JP2018008914A - Anti-brain tumor agent and pharmaceutical composition for treatment of brain tumor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗脳腫瘍剤及び脳腫瘍治療用医薬組成物に関する。 The present invention relates to an anti-brain tumor agent and a pharmaceutical composition for treating a brain tumor.
ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、ラパマイシンの標的分子として同定された、２種類の異なる複合体として存在するセリン・スレオニンキナーゼである。
ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）は、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、ＧβＬ（ｍＬＳＴ８）、及びＤｅｐｔｏｒから構成され、ラパマイシンによって部分的に阻害される。ｍＴＯＲＣ１は、増殖因子、栄養素、又はエネルギーの利用状況を反映する多くのシグナルを統合して、条件が良い時には細胞増殖を促進し、ストレス条件下や条件が良くない時には分解過程を亢進させる。ｍＴＯＲＣ１によるシグナル伝達経路の制御には様々ながん抑制遺伝子、及びがん遺伝子が関わっていることが知られている。
また、ｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）は、ｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＧβＬ、Ｓｉｎ１、ＰＲＲ５／Ｐｒｏｔｏｒ−１、及びＤｅｐｔｏｒから構成され、Ａｋｔを活性化することによって細胞の生存を促進する。
ｍＴＯＲは、細胞の栄養状態を反映し、蛋白合成、細胞増殖、血管新生、免疫などを制御する。ｍＴＯＲ阻害剤は、抗癌剤、免疫抑制剤として実用化されている。
mTOR (mammalian target of rapamycin) is a serine-threonine kinase that exists as two distinct complexes identified as a target molecule for rapamycin.
mTOR complex 1 (mTORC1) is composed of mTOR, Raptor, GβL (mLST8), and Deptor and is partially inhibited by rapamycin. mTORC1 integrates many signals that reflect the utilization of growth factors, nutrients, or energy, promotes cell growth when conditions are good, and enhances the degradation process when stress conditions and conditions are not good. It is known that various tumor suppressor genes and oncogenes are involved in the control of signal transduction pathways by mTORC1.
MTOR complex 2 (mTORC2) is composed of mTOR, Rictor, GβL, Sin1, PRR5 / Protor-1, and Deptor, and promotes cell survival by activating Akt.
mTOR reflects the nutritional state of cells and controls protein synthesis, cell proliferation, angiogenesis, immunity, and the like. mTOR inhibitors have been put to practical use as anticancer agents and immunosuppressive agents.
膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；ＧＢＭ）は、ヒトにおける星状細胞系腫瘍のうちグレードＩＶに分類される、最も悪性度の高い神経膠腫（グリオーマ）である。また、ｍＴＯＲＣ１の活性が高いほど、神経膠腫（グリオーマ）の予後が悪いことが知られている（例えば、非特許文献１〜３参照。）。ｍＴＯＲＣ１によるシグナル伝達経路は神経膠腫（グリオーマ）の悪性化の進行に関与していることは明らかであるが、ラパマイシン及びその類似体等のｍＴＯＲＣ１阻害剤は、ＧＢＭの治療に有効ではない。 Glioblastoma (GBM) is the most aggressive glioma (glioma) classified as grade IV among astrocytic tumors in humans. Moreover, it is known that the higher the activity of mTORC1, the worse the prognosis of glioma (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 3). Although it is clear that the signal transduction pathway by mTORC1 is involved in the progression of malignant progression of glioma (glioma), mTORC1 inhibitors such as rapamycin and its analogs are not effective in treating GBM.
よって、Ｐ１３Ｋの活性化を刺激し、腫瘍細胞の生存を助けるフィードバックループがｍＴＯＲによるシグナル伝達経路に存在すると考えられる。このことから、基質のリン酸化を完全に阻害するＡＴＰ競合ＴＯＲ阻害剤及びＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が開発されている（例えば、非特許文献４参照。）。 Therefore, it is considered that a feedback loop that stimulates activation of P13K and helps tumor cell survival exists in the signal transduction pathway by mTOR. Based on this, ATP competitive TOR inhibitors and P13K / mTOR inhibitors that completely inhibit phosphorylation of substrates have been developed (see, for example, Non-Patent Document 4).
非特許文献４に記載されているＡＴＰ競合ＴＯＲ阻害剤及びＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、望ましくない副作用を有する可能性があり、正常組織に重大な損傷を引き起こす可能性がある。
このため、脳腫瘍への特異性が高く、脳腫瘍の治療に有効な治療薬が求められていた。
The ATP competitive TOR inhibitors and P13K / mTOR inhibitors described in Non-Patent Document 4 may have undesirable side effects and may cause significant damage to normal tissues.
Therefore, there has been a demand for a therapeutic agent that has high specificity for brain tumors and is effective in treating brain tumors.
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、脳腫瘍への特異性が高い新規の抗脳腫瘍剤を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel anti-brain tumor agent having high specificity for brain tumors.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、発明者が独自に開発したマウスの脳腫瘍モデルを用いた実験系により、脳腫瘍の治療に有効な化合物が複数見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventor has found a plurality of compounds effective for the treatment of brain tumor by an experimental system using a mouse brain tumor model uniquely developed by the inventor, and completes the present invention. It came to.
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］アモキサピン又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有することを特徴とする抗脳腫瘍剤。
［２］脳腫瘍が神経膠腫（グリオーマ）である［１］に記載の抗脳腫瘍剤。
［３］［１］又は［２］に記載の抗脳腫瘍剤及び薬学的に許容できる担体を含むことを特徴とする脳腫瘍治療用医薬組成物。
That is, the present invention includes the following aspects.
[1] An anti-brain tumor agent comprising amoxapine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[2] The anti-brain tumor agent according to [1], wherein the brain tumor is glioma.
[3] A pharmaceutical composition for treating brain tumor, comprising the anti-brain tumor agent according to [1] or [2] and a pharmaceutically acceptable carrier.
本発明によれば、脳腫瘍への特異性が高い抗脳腫瘍剤を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the anti- brain tumor agent with high specificity to a brain tumor can be provided.
＜＜抗脳腫瘍剤＞＞
一実施形態において、本発明は、アモキサピン又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する抗脳腫瘍剤を提供する。
<< Anti-brain tumor agent >>
In one embodiment, the present invention provides an anti-brain tumor agent containing amoxapine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、脳腫瘍への特異性が高く、脳腫瘍、特に悪性度の高い脳腫瘍を効果的に治療することができる。 The anti-brain tumor agent of the present embodiment has high specificity for brain tumors, and can effectively treat brain tumors, particularly brain tumors with high malignancy.
本発明者は、独自に開発したマウスの脳腫瘍モデルを用いた実験系（参考文献：Hirao,A.,et al., “Loss of Tsc1 accelerates malignant gliomagenesis when combined with oncogenic signals”, J. Biochem., vol.15, no.4, p227-233, 2014.）により、脳腫瘍に有効な化合物を複数見出し、本発明を完成させた。
上記実験系による脳腫瘍の治療に有効な化合物のスクリーニング方法について、以下に詳細に説明する。
まず、マウスのグリオーマ細胞（以下、「コントロール細胞」と称する場合がある。）と、マウスのＴｓｃ１遺伝子が欠損し、ｍＴＯＲが活性化されたグリオーマ細胞（以下、「Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞」と称する場合がある。）と、をそれぞれ同じ細胞数となるように播種する。ｍＴＯＲＣ１の活性が高いほど、神経膠腫（グリオーマ）の予後が悪いことが知られていることから、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞は、より悪性度の高いグリオーマ（例えば、膠芽腫（グリオブラストーマ）等）のモデル細胞である。
The present inventor has developed an experimental system using a mouse brain tumor model developed uniquely (Reference: Hirao, A., et al., “Loss of Tsc1 accelerates malignant gliomagenesis when combined with oncogenic signals”, J. Biochem., vol.15, no.4, p227-233, 2014.), a plurality of compounds effective for brain tumors were found and the present invention was completed.
