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CN111579798A - 一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN111579798A CN202010472265.7A CN202010472265A CN111579798A CN 111579798 A CN111579798 A CN 111579798A CN 202010472265 A CN202010472265 A CN 202010472265A CN 111579798 A CN111579798 A CN 111579798A
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黄春宇
李玉叶
李龙飞
余姝毅
陈聪
曾勇
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Shenzhen Zhongshan Urology Hospital
Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括阳性对照标准品、阴性对照标准品、第一缓冲物、过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂、非特异蛋白阻断粉剂、第二缓冲物、第一抗原修复液、第二抗原修复液、抗体稀释液、一抗、二级级联检测物、第一显色液色元、第一显色液底物、第一显色液活化剂、第二显色液色元、第二显色液底物、复染液、分化液、返蓝液以及封片剂。能够稳定的、准确的在同一组织样本内实现多指标分析子宫内膜容受性，从而在同一张切片上可以得到更为丰富的信息。

Description

一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医学和生物学检测领域，具体涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前，中国不孕症的发生率约在15-20％，而且不孕不育患者的数量每年以数十万的速度递增。婚育年龄的推迟、工作压力的堆积以及生活方式的改变等因素直接或间接地减低了人们的生育能力。随着世界上首例试管婴儿的降生，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)已成为不孕女性尽快获得妊娠的有效途径。尽管辅助生殖技术的发展和技术革新，使得大部分不孕症患者已经能够通过胚胎体外培养技术获得优质胚胎进而妊娠，但是仍有一部分优质胚胎在妊娠早期甚至极早期发生丢失。研究表明，胚胎因素(包括胚胎移植方式)和子宫内膜容受性因素与胚胎成功种植存在着一定的相关性。但是，如何基于胚胎因素和子宫内膜容受性因素的情况，来判断患者行辅助生殖技术后，妊娠成功的可能性，从而辅助临床决策，进行适当的靶向干预，是提高目前辅助生殖成功率的有效途径。
在胚胎因素方面，胚胎的移植策略与妊娠成功率的关系日益受到关注。胚胎玻璃化冷冻保存技术的成功应用有效地提高了冻胚移植成功率，因而冻胚移植越来越受到重视。冻胚移植的优点主要包括两个方面：一方面，冻胚移植能够避免或降低迟发性卵巢过度刺激综合症(OHSS)的发生率；另一方面，冻胚移植能够有效利用已有的，冷冻保存的受精胚胎，减少患者进行促排卵的次数。与此相对的是，鲜胚移植缩短患者行辅助生殖技术的等待时间。而从结果上看，关于辅助生殖治疗中，冻胚移植和鲜胚移植的妊娠成功率结果不一。因此，选择何种胚胎移植方式，也是困扰临床医生进行临床决策的难题。
另一方面，子宫内膜容受性是指子宫内膜对于胚胎的接受能力，指子宫内膜处于一种允许胚胎定位、黏附和侵入的状态。子宫内膜容受性的改变，会导致流产或不孕等不良妊娠结局。研究表明，子宫内膜是一个周期性改变的黏膜免疫微环境，由内膜基质细胞、免疫细胞、细胞因子等相互影响相互调控。因此，子宫内膜容受性也受到这些因素的共同调节。
传统临床上对于子宫内膜容受性的诊断，主要是参考形态学的评估。其评估指标主要包括三大类：(1)子宫内膜厚度、回声和血流等超声形态；(2)腺体大小、间质疏密和血管丰度等组织活检形态；(3)子宫内膜胞饮突。然而，形态学评估无法准确反映子宫内膜细胞和细胞因素的表达情况，因此其评估的有效性在临床实践中受到一定的争议。
鉴于形态学评估的局限性，目前基础科研和临床实践中，已逐渐采用基于免疫组织化学染色技术和基因转录组分析技术的方法进行子宫内膜容受性评估。基于免疫组织化学染色技术分析子宫内膜容受性，能够直观的观察免疫细胞在子宫内膜组织上的分布情况。
目前，专利权人(深圳中山生殖与遗传研究所)已经开发了基于免疫组织化学染色方法的子宫内膜容受性评估试剂盒——“一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法”(专利号：ZL201610021908.X)。通过抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人T细胞表面分子CD3的抗体、抗人辅助性T细胞表面分子CD4的抗体、抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体来分析子宫内膜容受性。
尽管在体外实验和动物实验中已证实，上述免疫细胞表面分子标记物与子宫内膜容受性密切相关，但是这些免疫细胞表面分子标记物在人体组织标本内是否能反映子宫内膜容受性，即这些免疫细胞表面分子标记物在人体组织标本内的有效性判断，需要一种辅助临床决策的方法。
此外，不同免疫细胞亚群与免疫细胞容受性的关系逐渐被揭露。如巨噬细胞(Macrophage)可通过不同的极化方式(M1,M2)在妊娠过程中参与不同的生理过程。巨噬细胞既能够在孕早期通过促血管生成因子促进血管重塑，又能通过模式识别受体向M1方向，清除病原微生物。但是，不同细胞亚型往往难以通过单一抗体进行区分，比如CD163既能表达在巨噬细胞的亚群(M2)中，也能表达在单核细胞(monocyte)的亚群中。因此，确定某细胞亚群与子宫内膜的容受性之间的关系，也需要多重染色的检测方法。
传统的免疫组化检测通常一张玻片上只标记一种抗体，所带来的信息量较为有限，子宫内膜的免疫细胞亚群难以区分。此外，由于子宫内膜活检所获得的组织样本量较少，单一抗体染色需要消耗大量的样本，使得难以在患者的同一组织样本上实施多个指标的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括阳性对照标准品、阴性对照标准品、第一缓冲物、过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂、非特异蛋白阻断粉剂、第二缓冲物、第一抗原修复液、第二抗原修复液、抗体稀释液、一抗、二级级联检测物、第一显色液色元、第一显色液底物、第一显色液活化剂、第二显色液色元、第二显色液底物、复染液、分化液、返蓝液、封片剂。
