JP2018046795A - アミド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】工業的に非常に重要なアミド化合物の効率的な製造方法を提供する。【解決手段】ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法において電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した菌体および／またはその菌体処理物用いることを特徴とするアミド化合物の製造方法【選択図】なし

Description

本発明は、菌体および／またはその菌体処理物を触媒として用い、ニトリル化合物を水和してアミド化合物を得るアミド化合物の製造方法に関するものである。

アミド化合物の主要な製造方法の一つとして、ニトリル化合物を原料とする水和法は多くの場合に用いられており、アクリルアミド等のアミド化合物の工業的製法としては、例えば、ラネー銅等の金属銅を触媒として用い、アクリロニトリル等のニトリル化合物を水和する方法、あるいは近年ではニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物等を触媒として用い、ニトリル化合物を水和する方法が知られている。

菌体および／またはその菌体処理物を触媒として用いる方法は、アクリロニトリル等のニトリル化合物の転化率および選択率が高いことから工業的に注目を浴びている。
菌体触媒の活性は不安定であり、継時的に低下しやすい。また、菌体触媒は菌体の耐熱性を越える温度で活性の低下をもたらすことがあるため、反応槽は活性が維持される温度で通常は運転されている。例えば特許文献１では、熱に対して失活しやすい生体触媒を用いてアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、工業的な反応スケールでありながら反応熱を効率的に除去する方法として、反応温度と熱交換器に導入する冷却水の温度との温度差を一定の範囲に保持する方法が提案されている。特許文献２には、ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、より少ない触媒量でより高濃度の高品質なアクリルアミドを製造する方法として、３０℃未満で保存されたアクリロニトリルを使用する方法が提案されている。特許文献３には、菌体触媒の活性を低下させずに効率的にアミド化合物を製造する方法として、反応槽へ供給するニトリル化合物および水の温度を反応槽内の液温+１０℃以下で供給する方法が提案され、さらに、実施例においては、アクリロニトリルおよび純水の貯槽を１５℃の温度の水浴中に浸漬することにより貯槽内の温度を１５℃になるように制御し、かつ、菌体触媒の懸濁液の貯槽を５℃の温度の水浴中に浸漬することにより貯槽内の温度を５℃以下になるように制御する方法が開示されている。特許文献４には、ニトリル化合物からアミド化合物を製造するにあたり、生体触媒の劣化を抑えながら分散性が良好となることによりニトリル化合物からアミド化合物への変換効率を高める方法として、反応器内で攪拌しながら反応を行うアミド化合物の製造方法において、反応液流体の単位体積当たりの攪拌所要動力を０．０８〜０．７ｋＷ/ｍ³の範囲内にする方法が開示されている。特許文献５には、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法において、菌体とアミド化合物を含む液の輸送に、容積型ポンプを用いることにより不純物の少ないアミド化合物を製造する方法が開示されている。特許文献６には、アミド化合物の効率的な製造方法として、アミド化合物を製造する方法において温度制御装置および攪拌機を備えた菌体触媒貯槽を用いて菌体および／またはその菌体処理物を反応槽へ供給することを特徴とするアミド化合物の製造方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１や特許文献２に記載の方法においては、温度制御が実施されるのは反応槽や、供給される原料のみであり、菌体触媒を効率良く使用するには不十分であった。また、特許文献３に開示されている菌体触媒の懸濁液の貯槽を冷却する方法は、貯槽壁表面からのみの冷却となるため、貯槽内液を効率的に冷却することができない、また、貯槽内液を均一に冷却することができず、貯槽内液に温度分布が生じる。さらに、小スケールの菌体触媒の貯槽で検討されており、工業的なスケールでの除熱効率が考慮されていない。工業的な生産規模を考慮すると、菌体触媒の貯槽の容積は大きなものとなり、貯槽の容積が大きくなるほど、容積当たりの冷却に用いられる伝熱面積の割合は小さくなるため除熱はさらに困難になり菌体触媒を効率良く使用するには不十分である。また、特許文献４や特許文献５に記載の方法においては、反応器内へ供給された触媒の劣化は抑制されるものの、反応器への供給のために貯蔵されている触媒の劣化を抑制することはできない。また、特許文献６に記載の方法においては、反応器への供給のために貯蔵されている触媒の劣化の抑制が十分ではなく、未だ検討の余地が残されている。

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菌体および／またはその菌体処理物を用いたニトリル化合物の水和反応において、アミド化合物を効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法において、電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した菌体および／またはその菌体処理物を用いることにより菌体触媒の活性を低下させずに効率的にアミド化合物を製造することができることを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法において、電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した菌体および／またはその菌体処理物を用いることを特徴とするアミド化合物の製造方法
〔２〕ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである前記〔１〕に記載の製造方法
〔３〕アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである前記〔１〕または〔２〕に記載の製造方法

