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JP2017522015A - ヒトｋｒａｓ中における１塩基多型の検出 - Google Patents

ヒトｋｒａｓ中における１塩基多型の検出 Download PDF

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JP2017522015A JP2016574431A JP2016574431A JP2017522015A JP 2017522015 A JP2017522015 A JP 2017522015A JP 2016574431 A JP2016574431 A JP 2016574431A JP 2016574431 A JP2016574431 A JP 2016574431A JP 2017522015 A JP2017522015 A JP 2017522015A
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Abstract

本明細書中に開示されるのは、KRAS遺伝子中における1塩基多型(SNP)の検出のためのプライマー及びプローブである。これらのプライマー及びプローブは、KRAS遺伝子中における1以上のSNPの有無を確認する方法において使用され得る。これらのプライマー及びプローブは、がん治療による寛解の予測を、それを必要とする被験体においてする方法においても使用され得る。該プライマー及びプローブは、がん治療の選択を、それを必要とする被験体のためにする方法において更に使用され得る。【選択図】図1

Description

技術分野
本発明は、ヒトKRAS中における1塩基多型(single nucleotide polymorphism, SNP)、ヒトKRAS中における1以上のSNPの有無を確認する方法、がん治療を選択する方法、及びがん治療による寛解(response)を予測する方法に関する。
背景
v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)遺伝子は、多種多様ながん、例えば、大腸がん及び非小細胞肺がんに関連している。特に、がんは、KRAS遺伝子のコドン12、13、及び61における突然変異、すなわち1塩基多型(single nucleotide polymorphism, SNP)に関連し得る。これらのSNPは、1以上のがん治療(cancer therapy)又は処置(treatment)による、がんを患う被験体の寛解性(responsiveness)を示し得る。この予測が、ひいては、被験体へ施すためのがん治療の選択を補助(aide)する。
これらのSNPを検出するための本発明の分析は、2反応混合物中において、多数のSNPを検出可能な増幅を基礎とする分析を含む。しかしながら、かかる分析は、存在する特定の変異を同定せず、むしろ突然変異が存在するか又は存在しないかだけを検出する。存在する、又は存在しないSNPの正体(identity)を同定しないことにより、これらの分析は、ユーザが、がんを患う被験体の、1以上のがん治療による寛解を予測することを可能にせず、それによって被験体のためのがん治療の選択を妨げる。増幅を基礎とする他の分析は、特定のSNPを同定するが、そうするために、SNPごとに1の反応混合物を必要とし、従って、より大量の試料の投入(larger sample input)を必要とする。診断試験のための試料は、通常サイズが小さく、従って、1の分析における大量の試料の使用により、別の分析における追加的なマーカー試験の可能性が制限される。
従って、最小量の試料投入で、1以上のがん治療による被験体の寛解を予測することを容易にする、KRAS遺伝子中における多数のSNPを検出し同定する方法を開発する必要性が存在する。KRAS遺伝子についての特定のSNPを同定することは、医師(practitioner)が被験体のための適切ながん治療を選択することを更に可能にするだろう。
発明の要旨
本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号48からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマーを対象にする。
本発明は、(a)配列番号2、配列番号7、及び配列番号43からなる群から選択されるフォワードプライマー;(b)配列番号6、配列番号11、及び配列番号48からなる群から選択されるリバースプライマー;並びに(c)配列番号52及び配列番号56からなる群から選択されるペプチド核酸オリゴマーを含むプライマーセットも対象にする。プライマーセットは、(a)配列番号2、配列番号6、及び配列番号52;(b)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、及び配列番号52;(c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号52、及び配列番号56;(d)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、配列番号52、及び配列番号56;(e)配列番号7、配列番号11、及び配列番号56;並びに(f)配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、及び配列番号56からなる群から選択され得る。
本発明は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブも対象にする。プローブは、検出可能な標識(detectable label)と結合(combine)された、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識(fluorescent label)であり得る。蛍光標識は、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択され得る。プローブは、クエンチャー部分(quencher moiety)を更に含み得る。
本発明は、プローブも対象とし、該プローブは、検出可能な標識と結合された、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるヌクレオチド配列を更に含み得、検出可能な標識が、蛍光標識であり得る。蛍光標識は、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択され得る。
本発明は、プローブも対象とし、該プローブは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。プローブは、検出可能な標識及びクエンチャー部分と結合された、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるヌクレオチド配列を更に含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。蛍光標識は、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択され得る。
本発明は、プライマー及びプローブのセットも対象とし、該プライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;(b)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;(c)配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びに(d)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマー(peptide nucleic oligomer)を含む。
1以上のプローブが、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択され得(selected the group)、検出可能な標識を更に含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。蛍光標識は、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択され得る。1以上のプローブは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択され得(selected the group)、検出可能な標識を更に含み得、クエンチャー部分を更に含み得る。
プライマー及びプローブのセットは、内部コントロールセット(internal control set)を更に含み得、該内部コントロールセットは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに(c)配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブは、検出可能な標識を更に含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブは、クエンチャー部分を更に含み得る。
プライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号22、配列番号27、配列番号30、及び配列番号51;(b)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号13、配列番号16、配列番号20、及び配列番号51;並びに(c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号31、配列番号34、配列番号38、配列番号40、及び配列番号51からなる群から選択され得る。
本発明は、プライマー及びプローブのセットも対象とし、該プライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;(b)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;(c)配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びに(d)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む。プライマー及びプローブセットでは、1以上のプローブが検出可能な標識を含み得る。この検出可能な標識は、蛍光標識であり得、該蛍光標識は、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択される。プライマー及びプローブのセットでは、1以上のプローブがクエンチャー部分を更に含み得る。
本発明は、プライマー及びプローブのセットも対象とし、該プライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;(b)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;(c)配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びに(d)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む。このプライマー及びプローブのセットは、内部コントロールセットを更に含み得、該内部コントロールセットは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。このプライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号22、配列番号27、配列番号30、及び配列番号51;(b)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号13、配列番号16、配列番号20、及び配列番号51;及び(c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号31、配列番号34、配列番号38、配列番号40、及び配列番号51からなる群から選択され得る。
本発明は、プライマー及びプローブのセットも対象とし、該プライマー及びプローブのセットは、(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;(b)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;(c)配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びに(d)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む。このプライマー及びプローブのセットは、内部コントロールセットを更に含み得、該内部コントロールセットは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。このプライマー及びプローブのセットでは、配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブは、検出可能な標識を更に含み得る。このプライマー及びプローブのセットでは、配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブは、クエンチャー部分も更に含み得る。このプライマー及びプローブのセットでは、1以上のプローブは、検出可能な標識を更に含み得る。
本発明は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法も対象とし、該方法は、(a)(i)被験体から取得された試料(該試料は、KRAS標的配列(KRAS target sequence)を含有すると疑われる)及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;及びd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)反応混合物を1以上のアンプリコン(amplicon)の形成に十分な条件に供すること;及び(c)前記1以上のアンプリコンを検出することを含む。
反応混合物は、内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。
確認する方法は、サイクル数における差(ΔCN)を決定することを更に含み得る。ΔCNは、前記SNPを含有するアンプリコンと関連付けられる(associated with)サイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンと関連付けられるサイクル数との間の差であり得る。ΔCNがカットオフ値(cutoff value)未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在し得る。
確認する方法は、上述の工程(c)に記載された検出に基づいて、KRAS中における1以上のSNPの存在を確認することを更に含み得る。
この方法では、1以上のSNPが、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、及びQ61Hからなる群から選択され得る。
この方法では、プライマー及びプローブのセットのうちの1以上のプローブが、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は蛍光標識であり得る。検出可能な標識は、FAM、Cy5、NED、及びVICからなる群から選択され得る。請求のプライマー及びプローブのセットの1以上のプローブは、クエンチャー部分を更に含み得る。
この方法では、検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含み得る。
この方法では、請求項に記載されたプライマー及びプローブのセットが、(a)配列番号2、配列番号6、配列番号52、配列番号22、配列番号27、及び配列番号30;(b)配列番号2、配列番号6、配列番号52、配列番号13、配列番号16、及び配列番号20;並びに(c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号52、配列番号56、配列番号31、配列番号34、配列番号38、及び配列番号40からなる群から選択されるプライマー及びプローブのセットであり得る。
この方法では、試料が、前記被験体のがん組織(cancerous tissue)から取得されたものであり得る。がん組織は大腸がん又は非小細胞肺がんからの組織であり得る。試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料(fixed-formalin paraffin-embedded sample)から抽出された核酸であり得る。核酸は、ゲノムDNAであり得る。
この方法では、試料が、血液試料、血清試料、又は血漿試料であり得る。試料は、循環腫瘍DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)であり得る。
この方法では、反応混合物を形成することが、3反応混合物を形成することを含み得、各反応混合物が前記被験体から取得された前記試料並びに前記プライマー及びプローブのセットを含む。第1反応混合物は前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号22、配列番号27、及び配列番号30の前記プローブを含み得る。第2反応混合物は前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号13、配列番号16、及び配列番号20の前記プローブを含み得る。第3反応混合物は前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号7の前記フォワードプライマー、配列番号11の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー、配列番号56の前記ペプチド核酸オリゴマー、並びに配列番号31、配列番号34、配列番号38、及び配列番号40の前記プローブを含み得る。
第1、第2、及び第3反応混合物のそれぞれが内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールが(a)配列番号43に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び(c)配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。
本発明は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法も対象とし、該方法は、(a)(i)前記被験体から取得された試料(該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる)及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びにd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;及び(c)前記1以上のアンプリコンを検出することを含む。この確認する方法では、反応混合物が、内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。この確認する方法では、サイクル数における差(ΔCN)を決定することを更に含み得る。ΔCNは、前記SNPを含有するアンプリコンに関連付けられるサイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンに関連付けられるサイクル数との間の差であり得る。前記ΔCNがカットオフ値未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在し得る。
本発明は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法も対象とし、該方法は、(a)(i)前記被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びにd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;及び(c)前記1以上のアンプリコンを検出することを含む。この確認する方法は、工程(c)における前記検出に基づいて、KRAS中における1以上のSNPの前記存在を確認することを更に含み得る。1以上のSNPは、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、及びQ61Hからなる群から選択され得る。
本発明は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法も対象とし、該方法は、(a)(i)前記被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びにd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;及び(c)前記1以上のアンプリコンを検出することを含む。この確認する方法では、プライマー及びプローブのセットの1以上のプローブが、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は蛍光標識である。この確認する方法では、プライマー及びプローブのセットの1以上のプローブが、クエンチャー部分を更に含み得る。この確認する方法では、検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含み得る。