本发明的有益效果是：本发明试剂盒所提供试剂能够稳定的、准确的在同一组织样本内实现多指标分析子宫内膜容受性，从而在同一张切片上可以得到更为丰富的信息。从实际应用上，多指标评估子宫内容受性试剂盒既能够对子宫内膜免疫细胞亚型的数量进行准确分析，也能够通过多指标分析，减少患者组织样本的使用，从而更好的利用患者珍贵的组织样本，进行更细致的分析。本发明采用了二级级联检测系统，使用者无须考虑一抗的种属(小鼠或兔)，便可进行相应的阳性信号检测。同时，由于针对小鼠来源的一抗，二级级联检测系统能够有效放大信号，增强实验的灵敏度。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述第一缓冲物为TBS片剂；所述非特异蛋白阻断粉剂为牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum)；所述第二缓冲物为吐温-20；所述第一抗原修复液包括枸橼酸盐；所述第二抗原修复液包括EDTA；所述抗体稀释液为IHC抗体稀释液；所述一抗包括抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163和抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体；所述二级级联检测物包括兔抗小鼠IgG抗体、抗兔IgG-聚合物AP抗体和抗兔IgG-聚合物HRP抗体；所述第一显色液色元为AP Red显色液色原；所述第一显色液底物为AP Red显色液底物；所述第一显色液活化剂为AP Red活化剂：所述第二显色液为DAB显色液色元；所述第二显色液底物为DAB显色液底物；所述复染液为苏木素体细胞染色液，所述分化液为1％v/v盐酸酒精，所述返蓝液为1％v/v氨水，所述封片剂为中性树胶封片剂。
采用上述进一步方案的有益效果是当研究人员开展子宫内膜容受性相关指标(CD8、CD56、CD57、CD68、CD1a、CD83、CD163、Foxp3)在特定人群中的表达情况后，可通过本发明(辅助临床决策试剂盒)提供的分析方式(包括二元逻辑回归、列线图、决策曲线分析和临床影响曲线分析)来评估子宫内膜容受性，确定上述指标在不同人群对妊娠风险的预测价值。从而让临床医生能够有针对性的开展相关子宫内膜容受性相关指标的检测，降低患者不必要的支出，做到精准诊疗。过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂是一种双重内源性酶封闭剂，可以同时灭活过氧化物酶和碱性磷酸酶，降低DAB和AP的非特异性染色。抗体稀释液采用的就是IHC抗体稀释液(基因科技，GT100910)。产品为绿色溶液，滴加时易辨识，防止漏加一抗和二级级联检测物。
进一步，所述试剂盒包括盒体以及设置于所述盒体内的第一抽屉式隔层、第二抽屉式隔层和第三抽屉式隔层，所述第一抽屉式隔层内设有第一泡沫垫，所述第二抽屉式隔层内设有第二泡沫垫，所述第三抽屉式隔层内设有第三泡沫垫，所述第一泡沫垫开设分别放置所述第一缓冲物、所述过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂、所述非特异蛋白阻断粉剂、所述第二缓冲物、所述第一抗原修复液和所述第二抗原修复液的凹槽，所述第一泡沫垫还开设放置载玻片、盖玻片、所述阳性对照标准品和所述阴性对照标准品的腔体，所述第二泡沫垫上开设分别放置所述抗体稀释液的凹槽，放置所述一抗的凹槽和放置所述二级级联检测物的凹槽，所述第三泡沫垫开设分别放置所述第一显色液色元、所述第一显色液底物、所述第一染色液活化剂、所述第二显色液色元、所述第二显色液底物、所述复染液、所述分化液、所述返蓝液及所述封片剂的凹槽。
采用上述进一步方案的有益效果是试剂盒分区明确：用到哪层试剂就取出哪个隔层，避免了提前解冻试剂。同时，也减少了检测人员拿错试剂的可能性。
进一步，放置所述一抗的凹槽为8个，分别放置抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163、抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体；放置所述二级级联检测物的凹槽为3个，分别放置兔抗小鼠IgG抗体、抗兔IgG-聚合物AP抗体和抗兔IgG-聚合物HRP抗体。
进一步，所述第一抽屉式隔层、所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层由上至下层叠设置，且后端均设置第一磁性锁扣，所述盒体分别对应所述第一磁性锁扣设置第二磁性锁扣，所述第一磁性锁扣和所述第二磁性锁扣通过磁性连接。
采用上述进一步方案的有益效果是密封性好：本发明的试剂盒，在盒体和抽屉式隔层相应的设置了磁性锁合装置，试剂盒密封性好，便于移动和运输；本发明的试剂盒，能够同时标记两种抗体，实现在患者的同一组织样本中实施多个指标的检测，减少患者组织样本的使用量，或实现免疫细胞亚型的标记。
进一步，所述第一抽屉式隔层、所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层前端均设置把手。
采用上述进一步方案的有益效果是利于抽屉式隔层的抽拉。
进一步，还包括一份使用说明书。
本发明还涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)工作液配制及石蜡切片的制备：第一缓冲液和第二缓冲液的制备：将所述第一缓冲物溶于超纯水中，得到第一缓冲液；将所述第一缓冲物和所述第二缓冲物溶于超纯水中，得到第二缓冲液；一抗稀释：分别取所述抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、所述抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、所述抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、所述抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、所述抗人未成熟树突状细胞表面分子CD1a的抗体、所述抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、所述抗人M2巨噬细胞表面分子CD163和所述抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体，然后分别加所述抗体稀释液稀释100倍，得到一抗工作液；二级级联检测物稀释：取所述兔抗小鼠IgG抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到兔抗小鼠IgG抗体工作液；取所述抗兔IgG-聚合物HRP抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物HRP抗体工作液；取所述抗兔IgG-聚合物AP抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物AP抗体工作液；非特异蛋白阻断粉剂溶解：将所述非特异性蛋白阻断粉剂溶于所述第二缓冲液中，得到0.05g/ml的非特异性蛋白阻断剂工作液；第一显色液工作液制备：取1mL所述第一显色液底物，加入200uL所述第一显色液活化剂，混合均匀，随后加入10uL所述第一显色液色元，得到第一显色工作液；第二显色液工作液制备：取50uL所述第二显色液色元，加所述第二显色液底物稀释20倍，得到第二显色液工作液；将人体子宫内膜经福尔马林固定和石蜡包埋处理得到样品石蜡切片；
(2)石蜡切片脱蜡：样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品各1个，先放入二甲苯中浸泡10min，再放入另一份二甲苯中浸泡5min，再放入无水酒精和二甲苯等体积混合溶液中浸泡3min，得到脱蜡后样品石蜡切片、脱蜡后阳性对照标准品和脱蜡后阴性对照标准品；