本願発明においては、菌体触媒の活性を低下させずに効率的にアミド化合物を製造することができる。

以下、本発明のアミド化合物の製造方法について説明する。
〔アミド化合物の製造方法〕
本発明のアミド化合物の製造方法は、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法において、電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した菌体および／またはその菌体処理物を反応槽へ供給する工程を有する。
＜ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物＞
本発明では、ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物（以下、これらを単に「菌体触媒」ともいう。）をニトリル化合物のアミド化合物への水和触媒として用いる。
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力（以下、「ニトリルヒドラターゼ活性」ともいう。）を有する酵素（たんぱく質）をいう。

ニトリルヒドラターゼを含有する菌体としては、ニトリルヒドラターゼを産生し、かつニトリル化合物およびアミド化合物の水溶液中でニトリルヒドラターゼ活性を保持している菌体であれば特に限定されない。ニトリルヒドラターゼを産生する菌体としては、例えば、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属、バクテリジューム（Bacteridium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する菌体が挙げられる。これらは一種で用いても二種以上を併用しても良い。
また、これら菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および組換えＤＮＡ技術を用いて該ニトリルヒドラターゼの構成アミノ酸の一個または二個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体等も挙げられる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２〔本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７８５として、特許手続き上の菌体の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。〕が挙げられる。

これら菌体の中でも、高活性、高安定性のニトリルヒドラターゼを有するという点で、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する菌体、および該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体、および変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体が好ましい。なお、上記形質転換体は、ニトリルヒドラターゼの安定性をより高め、菌体当たりの活性がより高い点で好ましい。

また、菌体内にニトリルヒドラターゼを高発現できる、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ−１、該菌体よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で高発現させた形質転換体も同様に好ましい。上記ニトリルヒドラターゼを産生する菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法により調製できる。

本発明に係る組換えベクターは、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を含有するものであり、ベクターにニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を連結することにより得ることができる。ベクターとしては、特に限定されるものではなく、例えば、pET-21a(+)、pKK223-3、pUC19、pBluescriptKS(+)およびpBR322等に代表される市販の発現プラスミドに、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を組み込むことにより、該ニトリルヒドラターゼの発現プラスミドを構築することができる。また、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自己増殖可能で、さらに外来のＤＮＡの形質が発現できるものであれば良く、例えば大腸菌が好例として挙げられるが、大腸菌だけに限らず枯草菌、酵母等に導入することにより、ニトリルヒドラターゼの産生能を有する形質転換体を得ることができる。

上述のようなニトリルヒドラターゼを産生する菌体は、公知の方法により、適宜培養し増殖させ、ニトリルヒドラターゼを産生させても良い。この場合に使用される培地としては炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養素を適量含有する培地であれば合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等の通常の液体培地に、菌体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でも良い。）で培養させることにより調製できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養等の通常の培養方法を用いて行うことができる。形質転換体の培養温度としては、１５〜３７℃が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではなく、培養の種類、培養方法により適宜選択すれば良く、菌株が生育しニトリルヒドラターゼを産生することができれば良い。

本発明では上述のニトリルヒドラターゼを産生する菌体を、ニトリル化合物と反応させるために、遠心等による集菌や、破砕し菌体破砕物を作製する等、さまざまな処理を行っても良く、これらのなんらかの処理を施した菌体を菌体処理物と総称する。

菌体破砕物を作製する場合の破砕される菌体の形態としては、ニトリルヒドラターゼを産生する菌体を含む限り特に限定はされず、例えば、該菌体を含む培養液そのもの、その培養液を遠心分離して分離・回収された集菌体、さらにこの集菌体を生理食塩水等で洗浄したものが挙げられる。

本発明では、菌体および／またはその菌体処理物を電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した状態で反応槽へ供給する。

一般に自然界の水や水道水にはカルシウムやナトリウム等の塩類成分が微量溶解しており、主にそれらの成分はイオンの状態で溶解しているため、塩類成分が溶解している水は電気伝導度が高くなる。本発明で菌体および／または菌体処理物の懸濁に用いる水の電気伝導度は１００μS/ｃｍ以下であり、好ましくは５０μS/ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μS/ｃｍ以下である。水の電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である場合には、そのまま懸濁に用いることができる。水の電気伝導度が１００μS/ｃｍより大きい場合には、水を精製し、電気伝導度を低くする。水を精製する方法は、特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができ、例えば、蒸留、イオン交換樹脂による処理、逆浸透膜による濾過が挙げられる。水の電気伝導度は、例えば、交流二電極法や電磁誘導法により測定することができる。

菌体および／またはその菌体処理物の懸濁液における菌体および／またはその菌体処理物の濃度は、特に制限はないが、高濃度の懸濁液を用いると粘度が高くなり反応槽への供給が困難となるため、好ましくは、０．１ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下、より好ましくは、０．５ｗｔ％以上３０ｗｔ％以下、さらに好ましくは、１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下である。

＜ニトリル化合物＞
ニトリル化合物としては、例えば、炭素数２〜２０の脂肪族ニトリル化合物、炭素数６〜２０の芳香族ニトリル化合物が挙げられ、一種で用いても二種以上を併用しても良い。