本発明は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法も対象とし、該方法は、(a)(i)前記被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びにd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;及び(c)前記1以上のアンプリコンを検出することを含む。この確認する方法では、前記反応混合物を形成することが、3反応混合物を形成することを含み得、各反応混合物が前記被験体から取得された前記試料並びに前記プライマー及びプローブのセットを含む。この確認する方法では、第1反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号22、配列番号27、及び配列番号30の前記プローブを含み得る。この確認する方法では、第2反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号13、配列番号16、及び配列番号20の前記プローブを含み得る。この確認する方法では、第3反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号7の前記フォワードプライマー、配列番号11の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー、配列番号56の前記ペプチド核酸オリゴマー、並びに配列番号31、配列番号34、配列番号38、及び配列番号40の前記プローブを含み得る。前記第1、第2、及び第3反応混合物のそれぞれが内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールは、(a)配列番号43に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び(c)配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを更に含む。
本発明は、がん治療の選択を、それを必要としている被験体のためにするための方法も対象とし、該方法は、(a)(i)被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;及びd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記方法が、前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;(c)前記1以上のアンプリコンを検出すること;(d)v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)を同定すること;及び(e)工程(d)において同定された前記1以上のSNPに基づいて、前記被験体のための前記がん治療を選択することを含む。
このがん治療を選択するための方法では、前記試料が、前記被験体のがん組織から取得されたものであり得る。前記がん組織は、大腸がん又は非小細胞肺がんからの組織であり得る。前記試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から抽出された核酸であり得る。前記核酸はゲノムDNAであり得る。
このがん治療を選択するための方法では、前記試料が、血液試料、血清試料、又は血漿試料であり得る。前記試料は循環腫瘍DNA(ctDNA)であり得る。
このがん治療を選択するための方法では、前記反応混合物が、内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。
このがん治療を選択するための方法では、同定することが、サイクル数における差(ΔCN)を決定することを含み得る。ΔCNは、前記SNPを含有するアンプリコンと関連付けられるサイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンと関連付けられるサイクル数との間の差であり得る。前記ΔCNがカットオフ値未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在し得る。前記1以上のSNPは、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
このがん治療を選択するための方法では、プライマー及びプローブのセットのうちの1以上のプローブが、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。蛍光標識は、FAM、Cy5、NED、及びVICからなる群から選択され得る。プライマー及びプローブのセットの1以上のプローブは、クエンチャー部分を更に含み得る。このがん治療を選択するための方法では、検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含み得る。
このがん治療を選択するための方法では、選択することが、前記1以上のSNPがKRASにないと確認された場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor, EGFR)を標的とする治療を施すことを含み得る。選択することは、前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療を施さないことを含み得る。選択することは、前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療以外の治療を施すことを含み得る。
本発明は、がん治療の選択を、それを必要としている被験体のためにするための方法も対象とし、該方法は、(a)(i)被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びにd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;(c)前記1以上のアンプリコンを検出すること;(d)v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)を同定すること;及び(e)工程(d)において同定された前記1以上のSNPに基づいて、前記被験体のための前記がん治療を選択することを含む。このがん治療を選択するための方法では、反応混合物が、内部コントロールを更に含み得、該内部コントロールは、(a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;(b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び(c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブを含む。このがん治療を選択するための方法では、同定することが、サイクル数における差(ΔCN)を決定することを更に含み得る。前記ΔCNは、前記SNPを含有するアンプリコンと関連付けられるサイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンと関連付けられるサイクル数との間の差であり得る。前記ΔCNがカットオフ値未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在し得る。1以上のSNPは、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。このがん治療を選択するための方法では、試料が、被験体のがん組織から取得され得る。がん組織は、大腸がん又は非小細胞肺がんからの組織であり得る。試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から抽出された核酸であり得る。核酸は、ゲノムDNAであり得る。このがん治療を選択するための方法では、試料が、血液試料、血清試料、又は血漿試料であり得る。試料は、循環腫瘍DNA(ctDNA)であり得る。
本発明は、がん治療の選択を、それを必要としている被験体のためにするための方法も対象とし、該方法は、(a)(i)被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び(ii)a.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;b.配列番号4、 配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;c.配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;及びd.配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマーを含む、プライマー及びプローブのセットを含む、反応混合物を形成すること;(b)前記反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;(c)前記1以上のアンプリコンを検出すること;(d)v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)を同定すること;及び(e)工程(d)において同定された前記1以上のSNPに基づいて、前記被験体のための前記がん治療を選択することを含む。このがん治療を選択するための方法では、プライマー及びプローブのセットのうちの1以上のプローブが、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。前記プライマー及びプローブのセットの1以上のプローブは、クエンチャー部分を更に含み得る。このがん治療を選択するための方法では、検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含み得る。選択することは、前記1以上のSNPがKRASにないと確認される場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療を施すことを含み得;前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療を施さないことを含み得;又は前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療以外の治療を施すことを含み得る。1以上のSNPは、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
図1は、突然変異体(mutant)KRAS配列の選択的増幅及び検出を説明する概略図を示す。 図2は、本明細書中に記載された方法によって形成され、且つKRAS遺伝子中における9の異なるSNP、すなわちG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、及びQ61H（すなわち、Q61Ha及びQ61Hb）の検出のための3反応混合物を説明する概略図を示す。 図3は、標識されたプローブであって、該プローブのそれぞれが、図2の、1のSNPを検出するプローブの検出のために使用される、蛍光チャネル(fluorescent channel)を列挙する表を示す。内部コントロールプローブも標識され、従って、検出可能である。従って、Q61Ha及びQ61Hbが同じアミノ酸置換(amino acid substitution)、すなわちQ61Hを生じさせることから、これらの突然変異を検出するためのプローブが同じ標識を含有することを除いて、各反応混合物中において、各プローブが異なる標識を含有するので、各反応混合物のために、4蛍光チャネルが使用される。特に、該4チャネルが、標識NED、FAM、VIC、及びCy5からの蛍光を検出している。
詳細な説明
本発明は、KRAS中における1以上のSNPの有無の確認を、それを必要とする被験体においてするためのプライマー及びプローブに関する。1以上のSNPは、KRAS遺伝子のコドン12、13、及び/又は61中に存在し得る。
KRAS中における1以上のSNPが、がん、例えば、大腸がん(CRC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)と関連し得るが、これらには限定されない。KRAS中における1以上のSNPの有無が、特定のがん治療又は処置によるがん（例えば、CRC又はNSCLC）を患う被験体の寛解を示し得、従って、被験体のためのがん治療の選択を補助し得る。
本発明は、KRAS中における1以上のSNPの有無を確認する方法にも関する。この方法は、被験体からKRAS標的配列を含有すると疑われる試料を取得することを含む。KRAS標的配列は、野生型KRAS配列、突然変異体KRAS配列、又はそれらの組合せであり得る。確認する方法は、選択的増幅をもたらし、従って、突然変異体KRAS配列の濃縮をもたらす。この選択的増幅は、KRAS中における1以上のSNPの検出のために必要な試料がより少なく、且つ野生型KRAS配列の増幅に起因する干渉(interference)又はノイズ(noise)がより少ないという有利な特性をもたらす。
確認する方法は、多数のSNP（最大10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1のSNP等）の同時の増幅、検出及び同定ももたらす。このことが、ひいては、突然変異体KRAS配列の選択的増幅によってもたらされた濃縮を前提として、少量の試料投入により、KRAS中における、CRC及びNSCLCと関連している約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、又は約90%の突然変異の有無を決定するという有利な能力(capability)をもたらす。いくつかの実施態様では、方法は、100 ng又は10ng又は1ng又は1μg又は10μg又は100μgのKRAS標的配列中における少なくとも約2%のKRAS突然変異の感度(sensitivity)をもたらす。また、方法は、1以上のSNPの有無の検出において100%の再現性(reproducibility)をもたらす。方法は、更にまた、被験体から取得された試料中に存在し得る、微生物、ヘモグロビン、トリグリセリド(triglyceride)、壊死組織(necrotic tissue)、相同配列等の混入物質(contaminating substance)及び/又は妨害物質(interfering substance)と交差反応(cross-reaction)せず、且つ、これらの物質に妨げられない。
従って、確認する方法は、単一の分析においてCRC及びNSCLCに関連するKRAS中におけるほぼ全ての突然変異を検出するという注目すべき技術的効果を実現する。確認する方法は、所与の被験体のKRAS遺伝子中にどの突然変異が存在せず、且つ、どの突然変異が存在するのか確認するという注目すべき技術的効果も実現する。KRAS遺伝子中にどの突然変異が存在し又は存在しないのかを知っていることは、方法のユーザが、所与の処置による、CRC又はNSCLCを患う被験体の寛解を予測することを可能にする。この予測が、ひいては、ユーザが、以下により詳細に記載される通りの適切な処置を選択し及び施すことを可能にする。
1. 定義
別途定義しない限り、本明細書中に使用された全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願書類が調整(control)するだろう。本明細書に記載された方法及び材料と同様又はこれに相当(equivalent)するものが本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料は以下に記載される。本明細書中に言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照することにより、その全体が組み込まれる。本明細書中に記載された材料、方法、及び実施例は、単なる実例となるものであり、限定することを目的とするものではない。
本明細書中に使用する場合、用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、」「有する(has)」、「し得る(can)」、「含有する(contain(s))」、及びその異形は、追加的な行為又は構造の可能性を排除しないオープンエンド(open-ended)の移行句、用語、又は単語であることを意図している。文脈が別途明示しない限り、単数形「a」、「及び(and)」及び「the」は、複数の言及を含む。本開示は、明確に説明されたか否かにかかわらず、本明細書中に提示された実施態様又は要素「を含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」及び「から実質的になる(consisting essentially of)」他の実施態様も予期する。
本明細書中に使用する場合、用語「約(about)」は、規定された値からおよそ±10%の変動のことをいう。それについて特定の言及がなされるか否かにかかわらず、かかる変動が、本明細書中に与えられた任意の所与の値に常に含まれることを理解すべきである。
本明細書中に使用する場合、用語「蛍光色素分子(fluorophore)」又は「蛍光標識」は、蛍光を発する能力がある任意の適切な部分を意味する。光は、化学的に、生物学的に、励起光子(excitational photon)に反応して、又は他の任意の適切な原因からも生成され得る。好ましくは、蛍光色素分子は、結合部分(linking moiety)を介する、本明細書中に記載されたプローブの、核酸への結合のために誘導体化(derivatize)された蛍光有機色素(fluorescent organic dye)である。リボシル(ribosyl)ポリマー又はデオキシリボシルポリマー(deoxyribosyl polymer)が、核酸塩基(nucleobase)を結合するために使用される場合、色素(dye)は、都合よく誘導体化されて、ポリマーの末端3′炭素又は末端5′炭素に結合し得る。
本明細書中に使用する場合、用語「高親和性の核酸類似体」は、同じ塩基配列を有する修飾されていない核酸よりもデオキシリボ核酸(DNA)等の相補性核酸(complementary nucleic acid)へ高親和性でハイブリダイゼーション(hybridize)する、修飾された核酸を意味する。高親和性核酸としては、限定されるものではないが、ロックド核酸(locked nucleic acid, LNA)、ペプチド核酸(peptide nucleic acid, PNA)、ヘキシトール核酸(hexitol nucleic acid, HNA)、ホスホロアミデート(phosphoramidate)及び同様のものが挙げられる。
本明細書中に使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション(hybridization)」は、2本の1本鎖核酸の間の相補的塩基対合(complementary base pairing)による2本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、厳密に(exactly)相補的な核酸鎖の間又はミスマッチ数が少ない相補的核酸鎖の間で起こり得る。
本明細書中に使用する場合、用語「KRAS標的配列」又は「KRAS標的核酸配列」は、本明細書中に記載された1以上のプライマー及び/又はプローブを用いて、増幅されるか、検出されるか、又はその両方である、KRAS遺伝子のコドン12、コドン13、コドン61、コドン117、又はコドン146、又はそれらの任意の組合せ、又はその相補体(complement)を包含する核酸を意味する。加えて、用語、標的配列(target sequence)は、時には2本鎖核酸配列のことをいうが、標的配列は1本鎖でもあり得る。標的配列が2本鎖である場合、本発明のプライマーは、標的配列の両方の鎖を増幅し得る。特定の生物に対して、程度の差はあるが特異的な標的配列が選択され得る。例えば、標的配列は、属全体、1を超える属、種若しくは亜種、血清群(serogroup)、栄養要求株(auxotrope)、血清型(serotype)、系統(strain)、分離株(isolate)、又は生物の他の小集合(subset)に特異的であり得る。
本明細書中に使用する場合、用語「標識(label)」は、部分の固有の化学的性質又は別の分子と反応するその能力に基づいて、検出可能なシグナルを生成し得る任意の部分を意味する。標識の例としては、限定されるものではないが、放射性(radioactive)、蛍光性(fluorescent)、又は化学発光性(chemiluminescent)の分子又は酵素が挙げられる。標識は、ビオチン-アビジン系(biotin-avidin system)及び抗原-抗体系(antigen-antibody system)等の、容易に検出可能な他の分子に対して親和性を有する分子も含む。
本明細書中に使用する場合、用語「ロックド核酸(LNA)」は、リボース環に加えられた追加の2H-O、4H-C-メチレン架橋(methylene bridge)を有する、構造的に(conformationally)制限されたヌクレオチド類似体の1以上の単量体が存在することを特徴とする核酸類似体（プリン及び/又はピリミジン(pyrmidine)塩基の高分子化合物）を意味する。LNAは、1以上の2H-O、4H-C-メチレン-(D-リボフラノシル)ヌクレオチド単量体を有するオリゴヌクレオチドとして規定されている。LNAは、エクソヌクレアーゼ及び熱に耐性がある。
用語「核酸」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」、及び「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、修飾RNA若しくはDNAの核酸高分子、又はRNA若しくはDNA模倣剤(mimetic)（例えば、プロテイン核酸(protein nucleic acid, PNA)）、及びその誘導体(derivative)、並びにその変異体を意味する。従って、ポリヌクレオチドとしては、天然に存在する核酸塩基、糖(sugar)、及び共有結合性のヌクレオシド間（骨格）結合でできている高分子化合物、並びに、同様に機能する天然に存在しない部分を有する高分子化合物が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、通常、約10から最長で約160又は200ヌクレオチドの短いポリヌクレオチドである。