A method for screening a compound effective for treatment of brain tumor by the above experimental system will be described in detail below.
First, mouse glioma cells (hereinafter sometimes referred to as “control cells”) and mouse glioma cells in which the Tsc1 gene is deleted and mTOR is activated (hereinafter referred to as “Tsc1 gene-deficient cells”) And so that each cell has the same number of cells. It is known that the higher the activity of mTORC1 is, the worse the prognosis of glioma (glioma) is. Therefore, Tsc1 gene-deficient cells are more highly malignant glioma (for example, glioblastoma (glioblastoma), etc. ) Model cell.
次いで、コントロール細胞及びＴｓｃ１遺伝子欠損細胞に被検化合物を添加し、４８時間程度培養する。次いで、被検化合物処理後のコントロール細胞及びＴｓｃ１遺伝子欠損細胞での細胞生存率（％）を算出する。
ここで、「生存率（％）」とは、［（特定の被検化合物処理後の生存細胞数）÷（特定の被検化合物未処理での生存細胞数）×１００］で算出された値である。例えば、化合物Ａ未処理での生存細胞数が１００個であり、化合物Ａ処理後の生存細胞数が８０個である場合、生存率は８０％となる。
次いで、それぞれの被検化合物において、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞における生存率（％）とコントロール細胞における生存率（％）とを比較し、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞における生存率（％）が低い被検化合物をスクリーニングする。
本発明者は、スクリーニングした被検化合物のうち、１３種類の被検化合物では、上記実験系によるスクリーニング方法において、高い再現性が得られることを明らかにした。さらに、１３種類の被検化合物のうち、アモキサピン、モキシフロキサシン、及びクリンダマイシンの３つの化合物が抗脳腫瘍剤として有効であることを初めて明らかにし（後述の実施例１及び図１（Ａ）〜（Ｃ）参照。）、本発明を完成するに至った。
Next, a test compound is added to the control cells and Tsc1 gene-deficient cells and cultured for about 48 hours. Subsequently, the cell viability (%) in the control cells and Tsc1 gene-deficient cells after the test compound treatment is calculated.
Here, “survival rate (%)” is a value calculated by [(number of viable cells after treatment with specific test compound) ÷ (number of viable cells without treatment with specific test compound) × 100]. It is. For example, when the number of viable cells without treatment with Compound A is 100 and the number of viable cells after treatment with Compound A is 80, the survival rate is 80%.
Next, in each test compound, the survival rate (%) in the Tsc1 gene-deficient cells is compared with the survival rate (%) in the control cells, and a test compound having a low survival rate (%) in the Tsc1 gene-deficient cells is screened. To do.
The present inventor has clarified that among the screened test compounds, 13 kinds of test compounds can obtain high reproducibility in the screening method based on the above experimental system. Furthermore, among 13 kinds of test compounds, it was revealed for the first time that three compounds of amoxapine, moxifloxacin, and clindamycin are effective as anti-brain tumor agents (Example 1 and FIG. ) To (C)), and the present invention has been completed.
＜アモキサピン＞
一実施形態において、本発明の抗脳腫瘍剤は、アモキサピン又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する。
<Amoxapine>
In one embodiment, the anti-brain tumor agent of the present invention contains amoxapine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
アモキサピンは、従来、抗うつ薬として用いられる有機化合物の一種である。アモキサピンの構造式は、下記式（１）で表される化合物である。第二世代の三環系抗うつ薬として知られ、抗コリン作用が軽減されている。うつ病、抑うつ状態、パニック障害、過食症、線維筋痛症等の治療に用いられる。
本発明者により、アモキサピン又はその薬学的に許容できる塩が抗脳腫瘍剤として有効であることが初めて明らかとなった。
Amoxapine is a kind of organic compound conventionally used as an antidepressant. The structural formula of amoxapine is a compound represented by the following formula (1). Known as a second-generation tricyclic antidepressant, it has reduced anticholinergic effects. Used for the treatment of depression, depression, panic disorder, bulimia, fibromyalgia, etc.
The present inventor has revealed for the first time that amoxapine or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective as an anti-brain tumor agent.
本明細書において、「薬学的に許容できる」とは、被検動物に適切に投与された場合に、概して、副作用を起こさない程度を意味する。 As used herein, “pharmaceutically acceptable” generally means an extent that causes no side effects when properly administered to a subject animal.
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩としては、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
塩基性塩としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩が挙げられる。
The salt is preferably a pharmaceutically acceptable acid addition salt or basic salt.
Acid addition salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid; acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, benzoic acid Examples thereof include salts with acids, organic acids such as methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid.
Examples of the basic salt include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide and magnesium hydroxide; salts with organic bases such as caffeine, piperidine, trimethylamine and pyridine.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、他の成分として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。 The anti-brain tumor agent of this embodiment may contain additives, such as buffer solutions, such as PBS and Tris-HCl, sodium azide, and glycerol, as other components.
本実施形態の抗脳腫瘍剤を用いて、脳腫瘍、特に悪性度の高い脳腫瘍の治療方法を提供することができる。
治療対象として限定はされず、ヒト又はヒト以外の哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
By using the anti-brain tumor agent of this embodiment, it is possible to provide a method for treating a brain tumor, particularly a brain tumor with a high malignancy.
The subject of treatment is not limited, and examples thereof include humans and mammals other than humans, and humans are preferred.
本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、頭蓋内に発生する全ての腫瘍が含まれ、血液、肺や胃など他の臓器由来の腫瘍であっても、転移により頭蓋内で増殖する腫瘍であれば含まれる。
前記脳腫瘍としては、発生頻度の高く代表的な神経膠腫（グリオーマ）、下垂体腺腫、神経鞘腫等が挙げられる。中でも、本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、神経膠腫（グリオーマ）であることが好ましい。
The brain tumors to be treated with the anti-brain tumor agent of this embodiment include all tumors that occur in the skull, and even if they are tumors derived from other organs such as blood, lungs, and stomach, they grow in the skull by metastasis. Included if it is a tumor.
Examples of the brain tumor include gliomas (gliomas), pituitary adenomas, schwannomas and the like that have a high frequency of occurrence. Especially, it is preferable that the brain tumor used as the treatment object of the anti-brain tumor agent of this embodiment is a glioma (glioma).
一般に、「神経膠腫（グリオーマ）」とは、神経膠（グリア）細胞から発生する腫瘍を意味する。また、「神経膠（グリア）細胞」とは、神経系（脳及び脊髄等）を構成する神経細胞ではない細胞の総称であり、神経に栄養を与え、神経の活動を支える役割を果たしている。
グリオーマには、様々な種類及び悪性度があり、例えば、表１に示すように分類できる。
In general, "glioma" means a tumor that arises from glia cells. “Glial cells” are a general term for cells that are not neurons that constitute the nervous system (brain, spinal cord, etc.), and play a role of feeding the nerves and supporting the activities of the nerves.
There are various types and grades of glioma, and for example, they can be classified as shown in Table 1.
表１において、「悪性度」とは、グレード（ｇｒａｄｅ）ともいい、細胞の顕微鏡観察所見の異常、又は増殖及び転移速度の予測に基づいて評価されるものである。悪性度は、表２に示すように分類できる（参考文献：中里洋一、脳腫瘍の新ＷＨＯ分類、脳神経外科 ３６：４７３−４９１，２００８）。 In Table 1, “grade” is also referred to as a grade, and is evaluated based on abnormalities in microscopic observation of cells or prediction of growth and metastasis rates. The grade of malignancy can be classified as shown in Table 2 (reference: Yoichi Nakazato, new WHO classification of brain tumor, neurosurgery 36: 473-491, 2008).
