JP2018008954A - Ｈｅｒ２に特異的に結合できる抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】癌の予防または処置のためのＨＥＲ２（ヒト上皮細胞増殖因子受容体２）抗体の提供。【解決手段】癌細胞（特に、乳癌細胞および胃癌細胞）において過剰に発現されるＨＥＲ２に特異的に結合する抗体であって、トラスツマブに対するエピトープとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに特異的に結合する。該抗体のＣＤＲ配列は、公知のＨＥＲ２抗体のＣＤＲ配列と低い類似性を示し、このことは、該ＣＤＲ配列がユニークであることを示す。該抗体とトラスツマブの組み合わせは、顕著に増強された細胞毒性を有して癌細胞を死滅させ、それ故に、癌（特に、乳癌および胃癌）の治療に非常に有効である。理論に拘束されることはないが、併用療法の増強された効果は、トラスツマブに対するエピトープとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合し、トラスツマブと共同してＨＥＲ２を阻害することを示し得る。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、２０１１年１１月１日から２０１４年１０月１日までの間、助成金番号１４１５１１８３８５にて韓国産業技術振興院（ＫＩＡＴ）の支援を受け、ＫＩＡＴの国際協力支援チームの管理のもとに、ＡｂＣｌｏｎ社によって、国際協力技術開発事業および革新的なエピトープ発見のプラットフォーム技術に基づくグローバル抗体新薬開発との標題の基に行われたものである。

本出願は、韓国特許庁に２０１３年５月１６日に出願された韓国特許出願第１０−２０１３−００５５９１２号に基づく優先権を主張し、その開示内容は引用により本明細書中に包含される。
本発明は、ＨＥＲ２（ヒト上皮細胞増殖因子受容体２）関連疾患、特に癌を予防または処置するためのＨＥＲ２抗体に関する。

関連技術の説明
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）遺伝子は、ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子受容体）ファミリーメンバーの１つである、１８５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質をコードする。ＨＥＲ２タンパク質は、６２０アミノ酸残基を有する細胞外ドメイン、２３アミノ酸残基を有する膜貫通ドメインおよび４９０アミノ酸残基を有するチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる（Akiyama T, et al., Science, 232(4758):1644−1646(1986)）。

加えて、種々の特性を有するＨＥＲ２抗体が、多数の論文に報告されている。Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933−937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543−548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51:5361−5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350−362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691−8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580−2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401−408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771−2776 (1992); Hancock et al., Cancer Research. 51:4575−4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367−1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758−3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160−15167 (1992); U.S. Pat. No. 5,783,186; Kao et al., U.S. Publ. No. 2009/0285837 (2009); Ross et al., The Oncologist 8:307−325 (2003) および Klapper et al., Oncogene 14:2099−2109 (1997)。

ＨＥＲ２抗体のうち、最も商業的に成功した抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン^（商標）として市販、米国特許第５，８２１，３３７号）は、精力的に研究されてきた。Sapino, A., et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963−1968; Bussolati, G, et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261−1267; および、 Glazyrin A, et al., J Histology ＆ Cytochemistry (2007) 55(1):25−33。

トラスツズマブは商業的に成功しているにもかかわらず、この抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌患者のわずか１５％のみに治療効果を示す。従って、トラスツズマブの有効性の程度または範囲を向上させるという状況において、併用療法により、トラスツズマブに非応答性または乏しい応答性の癌患者の予後を改善するための試みがなされてきた。

例えば、米国特許出願公開第２０１１−００８６００４号は、トラスツズマブとＩＬ−２１を組み合わせた癌治療を開示しいている。米国特許出願公開第２０１２−０１０７２７０号は、トラスツズマブおよびＩＬ−２と共役したテネイシン−Ｃを標的とする抗体の組み合わせを記載している。

米国特許出願公開第２００５−０１０１６１８号は、トラスツズマブおよびｅｒｂＢ２リガンドを用いる癌治療を開示している。ヨーロッパ特許出願公開第２１３４３６４号は、テロメラーゼ阻害剤と組み合わせたトラスツズマブによる癌細胞増殖の阻害を開示している。ＷＯ２００８／０３１５３１は、ペルツズマブとトラスツズマブの併用が癌の転移を抑制し得ることを記載している。

本出願を通して、種々の特許および刊行物が引用され、引用文献が括弧内に示されている。これらの特許および刊行物の開示内容は、本発明および本発明の属する技術分野の技術水準をより完全に記載するために、引用により本明細書中に包含される。

韓国特許出願第１０−２０１３−００５５９１２号 米国特許第５，８２１，３３７号 米国特許出願公開第２０１１−００８６００４号 米国特許出願公開第２０１２−０１０７２７０号 米国特許出願公開第２００５−０１０１６１８号 ヨーロッパ特許出願公開第２１３４３６４号 国際公開番号ＷＯ２００８／０３１５３１ 国際公開番号ＷＯ９４／００１３６ 米国特許第５，７８３，１８６号 米国特許出願公開番号２００９／０２８５８３７

Akiyama T, et al., Science, 232(4758):1644−1646(1986) Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933−937 (1991) McKenzie et al., Oncogene 4:543−548 (1989) Maier et al., Cancer Res. 51:5361−5369 (1991) Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350−362 (1990) Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691−8695 (1991) Bacus et al., Cancer Research 52:2580−2589 (1992) Xu et al., Int. J. Cancer 53:401−408 (1993) Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771−2776 (1992) Hancock et al., Cancer Research. 51:4575−4580 (1991) Shawver et al., Cancer Res. 54:1367−1373 (1994) Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758−3765 (1994) Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160−15167 (1992) Ross et al., The Oncologist 8:307−325 (2003) Klapper et al., Oncogene 14:2099−2109 (1997) Sapino, A., et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963−1968 Bussolati, G, et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261−1267 Glazyrin A, et al., J Histology ＆ Cytochemistry (2007) 55(1):25−33

解決すべき技術的課題
本発明者らは、ＨＥＲ２関連疾患、特に癌（より具体的には、乳癌および胃癌）を予防または処置し得る抗体を開発するために鋭意研究を行った。特に、本発明者らは、単剤としてのトラスツズマブ治療に伴う抗癌効果の限界を克服することができる、トラスツズマブと併用する抗体を開発するために鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、それ自体が顕著な抗癌効果を有し、癌（特に、乳癌および胃癌、より具体的には、ＨＥＲ２を発現する乳癌および胃癌）の予防または処置のためにトラスツズマブと併用してより有益な効果を有する新規の抗体を開発した。

従って、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することが本発明の目的である。

なお、本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供することも、本発明の目的である。

該核酸分子を担持する組み換えベクターを提供することもまた、本発明の目的である。

組み換えベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供することもまた、本発明のさらなる目的である。

癌を予防または処置するための医薬組成物を提供することもまた、本発明の別の目的である。

アポトーシスを誘導するための医薬組成物を提供することもまた、本発明のさらなる目的である。

本発明の他の目的および利点は、添付の特許請求の範囲および図面と合わせて、以下の本明細書の記載から明らかになり得る。

発明の詳細な説明
本発明の第一の面において、（ａ）配列番号１の相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および以下の式１
Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （式１）
(式中、Ｘ_１は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ_２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、Ｘ_３は、ＧｌｙまたはＣｙｓであり、Ｘ_４は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ_５は、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ_６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、そしてＸ_７は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｈｒである。)
で示されるＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）軽鎖可変領域
を含む、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明者らは、ＨＥＲ２関連疾患、特に癌（より具体的には、乳癌および胃癌）を予防または処置し得る抗体を開発するために鋭意研究を行った。特に、本発明者らは、単剤としてのトラスツズマブ治療に伴う抗癌効果の限界を克服することができる、トラスツズマブと併用する抗体を開発するために鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、それ自体が顕著な抗癌効果を有し、癌（特に、乳癌および胃癌、より具体的には、ＨＥＲ２を発現する乳癌および胃癌）の予防または処置のためにトラスツズマブと併用してより有益な効果を有する新規の抗体を開発した。

本発明の抗体は、ＨＥＲ２に特異的な結合能を有している。特に、本発明の抗体は、トラスツズマブが結合するエピトープとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合する。

本明細書で用いる用語“トラスツズマブ”は、米国特許第５，８２１，３３７号に記載の抗体を意味する。

本発明の抗体は、種々のＨＥＲ２を発現する癌細胞に対する細胞毒性効果または増殖阻害効果を示す。癌細胞に関連して用語“細胞毒性”および“増殖阻害”には意図的な区別はなく、これらの用語は、本明細書中で互換的に用いられる。

本明細書で用いる用語“抗体”は、全抗体ならびに抗体の抗原結合フラグメントを含む、ＨＥＲ２特異的抗体を意味する。

全抗体は、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を含み、各軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎖に連結されている。重鎖定常領域は、γ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２のサブグループに分類されている、５つの異なるアイソタイプ（ｙ、μ、α、δおよびε）を含む。軽鎖定常領域は、２つの異なるアイソタイプ（κおよびλ）を含む（Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41−50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45−65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)）。

抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどを含む、抗原に結合できる抗体フラグメントを意味する。Ｆａｂは、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ_１）からなる一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖のＣＨ_１ドメインのＣ末端に１つまたはそれ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域が存在するという意味で、Ｆａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成することにより作製される。Ｆｖは、重鎖および軽鎖の可変領域からなる最小の抗体フラグメントであり、Ｆｖフラグメントを製造するための組換え技術は、国際公開番号ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６およびＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖において、重鎖および軽鎖の可変領域は非共有結合により連結され、一本鎖Ｆｖにおいて、重鎖および軽鎖の可変領域は、一般的に、ペプチドリンカーを介して共有結合によって連結されているか、またはＣ末端で互いに直接結合されて、二本鎖Ｆｖのような二量体を形成する。このような抗体フラグメントは、タンパク質分解酵素を用いて得ることができ（例えば、抗体全体をパパインで消化して、Ｆａｂフラグメントを生産し、ペプシン処理の結果、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生産する）、また遺伝子組換え技術により製造することができる。