これらの用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、長さに関係なく、プライマー、検出可能なオリゴヌクレオチド又はプローブ、及びオリゴマー(oligomer)のこともいい、ポリデオキシリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、及び修飾/非修飾のプリン/ピリミジン塩基の任意の他のN-グリコシドを含む。例としては、1本鎖DNA(ssDNA)、2本鎖DNA(dsDNA)、1本鎖RNA(ssRNA)、及び2本鎖RNA(dsRNA)が挙げられる。かかる分子は、ホスホジエステル結合を含み得、或いは、限定されるものでないが、ホスホトリエステル(phosphotriester)、ホスホルアミデート(phosphoramidate)、シロキサン(siloxane)、カーボネート(carbonate)、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート(acetamidate)、カルバメート(carbamate)、チオエーテル、架橋型ホスホルアミデート(bridged phosphoramidate)、架橋型メチレンホスホネート(bridged methylene phosphonate)、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、メチルホスホネート(methylphosphonate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、架橋型ホスホロチオエート(bridged phosphorothioate)又はスルホン結合、及びそれらの組合せを含む修飾された結合を含み得る。かかる分子は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及び/又はウラシル、並びに、他の修飾された、非標準の(non-standard)、又は誘導体化された塩基を含み得る。代替的に又は追加的に、かかる分子は、1以上の修飾された糖部分を含み得る。
本明細書中に使用する場合、用語「ペプチド核酸(PNA)」は、通常のホスホジエステル骨格がN-(2-アミノエチル)グリシン鎖又は他の代わりのアミノ酸鎖(alternative amino acid chain)で置き換えられている合成(synthetic)DNA類似体を意味する。その核酸塩基は、同じA-T(U)及びG-Cの様態でDNA又はRNAを相補(complement)する(Nielsen, et al., Science 254: 1497-1500(1991); Hanvey, et al., Science 258: 1481-1485(1992);及びEgholm, et al., Nature 365: 566-568(1993))。人工骨格(artificial backbone)は、PNAをヌクレアーゼ耐性にする。PNAは、当分野において既知の方法に従って合成され得る（例えば、Hyrup, et al., Bioorg. Med. Chem. 4: 5-23(1996); 国際特許出願公開第WO 92/20702号及び92/20703号; 及び米国特許第 5,539,082号参照、該方法に関する教示のために、これらの全内容は、参照することにより本明細書中に組み込まれる）。2の重要な特性が、PNAを、特異的な対立遺伝子についての優れたPCRクランプ(PCR clamp)とする。それは、重合(polymerization)のためのプライマーとして働き得ない。それは、Taqポリメラーゼによるエクソヌクレアーゼ活性のための基質(substrate)として働き得ない。加えて、完全に一致するPNA-DNA 2本鎖の融解温度は、同じ長さのDNA-DNA 2本鎖の融解温度より高く、従って、PNA-DNA 2本鎖は、より安定である。PNA-DNAハイブリッド鎖(hybrid)中におけるただ1つのミスマッチが、約10〜18℃の融解温度の降下を引き起こすだろう(Kyger, et al., Anal. Biochem. 260: 142-148(1998))。従って、適切な温度範囲にわたって、PNAは、ミスマッチの塩基（複数可）と鋳型の反応を妨げることなく、完全に一致する鋳型(template)における、プライマー/検出可能なオリゴヌクレオチドのアニーリング(annealing)又は鎖伸長(chain elongation)を特異的に阻害し得(Sun, et al., Nat. Biotechnol. 20: 186-189(2002); Thiede, et al., Nucleic Acids Res. 24: 983-984(1996); 及び Taback, et al., Int. J. Cancer 111: 409-414(2004))、これはPNA媒介(mediated)PCRクランプ法と呼ばれる(Orum, et al., Nucleic Acids Res. 21: 5332-5336(1993))。完全に一致するハイブリッド鎖と不一致のハイブリッド鎖との、融解温度における大きな差異により、PNAは、点突然変異の良いセンサーとなる（例えば、Karadag, et al., Nucleic Acids Res. 32: e63(2004); 上記Taback, et al.(2004); Hancock, et al., Clin. Chem. 48: 2155-2163(2002); Takiya, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: 360-368(2004); Kirishima, et al., J. Hepatol. 37: 259-265(2002); 及び Ohishi, et al., J. Med. Virol. 72: 558-565(2004)参照）。米国特許出願公開第2004/0014105号には、少量(low abundance)の試料中に存在するポリヌクレオチドの、選択的濃縮のための方法が記載されている。方法は、PCRクランプとして、酵素で伸長不可能な(enzymatically non-extendable)核酸塩基オリゴマー（例えば、PNA）を使用して、試料中に多量に存在するポリヌクレオチドについてのポリメラーゼ活性を選択的に阻害し、それによって、試料中により少量存在する種類(species)の濃縮をもたらす。「PNA」は、PNAクランプ(PNA clamp)を含み得る。クランプ法(Clamping)は、共通の標的部位についての、PNA及びDNAのプライマー又はプローブの間の物理的な競合(physical competition)によって機能し、それによってプライマー伸長を妨げる。
核酸配列に関して本明細書中に使用する場合、用語「核酸配列同一性パーセント(%)」は、配列をアライメント(align)し、必要ならば、ギャップを導入(introduce gap)し、最大の配列同一性パーセント(maximum percent sequence identity)を実現した後の、候補配列中における、対象の配列のヌクレオチドと一致するヌクレオチドの百分率を意味する。核酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメント(alignment)は、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegaalign(DNASTAR)ソフトウェア等の一般に入手可能(publicly available)なコンピュータソフトウェアを用いて、当分野の技能の範囲内である様々な方法において実現され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって、最大アライメント(maximal alignment)を実現するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。
ヌクレオチド配列をアライメントする場合、所与の核酸配列Dに対する(to)、該核酸配列Dとの(with)、又は該核酸配列Dと対照した(against)、所与の核酸配列C（或いは、所与の核酸配列Dに対する、該核酸配列Dとの、該核酸配列Dと対照した、いくらかの核酸配列同一性パーセントを有し又は含む所与の核酸配列Cと表現され得る）の核酸配列同一性パーセントは、以下のように計算され得る:
核酸配列同一性パーセント = W/Z*100
（式中、
Wは、C及びDの配列アライメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントにより、完全一致(identical match)として評価されたヌクレオチドの数であり、
且つ、
Zは、Dにおけるヌクレオチドの総数である。）
核酸配列Cの長さが、核酸配列Dの長さと同じでない場合、Dに対するCの核酸配列同一性パーセントは、Cに対するDの核酸配列同一性パーセントと同じではないだろう。
第2ポリヌクレオチドとの配列同一性を有する第1ポリヌクレオチドは、第2ポリヌクレオチドとの少なくとも約60%の核酸配列同一性又は少なくとも約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の核酸配列同一性を有する第1ポリヌクレオチドを意味する。
本明細書中に使用する場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)」は、DNA配列のコピーを作製する方法を意味する。方法は、温度サイクリング(thermal cycling)(すなわち、それぞれDNAの変性(denaturation)（又は融解）及び複製のための加熱及び冷却のサイクル)を用いる。コピーされるDNA配列に相補的な配列を含有する短いDNA断片であるプライマーと、Taqポリメラーゼと呼ばれるサーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus)からのDNAポリメラーゼ等の耐熱性のDNAポリメラーゼとが、DNA配列を選択し、且つ、それをコピーするために使用される（例えば、米国特許第4,683,195号;第4,800,195号、及び第4,965,188号参照、該方法に関する教示のために、該全ての文献は、参照することによって本明細書中に組み込まれる）。サイクルの繰り返しとともに、作製されたコピーが、更なるコピーを生成するための鋳型として使用される（すなわち、連鎖反応）。PCR技術としては、限定されるものではないが、標準のPCR、アレル特異的(allele-specific)PCR、アッセンブリ(assembly)PCR、非対称PCR、デジタルPCR、ホットスタート(Hot-start)PCR、配列間特異的(intersequence-specific)PCR、逆PCR、ライゲーション媒介(ligation-mediated)PCR、メチル化特異的(methylation-specific)PCR、ミニプライマーPCR、2段階PCR(nested PCR)、オーバーラップエクステンション(overlap-extension)PCR、リアルタイムPCR、逆転写PCR、固相(solid phase)PCR、熱非対称インターレース(thermal asymmetric interlaced)PCR、及びタッチダウン(Touchdown)PCRが挙げられる。
本明細書中に使用する場合、用語「プライマー」は、鋳型依存性核酸合成を起こすオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、核酸鋳型、ヌクレオシド三リン酸前駆体(nucleoside triphosphate precursor)、ポリメラーゼ、及び補因子の存在下、温度及びpHの適切な条件で、ポリメラーゼによるヌクレオチドの付加によって、その3′末端において伸長させられ、プライマー伸長産物を生じさせ得る。プライマーは、用いられる特定の条件及び増幅の目的に応じて、長さの点で異なり得る。例えば、診断目的のための増幅のためのプライマーは、通常、長さ約15〜約35ヌクレオチドである。プライマーは、望ましい伸長産物の合成をプライムする(prime)ために、望ましい鋳型に十分に相補的(complementarity)でなければならない。言い換えれば、プライマーは、ポリメラーゼによる合成開始における使用のために適切に並列したプライマーの、3′ヒドロキシル部分を提供するために十分な様態で、望ましい鋳型鎖(template strand)とアニーリング可能でなければならない。プライマーが、望ましい鋳型の厳密な(exact)相補体である必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの5′末端に存在し得る。或いは、プライマー配列が、望ましい鋳型鎖の配列と十分な相補性を有して、伸長産物の合成のための鋳型-プライマー複合体をもたらすという条件で、非相補的塩基が、オリゴヌクレオチドプライマー内に散在(intersperse)し得る。
本明細書中に使用する場合、用語「プローブ」又は「プライマー」は、長さ少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、又は少なくとも25ヌクレオチドであり、且つ、プローブ又はプライマー中の少なくとも1の配列と、標的領域中の配列との相補性に起因して、標的配列とハイブリッド構造(hybrid structure)を形成するポリヌクレオチドを意味する。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA及び/又はRNA及び/又は合成ヌクレオチド類似体からなり得る。好ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応の間標的配列に対してプライムするために使用される配列（複数可）に相補的な配列を含まない。プライマー及びプローブは、適切な条件下で選択的に標的配列へハイブリダイゼーションする。プローブは検出され得る。いくつかの実施態様では、プライマー及び/又はプローブは、1以上の高親和性核酸類似体を含み得る。
本明細書に使用する場合、用語「特異的にハイブリダイゼーションする(specifically hybridize)」は、別の核酸へ特異的に結合する、プライマー又はプローブ等の核酸（又はその類似体）の能力を意味する。
本明細書中に使用する場合、用語「被験体」は、哺乳類、鳥類、又は爬虫類を意味する。被験体は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、又は霊長類であり得る。被験体は、ヒトであり得る。被験体は、生存している場合又は死亡している場合がある。
本明細書中に使用する場合、用語「ストリンジェントな(stringent)」又は「配列特異的な(sequence-specific)」ハイブリダイゼーション条件は、厳密に相補的な核酸鎖が優先的に(preferentially)ハイブリダイゼーションするであろう条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当分野において周知である。ストリンジェントな条件は、配列依存性(sequence-dependent)であり、異なる環境下では異なるであろう。通常、ストリンジェントな条件は、特異的配列についての、pH及びイオン強度の(ionic strength)規定された条件下で50%の塩基対が解離する熱的融点(thermal melting point)(Tm)よりも約5℃低く選択される。
本明細書中に使用する場合、用語「実質的に相補的な(substantially complementary)」は、小さなミスマッチの領域を除けば相補的な配列を意味する。長さ約15ヌクレオチドである核酸中におけるミスマッチの総数は、通常、約3ヌクレオチド以下である。
本明細書中に使用する場合、用語「標的配列」及び「標的領域」は、それが検出され、又は検出され且つ分析される予定であり、且つ、対象の多型性部位(polymorphic site)を含む核酸の領域を意味する。
本明細書中に使用する場合、用語「試験試料(test sample)」、「生物試料(biological sample)」、「患者試料(patient sample)」、又は「試料(sample)」は、被験体から取得された試料、又は生体液(biological fluid)を意味し、試料は、KRAS標的配列を含有し得る。試験試料は、任意の供給源、例えば、組織、血液、血漿、唾液、痰(sputa)、粘液(mucus)、汗、尿、尿道スワブ(urethral swab)、子宮頸部スワブ(cervical swab)、泌尿生殖器(urogenital)又は肛囲スワブ(anal swab)、結膜スワブ(conjunctival swab)、眼レンズ液(ocular lens fluid)、脳脊髄液(cerebral spinal fluid)等から取得され得る。試験試料は、(i)供給源から取得されたままで直接使用されても、又は(ii)試料の性質を変更するための前処理の後に使用されてもよい。従って、試験試料は、例えば、血液から血漿又は血清を調製すること、細胞又はウイルス粒子を破壊(disrupt)すること、固形物から液体を調製すること、粘液(viscous fluid)を希釈すること、液体をろ過すること、試薬を加えること、核酸を精製すること等により、前処理され得る。いくつかの実施態様では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織であり得る。他の実施態様では、試料は、FFPE組織から抽出され又は取得された核酸（例えば、DNA及び/又はRNA）であり得る。更に他の実施態様では、試料は、血液、血漿、又は別の体液から抽出され又は取得された核酸（例えば、DNA及び/又はRNA）であり得る。
本明細書中に使用する場合、用語「治療する(treat)」、「治療(treating)」、又は「処置(treatment)」は、かかる用語が適用される疾患の進行又はかかる疾患の1以上の症状を改善し(reverse)、緩和し(alleviate)、又は抑制することを、交換可能に(interchangeably)意味する。被験体の状態に応じて、該用語は、疾患を予防することもいい、疾患の発病を予防すること、又は疾患に関連している症状を予防することを含む。処置は、急性(acute)又は慢性(chronic)の方法のいずれかで行われ得る。該用語は、疾患を原因とする苦痛に先立って、疾患又はかかる疾患に関連する症状の重症度(severity)を低減させることもいう。「予防(Preventing)」は、かかる疾患に関連している1以上の症状を伴う疾患の再発を予防することもいう。「処置」及び「治療的に(therapeutically)」は、上で「治療」が定義されたので、治療行為のことをいう。
本明細書中に使用する専門用語は、特定の実施態様を説明する目的だけのためのものであり、それ以外に限定することを意図するものではない。本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度(precision)で、間にあるそれぞれの途中の数が明確に予期される。例えば、6〜9の範囲について、6及び9に加えて数7及び8が予期され、範囲6.0〜7.0について、数6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0が明確に予期される。
2. KRAS中における1塩基多型を同定する方法
本明細書中、提供されるのは、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の同定を、それを必要とする被験体においてする方法である。同定する方法は、KRAS中における1以上のSNPの有無を決定する。KRAS中における1以上のSNPは、がん、例えば、限定されるものではないが、以下により詳細に記載される通り、大腸がん(CRC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)に関連している場合がある。KRAS中における1以上のSNPの有無は、がん（例えば、CRC又はNSCLC）を患う被験体の、特定のがん治療又は処置による寛解を示し得、ひいては、被験体のためのがん治療の選択を補助し得る。
同定する方法は、KRAS中における1のSNPを、KRAS中における別のSNPと区別する。同定する方法は、KRAS中におけるSNPを、KRAS中における野生型配列と区別する。同定する方法は、100 ng、10 ng、1 ng、1μg、10μg、又は100μgのKRAS標的配列中において、少なくとも約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、又は10%のKRAS突然変異の感度(sensitivity)をもたらす。同定する方法は、10 ngのKRAS標的配列中において、少なくとも約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、又は10%のKRAS突然変異の感度をもたらす。いくつかの実施態様では、方法は、10 ngのKRAS標的配列中において、少なくとも約2%のKRAS突然変異の感度をもたらす。
同定する方法は、再現可能である。同定する方法は、1以上のSNPの有無の検出において、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の再現性をもたらす。いくつかの実施態様では、同定する方法は、1以上のSNPの有無の検出において、100%の再現性をもたらす。
同定する方法は、検出のために標的とされる1以上のSNPに特異的であり、それによって、被験体から取得された試料中に存在し得る微生物、ヘモグロビン、トリグリセリド、壊死組織等の混入物質及び/又は妨害物質との交差反応(cross-reactivity)、またこれらの物質からの干渉(interference)を回避する。同定する方法は、検出のための標的とされる、KRAS中における1以上のSNPに特異的であり、従って、KRASのホモログ、例えば、hRAS及びnRAS、並びにKRAS偽遺伝子KRAS1Pと交差反応しない。
方法は、被験体から試料を取得することを含み、該被験体において、試料は、KRAS標的配列を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。以下により詳細に記載されるように、KRAS標的配列は、野生型KRAS配列、突然変異体KRAS配列、又はそれらの組合せであり得る。
方法は、KRAS中における1以上のSNPを測定又は検出することも含む。測定又は検出することは、以下により詳細に記載されるように、反応混合物を形成することを含み得る。反応混合物は、KRAS標的配列（又はその一部）を増幅するためのプライマー、及びペプチド核酸(PNA)オリゴマーを含み得る。PNAオリゴマーは、野生型KRAS配列の増幅を抑制し、それによって突然変異体KRAS配列の選択的増幅を可能にする。この選択的増幅は、増幅された突然変異体KRAS配列を濃縮する。従って、試料が取得された被験体が、KRAS中における1以上のSNPについて、ヘテロ接合体又はホモ接合体であったかにかかわらず、突然変異体KRAS配列が試料中に存在すれば、選択的に増幅される（従って濃縮される）。この選択的増幅は、KRAS中における1以上のSNPを検出するために必要な試料がより少なく、且つ、野生型KRAS配列の増幅に起因する干渉又はノイズもより少ないという、有利な特性ももたらす。