表２において、ＭＩＢ−１とは、抗Ｋｉ−６７抗体のクローンの１つであって、増殖の程度を表わす細胞増殖マーカーである。また、Ｋｉ−６７は乳癌、胃癌、大腸癌、子宮癌など多くの腫瘍において、分化度、血管侵襲及びリンパ節転移といった腫瘍の悪性度や予後とよく相関することが知られており、細胞増殖マーカーとして非常に有用である。 In Table 2, MIB-1 is one of anti-Ki-67 antibody clones and is a cell proliferation marker representing the degree of proliferation. Ki-67 is known to correlate well with tumor malignancy and prognosis such as differentiation, vascular invasion, and lymph node metastasis in many tumors such as breast cancer, stomach cancer, colon cancer, and uterine cancer. Very useful as a marker.
上述したグリオーマは、様々な種類又は悪性度のグリオーマが混ざっていることが多く、同じ病名でも抗がん剤の効果、放射線治療の効果、生命予後等が異なる。
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、上述した全ての種類又は悪性度のグリオーマを効果的に治療することができ、特に、高悪性度のグリオーマであるグレード３、４の膠芽腫（グリオブラストーマ）を効果的に治療することができる。
The above-mentioned glioma is often mixed with gliomas of various types or malignancy, and the effects of anticancer agents, the effects of radiation therapy, life prognosis, etc. are different even in the same disease name.
The anti-brain tumor agent of this embodiment can effectively treat all the above-mentioned types or malignant gliomas, and in particular, grade 3 and 4 glioblastomas (glioblastomas) which are high-grade gliomas. ) Can be effectively treated.
＜モキシフロキサシン＞
他の実施形態において、本発明の抗脳腫瘍剤は、モキシフロキサシン又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する。
<Moxifloxacin>
In another embodiment, the anti-brain tumor agent of the present invention contains moxifloxacin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
モキシフロキサシンは、従来、ニューキノロン系抗菌薬として用いられる有機化合物の一種である。モキシフロキサシンの構造式は、下記式（２）で表される化合物である。表在性皮膚感染症、深在性皮膚感染症、外傷・熱傷及び手術創等の二次感染、咽頭及び喉頭炎、扁桃炎、急性気管支炎、肺炎、慢性呼吸器病変の二次感染、副鼻腔炎、眼瞼炎、涙嚢炎、麦粒腫、結膜炎、瞼板腺炎、角膜炎（角膜潰瘍を含む）等の治療に用いられている。
本発明者により、モキシフロキサシン又はその薬学的に許容できる塩が抗脳腫瘍剤として有効であることが初めて明らかとなった。
Moxifloxacin is a kind of organic compound conventionally used as a new quinolone antibacterial agent. The structural formula of moxifloxacin is a compound represented by the following formula (2). Superficial skin infection, deep skin infection, secondary infection such as trauma / burn and surgical wound, pharyngeal and laryngitis, tonsillitis, acute bronchitis, pneumonia, secondary infection of chronic respiratory lesions, secondary infection It is used for the treatment of rhinosinitis, blepharitis, lacrimal cystitis, stye, conjunctivitis, pleuriditis, keratitis (including corneal ulcer) and the like.
The inventor has revealed for the first time that moxifloxacin or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective as an anti-brain tumor agent.
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩及び塩基性塩としては、上述の＜アモキサピン＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
The salt is preferably a pharmaceutically acceptable acid addition salt or basic salt.
Examples of the acid addition salt and the basic salt include those exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、他の成分として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。 The anti-brain tumor agent of this embodiment may contain additives, such as buffer solutions, such as PBS and Tris-HCl, sodium azide, and glycerol, as other components.
本実施形態の抗脳腫瘍剤を用いて、脳腫瘍、特に悪性度の高い脳腫瘍の治療方法を提供することができる。
治療対象として限定はされず、ヒト又はヒト以外の哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
By using the anti-brain tumor agent of this embodiment, it is possible to provide a method for treating a brain tumor, particularly a brain tumor with a high malignancy.
The subject of treatment is not limited, and examples thereof include humans and mammals other than humans, and humans are preferred.
本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、上述の＜アモキサピン＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、グリオーマであることが好ましい。 Examples of the brain tumor to be treated with the anti-brain tumor agent of the present embodiment include the same as those exemplified in the above <Amoxapine>. Especially, it is preferable that the brain tumor used as the treatment object of the anti-brain tumor agent of this embodiment is a glioma.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、上述の＜アモキサピン＞において例示された全ての種類又は悪性度のグリオーマを効果的に治療することができ、特に、高悪性度のグリオーマであるグレード３、４の膠芽腫（グリオブラストーマ）を効果的に治療することができる。 The anti-brain tumor agent of this embodiment can effectively treat all types or malignant gliomas exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>, and in particular, grades 3 and 4 which are high-grade gliomas. Glioblastoma (glioblastoma) can be effectively treated.
＜クリンダマイシン＞
他の実施形態において、本発明の抗脳腫瘍剤は、クリンダマイシン又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する。
<Clindamycin>
In another embodiment, the anti-brain tumor agent of the present invention contains clindamycin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
クリンダマイシンは、従来、リンコマイシン系抗菌薬として用いられる有機化合物の一種である。クリンダマイシンの構造式は、下記式（３）で表される化合物である。誤嚥性肺炎（嚥下性肺炎）、口腔内感染症、ペニシリンアレルギーがある場合の咽頭炎や副鼻腔炎、腹腔内感染症、ＣＡ−ＭＲＳＡ（市中獲得型ＭＲＳＡ）感染症、表在性皮膚感染症、深在性皮膚感染症等の治療に用いられている。
本発明者により、クリンダマイシン又はその薬学的に許容できる塩が抗脳腫瘍剤として有効であることが初めて明らかとなった。
Clindamycin is a kind of organic compound conventionally used as a lincomycin antibacterial agent. The structural formula of clindamycin is a compound represented by the following formula (3). Aspiration pneumonia (swallowing pneumonia), oral infection, pharyngitis and sinusitis in the presence of penicillin allergy, intraperitoneal infection, CA-MRSA (community acquired MRSA) infection, superficial skin It is used for the treatment of infections, deep skin infections, etc.
The present inventor has revealed for the first time that clindamycin or a pharmaceutically acceptable salt thereof is effective as an anti-brain tumor agent.
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩及び塩基性塩としては、上述の＜アモキサピン＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
The salt is preferably a pharmaceutically acceptable acid addition salt or basic salt.
Examples of the acid addition salt and the basic salt include those exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、他の成分として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤を含んでいてもよい。 The anti-brain tumor agent of this embodiment may contain additives, such as buffer solutions, such as PBS and Tris-HCl, sodium azide, and glycerol, as other components.
本実施形態の抗脳腫瘍剤を用いて、脳腫瘍、特に悪性度の高い脳腫瘍の治療方法を提供することができる。
治療対象として限定はされず、ヒト又はヒト以外の哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
By using the anti-brain tumor agent of this embodiment, it is possible to provide a method for treating a brain tumor, particularly a brain tumor with a high malignancy.
The subject of treatment is not limited, and examples thereof include humans and mammals other than humans, and humans are preferred.
本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、上述の＜アモキサピン＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の抗脳腫瘍剤の治療対象となる脳腫瘍は、グリオーマであることが好ましい。 Examples of the brain tumor to be treated with the anti-brain tumor agent of the present embodiment include the same as those exemplified in the above <Amoxapine>. Especially, it is preferable that the brain tumor used as the treatment object of the anti-brain tumor agent of this embodiment is a glioma.