脂肪族ニトリル化合物としては、例えば、炭素数２〜６の飽和または不飽和ニトリルが挙げられ、具体的には、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリル等の脂肪族飽和モノニトリル類；マロノニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリル等の脂肪族飽和ジニトリル類；アクリロニトリル、メタクリロニトリル、クロトンニトリル等の脂肪族不飽和ニトリルが挙げられる。

芳香族ニトリル化合物としては、例えば、ベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−トルニトリル、ｏ−，ｍ−またはｐ−シアノピリジン、ベンジルシアナイドが挙げられる。

ニトリル化合物の中でも、アクリロニトリル、メタクリロニトリルが好ましい。
＜水（原料水）＞
原料水は特に限定されず、蒸留水、イオン交換水等の精製水を用いることができ、好ましくは、電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下の水である。
＜ｐＨ調節剤＞
ｐＨ調節剤は、反応液のｐＨを菌体触媒の活性を良好に保つための好適な範囲に調節するために用いられる。
反応に好適なｐＨが７よりも小さい場合には、ｐＨ調節剤として酸を用いることができる。
ｐＨ調節剤として用いる酸としては、無機酸、有機酸のいずれも用いることができる。無機酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、沃化水素等のハロゲン化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜沃素酸、亜沃素酸、沃素酸、過沃素酸等のハロゲン化オキソ酸、硫酸、硝酸、燐酸、硼酸が挙げられる。有機酸としては、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、蓚酸、マロン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、安息香酸等のカルボン酸やメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。ｐＨ調節剤として用いる酸は、気体、固体、液体いずれの状態でも用いることができるが、反応槽への供給の容易性を考慮すると、液体の状態のものを用いることは好ましく、気体あるいは固体の状態の酸は水溶液として用いることはより好ましい。反応槽のｐＨ調節の制御性を考慮すると、液体の状態の酸も水溶液として用いることはより好ましい。水溶液として用いる場合の酸の濃度は、特に制限はないが、高濃度の水溶液を用いるとｐＨ調節が困難となるため、好ましくは０．１ｗｔ％以上９９ｗｔ％以下、より好ましくは１ｗｔ％以上９０ｗｔ％以下、さらに好ましくは１ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下である。
反応に好適なｐＨが７よりも大きい場合には、ｐＨ調節剤として塩基を用いることができる。

ｐＨ調節剤として用いる塩基としては、無機塩基、有機塩基のいずれも用いることができる。無機塩基としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩、アンモニアが挙げられる。有機塩基としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、アニリン、ピリジンが挙げられる。ｐＨ調節剤として用いる塩基は、気体、固体、液体いずれの状態でも用いることができるが、反応槽への供給の容易性を考慮すると、液体の状態のものを用いることは好ましく、気体あるいは固体の状態の塩基は水溶液として用いることはより好ましい。反応槽のｐＨ調節の制御性を考慮すると、液体の状態の塩基も水溶液として用いることはより好ましい。水溶液として用いる場合の塩基の濃度は、特に制限はないが、高濃度の水溶液を用いるとｐＨ調節が困難となるため、好ましくは０．１ｗｔ％以上９９ｗｔ％以下、より好ましくは１ｗｔ％以上９０ｗｔ％以下、さらに好ましくは１ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下である。
＜反応槽＞
反応槽としては、一つの反応器から構成される単段の反応槽を用いても良く、複数の反応器から構成される多段の反応槽を用いても良い。反応器としては、槽型反応器を用いても良く、管型反応器を用いても良い。槽型反応器としては、撹拌機を備える反応器が好ましい。槽型反応器が攪拌機を有する場合の攪拌機の攪拌翼は任意の形状のものを選択でき、例えば、プロペラ翼、フラットパドル翼、ピッチドパドル翼、フラットタービン翼、ピッチドタービン翼、リボン翼、アンカー翼、フルゾーン翼が挙げられる。攪拌翼は、１枚であっても良く、複数枚備えていても良い。
反応槽には、循環ポンプを備えた外部循環ラインが設置されていても良い。循環ポンプを備えた外部循環ラインは、反応槽に一つ設置されていても、複数設置されていても良い。

反応槽にポンプを備えた外部循環ラインを設置する場合の、外部循環ラインに備えられたポンプは、特に限定されるものではなく、例えば、遠心ポンプ、傾斜ポンプあるいは軸流ポンプ等のターボ式ポンプや、往復ポンプや回転ポンプ等の容積型ポンプが挙げられる。
反応槽にポンプを備えた外部循環ラインを設置する場合には、外部循環ラインに備えられたポンプを用いて、反応液の一部が反応槽内から取り出され、外部循環ラインを経由して反応槽へ戻される。反応槽に設置された外部循環ラインには、温度制御装置が設置されていることは好ましい。温度制御装置としては、好ましくは熱交換器が挙げられる。熱交換器としては、例えば、多管円筒式、渦巻管式、渦巻板式、プレート式、二重管式等の形態のものが挙げられる。
複数の反応器から構成される多段の反応槽にポンプを備えた外部循環ラインを設置する場合には、ポンプを備えた外部循環ラインは各々の反応器に全て設置されていても良く、いずれか一つの反応器にのみ設置されていても良い。複数の反応器から構成される場合において、ポンプを備えた外部循環ラインがいずれか一つの反応器にのみ設置される場合には、一段目の反応器（最も上流に位置する反応器）に設置されることが好ましい。