反応混合物は、内部コントロールも含み得る。反応混合物は、1以上のプローブを更に含み得、それぞれが独立した検出を可能にし、従って、KRAS中における異なるSNPの同定を可能にする。1以上のプローブは、以下により詳細に記載されるように、検出可能に標識され得る。
方法は、反応混合物を、KRAS中において1以上のSNPを含む、1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供することも含む。方法は、1以上のプローブを用いて1以上のアンプリコンを検出することを更に含み、該方法において、検出は、KRAS中における1以上のSNPが存在することを示す。非検出(no detection)は、KRAS中に1以上のSNPが存在しないことを示す。検出は、KRAS中における特定のSNPに合わせて調整(align)され得る。
好都合なことには、1以上のプローブが、異なる標識を用いてそれぞれ独立に標識され得、それによって、KRAS中における1を超えるSNPの検出、ひいては同定を可能にする。いくつかの実施態様では、それぞれのコドン内の異なる突然変異（該コドンにおいて異なる突然変異が同じアミノ酸置換を引き起こす）を検出するプローブが、同じ標識を含有し得る。具体的には、多数のSNP（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを超えるSNP）が、本明細書中に記載された同定する方法により、同時的様体で検出され、且つ同定され得る。これは、突然変異体KRAS配列の選択的増幅によってもたらされる濃縮を前提とした少量の試料投入（1 ng、10 ng、100 ng、又は1 μg等）で、KRAS中における、それぞれCRC及びNSCLCに関連している、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%の突然変異の有無を決定する有利な能力をもたらす。従って、KRAS中における1以上のSNPを同定する方法は、CRC及びNSCLCと関連している、KRAS中におけるほぼ全ての突然変異を検出するという注目すべき技術的効果を実現する。同定する方法は、所与の被験体のKRAS遺伝子中において、どの突然変異が存在しないかや、どの突然変異が存在するかを同定するという注目すべき技術的効果も実現する。どの突然変異がKRAS遺伝子中において存在するか又は存在しないかを知っていることは、該方法のユーザが、CRC又はNSCLCを患う被験体の、所与の処置による寛解を予測することを可能にする。この予測が、ひいては、ユーザが、以下により詳細に記載される通りの適切な処置を選択し、且つ施すことを可能にする。
a. KRAS遺伝子中におけるSNP
方法は、v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)遺伝子中における1以上のSNPの有無を確認する。KRASは、低分子量GTPアーゼ(small GTPase)をコードし、該低分子量GTPアーゼは、GTPを結合した活性コンフォメーション(GTP-bound active conformation)とGDPを結合した不活性コンフォメーションとの間を循環(cycle)する。KRASによりコードされたGTPアーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(mitogen-activated protein kinase, MAPK)シグナル伝達経路の一員でもあり、該シグナル伝達経路は、細胞増殖及び分化を調節する。具体的には、KRASは、細胞表面受容体チロシンキナーゼ(cell surface receptor tyrosine kinase, RTK)、例えば、上皮成長因子受容体(EGFR)から生じた上流シグナルによって活性化される。KRASの活性コンフォメーションは、下流の急速進行性線維肉腫(rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF)キナーゼ、例えば、B-RAFを活性化することにより、シグナル伝達する。
KRAS中における、GTP加水分解を妨げる突然変異が、構成的に活性なKRASコンフォメーションを誘導するため、これらの突然変異は発がん性(oncogenic)である。これらの活性化突然変異は、支配的に、KRAS遺伝子のコドン12、13、及び61内に位置し、SNPであり得る。KRAS遺伝子のエクソン2のコドン12及び13、並びにエクソン3のコドン61中には、最多で18アミノ酸の、起こり得る変化がある。コドン61は、KRAS遺伝子のエクソン3に位置するが、コドン12及び13は、KRAS遺伝子のエクソン2に位置する。KRAS中における活性化突然変異は、例えば、以下により詳細に記載される大腸がん(CRC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)を含むいくつかのがんにおいて発見される。特に、これらのがん中において同定されたKRAS突然変異の98%よりも多くが、コドン12、13、及び61において起こり得る18のアミノ酸の変化のうちの、G12D、G12A、G12V、G12S、G12C、G12R、G13D、G13C、又はQ61Hである。加えて、KRAS遺伝子のコドン117及び146に位置する突然変異は発がん性である。発がん性である、KRAS遺伝子のコドン117及び146中において起こり得るアミノ酸の変化が最多で4あり（以下の表1参照）、上述され、以下表1に示されるKRAS遺伝子のコドン12、13及び/又は61中における突然変異変化(mutation change)と組合され得る)。
従って、KRAS中における1以上のSNPが、がん、例えば、限定されるものではないが、大腸がん(CRC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)と関連している場合がある。KRAS中における1以上のSNPの有無が、以下により詳細に記載される通りの、特定のがん治療又は処置による、がん（例えば、CRC又はNSCLC）を患う被験体の寛解を示し得る。
1以上のSNPが、KRAS遺伝子のエクソン2、エクソン3、エクソン2とエクソン3、又は別の一部において発見され得る。1以上のSNPがKRAS遺伝子のコドン12、13、61、117、及び/又は146において発見され得る。1以上のSNPが、以下の表1に列挙された1以上のSNPであり得る。いくつかの実施態様では、1以上のSNPが、G12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、Q61H（すなわち、Q61Ha又はQ61Hb）のうちの1以上であり得る。
1以上のSNPは、以下の表1に列挙されたSNPの任意の組合せであり得る。いくつかの実施態様では、1以上のSNPが、G12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、Q61H（すなわち、Q61Ha又はQ61Hb）の任意の組合せであり得る。

*下線を引くことにより、アミノ酸配列中において、対応する突然変異（すなわち、置換）を引き起こす1塩基多型にマークをつける。
** Q61Ha又はQ61HbのどちらもQ61H突然変異を引き起こし得る。
(1)がんとのSNPの関連性
KRAS遺伝子中における1以上のSNPは、がん細胞(cancer cell)、がん組織(cancerous tissue)、がん(cancer)、新生物(neoplasm)、腫瘍(tumor)、及び/又は転移がん(metastatic cancer)と関連している場合がある。特に、上述されたKRAS遺伝子中における1以上のSNPが、1以上のがんと関連している場合がある。1以上のがんは、限定されるものではないが、大腸がん(CRC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)であり得る。
35%の大腸がん又は腫瘍は、KRAS遺伝子中において突然変異を含む。16%の非小細胞肺がん又は腫瘍は、KRAS遺伝子中における突然変異を含む。以下の表2は、同定されたがんにおける各SNPの発生を示す。
特に、上記表1中に列挙された1以上のSNPの有無は、本明細書中に記載された同定する方法のユーザが、所与の処置による、CRC又はNSCLCを患う被験体の寛解を予測することを可能にする。この予測が、ひいては、該ユーザが、以下により詳細に記載される通りの適切な処置を選択し、施すことを可能にする。
いくつかの実施態様では、SNPであるG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、及びQ61Hのうちの1以上の有無は、本明細書中に記載された同定する方法のユーザが、所与の処置による、CRC又はNSCLCを患う被験体の寛解を予測することを可能にする。この予測が、ひいては、該ユーザが、以下により詳細に記載される通りの適切な処置を選択し、施すことを可能にする。
(2)KRAS標的配列
方法は、KRAS標的配列を増幅することを含み得る。KRAS標的配列は、DNA、RNA、又はcDNA内に存在し得る。DNAは、ゲノムDNA又は循環腫瘍DNA(ctDNA)であり得る。いくつかの実施態様では、DNA、RNA、又はcDNAは、血液、血漿、又は他の体液内を循環し得、又は血液、血漿、又は他の体液中において発見され得る。
KRAS標的配列は、上述された試料から取得されたDNA、RNA、又はcDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、がん又は腫瘍からの組織又は細胞から取得されたDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、がん又は腫瘍からの組織又は細胞から取得されたゲノムDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)された、がん又は腫瘍組織から取得又は抽出されたゲノムDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、大腸がん又は腫瘍からの組織又は細胞から取得されたゲノムDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、非小細胞肺がん又は腫瘍からの組織又は細胞から取得されたゲノムDNA内に存在し得る。KRAS標的配列は、KRAS配列のエクソン2（以下に検討される第1アンプリコン）及び/又はエクソン3（以下に検討される第2アンプリコン）内に存在し得る。
KRAS標的配列は、野生型KRAS配列、突然変異体KRAS配列、又はそれらの組合せであり得る。野生型KRAS配列は、上述された1以上のSNPを含まない。突然変異体KRAS配列は、上述された1以上のSNPを含有し得る。
(a)KRAS遺伝子のエクソン2を増幅するためのプライマー
KRAS標的配列は、KRAS遺伝子のエクソン2（又はその一部）であり得る。従って、方法は、KRAS遺伝子のエクソン2（又はその一部）を増幅するためのプライマーのペアを含み得る。このプライマーのペアは、KRAS遺伝子のエクソン2内に含まれる核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションする。プライマーのペアは、第1アンプリコンの生成のための第1フォワードプライマー及び第1リバースプライマー（すなわち、本明細書中においてそれぞれ「エクソン2フォワードプライマー」及び「エクソン2リバースプライマー」としても知られる）を含む。第1アンプリコンは、SNPであるG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13C、G13D、又はそれらの任意の組合せのうちの1以上を含み得る。第1アンプリコンは、以下により詳細に記載される第2アンプリコン及び/又は第3アンプリコンと同時に生成され得る。
第1フォワードプライマーは、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表3参照）。第1リバースプライマーは、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表3参照）。
(b)KRAS遺伝子のエクソン3を増幅するためのプライマー
KRAS標的配列は、KRAS遺伝子のエクソン3（又はその一部）であり得る。従って、方法は、KRAS遺伝子のエクソン3（又はその一部）を増幅するためのプライマーのペアを含み得る。このプライマーのペアは、KRAS遺伝子のエクソン3内に含まれる核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションする。プライマーのペアは、第2アンプリコンの生成のための第2フォワードプライマー及び第2リバースプライマー（すなわち、本明細書中においてそれぞれ「エクソン3フォワードプライマー」及び「エクソン3リバースプライマー」としても知られる）を含む。第2アンプリコンは、SNPであるQ61Hを含み得る。第2アンプリコンは、第1アンプリコン及び/又は第3アンプリコンと同時に生成され得る。
第2フォワードプライマーは、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表4参照）。第2リバースプライマーは、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表4参照）。
(3)SNPの検出のためのプローブ
方法は、上述の通りの、KRAS遺伝子中における1以上のSNPを検出するための1以上のプローブを含む。1以上のプローブは、第1アンプリコン又は第2アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションし得る。1以上のプローブは、標識を含有し得、該1以上のプローブにおいて、各プローブが異なる標識を含有し、それによって各プローブの独立した検出を可能にする。標識は、以下により詳細に説明される。いくつかの実施態様では、各コドン内の異なる突然変異を検出するプローブ（該コドンにおいて、異なる突然変異が同じアミノ酸置換を生じさせる）が、同じ標識を含み得、それによって、特異的なアミノ酸置換に関連している各プローブ（複数可）の独立した検出を可能にする。
上述のように、第1アンプリコンは、SNPであるG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13C、G13D、又はそれらの任意の組合せのうちの1以上を含み得る。従って、第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションする1以上のプローブとしては、SNPであるG12Sが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「G12Sプローブ」としても知られる）、SNPであるG12Cが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（本明細書中において「G12Cプローブ」としても知られる）、SNPであるG12Rが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「G12Rプローブ」としても知られる）、SNPであるG12Vが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「G12Vプローブ」としても知られる）、SNPであるG12Dが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「G12Dプローブ」としても知られる）、SNPであるG12Aが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「G12Aプローブ」としても知られる）、SNPであるG13Cが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、「G13Cプローブ」としても知られる）、SNPであるG13Dが第1アンプリコンに存在する場合に第1アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（本明細書中において「G13Dプローブ」としても知られる）、又はそれらの任意の組合せが挙げられ得る。
G12Sプローブは、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G12Cプローブは、配列番号25、配列番号26、又は配列番号27に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G12Rプローブは、配列番号28、配列番号29、又は配列番号30に記載された核酸配列を含み得る（以下の表5参照）。G12Vプローブは、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G12Dプローブは、配列番号13、配列番号14、又は配列番号15に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G12Aプローブは、配列番号16、配列番号17、又は配列番号18に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G13Cプローブは、配列番号34、配列番号35、又は配列番号36に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。G13Dプローブは、配列番号31、配列番号32、又は配列番号33に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。
上述のように、第2アンプリコンは、SNPであるQ61Hを含み得る。従って、第2アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションする1以上のプローブは、SNPであるQ61Haが第2アンプリコンに存在する場合に第2アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「Q61Haプローブ」としても知られる）、SNPであるQ61Hbが第2アンプリコンに存在する場合に第2アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするプローブ（すなわち、本明細書中において「Q61Hbプローブ」としても知られる）、又はその組合せを含み得る。
Q61Haプローブは、配列番号37、配列番号38、又は配列番号39に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。Q61Hbプローブは、配列番号40、配列番号41、又は配列番号42に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表5参照）。
b.内部コントロール(IC)
方法は、反応混合物中において、内部コントロール(internal control)も含み、該反応混合物の形成は、以下により詳細に記載される。内部コントロールは、既知の突然変異の発生がないKRAS遺伝子の一部である。内部コントロールは、反応混合物において、増幅が生じるための条件が十分であるか否かを示し、従って、増幅の効率を示す。内部コントロールは、被験体から取得された試料中に、KRAS標的配列が存在するか否かも示す。内部コントロールは、以下により詳細に記載されるように、増幅可能であったKRAS標的配列の総量を更に示し、従って、反応混合物中における、KRAS標的配列の量の投入量を示す。加えて、KRAS標的配列が増幅前に試料から抽出される場合、内部コントロールが抽出の効率を示し得る。
内部コントロールは、第3アンプリコンを生成するためのプライマーのペアと、第3アンプリコンを検出するためのプローブ（本明細書中において「内部コントロールプローブ」又は「ICプローブ」としても知られる）とを含む。第3アンプリコンの形成は、上述された第1アンプリコン及び/又は第2アンプリコンの形成を妨げない。加えて、第3アンプリコンは、第1及び/又は第2アンプリコンの検出と同時に検出され得る。
(1)内部コントロール(IC)のためのプライマー
内部コントロールは、第3アンプリコンを生成するためのプライマーのペアを含む。このプライマーのペアは、既知の突然変異の発生がないKRAS遺伝子の一部の内部に含まれる核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションする。従って、第3アンプリコンの形成は、上述された第1及び第2アンプリコンの形成と独立しており、従って、第1及び第2アンプリコンの形成を妨げない。
このプライマーのペアは、第3アンプリコンを生成するための第3フォワードプライマー及び第3リバースプライマー（すなわち、本明細書中においてそれぞれ「ICフォワードプライマー」及び「ICリバースプライマー」としても知られる）を含む。この第3アンプリコンは、第2アンプリコン及び/又は第1アンプリコンと同時に生成され得る。第3フォワードプライマーは、配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表6参照）。第3リバースプライマーは、配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表6参照）。
(2)内部コントロールプローブ
内部コントロールは、第3アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションするICプローブも含む。ICプローブは、上述された1以上のプローブ（すなわち、G12Sプローブ、G12Cプローブ、G12Rプローブ、G12Vプローブ、G12Dプローブ、G12Aプローブ、G13Cプローブ、G13Dプローブ、Q61Haプローブ、及び/又はQ61Hbプローブ）のために使用された標識とは異なる標識を含有し得、それによって、該ICプローブと第1又は第2アンプリコンに特異的にハイブリダイゼーションする1以上のプローブとの、独立且つ同時の検出を可能にする。ICプローブは、配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載された核酸配列を含み又は有し得る（以下の表7参照）。