(3)水化：将所述脱蜡后样品石蜡切片、所述脱蜡后阳性对照标准品和所述脱蜡后阴性对照标准品，依次放入100％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，另一份95％乙醇浸泡2min，80％酒精浸泡2min，蒸馏水浸泡2min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，得到水化后样品石蜡切片、水化后阳性对照标准品和水化后阴性对照标准品；
(4)过氧化物酶和碱性磷酸酶失活：将所述水化后样品石蜡切片、水化后阳性对照标准品和水化后阴性对照标准品上多余液体甩去，浸泡在所述过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂中15min，再用所述第一缓冲液进行冲洗3次，每次3min，得到过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后样品石蜡切片和过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阳性对照标准品以及过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阴性对照标准品；
(5)第一次抗原修复：将所述第一抗原修复液或所述第二抗原修复液放入耐高温容器中，再将所述过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后样品石蜡切片、所述过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阳性对照标准品和所述过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阴性对照标准品置于所述耐高温容器中，煮沸15min，放置室温冷却20min，然后放入蒸馏水中10min平衡至室温，然后用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，得到第一次修复的样品石蜡切片、第一次修复的阳性对照标准品和第一次修复的阴性对照标准品；
(6)封闭：将所述过第一次修复后的样品石蜡切片、第一次修复的阳性对照标准品、第一次修复的阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述非特异性蛋白阻断剂工作液，室温孵育20min，使用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，甩去多余的液体，得到封闭后样品石蜡切片、封闭后阳性对照标准品和封闭后阴性对照标准品；
(7)第一次一抗孵育：将所述封闭后样品石蜡切片、所述封闭后阳性对照标准品和所述封闭后阴性对照标准品各1个均甩去所述第一缓冲液，滴加一种所述一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，得到第一次一抗后样品石蜡切片、第一次一抗后阳性对照标准品和第一次一抗后阴性对照标准品；
(8)第一次二级级联检测：将所述第一次一抗后样品石蜡切片、所述第一次一抗后阳性对照标准品和所述第一次一抗阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加所述抗兔IgG-聚合物AP抗体工作液，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用第一缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，得到第一次二级级联检测后样品石蜡切片、第一次二级级联检测后阳性对照标准品和第一次二级级联检测后阴性对照标准品；
(9)第一次显色：将所述第一次二级级联检测后样品石蜡切片、所述第一次二级级联检测后阳性对照标准品和第一次二级级联检测后阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述AP Red显色液工作液进行显色，得到第一次显色后样品石蜡切片、第一次显色后阳性对照标准品；
(10)第二次抗原修复：将所述第一抗原修复液或所述第二抗原修复液放入耐高温容器中，再将所述第一次显色后样品石蜡切片、所述第一次显色后阳性对照标准品和所述第一次显色后阴性对照标准品置于其中，煮沸15min，放置室温冷却20min，再放入预先装好常温蒸馏水的容器10min，平衡至室温，然后用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，得到第二次修复的样品石蜡切片、第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品；
(11)第二次一抗孵育：将所述第二次修复的样品石蜡切片、所述第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品上多余的液体甩去，将所述第二次修复的样品石蜡切片、所述第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品滴加与所述第一次一抗孵育所用不同种类的所述一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第二缓冲液冲洗3min，得到第二次一抗后样品石蜡切片、第二次一抗后阳性对照标准品和第二次一抗后阴性对照标准品；
(12)第二次次二级级联检测：将所述第二次一抗后样品石蜡切片、所述第二次一抗后阳性对照标准品和所述第二次一抗阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第二缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加所述抗兔IgG-聚合物HRP抗体工作液，然后用所述第一缓冲溶液冲洗3次，每次3min，得到第二次二级级联检测后样品石蜡切片、第二次二级级联检测后阳性对照标准品和第二次二级级联检测后阴性对照标准品；
(13)第二次显色：将所述第二次二级级联检测后样品石蜡切片、所述第二次二级级联检测后阳性对照标准品和所述第二次二级级联检测后阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加第二显色液工作液进行显色，得到第二次显色后样品石蜡切片、第二次显色后阳性对照标准品和第二次显色后阴性对照标准品；
(14)复染、分化和反蓝：将所述第二次显色后样品石蜡切片、所述第二次显色后阳性对照标准品和所述第二次显色后阴性对照标准品上的显色液工作液甩去，滴加所述复染液复染7min，使用蒸馏水冲洗1min，滴加所述分化液分化10s，使用蒸馏水冲洗1min，滴加所述返蓝液进行返蓝30s，使用蒸馏水冲洗1min，得到返蓝后样品石蜡切片、返蓝后阳性对照标准品和返蓝后阴性对照标准品；
(15)脱水、透明化：将所述返蓝后样品石蜡切片、返蓝后阳性对照标准品和返蓝后阴性对照标准品，依次放入70％酒精中浸泡30s、80％酒精中浸泡30s、95％酒精浸泡30s、100％酒精浸泡30s、另一份100％酒精中浸泡30s、脱水后转入二甲苯溶液浸泡30s、再转入另一份二甲苯溶液30s进行透明化处理，得到透明化后样品石蜡切片、透明化后阳性对照标准品和透明化后阴性对照标准品；
(16)封固和封片：将所述透明化后样品石蜡切片、所述透明化后阳性对照标准品和所述透明化后阴性对照标准品上多余的液体甩去，用中性树胶封片，得到多指标免疫组织化学染色切片；
(17)实验结果处理及分析：采用成像显微镜和病理图片分析软件结果，在同一组织切片上实现免疫细胞亚群的数量分析或多指标评估子宫内膜容受性。
附图说明