一段目の槽型反応器と二段目の管型反応器とから構成される反応槽を用い、槽型反応器から取り出される反応液を管型反応器で更に反応させる形態とし、槽型反応器にポンプを備えた外部循環ラインを設置する反応槽は、転化率を向上できるのでより好ましい。

槽型反応器および管型反応器は、菌体触媒のニトリルヒドラターゼ活性が維持される温度に保たれる限り、熱交換器を備えていてもいなくても良いが、後述する反応槽温度を制御するため、前記反応器は熱交換器を備えることが好ましい。熱交換器としては、例えば、多管円筒式、渦巻管式、渦巻板式、プレート式、二重管式等の形態のものを外部循環ライン上に設置することは好ましく、それ以外にも、ジャケット式、コイル式等の反応器に直接設置する形態のものが挙げられる。反応器が管型反応器である場合は、反応器自体を多管円筒式あるいは二重管式の熱交換器で構成することが可能である。

反応方法としては、例えば、（１）菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤を反応槽に一度に全量仕込んでから反応を行う方法（回分反応）、（２）菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤の一部を反応槽に仕込んだ後、連続的または間欠的に残りの菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤を供給して反応を行う方法（半回分反応）、（３）菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤の連続的または間欠的な供給と、反応液（菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む。）の連続的または間欠的な取り出しを行いながら、反応槽内の反応液を全量取り出すことなく連続的に反応を行う方法（連続反応）が挙げられる。これらの中でも、工業的にアミド化合物を大量かつ効率的に製造しやすい点で、連続反応が好ましい。

反応は、菌体触媒の存在下で行われる。菌体触媒の使用形態として、好ましくは懸濁床であり例えば連続反応の場合、菌体触媒の懸濁液を調製し、懸濁液を反応槽に供給すれば良い。

なお、反応槽として複数の反応器から構成される多段の反応槽を用いる場合、その構成としては、（ａ）菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤を上段の反応器に供給し、上段の反応器から取り出された反応液（菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む。）を、下段の反応器に供給する直列式態様、（ｂ）菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤を二以上の反応器に（他の反応器を経由せずに）直接供給する並列式態様が挙げられる。

例えば、多段の反応槽を用いて連続反応を行う場合において、菌体触媒、反応原料（ニトリル化合物および原料水）およびｐＨ調節剤の供給先は、一段目の反応器（最も上流に位置する反応器）のみに限定されず、二段目以降の反応器（下流に位置する反応器）であっても良い。

反応槽内の液温である反応槽温度は、菌体触媒の耐熱性にもよるが、通常０〜５０℃に設定され、好ましくは１０〜４０℃に設定される。反応槽温度が前記範囲にあると、菌体触媒のニトリルヒドラターゼ活性を良好に維持できる点で好ましい。

反応槽温度とは、反応槽が一つの反応器のみから構成される場合は、当該反応器内の液温を指し、反応槽が複数の反応器から構成される場合は、各々の反応器内の液温を指す。反応槽温度は、例えば、熱電対法（例：Ｋタイプ）により測定することができる。反応槽温度は、反応槽内の任意の場所で測定可能であり、具体的には反応槽出口（反応液取り出し口）で測定可能である。

反応槽の容積は、特に限定するものではないが、工業的な生産を考慮すると、通常０．１ｍ³以上、好ましくは１〜１００ｍ³、より好ましくは５〜５０ｍ³である。反応槽が複数の反応器から構成される場合、前記容積は各々の反応器の容積を指す。

反応は、一般的には常圧下で行われるが、ニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。
反応槽内のｐＨは、菌体触媒の活性を良好に保つための好適な範囲であれば特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲にある。ｐＨが前記範囲にあると、ニトリルヒドラターゼ活性を良好に維持できる点で好ましい。

