘍、子宮内膜腫瘍、ＮＳＣＬＣ腫瘍、および腎腫瘍から成る一連の腫瘍ＴＭＡ（本アッセイの意図された臨床用途を代表する試料セット）の染色および評価によってさらに特徴付けた。陽性染色は一貫して腫瘍組織に局在化しており、間質、血管、リンパ球および正常な器官組織を含む正常な周囲組織構成要素は、予想通り、陰性または陽性に染色されていた。卵巣癌またはＮＳＣＬＣいずれかの各サブタイプについて、異なる供給元から得られたＴＭＡ間の染色スコアの分布は同様のスコア分布を示し、このことは、この方法が様々な固定および処理条件に対して感度が高くないことを示している。分布パターンはＴＭＡの間で類似していたため、異なるアレイから得られたデータを組み合わせて、スコアを分類した。サブタイプあたり２０以上の試料を含む腫瘍サブタイプのこれらのスコアの要約を、下の表に列挙する。これらの表に要約されるように、スコアの動的範囲は各腫瘍型について記載され、このアッセイが、卵巣、子宮内膜、ＮＳＣＬＣ、および腎臓のＦＦＰＥ腫瘍組織における様々なレベルおよび様々な均一性の膜関連ＦＯＬＲ１発現を区別するのに適切な感度を示すことを示している。漿液性卵巣癌、類内膜卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜癌、および腎明細胞癌の代表的な写真を、図１４〜１８に示す。例えば、染色の手引きまたは診断キットに有用な追加の代表的な写真を、図２３〜２５に示す。これらの試験は、本アッセイが特異的であり、診断または比較診断試薬として使用するのに適切な感度を有することを示している。

各試料が高い、中程度、または低いスコアを示す卵巣腫瘍、ＮＳＣＬＣ腫瘍、または腎腫瘍の３種のＦＦＰＥ腫瘍組織試料を用いて、アッセイの実験内（intra-run）再現性および実験間（inter-run）再現性を評価することにより、本試験アッセイの正確さを調べた。実験内再現性については、肺腫瘍、卵巣腫瘍、および腎腫瘍の切片をそれぞれ含む９枚のスライドを、ライカ社製Ｂｏｎｄ ＲＸの９つの無作為な場所に配置した。実験間再現性については、同一の試料からの切片を含む３枚のスライドを、３つの異なる日に染色した。実験内再現性実験および実験間再現性実験の両方から得られた全てのスライドを評価したところ、各試料について同等の染色結果を示した：肺腫瘍（高い：３均一）、卵巣腫瘍（中程度：２不均一）、および腎腫瘍（低い：１〜２不均一）。このデータは、低い、中程度および高い発現レベルを有する組織型の全般で、再現性を示している。

ＩＨＣによる２不均一以上のＦＯＬＲ１発現スコアは、ＩＭＧＮ８５３を用いる治療のための、患者の選択基準である。
腫瘍細胞株におけるＦＯＬＲ１の発現レベルを、抗体−ＰＥ複合体（ＦＲ１−２４−ＰＥ）およびＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ系を用いて決定した。３種の卵巣癌細胞株（Ｉｇｒｏｖ−１、Ｓｋｏｖ−３およびＯｖｃａｒ−３）、絨毛癌細胞株Ｊｅｇ−３および子宮頸癌細胞株ＫＢが、試験に含まれた。信頼性のあるＡＢＣ値を得るために、抗体−ＰＥ複合体を用いる結合実験は、飽和濃度（全ての利用可能な結合部位が複合体によって占められている濃度）で行われるべきである。ＦＲ１−２４−ＰＥ複合体のそのような濃度を決定するために、多様なＦＯＬＲ１発現を有する一連のＦＯＬＲ１陽性細胞株に対して、結合実験を行った。細胞を、広範な濃度範囲のＦＲ１−２４−ＰＥ複合体と一緒に、氷上で２時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。１×１０^−８Ｍの濃度で、複合体は、全試験細胞株Ｉｇｒｏｖ−１、Ｊｅｇ−３、Ｓｋｏｖ−３、Ｏｖｃａｒ−３、およびＫＢ上の細胞表面の結合部位を飽和させた。続く結合ＡＢＣ実験では、ＦＲ１−２４−ＰＥ複合体を１×１０^−８Ｍの濃度で使用した。各試料は３連で分析し、数回の独立した実験を各細胞株に対して行った。最も高い発現が見られたのは、およそ４，０００，０００±３００，０００のＡＢＣ値を有したＫＢ細胞であり、次に、４００，０００±８５，０００および１５０，０００±７５，０００のＡＢＣ値をそれぞれ有したＩｇｒｏｖ−１およびＪｅｇ−３細胞株であった。２種の細胞株、Ｓｋｏｖ−３およびＯｖｃａｒ−３は、それぞれ２０，０００±１０，０００ＡＢＣおよび７，０００±４，０００ＡＢＣという、低いＦＯＬＲ１発現を有した。実験間におけるＡＢＣ値の有意な変動が、Ｊｅｇ−３細胞において観察され、そのＡＢＣ値は４０，０００から３００，０００まで変動した。分析された他の細胞株について得られたＡＢＣ値はそれほど変動的ではなかった（以下の表を参照）ため、この変動性は、アッセイの変動性というよりも、その細胞株のいくつかの生物学的特性を反映したものであった可能性が高い。