本実施形態の抗脳腫瘍剤は、上述の＜アモキサピン＞において例示された全ての種類又は悪性度のグリオーマを効果的に治療することができ、特に、高悪性度のグリオーマであるグレード３、４の膠芽腫（グリオブラストーマ）を効果的に治療することができる。 The anti-brain tumor agent of this embodiment can effectively treat all types or malignant gliomas exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>, and in particular, grades 3 and 4 which are high-grade gliomas. Glioblastoma (glioblastoma) can be effectively treated.
＜＜脳腫瘍治療用医薬組成物＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の抗脳腫瘍剤及び薬学的に許容できる担体を含む脳腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
<< Pharmaceutical composition for treatment of brain tumor >>
In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating brain tumor comprising the above-mentioned anti-brain tumor agent and a pharmaceutically acceptable carrier.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物によれば、脳腫瘍、特に悪性度の高い脳腫瘍を効果的に治療することができる。 According to the pharmaceutical composition for brain tumor treatment of the present embodiment, it is possible to effectively treat brain tumors, particularly brain tumors with high malignancy.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物の治療対象となる脳腫瘍は、上述の＜アモキサピン＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物の治療対象となる脳腫瘍は、グリオーマであることが好ましい。 Examples of the brain tumor to be treated by the pharmaceutical composition for treating brain tumor of the present embodiment include those exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>. Especially, it is preferable that the brain tumor used as the treatment object of the pharmaceutical composition for brain tumor treatment of this embodiment is a glioma.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物は、上述の＜アモキサピン＞において例示された全ての種類又は悪性度のグリオーマを効果的に治療することができ、特に、高悪性度のグリオーマであるグレード３、４の膠芽腫（グリオブラストーマ）を効果的に治療することができる。 The pharmaceutical composition for treating brain tumor of the present embodiment can effectively treat all types or malignant gliomas exemplified in the above-mentioned <Amoxapine>, and in particular, grade 3 which is a high-grade glioma. 4 glioblastomas (glioblastomas) can be effectively treated.
＜組成成分＞
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物は、治療的に有効量の上述の抗脳腫瘍剤及び薬学的に許容されうる担体を含む。薬学的に許容されうる担体としては、通常製剤に用いられる賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
<Composition component>
The pharmaceutical composition for treating brain tumor of this embodiment comprises a therapeutically effective amount of the above-mentioned anti-brain tumor agent and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, viscous, which are commonly used in pharmaceutical preparations. Agents, flavoring agents, solubilizers, additives and the like. By using one or more of these carriers, pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions, syrups and the like can be prepared.
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上述の抗脳腫瘍剤の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、上述の抗脳腫瘍剤の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えばポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の臓器、組織、又は細胞へ、上述の抗脳腫瘍剤を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。 A colloidal dispersion system can also be used as the carrier. The colloidal dispersion system is expected to have an effect of increasing the in vivo stability of the antibrain tumor agent described above and an effect of increasing the migration property of the antibrain tumor agent described above to a specific organ, tissue, or cell. Examples of the colloidal dispersion include lipids including, for example, polyethylene glycol, polymer composites, polymer aggregates, nanocapsules, microspheres, beads, oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and liposomes. Liposomes and artificial membrane vesicles that are effective in efficiently transporting the above-mentioned anti-brain tumor agent to specific organs, tissues, or cells are preferred.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
Examples of formulation in the pharmaceutical composition for treating brain tumor of the present embodiment include those used orally as tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as necessary.
Or what is used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension. Furthermore, a pharmacologically acceptable carrier or diluent, specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, Examples thereof include those formulated by mixing with a preservative, a binder and the like, and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。 Additives that can be mixed into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling such as corn starch, gelatin, and alginic acid Agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red mono oil or cherry. When the dispensing unit form is a capsule, the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物が注射剤である場合、無菌組成物は、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤（例えば、アルコール（具体的には、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等））、又は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）と併用してもよい。 When the pharmaceutical composition for treating brain tumor of the present embodiment is an injection, the sterile composition can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection. Examples of aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and the like. An adjuvant (for example, alcohol (specifically, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.)) or nonionic surfactant (for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) You may use together.
また、油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、又は酸化防止剤をさらに配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。 Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil. As the solubilizer, for example, benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination. Further, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), a soothing agent (eg, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), or an antioxidant is further added. May be. The prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類等）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。 Injectables can also be prepared as non-aqueous diluents (eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, or emulsions. Such sterilization of injections can be performed by blending filter sterilization with a filter, bactericides, and the like. Injectables can be manufactured in the form of business preparation. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in distilled water for injection or other solvent before use.
本実施形態の医薬組成物は、単独で用いてもよく、その他の脳腫瘍治療用医薬組成物と組み合わせて用いてもよい。 The pharmaceutical composition of this embodiment may be used alone or in combination with other pharmaceutical compositions for treating brain tumors.
＜投与量及び投与方法＞
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物は、患者又は患畜の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。また、投与方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、腹腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
<Dose and administration method>
The pharmaceutical composition for treating brain tumor of this embodiment is appropriately adjusted in consideration of the age, sex, weight, symptom, treatment method, administration method, treatment time, etc. of the patient or livestock. As the administration method, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intranasal, intraperitoneal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or oral method known to those skilled in the art Is mentioned.
本実施形態の脳腫瘍治療用医薬組成物に含まれる上述の抗脳腫瘍剤の投与量は、症状及び抗脳腫瘍剤に含まれる有効成分（アモキサピン、モキシフロキサシン、又はクリンダマイシン）の種類により差異はあるが、有効成分がアモキサピンである場合、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり２５〜３００ｍｇを経口投与することが挙げられる。また、有効成分がモキシフロキサシンである場合、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり２００〜４００ｍｇを経口投与することが挙げられる。また、有効成分がクリンダマイシンである場合、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり６００〜１，２００ｍｇ（力価）を点滴静注することが挙げられる。抗脳腫瘍剤は、上記の投与量となるように１日に１回投与してもよいし、１日に複数回投与してもよい。 The dose of the above-mentioned anti-brain tumor agent contained in the pharmaceutical composition for treatment of brain tumor of the present embodiment varies depending on the symptoms and the type of active ingredient (amoxapine, moxifloxacin, or clindamycin) contained in the anti-brain tumor agent. However, when the active ingredient is amoxapine, 25 to 300 mg per day for an adult (body weight 60 kg) can be administered orally. Moreover, when an active ingredient is moxifloxacin, 200-400 mg is orally administered to an adult (body weight 60 kg) per day. Moreover, when an active ingredient is clindamycin, it is mentioned that an adult (body weight 60 kg) is intravenously infused with 600 to 1,200 mg (titer) per day. The anti-brain tumor agent may be administered once a day so as to achieve the above dose, or may be administered a plurality of times a day.
＜治療方法＞
本発明の一側面は、脳腫瘍の治療のための上述の抗脳腫瘍剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の上述の抗脳腫瘍剤、並びに薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む脳腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、脳腫瘍の治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、脳腫瘍の治療剤を製造するための上述の抗脳腫瘍剤の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上述の抗脳腫瘍剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、脳腫瘍の治療方法を提供する。
<Treatment method>
One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the above-described anti-brain tumor agent for the treatment of brain tumors.
One aspect of the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating brain tumor comprising a therapeutically effective amount of the above-described anti-brain tumor agent and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
Moreover, one aspect of the present invention provides a therapeutic agent for brain tumor, comprising the pharmaceutical composition.