ひとつの態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ抗体および全抗体を含む。加えて、重鎖定常領域は、γ、μ、α、δまたはεからなるアイソタイプから選択される。好ましくは、重鎖定常領域は、γ１、γ３およびγ４アイソタイプを含み、より好ましくは、γ１アイソタイプを含む。軽鎖定常領域は、κおよびλアイソタイプであり得て、好ましくは、κアイソタイプであり得る。従って、本発明の抗体の好ましい態様は、κ軽鎖およびγ１重鎖を含むＦａｂまたはＩｇＧ１抗体である。

本明細書で用いる用語“重鎖”は、完全長重鎖ならびに抗原に特異的に結合するための可変領域配列および３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）のアミノ酸配列を含む可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むその部分の両方を意味する。本明細書で用いる用語“軽鎖”は、完全長軽鎖ならびに抗原に特異的に結合するための可変領域配列および定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）のアミノ酸配列を含む可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むその部分の両方を意味する。

本明細書で用いる用語“ＣＤＲ（相補性決定領域）”は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域のアミノ酸配列を意味する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）。重鎖および軽鎖のそれぞれは、３つのＣＤＲ（重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３））を含む。ＣＤＲは、抗原またはエピトープに結合する抗体において重要な役割を果たす接触残基(contacting residue)を提供する。

本発明の抗体において、ＣＤＲＨ３は、式１で示される。

式１中、Ｘ_１は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、具体的には、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、より具体的には、ＨｉｓまたはＡｓｎであり、さらにより具体的には、Ｈｉｓである。

式１中、Ｘ_２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、具体的には、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、ＡｓｎまたはＩｌｅであり、より具体的には、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、さらにより具体的には、Ｌｅｕである。

式１中、Ｘ_３は、ＧｌｙまたはＣｙｓであり、具体的にはＧｌｙである。

式１中、Ｘ_４は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、具体的にはＧｌｙである。

式１中、Ｘ_５は、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａであり、具体的にはＴｈｒである。

式１中、Ｘ_６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、具体的にはＡｌａである。

式１中、Ｘ_７は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｈｒであり、具体的にはＳｅｒである。

ひとつの態様では、Ｘ_１は、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ_２は、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ_３は、Ｇｌｙであり、Ｘ_４は、Ｇｌｙであり、Ｘ_５は、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ_６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、そしてＸ_７は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｈｒである。

より具体的には、Ｘ_１は、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ_２は、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ_３は、Ｇｌｙであり、Ｘ_４は、Ｇｌｙであり、Ｘ_５は、Ｔｈｒであり、Ｘ_６は、Ａｌａであり、そしてＸ_７は、Ｓｅｒである。

さらにより具体的には、ＣＤＲＨ３は、配列番号３、２７−２８、３２および３９−８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらにより具体的には、ＣＤＲＨ３は、配列番号３、４３、６４、６７、７１、７６、８３、８４または８５のアミノ酸配列を含み、最も具体的には、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

ひとつの態様では、軽鎖可変領域は、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２、および以下の式２
Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｙ_６−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ （２）
(式中、Ｙ_１は、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＡｌａであり、Ｙ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｌａであり、Ｙ_３は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｙ_４は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、Ｙ_５は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｌａであり、そしてＹ_６は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＬｅｕである。)
で示されるＣＤＲＬ３を含む。

式２中、Ｙ_１は、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＡｌａであり、具体的には、ＧｌｎまたはＡｓｐであり、より具体的には、Ｇｌｎである。

式２中、Ｙ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｌａであり、具体的には、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＧｌｕであり、より具体的には、Ｇｌｎである。

式２中、Ｙ_３は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＬｙｓであり、具体的には、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、より具体的には、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＡｓｎまたはＩｌｅであり、さらにより具体的には、ＬｅｕまたはＭｅｔであり、最も具体的には、Ｌｅｕである。

式２中、Ｙ_４は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、具体的には、ＴｙｒまたはＡｌａである。

式２中、Ｙ_５は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｌａであり、具体的には、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅであり、より具体的には、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＴｙｒである。

式２中、Ｙ_６は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、具体的には、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｓｎであり、より具体的には、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａである。

ひとつの態様では、Ｙ_１は、ＧｌｎまたはＡｓｐであり、Ｙ_２は、Ｇｌｎであり、Ｙ_３は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｙ_４は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、Ｙ_５は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅであり、そしてＹ_６は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｓｎである。

より具体的には、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、３３−３８または８７−２４５のアミノ酸配列を含む。さらにより具体的には、ＣＤＲＬ３は、配列番号６、８８、１０９、１３１、１５５、１５６、１５７、１７８、２１８、２２０、２２２または２３９のアミノ酸配列を含み、より具体的には、配列番号６、８８（ｈｚ１Ｅ１１−３）、２１８（ｈｚ１Ｅ１１−１３３）または２３９（ｈｚ１Ｅ１１−１５４）のアミノ酸配列を含む。

ひとつの態様では、重鎖可変領域は、配列番号８（１Ｅ１１）または２４（ｈｚ１Ｅ１１）のアミノ酸配列を含む。

ひとつの態様では、軽鎖可変領域は、配列番号１０（１Ｅ１１）、２６（ｈｚ１Ｅ１１）、２４７（ｈｚ１Ｅ１１−３）、２４９（ｈｚ１Ｅ１１−１３３）または２５１（ｈｚ１Ｅ１１−１５４）のアミノ酸配列を含む。

実施例に示す通り、本発明の抗体は、特に、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのうちサブドメイン４に結合しているが、本発明の抗体は、トラスツズマブのエピトープとは異なるサブドメイン４上のエピトープに結合している。

本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントは、それらが特異的にＨＥＲ２を認識することが可能である限り、配列表に記載のアミノ酸配列の変異体を包含する。例えば、抗体のアミノ酸配列は、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特徴を改善するために改変されてもよい。例えば、そのような改変は、抗体のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含む。

かかるアミノ酸の変異は、アミノ酸側鎖の相対的類似性に基づいて、例えば、疎水性、親水性、電荷および大きさに基づいて提供され得る。アミノ酸側鎖の大きさ、形状、およびタイプの分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジン残基は全て、正の電荷を有するものであり、アラニン、グリシンおよびセリンは、同様の大きさを有し、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、同様の形状を有することが明らかであり得る。従って、これらの大きな要因に基づき、アルギニン、リジンおよびヒスチジン、アラニン、グリシンおよびセリン、ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、生物学的に機能的等価物であるとみなされ得る。

変異を導入するために、アミノ酸の疎水親水性（ハイドロパシー）指標を考慮することができる。疎水性および電荷に基づいて、疎水親水性指標が各アミノ酸に与えられる。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；および、アルギニン（−４．５）。

タンパク質の相互作用の生物学的機能を提供するために、アミノ酸の疎水親水性指数が顕著に重要である。これはよく、変異体は、タンパク質が同様の疎水親水性指標を有するアミノ酸で置換されている場合にのみ、同様の生物学的活性を有することができることは、当業者によく知られている。変異が疎水親水性指標に基づいて導入される場合、置換は、好ましくは、±２以下の疎水親水性指標の差異、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の差異を有するアミノ酸残基との間で行われる。

同様の親水性値を有する他のアミノ酸とのアミノ酸置換が、生物学的に同等の活性を有する変異体の作製をもたらし得ることもまた、当業者には明らかであり得る。米国特許第４，５５４，１０１に記載の通り、各アミノ酸残基は、以下の親水性値を有する。アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。

変異が親水性値に基づいて導入することを意図される場合、置換は、好ましくは、±２以下の親水性値の差異、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の差異を有するアミノ酸残基との間で行われる。

実質的にタンパク質の活性を損なうことのないアミノ酸残基の改変は、当業者によく知られている（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。このようなアミノ酸改変には、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙの置換が含まれるが、これらに限定されない。

生物学的に等価な活性を有する上記の変異を考慮して、本発明の抗体またはそれをコードする核酸のいずれかは、配列表に記載の配列と実質的に同一の配列を含むことが理解され得る。実質的に同一の配列とは、常套的に用いられている配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定される通り、好ましくは、配列表の配列と少なくとも６１％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を示すものであることを意味する。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが記載されている。Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307−31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237−44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151−3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881−90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155−65(1992); および、Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307−31(1994)。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ用の配列分析プログラムに関連して使用するための、NCBI Basic Local Alignment 検索ツール (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403−10(1990)）は、国立生物情報センター（ＮＢＣＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含むいくつかの供給源ならびにインターネット上から入手可能である。それは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において入手可能である。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI−AST/blast help.htmlにおいて利用可能である。

本発明の抗体には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体およびそのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の抗体のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列がユニークであるために、公知の抗体のＣＤＲ配列に対して低い類似性を示す。例えば、ＢＬＡＳＴ検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において本発明の抗体に高い類似性を有する米国特許第７，３２９，７３７号および同第７，９９３，６４６号に記載の抗体は、親抗体(mother antibody)である１Ｅ１１抗体のＣＤＲ配列に５０％未満の類似性を示し、さらに、本発明の抗体の標的とは異なるｈＫ−１に結合する。

従って、本発明の抗体のアミノ酸配列は、新規かつユニークであると考えられ得る。

本発明の別の面において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子が提供される。

本明細書で用いる用語“核酸分子”は、包括的にＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子を意味し、核酸分子の基本的なヌクレオチドは、修飾された糖類または塩基の類似体、ならびに天然ヌクレオチドを含む（Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543−584 (1990)）。重鎖および軽鎖の可変領域をコードする本発明の核酸分子の配列を変更することができる。このような修飾は、ヌクレオチドの付加、欠失または非保存的もしくは保存的置換が含まれる。

ひとつの態様では、重鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号７または２３のヌクレオチド配列を含む。

ひとつの態様では、軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列番号９、２５、２４６、２４８または２５０のヌクレオチド配列を含む。

本発明のＨＥＲ２抗体をコードする核酸分子はまた、上記のヌクレオチド配列と実質的な相同性を共有するヌクレオチド配列を含む。実質的な相同性とは、本発明のヌクレオチド配列と他のランダム配列との間の最大のアラインメントならびに当業者に公知のアルゴリズムを用いる配列アラインメント分析によって、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を共有するヌクレオチド配列を意味する。

本発明のさらに別の面では、上記の本発明の核酸分子を含む組み換えベクターが提供される。

本明細書で用いる用語“ベクター”は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ならびに、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む、宿主細胞において標的遺伝子を発現するためのツールである。