反応槽のｐＨとは、反応槽が一つの反応器のみから構成される場合は、当該反応器内のｐＨを指し、反応槽が複数の反応器から構成される場合は、各々の反応器内のｐＨを指す。反応槽のｐＨは、例えば、指示薬法、水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法、ガラス電極法により測定することができる。反応槽のｐＨは、反応槽内の任意の場所で測定可能であり、具体的には反応槽出口（反応液取り出し口）で測定可能である。
＜菌体触媒貯槽＞
菌体触媒貯槽とは、菌体触媒の懸濁液を保有し、菌体触媒の懸濁液を反応槽に供給する触媒供給管を有する。菌体触媒貯槽は温度制御装置を有していても良く、温度制御装置を有していなくても良いが、菌体触媒の懸濁液の液温を制御する観点から、温度制御装置を有することは好ましい。
菌体触媒貯槽が温度制御装置を有する場合の温度制御装置は、菌体触媒貯槽自体に設けても良く、菌体触媒貯槽が外部循環ラインを有している場合には、外部循環ライン上に設けても良い。菌体触媒貯槽における温度制御装置としては、例えば、熱交換器が挙げられる。熱交換器としては、例えば、ジャケット式熱交換器、コイル式熱交換器等の菌体触媒貯槽に直接設置する形態のもの、あるいは多管円筒式熱交換器、渦巻管式熱交換器、渦巻板式熱交換器、プレート式熱交換器、二重管式熱交換等の菌体触媒貯槽の外部循環ラインに設置する形態のものが挙げられる。
菌体触媒貯槽は攪拌機を有していても良く、攪拌機を有していなくても良いが、菌体触媒の液温を制御する観点から、攪拌機を有することは好ましい。菌体触媒貯槽が攪拌機を有する場合の攪拌機の攪拌翼は任意の形状のものを選択でき、例えば、プロペラ翼、フラットパドル翼、ピッチドパドル翼、フラットタービン翼、ピッチドタービン翼、リボン翼、アンカー翼、フルゾーン翼が挙げられる。攪拌翼は、１枚であっても良く、複数枚備えていても良い。
＜反応原料の供給＞
反応槽へ供給する原料水は、単独で反応槽へ供給しても良く、ニトリル化合物と混合した後に反応槽へと供給しても良い。原料水を単独で反応槽へ供給する場合、原料水供給管の反応槽中の反応液への供給口の設置位置には特に制限はなく、反応液の上部へ設置しても、反応液中へ設置しても良い。
原料水を単独で反応槽へ供給する場合の原料水の供給方法は、特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができる。原料水を反応槽へ供給する方法としては、液体輸送機能を有する機器を使用することができ、例えば、遠心ポンプ、傾斜ポンプあるいは軸流ポンプ等のターボ式ポンプや、往復ポンプや回転ポンプ等の容積型ポンプ等のポンプ類、スクリューコンベア等のコンベア類を用いることができる。原料水を反応槽へ供給する方法として、上記の液体輸送機能を有する機器を使用しないで供給することもできる。液体輸送機能を有する機器を使用しない場合には、例えば、原料水を貯蔵する原料水貯槽を反応槽の上部へ設置し、原料水貯槽と反応槽を原料水供給管により接続し、重力を用いた落下により供給する方法が挙げられる。あるいは、原料水貯槽を加圧することにより生じる原料水貯槽と反応槽との圧力差を用いて供給する方法が挙げられる。

原料水を反応槽へ供給する原料水供給管は、一つの反応槽につき一本であっても良く、複数本あっても良い。原料水供給管の供給口は、一本の供給管につき一つであっても良く、複数あっても良い。原料水供給管の供給口の形状は特に制限はなく、通常使用される形状のものであればいずれも好適に使用できる。
原料水とニトリル化合物を混合した後に反応槽へ供給する場合の原料水と二トリル化合物を混合する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、混合槽を用いて攪拌混合する方法、原料水とニトリル化合物を配管中で混合する方法が挙げられる。混合槽を用いる場合には、混合槽の形状は特に限定されるものではないが、一般的に円筒形の混合槽が用いられ、縦型円筒形、横型円筒形、いずれの場合も用いることができる。混合槽には邪魔板を供えていても良く、邪魔板を供えていなくても良い。

混合槽を用いる場合の、攪拌翼は任意の形状のものを選択でき、例えば、プロペラ翼、フラットパドル翼、ピッチドパドル翼、フラットタービン翼、ピッチドタービン翼、リボン翼、アンカー翼、フルゾーン翼が挙げられる。攪拌翼は、１枚であっても良く、複数枚備えていても良い。
原料水とニトリル化合物を配管中で混合するには、原料水供給管とニトリル化合物供給管を結合することにより原料水とニトリル化合物を直接混合することができ、さらには配管中にスタティックミキサー等のラインミキサーを設置することにより積極的に混合する方法等が挙げられる。

原料水とニトリル化合物を混合した後に反応槽へ供給する場合に、ニトリル化合物は水との混合後、完全に水に溶解していても良いが、必ずしも水に完全に溶解している必要はなく、任意の比率で混合させれば良い。好ましくは水：ニトリル化合物の比率が、体積比で１００：１〜１：１００、より好ましくは５０：１〜１：５０、さらに好ましくは１０：１〜１：１０である。

原料水とニトリル化合物を混合した後に反応槽へ供給する場合の、原料水とニトリル化合物の混合物の供給方法は、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を単独で反応槽へ供給する場合の原料水の供給方法で例示した方法を用いることができる。

