JP2017501380A - マイクロ流体装置並びにかかる装置に試薬及び生体試料を供給するための配置 - Google Patents

Abstract

好ましくは、材料を通して液体を流すことのできる多孔度を有するセルロース繊維材料からなる固体支持体と、１箇所以上の試薬位置で支持体の表面に保存された１種以上の乾燥試薬とを備え、支持体が、１箇所以上の試薬位置から離隔した１箇所以上の試料位置で生体試料材料を乾燥状態で保存するのにも適している、試薬供給装置を含むマイクロ流体装置が開示されている。【選択図】図１

Description

本発明は、マイクロ流体装置並びにかかる装置に試薬及び／又は生体試料を供給するための配置に関する。特に、排他的ではないが、本発明は、分子及び生化学アッセイ、生体細胞の培養又は、マイクロ流体及び確かな試薬供給を必要とする他の技術、例えば、小型化「ラボオンチップ」技術の用途に採用できる。技術は、いわゆるエレクトロウェッティング又は他のマイクロ流体マイクロチップ並びにかかる技術を提供するために安定化させた試薬化学に基づいていることができる。

本明細書において、「試薬」は、アッセイを行い、或いはアッセイを容易にするのに使用される任意の材料を意味する。試薬の用語は、試薬を形成するのに組合せられ、或いは反応させる構成的試薬材料及び試料を安定化させる材料も包含する。

市販のマイクロ流体装置は、典型的には、１ｍｍ²〜１０ｃｍ²の面積を有し、典型的には、厚みが数ミリメートルである。通常、かかる装置は、二次元構造を有するが、一部の例では、複数の層を含む三次元である場合がある。この装置は、流路、管又はゾーンのいずれかが静電力を印加して、エレクトロウェッティングとして公知の方法により、少量の流体を移動させることにより相互接続されていることができる、数多くのチャンバを含むように設計される場合がある。この場合、流体は動き回る。種々のアッセイ段階が、この装置上の種々の位置で行われる。必要とされる液体の内容積は、具体的な構造の断面及び形状により決まるが、通常、ナノリットルからマイクロリットルの範囲にある。マイクロ流体装置は、例えば、ケイ素、ガラス又は種々の種類のプラスチック、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）もしくはポリメチルメタクリレートで組み立てられてもよいし、或いはエレクトロウェッティングなしに設計される場合、他の公知技術、例えば、エッチング、熱エンボス処理、ワイヤインプリンティング、ワックス流路生成、反応性イオンエッチングもしくはレーザ切除の使用を含んでもよい。

他の市販のマイクロ流体装置は、生体分子と非生体材料との間の界面を有し、流体移動もしくは小滴移動又は生体分子から装置への信号変調をもたらす、いわゆる生体電子チップを含む。この場合、試料を、電子的に移動させることができ、或いは電気的に増幅させることができる。これらの生体電子チップ装置は、ビルトイン電気部品を含み、或いは流体素子との組合せで電気回路もしくはＰＣＢボード上にある。電気部品（例えば、電極）は、装置内又は同装置の下（例えば、マイクロチャンバ内又は同チャンバの下）に位置しており、チャンバ内又は装置の表面上の流体又は流体成分を操作するのに使用される。

上記マイクロ流体装置は、それらが訓練されていないスタッフにより使用されることができ、及び、研究室が無い世界の地域において使用されることができるという利点を有する。通常、結果は、分析的技能をほとんど使用することなく得ることができる。