ひとつの態様では、軽鎖および重鎖の可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターに操作可能に連結されている。

本明細書で用いる用語“操作可能に連結されている”とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との間の機能的結合を意味し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を与える。

本発明の組み換えベクターは、当業者に公知の種々の方法によって構築され得て、その実用的な方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されており、それは引用により本明細書中に包含される。

典型的に、本発明のベクターは、クローニングまたは発現ベクターとして構築され得る。加えて、本発明のベクターは、原核または真核細胞を宿主細胞として用いて構築され得る。

例えば、発現ベクターが、真核宿主細胞について構築されているとき、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスプロモーター、エプスタイン−バール ウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）を用いることができる。ベクターは、一般的に、転写ターミネーターとしてポリアデニル化配列を含む。

本発明のベクターは、発現された抗体を精製するために、他の配列と融合され得る。例えば、融合される配列としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ (Pharmacia, USA)、マルトース結合タンパク質（NEB, USA）、ＦＬＡＧ（IBI, USA）および６ｘＨｉｓ（ヘキサヒスチジン；Quiagen, USA）が含まれる。

本発明のベクターによって発現されるタンパク質は抗体であるため、発現された抗体はまた、精製のための付加配列なしに容易にプロテインＡカラムを通して精製することができる。

本発明の発現ベクターは、選択マーカー、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子として当業者に知られている抗生物質耐性遺伝子を含む。

本発明のさらなる面において、上記の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明のベクターが安定に、かつ連続的にクローニングされ、発現される宿主細胞はまた、当業者に公知の任意のものが利用され、例えば、好適な真核宿主細胞としては、ＣＯＳ７細胞（サル腎臓細胞）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞およびＨＥＫ−２９３細胞が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の別の面において、（ａ）薬学的に有効量の本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防または処置のための医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、本発明のＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメントを活性成分として含むため、それらに共通する説明は、本明細書の過度の複雑化を避けるために省略されている。

実施例に記載の通り、トラスツズマブと組み合わせた本発明のＨＥＲ２抗体は、顕著に増強された細胞毒性を有して癌細胞（特に、乳癌細胞、より具体的には、ＨＥＲ２を発現する乳癌細胞）を殺し、それ故に、癌（特に、乳癌および胃癌、より具体的には、ＨＥＲ２を発現する乳癌および胃癌）の治療により有効である。一態様によれば、該医薬組成物は、トラスツズマブをさらに含む。

本発明の組成物によって予防または処置される癌としては、当業者に公知の種々の癌、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、気管支腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、結腸癌、子宮頚癌、脳腫瘍、前立腺癌、骨腫瘍、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌または輸尿管癌が含まれる。

具体的には、該組成物によって予防または処置されるべき癌は、ＨＥＲ２を発現する癌であり、より具体的にはＨＥＲ２を発現する乳癌または胃癌である。

本発明のさらに別の面において、（ａ）薬学的に有効量の本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、アポトーシスを誘導するための医薬組成物を提供する。

ひとつの態様では、該医薬組成物は、アポトーシスを誘導して、癌、過形成、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性赤血球増加症、白板症、肥厚性瘢痕、扁平苔癬、黒子症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄または狭窄である過剰増殖性疾患を予防または処置する。

薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ラバーアラブル（rubber arable）、リン酸カリウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カリウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油を含むが、これらに限定されない、製剤用に常套の担体であってよい。本発明の医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁化剤、および防腐剤をさらに含んでいてよい。好適な薬学的に許容される担体および製剤の詳細は、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)）に見出すことができ、それは引用により本明細書中に包含される。

本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、局所、経鼻、肺または直腸投与により、非経腸的に投与され得る。

本発明の医薬組成物の好適な用量は、医薬製剤方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、疾患の重症度、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度および該医薬組成物に対する感受性によって変化し得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の日用量で投与される。用語“薬学的に有効な量”は、癌を予防または処置するのに適した量を意味する。

当業者に公知の従来技術によれば、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または添加剤と共に製剤され得て、最終的には単位用量形態および複数回投与量形態を含むいくつかの形態で提供される。製剤は、油性または水性媒体、再懸濁液またはエマルジョン、抽出物、粉末、坐薬、顆粒、錠剤またはカプセル剤であってもよく、さらには、分散剤または安定化剤を含む。

本発明の抗体は、ＨＥＲ２発現に関係する障害、疾患または病状を診断するために使用され得る。

本発明のさらなる面において、本発明のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ＨＥＲ２発現に関係する障害、疾患または病状を診断するためのキットを提供する。

ＨＥＲ２発現に関係する障害、疾患または病状は、特に、癌、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、気管支腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、結腸癌、子宮頚癌、脳腫瘍、前立腺癌、骨腫瘍、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌または輸尿管癌である。具体的には、本発明の診断キットは、ＨＥＲ２を発現する癌、より具体的にはＨＥＲ２を発現する乳癌または胃癌を診断するために使用される。

本発明の抗体は、患者における本発明の抗体の薬剤反応性を分析するために使用することができる。

本発明の別の面において、本発明の抗体を含む薬剤反応性を分析するためのキットを提供する。

本発明の分析キットは、患者における本発明の抗体の薬剤反応性を評価するために使用される。例えば、患者から得られた癌細胞を本発明の抗体と共にインキュベートし、抗体が細胞に結合することが明らかにされる場合、該患者は、本発明の抗体の薬剤反応性を有すると決定される。

本発明のキットは抗体を含むため、免疫アッセイまたは免疫染色のために製造され得る。免疫アッセイまたは免疫染色の形式としては、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、捕捉ＥＬＩＳＡ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および免疫親和性精製が含まれるが、これらに限定されない。免疫アッセイまたは免疫染色の手順は、Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme−linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; および、 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に見出すことができ、これは、引用により本明細書に包含される。

例えば、放射免疫アッセイによれば、放射性同位体（例えば、Ｃ^１４、Ｉ^１２５、Ｐ^３２およびＳ^３５）で標識された抗体は、癌細胞の表面上のＨＥＲ２を識別するために使用され得る。ＥＬＩＳＡ法によれば、本発明の方法の具体例は、以下の工程を含む。（ｉ）分析すべき生体サンプルで固体基質の表面をコーティングし、（ｉｉ）該生体サンプルを一次抗体としての本発明のＨＥＲ２抗体と共にインキュベートし、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の結果物を酵素と結合した二次抗体と共にインキュベートし、そして（ｉｖ）酵素の活性を測定する。

固体基質は、炭化水素ポリマー（例えば、ポリスチレンおよびポリプロピレン）、ガラス、金属またはゲルであってもよい。最も好ましくは、固体基質は、マイクロタイタープレートである。

二次抗体に結合した酵素は、比色、蛍光、発光または赤外線反応を触媒する酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびシトクロムＰ_４５０を含む。アルカリホスファターゼを用いるとき、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェートおよびＥＣＦ（増強化学蛍光）を基質として使用してもよい。西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する場合、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン、Pierce）、ＨＹＲ（ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌおよびピロカテコール）、ＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼおよびｔ−ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）ならびにｍ−ＰＭＳ（フェナジンメチルスルファート）を基質として使用してもよい。

捕捉ＥＬＩＳＡ法によれば、本発明の方法の具体例は、以下の工程を含み得る。（ｉ）固体基質の表面を捕捉抗体としてのＨＥＲ２抗体でコーティングし、（ｉｉ）捕捉抗体を分析すべき生体サンプルと共にインキュベートし、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の結果物を、検出抗体として、検出可能なシグナルを発生する標識と結合したＨＥＲ２抗体と共にインキュベートし、そして（ｉｖ）標識から生じたシグナルを測定する。

検出抗体は、検出可能なシグナルを発生する標識を有している。標識には、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびシトクロムＰ_４５０）、放射性物質（例えば、Ｃ^１４、Ｉ^１２５、Ｐ^３２およびＳ^３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光、化学発光およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）標識が含まれるが、これらに限定されない。抗体を標識するための種々の標識および方法は、Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 に見出され得る。

ＥＬＩＳＡおよび捕捉ＥＬＩＳＡにおける酵素活性またはシグナルの測定は、当技術分野で周知の種々の方法によって行われ得る。ビオチンを標識として使用する場合、検出はストレプトアビジンを用いて行うことができる。ルシフェラーゼが使用される場合、検出はルシフェリンを用いて行われ得る。

本発明のキットに適用可能な生体サンプルには、細胞、組織、組織由来の抽出物、溶解物または精製物、血液、血漿、血清、リンパ液および腹水が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の抗体は、インビボまたはインビトロでの画像化のために使用され得る。本発明の別の面において、本発明の抗体および該抗体に結合してシグナルを発生する標識を含むイメージング組成物を提供する。

シグナル発生標識としては、Ｔ１造影剤（例えば、Ｇｄキレート化合物）、Ｔ２造影剤（例えば、超常磁性物質（例えば、マグネタイト、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライト））、放射性同位体（例えば、^１１Ｃ、^１５Ｏ、^１３Ｎ、Ｐ^３２、Ｓ^３５、^４４Ｓｃ、^４５Ｔｉ、^１１８Ｉ、^１３６Ｌａ、^１９８Ｔｌ、^２００Ｔｌ、^２０５Ｂｉおよび^２０６Ｂｉ）、蛍光物質、例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン、ローダミン、リサミン、Ｃｙ３およびＣｙ５）、化学発光物質、磁性粒子、質量標識および電子密度の高い粒子が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の抗体は、単独で癌治療において有用であるが、該抗体はＨＥＲ２を発現する細胞を標的とし得るから、他の薬剤と組み合わせることによりＡＤＣ（抗体薬物複合体）の形態で提供されてもよい。