原料水とニトリル化合物を混合した後に反応槽へ供給する場合の、原料水とニトリル化合物の混合物を反応槽へ供給する供給管は、一つの反応槽につき一本であっても良く、複数本あっても良い。供給管の供給口は、一本の供給管につき一つであっても良く、複数あっても良い。供給管の供給口の形状は特に制限はなく、通常使用される形状のものであればいずれも好適に使用できる。
反応槽へ供給するニトリル化合物は、原料水と混合した後に反応槽へと供給しても良く、単独で反応槽へ供給しても良い。ニトリル化合物を単独で反応槽へ供給する場合、ニトリル化合物供給管の反応槽中の反応液への供給口の設置位置には特に制限はなく、反応液の上部へ設置しても、反応液中へ設置しても良い。
ニトリル化合物を単独で反応槽へ供給する場合のニトリル化合物の供給方法は、特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を反応槽へ供給する方法で例示した方法を用いることができる。
ニトリル化合物を反応槽へ供給するニトリル化合物供給管は、一つの反応槽につき一本であっても良く、複数本であっても良い。ニトリル化合物供給管の供給口は、一本の供給管につき一つであっても良く、複数あっても良い。ニトリル化合物供給管の供給口の形状は特に制限はなく、通常使用される形状のものであればいずれも好適に使用できる。
＜ｐＨ調節剤の供給＞
反応槽へ供給するｐＨ調節剤は、単独で反応槽へ供給しても良く、反応槽へ供給する水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物に混合した後に反応槽へ供給しても良い。ｐＨ調節剤を単独で反応槽へ供給する場合、ｐＨ調節剤の供給管の反応槽中の反応液への供給口の設置位置には特に制限はなく、反応液の上部へ設置しても、反応液中へ設置しても良い。
ｐＨ調節剤を単独で反応槽へ供給する場合のｐＨ調節剤の供給方法は、特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を反応槽へ供給する方法で例示した方法を用いることができる。
ｐＨ調節剤を反応槽へ供給するｐＨ調節剤の供給管は、一つの反応槽につき一本であっても良く、複数本であっても良い。ｐＨ調節剤の供給管の供給口は、一本の供給管につき一つであっても良く、複数あっても良い。ｐＨ調節剤の供給管の供給口の形状は特に制限はなく、通常使用される形状のものであればいずれも好適に使用できる。
ｐＨ調節剤と水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物を混合した後に反応槽へ供給する場合のｐＨ調節剤が混合される水系媒体とは、好ましくは原料水である。ｐＨ調節剤が混合される水系媒体を含有する混合物とは、例えば、原料水とニトリル化合物の混合物や菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む反応液が挙げられる。

ｐＨ調節剤を原料水と混合した後に反応槽へ供給する場合の、ｐＨ調節剤と原料水を混合する方法としては、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水と二トリル化合物を混合する方法で例示した方法を用いることができる。
ｐＨ調節剤を原料水と混合した後に反応槽へ供給する場合の、ｐＨ調節剤と原料水の混合物を供給する方法は、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を単独で反応槽へ供給する場合の原料水の供給方法で例示した方法を用いることができる。
反応槽へ供給するｐＨ調節剤と水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物は任意の比率で混合されれば良く、好ましくは、ｐＨ調節剤：水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物の比率が、体積比で１：１〜１：１００，０００，０００、より好ましくは、１：１０〜１：１０，０００，０００である。

ｐＨ調節剤を原料水とニトリル化合物と混合した後に反応槽へ供給する場合の、ｐＨ調節剤と原料水とニトリル化合物の混合物を混合する方法としては、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水と二トリル化合物を混合する方法で例示した方法を用いることができる。

ｐＨ調節剤と菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む反応液と混合した後に反応槽へ供給する場合の、ｐＨ調節剤と菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む反応液を混合する方法としては、例えば以下の方法を用いることができる。反応槽に反応液の一部を反応槽に戻すためのポンプを備えた外部循環ラインを設置し、当該外部循環ラインとｐＨ調節剤供給管を結合させることにより、水系媒体を含有する混合物として反応槽内から取り出された反応液の一部を用い、反応液の一部とｐＨ調節剤を外部循環ライン中で直接混合する方法等が挙げられる。外部循環ラインにて直接混合された反応液の一部とｐＨ調節剤は、そのまま外部循環ラインを用いて反応槽へ供給される

＜菌体触媒の供給＞
反応槽へ供給する菌体触媒は、単独で反応槽へ供給しても良く、反応槽へ供給される水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物に混合した後に反応槽へ供給しても良い。菌体触媒を単独で反応槽へ供給する場合、菌体触媒の供給管の反応槽中の反応液への供給口の設置位置には特に制限はなく、反応液の上部へ設置しても、反応液中へ設置しても良い。
菌体触媒を単独で反応槽へ供給する場合の菌体触媒の供給方法は、特に限定するものではなく、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を反応槽へ供給する方法で例示した方法を用いることができる。
菌体触媒を反応槽へ供給する菌体触媒の供給管は、一つの反応槽につき一本であっても良く、複数本であっても良い。菌体触媒の供給管の供給口は、一本の供給管につき一つであっても良く、複数あっても良い。菌体触媒の供給管の供給口の形状は特に制限はなく、通常使用される形状のものであればいずれも好適に使用できる。
菌体触媒と水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物を混合した後に反応槽へ供給する場合の菌体触媒が混合される水系媒体とは、好ましくは原料水である。菌体触媒が混合される水系媒体を含有する混合物とは、例えば、原料水とニトリル化合物の混合物や菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む反応液が挙げられる。