One aspect of the present invention provides use of the above-described anti-brain tumor agent for producing a therapeutic agent for a brain tumor.
Another aspect of the present invention provides a method for treating brain tumor, comprising administering an effective amount of the above-described anti-brain tumor agent to a patient in need of treatment.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］抗脳腫瘍剤として有効な化合物のスクリーニング
（１）マウスＴｓｃ１遺伝子欠損細胞の作製
まず、Ｔｓｃ１ｆ／ｆ；Ｒｏｓａ２６−ＣｒｅＥＲＴ２マウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ：ＳＶＺ）から神経幹／前駆細胞 （ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ： ＮＳＰＣ）を単離した。次いで、ＮＳＰＣをＣｏｓｔａｒ（登録商標） Ｕｌｔｒａ−ＬＯＷ 付着性マルチウェルプレート（コースター社製）に播種し、血清不含のＮＳＰＣ培地を用いて培養した。ＮＳＰＣ培地の組成成分としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ライフテクノロジー社製）、Ｂ２７（登録商標）サプリメント（ライフテクノロジー社製）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、０．５％ストレプトマイシン（ライフテクノロジー社製））、２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）である。
[Example 1] Screening of compounds effective as anti-brain tumor agents (1) Preparation of mouse Tsc1 gene-deficient cells First, nerve trunk from Tsc1 f / f ; Rosa26-CreER T2 mouse subventricular zone (SVZ) / Progenitor cells (NSPC) were isolated. Next, NSPC was seeded on a Costar (registered trademark) Ultra-LOW adherent multiwell plate (manufactured by Coaster) and cultured using NSPC medium without serum. As composition components of the NSPC medium, DMEM / F12 medium (Life Technology), B27 (registered trademark) supplement (Life Technology), 50 U / mL penicillin, 0.5% streptomycin (Life Technology)), These are 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma).
次いで、レトロウイルス産生用パッケージング細胞に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びヒト化されたクサビラオレンジ（ｈｕＫＯ）の発現ベクターを導入した。次いで、導入後の培養上清を６，０００×ｇ、１６時間遠心し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｈｕＫＯを発現するレトロウイルスを得た。 Next, EGFRvIII and a humanized wedge orange (huKO) expression vector were introduced into packaging cells for retrovirus production. Subsequently, the culture supernatant after introduction was centrifuged at 6,000 × g for 16 hours to obtain a retrovirus expressing EGFRvIII and huKO.
次いで、ＮＳＰＣにＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｈｕＫＯを発現するレトロウイルスを添加し、２４時間培養し、感染させた。次いで、形質転換されたＮＳＰＣについて、単一の細胞を分離し、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁した。次いで、形質転換されたＮＳＰＣのうち１×１０４個を、麻酔をしたＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの脳内に移植した。 Next, retroviruses expressing EGFRvIII and huKO were added to NSPC, and cultured for 24 hours for infection. For transformed NSPC, single cells were then separated and resuspended in PBS containing 5% FBS. Then 1 × 10 4 of the transformed NSPCs were transplanted into the brain of anesthetized Balb / c nu / nu mice.
次いで、脳内に細胞を移植されたマウスから腫瘍組織を摘出し、Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、グリオーマ細胞を分離した。次いで、分離されたグリオーマ細胞において、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩを用いて、ｈｕＫＯ＋細胞を選別した。 Next, tumor tissues were removed from the mice transplanted with cells in the brain, and glioma cells were isolated using Brain Tumor Dissociation Kit. Subsequently, hu KO + cells were selected from the separated glioma cells using BD FACSAria III.
次いで、０．１μＭ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ （４−ＯＨＴ）（シグマ社製）含有完全ＮＳＰＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）含有）を用いて、ｈｕＫＯ＋細胞を３日間培養した。次いで、培養細胞を洗浄して４−ＯＨＴを取り除き、完全ＮＳＰＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）含有）でさらに２日間培養して、Ｔｓｃ１遺伝子欠損グリオーマ細胞（以下、「Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞」と称する場合がある。）を得た。また、コントロールとして、４−ＯＨＴ処理をしていないグリオーマ細胞（以下、「コントロール細胞」と称する場合がある。）も準備した。 Next, a complete NSPC medium (containing 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma)) containing 0.1 μM 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (manufactured by Sigma) was used. , HuKO + cells were cultured for 3 days. Next, the cultured cells were washed to remove 4-OHT, and cultured in complete NSPC medium (containing 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma)) for another 2 days. Tsc1 gene-deficient glioma cells (hereinafter sometimes referred to as “Tsc1 gene-deficient cells”) were obtained. Further, glioma cells not treated with 4-OHT (hereinafter sometimes referred to as “control cells”) were also prepared as controls.
（２）抗脳腫瘍剤として有効な化合物のスクリーニング
次いで、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞をそれぞれ同じ細胞数となるように３８４ウェルプレート（コーニング社製）に播種し、ドラッグライブラリに登録されている複数の化合物を、１μＭ、５μＭ、及び２０μＭと濃度をふって添加し、４８時間培養した。使用したドラックライブラリとしては、ＦＤＡ−ａｐｐｒｏｖｅｄ ｄｒｕｇ ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ；ＣＢ−ＭＬ−２８４１Ｊ０１００）、ＩＣＣＢ ｋｎｏｗｎ ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ；ＣＢ−ＢＭＬ−２８４０Ｊ０１００）、ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ；ＣＢ−ＢＭＬ−２８３２Ｊ０１００）、ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ；ＣＢ−ＢＭＬ−２８０３Ｊ０１００） 、及び ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ；ＣＢ―ＢＭＬ−２８３４Ｊ０１００）である。また、細胞生存率を算出するために、化合物未処理のＴｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞も準備した。
(2) Screening of compounds effective as anti-brain tumor agents Next, Tsc1 gene-deficient cells and control cells are seeded in 384 well plates (Corning) so as to have the same number of cells, and a plurality of compounds registered in a drug library are registered. Were added at concentrations of 1 μM, 5 μM, and 20 μM and incubated for 48 hours. As the drug library used, FDA-applied drug library (ENZO; CB-ML-2841J0100), ICCB known bioactives library (ENZO; CB-BML-2840J0100), Kinase inhibitC32 acid library (ENZO; CB-BML-2803J0100) and phosphatase inhibitor library (ENZO; CB-BML-2835J0100). In addition, in order to calculate the cell viability, Tsc1 gene-deficient cells and control cells not treated with the compound were also prepared.
次いで、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁化学研究所製）を用いて、生存している細胞を測定した。具体的には、ＷＳＴ−８剤を用いて３０分間インキュベーションし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ２００（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。化合物未処理のＴｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞における４５０ｎｍでの吸光度と比較することで、細胞生存率を算出した。 Next, the surviving cells were measured using Cell Counting Kit (manufactured by Dojindo Laboratories). Specifically, it was incubated for 30 minutes using WST-8 agent, and the absorbance at 450 nm was measured using Infinite Pro200 (manufactured by Tecan). The cell viability was calculated by comparison with the absorbance at 450 nm in compound-untreated Tsc1 gene-deficient cells and control cells.
この結果、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞での細胞生存率が、コントロール細胞での細胞生存率での細胞生存率よりも低くなる化合物が３７種類得られた（図示せず。）。
さらに、そのうち、１３種類の化合物について、高い再現性が得られた。中でも、アモキサピン、モキシフロキサシン、及びクリンダマイシンの３つの化合物が抗脳腫瘍剤として有効であることが初めて明らかとなった。
アモキサピン、モキシフロキサシン、及びクリンダマイシンを用いた場合におけるＴｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞での細胞生存率を図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図１（Ａ）〜（Ｃ）において、横軸はそれぞれの化合物の細胞に添加した濃度を示し、縦軸は、細胞生存率（％）を示す。また、図１（Ａ）〜（Ｃ）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、コントロール細胞を示し、「Ｔｓｃ１−／−」はＴｓｃ１遺伝子欠損細胞を示す。
As a result, 37 types of compounds were obtained in which the cell viability in the Tsc1 gene-deficient cells was lower than that in the control cells (not shown).