従って、本発明の別の面では、本発明の抗体および該抗体と結合した薬剤を含むＡＤＣ（抗体薬物複合体）が提供される。

抗体と組み合わせる薬剤には、化学物質、放射性核種、免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物学的薬剤および酵素阻害剤、特に以下の抗癌剤：アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール（acodazole）、アクロマイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アンプリゲン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、グリシン酸アフィジコリン、アシュリー（asaley）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット・ゲラン（BCG）、ベーカーズアンチフォール、ベータ−２’−デオキシチオグアノシン、ビサントレン塩酸、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ７Ｕ８５メシル酸、セラセミド（ceracemide）、カルベタイマー（carbetimer）、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリン−スルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパルブム、ＣＰＴ−１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ジアザウリジン（deazauridine）、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデムニンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコールアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン、エダトレキセート（dedatrexate）、エデルフォシン、エフロルニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エピルビシン（esorubicin）、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５−フルオロウラシル、フルオゾール^（商標）、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリングトニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシウレア（hydrozyurea）、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュープロリド、レバミゾール、リポソームダウノルビシン、リポソームカプセル化ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、カルメット・ゲラン桿菌のメタノール抽出残渣、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシン−Ｃ、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、単球／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パーラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、ピクサントロン（piroxantrone）塩酸塩、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール（sulofenur）、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン（teroxirone）、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、トリフルオペラジン塩酸塩、トリフルリジン、トリメトレキサート、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ウラシルマスタード、ＴＮＦビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ８６４、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タキソテールおよびタキソールが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の効果
本発明の特徴および利点を以下にまとめる。
（ａ）本発明の抗体は、癌細胞（特に、乳癌および胃癌細胞）において過剰に発現されたＨＥＲ２、具体的には、トラスツズマブに対するエピトープとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに特異的に結合する。
（ｂ）本発明の抗体のＣＤＲ配列は、公知のＨＥＲ２抗体のＣＤＲ配列とは低い類似性を示し、このことは、ＣＤＲ配列がユニークであることを示す。
（ｃ）トラスツズマブと組み合わせた本発明の抗体は、顕著に増強された細胞毒性を有して癌細胞を殺し、それ故に、癌（特に、乳癌および胃癌）の治療において極めて有効である。
（ｄ）理論はともかく、併用療法の増強された効果は、本発明の抗体が、トラスツズマブに対するエピトープと異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合し、トラスツズマブと協働してＨＥＲ２を阻害することを示し得る。
（ｅ）アポトーシスを誘導し得る本発明の抗体は、過剰増殖性疾患の予防または処置に使用され得る。
（ｆ）本発明は、癌診断、薬剤反応性の分析、イメージングおよびＡＤＣ（抗体薬物複合体）、ならびに癌治療においても有用であり得る。

図１は、ｐｃＤＮＡ３．３−ＩｇＧ重鎖(Heavy)ベクターおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＩｇＧカッパ(Kappa)ベクターの遺伝子マップを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、ＮＣＩ−Ｎ８７癌細胞株およびＢＴ−４７４癌細胞株に対する、１Ｅ１１抗体での単剤処理および１Ｅ１１抗体とトラスツズマブの併用処理の増殖阻害効果をそれぞれ示すグラフである。ＴＲＡ、ＰＥＲ、およびｈＩｇＧはそれぞれ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、およびヒトＩｇＧ（陰性対照）を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、１Ｅ１１抗体が、トラスツズマブの結合ドメインとは異なるＨＥＲ２サブドメインのドメインに結合することを示す。図３Ａおよび３Ｂはそれぞれ、ＳＰＲ分析およびＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。 図４Ａは、１Ｅ１１抗体が、ＨＥＲ２が属するＥｒｂＢファミリータンパク質のうち、ＨＥＲ２に特異的に結合するかどうかを調べるＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。セツキシマブ（ＣＥＴ）を、ＥＧＦＲタンパク質に対する対照抗体として使用した。図４Ｂは、１Ｅ１１抗体がヒト以外のＨＥＲ２に結合するかどうかを調べるＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。 図５Ａは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いて処理したとき、アポトーシスが発生した癌細胞の割合の分析結果を示す。図５Ｂは、ＢＴ−４７４細胞を、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いて処理したとき、アポトーシスが発生した癌細胞の割合の分析結果を示す。図５Ｃは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いて処理した２４時間および４８時間後の細胞生存率の分析結果を示す。対照群は、抗体用の溶媒であるＰＢＳのみで処理した細胞の生存率を示す。図５Ｄは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いて処理した２４時間後のカスパーゼ−３／７活性の分析結果を示す。対照群は、抗体用の溶媒であるＰＢＳのみで処理した細胞の生存率を示す。

図６Ａは、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いる処理によるＨＥＲ２下流シグナル伝達の減少を示すウェスタンブロット分析の結果を示す。図６Ｂは、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いる処理によるヘテロ二量体化誘導性細胞増殖に対する阻害効果を示すグラフである。陰性対照（陰性対照）は、リガンドや抗体で処理しない細胞の生存率を示し、陽性対照（陽性対照対照）は、抗体で処理することなくリガンドのみで処理した細胞の生存率を示す。 図７Ａから７Ｃは、１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いる処理によるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植動物モデルにおける腫瘍細胞増殖阻害効果を示す。図７Ａは、腫瘍容積の変化を示すグラフであり、図７Ｂは、腫瘍重量の変化を示すグラフであり、図７Ｃは、腫瘍組織の染色結果を示す画像である。対照Ａｂは、パリビズマブである。 図８Ａおよび８Ｂは、ヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１抗体での単独処理、ならびにｈｚ１Ｅ１１抗体およびトラスツズマブの併用処理による、ＮＣＩ−Ｎ８７癌細胞株およびＯＥ−１９癌細胞株に対する増殖阻害効果をそれぞれ示すグラフである。

図９は、ｈｚ１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせを用いる処理によるＮＣＩ−Ｎ８７異種移植動物モデルにおける腫瘍細胞増殖阻害効果を示す。対照Ａｂは、パリビズマブである。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ｈｚ１Ｅ１１抗体のＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３のアラニンスキャニング結果をそれぞれ示す。 図１１Ａから１１Ｆは、親和性を改善されたヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１−３、ｈｚ１Ｅ１１−１３３、およびｈｚ１Ｅ１１−１５４抗体での単独処理、ならびにそれらとトラスツズマブとの併用処理による、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＯＥ−１９、およびＢＴ−４７４癌細胞株に対する増殖阻害効果を示すグラフである。

本発明は、実施例によりさらに詳細に説明され得る。これらの実施例は、より具体的に例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲が実施例に、またはそれにより限定されるものではないことは、当業者には明らかであり得る。

実施例
実施例１：ＨＥＲ２抗体の開発
抗体を調製するために、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を動物細胞を用いて製造し、その後、それを抗原として用いた。ヒトＩｇＧ１およびＦｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３）のヒンジ領域が、ＥＣＤのＣ末端に結合されているＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いてクローニングした。次いで、クローニングされたベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Invitrogen, Cat. No. R790−07）細胞にポリエチレンイミン（Polyscience Inc., Cat. No. 23966）を用いて一過性にトランスフェクションし、ＨＥＲ２−ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質を、該細胞培養物からプロテイン−Ａセラミック・ハイパードＦ樹脂（PALL, Cat No. 20078−028）を用いて精製した。精製されたタンパク質を、タンパク質アッセイ色素（Bio−Rad, Cat. No. 500−0006）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って定量し、その濃度および純度をクーマシー染色によって確認した。１００μｇの精製されたタンパク質抗原をフロイントのアジュバント（Sigma, Cat. No. F5506）と混合し、その後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（DBL Co., Ltd., Korea）に腹腔内注入した。２週間目に、１００μｇの抗原をＰＢＳで希釈し、再度注入し、その３日後に、マウスの脾臓を取り出し、そこからリンパ球を単離した。単離したリンパ球を骨髄腫細胞株 ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ATCC, Cat. No. CRL−1581）と５：１の比で混合し、ＰＥＧ−１５００（Roche, Cat. No. 783641）を用いて融合させた。融合した細胞を、ＨＡＴサプリメント（Sigma, Cat. No. H0262）を含む培地で培養し、融合細胞（ハイブリドーマ）を、選択的に選別し、培養した。

このようにして得られたハイブリドーマ細胞を、それらが抗原に結合する抗体を生産する細胞であるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイにより調べた。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−ＦｃまたはＣｈｒｏｍＰｕｒｅヒトＩｇＧ（hIgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., Cat. No. 009−000−003）を、Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルプレート（Corning, Cat. No. 3590）に、室温にて、１μｇ／ｍＬの濃度で１時間、固定化した。これをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ トライトンＸ−１００）で３回洗浄し、次いで室温にて３０分間、３００μＬのＴＢＳ−Ｔ／ＳＭ（２％スキムミルク）を用いてブロッキングした。ブロッキングされたプレートを３回洗浄し、ハイブリドーマ培養液を添加し、そして３７℃にて１時間、抗体に結合させた。結果物を３回洗浄後、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Pierce, Cat. No. 31439）を、ＴＢＳ−Ｔ／ＳＭで１：５，０００の比で希釈し、３７℃にて１時間、これに結合させた。結果物を３回洗浄後、ＴＭＢ（SurModics, Cat. No. TMBC−1000−01）を加え、室温にて５分間発色させ、１Ｎ硫酸（DukSan, Cat. No. 254）を加えて発色を停止させた。吸光度をＶｉｃｔｏｒ Ｘ３（PerkinElmer, Cat. No. 2030−0030）を用いて４５０ｎｍで測定し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに特異的に結合する抗体を選択した。

ＨＥＲ２は、細胞表面上に発現されるタンパク質であるため、開発された抗体が、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイにより、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞に結合したかどうかを調べた。ＨＥＲ２を過剰発現する卵巣癌細胞株であるＳＫＯＶ−３（Korean Cell Line Bank (KCLB), Cat. No. 30077）を、Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル細胞培養プレート（Corning, Cat. No. 3595）に１０，０００細胞／ウェルの濃度で分注し、２４時間培養した。次の日に、細胞培養上清を除去後、これをＰＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマ培養液を添加し、そして３７℃にてさらに２時間培養した。結果物をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＰＢＳ／ＦＢＳ（３％ＦＢＳ）で１：５，０００の比で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体としてそれに添加し、室温にて１時間処理した。結果物をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢを用いて発色させた。陰性対照としてのＳＰ２／０細胞培養物よりも高い吸光度を示す６１個のクローンを選択した。