图1为本发明试剂盒结构示意图；图2为数字化病理图，其中左图为数字化病理图片分析软件采集图片，右图为数字化病理图片分析软件进行分析后结果，红色细胞为CD163单阳性细胞；绿色细胞为CD68单阳性细胞；黄色细胞为CD68、CD163双阳性细胞；其余图上未标记的细胞为染色阴性细胞。本图中，CD163单阳性细胞百分比为0.17％；CD68单阳性细胞百分比为0.17％；CD68、CD163双阳性细胞百分比为：2.01％；图3为预测模型图，其中预测正确的实际人数和预测妊娠高风险人数的比值是判断患者过度治疗的指标(即预测的假阳性率)。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1、盒体，2、第一抽屉式隔层，3、第二抽屉式隔层，4、第三抽屉式隔层，5、第二磁性锁扣,6、第一磁性锁扣,7、把手,8、泡沫垫,801、第一泡沫垫，802、第二泡沫垫，803、第三泡沫垫，9、载玻片，10、盖玻片，11、阳性对照标准品，12、阴性对照标准品，13、第一缓冲物，14、过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂，15、非特异蛋白阻断粉剂，16、第二缓冲物，17、第一抗原修复液，18、第二抗原修复液，19、抗体稀释液，20、一抗，21、兔抗小鼠IgG抗体，22、抗兔IgG-聚合物AP抗体，23、抗兔IgG-聚合物HRP抗体，24、第一显色液色元，25、第一显色液底物，26、第一显色液活化剂,27、第二显色液色元，28、第二显色液底物，29、复染液，30分化液，31、返蓝液，32、封片剂。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
本发明的一种多指标评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括盒体和三层抽屉式隔层。在盒体、各隔层衔接处分别设有磁性锁扣，所述抽屉式隔层内部设置有深色泡沫垫和1份说明书，所述泡沫垫上设有1个阳性对照标准品、1个阴性对照标准品、27瓶试剂、载玻片和盖玻片、27瓶试剂分别为1瓶TBS片剂、1瓶过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂、1瓶非特异蛋白阻断粉剂、1瓶吐温-20(Tween-20)、1瓶抗原修复液1(含枸橼酸盐)、1瓶抗原修复液2(含EDTA)、1瓶抗体稀释液、8瓶一抗储存液、1瓶100×兔抗小鼠IgG(Rabbit anti-mouse IgG)抗体、1瓶100×抗兔IgG-聚合物HRP(Anti-rabbit Poly-HRP-IgG)抗体、1瓶100×抗兔IgG-聚合物AP(Poly-AP anti-rabbit IgG)抗体、1瓶AP Red色元、1瓶AP-Red显色液底物、1瓶AP-Red显色液活化剂；1瓶DAB显色液色元、1瓶DAB显色液底物、1瓶复染液、1瓶1％v/v盐酸酒精、1瓶1％v/v氨水、1瓶封片剂。
过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂是一种双重内源性酶封闭剂，可以同时灭活过氧化物酶和碱性磷酸酶，降低DAB和AP的非特异性染色。
阳性对照和阴性对照，是子宫内膜的组织切片。其中阳性对照为，能够经染色后呈现阳性信号的组织切片；阴性对照为，能够经染色后不呈现阳性信号的组织切片。
所述的一抗包括：抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163、抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体。
所采用的检测系统为两种二级级联检测系统，包括兔抗小鼠IgG(Rabbit anti-mouse IgG)抗体、抗兔IgG-聚合物HRP(Anti-rabbit Poly-HRP-IgG)抗体以及兔抗小鼠IgG(Rabbit anti-mouse IgG)抗体、抗兔IgG-聚合物AP(Poly-AP anti-rabbit IgG)抗体。
所采用的显色系统为DAB和AP-Red。
在上述技术方案的基础上，本发明可以做出如下改进：
进一步，所述泡沫垫包括位于抽屉式隔层1的第一泡沫垫、位于抽屉式隔层2的第二泡沫垫、位于抽屉式隔层3的第三泡沫垫，所述第一泡沫垫上开设有6个分别放置TBS片剂、过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂、非特异蛋白阻断粉剂、吐温-20(Tween-20)、抗原修复液1(含枸橼酸盐)、抗原修复液2(含EDTA)的凹槽，以及4个分别放置载玻片、盖玻片、阳性对照标准品、阴性对照标准品的腔体。所述第二泡沫垫开设有12个分别放置1瓶抗体稀释液、8瓶一抗(抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163、抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体)、1瓶100×兔抗小鼠IgG抗体、1瓶100×抗兔IgG-聚合物AP抗体和1瓶100×抗兔IgG-聚合物HRP抗体的凹槽。所述第三泡沫垫开设有9个分别放置1瓶AP Red显色液色元、1瓶AP-Red显色液底物、1瓶AP-Red显色液活化剂、1瓶DAB显色液色元、1瓶DAB显色液底物、1瓶复染液、1瓶分化液、1瓶返蓝液和1瓶封片剂的凹槽。
进一步，本试剂盒提供了确定多指标染色的搭配方法。
方案一：根据现有文献，确定分析免疫细胞亚型所需的指标，入选相应的对照组，确定免疫指标的参考范围。
例如，采用CD68和CD163共染，可以更准确的标记M2巨噬细胞；采用CD1a和CD83共染，可以同时标记未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞，可以更加准确的确定未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞的比例，避免因为组织切片不同切面的差异以及图像数据采集和分析时视野不同造成的差异。
方案二：采用统计学方法进行分析，确定评估特定人群子宫内膜容受性关键的指标。
列线图评估妊娠失败风险性：招募特定的人群(如第一次行辅助生殖技术患者)，根据患者的妊娠结局进行分组，将胚胎的移植方式和子宫内膜免疫细胞表面分子或核转录因子的表达情况纳入二元逻辑回归分析中，筛选出妊娠成功和失败的关键性因素。通过列线图(nomogram)将二元逻辑分析的结果以图形的方式，快速、直观、精确的展现出来，建立预测妊娠结果的模型，方便临床医生通过胚胎的移植方式和子宫内膜免疫细胞表面分子或核转录因子的表达情况来预测妊娠失败的风险性大小。
辅助决策模型的建立：采用决策曲线分析(Decision curve analysis,DCA)来计算患者在不同妊娠风险系数下进行临床干预的净获益情况，并通过临床影响曲线分析(clinical impact curve analysis)来计算患者在不同妊娠风险系数下因临床干预造成过度治疗的可能性。临床医生可通过两条曲线分析的结果，综合制定针对不同地区、不同人群以及不同诊疗方案下，合适的临床干预后风险系数。
分析结果：目前发明人对第一次行辅助生殖技术患者的妊娠结果分析，CD68阳性细胞率、CD163阳性细胞率、CD68阳性细胞率/CD163阳性细胞率以及胚胎移植方式是影响妊娠结果的关键因素。CD68阳性细胞率上升，CD163阳性细胞率显著上升低以及冷冻移植，是妊娠失败的高风险性因素。并确定在风险概率为55％的情况下进行干预，是获得患者较高净获益和避免过度治疗的临界点。