c. PNAオリゴマー
方法は、野生型KRAS配列の増幅を阻害するためのPNAオリゴマーの使用を含み、それによって、突然変異体KRAS配列の選択的増幅及び濃縮を可能にする。PNAオリゴマーは、野生型KRAS配列に相補的であり、従って、選択的にハイブリダイゼーションする。特に、PNAオリゴマーは、野生型KRAS配列中における核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションし、該核酸配列は、第1若しくは第2フォワードプライマー又は第1若しくは第2リバースプライマーが、KRAS標的配列に選択的にハイブリダイゼーションするところの下流に位置する（図1）。このように、PNAオリゴマーは、第1若しくは第2フォワードプライマー又は第1若しくは第2リバースプライマーの伸長を阻害する。PNAオリゴマーは、図1に示すように、例えば、リバースプライマーの伸長を阻害するが、PNAオリゴマーは、KRAS標的配列のいずれかの鎖にハイブリダイゼーションするように設計され得、従って、フォワードプライマー又はリバースプライマーのいずれからの伸長をも阻害し得ることは理解すべきである。
PNAの相補鎖及び標的配列（例えば、DNA）から形成された2本鎖は、対応するDNA:DNA 2本鎖よりも大きな熱安定性(thermal stability)を有し、従って、伸長ポリメラーゼ(elongating polymerase)によって容易に取り除かれないため、PNAオリゴマーは、プライマー伸長を阻害する。しかしながら、PNA:DNA 2本鎖は、ただ1つのミスマッチにより不安定化され、伸長ポリメラーゼにより取り除かれ得る。従って、KRAS標的配列が野生型KRAS配列である場合に、PNAオリゴマーが野生型KRAS配列に選択的にハイブリダイゼーションし、PNA:DNA 2本鎖が形成され、伸長が阻止され、それによって野生型KRAS配列からのアンプリコンの形成が阻害又は抑制される。
KRAS標的配列が突然変異体KRAS配列である場合に、PNA:DNA 2本鎖において、1以上のミスマッチが生じ、それによってPNA:DNA 2本鎖を不安定化する。伸長は、不安定な2本鎖を通り抜けて進み、突然変異体KRAS配列からのアンプリコンの生成をもたらし得る。
従って、PNAオリゴマーは、突然変異体KRAS配列の選択的増幅、ひいては濃縮をもたらす。従って、試料が取得された被験体がKRAS中における1以上のSNPについてヘテロ接合体であるか、又はホモ接合体であるかにかかわらず、突然変異体KRAS配列が、試料中に存在すれば、選択的に増幅される（従って濃縮される）。この選択的増幅は、KRAS中における1以上のSNPの検出のために必要な試料がより少なく、且つ野生型KRAS配列の増幅に起因する干渉やノイズがより少ないという有利な特性ももたらす。この干渉を低減させることにより、ひいては、KRAS遺伝子中における多数のSNP（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はより多いSNP）の同時検出及び同定を容易にする。この同時の検出及び同定が、CRC及びNSCLCに関連している、KRAS中におけるほぼ全ての突然変異を検出し、これらの突然変異のうちのどれが、所与の被験体のKRAS遺伝子中に存在しないか、及び/又は存在するかを確認するという注目すべき技術的効果を実現する。
PNAオリゴマーは、上述された第1アンプリコンに選択的にハイブリダイゼーションし得る。PNAオリゴマーは、上述された第2アンプリコンに選択的にハイブリダイゼーションし得る。PNAオリゴマーは、2のPNAオリゴマーであり得、該PNAオリゴマーのうちの一方は、第1アンプリコンに選択的にハイブリダイゼーションし、該PNAオリゴマーのうちの他方は、第2アンプリコンに選択的にハイブリダイゼーションする。
PNAオリゴマーは、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、又は配列番号57に記載された配列を含み又は有し得る（以下の表8参照）。配列番号52、配列番号53、又は配列番号54に記載された配列を有するPNAオリゴマーは、第1アンプリコン（すなわち、KRAS遺伝子のエクソン2の増幅された領域）に選択的にハイブリダイゼーションし得、従って、本明細書中において「エクソン2 PNA オリゴマー」としても知られ得る。配列番号55、配列番号56、又は配列番号57に記載された配列を有するPNAオリゴマーは、第2アンプリコン（すなわち、KRAS遺伝子のエクソン3の増幅された領域）に選択的にハイブリダイゼーションし得、従って、本明細書中において「エクソン3 PNAオリゴマー」としても知られ得る。
d.プライマー及びプローブセット
同定する方法は、プライマー及び/又はプローブのセット中において、上述されたプライマー、プローブ、及びPNAオリゴマーの任意の組合せを利用し得る。プライマーセットとしては、限定されるものではないが、(1)配列番号2及び6;(2)配列番号7及び11;(3)配列番号43及び48;(4)配列番号2、6、7、及び11;(5)配列番号2、6、7、11、43、及び48;(6)配列番号7、11、43、及び48;並びに(7)配列番号2、6、43、及び48が挙げられ得る。いくつかの実施態様では、プライマーセットとしては、配列番号52、配列番号56、又は配列番号52と56が更に挙げられ得る。
プライマー及びプローブのセットとしては、限定されるものではないが、(1)配列番号2、6、43、48、22、27、30、及び51;(2)配列番号2、6、43、48、13、16、20、及び51;並びに(3)配列番号2、6、7、11、43、48、31、34、38、40、及び51が挙げられ得る。プライマー及びプローブのセットとしては、配列番号52、配列番号56、又は配列番号52と56が更に挙げられ得る。
他の実施態様では、プライマー及びプローブのセットとしては、やはり限定されるものではないが、(1)配列番号2、6、43、48、13、16、20、22、27、30、及び51;(2)配列番号2、6、43、48、13、16、20、22、27、30、31、34、及び51(3)配列番号2、6、7、11、43、48、13、16、20、22、27、30、31、34、38、40、及び51が挙げられ得る。プライマー及びプローブのセットとしては、配列番号52、配列番号56、又は配列番号52と56が更に挙げられ得る。
いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブのセットは、表3、4、5、6、7、及び8中に上述されたプライマー、プローブ、及びPNAオリゴマーの任意の組合せを含み得る。
e.プライマーの化学修飾
KRAS中において1以上のSNPを同定する方法は、KRAS標的配列へのハイブリダイゼーションの効率を向上させるために、例えば、上述したプライマーの化学修飾型を使用し得る。例えば、種間で保存された領域中における、（3番目の位置におけるコドンゆらぎ(codon wobble)に起因する）多様性がDNAのトリプレット(triplet)の3番目の位置においてしばしば生じるので、この位置に対応するヌクレオチドが、1を超えるヌクレオチドに結合し得る「ユニバーサル塩基(universal base)」となるように、上述されたプライマーが修飾され得る。例えば、イノシン(I)は、ウリジン(U)、シトシン(C)、又はアデニン(A)を結合させ、グアニン(G)は、U又はCに結合し、Uは、A又はGに結合する。ユニバーサル塩基の他の例としては、ニトロインドール(5-ニトロインドール等)又は3-ニトロピロール、縮重(degenerate)ヌクレオチドdP又はdK、5-ニトロインダゾールを含有する非環状ヌクレオシド類似体又はプリン類似体1-(2-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-イミダゾール-4-カルボキサミドが挙げられる。
別の実施態様では、プライマーが、「ゆらぎ」塩基による、ややより弱い結合を埋め合わせるために、各トリプレットの1番目及び2番目の位置が、非修飾のヌクレオチドよりも大きな親和性で結合するヌクレオチド類似体によって占められるように設計され得る。これらの類似体の例としては、チミンに結合する2,6-ジアミノプリン、アデニンに結合するプロピンT、並びに、グアニンに結合するプロピンC及びフェノキサジン（G-クランプ(G-clamp)等）が挙げられる。プロピニル化ピリミジン(Propynylated pyrimidine)は、米国特許第5,645,985号、第5,830,653号、及び第5,484,908号に記載され、各特許の全内容が参照によって本明細書中に組み込まれる。フェノキサジンは、米国特許第5,502,177号、第 5,763,588号、及び第6,005,096号に記載され、各特許の全内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。G-クランプは、米国特許第6,007,992号及び第6,028,183号に記載され、各特許の全内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
f.標識
KRAS中における1以上のSNPを同定する方法は、それらの検出を容易にするために、上述されたプローブのための標識を使用し得る（すなわち、プローブは、検出可能に標識される）。以下により詳細に記載されるように、この標識が上述されたプローブのための蛍光標識である場合、同定する方法は、クエンチャーもこの標識と組合せて使用し得る。
標識は、標識検出分野における当業者に既知の分光学的(spectroscopic)、光化学的(photochemical)、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出され得る。標識は、蛍光色素分子又は蛍光標識、化学発光標識(chemiluminescent label)、又は別の分子に対する親和性を有する別の部分であり得る。他の有用な標識としては、蛍光色素(fluorescent dye)等の色素、32P等の放射性標識、高電子密度試薬(electron-dense reagent)、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素、ビオチン、又は抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能な、ハプテン及びタンパク質が挙げられる。
反応混合物中において、各プローブがはっきりと検出され得るように、異なる色の蛍光色素分子が選ばれ得る。例えば、以下の蛍光色素分子の組合せが（限定されるものでないが）使用され得る: FAM（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)、 VIC（登録商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)、 Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)、NED（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)、7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(AMCA)、テキサスレッド(Texas Red)（商標）(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)、5-(及び-6)-カルボキシ-X-ローダミン、リサミンローダミンB、5-(及び-6)-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン-5-イソチオシアネート(FITC)、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、テトラメチルローダミン-5-(及び-6)-イソチオシアネート、5-(及び-6)-カルボキシテトラメチルローダミン、7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸、6-[フルオレセイン5-(及び-6)-カルボキシアミド]ヘキサン酸、N-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4aジアザ-3-インダセンプロピオン酸、エオシン-5-イソチオシアネート、エリスロシン-5-イソチアシネート、カスケード（商標）ブルーアセチルアジド(Cascade blue acetylazide)(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)、ヴァイオレット/ブルー色素(Emmax 375-491 nm) 7-メトキシクマリン-3-カルボキシ、AMCA-X(7-アミノクマリン-X)、6-MI又は6-MAP(6-メチル-8-(2-デオキシ(deoy)-β-D-リボフラノシル)イソキサントプテリジン);グリーン/イエロー色素(Emmax 492-585 nm) DTAF(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン、6-FAM(フルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン)、Dansyl-X(6-((5-ジメチルアミノナフタレン(dimethtylaminonaphtalene)-1-スルホニル)アミノ)ヘキサノエート、6-JOE(6-カルボキシ-4′,5′-ジクロロ-2′,7′-ジメトキシフルオレセイン)、HEX(ヘキサクロロフルオレセイン)、BODIPY-TMR-X(テトラメチルローダミン置換体(substitute))、PyMPO(1-(3-カルボキシベンジル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムブロミド)、TAMRA-X(6-(テトラメチルローダミン-5(6)-カルボキシアミド)ヘキサノエート);オレンジ色素(Emmax 586-647 nm) ローダミン誘導体BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、ROX（カルボキシローダミン）、VIC Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)、NED(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)及びカルボキシナフトフルオレセインのようなレッド色素(Emmax 647-700 nm)。
いくつかの実施態様では、反応混合物中における各プローブが、KRAS遺伝子中において、その対応するSNPのはっきりした検出及び同定をもたらすように、反応混合物中において、プローブを標識するために使用される蛍光色素分子の組合せは、FAM（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)、VIC（登録商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)、Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)、及びNED（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)であり得る。
蛍光特性を有する他の分子も適切な標識である。例えば、フィコエリトリンのようなタンパク質は、240キロダルトン(kDa)のタンパク質であり、確固とした蛍光特性を見せる。蛍光特性を有する他の標識としては、量子ドット、ナノ結晶、及び関連した半導体の蛍光色素分子が挙げられ得る。
蛍光標識は、蛍光を検出する任意の適切な手段によっても検出される。かかる技術は、当分野において周知である。
蛍光色素分子又は蛍光標識は、クエンチャー（本明細書中において「クエンチャー部分」としても知られる）と組合せて使用され得る。本明細書中に使用されるクエンチャーは、シグナルが測定される波長において、蛍光色素分子によって放出される光を減少させる部分であり、又は核酸プローブの蛍光色素分子によって放出される光の波長を、偏移(shift)させる役目をする蛍光部分である。本発明との関連で適切なクエンチャーとしては、（限定するものではないが）DABCYL(4-(4′-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸)、QSY-7(9-[2-[[4-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]カルボニル]-1-ピペリジニル]スルホニル]フェニル]-3,6-ビス(メチルフェニルアミノ))、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3(Biosearch Technologies Inc., 2003, Cat. Nos. BG5-5041T, BG5-5042T,及びBG5-5043T)及びTAMRA((6-テトラメチルローダミン-5(6)-カルボキシアミド)ヘキサノエート)が挙げられる。加えて、クエンチャーは、本発明の実施態様に応じて、蛍光性であっても、又は蛍光性でなくてもよい、有機色素であり得る。
いくつかの実施態様では、標識は、化学発光標識であり得る。例えば、化学発光標識は、限定されるものではないが、アクリジニウム化合物であり得る。アクリジニウム化合物としては、アクリジニウム-9-カルボキシアミド及びアクリジニウム-9-カルボン酸アリールエステル(carboxylate aryl ester)が挙げられ得る。かかる化合物は、例えば、米国特許第5,783,699号に記載され、該文献の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
また、次に、プローブを検出するために、2次検出分子又は更なる工程が必要であるが、プローブは、ビオチン(biotein)若しくはジゴキシゲニン(digoxygenin)を用いて間接的に標識され、又は32P及び3H等の放射性同位体で標識され得る。例えば、ビオチンを用いて間接的に標識されたプローブは、検出可能なマーカーに結合されたアビジンによって検出され得る。例えば、アビジンは、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素マーカーに結合され得る。酵素マーカーは、酵素のための基質及び/又は触媒を用いる標準の比色反応(colorimetric reaction)において検出され得る。アルカリホスファターゼのための触媒は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(indolylphosphate)及びニトロ・ブルー・テトラゾリウム(nitro blue tetrazolium)が挙げられる。ジアミノベンゾエート(Diaminobenzoate)は、西洋ワサビペルオキシダーゼのための触媒として使用され得る。
g.ポジティブ及びネガティブコントロール
同定する方法は、ポジティブ及びネガティブコントロールを用いて、試料調製、増幅、及び検出を検査(monitor)することを容易にし、これらの全てが、以下により詳細に記載されている。検査することは、混入(contamination)を検査することも含み得る。
いくつかの実施態様では、ポジティブコントロールは、反応混合物中において、各プライマーのペアについてのアンプリコンを生成し、検出するために設計され得る。例えば、ポジティブコントロールとしては、内部コントロールをコードするプラスミド及び1以上のSNPをコードする1以上のプラスミドが挙げられ得る。加えて、蛍光標識が1以上のプローブ内に含まれる場合、ポジティブコントロールとしては、増幅を検査するために使用されている各蛍光チャネル中において、少なくとも1のポジティブシグナルを生成することが更に挙げられ得る。
ネガティブコントロールは、第3アンプリコン（すなわち、内部コントロールの増幅）を生成及び検出するが、1以上のSNPに対応するアンプリコンを生成及び検出しないように設計され得る。例えば、ネガティブコントロールは、内部コントロールをコードするプラスミドを含み得る。
h.試料調製
KRAS中における1以上のSNPを同定する方法は、被験体から試料を取得することを含み得る。同定する方法では、被験体から取得された試料は、以下に記載される反応混合物を形成する前に、所望により処置され、処理され、又は調製され得る。かかる処置としては、限定されるものではないが、希釈、限外ろ過(ultrafiltration)、抽出、沈殿、透析、酵素的消化(enzymatic digestion)、及び均質化(homogenization)が挙げられ得る。また、かかる処置方法が、試料と共に使用される場合、かかる処置方法は、未処置の試料（例えば、換言すれば、任意のかかる処置方法（複数可）を受けていない試料）に比例する濃度の、試料中に残存するKRAS標的配列を有する。
例えば、試料は、当分野において、既知の任意の適切な方法を用いる増幅分析(amplification assay)のために調製され得る。望ましくは、方法は、核酸を抽出し、濃縮する。また、方法は、望ましくはKRAS標的配列を、増幅のためにアクセスしやすく(accessible)し、抽出物から、増幅の阻害物質の可能性があるもの(potential inhibitor)を除去する。
いくつかの実施態様では、KRAS標的配列は、DNAであり得る。DNAは、例えば、キアゲン社(Valencia, Calif.)からの、DNeasy DNA単離キット(isolation kit)、QIAamp DNA血液キット(blood kit)、若しくはPAXgene血液DNAキット、又は当業者に既知の他の方法を用いて末梢血から単離され得る。他の組織試料からのDNAも、DNeasy DNA単離キットを用いて取得され得る。フェノール-クロロホルム抽出から自動電磁ビーズ核酸捕捉システム(automated magnetic bead nucleic acid capture system)に及ぶ、液-液(liquid-liquid)法及び固相法を含む任意の他のDNA抽出及び精製技術も使用され得る。RNAは、単離され、逆転写され得、結果として生じるcDNAが増幅され得る（例えば、米国特許第5,310,652号;第 5,322,770号;第 5,561,058号;第 5,641,864号;及び第5,693,517号に記載された逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)）。