実施例２：乳癌細胞の増殖に対する、開発された抗体の阻害効果の比較
乳癌細胞の増殖に対する阻害効果を確認するために、細胞生存アッセイを行うために、ハイブリドーマ培養液から抗体を精製した。ハイブリドーマを、３％ＦＢＳを含む培地中で培養し、ＩｇＧの形態の抗体を、プロテイン−Ａ樹脂を用いて精製した。精製した抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、ＢＣＡアッセイ（Pierce, Cat. No. 23227）により定量し、それらの濃度および純度をクーマシー染色によって確認した。

細胞生存アッセイを、ＨＥＲ２が過剰発現されている、代表的な乳癌細胞株であるＢＴ−４７４および代表的な胃癌細胞株であるＮＣＩ−Ｎ８７細胞株に対する、単独処理またはトラスツズマブとの併用処理により行った。併用処理について、開発された抗体とトラスツズマブを１：１の混合比（重量比）の混合物を用いた。９６ウェルプレートにＢＴ−４７４(ATCC, Cat. No. HTB−20、１０，０００細胞／ウェル)およびＮＣＩ−Ｎ８７（ATCC, Cat No. CRL−5822、１０，０００細胞／ウェル）細胞を分注し、２４時間培養した。精製した抗体をそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度で処理し、ＢＴ−４７４およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞株をさらに４日間培養した。細胞生存アッセイのために、ＣＣＫ−８（Dojindo, Cat. No. CK−04−13）を１０％の終濃度で添加し、３７℃にて３時間処理し、その吸光度を測定した。相対生存率は、１００％の生存率に設定された抗体で処理していないウェルの吸光度と比較して計算した。上記に基づき、１Ｅ１１抗体を選択した。

実施例３：抗体配列の分析
抗体配列アッセイのために、ファージＦａｂ抗体ライブラリーを、それぞれのハイブリドーマのＲＮＡを用いて構築し、３段階のパニング（panning）を、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに結合するファージを得るために行った（Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）。ハイブリドーマを培養した後、ＲＮＡを、ＳＶ総ＲＮＡ単離システム（Promega, Cat. No. Z3100）を用いて単離し、ｃＤＮＡをそこから合成した。既知のプライマーセット（参照：Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて、抗体の可変領域を増幅し、ヒトＣｋおよびＣＨ１に連結後にＳｆｉＩ制限酵素を用いてｐＣｏｍｂ３Ｘベクター（Barbas laboratory, The Scripps Research Institute）にクローニングし、その後、ＥＲ２５３７細菌（New England Biolabs, Cat. No. 801−N）に形質転換した。形質転換された細菌は、ファージを得るためにＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Stratagene, Cat. No. 200251）を用いてトランスフェクションされ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃが固定化されているため、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに結合したクローンをイムノチューブ（immunotube(登録商標)）を用いて得た。

抗体のそれぞれについてのコロニーのうち、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに結合する抗体をＥＬＩＳＡアッセイにより確認した。形質転換された細菌のコロニーを、６００ｎｍでの吸光度が０．５に達するまで３７℃にて培養し、１ｍＭの終濃度のＩＰＴＧで処理して、３０℃で一晩培養しながら、Ｆａｂの形態で抗体を発現させた。５ｍＬの培養後、細胞を遠心により集め、０．４ｍＬの１×ＴＥＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）スクロース、ｐＨ８．０）注に懸濁し、４℃にて１０分間処理した。そこへ０．６ｍＬの０．２×ＴＥＳを添加後、結果物を４℃にて３０分間処理し、遠心して、上清を回収した。１μｇ／ｍＬの濃度でＨＥＲ２−ＥＣＤ−ＦｃでコーティングしたＣｏｓｔａｒ ９６ウェルハーフエリアプレート（Corning Inc., Cat. No. 3690）をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＢＳ−Ｔ／ＳＭ（３％無脂肪スキムミルク、０．０５％トライトンＸ−１００）を用いて、室温にて１時間ブロッキングした。各コロニーについての培養液またはペリプラズム抽出物(Periplasm)を、ＴＢＳ−Ｔ／ＳＭを用いて１：３の比でそれを希釈することによって処理し、室温にて１時間結合させた。３回洗浄後、二次抗体としての抗ＨＡ−ＨＲＰ（Roche, Cat. No. 120−138−190−01）を１：５０００の比で希釈し、室温にて１時間結合させて、３回洗浄し、ＴＭＢを用いて発色させた。

細胞培養液またはペリプラズム抽出物中の大部分のコロニーが０．２以上の吸光度を有し、抗体の配列を、これらのクローンについて分析した。配列分析は、単一のハイブリドーマに由来するコロニーは、同じ配列を有することが示されたことを明らかにした。１Ｅ１１抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を以下の表１にまとめる。

実施例４：キメラ抗体の構築および生産
キメラ抗体は、本発明の抗体をより新薬開発を可能にする形態（druggable form）で調製するために構築された。

ヌクレオチド配列分析を完了させるためにマウス抗体の可変領域を増幅し、ヒト定常領域ＣκおよびＣＨに結合させ、重鎖部分をｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Cat. No., K8300−01）ベクターによりＴＡクローニングし、一方で、軽鎖部分をｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Cat. No., 12744−017）ベクターによりＴＡクローニングした。増幅に用いたプライマーを以下の表２および３に示す。フォワードプライマーをＣｌａＩ制限部位を用いて挿入し、他方、リバースプライマーを重鎖についてＮｈｅＩ制限部位を、軽鎖についてＢｓｉＷＩ制限部位をそれぞれ用いて添加した。さらに、可変領域内のフォワードプライマーを、キメラ抗体が細胞培養液中に分泌され得るように、シグナル配列を用いて添加した。本発明で用いるＣκおよびＣＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号１１から１４に記載されている。

ＰＣＲ反応（９５℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、そして７２℃にて３０秒）を、上記のプライマーおよびＧｏＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Promega, Cat. No. M3005）を用いて３５サイクル繰り返して行った。可変領域および定常領域の増幅されたＰＣＲ産物のそれぞれを、１％アガロースゲル電気泳動後に、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（QIAGEN, Cat. No. 28706）を用いて精製した。可変領域および定常領域を連結するために、可変領域および定常領域のＰＣＲ産物を等量で混合し、オーバーラップ伸長ＰＣＲを、可変領域についてフォワードプライマーを、定常領域についてリバースプライマーを用いて行い、遺伝子産物を得て、該産物を上記と同様の方法で精製した。オーバーラップ伸長ＰＣＲ（９５℃にて３０秒、５８℃にて３０秒、そして７２℃にて４５秒）を、複数のプライマーを用いて３５サイクル繰り返して行い、ＧｏＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Promega, Cat. No. M3005）を用いて行った。増幅された遺伝子産物を、製造元のマニュアルに従って、重鎖部分についてｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Cat. No., K8300−01）ベクターにＴＡクローニングし、軽鎖部分についてｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（Invitrogen, Cat. No., 12744−017）ベクターにＴＡクローニングした。

上の表中、太字部分は制限酵素のための制限部位を示し、下線を引いた部分はシグナル配列を示す。

最終的に構築されたｐｃＤＮＡ３．３−ＩｇＧヘビーベクターおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＩｇＧカッパベクターの遺伝子地図を図１に示す。

その後、クローニングされたベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３Ｆ（Invitrogen, Cat. No. R790−07）動物細胞にポリエチレンイミン（Polyscience Inc., Cat. No. 23966）を用いて一過的にトランスフェクションし、キメラ抗体をプロテイン−Ａセラミック・ハイパードＦ樹脂（PALL, Cat No. 20078−028）を用いて細胞培養液から精製した。精製されたキメラ抗体を、ＢＣＡアッセイ（Pierce, Cat. No. 23227）により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って定量し、それらの濃度および純度をクーマシー染色によって確認した。

実施例５：乳癌および胃癌細胞の増殖に対する開発された抗体の阻害効果の比較
開発された抗体の抗癌効果をその濃度に応じて確認するために、細胞生存率アッセイを、ＨＥＲ２を過剰発現している癌細胞株、例えば、ＢＴ−４７４（乳癌細胞株）およびＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌細胞株）について行った。ＢＴ−４７４（１０，０００細胞／ウェル）およびＮＣＩ−Ｎ８７（１０，０００細胞／ウェル）を７０μＬの容量で９６ウェルプレートに分注し、２４時間培養しながら、固定化した。次の日、３０μＬの抗体を培養細胞に添加した。処理された抗体の終濃度は、各抗体当たり最大２０μｇ／ｍＬであって、１：４の比で連続希釈し、アッセイを５つの異なる濃度で行った。トラスツズマブとの組み合わせで処理したとき、開発された抗体とトラスツズマブとの比を１：１の比に設定した（例えば、図２Ａおよび２Ｂ中、投与量が１μｇ／ｍＬであったとき、１μｇ／ｍＬのＴＲＡおよび１μｇ／ｍＬの１Ｅ１１を投与した）。抗体で処理した後、ＢＴ−４７４およびＮＣＩ−Ｎ８７細胞をさらに４日間培養し、１０％の終濃度までＣＣＫ−８を添加し、３７℃にて３時間処理した。その後、処理した細胞の吸光度を、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３を用いて４５０ｎｍで測定した。抗体で処理されていない細胞の吸光度を１００％に設定し、それらの相対生存率を計算した（図２Ａおよび２Ｂ）。

開発された１Ｅ１１抗体は、トラスツズマブに反応したＮＣＩ−Ｎ８７細胞株（図２Ａ）およびＢＴ−４７４（図２Ｂ）細胞株の増殖に対する阻害効果を示した。さらに、１Ｅ１１抗体とトラスツズマブの併用療法は、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＢＴ−４７４細胞株については、トラスツズマブ単独での処理よりも、癌細胞の増殖に対する高い阻害活性を示した。興味深いことに、１Ｅ１１抗体およびトラスツズマブの併用療法は、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株について、トラスツズマブおよびペルツズマブの療法よりも癌細胞の増殖に対して高い阻害活性を示した（図２Ａ）。