对于“第一次行辅助生殖技术患者”，只有CD68、CD163以及移植方式(冷冻/新鲜移植)是妊娠失败的高风险性因素，并建立妊娠失败的预测模型，并将预测模型利用辅助决策模型，评估患者的获得较高净获益和避免过度治疗的临界点。
但是其他的指标，包括CD68/CD163/CD83/CD57这四个指标，在妊娠成功和失败患者中是存在显著的统计学差异。
本发明的多指标评估子宫内膜容受性试剂盒的使用方法，包括以下几个步骤：
(1)工作液配制：
TBS片剂溶解：将1片TBS片剂(第一缓冲物)溶于1000mL超纯水中，得到1×TBS溶液，将1片TBS片剂溶于1000mL超纯水中。另取1片TBS片剂(第一缓冲物)加500uL吐温-20(Tween-20)(第二缓冲物)，得到1×TBST溶液；
一抗储存液稀释：分别取100×抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、100×抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、100×抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、100×抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、100×抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、100×抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、100×抗人M2巨噬细胞表面分子CD163、100×抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体，加抗体稀释液稀释100倍，得到一抗工作液；
二级级联检测系统检测液稀释：取100×兔抗小鼠IgG(Rabbit anti-mouse IgG)抗体，加抗体稀释液稀释100倍，得到兔抗小鼠IgG抗体工作液；取100×抗兔IgG-聚合物HRP(Anti-rabbit Poly-HRP-IgG)抗体，加抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物HRP(Anti-rabbit Poly-HRP-IgG)抗体工作液；取100×抗兔IgG-聚合物AP(Poly-AP anti-rabbit IgG)抗体，加抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物AP(Poly-AP anti-rabbit IgG)抗体工作液；
第一显色液工作液制备：取1mL所述AP Red显色液底物，加入200uL所述AP Red显色液活化剂，混合均匀，随后加入10uL AP Red显色液色元，得到第一显色工作液；第二显色液工作液制备：取所述50uL DAB显色液色元，加所述DAB显色液底物稀释20倍，得到第二显色液工作液；
非特异性蛋白阻断粉剂溶解：取0.5g白蛋白粉溶于10mL所得1×TBST溶液中，得到0.05g/ml的非特异性蛋白阻断剂工作液；
进一步，所述第一缓冲液浓度为50mM Tris HCl,150mM NaCl，pH 7.6，所述第二缓冲液的浓度为50mM Tris HCl,150mM NaCl,0.05％Tween20,pH 7.6。
(2)石蜡切片脱蜡：将经福尔马林固定、石蜡包埋处理的人体子宫内膜的待测样品，阳性对照标准品和阴性对照标准品各1张切片先放入二甲苯中浸泡10min，再放入另一份二甲苯中浸泡5min，无水酒精和二甲苯等体积混合溶液中浸泡3min，得到脱蜡后的切片；
(3)水化：将步骤(2)所得脱蜡后的切片，依次放入100％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，另一份95％乙醇浸泡2min，80％酒精浸泡2min，蒸馏水浸泡2min。然后用步骤(1)所述的1×TBS溶液冲洗3min，得到水化后的切片；
(4)过氧化物酶和碱性磷酸酶失活：将步骤(3)所得水化后样品石蜡切片、第一次水化后阳性对照标准品和第一次水化后阴性对照标准品上多余液体甩去，浸泡在所述过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂中15min，再用所述第一缓冲液进行冲洗3次，每次3min，得到过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(5)抗原修复1：根据步骤(5)中一抗所需要的修复方式，将抗原修复液1(含枸橼酸盐)或抗原修复液2(含EDTA)放入耐高温容器中，再将步骤(3)所得水化后的切片置于其中，煮沸15min，放置室温冷却20min。再放入预先装好常温蒸馏水的容器10min，平衡至室温。然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗，每次3min，洗3次，得到抗原修复后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
抗原修复液1(含枸橼酸盐)修复项目：CD163、CD57、CD138。
抗原修复液2(含EDTA)修复项目：CD56、CD68、Foxp3、CD8、CD1a、CD83。
(6)封闭：将步骤(5)所得抗原修复后切片(抗原修复后的样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)，甩去多余的液体，滴加步骤(1)e所得非特异性蛋白阻断剂工作液，室温孵育20min，得到非特异性蛋白封闭的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(7)一抗孵育(1)：将步骤(6)所得封闭后的切片(封闭后的样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)甩去步骤(1)a所得1×TBS溶液，滴加所需的步骤(1)b所得的其中一种一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液溶液冲洗3min，得到第一次一抗后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
具体的，先用第二缓冲液冲洗3次，再用第一缓冲液冲洗1次。是因为第二缓冲液中带有Tween-20，是一种清洁剂，能够把标本冲洗的相对干净一些，降低背景或干扰。
(8)二级级联检测系统(1)：将步骤(7)所得第一次一抗后的切片，甩去多余的液体，滴加步骤(1)c所得兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加步骤(1)c所得抗兔IgG-聚合物AP(Poly-APanti-rabbit IgG)抗体工作液，然后用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，再用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗3min，得到第一次二级级联检测系统后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(9)显色(1)：