広範囲のＦＯＬＲ１発現を有するＦＯＬＲ１陽性細胞株に対するＩＭＧＮ８５３の作用強度および特異性を分析した（細胞株のＡＢＣ値は上に記載）。さらに、ＦＯＬＲ１陰性細胞株ＮａｍａｌｗａおよびＳＷ２が実験に含まれた。ＩＭＧＮ８５３は、ＦＯＬＲ１を高発現する細胞、ＫＢ（４，０００，０００±３００，０００ＡＢＣ）、Ｉｇｒｏｖ−１（４００，０００±８５，０００ＡＢＣ）およびＪｅｇ−３（１５０，０００±７５，０００ＡＢＣ）に対して、それぞれ０．１０±０．０１ｎＭ、０．５０±０．０７ｎＭおよび１．００±０．０５ｎＭのＩＣ_５０値で、高い細胞傷害性を有した。過剰な無改変ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体（０．５μＭ）により、複合体の作用強度が典型的な非特異的レベルにまで著しく減少した（１０〜２０倍）ことから、３種の細胞株全てに対して細胞殺傷活性はＦＯＬＲ１依存性であった。ＩＭＧＮ８５３は、ＦＯＬＲ１低発現体であるＳｋｏｖ−３細胞およびＯｖｃａｒ−３細胞に対して（それぞれ２０，０００±１０，０００ＡＢＣおよび７，０００±４，０００ＡＢＣ）、およびＦＯＬＲ１陰性細胞であるＮａｍａｌｗａおよびＳＷ２に対しては、ほんのわずかな活性しか有さず、ＩＣ_５０値は２ｎＭよりも大きかった。これらの細胞株に対するＩＭＧＮ８５３の細胞障害活性は低く、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）のブロックがそれに影響を及ぼさなかったことから、ＦＯＬＲ１依存的ではなかった。図１９および２０を参照されたい。

マウス異種移植片腫瘍モデルから調製したＦＦＰＥ試料を、上記の最適化され、有効性が認められたアッセイを用いて、ＦＯＬＲ１陽性について評価した。対照物質で染色されたいかなる異種移植片試料の腫瘍細胞にも、染色は観察されなかった。以下の細胞株から得られたＦＦＰＥマウス異種移植片組織は以下の染色パターンを示した：Ｉｇｒｏｖ−１、ＫＢ、およびＮＣＩ−Ｈ２１１０はレベル３の強度を有する均一な染色パターンを示し、ＩｓｈｉｋａｗａおよびＯｖｃａｒ３はレベル３の強度を有する不均一な染色パターンを示し、ＬＸＦＡ７３７はレベル２の強度を有する均一な染色パターンを示し、ＯＶ−９０はレベル２の強度を有する不均一なパターンを示し、ＳＫＯＶ３は陰性であった。腫瘍異種移植片の代表的な写真を、図２１および２２に示す。

染色閾値（２不均一以上）は、最小レベルの発現（染色強度）および最低分布の染色（ＦＯＬＲ１を発現する腫瘍細胞の割合）の両方を必要とする。前臨床のデータによって、卵巣癌におけるこの閾値の正当性が認められる。２不均一以上のＩＨＣスコアを有するマウス異種移植片腫瘍試料は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＩＭＧＮ８５３に対する感受性を示す。マウス異種移植片卵巣腫瘍モデルから調製されたＦＦＰＥ試料を、上記の最適化され、有効性が認められたアッセイを用いて、ＦＯＬＲ１陽性について評価した。２種の卵巣癌異種移植モデル、ＯＶＣＡＲ−３およびＩＧＲＯＶ−１が、レベル３の強度を有する不均一または均一な染色パターンを示した。ＯＶ−９０卵巣癌細胞から得られた異種移植モデルはレベル２の強度を有する不均一な染色パターンを示し、Ｓｋｏｖ−３卵巣癌モデルはＦＯＬＲ１陰性であった。ＩＭＧＮ８５３は、レベル３のＦＯＬＲ１強度を有する該２種の卵巣モデルにおいて高活性であり、レベル２のＦＯＬＲ１強度を有するＯＶ−９０モデルにおいて活性であった。ＳＫＯＶ−３モデルでは活性は観察されなかった。異種移植片モデルを、肺腫瘍、子宮内膜腫瘍、および子宮頸部腫瘍を含む他の疾患徴候（diseseas indication）についても評価したところ、活性およびＦＯＬＲ１染色スコアの間に相関性は認められたが、さらなる試料を試験する必要がある。

本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受入番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）は、個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または受入番号／データベース配列が、具体的且つ個々に、参照によって組み込まれた場合と同程度に、あらゆる目的のために、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

1. 本願図面に記載の発明。