実施例６：トラスツズマブとの併用療法における開発された抗体の相乗効果の確認
胃癌における開発された１Ｅ１１抗体とトラスツズマブの併用療法の抗癌効果が相乗効果であるかどうかを確認するために、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を１Ｅ１１抗体またはトラスツズマブ単独またはそれらの組み合わせで処理して、抗癌効果を分析した（図２Ａ）。濃度に応じた抗癌効果を、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラム（Biosoft）により、少なくとも２つの薬剤の併用投与の効果を分析するＣｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙの方法（Chou et al., Adv. Enzyme. Regul. 22:27−55(1984)）を用いて分析した（表４）。２つの薬剤が併用投与されるとき、それらは、アゴニスト作用、相加作用、または相乗作用のいずれかを示す。薬剤の、相互作用は、併用係数（ＣＩ）の点でＣｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙの方法を用いて分析することができる。１以上のＣＩ値はアゴニスト作用を示し、ＣＩ値が１および１以下は、相加作用および相乗作用をそれぞれ示す。

上記の表中、ＥＤ５０、ＥＤ７５およびＥＤ９０は、５０％、７５％および９０％の集団においてそれぞれ効果を示す、有効量を示す。‘ｒ’は、中央値−効果プロット（median−effect plot）の線形相関係数を示している。

図２Ａおよび表４で見られる通り、それらの併用時のトラスツズマブおよび１Ｅ１１クローンの２つの薬剤のＣＩ値は、０．１未満であった。従って、２つの抗体を組み合わせて投与した場合に相乗効果を有することが確認された。

実施例７：開発された抗体とトラスツズマブとのエピトープの比較
ＨＥＲ２に対する抗体であるトラスツズマブは、ＨＥＲ２ ＥＣＤの４つのドメインのうちドメイン４に結合することが知られている。開発された抗体のＨＥＲ２上のエピトープがトラスツズマブのものと重複するかどうかを確認するために、エピトープビニング（epitope binning）を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（GE Healthcare）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により行った。約１，０００ＲＵ（応答単位）のトラスツズマブを、ＥＣＤ／ＮＨＳを用いたアミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare, Cat. No. BR−1000−12）に固定化した。３２０ｎＭの濃度のＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、センサーチップに結合させ、そこにＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％トゥイーン−２０、ｐＨ７．４）を用いて４分間トラスツズマブを固定化させ、そこに５分間、緩衝液のみを流し、その後、トラスツズマブとＨＥＲ２−ＥＣＤとの結合を安定化させた。次いで、そこに１μｇ／ｍＬの濃度で二次抗体を４分間結合させ、その上に緩衝液を流した。全ての実験において、流量は５０μＬ／分に設定した。二次結合した抗体が、トラスツズマブが結合したＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質にさらに結合するとき、それらは、トラスツズマブと共通のエピトープを共有していない抗体である。

図３Ａに示す通り、二次抗体として用いたｈＩｇＧは、ＨＥＲ２に結合しないため、さらなる結合はなく、トラスツズマブは同じエピトープを有するため、それがさらに結合することはない。対照的に、１Ｅ１１抗体は、トラスツズマブに結合させたＨＥＲ２−ＥＣＤにさらに結合し、それ故に、それは、トラスツズマブのエピトープと異なるエピトープを有することが確認された。

１Ｅ１１クローンが結合するドメイン領域を確認するために、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインを構成する４つのサブドメイン（ドメイン１−４）を、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域およびＦｃ領域を結合させた動物細胞を用いて個々に製造し、プロテイン−Ａを用いて精製した。１Ｅ１１クローン、トラスツズマブ、ペルツズマブの結合は、このように生産された組み換えタンパク質についてのＥＬＩＳＡアッセイにより確認された。図３Ｂに見られる通り、１Ｅ１１クローンは、トラスツズマブと同様に、サブドメイン４に結合することが示された。

以上の結果から、１Ｅ１１クローンは、ＨＥＲ２タンパク質のＥＣＤのサブドメイン４に結合するが、それらは、トラスツズマブとは異なるエピトープに結合することが確認された（図３）。

実施例８：ＨＥＲ２に対する開発された抗体の特異性
開発された１Ｅ１１抗体は、ＨＥＲ２が属するＥｒｂＢファミリータンパク質のうち、ＨＥＲ２に特異的に結合し、それらがヒト以外の種のＨＥＲ２と結合するか否かは、ＥＬＩＳＡアッセイによって確認された。開発された１Ｅ１１抗体がＥｒｂＢファミリータンパク質のうちＨＥＲ２に特異的に結合するかどうかを確認するために、ＥｒｂＢファミリーに属するＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４の細胞外ドメインを、ＥＬＩＳＡアッセイにより調べた。ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ）の細胞外ドメインを、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃと同様の方法で製造し、ＨＥＲ３（R＆D Systems, ＃348−RB−050）およびＨＥＲ４（R＆D Systems, ＃1131−ER−050）を購入した。開発された抗体が異なる種のＨＥＲ２タンパク質に対する種間交差反応性を示すかどうかを確認するために、ヒト、アカゲザル、カニクイザル、マウス、およびラットのＨＥＲ２細胞外ドメインを使用し、ＥＬＩＳＡアッセイによって確認した。カニクイザルの細胞外ドメインは、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃと同様にして作製し、アカゲザルのＨＥＲ２細胞外ドメイン（Sino Biological Inc., ＃90020−K08H）、マウスのＨＥＲ２細胞外ドメイン（Sino Biological Inc., ＃50714−M08H）、およびラットのＨＥＲ２細胞外ドメイン（Sino Biological Inc., ＃80079−R08H）を購入した。

図４Ａおよび４Ｂに見られる通り、開発された１Ｅ１１抗体は、ヒトＥｒｂＢファミリータンパク質のうち、ＨＥＲ２に特異的に結合し、アカゲザルおよびカニクイザルのＨＥＲ２タンパク質の種間交差反応を有することが確認された。

実施例９：ＨＥＲ２抗体のアポトーシス分析
本発明者らは、ＨＥＲ２抗体のアポトーシス誘導能力を分析して、１Ｅ１１抗体とトラスツズマブの同時投与の抗癌効果の基本的分子機序を明らかにした。アポトーシス誘導能を調べるために、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＢＴ−４７４細胞を１０μｇ／ｍＬの１Ｅ１１抗体、トラスツズマブまたはそれらの組み合わせで４８時間処理した（併用投与について、１０μｇ／ｍＬの１Ｅ１１および１０μｇ／ｍＬのトラスツズマブ）。抗体処理後、細胞をトリプシンで剥離し、５００，０００細胞を、ＡｐｏＳｃｒｅｅｎ アネキシンＶアポトーシスキット（SouthernBiotech, ＃10010−02）を用いてフローサイトメトリー分析（Cytomics FC500 , Beckman Coulter Inc.）により分析した（図５ａおよび５ｂ）。

アポトーシスにおいて重要な役割を果たすカスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の活性を測定するために、１Ｅ１１抗体、トラスツズマブまたはそれらの組み合わせの抗癌効果を、処理時間にわたって分析した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、抗体を１０μｇ／ｍＬの抗体で処理した。処理の２４時間および４８時間後に、カスパーゼ−Ｇｌｏ（Promega, ＃G7571）を用いて細胞生存率アッセイを行った（図５ｃ）。細胞生存率が、処理の２４時間後に急激に減少したことが示された。このような結果に基づいて、カスパーゼ−３／７の活性は、処置の２４時間後に測定された。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗体で２４時間、処理した。カスパーゼ−Ｇｌｏ ３／７アッセイ（Promega, ＃G809）を用いて、カスパーゼ−３／７活性を測定した（図５ｄ）。

図５ａおよび５ｂに示す通り、１Ｅ１１抗体単独では、ＨＥＲ２を過剰発現する胃癌（ＮＣＩ−Ｎ８７細胞）および乳癌（ＢＴ−４７４細胞）に対して、トラスツズマブとは異なり、アポトーシス誘導活性を発揮することが示された。１Ｅ１１抗体のアポトーシス活性は、トラスツズマブとの併用処理でさらに増加した。１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理の増加したアポトーシス活性は、アポトーシスにおいて重要な役割を果たす、カスパーゼ−３／７活性の増加によるものと分析された（図５ｄ）。

実施例１０：抗体によるＨＥＲ２の細胞シグナル伝達阻害
ＨＥＲ２を過剰発現する胃癌および乳癌細胞に対する、トラスツズマブとの組み合わせでの１Ｅ１１の抗癌機序を解明するために、本発明者らは、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達活性を分析した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を１０μｇ／ｍＬの抗体で２４時間処理した。その後、細胞を細胞溶解溶液［５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）］で溶解して、細胞溶解物を得た。該細胞溶解物をウェスタンブロット分析を行った。ＨＥＲ２（＃４２９０）、ｐＨＥＲ２（＃２２４３）、ｐＨＥＲ３（＃４７９１）、ＥＧＦＲ（＃４２６７）、ｐＥＧＦＲ（＃３７７７）、ＡＫＴ（＃４６９１）、ｐＡＫＴ（＃４０６０）、ＥＲＫ（＃４６９５）、およびｐＥＲＫ（＃４３７０）抗体を、Cell Signaling Technology社から購入した。ＨＥＲ３（ｓｃ−２８５）抗体を、Santa Cruz Biotechnology社から購入し、ＧＡＰＤＨ（ＡｂＣ−１００１）抗体をコーディング対照としてAbClonから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＡｂＣ−５００１）および抗ラット抗体（ＡｂＣ−５００３）もまた、AbClonから購入した。バンドは、Ａｂシグナル（AbClon, AbC−3001）を用いて可視化した。

本発明者らは、１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用処理が、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたは別のＥｒｂＢファミリータンパク質のようなＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻害するかどうかを、さらに調べた。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、ＨＥＲ２とＥＧＦＲとのヘテロ二量体化を誘導するためにＥＧＦで処理し、ＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘテロ二量体化の誘導のためにＨＲＧ(ヘレグリン)で処理した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、０．１％ ＦＢＲを添加した細胞培地中に分注し、２４時間培養した。その後、細胞を１０μｇ／ｍＬの抗体で１時間処理し、次いで２００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（R＆D Systems, ＃236−EG−200）またはＨＲＧ（R＆D Systems, ＃377−HB/CF）で処理した。３日後、細胞生存率を試験した。