Furthermore, high reproducibility was obtained for 13 types of compounds. Among them, it has been revealed for the first time that three compounds of amoxapine, moxifloxacin, and clindamycin are effective as antibrain tumor agents.
Cell survival rates in Tsc1 gene-deficient cells and control cells in the case of using amoxapine, moxifloxacin, and clindamycin are shown in FIGS. 1A to 1C, the horizontal axis indicates the concentration of each compound added to the cells, and the vertical axis indicates the cell viability (%). 1A to 1C, “Control” indicates a control cell, and “Tsc1 − / −” indicates a Tsc1 gene-deficient cell.
図１（Ａ）〜（Ｃ）から、いずれの化合物においても、Ｔｓｃ１遺伝子欠損細胞での生存率が、コントロール細胞での生存率よりも低く、ｍＴＯＲが活性化されているＴｓｃ１遺伝子欠損細胞、すなわちより悪性度の高いグリオーマ細胞に有効な抗腫瘍剤となり得る可能性が示唆された。 From FIGS. 1 (A) to (C), in any compound, the survival rate of Tsc1 gene-deficient cells is lower than the survival rate of control cells, and mTOR is activated, ie, This suggests the possibility of becoming an effective antitumor agent for glioma cells with higher malignancy.
［実施例２］アモキサピン処理したヒト膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；ＧＢＭ）患者由来細胞株におけるミトコンドリア膜電位測定試験
（１）アモキサピン処理
細胞としては、ヒト膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ；ＧＢＭ）患者由来細胞株であるＴＧＳ−０１及びＴＧＳ−０４を用いた。次いで、２０μＭのアモキサピンを添加、又は無添加条件下において、ＴＧＳ−０１及びＴＧＳ−０４をそれぞれ３０分間培養した。
Example 2 Mitochondrial Membrane Potential Measurement Test in Amoxapine-treated Human Glioblastoma (GBM) Patient-Derived Cell Line (1) Amoxapine-treated Cells are human glioblastoma (GBM) patient-derived cell lines Some TGS-01 and TGS-04 were used. Subsequently, TGS-01 and TGS-04 were each incubated for 30 minutes with or without 20 μM amoxapine.
（２）ミトコンドリア膜電位測定
次いで、アモキサピン処理及び未処理のＴＧＳ−０１及びＴＧＳ−０４に、ＪＣ−１０ ｄｙｅ ｂｕｆｆｅｒ（アブカム社製）を添加し、５％ＣＯ２条件下で、３７℃、３０分間インキュベーションした。ＪＣ−１０ ｄｙｅは、ミトコンドリア膜電位依存的な蓄積を呈し、これは緑色（約５２９ｎｍ）から赤色（約５９０ｎｍ）への蛍光波長シフトによって示される。このため、ミトコンドリアの脱分極は、赤色／緑色の蛍光強度比の減少によって示される。
次いで、ＰＢＳで洗浄し、５３０ｎｍ及び５８５ｎｍのバンドパスフォルターを装着したフローサイトメーターにより４８８ｎｍの励起波長で解析した。結果を図２（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図２（Ａ）及び（Ｂ）において、「Ａｍｏｘａｐｉｎｅ（−）」とはアモキサピン未処理のＴＧＳ−０１又はＴＧＳ−０４を示し、「Ａｍｏｘａｐｉｎｅ（＋）」とはアモキサピン処理のＴＧＳ−０１又はＴＧＳ−０４を示す。
(2) Mitochondrial membrane potential measurement Next, JC-10 dye buffer (manufactured by Abcam) was added to amoxapine-treated and untreated TGS-01 and TGS-04, and 37 ° C, 30% under 5% CO 2 conditions. Incubated for minutes. JC-10 dye exhibits a mitochondrial membrane potential dependent accumulation, which is indicated by a fluorescence wavelength shift from green (about 529 nm) to red (about 590 nm). Thus, mitochondrial depolarization is indicated by a decrease in the red / green fluorescence intensity ratio.
Subsequently, it was washed with PBS, and analyzed with a flow cytometer equipped with bandpass filters of 530 nm and 585 nm at an excitation wavelength of 488 nm. The results are shown in FIGS. 2 (A) and (B). In FIGS. 2A and 2B, “Amoxpine (−)” indicates TGS-01 or TGS-04 not treated with amoxapine, and “Amoxapine (+)” indicates TGS-01 or TGS- treated with amoxapine. 04 is shown.
図２（Ａ）及び（Ｂ）から、アモキサピン処理によりミトコンドリアの膜電位が変化することが確かめられた。本発明者は、ｍＴＯＲが活性化されているグリオーマ細胞では、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化をエネルギー源としていることをすでに確かめている。よって、膜電位を変化させ、酸化的リン酸化を阻害するアモキサピンは、ｍＴＯＲが活性化されているグリオーマ細胞、すなわち悪性度の高いグリオーマ細胞に有効な抗腫瘍剤となり得ることが示唆された。 2 (A) and (B), it was confirmed that the membrane potential of mitochondria was changed by amoxapine treatment. The present inventor has already confirmed that mitochondrial oxidative phosphorylation is an energy source in glioma cells in which mTOR is activated. Thus, it was suggested that amoxapine, which changes the membrane potential and inhibits oxidative phosphorylation, can be an effective antitumor agent for glioma cells in which mTOR is activated, that is, glioma cells with high malignancy.
［実施例３］アモキサピン処理したヒトＧＢＭ患者由来細胞株及びマウスＧＢＭモデル細胞におけるＡＴＰの定量試験
（１）アモキサピン処理
細胞としては、ヒトＧＢＭ患者由来細胞株ＴＧＳ−０１及びＴＧＳ−０４、並びに実施例１で作製したＴｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞を用いた。
まず、それぞれの細胞を９６ウェル又は３８４ウェル低接着プレート（コーニング社製）に播種し、ＤＭＳＯ、又は１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、若しくは５０μＭのアモキサピン添加し、４８時間培養した。
[Example 3] Quantitative test of ATP in a human GBM patient-derived cell line and mouse GBM model cell treated with amoxapine (1) Amoxapine-treated cells include human GBM patient-derived cell lines TGS-01 and TGS-04, and Examples The Tsc1 gene-deficient cells and control cells prepared in 1 were used.
First, each cell was seeded on a 96-well or 384-well low adhesion plate (Corning), DMSO, or 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, or 50 μM amoxapine was added and cultured for 48 hours.
（２）ＡＴＰの定量
次いで、それぞれの細胞に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（プロメガ社製）を添加し、撹拌して１０分間静置した。次いで、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ２００（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて、発光を検出し、細胞内在性のＡＴＰ量を測定した。結果を図３（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図３（Ａ）〜（Ｃ）において、横軸はＤＭＳＯ、又はアモキサピンの濃度を示し、縦軸は発光強度を示す。また、図（Ｃ）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、コントロール細胞を示し、「Ｔｓｃ１−／−」はＴｓｃ１遺伝子欠損細胞を示す。
(2) Quantification of ATP Subsequently, CellTiter-Glo (registered trademark) (manufactured by Promega) was added to each cell, stirred and allowed to stand for 10 minutes. Next, luminescence was detected using Infinite Pro200 (manufactured by Tecan), and the amount of ATP endogenous to the cells was measured. The results are shown in FIGS. 3A to 3C, the horizontal axis represents DMSO or amoxapine concentration, and the vertical axis represents emission intensity. In FIG. (C), “Control” indicates a control cell, and “Tsc1 − / −” indicates a Tsc1 gene-deficient cell.