他の実施態様では、DNAは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織から抽出され得る。従って、試料調製キット(sample preparation kit)の別の例は、キアゲンから入手可能なQIAamp DNA FFPE組織キットである。
更に他の実施態様では、Abbott mSample Preparation SystemDNA（4×24プレップ; Abbott）試薬は、核酸を捕捉し、非結合試料成分を除去する。プロテイナーゼK(Proteinase K)は、試料に結合しているタンパク質を消化するための、溶解の工程に含まれる。結合された核酸は、溶出され、96-ウェルディーププレート(96-well deep plate)に移される。その結果、核酸の増幅のための準備ができる。いくつかの実施態様では、内部コントロール(IC)として働いて、処理過程が各試料について正しく進められたことを明らかにする非関連DNA配列が、試料調製手順に導入され、較正物質(calibrator)、コントロール、及び検体(specimen)とともに処理される。
いくつかの実施態様では、KRAS標的配列がRNAである場合に、cDNAを生成するために、逆転写が使用され得る。次に、このcDNAが、以下に記載される通りの反応混合物中において増幅され得る。
いくつかの実施態様では、核酸の精製のための磁性微粒子処理過程(magnetic microparticle process)を使用するために設計された自動試料調製システム等の自動試料調製システムの使用が好ましい場合がある。自動試料調製システムの例は、Abbott Laboratories, Abbott Park, Illから入手可能なm2000spである。或いは、試料は、m24sp自動試料調製システム(Abbott)を用いて調製され、又は手作業で調製され得る。自動試料調製は、より安定しているため、手作業の調製よりも好ましい。
i.反応混合物を形成すること
KRAS中において1以上のSNPを同定する方法は、反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、KRAS標的配列を含有すると疑われる試料、第1及び/又は第2アンプリコンを生成するためのプライマー、KRAS遺伝子中における1以上のSNPを検出するための1以上のプローブ、PNAオリゴマー、及び内部コントロールを含む。反応混合物は、形成する時に、以下により詳細に記載される通りの、核酸配列の増幅のために十分な条件下におかれる。
反応混合物を形成することは、1以上の反応混合物を形成することを含み得る。反応混合物を形成することは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はより多くの反応混合物を形成することを含み得る。各反応混合物は、第1及び/又は第2アンプリコンを生成するためのプライマーと、KRAS遺伝子中における1以上のSNPを検出するための1以上のプローブとの異なる組合せを含有し得る。これらの異なる組合せは、各反応混合物中において、特有のSNP群の検出をもたらす。単一のアンプリコンの生成が多数のSNPの有無の検出を可能にするように、特有の各SNP群が、重複(overlap)するSNPを含み得る。例えば、第1アンプリコンの生成は、重複するSNPであるG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、及びG12Vの有無を検出することを可能にする。別の例では、第1アンプリコンの生成は、重複するSNPであるG13D及びD13Cの有無を検出することを可能にする。
反応混合物は、核酸増幅試薬も含み得る。核酸増幅試薬としては、ポリメラーゼ活性 を有する酵素（例えば、DNAポリメラーゼ）、マグネシウム又はマンガン等の酵素補因子(enzyme co-factor)、塩、及びニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(NAD)、及びデオキシヌクレオチドトリホスフェート(deoxynucleotide triphosphate, dNTP)、すなわちdATP、dGTP、dCTP、及びdTTPが挙げられ得る。いくつかの例では、核酸増幅試薬は、リボヌクレオシド三リン酸を含み得る。
(1)KRAS遺伝子中における、9のSNPの検出及び同定のための3反応混合物
1以上の反応混合物を形成する非限定的な例として、反応混合物を形成することは、3反応混合物、すなわち第1反応混合物、第2反応混合物、及び第3反応混合物を形成することを含み得る。これらの3反応混合物は、被験体から取得された試料からの、KRAS遺伝子中における9の異なるSNPの同時の増幅、検出、及び同定を容易にする。この同時の増幅、検出、及び同定は、CRC及びNSCLCに関連している、KRAS中におけるほぼ全ての突然変異を検出し、且つ、これらの突然変異のうちのどれが、所与の被験体のKRAS遺伝子中に存在しないか、及び/又は存在するかを同定するという、注目すべき技術的効果を実現する。
第1反応混合物は、KRAS標的配列を含有すると疑われる試料、第1アンプリコンを生成するためのプライマー、KRAS遺伝子中における3のSNPを検出するための3プローブ、エクソン2 PNAオリゴマー、及び内部コントロールを含み得る。第1反応混合物は、上述された核酸増幅試薬も含み得る。いくつかの実施態様では、第1反応混合物は、G12Cプローブ、G12Rプローブ、及びG12Sプローブを含み得る。各プローブ及びICプローブは、異なる標識を有し得、それによって各プローブ、ひいては、SNPであるG12C、G12R、及びG12Sのそれぞれの独立且つ同時の検出を可能にする（図2及び3）。いくつかの実施態様では（図2及び3に示すように）、ICプローブは、標識NED（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G12Sプローブは、標識Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)を含有し得、G12Cプローブは、標識FAM（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G12Rプローブは、標識VIC（登録商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得る。他の実施態様では、各プローブが蛍光標識を含む場合、各プローブは、クエンチャーも含み得、該クエンチャーは、例えば、限定されるものではないが、FAM及びVIC蛍光標識を伴う使用のためのBHQ1、並びにQuasara、Q670、及びNED蛍光標識を伴う使用のためのBHQ2であり得る。
第2反応混合物は、KRAS標的配列を含有すると疑われる試料、第1アンプリコンを生成するためのプライマー、KRAS遺伝子中における3のSNPを検出するための3プローブ（該第2反応混合物においては、3プローブが第1反応混合物中における3プローブと異なる）、エクソン2 PNAオリゴマー、及び内部コントロールを含み得る。第2反応混合物は、上述された核酸増幅試薬も含み得る。いくつかの実施態様では、第2反応混合物は、G12Dプローブ、G12Aプローブ、及びG12Vプローブを含み得る。各プローブ及びICプローブは、異なる標識を有し得、それによって各プローブ、ひいては、SNPであるG12D、G12A、及びG12Vのそれぞれの独立且つ同時の検出を可能にする（図2及び3）。いくつかの実施態様では（図2及び3に示すように）、ICプローブは、標識NED（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G12Dプローブは、標識FAM（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G12Aプローブは、標識VIC（登録商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G12Vプローブは、標識Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)を含有し得る。他の実施態様では、各プローブが蛍光標識を含む場合、各プローブは、クエンチャーも含み得、該クエンチャーは、例えば、限定されるものではないが、FAM及びVIC蛍光標識を伴う使用のためのBHQ1、並びにQuasara、Q670、及びNED蛍光標識を伴う使用のためのBHQ2であり得る。
第3反応混合物は、KRAS標的配列を含有すると疑われる試料、第1アンプリコンを生成するためのプライマー、第2アンプリコンを生成するためのプライマー、KRAS遺伝子中における4のSNPを検出するための4プローブ（該第3反応混合物においては、4プローブは、第1及び第2反応混合物におけるプローブと異なる）、エクソン2 PNAオリゴマー、エクソン3 PNAオリゴマー、及び内部コントロールを含み得る。第3反応混合物は、上述した核酸増幅試薬も含み得る。いくつかの実施態様では、第3反応混合物は、G13Dプローブ、G13Cプローブ、Q61Haプローブ、及びQ61Hbプローブを含み得る。各プローブ及びICプローブは、異なる標識を有し得、それによって各プローブ、ひいては、SNPであるG13D、G13C、及びQ61Hのそれぞれの独立且つ同時の検出を可能にする。いくつかの実施態様では、Q61Haプローブ及びQ61Hbプローブは同じSNP、すなわちQ61Hの検出をもたらすため、両方のプローブが、同じ標識を含有し得る。いくつかの実施態様では（図2及び3に示すように）、ICプローブは、標識NED（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G13Dプローブは、標識FAM（商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、G13Cプローブは、標識VIC（登録商標）(Life Technologies, Carlsbad, California)を含有し得、Q61Haプローブは、標識Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)を含有し得、Q61Hbプローブは、標識Cy（登録商標）5(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon)を含有し得る。他の実施態様では、各プローブが蛍光標識を含む場合、各プローブがクエンチャーも含み得、該クエンチャーは、例えば、限定されるものではないが、FAM及びVIC蛍光標識を伴う使用のためのBHQ1、並びにQuasar、Q670、及びNED蛍光標識を伴う使用のためのBHQ2であり得る。
j. 増幅
上述した反応混合物を形成する際、反応混合物は、核酸配列の増幅に十分な条件（すなわち、増幅条件）に供される。これらの増幅条件は、標的配列が試料中に存在する場合に、標的配列に相補的な、少なくとも1コピーの核酸配列が生成されるような条件である。従って、反応混合物を増幅条件に供することは、検出工程より前に、又は検出工程と同時に、任意の適切な回数繰り返され得る。反応混合物を、例えば、10及び100回（又はより多い）の間、典型的には約20及び約60回の間、及びより典型的には約25及び約45回の間において温度サイクリングにかけることによる。
増幅条件は、1以上の核酸配列のアニーリング及び伸長を促進させる条件を含み得る。かかるアニーリングは、温度、イオン強度、配列長、相補性(complementarity)、及び核酸配列のG:C含量(content)を含むいくつかのパラメータによって、どちらかといえば予測可能な様態で決まる。例えば、相補的核酸配列の環境中の温度を下げることは、アニーリングを促進する。通常、診断的適用(diagnostic application)では、融解温度Tmより約2℃〜約18℃（例えば、約10℃）下であるハイブリダイゼーション（すなわち、アニーリング）温度を使用する。イオン強度も、Tmに影響を与える。通常の塩濃度は、陽イオンの性質及び原子価(valency)によって決まるが、当業者によって容易に理解される。同様に、高いG:C含量及び配列長の増加は2本鎖形成を安定化させ、Tmを上昇させる。
最終的に、ハイブリダイゼーション温度は、プライマーのTmの近傍に、又はTmに選択され得る。従って、プライマー又はプライマーセットの特定のペアについての、適切なハイブリダイゼーション条件を得ることは、PCR技術の通常の技能の範囲内である。
増幅は、m2000rt機器(Abbott Molecular Inc., Des Plaines, Ill.)の使用によって等、当分野において既知の通り実行され得る。標的核酸（例えば、DNA、RNA又は両方）は、デオキシヌクレオチドトリホスフェート(dNTP)及び活性化剤、例えば、マグネシウム又はマンガンの存在下で、DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素によって増幅される。PCR増幅の間、2本鎖DNAの鎖を分離するために、高温が使用される。反応混合物は、DNAアニーリングが起こり得る温度に冷却され、被検物質に特異的な(analyte-specific)1本鎖DNAオリゴヌクレオチドプライマーが、被検物質DNAに結合する。プライマーは、DNAポリメラーゼによって伸長され、それによって、被検物質DNAの、短い標的ストレッチの正確なコピーを作る。DNAポリメラーゼは、その活性部位において、それを不活性な状態にする分子によって修飾された好熱性酵素であり得るが、そうである必要はない。酵素が、PCRの開始より前に加熱される場合、抑制分子は、酵素から切断され(cleaved)、それによって、それがその活性を取り戻すことを可能にする。この方法では、酵素は特異的DNA-DNA相互作用が生じる温度でのみ活性がある。このことは、プライマー2量体等の非特異的なPCRの人工産物(artifact)を大いに減少させる。温度サイクリングの各期間の間、増幅産物（すなわち、アンプリコン）は、高温で1本鎖に解離し、温度が低くなるにつれてプライマーアニーリング及び伸長を可能にする。標的の指数関数的増幅(Exponential amplification)は、高温と低温との間のサイクリングの繰り返しによって実現される。第1、第2、及び/又は第3アンプリコンを生成するためのKRAS標的配列の増幅は、同時に起こる。
増幅の手順は、当分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR、定量PCR、PNAクランプ媒介PCR(PNA clamp-mediated PCR)、転写増幅法(transcription-mediated amplification, TMA)、ローリングサークル増幅法(rolling circle amplification)、核酸ベース増幅法(nucleic acid based amplification, NASBA)、リガーゼ連鎖反応(ligase chain reaction)、及び鎖置換増幅法(strand displacement amplification, SDA)を含む。当業者は、いくつかの増幅技術における使用のために、プライマーが修飾される必要があり得ると理解する。例えば、SDAプライマーは、通常、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を構成する付加的なヌクレオチドを5’末端近傍に含む。NASBAのために、プライマーは、RNAポリメラーゼプロモーターを構成する付加的なヌクレオチドを5’末端近傍に含み得る。このようにして修飾されたポリヌクレオチドは、本発明の範囲内であるとみなされる。
増幅の後に、増幅産物を標的配列及び過剰なプライマーから分離して、特異的な増幅が起きたか否かを決定することが望ましい場合がある。分離は、標準の方法論（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)参照）を用いるアガロース、アガロース-アクリルアミド又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によってもたらされ得る。或いは、クロマトグラフィーが、分離をもたらすために使用され得る。クロマトグラフィーの例としては、吸着、分配(partition)、イオン交換及び分子篩(molecular sieve)が挙げられ、クロマトグラフ法の種類の例としては、カラム、紙、薄層及びガスクロマトグラフィーが挙げられる（例えば、 Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed., Wm. Freeman & Co., New York, N.Y.(1982)参照）。
k. 検出
同定する方法は、KRAS中における1以上のSNPを検出することも含む。この検出工程は、第1アンプリコン及び/又は第2アンプリコン、並びに第3アンプリコンを検出又は測定することを含む。
上述のように、反応混合物中の各プローブは、異なる標識を含み得、従って、はっきりと区別されて検出され得る。いくつかの実施態様では、同じアミノ酸置換であるが、各コドンにおける異なるヌクレオチド変化を検出するプローブが、同じ標識を含有し得る。このはっきりと区別した検出が、ひいては、KRAS遺伝子中における1以上のSNPの有無を確認することをもたらす。検出は、増幅と同時に行われるものであり得る。従って、単一の反応混合物中において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はより多くの異なるプローブが使用され得、異なる標識を含有する各プローブが、それによって各プローブのはっきりと区別した検出を可能にする。このはっきりと区別した検出が、ひいては、単一の反応混合物において、KRAS遺伝子中における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はより多くのSNPの有無を確認することをもたらす。
いくつかの実施態様では、リアルタイムPCR分析において、増幅及び検出が組合され得る。リアルタイムPCRが使用される場合、検出可能に標識されたプローブは、プローブが、その相補的核酸配列と選択的にハイブリダイゼーションした後のみ検出を可能にし、それによって、同時に増幅及び検出することを可能にする。増幅の間、検出可能に標識されたプローブが、反応混合物中に存在する場合に、検出可能に標識されたプローブは、増幅を促進する条件下で安定である必要があり、増幅を妨げてはならず、増幅条件下でその標的配列に結合し、その標的配列を結合させている状態でのみシグナルを発する必要がある。この点において、特に適した、検出可能に標識されたプローブの例としては、分子ビーコンの検出可能な(molecular beacon detectable)オリゴヌクレオチド、TAQMAN（登録商標）の検出可能なオリゴヌクレオチド、及びAbravaya, et al.（米国特許出願公開第 2005/0227257号）により記載されたもの等の直鎖の検出可能な(linear detectable)オリゴヌクレオチドが挙げられる。検出可能に標識されたプローブは、単独で、又は分子ビーコンのステム領域の一部との更なる組合せにおいて、ループ領域を形成し得る。検出可能に標識されたプローブは、一端に蛍光色素分子（例えば、FAM）を有し、且つ、ブラックホールクエンチャー(Black Hole Quencher, BHQ（登録商標）; BioSearch Technologies, Inc., Novato, Calif.)等の高効率クエンチャーを他端に有する、検出可能な直鎖のオリゴヌクレオチドとしても使用され得る。
必要に応じて、KRAS標的配列を含有すると疑われる試料又は検出可能に標識されたプローブが、検出を容易にするための固体支持体(solid support)に固定され得る。固体支持体を利用する分析フォーマット(assay format)の例としては、ドットブロットフォーマット及び逆ドットプロット(reverse dot-blot)フォーマットが挙げられる（例えば、米国特許第5,310,893号;第 5,451,512号;第 5,468,613号; 及び第5,604,099号参照、該フォーマットに関する教示のために、該全ての文献が、参照することによって明確に本明細書中に組み込まれる）。
他の実施態様では、増幅は、可視化(visualization)によって検出され得る。例えば、エチジウムブロマイドで染色されたゲルが紫外線で可視化され得る。放射性同位元素で標識された増幅産物は、x線フィルムを露光させ、現像することによって可視化され得るが、蛍光標識(fluorometric label)を用いて標識された増幅産物は、増幅産物を励起スペクトル(stimulating spectra)に曝すことによって可視化され得る。増幅の可視化の好ましい方法は、増幅された産物にハイブリダイゼーションする、標識された、検出可能なオリゴヌクレオチドの使用である。キアゲンから入手可能な手動カラム(manual column)等の手動カラムも使用し得る。
更に他の実施態様では、ジデオキシ配列決定法を基礎とする方法(dideoxy sequencing-based method)及びオリゴヌクレオチド長の産物のパイロシークエンス(Pyrosequencing)（商標）も、増幅された核酸を検出するために用いられ得る。別のシークエンス方法は、Kobayashi, et al., Mol. Cell. Detectable oligonucleotides 9: 175-182(1995))により記載されている。
l. ΔCNの決定
同定する方法は、各反応混合物についてのサイクル数の差(ΔCN)を決定することも含む。ΔCNは、KRAS変異配列の増幅のためのサイクル数(CN)と、内部コントロールの増幅のためのCNとの差である。各SNPについてのΔCN値は、固定カットオフ値(fixed cutoff value)に対して評価され、ΔCNが固定カットオフ値未満であれば、各SNPが検出される。各固定カットオフ値は、検出されるSNPと各プローブに含有される標識との組合せに特有である。従って、所与のSNPについてのΔCNがより小さくなるほど、SNPがKRAS標的配列中に存在する可能性が増加する（すなわち、率がより高くなる）。