図６ａに示す通り、１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用療法は、ＨＥＲ２タンパク質濃度の低下に寄与する。ＨＥＲ２タンパク質濃度が低下すると、リン酸化ＨＥＲ２タンパク質も減少した。本発明者らは、全タンパク質濃度の変化なしで、リン酸化ＨＥＲ３およびＥＧＦＲ濃度の減少を観察した。このような結果は、１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用療法が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの活性を制御することができることを示している。そのような活性を制御することによって、周知のＨＥＲ２下流因子であるＡＫＴおよびＥＲＫの活性もまた、総タンパク質濃度を変化させることなく改変された。

１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用療法は、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ（またはＨＥＲ３）のヘテロ二量体化による細胞増殖の減少をもたらすことが示された（図６ｂ）。ＨＥＲ２およびＥＧＦＲのヘテロ二量体化を誘導し得るＥＧＦ、ならびにＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化を誘導し得るＨＲＧによるＮＣＩ−Ｎ８７細胞増殖は、他の受容体に結合してＨＥＲ２を阻害することが知られているペルツズマブと同様のレベルで、１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用処理により減少された。

これらの結果は、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ（またはＨＥＲ３）のヘテロ二量体化を介する細胞シグナル伝達が、１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用療法によって抑制されたことを示す。

実施例１１：動物モデルにおける抗体の抗癌効果
１Ｅ１１抗体の抗癌効果は、動物モデルを用いて評価した。無胸腺ヌード雌マウス（Daehan Biolink, Korea）を、異種移植モデルを調製するために、５ｘ１０^６のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を皮下注射した。腫瘍サイズを約２００ｍｍ^３まで増殖させ、次いで、マウスを４つの群に無作為化した。４つの群の動物に対して、１０ｍｇ／ｋｇのパリビズマブ（トラスツズマブのアイソタイプコントロール（MedImmune LLC.））、１Ｅ１１、トラスツズマブ、および１Ｅ１１とトラスツズマブの併用でそれぞれ２週間腹腔内投与した。併用投与のために、各抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。腫瘍容積を経時的に測定した。２２日目に、動物を屠殺し、腫瘍を単離した。腫瘍容積を、式（Ｌ^＊Ｗ^＊Ｗ）／２（式中、“Ｌ”は、最大腫瘍直径を示し、“Ｗ”は最小腫瘍直径を示す）を用いて計算した。単離された腫瘍を計量し、免疫組織化学分析のために調製した。腫瘍異種移植片組織をホルマリン固定処理し、パラフィン包埋標本切片とした。これらを、ヘマトキシリン（ＤＡＫＯ、＃ＣＳ７００）およびエオシン（ＤＡＫＯ、＃ＣＳ７０１）（Ｈ＆Ｅ）染色ならびにＨＥＲ２抗体（Cell Signaling Technology, ＃4290）を用いるＨＥＲ２タンパク質染色によって調べた。

１Ｅ１１単独は、トラスツズマブと同程度に腫瘍増殖を阻害した（図７ａ）。１Ｅ１１は、各単一抗体処理と比較して、トラスツズマブとの組み合わせで顕著に増大した抗腫瘍活性を示した。抗腫瘍活性はまた、実験後に抽出された腫瘍塊を分析することにより確認された（図７ｂ）。１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理によるＨＥＲ２を発現する細胞の減少は、免疫組織化学染色で観察され（図７ｃ）、それはウェスタンブロッティングの結果と互換性があった（図６ａ）。これらの結果は、トラスツズマブと組み合わせた１Ｅ１１が、単一の抗体処理と比較して、ＨＥＲ２タンパク質の発現の抑制に起因して、腫瘍増殖を顕著に阻害することを示す。

実施例１２：ヒト化抗体の開発およびそれらの効果の確認
実施例４で開発されたキメラ１Ｅ１１抗体のヒト化抗体は、ＣＤＲグラフト法を用いて開発された。開発された抗体のＣＤＲを受容するために、ヒト抗体について、高いヌクレオチド配列ベースの相同性を有するヒト生殖系列抗体遺伝子のＶおよびＪ遺伝子を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Brochet, X. et al., Nucl Acids Res. 36:503−508(2008)）を用いて選択した。重鎖のＶ遺伝子およびＪ遺伝子として、ＩＧＨＶ３−４８^＊０３遺伝子およびＩＧＨＪ４^＊０１遺伝子をそれぞれ選択し、それらの配列相同性はそれぞれ８５．０７％および８７．２３％であった。さらに、軽鎖のＶ遺伝子およびＪ遺伝子として、ＩＧＫＶ１−３９^＊０１遺伝子およびＩＧＫＪ１^＊０１遺伝子をそれぞれ選択し、それらの配列相同性はそれぞれ８１．３６％および８１．０８％であった。ＣＤＲの移植のみが親和性を低下させるという報告を考慮して、抗体の全体構造に影響を与え得るバーニアゾーン（vernier zone）に対応する重鎖のＫａｂａｔの番号付けに基づいて、Ｈ４９は、ヒト生殖系列遺伝子上でアラニンの代わりにセリンで置換されている。開発されたヒト化抗体ｈｚ１Ｅ１１は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ(商標) ２９３Ｆ細胞株を用いてＩｇＧの形態で製造された。開発されたｈｚ１Ｅ１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２４および２６にそれぞれ記載されている。

ＨＥＲ２に対する１Ｅ１１の親和性、開発されたヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより測定された。全ての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を用いて行った。最初に、ヒトＩｇＧに対するヤギ抗体を、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに１０００ＲＵの濃度で固定化した。トラスツズマブ、ペルツズマブ、およびｈｚ１Ｅ１１をそれぞれ、２．８４μＭ、５．６８μＭ、および７．１μＭにＨＢＳ−Ｐ緩衝液を用いて希釈した。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質に結合する前に、各抗体を、５０μＬ／分の速度で１８０秒間結合させ、安定化の目的のために緩衝液をその上に流した。次に、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、６４０ｎＭ、３２０ｎＭ、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭおよび０ｎＭの濃度で４分間結合させて、その上に緩衝液を１５分間流した。センサーチップは、１０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）緩衝液をその上に流すことにより再循環させた。全てのセンサーグラムデータを、ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて１：１相互作用モデルにより分析した。抗体の親和性は、以下の表５にまとめた。トラスツズマブおよびペルツズマブの親和性は、それぞれ１．９４ｎＭおよび１．８９ｎＭであり、一方、開発した抗体１Ｅ１１の親和性は、１６．０ｎＭであった。１Ｅ１１のヒト化抗体の親和性は、１０．４ｎＭであり、既存の１Ｅ１１抗体とはほとんど差異がなかった。

１Ｅ１１の開発されたヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１の抗癌効果は、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７およびＯＥ−１９において確認された（図８）。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞におけるｈｚ１Ｅ１１の単剤処理は、トラスツズマブ処理と同様の癌の生存率の減少を示したが、ｈｚ１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理は、各抗体の単剤処理と比較して癌の生存率の顕著に高い減少を示した（図８Ａ）。さらに、異なるヒト胃癌細胞株であるＯＥ−１９におけるｈｚ１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理は、各抗体の単剤処理と比較して癌の生存率のより高い減少を示した（図８Ｂ）。さらに、ｈｚ１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理は、癌細胞の増殖に対して、１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理（図２Ａ）よりも高い阻害効果を示した（図８Ａ）。ｈｚ１Ｅ１１とトラスツズマブの併用処理は、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＯＥ−１９細胞株において、癌細胞の増殖に対して、トラスツズマブとペルツズマブの併用処理よりも高い阻害効果を示した。

上記の結果は、１Ｅ１１の開発されたヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１が、従来の１Ｅ１１と比較して同等の結合能力を有し、改善された抗癌効果を有することを示す。

１Ｅ１１の開発されたヒト化抗体であるｈｚ１Ｅ１１のトラスツズマブとの併用処理の抗癌効果は、ＮＣＩ−Ｎ８７を用いて異種移植モデルにおいて確認された。ＮＣＩ−Ｎ８７移植により形成された癌を有するマウスに、開発された抗体およびトラスツズマブのアイソタイプ対照群、ｈｚ１Ｅ１１、トラスツズマブ、ならびにｈｚ１Ｅ１１およびトラスツズマブの組み合わせをそれぞれ１週間に２回腹腔内注射した。アイソタイプ対照群とトラスツズマブを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。併用処理の場合には、ｈｚ１Ｅ１１およびトラスツズマブを１：１の比で混合し、各抗体に基づき、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ｈｚ１Ｅ１１およびトラスツズマブの併用処理は、用量依存的に癌の増殖の減少を示した（図９）。１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブの投与で観察された抗癌効果は、１ｍｇ／ｋｇのｈｚ１Ｅ１１またはトラスツズマブの投与でも観察された。ｈｚ１Ｅ１１およびトラスツズマブの５ｍｇ／ｋｇより高用量での投与は、癌の増殖を阻害するだけでなく、既に形成された癌も減少させたことが示された。

実施例１３：開発された抗体の結合領域の確認
開発された抗体の抗原に結合するために重要な領域を確認するために、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３に対応するアミノ酸をアラニンに返還することによって結合能を試験するアラニンスキャニングアッセイを行った。Ｋａｂａｔの番号付けに従い９５、９６、９７、９８、９９および１００ａに対応する重鎖のＣＤＲ３領域のうち、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）、ならびにＫａｂａｔ番号付けに従い８９、９０、９１、９２、９３および９４に対応する軽鎖のＣＤＲ３領域のうち、グルタミン（Ｑ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２００５１８）を用いてアラニンに変更した。開発された抗体はアラニンを有するため、重鎖のＣＤＲ３のうち、Ａ１００をアッセイから除外した。細菌において各改変された抗体を発現させた後、その発現をそこからのペリプラズム抽出液を得た後にドットブロットにより確認し、結合能力をＥＬＩＳＡアッセイによりＨＥＲ２−ＥＣＤについて分析した（参照：図１０）。

表６および図１０Ａおよび１０Ｂに見られる通り、改変された抗体は、同様のレベルで発現されたが、重鎖のＧ９８Ａは、その結合能の完全な消失を示し、重鎖のＧ９７Ａは、その結合能の顕著な減少を示した。他の領域の変更は、抗原−抗体結合に顕著な効果を示さなかった。