しかしながら、試薬又は生体試料を使用する上記装置及び同様の装置を用意する必要性は、今日十分に考慮されていない。訓練されていないスタッフの使用は、使用される試薬の汚染リスクをもたらす。このため、使用し易い試薬及び試料供給システムが必要とされる。この問題は、密封した液体試薬カセットを使用して取り組まれてきた。しかしながら、かかるカセットは、各アッセイの全体的なコスト及び装置の初期コストを増大させる。密封を破る機械的手段が必要とされるためである。例えば、複数の生体試料が収集される場合、各試料用の密封した供給容器を使用することは現実的ではない。通常、試料は、現場又はクリニックで収集されるため、試料を正確に密封することは困難なためである。このため、別々の生体試料供給工程も必要となる。加えて、高温の気候では、マイクロ流体装置へのその供給前に温度感受性試薬の冷却が、特に電気を使用できない場合問題となる。

正確な方法で装置を単純に制御することにより、種々のタスクを実施し得る一般的な装置を製造可能であるため、比較的低コストの多目的装置を製造可能であるべきである。しかしながら、例えば、各範囲の装置が、種々の試薬を必要とするであろう。この試薬が特定の試料におけるアッセイを行うのに必要とされる場合、試料も、正確な試薬と共に装置に導入されなければならない。必須の専用の供給ハードウェアが含まれている場合、比較的低コストの装置がよりコスト高になってしまう可能性がある。

例として、マイクロ流体装置が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、血液試料の遺伝的サインに基づく種々の疾患を検出するのに使用されるものである場合、例えば、種々のオリゴヌクレオチドプライマーが、種々の検出を行うのに必要とされるであろう。各検出について十分であろう、数多くの種々のプライマーを供給し、生体試料を供給する単純な方法が必要である。従来から、それは、低温に保つ必要がある場合があり、限られた貯蔵寿命を有するであろう、高コストのカセット系密封液体システムを必要とするであろう。加えて、例えば、密閉又は他の方法で保存されるカセットに、添加されるべき血液試料が添加される。

国際公開第２０１３／１４４７４３号

本発明の発明者らは、マイクロ流体装置に試薬及び試料を供給するための、非常に単純で、低コストの手段についての必要性を認識し、実施形態では、その必要性に取り組んできた。

第１態様に基づいて、本発明は、マイクロ流体装置に供給するための試薬及び生体試料供給装置であって、概ね非溶解性であるが、材料を通して液体を流すことのできる多孔度を有する材料からなる固体支持体と、１箇所以上の試薬位置で支持体の表面に保存された１種以上の乾燥試薬とを備え、支持体が、１箇所以上の試薬位置から離隔した１箇所以上の試料位置で生体試料材料を乾燥状態で保存するのにも適している、装置を提供する。

実施形態では、固体支持体は、繊維質であり、例えば、セルロース繊維材料又はガラス繊維／ミクロ繊維材料である。

或いは、固体支持体は、多孔質ポリマー、例えば、多孔質膜材料、例えば、ポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ニトロセルロース、酢酸セルロース、酸化アルミニウム又は多糖類、例えば、アルギネート、セルロースもしくは変性セルロースである。

実施形態では、支持体は略平面であり、例えば、カード又はプラスチックシートから形成された周辺支持枠を含み、これにより、試料及び試薬マウント、例えば、平坦な直進型又は回転可能なディスクを形成しており、適宜、平面材料に形成され、例えば、エンボス加工により形成されている、１以上の窪み又はディンプルを有する。

実施形態では、支持体が、直交マトリックス又は円形アレイとして配置された複数の位置を含んでおり、例えば、複数のアッセイを実施できるように、回転などによって装置の共働部分と順次位置合わせされるように配置されている。

実施形態では、試薬は、溶液中で支持体上に堆積されるか、或いは液体賦形剤中に含まれていて適宜スポッティング又は上塗りによって塗工した後その場で乾燥させるか、或いは予備乾燥試薬を支持体に塗工し、適宜接着剤（例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）接着剤）を用いて保持する。