将步骤(8)所得第一次二级级联检测系统后切片，甩去多余的液体，滴加步骤(1)d所得第一显色液工作液进行显色，得到第一次显色后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(10)抗原修复2：根据步骤(11)中所采用的一抗所需的修复方式，将抗原修复液1(含枸橼酸盐)或抗原修复液2(含EDTA)放入耐高温容器中，再将步骤(9)所得第一次显色后的切片置于其中，煮沸15min，放置室温冷却20min，再放入预先装好常温蒸馏水的容器10min，平衡至室温，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗，每次3min，洗3次，得到抗原修复后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(11)一抗孵育-2：将步骤(10)所得第二次抗原修复后片，甩去多余的液体滴加所需的另外一种步骤(1)b所得一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗3min，得到第二次一抗后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(12)二级级联检测系统-2：将步骤(11)所得第二次一抗后的切片，甩去多余的液体，滴加步骤(1)c所得兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加步骤(1)c所得抗兔IgG-聚合物HRP(Anti-rabbit Poly-HRP-IgG)抗体工作液，然后用步骤(1)a所得1×TBST溶液冲洗，每次3min，洗3次，然后用步骤(1)a所得1×TBS溶液冲洗3min，得到第二次二级级联检测系统后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(13)显色(2)：
将步骤(12)所得第二次二级级联检测系统后切片，甩去多余的液体，滴加步骤(1)d所得显色液工作液进行显色，得到第二次显色后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(14)复染、分化、返蓝：将步骤(13)所得显色后的切片，甩去显色液工作液，滴加复染液复染7min，使用蒸馏水冲洗1min，滴加1％v/v盐酸酒精分化10s，使用蒸馏水冲洗1min，滴加1％v/v氨水中返蓝30s，使用蒸馏水冲洗1min，得到返蓝后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(15)脱水、透明化：将步骤(14)所得返蓝后的切片，甩去多余的液体，依次放入70％酒精中浸泡30s、80％酒精中浸泡30s、95％酒精中浸泡30s、100％酒精中浸泡30s、另一份100％酒精中浸泡30s、脱水后转入二甲苯溶液浸泡30s、再转入另一份二甲苯溶液30s进行透明化处理，得到透明化后的切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(16)封固和封片：将步骤(15)得到透明化后切片，甩去多余的液体，用中性树胶封片，得到多指标免疫组织化学染色切片(样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品)；
(17)数据采集和记录：采用显微镜进行成像，计算机随机选择30个不重合的视野进行拍照采集。通过数字化病理图片分析软件分析阳性信号的百分比，结合已建立的妊娠失败预测模型，判断患者的子宫内膜容受性。目前本试剂盒提供对第一次行辅助生殖技术患者的妊娠失败概率判断截断值为72分。列线图的计算公式为：CD68评分y1：y1＝25.1*x1-0.0889(y1为CD68评分，x1为CD68的阳性细胞率)；CD163评分y2：y2＝＝-6*x2+36(y2为CD163评分，x2为CD163的阳性细胞率；移植策略评分y3：新鲜移植＝0分，冷冻移植＝16分)。妊娠失败概率评分(即内膜容受性评分)＝y1+y2+y3。
例如：
患者1和患者2均为第一次行辅助生殖技术患者，在黄体中期进行内膜活检术，取得的内膜组织经福尔马林固定、石蜡包埋、切片后行上述检查，并进行数字化病理图片分析后得到结果。
Figure BDA0002514680000000201
患者1 CD68的阳性细胞率为1.04，CD163的阳性细胞率为1.11。经列线图公式换算后可得到，CD68评分为26.02分，CD163评分为29.34分。因此若患者1采用新鲜移植，妊娠失败的风险性评分为55.36分；若采用冷冻移植，妊娠失败的风险性评分为71.36分。因此，患者1无论是采用新鲜移植还是冷冻移植，其妊娠失败的风险性均较低。
患者2 CD68的阳性细胞率为1.89，CD163的阳性细胞率为2.33。经列线图公式换算后可得到，CD68评分为47.35分，CD163评分为22.02分。因此若患者1采用新鲜移植，妊娠失败的风险性评分为69.37分；若采用冷冻移植，妊娠失败的风险性评分为85.37分。因此，患者2若采用新鲜移植，妊娠失败的风险性较低，若采用冷冻移植，妊娠失败的风险性较高，推荐患者在尽可能选择新鲜移植的胚胎移植方式。
本发明还提供了一种妊娠失败风险性(即内膜容受性评估)的预测模型建立和评估的方式。评估容受性会涉及到指标判断的取值问题，而通过下述的一系列的分析方式(包括二元逻辑回归、列线图、决策曲线分析和临床影响曲线分析)，来得到这个合适的判断值。
发明人通过数字化病理图片分析软件分析阳性信号的百分比，得到第一次行辅助生殖技术患者黄体中期子宫内膜免疫细胞指标CD56、CD57、CD68、CD1a、CD83、CD163、Foxp3的阳性细胞率，并根据患者的妊娠结果，分为妊娠成功组和妊娠失败组，记录患者的胚胎移植方式、基础资料(如BMI(身高体重指数)、基础内分泌水平等)，运用统计学分析方法进行分析。
(1)T检验或非参数检验：采用学生t检验(Student's t test)或非参数检验分析妊娠成功组和妊娠失败组中，具有统计学差异的指标。结果表明：CD68/CD163/CD83/CD57这四个免疫细胞指标、胚胎移植方式(新鲜移植或冷冻移植)以及患者BMI，在妊娠成功和失败患者中是存在显著的统计学差异。
(2)将上述具有统计学差异的指标纳入二元逻辑回归分析，CD68阳性细胞率、CD163阳性细胞率和胚胎移植类型是妊娠失败的妊娠失败的高风险性因素。
Figure BDA0002514680000000211
(3)采用R软件“rms程序包”将各患者的CD68阳性细胞率、CD163阳性细胞率和胚胎移植类型纳入并构建列线图，得到列线图评分表，并进行公式转换。
表x列线图评分表
Figure BDA0002514680000000221
进行公式转化后以便于计算：CD68评分y1：y1＝25.1*x1-0.0889(y1为CD68评分，x1为CD68的阳性细胞率)；CD163评分y2：y2＝＝-6*x2+36(y2为CD163评分，x2为CD163的阳性细胞率；移植策略评分y3：新鲜移植＝0分，冷冻移植＝16分。患者妊娠风险性(即内膜容受性)总得分：y＝y1+y2+y3。通过比照下述表格，得到患者妊娠失败的概率。即构建患者风险性(即内膜容受性)的预测模型。
表x妊娠失败概率评分
Figure BDA0002514680000000231
(4)采用R软件“rmda程序包”对上述的预测模型进行决策曲线分析和临床影响曲线分析，分别计算患者在不同妊娠风险系数下进行临床干预的净获益情况和患者在不同妊娠风险系数下因临床干预造成过度治疗的可能性。【见附图3】