図３（Ａ）及び（Ｂ）から、アモキサピンの濃度が２０μＭ以上において、細胞内在性のＡＴＰ量が低下しており、図３（Ｃ）から、アモキサピンの濃度が５０μＭ以上において、細胞内在性のＡＴＰ量が低下していた。この差は、ヒトとマウスとの違いによるものであると推察された。
また、図３（Ａ）〜（Ｃ）から、アモキサピンの濃度依存的に、顕著なＡＴＰ合成阻害効果が見られることが確かめられた。
3 (A) and 3 (B), the amount of endogenous ATP is reduced when the concentration of amoxapine is 20 μM or more, and from FIG. 3 (C), the concentration of cellular endogenous is reduced when the concentration of amoxapine is 50 μM or more. The amount of ATP was decreasing. This difference was presumed to be due to the difference between humans and mice.
Further, from FIGS. 3A to 3C, it was confirmed that a significant ATP synthesis inhibitory effect was observed depending on the concentration of amoxapine.
［実施例４］アモキサピン処理したヒトＧＢＭ患者由来細胞株及びマウスＧＢＭモデル細胞におけるスフィア形成アッセイ
実施例１で作製したＴｓｃ１遺伝子欠損細胞及びコントロール細胞について、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞の懸濁液を調製し、４０μｍセルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いてろ過した。次いで、ヒトＧＢＭ患者由来細胞株ＴＧＳ−０１及びＴＧＳ−０４、並びにろ過したＴｓｃ１遺伝子欠損グリオーマ細胞及びコントロール細胞を５×１０２細胞ずつ低接着プレート（コーニング社製）に播種した。次いで、ＤＭＳＯ、又は各濃度のアモキサピン、及び１％メチルセルロース含有ＮＳＰＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）含有）を用いて、７日間培養した。結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
図４（Ａ）〜（Ｃ）において、横軸はＤＭＳＯ、又はアモキサピンの濃度を示し、５×１０２細胞播種したうち形成されたスフィア数を示す。また、図４（Ｃ）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、コントロール細胞を示し、「Ｔｓｃ１−／−」はＴｓｃ１遺伝子欠損細胞を示す。
[Example 4] Sphere formation assay in a human GBM patient-derived cell line and mouse GBM model cell treated with amoxapine Regarding the Tsc1 gene-deficient cells and control cells prepared in Example 1, Accutase (registered trademark) (manufactured by Innovative Cell Technologies) A single cell suspension was prepared using, and filtered using a 40 μm cell strainer (BD Biosciences). Subsequently, human GBM patient-derived cell lines TGS-01 and TGS-04, and filtered Tsc1 gene-deficient glioma cells and control cells were seeded on 5 × 10 2 cells on a low adhesion plate (Corning). Subsequently, it was cultured for 7 days using DMSO or amoxapine at various concentrations and NSPC medium containing 1% methylcellulose (containing 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma)). . The results are shown in FIGS.
4A to 4C, the horizontal axis indicates the concentration of DMSO or amoxapine, and indicates the number of spheres formed while seeding 5 × 10 2 cells. In FIG. 4C, “Control” indicates a control cell, and “Tsc1 − / −” indicates a Tsc1 gene-deficient cell.
図４（Ａ）及び（Ｂ）から、アモキサピン濃度が１０μＭ以上において、スフィア形成数が減少していた。また、図４（Ｃ）から、アモキサピン濃度が１μＭ以上において、スフィア形成数が減少していた。この差は、ヒトとマウスとの違いによるものであると推察された。
また、図４（Ａ）〜（Ｃ）から、アモキサピンの濃度依存的に、スフィア形成能の低下、すなわちグリオーマ細胞の増殖抑制効果が見られることが確かめられた。
4A and 4B, the number of spheres formed was reduced when the amoxapine concentration was 10 μM or more. In addition, from FIG. 4C, the number of spheres formed was reduced when the amoxapine concentration was 1 μM or more. This difference was presumed to be due to the difference between humans and mice.
4 (A) to 4 (C), it was confirmed that the sphere-forming ability was decreased, that is, the proliferation inhibitory effect of glioma cells was seen depending on the concentration of amoxapine.
［実施例５］アモキサピン処理したヒトＧＢＭ患者由来細胞株におけるタンパク質合成確認試験
（１）アモキサピン処理
細胞としては、ヒトＧＢＭ患者由来細胞株ＴＧＳ−０１を用いた。まず、ＴＧＳ−０１を９６ウェル低接着プレート（コーニング社製）に播種した。次いで、ＤＭＳＯ、又は２０μＭのアモキサピン、及び１μｇ／ｍＬピューロマイシン含有ＮＳＰＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）含有）を用いて、４８時間培養した。ピューロマイシンは、細胞内の翻訳中のペプチドに取り込まれるため、細胞内におけるタンパク質合成の指標となる。
[Example 5] Protein synthesis confirmation test in amoxapine-treated human GBM patient-derived cell line (1) Amoxapine-treated As a cell, human GBM patient-derived cell line TGS-01 was used. First, TGS-01 was seeded on a 96-well low adhesion plate (Corning). Subsequently, DMSO or 20 μM amoxapine and 1 μg / mL puromycin-containing NSPC medium (containing 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma)) were cultured for 48 hours. did. Puromycin is incorporated into a peptide during translation in the cell, and thus serves as an index for protein synthesis in the cell.
（２）ウェスタンブロッティング法によるピューロマイシンの検出
次いで、各条件で培養した細胞を回収し、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）、４％ＳＤＳ、リン酸化酵素阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、プロテアーゼインヒビターカクテル錠Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロッシュ社製）含有）を用いて、細胞破砕液を調製した。次いで、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、細胞破砕液に含まれるタンパク質量を定量した。次いで、５μｇのタンパク質量となるように調製した各条件の細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、分画した。次いで、分画したタンパク質を０．４５ｍｍＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）に転写し、５％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳを用いて、ブロッキングした。次いで、ヤギ抗ピューロマイシン抗体を用いて、４℃でオーバーナイト１次抗体による抗原抗体反応を行った。次いで、ＨＲＰ結合抗ヤギ抗体を用いて２次抗体による抗原抗体反応を行い、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、検出した。結果を図５に示す。
(2) Detection of puromycin by Western blotting Subsequently, cells cultured under each condition were collected, and Lysis Buffer (0.1 M Tris (pH 6.7), 4% SDS, phosphorylase inhibitor (Thermo Fisher Scientific, Inc.) Cell disruption solution was prepared using Protease Inhibitor Cocktail Tablet Complete Mini (manufactured by Roche). Subsequently, the amount of protein contained in the cell lysate was quantified using BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Subsequently, the cell lysate of each condition prepared so that it might become a protein amount of 5 micrograms was fractionated using SDS-PAGE. Next, the fractionated protein was transferred to a 0.45 mm PVDF membrane (Millipore) and blocked using PBS containing 5% BSA and 0.02% Tween 20. Subsequently, an antigen-antibody reaction with an overnight primary antibody was performed at 4 ° C. using a goat anti-puromycin antibody. Subsequently, an antigen-antibody reaction with a secondary antibody was performed using an HRP-conjugated anti-goat antibody, and detection was performed using ECL Prime (manufactured by GE Healthcare). The results are shown in FIG.