好ましくは、溶液中の試薬は、例えば、適切な糖、例えば、デキストロース、ラクトース又はタンパク質の存在下で、凍結乾燥される。

実施形態では、支持体表面が化学物質で含浸されており、化学物質が、弱塩基、キレート剤、陰イオン界面活性剤及び／又はカオトロピック剤を含む。

実施形態では、支持体は、生体試料材料及び／又は試薬の回収率を向上させる１種以上の材料でコートされている。回収率を向上させる１種以上の材料としては、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰｅＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドンと非イオン界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０、ポリビニルピロリドンとアルブミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰｅＯＸと非イオン界面活性剤、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とアルブミン、非イオン界面活性剤とアルブミンが挙げられる。

実施形態では、支持体は、ｉ）内在性成分、ｉｉ）バイオ医薬品もしくはバイオ新薬その他の医薬品、（ｉｉｉ）核酸、（ｉｖ）ペプチド、タンパク質もしくは抗体、又はｖ）細胞もしくは組織を含む又はそれらからなる生体試料を含む。

実施形態では、支持体は、乾燥させた、血液、血漿又は他の血液成分、尿、脳培養培地、細胞試料、細胞培養物又は組織滲出液を含むか或いはそれらからなる生体試料を含む。

第２態様に基づいて、本発明は、第１態様又はその実施形態に基づく試薬供給装置を含むマイクロ流体装置であり、装置と共働させるために、試薬供給装置が、第１の位置にある１種以上の乾燥試薬と、第１の位置とは別の第２の位置にある乾燥生体試料材料とを保持している、マイクロ流体装置を提供する。

実施形態では、マイクロ流体装置は、乾燥試薬を溶解させるための液体ディスペンサを含んでいるとともに、溶解した試薬を、支持体からマイクロ流体装置に輸送するための液体輸送体を含んでおり、適宜、装置が、溶解した試薬を受容するための流体受容領域を有する流体処理ゾーンをさらに含んでいて、流体受容領域が、マイクロ流体装置の電気部品と電気的に接続されていて、マイクロ流体装置を電子コントローラ又はモニタに接続させるための電気的接続を有する。

第３態様に基づいて、本発明は、１種以上の試薬を実質的に乾燥状態で保持している第１マウントと、生体試料を乾燥保存するのに適した第２マウントとの、マイクロ流体装置であり、マイクロ流体装置が、第１及び第２マウント受容領域と、領域から液体処理領域への液体経路を含む、マイクロ流体装置を提供する。

第４形態に基づいて、本発明は、以下の工程を任意の順序で含むアッセイ方法を提供する。
ａ）１種以上の試薬を第１の固体支持体上に堆積させ、試薬が乾燥状態にない場合には、試薬を乾燥させる工程と、
ｂ）生体試料を第１の固体支持体上又は別個の第２の固体支持体上のいずれかに堆積させる工程と、
ｃ）各固体支持体を受容するための１以上の受容領域を有するマイクロ流体装置を用意する工程と、
ｄ）試料及び／又は各試薬を溶解又は溶出させる工程と、
ｅ）所定のアッセイに従って、適宜、第１６頁に記載されたアッセイ１）〜６）のいずれかに記載された通り、溶解又は溶出した試料及び試薬を処理する工程と、
ｆ）適宜、マイクロ流体装置内に収容された追加の試薬で工程ｅ）を実施する工程と
本発明は、適宜図面を参照して、本願明細書に実質的に記載されている、試薬供給装置、マイクロ流体装置、組合せ又はアッセイ方法に及ぶ。

本発明は、数多くの方法における効果に向けられ得る。例として、図面に例証のみされている例を使用して、実施形態が以下に記載される。

本発明に基づく装置及び装置の概略図を示す。 図１に示されている装置及び装置の一部の拡大断面図を示す。 改良された装置及び改良された装置を示す。 ＤＮＡ回収実験の結果を示す。 更なる回収実験の結果を示す。