(5)通过两条曲线分析的结果，综合制定针对不同地区、不同人群以及不同诊疗方案下，合适的临床干预后风险系数。在本实例中，判断高风险阈值为0.55时，是患者获得较高净获益和避免过度治疗的临界点。对应到上表(妊娠失败概率评分)中，即预测模型为72分时，是患者获得较高净获益和避免过度治疗的临界点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，包括阳性对照标准品(11)、阴性对照标准品(12)、第一缓冲物(13)、过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂(14)、非特异蛋白阻断粉剂(15)、第二缓冲物(16)、第一抗原修复液(17)、第二抗原修复液(18)、抗体稀释液(19)、一抗(20)、二级级联检测物、第一显色液色元(24)、第一显色液底物(25)、第一显色液活化剂(26)、第二显色液色元(27)、第二显色液底物(28)、复染液(29)、分化液(30)、返蓝液(31)、封片剂(32)。
2.根据权利要求1所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲物(13)为TBS片剂；所述非特异蛋白阻断粉剂(15)为牛血清白蛋白；所述第二缓冲物(16)为吐温-20；所述第一抗原修复液(17)包括枸橼酸盐；所述第二抗原修复液(18)包括EDTA；所述抗体稀释液(19)为IHC抗体稀释液；所述一抗(20)包括抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子抗体CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163和抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体；所述二级级联检测物包括兔抗小鼠IgG抗体(21)、抗兔IgG-聚合物AP抗体(22)和抗兔IgG-聚合物HRP抗体(23)；所述第一显色液色元(24)为APRed显色液色原；所述第一显色液底物(25)为AP Red显色液底物；所述第一显色液活化剂(26)为AP Red活化剂：所述第二显色液(27)为DAB显色液色元；所述第二显色液底物(28)为DAB显色液底物；所述复染液(29)为苏木素体细胞染色液，所述分化液(30)为1％v/v盐酸酒精，所述返蓝液(31)为1％v/v氨水，所述封片剂(32)为中性树胶封片剂。
3.根据权利要求1所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体(1)以及设置于所述盒体(1)内的第一抽屉式隔层(2)、第二抽屉式隔层(3)和第三抽屉式隔层(4)，
所述第一抽屉式隔层(2)内设有第一泡沫垫(801)，所述第二抽屉式隔层(3)内设有第二泡沫垫(802)，所述第三抽屉式隔层(4)内设有第三泡沫垫(803)，
所述第一泡沫垫(801)开设分别放置所述第一缓冲物(13)、所述过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂(14)、所述非特异蛋白阻断粉剂(15)、所述第二缓冲物(16)、所述第一抗原修复液(17)和所述第二抗原修复液(18)的凹槽，所述第一泡沫垫(801)还开设放置载玻片(9)、盖玻片(10)、所述阳性对照标准品(11)和所述阴性对照标准品(12)的腔体，
所述第二泡沫垫(802)上开设分别放置所述抗体稀释液(19)的凹槽，放置所述一抗(20)的凹槽和放置所述二级级联检测物的凹槽，
所述第三泡沫垫(803)开设分别放置所述第一显色液色元(24)、所述第一显色液底物(25)、所述第一染色液活化剂(26)、所述第二色元(27)、所述第二显色液底物(28)、所述复染液(29)、所述分化液(30)、所述返蓝液(31)及所述封片剂(32)的凹槽。
4.根据权利要求3所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，放置所述一抗(20)的凹槽为8个，分别放置抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、抗人未成熟树突状细胞表面分子CD1a的抗体、抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、抗人M2巨噬细胞表面分子CD163、抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体；放置所述二级级联检测物的凹槽为3个，分别放置兔抗小鼠IgG抗体(21)、抗兔IgG-聚合物AP抗体(22)和抗兔IgG-聚合物HRP抗体(23)。
5.根据权利要求3所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)由上至下层叠设置，且后端均设置第一磁性锁扣(6)，所述盒体(1)分别对应所述第一磁性锁扣(6)设置第二磁性锁扣(5)，所述第一磁性锁扣(6)和所述第二磁性锁扣(5)通过磁性连接。
6.根据权利要求4所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)前端均设置把手(7)。
7.根据权利要求3所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，还包括一份使用说明书。
8.一种如权利要求1-7任一项所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，包括如下步骤，
(1)工作液配制及石蜡切片的制备：第一缓冲液和第二缓冲液的制备：将所述第一缓冲物溶于超纯水中，得到第一缓冲液；将所述第一缓冲物和所述第二缓冲物溶于超纯水中，得到第二缓冲液；一抗稀释：分别取所述抗人杀伤性T细胞表面分子CD8的抗体、所述抗人自然杀伤细胞表面分子CD56的抗体、所述抗人自然杀伤细胞-T细胞表面分子CD57的抗体、所述抗人巨噬细胞表面分子CD68的抗体、所述抗人未成熟树突状细胞表面分子CD1a的抗体、所述抗人成熟树突状细胞表面分子CD83的抗体、所述抗人M2巨噬细胞表面分子CD163和所述抗人调节性T细胞核转录因子Foxp3的抗体，然后分别加所述抗体稀释液稀释100倍，得到一抗工作液；二级级联检测物稀释：取所述兔抗小鼠IgG抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到兔抗小鼠IgG抗体工作液；取所述抗兔IgG-聚合物HRP抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物HRP抗体工作液；取所述抗兔IgG-聚合物AP抗体，加所述抗体稀释液稀释100倍，得到抗兔IgG-聚合物AP抗体工作液；非特异蛋白阻断粉剂溶解：将所述非特异性蛋白阻断粉剂溶于所述第二缓冲液中，得到0.05g/ml的非特异性蛋白阻断剂工作液；第一显色液工作液制备：取1mL所述第一显色液底物，加入200uL所述第一显色液活化剂，混合均匀，随后加入10uL所述第一显色液色元，得到第一显色工作液；第二显色液工作液制备：取50uL所述第二显色液色元，加所述第二显色液底物稀释20倍，得到第二显色液工作液；将人体子宫内膜经福尔马林固定和石蜡包埋处理得到样品石蜡切片；
(2)石蜡切片脱蜡：样品石蜡切片、阳性对照标准品和阴性对照标准品各1个，先放入二甲苯中浸泡10min，再放入另一份二甲苯中浸泡5min，再放入无水酒精和二甲苯等体积混合溶液中浸泡3min，得到脱蜡后样品石蜡切片、脱蜡后阳性对照标准品和脱蜡后阴性对照标准品；