菌体触媒を原料水と混合した後に反応槽へ供給する場合の、菌体触媒と原料水を混合する方法としては、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水と二トリル化合物を混合する方法で例示した方法を用いることができる。
菌体触媒を原料水と混合した後に反応槽へ供給する場合の、菌体触媒と原料水の混合物を供給方法は、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水を単独で反応槽へ供給する場合の原料水の供給方法で例示した方法を用いることができる。

反応槽へ供給する菌体触媒と水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物は任意の比率で混合されれば良く、好ましくは、菌体触媒：水系媒体および／または水系媒体を含有する混合物の比率が、体積比で１：１〜１：１００，０００，０００、より好ましくは、１：１０〜１：１０，０００，０００である。

菌体触媒を原料水とニトリル化合物の混合物と混合した後に反応槽へ供給する場合の、菌体触媒と原料水とニトリル化合物の混合物を混合する方法としては、公知の方法を用いることができ、具体的には、上記の原料水と二トリル化合物を混合する方法で例示した方法を用いることができる。

菌体触媒を菌体触媒、未反応原料、ｐＨ調節剤および生成したアミド化合物等を含む反応液と混合する方法としては、例えば以下の方法を用いることができる。反応槽に反応液の一部を反応槽に戻すためのポンプを備えた外部循環ラインを設置し、当該外部循環ラインと菌体触媒供給管を結合させることにより、水系媒体を含有する混合物として反応槽内から取り出された反応液の一部を用い、反応液の一部と菌体触媒を外部循環ライン中で直接混合する方法等が挙げられる。外部循環ラインにて直接混合された反応液の一部と菌体触媒は、そのまま外部循環ラインを用いて反応槽へ供給される

菌体触媒の使用量は、反応条件や触媒の種類およびその形態により変化するが、上記菌体の乾燥菌体重量換算で、反応液に対して、通常１０〜５０，０００重量ｐｐｍ、好ましくは５０〜３０，０００重量ｐｐｍである。

反応時間（反応液の滞留時間）は、通常０．５〜５０時間、好ましくは２〜２５時間である。多段の反応槽を用いる場合、反応時間とは、全反応器における合計の反応時間（反応液の滞留時間）を指す。
本発明のアミド化合物の製造方法において、得られたアミド化合物の回収および精製は、例えば、濃縮操作（例：蒸発濃縮）、活性炭処理、イオン交換処理、濾過処理、晶析操作により行うことができる。

以上のようにして、反応原料であるニトリル化合物に対応するアミド化合物、例えば（メタ）アクリロニトリルであれば（メタ）アクリルアミドを得ることができる。

次に本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
〔ニトリルヒドラターゼを含有する菌体の調製〕
特開２００１−３４００９１号公報の実施例１に記載の方法に従いＮｏ．３クローン菌体を取得し、同じく、同実施例１の方法で培養してニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体を得た。

〔水の精製〕
蒸留装置として、ジムロート式冷却凝集器および8段相当の充填塔を備えたガラス製５Ｌ丸底フラスコを準備した。

水道水３ｋｇを丸底フラスコへ装置に装入し、蒸留操作を行った。加熱にはオイルバスを使用し、留出温度が１００℃に達するまでの留分を初留とした。留出温度１００〜１０１℃の留分を主留として２ｋｇ得た。
水道水の電気伝導度を交流二電源法により測定したところ１８０μS/ｃｍであった。また主留サンプルを同様に分析したところ電気伝導度は１０μS/ｃｍであった。以後、蒸留処理後の水を精製水ａと呼ぶ。

〔アクリルアミドの製造〕
最終製品として、水溶液中のアクリルアミド濃度が５０重量％の製品を得るため、以下の条件で反応を行った。

第１反応器として攪拌器を備えた１Ｌガラス製フラスコ、第２反応器として内径５ｍｍのテフロン（登録商標）製チューブ２０ｍを準備した。原料水の供給管、ｐＨ調節剤の供給管、アクリロニトリルの供給管および菌体触媒の供給管はそれぞれ第１反応器へ直接接続している。

第１反応器には、予め４００ｇの水道水を仕込んだ。上記培養方法で得られた湿菌体２００ｇを精製水ａ８００ｇに懸濁した。第１反応器内を撹拌しながら、この懸濁液を１０ｇ/ｈの速度で連続的に供給した。また、アクリロニトリルは３２ｇ/ｈの速度で、水道水は３８ｇ/ｈの速度で連続的に供給した。反応中の反応液の温度は１５℃となるように、第１反応器および第２反応器とも１０〜２０℃の温度の水浴中に浸漬し温度制御を行った。ｐＨ調節剤として０．１Ｍ−ＮａＯＨ水溶液を用い、反応ｐＨが７．５〜８．５となるように供給量を調節し、第１反応器へ連続的に供給した。