いくつかの実施態様では、KRAS遺伝子中における突然変異は、「ドライバー(driver)」突然変異であるため、1を超えるSNPが検出される場合、最も小さな相対的ΔCNを有するSNPが検出されているものとして報告される。かかるドライバー突然変異は、腫瘍形成を促進し、従って、選択的優位性(selective advantage)は、原発腫瘍(primary tumor)内で、1を超える突然変異について存在しない。従って、原発腫瘍が、KRAS遺伝子中において突然変異を含有する場合、1の突然変異又はSNPがしばしば予期される。
しかしながら、同定する方法は、KRAS遺伝子中における1のSNPだけを検出することに限定されるとみなされるべきではない。いくつかの実施態様では、対応する固定カットオフ値未満の、それぞれのΔCNを有する全てのSNPを、検出されているものとして報告することが望ましい場合がある。報告することは、最も小さな相対的ΔCNを有するSNPを1番目に順位付けし、最も大きな相対的ΔCN有するSNPを1番終わりに順位付けする、検出されたSNPの順位(rank order)を含み得、それによって、KRAS遺伝子中における、検出されたSNPの順序付きリストを、同定する方法のユーザに提供する。
いくつかの実施態様では、いかなるSNPも反応混合物中において検出されない（すなわち、いずれの所与のSNPについてのΔCNも、各固定カットオフ値以上である）場合がある。内部コントロールの増幅（すなわち、第3アンプリコンの検出）が、十分なKRAS標的配列が反応混合物中に存在して、低率(low-percentage)のSNPを検出したことを示す場合に、これは、真正の(true)又は正確な否定的結果(negative result)であると決定される。他方、内部コントロールの増幅（すなわち、第3アンプリコンの検出）が、反応混合物中に存在したKRAS標的配列が、低率のSNPを検出するには不十分なことを示す場合は、否定的な結果が誤った否定的結果であり得、それによって、同定する方法のユーザは、増幅可能量のKRAS標的配列をより多くもたらすことが予想される試料を用いる方法を、繰り返す必要があることを示す。従って、内部コントロールの増幅（すなわち、第3アンプリコンの生成及び検出）は、反応混合物中に存在する増幅可能なKRAS標的配列の量を決定し、ひいては、反応混合物及び増幅条件が、KRAS遺伝子中において、いかなるSNPも検出されていないという、正確な報告を可能にするほどに十分に精度が高いか否かを示す。
3.がん治療を選択する方法
本明細書中に提供されるのは、がん治療又は処置を、それらを必要とする被験体のために選択する方法である。方法は、上述されたKRAS中における1以上のSNPの有無を確認する方法を利用して、被験体のための処置を選択し得る。選択に際し、方法は、被験体に処置を施すことも含み得る。
KRAS中において1以上のSNPが検出された場合、いくつかの実施態様では、選択する方法のユーザは、上皮成長因子受容体(EGFR)を標的としない治療を選択し得る。選択することは、1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、被験体に、上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療以外の治療を施すことを含み得る。
上述のように、EGFRは、MAPKシグナル伝達経路においてKRASの上流で作用し(act)、KRAS遺伝子中における1以上のSNPが、KRASを構成的に活性な状態にする。従って、1以上のSNPがKRAS遺伝子中に存在する場合、突然変異体KRASの構成的活性を考えると、MAPK経路の下流部分がEGFR治療によって抑制されないことから、CRC及びNSCLCでは、EGFRを標的とする治療は、効果がより小さいものであり得る。いくつかの実施態様では、本明細書中に記載された方法がKRAS中における1以上のSNPを検出する場合に、選択する方法は、EGFRを標的とする治療を被験体に施さないことを含み得る。
KRAS中における1以上のSNPが検出されない場合に、いくつかの実施態様では、選択する方法のユーザは、被験体のためのがん治療として、EGFRを標的とする治療を選択し得る。従って、いくつかの実施態様では、本明細書中に記載された方法が、KRAS中における1以上のSNPを検出しない場合に、選択する方法は、EGFRを標的とする治療を被験体へ施すことを含み得る。
4.がん治療による寛解を予測する方法
また、本明細書中に提供されるのは、がん治療又は処置による寛解の予測を、それを必要とする被験体においてするための方法である。方法は、上述されたKRAS中における1以上のSNPの有無を確認する方法を利用して、所与のがん治療による被験体の寛解を予測し得る。
いくつかの実施態様では、被験体のKRAS遺伝子中に1以上のSNPが存在すると確認された場合、このことにより、方法のユーザは、被験体はEGFRを標的とする治療により寛解する可能性が減少している場合があると予測することが可能になるだろう。従って、1以上のSNPを含有する被験体は、EGFRを標的としない治療を施され得る。
他の実施態様では、被験体のKRAS遺伝子中に1以上のSNPが存在すると確認されなかった場合、このことにより、方法のユーザは、被験体はEGFRを標的とする治療により寛解する可能性が増加している場合があると予測することが可能になるだろう。従って、1以上のSNPを含有していない被験体は、EGFRを標的とする治療を施され得る。
5.キット
また、本明細書中に提供されるのは、本明細書中に開示された方法を用いて使用するためのキットである。キットは、本明細書中に記載されたプライマー、プローブ、PNAオリゴマー、及び内部コントロールを含み得、これらのそれぞれが、単一の容器(container)内に入れられ又は1以上の容器中に任意の組合せで組合せられ得る。キットは、上述されたポジティブ及びネガティブのコントロールも含み得る。キットは、上述された核酸増幅試薬を更に含み得る。キットは、緩衝液（複数可）、希釈液（複数可）、標準物質(standard)（複数可）、及び/又は、試料の処理、洗浄、又は本明細書中に記載された方法の任意の他の工程の実施において有用な他の物質等の、ユーザの観点から望ましい場合がある他の物質（複数可）も含み得る。
本記載によるキットは、好ましくは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含む。本記載のキットに含まれる使用説明書は、包装材に添付され得、又は添付文書として含まれ得る。使用説明書は、通常、書物(written material)又は印刷物であるが、それらは、かかるものに限定されない。かかる使用説明書を保存し、且つ、エンドユーザにそれらを伝えることが可能な任意の媒体が本開示により予期される。かかる媒体は、限定されるものではないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ(chip)）、光媒体(optical media)（例えば、CD ROM）等が挙げられる。本明細書中に使用する場合、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって説明される多数の態様を有する。
6. 実施例
実施例1
実施例2〜8についての材料及び方法
検体収集。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)切片（5〜10ミクロン）を、ヒトNSCLC組織、CRC組織、又は以下に明示された細胞株から調製した。スライドに載せたFFPE切片について、切片を、（例えば、メス(scalpel)又は片刃かみそりを用いて）スライドから掻き取り(scrape off)、以下に記載するように、標識された、DNA抽出用のチューブに移した。スライドに載せていないFFPE切片については、切片を、以下に記載するように、標識された、DNA抽出用のチューブに移した。各チューブにおける合計組織面積は、少なくとも4 mm2であった。
器具使用。Abbott Laboratoriesからのm2000rt機器を、リアルタイムPCRのために使用した。
FFPE 試料からのゲノムDNA抽出。TargetPrep DNA FFPE試料調製キットI及びII(Abbott Laboratories)を用い、製造業者の使用説明書に従って、ゲノムDNAを、FFPE試料から抽出した。簡潔には、FFPE試料を、キシレン又はヘモディー(Hemo-De)を用いて脱パラフィン(deparaffinized)し、次いでプロテイナーゼKを添加した溶解液(Lysis Solution)1中においてインキュベートして、DNAを遊離させた(release)。温度を上昇させた状態におけるインキュベーション工程が、遊離した核酸のホルマリン架橋を部分的に解消(reverse)させ、DNA収率(yield)及び品質を改善させた。次いで、溶解物を溶解バッファ2及びエタノールと混合して、DNAについての適切な結合状態をもたらし、続いて試料を、DNA溶出スピンカラム(DNA Elution Spin Column)にアプライ(application)し、DNAをシリカ膜に結合させた。結合DNAを、洗浄液(Wash Buffer)1で洗浄し、次いで洗浄液2で洗浄して不純物を除去した。結合DNAを溶出バッファで溶出し、次いでPCR増幅のために用いた。
増幅及び検出。増幅試薬を、特徴的な3マスターミックスへと混合した。精製したDNA試料を、96-ウェル光学反応プレート(optical reaction plate)中において各マスターミックスと混合した（すなわち、各試料についての3 PCRウェル）。プレートを、光学膜を用いて密閉した後、次いで、プレートを増幅及びKRAS突然変異の検出のためにm2000rt機器に移した。増幅及び検出における更なる詳細は、以下に提供される。
第1マスターミックスは、以下の表9に示す試薬を含有した。表9は、各試薬の最終反応濃度も示す。
* 緩衝液は、プライマー、プローブ、及び内部コントロールを利用するPCR分析に適していた。
** 活性化試薬は、MgCl2及びTrisを含有する緩衝液中に存在した。MgCl2は、DNAポリメラーゼの補因子であった。
第2マスターミックスは、以下の表10に示す試薬を含有した。表10は各試薬の最終反応濃度も示す。
* 緩衝液は、プライマー、プローブ、及び内部コントロールを利用するPCR分析に適していた。
** 活性化試薬は、MgCl2及びTrisを含有する試薬中に存在した。MgCl2は、DNAポリメラーゼの補因子であった。
第3マスターミックスは、以下の表11に示す試薬を含有した。表11は、各試薬の最終反応濃度も示す。
* 緩衝液は、プライマー、プローブ、及び内部コントロールを利用するPCR分析に適していた。
** 活性化試薬は、MgCl2及びTrisを含有する緩衝液中に存在した。MgCl2は、DNAポリメラーゼの補因子であった。
加えて、ポジティブ及びネガティブのコントロール試薬を、各ラン(run)に含め、方法のDNA抽出、増幅、及び検出工程によって処理して、ランの有効性を評価した。特に、ネガティブコントロール試薬は、6.67 x 105コピー/mLのレベルの内部コントロールをコードするプラスミドと、キャリアDNAを添加したTE緩衝液とを含んだ。内部コントロールは、既知の突然変異が発生していないKRAS遺伝子領域であった。ポジティブコントロール試薬は、（6.67 x 105コピー/mLのレベルで存在する）内部コントロールをコードするプラスミド、標的とされたSNPをコードする2のプラスミド（それぞれ1.00 x 105コピー/mLであり、一方のプラスミドがG12R及びG12Dをコードし、他方のプラスミドがG13D及びQ61Haをコードした）及びキャリアDNAを有するTE緩衝液を含んだ。従って、ポジティブコントロール試薬は、全てのプライマーペアについて反応ごとにアンプリコンを生成し、方法における増幅を検査するために使用されている各蛍光チャネル中における、少なくとも1の陽性シグナルを生成した。ポジティブ及びネガティブのコントロール試薬を、試料の調製、増幅、及び検出並びに混入について検査するために使用した。
m2000rt機器におけるサイクル条件を、以下の表12に示した。ランピング(Ramping)は高速、体積設定(volume setting)は50 μl、反応体積は80 μlであった。
* この工程の間、リアルタイム蛍光測定を、各サイクルで実行した。
各プローブは、以下表13中において示す5’蛍光標識及び3’クエンチャー部分を含有し、それによって、光学反応プレートのその各ウェルにおいて、各プローブの独立した検出を可能にした。この独立した検出が、ひいては、KRAS遺伝子中において各SNPが存在する場合に、各SNPを検出し、且つ同定する能力をもたらした。
具体的には、光学反応プレートの任意の所与のウェル内で、各プローブは、異なる蛍光色素分子を含有し、m2000rt機器において個別の蛍光チャネルにより検出した。この設定は、光学読み取りプレート(optical reader plate)の単一のウェル中における内部コントロール、及び、もしあるとすれば3突然変異（すなわち、SNP）のいずれかの、同時の増幅及び検出を可能にした。従って、患者ごとの3の反応設定は、KRAS遺伝子中における独立した9のSNPの検出を可能にした。
実施例2
突然変異の包括性
上述された方法の、G12D、G12A、G12V、G12S、G12C、G12R、G13D、及びG13Cを互いに区別し、且つ、G12、G13、G13A、G13V、G13S、及びG13Rと区別する能力、並びにQ61Hを、Q61、Q61P、Q61E、Q61K、Q61L、及びQ61Rと区別する能力を評価した。半数体ゲノムごとに1コピーの頻度で、列挙した突然変異を含有するプラスミドを加えた(spike)KRAS野生型ヒト細胞株DNA又はKRAS野生型ヒト細胞株DNAを、3レプリケート(replicate)において試験した。各突然変異の有無を、以下の表14に示すように、各事例において正確に決定した。従って、上述された方法は、標的とされた各SNPを正確に同定し、検出のために標的とされなかったSNP又は野生型配列を検出しなかった。
a KRAS突然変異（下線を引いた突然変異体ヌクレオチドを有するコドン）。
b G12、G13、及びQ61は、野生型を示した。
実施例3
FFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋)切片のタイプ
上述された方法を、スライドに載せたFFPE切片と、スライドに載せていないFFPE切片を伴う使用のために更に評価した。具体的には、(1)スライドに載せたFFPE切片と、(2)スライドに載せていないFFPE切片との、切片のタイプの間の一致を、合計50のFFPE試料（すなわち、22 CRC検体、24 NSCLC検体、及び4細胞株試料）を用いて評価した。各FFPE細胞株試料は、具体的なKRAS突然変異（G12R、G12D、G13C、又はQ61H）及びKRAS野生型細胞株を含有する細胞株の混合物からなった。細胞株試料を混合して、5%の突然変異体細胞株の頻度を生じさせ、その後にホルマリン中に固定し、及びパラフィン中に包埋した。表15に示すように、50の試料のうちの30が、両方の切片のタイプについて「突然変異検出」と解釈されている。50の試料のうちの20が、両方の切片のタイプについて「検出なし」と解釈されている。これらの結果は、切片のタイプ（すなわち、スライドに載せたFFPE切片及びスライドに載せていないFFPE切片）の間において、100%(50/50)の総合的一致(overall agreement)を実例で示した。従って、これらのデータは、上述された方法が、スライドに載せたFFPE切片とスライドに載せていないFFPE切片とを区別しないことも実例で示した。
実施例4
分析感度
上述された方法を、分析感度についても評価した。具体的には、KRAS突然変異体及び野生型FFPE細胞株からのDNAを抽出し、精製した。各KRAS突然変異体DNA精製物(purification)を、KRAS野生型DNA精製物と混合して、10 ngの増幅可能なゲノムDNA中における4.0%、又は、2 ngの増幅可能なゲノムDNA中における8.0%のいずれかの突然変異頻度を実現した。各10 ngの混合物を、その後に希釈して、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%、及び0.25%の突然変異頻度でパネル(panel)を作製した。各2 ngの混合物を、その後に希釈して、8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、及び0.5%の突然変異頻度でパネルを作製した。各パネルについて、2ロット(lot)の増幅試薬及び3台のm2000rt機器を用いて、合計6回のランを行った。各パネルの8レプリケートを各ランに含め、パネルごとに合計48回の試験が生じた。
各10 ngのパネル及び各2 ngのパネルについての検出率を、以下の表16及び17にそれぞれ示す。プロビットデータ解析(Probit data analysis)を用いて、10 ng又は2 ngの増幅可能なゲノムDNAのいずれかにおいて、95%の確率(probability)で突然変異検出率(mutation parcentage detection)を決定し、以下の表18に示す。これらのデータは、方法についての分析感度が、10 ngの増幅可能なゲノムDNA中における2%のKRAS突然変異であることを実例で示した。
a Q61HコドンCAC
b Q61HコドンCAT
c無効(invalid)な結果を有する1レプリケートを、分析から除外した。
a Q61HコドンCAC
b Q61HコドンCAT
a Q61HコドンCAC
b Q61HコドンCAT
実施例5
再現性
上述した方法の再現性も評価した。再現性を、CRC及びNSCLC検体の、FFPEホモジネート(homogenate)の11要素のパネルを用いて証明した。本研究の結果を、以下の表19に示す。
パネル要素01〜09は、対象とするKRAS突然変異に相当した。パネル要素10及び11は、KRAS野生型に相当した。この研究は、10 ng以下のゲノムDNAの投入(input)及び5%以下の突然変異率を対象にする、かすかな陽性(low-positive)の4試料（すなわち、パネル要素01、05、08、及び09）も含んだ。研究を、パネル要素ごとに2回の試料調製及び1日ごとに6日間、2回のm2000rt機器のランを行い、3ロットの増幅試薬/3台の機器/3人の技師を使用して完了した。
該方法では、「検出なし」のパネル要素に関する100%の(144/144)一致、及び、「突然変異検出」のパネル要素に関する100%の(647/647)一致を含む、全パネル要素、複製、技師、試薬のロット、機器、及び混合された日数に関する、100%の(791/791)の総合的一致があった。従って、これらのデータは、上述の方法が再現可能な、すなわち100%の再現率で、結果をもたらすことを実例で示した。
実施例6
基準方法との相関
上述した方法を、SNPを検出する別の方法、すなわち2X双方向性サンガーシークエンシングと比較した。81のNSCLC及び97のCRC FFPE検体を、TargetPrep DNA FFPE試料調製キットI及びIIを用いて処理した。同一のDNA含有溶出液を、上述した方法及び2X双方向性サンガーシークエンシングにより試験した。同一の突然変異が両方の方法により検出された場合に、突然変異の検出を、陽性一致(positive agreement)であるとみなした。一致を、NSCLC、CRC、並びにNSCLC及びCRCの組合せについて以下の表20、21、及び22にそれぞれ以下に示す。
上述した方法と2X双方向性サンガーシークエンシングとのNSCLC検体についての総合的一致は、95.1%(77/81)であり、92.9%(13/14)の陽性一致だった。陽性一致であることが見出された13の突然変異のうち、以下の突然変異が観察された（例）: G12C(6)、G12D(1)、G12V(2)、G13D(1)、G13C(1)、及びQ61H(2)。
上述した方法と2X双方向性サンガーシークエンシングとの間のCRC検体についての総合的一致は、86.6%(84/97)であり、97.6%(41/42)の陽性一致だった。陽性一致であることが見出された41の突然変異のうち、以下の突然変異が観察された（例）: G12S(1)、G12C(1)、G12D(12)、G12V(9)、G13D(15)、及びQ61H(3)。
上述した方法と2X双方向性サンガーシークエンシングとの間のNSCLC及びCRC検体の組合せについての総合的一致は、90.4%(161/178)であり、96.4%(54/56)の陽性一致であった。陽性一致であることが見出された54の突然変異のうち、以下の突然変異が観察された（例）: G12S(1)、G12C(7)、G12D(13)、G12V(11)、G13D(16)、G13C(1)、及びQ61H(5)。
要約すると、これらのデータは、上述した方法及び2X双方向性サンガーシークエンシングの間において86%以上の総合的一致及び92%以上の陽性一致を実例で示した。
a 双方向性サンガーシークエンシングは、FFPE検体中における約20%の突然変異含有量(mutation content)が検出限界であった。各突然変異の存在及び同定を、キアゲンセラスクリーン(Qiagen therascreen)RGQ PCRによって確認した。
b 2X 双方向性サンガーシークエンシングにより同定された突然変異は、G13Dであった。Ion AmpliSeqキャンサーホットスポットパネル(Cancer Hotspot Panel)v2を用いる検体の次世代シークエンシングは、コドン12、13、及び61における野生型配列を示した。突然変異が存在しないことも、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより確認した。
a 双方向性サンガーシークエンシングは、FFPE検体中における約20%の突然変異含有量が検出限界であった。Q61H突然変異を有する2検体を、Ion AmpliSeqキャンサーホットスポットパネルv2を用いる次世代シークエンシングにより確認した。10検体が、コドン12又は13の突然変異を有した。9つの突然変異の存在及び正体をキアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより確認した。残りの突然変異の存在をキアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより確認したが、突然変異の正体は、異なっていた（本明細書中に記載された方法により同定されたG12A突然変異、及び、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより同定されたG12S突然変異）。