図１を参照して、セルロース紙固体支持体１２を含む、マウント１０の形状での装置が示される。固体支持体１２は周囲に、硬いカードから形成されている周辺補強枠１４を有する。枠１４は、支持体１２を露出させ、生化学アッセイ用試薬１６、例えば、酵素が支持体上の試薬位置１３（便宜上、支持体１２上に印をつけている）に、例えば、その後に凍結乾燥されるスラリー状で堆積されるのを可能にする、開口１５を有する。試薬をアプライする他の方法は、以下に提供される。

必須ではないが、装置は、剥離フィルム１８を含む。剥離フィルム１８は、試薬が支持体上で乾燥された後に、支持体１２の両側に適用される。

使用時に、試料１７が、試料位置１１においてマウント１０にアプライされる直前に、フィルム１８は除去される。この試料は、例えば、検体、例えば、核酸、バイオ医薬品又は薬剤代謝産物を含む、乾燥血液スポッティング、血漿、尿、脳培養培地、細胞培養物、組織滲出液等である。

フィルム１８が除去され、試料がアプライされたマウント１０は、可能な限り長期間の保管後（適宜、数年）、矢印Ａの方向にスロット１１０を介して、マイクロ流体装置１００内、装置１００の本体部１１２に供給される。この例では、装置は、流体処理領域１５０において、上述のように静電荷により、流体を操作可能である。

本体１１２内に収められたマウント１０は、本体１１２における開口１１６及び１１７それぞれと一致する、位置１１及び１３のみが露出される。

さらに図２を参照して、その中に挿入されているマウント１０を有する、装置１００の部分断面図が示される。この図では、開口１１６は、支持体１２上の試薬１６を露出する断面で示される。この場合、個々のアリコートの試薬１６は、支持体上に堆積されているため、必要に応じて、種々の試薬を使用することができ、又は、複数のアッセイを利用することができる。図２において、液体分注端１２２を有するピペッティングノズル１２０が示されている。この図には、流入口１３０のアレイも示されている。これらはそれぞれ、図１に示されている流体処理領域１５０と流体連通している。

ノズル１２０は、垂直に移動可能であるため、その端部１２２は、支持体１２もしくは試薬１６に隣接し、又は、支持体１２もしくは試薬１６と接触する。溶媒は、ノズルから流れ、試薬を溶解又は懸濁させる。これにより、試薬は、支持体を通って、各流入口１３０内に流れる。その後、流体処理領域１５０の規定部分に運ばれる。次に、ノズル１２０は、残りの流入口１３０上方に水平移動することができる。次いで必要に応じて、上記液体分注工程が、各流入口１３０について繰り返され得る。

実際に、同じ動作が、生体試料１７について起こるであろうし、試薬１６よりむしろ、試料１７が支持体１２から除去されることを除いて、図２に示されているのと同じ配置を使用することができる。

図３は、装置２０及び３０並びに装置２００の改良された設計を示す。装置２０及び３０は、２つの別々のマウント２２及び３２からなる。マウント２２は、生体試料２７を回収するのに使用される。マウント３２は、別の領域において、試薬アリコート３６を支持する。マウントは、上述のように、繊維性材料から形成されており、試薬アリコート３６を保持するためのエンボス加工されたウェルを有している。マウント２２及び３２は、上記と同様の方法で処理するために、スロット２２０及び２３０それぞれに挿入され、開口２２７及び２３６それぞれによる液体の添加を含む。この配置は、試料が試薬に対して別々の回収及び輸送され得るという利益を有する。これにより、より環境に感受性の試薬の使用が可能となる。