(3)水化：将所述脱蜡后样品石蜡切片、所述脱蜡后阳性对照标准品和所述脱蜡后阴性对照标准品，依次放入100％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，另一份95％乙醇浸泡2min，80％酒精浸泡2min，蒸馏水浸泡2min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，得到水化后样品石蜡切片、水化后阳性对照标准品和水化后阴性对照标准品；
(4)过氧化物酶和碱性磷酸酶失活：将所述水化后样品石蜡切片、水化后阳性对照标准品和水化后阴性对照标准品上多余液体甩去，浸泡在所述过氧化物酶和碱性磷酸酶封闭剂中15min，再用所述第一缓冲液进行冲洗3次，每次3min，得到过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后样品石蜡切片和过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阳性对照标准品以及过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阴性对照标准品；
(5)第一次抗原修复：将所述第一抗原修复液或所述第二抗原修复液放入耐高温容器中，再将所述过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后样品石蜡切片、所述过氧化物酶和碱性磷酸酶失活后阳性对照标准品和碱性磷酸酶失活后阴性对照标准品置于所述耐高温容器中，煮沸15min，放置室温冷却20min，然后放入蒸馏水中10min平衡至室温，然后用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，得到第一次修复的样品石蜡切片、第一次修复的阳性对照标准品和第一次修复的阴性对照标准品；
(6)封闭：将所述过第一次修复的样品石蜡切片、第一次修复的阳性对照标准品、第一次修复的阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述非特异性蛋白阻断剂工作液，室温孵育20min，使用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，甩去多余的液体，得到封闭后样品石蜡切片、封闭后阳性对照标准品和封闭后阴性对照标准品；
(7)第一次一抗孵育：将所述封闭后样品石蜡切片、所述封闭后阳性对照标准品和所述封闭后阴性对照标准品各1个均甩去所述第一缓冲液，滴加一种所述一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，得到第一次一抗后样品石蜡切片、第一次一抗后阳性对照标准品和第一次一抗后阴性对照标准品；
(8)第一次二级级联检测：将所述第一次一抗后样品石蜡切片、所述第一次一抗后阳性对照标准品和所述第一次一抗阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第一缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加所述抗兔IgG-聚合物AP抗体工作液，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用第一缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，得到第一次二级级联检测后样品石蜡切片、第一次二级级联检测后阳性对照标准品和第一次二级级联检测后阴性对照标准品；
(9)第一次显色：将所述第一次二级级联检测后样品石蜡切片、所述第一次二级级联检测后阳性对照标准品和第一次二级级联检测后阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述AP Red显色液工作液进行显色，得到第一次显色后样品石蜡切片、第一次显色后阳性对照标准品和第一次显色后阴性对照标准品；
(10)第二次抗原修复：将所述第一抗原修复液或所述第二抗原修复液放入耐高温容器中，再将所述第一次显色后样品石蜡切片、所述第一次显色后阳性对照标准品和所述第一次显色后阴性对照标准品置于其中，煮沸15min，放置室温冷却20min，再放入预先装好常温蒸馏水的容器10min，平衡至室温，然后用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，得到第二次修复的样品石蜡切片、第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品；
(11)第二次一抗孵育：将所述第二次修复的样品石蜡切片、所述第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品上多余的液体甩去，将所述第二次修复的样品石蜡切片、所述第二次修复的阳性对照标准品和所述第二次修复的阴性对照标准品滴加与所述第一次一抗孵育所用不同种类的所述一抗工作液，37℃水浴孵育60min，然后用所述第二缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第二缓冲液冲洗3min，得到第二次一抗后样品石蜡切片、第二次一抗后阳性对照标准品和第二次一抗后阴性对照标准品；
(12)第二次二级级联检测：将所述第二次一抗后样品石蜡切片、所述第二次一抗后阳性对照标准品和所述第二次一抗阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，37℃水浴孵育30min，甩去所述兔抗小鼠IgG抗体工作液，然后使用所述第一缓冲液冲洗3次，每次3min，然后用所述第二缓冲液冲洗3min，甩去多余的液体，滴加所述抗兔IgG-聚合物HRP抗体工作液，然后用所述第一缓冲溶液冲洗3次，每次3min，得到第二次二级级联检测后样品石蜡切片、第二次二级级联检测后阳性对照标准品和第二次二级级联检测后阴性对照标准品；
(13)第二次显色：将所述第二次二级级联检测后样品石蜡切片、所述第二次二级级联检测后阳性对照标准品和所述第二次二级级联检测后阴性对照标准品上多余的液体甩去，滴加第二显色液工作液进行显色，得到第二次显色后样品石蜡切片、第二次显色后阳性对照标准品和第二次显色后阴性对照标准品；
(14)复染、分化和反蓝：将所述第二次显色后样品石蜡切片、所述第二次显色后阳性对照标准品和所述第二次显色后阴性对照标准品上的显色液工作液甩去，滴加所述复染液复染7min，使用蒸馏水冲洗1min，滴加所述分化液分化10s，使用蒸馏水冲洗1min，滴加所述返蓝液进行返蓝30s，使用蒸馏水冲洗1min，得到返蓝后样品石蜡切片、返蓝后阳性对照标准品和返蓝后阴性对照标准品；
(15)脱水、透明化：将所述返蓝后样品石蜡切片、返蓝后阳性对照标准品和返蓝后阴性对照标准品，依次放入70％酒精中浸泡30s、80％酒精中浸泡30s、95％酒精浸泡30s、100％酒精浸泡30s、另一份100％酒精中浸泡30s、脱水后转入二甲苯溶液浸泡30s、再转入另一份二甲苯溶液30s进行透明化处理，得到透明化后样品石蜡切片、透明化后阳性对照标准品和透明化后阴性对照标准品；
(16)封固和封片：将所述透明化后样品石蜡切片、所述透明化后阳性对照标准品和所述透明化后阴性对照标准品上多余的液体甩去，用中性树胶封片，得到多指标免疫组织化学染色切片；
(17)实验结果处理及分析：采用成像显微镜和病理图片分析软件结果，在同一组织切片上实现免疫细胞亚群的数量分析或多指标评估子宫内膜容受性。
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