b 2X双方向性サンガーシークエンシングにより同定された突然変異は、G13Dであった。Ion AmpliSeqキャンサーホットスポットパネルv2を用いる、検体の次世代シークエンシングは、コドン12、13、及び61における野生型配列を示した。突然変異が存在しないことも、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより確認した。
a 双方向性サンガーシークエンシングは、FFPE検体中における約20%の突然変異含有量が検出限界であった。Q61H突然変異を有する2検体を、Ion AmpliSeqキャンサーホットスポットパネルv2を用いる次世代シークエンシングによって確認した。13検体が、コドン12又は13の突然変異を有していた。12個の突然変異の存在及び正体を、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRによって確認した。残りの突然変異の存在を、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより確認したが、突然変異の正体は異なっていた（本明細書中に記載された方法によって同定されたG12A突然変異、及び、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRにより同定されたG12S突然変異）。
b 2X双方向性サンガーシークエンシングにより同定された突然変異は、各検体についてG13Dであった。Ion AmpliSeqキャンサーホットスポットパネルv2を用いる、各検体の次世代シークエンシングは、各検体においてコドン12、13、及び61における野生型配列を示した。各検体において突然変異が存在しないことも、キアゲンセラスクリーンRGQ PCRによって確認した。
実施例7
分析特異性
上述された方法を、その分析特異性(analytical specificity)についても評価した。分析特異性を、KRASホモログhRAS及びnRAS並びにKRAS偽遺伝子KRAS1Pを含有するヒト胎盤由来のDNAを用いて評価した。ヒト胎盤由来DNAを、25 ngのゲノムDNAの投入で3レプリケートで試験し、交差反応性は観察されなかった。
加えて、4の肺関連微生物及び3の結腸関連微生物を、上述された方法において交差反応の可能性について評価した（以下の表23参照）。試料処理の溶解工程の間、各微生物を、106コロニー形成単位(colony-forming unit, CFU)又は106ゲノムコピーで、KRAS突然変異について陰性の試料に加え、3レプリケートで試験した。試験されたいかなる微生物との交差反応性も、観察されなかった。
加えて、KRAS突然変異陽性試料を、微生物による干渉について評価した。KRAS突然変異体プラスミドを、2%のコピーの頻度で10 ngのKRAS野生型ヒト細胞株DNAに加え、該方法によって、試料の投入ごとに106 CFU又は106ゲノムコピーで、各微生物の存在下、3レプリケートで試験した。どの微生物もKRAS変異の検出を妨げなかった。
要約すると、これらのデータは、上述された方法が、KRASホモログ又は偽遺伝子と交差反応せず、従って、方法が、KRASについて特異的であることを実例で示した。この方法の特異性は、被験体から取得された試料に混入し得る微生物との交差反応及び該微生物による干渉がない(lack)ことにより、更に実証された。
実施例8
潜在的な妨害物質
臨床検体(clinical specimen)中に存在する可能性のある物質のレベル上昇による干渉に対する、上述された方法の感受性(susceptibility)も評価した。KRAS突然変異について陰性の試料（すなわち、KRAS野生型FFPEヒト細胞株）及びKRAS突然変異について陽性の試料（すなわち、2%の突然変異含有量をもたらす、KRAS突然変異体FFPEヒト細胞株と混合したKRAS野生型FFPEヒト細胞株）を、試料処理の溶解工程において加えられたヘモグロビン、トリグリセリド、及び壊死組織と共に試験した。
突然変異陰性及び突然変異陽性試料の両方について、報告された解釈及び突然変異検出結果におけるいかなる干渉も、最大4 g/Lのヘモグロビン（臨床・検査標準協会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)により推奨された濃度の2倍(2X)）、最大74 mMのトリグリセリド（CLSI により推奨された高濃度の2倍）の存在下、及び70%の壊死部分(necrotic area)を有する追加的なヒトCRC FFPE組織の10ミクロンの切片の存在下で、観察されなかった。従って、これらの結果は、上述された方法が、ヘモグロビン、トリグリセリド、及び壊死組織が存在すること（且つ高レベルであること）によって妨げられないことを実例で示した。
上述の詳細な説明及び付随の実施例は、単に説明的なだけであり、添付された特許請求の範囲及びその相当物によってもっぱら規定される発明の範囲において限定解釈されるべきではないと理解される。
開示された実施態様に対する様々な変更及び改変は、当業者にとって明白だろう。限定するものではないが、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、剤形、又は本発明の使用方法に関するものを含む、かかる変更及び改変は、それらの精神及び範囲から逸脱せずになされ得る。

Claims (58)

  1. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び配列番号48からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプライマー。
  2. (a)配列番号2、配列番号7、及び配列番号43からなる群から選択されるフォワードプライマー;
    (b)配列番号6、配列番号11、及び配列番号48からなる群から選択されるリバースプライマー;並びに
    (c)配列番号52及び配列番号56からなる群から選択されるペプチド核酸オリゴマー
    を含むプライマーセット。
  3. 前記プライマーセットが、
    (a)配列番号2、配列番号6、及び配列番号52;
    (b)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、及び配列番号52;
    (c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号52、及び配列番号56;
    (d)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、配列番号52、及び配列番号56;
    (e)配列番号7、配列番号11、及び配列番号56;並びに
    (f)配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、及び配列番号56
    からなる群から選択される、請求項2に記載のプライマーセット。
  4. 配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブ。
  5. 検出可能な標識を更に含む、請求項4に記載のプローブ。
  6. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項5に記載のプローブ。
  7. 前記蛍光標識が、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択される、請求項6に記載のプローブ。
  8. クエンチャー部分を更に含む、請求項6に記載のプローブ。
  9. (a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される1以上のフォワードプライマー;
    (b)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択される1以上のリバースプライマー;
    (c)配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、及び配列番号42からなる群から選択される1以上のプローブ;並びに
    (d)配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、及び配列番号57からなる群から選択される1以上のペプチド核酸オリゴマー
    を含む、プライマー及びプローブのセット。
  10. 前記1以上のプローブが、検出可能な標識を含む、請求項9に記載のプライマー及びプローブのセット。
  11. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項10に記載のプライマー及びプローブのセット。
  12. 前記蛍光標識が、FAM、NED、Cy5、及びVICからなる群から選択される、請求項11に記載のプライマー及びプローブのセット。
  13. 前記1以上のプローブがクエンチャー部分を更に含む、請求項11に記載のプライマー及びプローブのセット。
  14. (a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;
    (b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに
    (c)配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブ
    を含む内部コントロールセットを更に含む、請求項9に記載のプライマー及びプローブのセット。
  15. 配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載された前記ヌクレオチド配列を含む前記プローブが、検出可能な標識を更に含む、請求項14に記載のプライマー及びプローブのセット。
  16. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項15に記載のプライマー及びプローブのセット。
  17. 配列番号49、配列番号50又は配列番号51に記載された前記ヌクレオチド配列を含む前記プローブが、クエンチャー部分を更に含む、請求項15に記載のプライマー及びプローブのセット。
  18. 前記プライマー及びプローブのセットが、
    (a)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号22、配列番号27、配列番号30、及び配列番号51;
    (b)配列番号2、配列番号6、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号13、配列番号16、配列番号20、及び配列番号51;並びに
    (c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号43、配列番号48、配列番号52、配列番号56、配列番号31、配列番号34、配列番号38、配列番号40、及び配列番号51
    からなる群から選択される、請求項14に記載のプライマー及びプローブのセット。
  19. v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)の有無を確認する方法であって、該方法が、
    (a)(i)被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び
    (ii)請求項9に記載のプライマー及びプローブのセット
    を含む反応混合物を形成すること;
    (b)該反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;及び、
    (c)該1以上のアンプリコンを検出すること
    を含む、方法。
  20. 前記反応混合物が、内部コントロールを更に含み、該内部コントロールが、
    (a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;
    (b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;並びに
    (c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブ
    を含む、請求項19に記載の方法。
  21. サイクル数における差(ΔCN)を決定することを更に含み、該ΔCNが、前記SNPを含有するアンプリコンと関連付けられるサイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンと関連付けられるサイクル数との間の差である、請求項20に記載の方法。
  22. 前記ΔCNがカットオフ値未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在する、請求項21に記載の方法。
  23. 工程(c)における前記検出に基づいて、KRAS中における1以上のSNPの存在を確認することを更に含む、請求項19に記載の方法。
  24. 前記1以上のSNPが、G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、及びQ61Hからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
  25. 請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットのうちの前記1以上のプローブが、検出可能な標識を含む、請求項19に記載の方法。
  26. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項25に記載の方法。
  27. 請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットのうちの前記1以上のプローブが、クエンチャー部分を更に含む、請求項26に記載の方法。
  28. 前記検出可能な標識が、FAM、Cy5、NED、及びVICからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
  29. 検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含む、請求項26に記載の方法。
  30. 請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットが、
    (a)配列番号2、配列番号6、配列番号52、配列番号22、配列番号27、及び配列番号30;
    (b)配列番号2、配列番号6、配列番号52、配列番号13、配列番号16、及び配列番号20;並びに
    (c)配列番号2、配列番号6、配列番号7、配列番号11、配列番号52、配列番号56、配列番号31、配列番号34、配列番号38、及び配列番号40
    からなる群から選択されるプライマー及びプローブのセットである、請求項20に記載の方法。
  31. 前記試料が前記被験体のがん組織から取得されたものである、請求項19に記載の方法。
  32. 前記がん組織が大腸がん又は非小細胞肺がんからの組織である、請求項31に記載の方法。
  33. 前記試料がホルマリン固定パラフィン包埋試料から抽出された核酸である、請求項31に記載の方法。
  34. 前記核酸がゲノムDNAである、請求項33に記載の方法。
  35. 前記試料が血液試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項19に記載の方法。
  36. 前記試料が循環腫瘍DNA(ctDNA)である、請求項19に記載の方法。
  37. 前記反応混合物を形成することが、3反応混合物を形成することを含み、各反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料並びに請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットを含む、請求項19に記載の方法。
  38. (a)第1反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号22、配列番号27、及び配列番号30の前記プローブを含み;
    (b)第2反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー;並びに配列番号13、配列番号16、及び配列番号20の前記プローブを含み;且つ
    (c)第3反応混合物が、前記被験体から取得された前記試料、配列番号2の前記フォワードプライマー、配列番号6の前記リバースプライマー、配列番号7の前記フォワードプライマー、配列番号11の前記リバースプライマー、配列番号52の前記ペプチド核酸オリゴマー、配列番号56の前記ペプチド核酸オリゴマー、並びに配列番号31、配列番号34、配列番号38、及び配列番号40の前記プローブを含む、
    請求項37に記載の方法。
  39. 前記第1、第2、及び第3反応混合物のそれぞれが内部コントロールを更に含み、該内部コントロールが、
    (a)配列番号43に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;
    (b)配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び
    (c)配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブ
    を含む、請求項38に記載の方法。
  40. がん治療の選択を、それを必要としている被験体のためにするための方法であって、該方法が、
    (a)(i)被験体から取得された試料（該試料はKRAS標的配列を含有すると疑われる）及び
    (ii)請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットを含む反応混合物を形成すること;
    (b)該反応混合物を1以上のアンプリコンの形成に十分な条件に供すること;
    (c)該1以上のアンプリコンを検出すること;
    (d)v-Ki-ras2カーステン・ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ(KRAS)中における1以上の1塩基多型(SNP)を同定すること;及び
    (e)工程(d)において同定された該1以上のSNPに基づいて、該被験体のための該がん治療を選択すること
    を含む、方法。
  41. 前記試料が、前記被験体のがん組織から取得されたものである、請求項40に記載の方法。
  42. 前記がん組織が、大腸がん又は非小細胞肺がんからの組織である、請求項41に記載の方法。
  43. 前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から抽出された核酸である、請求項41に記載の方法。
  44. 前記核酸がゲノムDNAである、請求項43に記載の方法。
  45. 前記試料が血液試料、血清試料、又は血漿試料である、請求項40に記載の方法。
  46. 前記試料が循環腫瘍DNA(ctDNA)である、請求項40に記載の方法。
  47. 前記反応混合物が内部コントロールを更に含み、該内部コントロールが、
    (a)配列番号43、配列番号44、又は配列番号45に記載されたヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー;
    (b)配列番号46、配列番号47、又は配列番号48に記載されたヌクレオチド配列を含むリバースプライマー;及び
    (c)配列番号49、配列番号50、又は配列番号51に記載されたヌクレオチド配列を含むプローブ
    を含む、請求項40に記載の方法。
  48. 同定することが、サイクル数における差(ΔCN)を決定することを含み、該ΔCNが、前記SNPを含有するアンプリコンと関連付けられるサイクル数と、前記内部コントロールから生成されたアンプリコンと関連付けられるサイクル数との間の差である、請求項47に記載の方法。
  49. 前記ΔCNがカットオフ値未満である場合に、前記SNPがKRAS中に存在する、請求項48に記載の方法。
  50. 前記1以上のSNPがG12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項40の方法。
  51. 請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットのうちの前記1以上のプローブが、検出可能な標識を含む、請求項40に記載の方法。
  52. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項51に記載の方法。
  53. 前記蛍光標識が、FAM、Cy5、NED、及びVICからなる群から選択される、請求項52に記載の方法。
  54. 請求項9に記載のプライマー及びプローブのセットのうちの前記1以上のプローブが、クエンチャー部分を更に含む、請求項52に記載の方法。
  55. 検出することが、前記検出可能な標識により生成された蛍光シグナルを測定することを含む、請求項52に記載の方法。
  56. 前記1以上のSNPがKRASにないと確認される場合に、選択することが、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療を施すことを含む、請求項40に記載の方法。
  57. 前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、選択することが、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療を施さないことを含む、請求項40に記載の方法。
  58. 前記1以上のSNPがKRAS中に存在すると確認される場合に、選択することが、前記被験体に上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とする治療以外の治療を施すことを含む、請求項40に記載の方法。
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