実施例１４：開発された抗体の親和性の改善
開発された抗体の親和性を向上させるために、軽鎖および重鎖の無作為化ＣＤＲ３のライブラリを開発した。Ｋａｂａｔの番号付けによるアミノ酸番号Ｆ１００、Ｄ１０１、およびＹ１０２に対応する重鎖のＣＤＲ３のうちＦ、ＤおよびＹ、ならびにＫａｂａｔの番号付けによるＰ９５、Ｗ９６およびＴ９７に対応する軽鎖のＣＤＲ３のうちＰ、ＷおよびＴは、それらがヒト抗体において一般的に見出されるアミノ酸であるため、無作為化から除外された。上記のアミノ酸を除く、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３アミノ酸の２０個の無作為化されたアミノ酸のファージ抗体ライブラリが、開発された（Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press）。特に、上記で用いたプライマーは、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３に相当する領域に関連し、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）が、等しい比率で混合されて、無作為化されるべきアミノ酸に対応するコドンの第一および第二の位置にランダムに挿入され、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）が、等しい比率で混合されて、第三の位置に挿入されるように、合成された。

開発されたライブラリから改善された親和性を有するクローンを選択するために、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチニル化キット（Thermo Scientific, ＃21435）を用いてビオチニル化し、抗体を選択するための抗原として用いた。開発されたファージ抗体ライブラリおよびビオチン−ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、室温にて２時間結合させ、抗原に結合したファージを、５０μＬのダイナビーズＭ−２７０ストレプトアビジン（Invitrogen, ＃653.06）を用いて分離した。上記の選別プロセスを４回行い、こうして選択されたコロニーのうちＨＥＲ２−ＥＣＤに結合する抗体を発現するコロニーを、ペリプラズム抽出物を用いたＥＬＩＳＡアッセイにより選択し、選択されたコロニーで発現される抗体の配列を、ヌクレオチド分析により確認した。ＨＥＲ２−ＥＣＤに結合する抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を、以下の表７および８にまとめる。各表中の数字は、ｈｚ１Ｅ１１の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。

選択されたクローンのうち改善されたＫｏｆｆを有するクローンを選択するために、該クローンを、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（GE Healthcare）により分析した。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、ＥＣＤ／ＮＨＳを用いてアミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに固定化した。ＩＰＴＧを用いて各クローンから抗体を発現させた後、そこからペリプラズム抽出物を得て、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓに結合させた。各抗体についてのＫｏｆｆ値を、ＢＩＡ評価ソフトウェアによって分析した。以上のことから、改善されたＫｏｆｆ値を有する抗体が選択された（参照：表９ａ）。表９ａは、本発明者らによって開発されたクローンのうち、ｈｚ１Ｅ１１親抗体と比較して同様または改善されたＫｏｆｆ値を示すクローンの代表的な例を示している。

表９ａに見られる通り、本発明の一般式１で示される種々のＣＤＲＨ３および一般式２で示されるＣＤＲＬ３は、親抗体ｈｚ１Ｅ１１のＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３と比較して同様のまたは改善されたＫｏｆｆ値を示す。

軽鎖の無作為化ＣＤＲ３配列のうち、実験は、ｈｚ１Ｅ１１−３、ｈｚ１Ｅ１１−１３３およびｈｚ１Ｅ１１−１５４を用いて行った。

ｈｚ１Ｅ１１−３、ｈｚ１Ｅ１１−１３３およびｈｚ１Ｅ１１−１５４の重鎖可変領域は、ｈｚ１Ｅｌｌのものと同じであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２４７、２４９および２５１にそれぞれ記載されている。

選択された３種類の抗体の親和性の増加を確認するために、抗体は、ＩｇＧの形態で製造された。２０００ ＲＵの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Invitrogen, ＃H10500）を、ＥＣＤ／ＮＨＳ法によってＣＭ５センサーチップに固定化した。次いで、抗体を５０μＬ／分の速度で５分間結合させて、そして緩衝液を安定化の目的のために５分間、その上に流した。抗体の結合のために用いた抗体の濃度は、トラスツズマブ（ＴＲＡ）について０．４μｇ／ｍＬ、ペルツズマブ（ＰＥＲ）について０．８μｇ／ｍＬ、ならびにｈｚ１Ｅ１１および選択された抗体について１μｇ／ｍＬであった。抗体を安定化した後、６４０ｎＭ、３２０ｎＭ、１６０ｎＭ、８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、および０ｎＭの濃度のＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を、５０μＬ／分の速度で４分間結合させて、その上に緩衝液を１５分間流し、分離させた。各濃度を分析した後、それらは、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）を用いてリサイクルされ、後続のアッセイを行った。抗体の親和性は、ＢＩＡ評価ソフトウェアにより分析した。分析結果を表９ｂにまとめる。

上記の表９ｂにおいて、ｋａ、ｋｄ、ＲｍａｘおよびＫＤはそれぞれ、会合速度定数、解離速度定数、最大結合容量、平衡解離定数を示す。

表９ｂに見られる通り、ｈｚ１Ｅ１１−１３３およびｈｚ１Ｅ１１−１５４は、ｈｚ１Ｅ１１のＫｏｆｆ値と比較して、Ｋｏｆｆ値、すなわち、ｋｄ値の８．４倍の減少を示すが、それらは、ｋｏｎ値、すなわち、ｋａ値のわずかな増加を示した。最終的な親和性に関して、ｈｚ１Ｅ１１−１３３は１．５ｎＭを示し、ｈｚ１Ｅ１１−１５４は、１．１ｎＭを示し、ｈｚ１Ｅ１１のそれと比較して、１５倍の改善および２０倍の改善となった結果が明らかとなった。

実施例１５：改善された親和性を有する抗体の抗癌効果の確認
改善された親和性を有する抗体の抗癌効果を、ＨＥＲ２を過剰発現する胃癌および乳癌に関して確認した。ＨＥＲ２を過剰発現する胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７およびＯＥ−１９、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌細胞株ＢＴ−４７４を、各抗体単独で処理したか、またはトラスツズマブとの組み合わせで処理したときの、濃度に依存した癌細胞の生存率を分析した。

図１１Ａから１１Ｆに見られる通り、改善された親和性を有するｈｚ１Ｅ１１−３、ｈｚ１Ｅ１１−１３３、およびｈｚ１Ｅ１１−１５４抗体は、ｈｚ１Ｅ１１の効果と比較して、単独処理および併用処理において改善された効果を示した。

本発明の好ましい態様が記載されているが、本発明の精神の範囲内にあるその変異体および改変は当業者に明らかとなり得ることが理解されるべきであり、そして本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって決定されるべきである。

Claims (27)

1. （ａ）配列番号１の相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および以下の式１
   Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ （式１）
   (式中、Ｘ_１は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ_２は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＩｌｅまたはＡｌａであり、Ｘ_３は、ＧｌｙまたはＣｙｓであり、Ｘ_４は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ_５は、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ_６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、そしてＸ_７は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｈｒである。)
   で示されるＣＤＲＨ３を含む、重鎖可変領域；ならびに
   （ｂ）軽鎖可変領域
   を含む、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. Ｘ_２が、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. Ｘ_３がＧｌｙである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. Ｘ_４がＧｌｙである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. Ｘ_１が、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ_２が、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ_３がＧｌｙであり、Ｘ_４がＧｌｙであり、Ｘ_５が、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａであり、Ｘ_６が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、そしてＸ_７が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＣｙｓまたはＴｈｒである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. Ｘ_１が、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ_２が、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ_３がＧｌｙであり、Ｘ_４がＧｌｙであり、Ｘ_５がＴｈｒであり、Ｘ_６がＡｌａであり、そしてＸ_７がＳｅｒである、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. ＣＤＲＨ３が、配列番号３、２７−２８、３２および３９−８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. ＣＤＲＨ３が、配列番号３、４３、６４、６７、７１、７６、８３、８４または８５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
9. ＣＤＲＨ３が、配列番号３のアミノ酸配列である、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
10. 軽鎖可変領域が、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２および以下の式２
    Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｙ_５−Ｙ_６−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ （２）
    (式中、Ｙ_１は、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＡｌａであり、Ｙ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｌａであり、Ｙ_３は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｙ_４は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、Ｙ_５は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｌａであり、そしてＹ_６は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＬｅｕである。)
    で示されるＣＤＲＬ３を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
11. Ｙ_２がＧｌｎである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
12. Ｙ_３が、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
13. Ｙ_５が、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
14. Ｙ_６が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｓｎである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
15. Ｙ_１が、ＧｌｎまたはＡｓｐであり、Ｙ_２がＧｌｎであり、Ｙ_３が、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｙ_４が、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＭｅｔまたはＰｈｅであり、Ｙ_５が、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅであり、そしてＹ_６が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｓｎである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
16. ＣＤＲＬ３が、配列番号６、３３−３８または８７−２４５のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
17. ＣＤＲＬ３が、配列番号６、８８、１０９、１３１、１５５、１５６、１５７、１７８、２１８、２２０、２２２または２３９のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
18. ＣＤＲＬ３が、配列番号６、８８、２１８または２３９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
19. 重鎖可変領域が、配列番号８または２４のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
20. 軽鎖可変領域が、配列番号１０、２６、２４７、２４９または２５１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
21. （ａ）薬学的に有効量の請求項１から２０のいずれか一項に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、癌の予防または処置のための医薬組成物。
22. 組成物がトラスツマブをさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、気管支腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、結腸癌、子宮頚癌、脳腫瘍、前立腺癌、骨腫瘍、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌または輸尿管癌である、請求項２１に記載の医薬組成物。
24. 癌が、乳癌または胃癌である、請求項２３に記載の医薬組成物。
25. （ａ）薬学的に有効量の請求項１から２０のいずれか一項に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、アポトーシスを誘導するための医薬組成物。
26. 医薬組成物が、癌、過形成、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性赤血球増加症、白板症、肥厚性瘢痕、扁平苔癬、黒子症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄または狭窄である過剰増殖性疾患の予防または処置のためにアポトーシスを誘導する、請求項２５に記載の医薬組成物。
27. 請求項１から２０のいずれか一項に記載のＨＥＲ２に対する抗体またはその抗体結合フラグメントを含む、癌を診断するためのキット。