図５から、２０μＭのアモキサピン処理したＴＧＳ−０１では、ほとんどバンドが検出されなかった。このことから、アモキサピンによるタンパク質合成抑制効果が見られることが確かめられた。 From FIG. 5, almost no band was detected in TGS-01 treated with 20 μM amoxapine. From this, it was confirmed that the protein synthesis inhibitory effect by amoxapine was seen.
［実施例６］アモキサピン処理したヒトＧＢＭ患者由来細胞株における細胞周期解析試験
（１）アモキサピン処理
細胞としては、ヒトＧＢＭ患者由来細胞株ＴＧＳ−０１を用いた。まず、ＴＧＳ−０１を９６ウェル低接着プレート（コーニング社製）に播種した。次いで、ＤＭＳＯ、又は２０μＭのアモキサピン含有ＮＳＰＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ２（和光社製）、及び２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（シグマ社製）含有）を用いて、４８時間培養した。
[Example 6] Cell cycle analysis test in a human GBM patient-derived cell line treated with amoxapine (1) Amoxapine-treated As a cell, a human GBM patient-derived cell line TGS-01 was used. First, TGS-01 was seeded on a 96-well low adhesion plate (Corning). Subsequently, the cells were cultured for 48 hours using DMSO or 20 μM amoxapine-containing NSPC medium (containing 20 ng / mL human FGF2 (manufactured by Wako) and 20 ng / mL human EGF (manufactured by Sigma)).
（２）細胞周期の解析
次いで、１０μＭのＢｒｄＵを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、−３０℃の７０％エタノールを加えて１６時間保存した。次いで、２Ｎの塩酸及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を加えて、室温で３０分間インキュベーションした。次いで、抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、遮光条件下において室温で１時間インキュベーションして細胞を染色した。次いで、１％ウシ血清アルブミン及び７ＡＡＤ（ＢＤバイオサイエンス社製）含有ＰＢＳに細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩを用いて、１細胞ずつ検出し、細胞周期を解析した。結果を図６に示す。図６において、横軸は細胞周期の各期（Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、又はＧ２／Ｍ期）を示し、縦軸は全生細胞数中の各期にある細胞数の割合を示す。
(2) Analysis of cell cycle Subsequently, 10 μM BrdU was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The cells were then collected, washed with PBS, added with -30 ° C 70% ethanol and stored for 16 hours. Then 2N hydrochloric acid and 0.5% Triton X 100 were added and incubated for 30 minutes at room temperature. Subsequently, using an anti-BrdU-FITC antibody (manufactured by BD Bioscience), the cells were stained by incubation at room temperature for 1 hour under light-shielding conditions. Subsequently, the cells were resuspended in PBS containing 1% bovine serum albumin and 7AAD (manufactured by BD Biosciences), and each cell was detected using BD FACSAria III, and the cell cycle was analyzed. The results are shown in FIG. In FIG. 6, the horizontal axis indicates each phase of the cell cycle (G0 / G1 phase, S phase, or G2 / M phase), and the vertical axis indicates the ratio of the number of cells in each phase in the total number of living cells.
図６から、２０μＭのアモキサピン処理したＴＧＳ−０１では、ＤＭＳＯ処理したＴＧＳ−０１よりＧ２／Ｍ期の細胞数が上昇しており、Ｇ０／Ｇ１期の細胞が低下していることが明らかとなった。このことから、アモキサピンにより細胞周期異常が引き起こされており、細胞分裂が停止されて、細胞増殖が停止していると推察された。 From FIG. 6, it is clear that TGS-01 treated with 20 μM amoxapine has an increased number of cells in the G2 / M phase and decreased cells in the G0 / G1 phase than TGS-01 treated with DMSO. It was. From this, it was speculated that the cell cycle abnormality was caused by amoxapine, cell division was stopped, and cell proliferation was stopped.
［実施例７］アモキサピン投与によるマウス生存率の確認試験
（１）Ｔｓｃ１遺伝子欠損グリオーマモデルマウスの作製
実施例１において作製した、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｈｕＫＯを発現するＮＳＰＣを脳内に移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを用いた。前記マウスに１ｍｇタモキシフェン（ＴＡＭ）（シグマ社製）を腹腔内投与し、腫瘍組織においてＴｓｃ１遺伝子を欠損させた。
[Example 7] Confirmation test of mouse survival rate by amoxapine administration (1) Production of glioma model mice lacking Tsc1 gene Balb / c nu / transplanted NSPC expressing EGFRvIII and huKO in Example 1 into the brain Nu mice were used. 1 mg tamoxifen (TAM) (manufactured by Sigma) was intraperitoneally administered to the mice, and the Tsc1 gene was deleted in the tumor tissue.
（２）アモキサピンの投与
次いで、アモキサピン（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を腹腔内投与した。コントロールとして、アモキサピンを投与していないものも準備した。次いで、それぞれのマウスを飼育し、経時的な生存率を算出した。
(2) Administration of amoxapine Next, amoxapine (5 mg / kg / day) was intraperitoneally administered. As a control, those not administered amoxapine were also prepared. Subsequently, each mouse was bred and the survival rate over time was calculated.
その結果、アモキサピンを投与したマウス群が全て死滅したのは約３３日後であり、アモキサピンを投与しなかったマウス群が全て死滅したのは約２９日後であった。また、アモキサピンを投与したマウス群は、アモキサピンを投与しなかったマウス群と比較して、経時的な生存率が高い傾向があった。
このことから、アモキサピンはグリオーマの治療に有効であると推察された。
As a result, it was about 33 days after all mice groups that received amoxapine died, and about 29 days after all mice groups that did not receive amoxapine died. In addition, the group of mice that received amoxapine tended to have a higher survival rate over time than the group of mice that did not receive amoxapine.
From this, it was speculated that amoxapine is effective in the treatment of glioma.
本発明によれば、脳腫瘍への特異性が高い抗脳腫瘍剤を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the anti- brain tumor agent with high specificity to a brain tumor can be provided.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022528908A (en) * | 2019-04-15 | 2022-06-16 | インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） | How to profile the energy metabolism of a cell population |
| EP4368183A4 (en) * | 2021-07-06 | 2025-07-02 | Nat Cancer Ct | Pharmaceutical composition for cancer prevention or treatment containing CDK4/6 inhibitor and tricyclic antidepressant |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016488A2 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Compugen, Ltd. | Compositions comprising tetracyclic antidepressants for treatment of cancer and related methods |
| US20110224141A1 (en) * | 2008-06-05 | 2011-09-15 | Stc.Unm | Methods and related compositions for the treatment of cancer |
| US20110251144A1 (en) * | 2008-09-16 | 2011-10-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Molecular modulators of the wnt/beta-catenin pathway |
-
2016
- 2016-07-15 JP JP2016140810A patent/JP2018008914A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016488A2 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Compugen, Ltd. | Compositions comprising tetracyclic antidepressants for treatment of cancer and related methods |
| US20110224141A1 (en) * | 2008-06-05 | 2011-09-15 | Stc.Unm | Methods and related compositions for the treatment of cancer |
| US20110251144A1 (en) * | 2008-09-16 | 2011-10-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Molecular modulators of the wnt/beta-catenin pathway |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MOLECULAR AND CELLULAR NEUROSCIENCE, vol. 54, JPN6020016214, 2013, pages 44 - 57, ISSN: 0004388743 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022528908A (en) * | 2019-04-15 | 2022-06-16 | インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） | How to profile the energy metabolism of a cell population |
| JP7518853B2 (en) | 2019-04-15 | 2024-07-18 | インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） | Methods for profiling the energy metabolism of cell populations |
| EP4368183A4 (en) * | 2021-07-06 | 2025-07-02 | Nat Cancer Ct | Pharmaceutical composition for cancer prevention or treatment containing CDK4/6 inhibitor and tricyclic antidepressant |
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