第１反応器の液面レベルを一定に保つように、反応液を第１反応器から８０ｇ/ｈの速度で連続的に抜き出し、第２反応器に連続的に供給して、第２反応器内でさらに反応を進行させた。

反応開始から５０時間後に以下のＨＰＬＣ条件にて分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９５％、かつ第２反応器出口でのアクリロニトリル濃度が検出限界以下（１０ｐｐｍ以下）となった。

ここで分析条件は以下のとおりであった。
・アクリルアミド分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長２５０ｎｍ、カラム温度４０℃）
分離カラム ：ＳＣＲ-１０１Ｈ (株式会社島津製作所製)
溶離液 ：０．０５％（容積基準）−リン酸水溶液
・アクリロニトリル分析条件：
高速液体クロマトグラフ装置：ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）
（ＵＶ検出器波長２００ｎｍ、カラム温度４０℃）
分離カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ-ＩＩ ５Ｃ１８ＨＧ (和光純薬製)
溶離液 ：７％（容積基準）−アセトニトリル、０．１ｍＭ−酢酸、
０．２ｍＭ−酢酸ナトリウムを各濃度で含有する水溶液

［実施例２］
〔水の精製〕
イオン交換装置として、陽イオン交換樹脂の充填塔および陰イオン交換樹脂の充填等を準備し、それぞれの充填塔に５００ｃｃの樹脂を充填した。陽イオン交換樹脂塔と陰イオン交換樹脂塔は連結した。

水道水３ｋｇを３００ｃｃ/ｈの流速で陽イオン交換樹脂塔、次いで陰イオン交換樹脂塔に通液し、２．５ｋｇのイオン交換処理水を得た。
水道水の電気伝導度を交流二電源法により測定したところ１８０μS/ｃｍであった。またイオン交換処理水を同様に分析したところ電気伝導度は３μS/ｃｍであった。以後、イオン交換処理水を精製水ｂと呼ぶ。

〔アクリルアミドの製造〕
実施例１のアクリルアミドの製造において、ニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体の希釈に精製水ａを使用する代わりに、精製水ｂを使用した以外は実施例１と同様にして、アクリルアミドの製造を行った。反応開始から５０時間後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９５％、かつ第２反応器出口でのアクリロニトリル濃度が検出限界以下（１０ｐｐｍ以下）となった。

［実施例３］
〔水の精製〕
逆浸透膜処理装置として、２００ｃｍ2の有効面積を有する逆浸透膜を準備した。

水道水３ｋｇを３００ｃｃ/ｈの流速で逆浸透膜に通液し、２ｋｇの逆浸透膜処理水を得た。
水道水の電気伝導度を交流二電源法により測定したところ１８０μS/ｃｍであった。また逆浸透膜処理水を同様に分析したところ電気伝導度は８μS/ｃｍであった。以後、逆浸透膜処理水を精製水ｃと呼ぶ。

〔アクリルアミドの製造〕
実施例１のアクリルアミドの製造において、ニトリルヒドラターゼを含有する湿菌体の希釈に精製水ａを使用する代わりに、精製水ｃを使用した以外は実施例１と同様にして、アクリルアミドの製造を行った。反応開始から５０時間後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９５％、かつ第２反応器出口でのアクリロニトリル濃度が検出限界以下（１０ｐｐｍ以下）となった。

［比較例］
実施例１のアクリルアミドの製造において、精製水ａを使用する代わりに、水道水を使用した以外は実施例１と同様にして、アクリルアミドの製造を行った。反応開始から５０時間後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９２％、かつ第２反応器出口でのアクリロニトリル濃度が１５ｐｐｍとなった。
第２反応器出口にてアクリロニトリルが検出されたため、反応を完結させるために湿菌体の懸濁液の供給速度を１０ｇ/ｈから１２ｇ/ｈへと変更した以外は実施例１と同様にして、アクリルアミドの製造を行った。反応開始から５０時間後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、第１反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が９５％、かつ第２反応器出口でのアクリロニトリル濃度が検出限界以下（１０ｐｐｍ以下）となり反応が完結した。

Claims (3)

1. ニトリルヒドラターゼを含有する菌体および／またはその菌体処理物を用いてアミド化合物を製造する方法において、電気伝導度が１００μS/ｃｍ以下である水に懸濁した菌体および／またはその菌体処理物を用いることを特徴とするアミド化合物の製造方法
2. ニトリルヒドラターゼがシュードノカルディア属由来またはロドコッカス属由来ニトリルヒドラターゼである請求項１に記載の製造方法
3. アミド化合物がアクリルアミドまたはメタクリルアミドである請求項１または２に記載の製造方法