装置の２つの実施形態にういて例示し、説明してきたが、本願明細書に規定されている本発明の範囲を逸脱することなく、数多くの改良、付加又は省略がなされ得ることが容易に明らかであろう。例えば、記載されているノズル１２０は省略することができ、手動で操作可能なピペット又は他の流体アプリケータを、代わりに使用することができる。自動液体アプリケーションが提供される場合、開口１１７、１１６、２２７及び２３６は不要である。移動可能なノズルが利用される場合、ノズルは、試薬堆積物のパターンに一致するように所定のパターンに水平移動可能であることが意図されるが、ノズルは固定されていてもよいし、支持体が、例えば、パターン状に移動可能でもよい。試薬及び試料は、使用時に上側に面する支持体１２表面にアプライされることを意図する。液体が流体圧力により支持体を通される際に、支持体が、より大きい粒子を除去するフィルタとして機能するであろうためである。ただし、溶解液は、重力又は流入口１３０の下側における陰圧により、下向きに引き込まれてもよい。ただし、試料及び／又は試薬を、満足のいく結果を伴って、使用時に下側に面する表面にアプライすることができる。

試薬は、支持体上に実質的に乾燥した状態で保存されることを意図しているが、更なる試薬、例えば、複数のアッセイに対して共通するもの又は一般的なものが、マイクロ流体装置内、例えば、流体処理領域１５０に、さらに保存されていてもよい。

実施例１：例えば、ＦＴＡ処理したセルロース繊維支持体からの核酸の回収
本実施例では、公知のマイクロ流体装置を、生体試料から核酸を回収し、特定する目的で特定の核酸の電気泳動分離の目的のために、核酸を増幅させるように機能させるために予めプログラムする。公知のＰＣＲ試薬（ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ（デオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（これらは、ＰＣＲ反応及び反復中にＤＮＡ鎖に付加するヌクレオチドとして、ＤＮＡポリメラーゼにより使用される、デオキシリボヌクレオチドモノマー又はＤＮＡの一単位である。）を含む）及び標準（装置における反応を校正するＤＮＡ標準）を、セルロール繊維支持体にアプライし、公知技術に基づいて乾燥させる。生体試料、例えば、個体からの血液試料を、支持体にアプライし、乾燥させた。上記手順を検証するために、セルロース固体支持体マトリクス（商品名「ＦＴＡカード」、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログコード ＷＢ１２０２０５として販売されている支持体を使用）から直接ＤＮＡを増幅させる実験を行った。いわゆるＤＮＡプロファイリングは、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）を使用するＰＣＲに基づいている。ＳＴＲは、ＤＮＡ塩基対の短い繰り返し配列である。この方法は、ＤＮＡの短い繰り返し配列を有する、高度に多型の領域を使用する（最も一般的には、４つの塩基が繰り返されている。）。無関係の人の大部分は、確かに異なる数の繰り返し単位を有し、ＳＴＲは、無関係の個体間を区別するのに使用することができるためである。これらのＳＴＲ遺伝子座（染色体上の位置）は、配列特異的プライマーの標的となり、ＰＣＲを使用して増幅される。次いでその結果、ＤＮＡフラグメントが分離され、キャピラリー電気泳動を使用して検出される。このため、ＳＴＲ遺伝子座は、長さが３−７塩基対の短い反復配列素子からなる。これらの繰り返しは、ヒトゲノム全体に十分分布されており、高度に多型のマーカーが豊富に含まれている。同マーカーは、ＰＣＲを使用して検出することができる。ＳＴＲ遺伝子座の対立遺伝子は、増幅された領域内に含まれる繰り返し配列のコピー数により識別され、電気泳動分離後に蛍光検出を使用して、互いに区別される。

本実施例では、匿名ドナーからの単一ソース由来の血液を供給するＴｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄから得た血液を、ＦＴＡマイクロカードにスポッティングした。７５μｌの血液を、６０個のＦＴＡマイクロカードにアプライし、デシケータ中で保存する前に、少なくとも２時間乾燥させた。

Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ １６ＨＳシステム（カタログコード ＤＣ２１０１、Ｐｒｏｍｅｇａ社（英国サザンプトン））を使用して、ＤＮＡプロファイリングを行った。Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ １６ＨＳシステムは、阻害を避けるためにＦＴＡ材料を洗浄するのを推奨している。このように、製造メーカーの説明書に従って、ＤＮＡを、分析前にその支持体から溶出した。Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ（登録商標）１６ＨＳシステムは、ＤＮＡタイピングに使用するための多重化ＳＴＲシステムである。このシステムは、（フルオレセインで標識された）Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＴＨ０１、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｐｅｎｔａ Ｅ、（ＴＭＲで標識された）ＦＧＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１７９、ｖＷＡ及びアメロゲニン、（ＪＯＥで標識された）ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８及びＰｅｎｔａ Ｄの遺伝子座を同時に増幅する。この多重化は、１３個全てのＣＯＤＩＳ ＳＴＲマーカー、性別判定用のアメロゲニン及び２つの低スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）の非常に識別力のあるペンタヌクレオチドＳＴＲマーカーを含む。１６個の遺伝子座を、１本のチューブ中で同時に増幅させ、１回の注入で分析した。

Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ １６ＨＳは、ヒトのゲノムＤＮＡのＳＴＲ領域を増幅させるのに必須の全ての材料、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マスターミックス及びプライマーを提供した。このキットを、ＦＴＡカードから採取された直径１．２ｍｍの試料から、ＤＮＡを増幅させるのに使用した。精製試薬についての製造メーカーの説明書に従って、ＦＴＡ精製試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログコード ＷＢ１２０２０４）を使用して、支持されている材料からＤＮＡを溶出し、ＴＥ^-1（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）緩衝液で洗浄した。

ＳＴＲ分析法を、Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ １６ＨＳシステムの取扱説明書に概説されている通り正確に行った。２８サイクルにわたる熱サイクル条件は以下の通りであった。
ｉ． ９５℃、２分間
ｉｉ． ９４℃、５秒間
ｉｉｉ． ５８℃、１５秒間
ｉｖ． ２８サイクルについて、７２℃、１０秒間
ｉ． ７２℃、７分間
ｉｉ． ４℃、保持。

ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（商標）ｖ３．２ソフトウェアを使用するＡＢＩ（商標）３１３０ｘｌ遺伝子分析キャピラリー電気泳動システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）において、得られたＰＣＲ産物を分析した。支持されている材料から生成したＳＴＲプロファイルを取得し、試料の結果を比較した。ＦＴＡ支持体からのＤＮＡ増幅及びＤＮＡプロファイリングの結果を、図４に示す。これにより、マイクロ流体装置において容易に繰り返すことができる公知技術を使用して、ＦＴＡ支持体から、完全なＤＮＡ ＳＴＲプロファイルを得たことを証明することができる。ＤＮＡがこのセルロースマトリクスに保存され、同材料から回収され、増幅されたことを、結果は示す。このことは、ＦＴＡが、本明細書に概説されている装置についての試料又は試薬保存媒体として使用することができることを示す。

実施例２：ＦＴＡ ＥｌｕｔｅセルロースマトリクスからのＤＮＡの回収
正常なヒトの血液又はＨｅＬａ細胞（１×１０⁷個／ｍｌ）（６５μｌ）を、試料が置かれた箇所を示す指示染料を含むセルロース紙支持体、例えば、商品名「指示薬付きＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード」（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログコード：ＷＢ１２０４１２）で販売されている紙にアプライし、乾燥させた。マイクロ流体装置に使用される加熱に類似する加熱ブロックにおいて、９５℃で３０分間、カードからＤＮＡを溶出させた。

ヒトｇＤＮＡレベルを定量するのに、ＴａｑＭａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ検出試薬キット（Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログコード ４３１６８３１）を使用した。このキットを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ リアルタイムＰＣＲシステムにおいて、製造メーカーの説明書に従って使用した。４０サイクルにわたる熱サイクル条件は以下の通りであった。
ｉ． ５０℃、２分間
ｉｉ． ９５℃、１０分間
ｉｉｉ． ９５℃、１５秒間
ｉｖ． ６０℃、１分間
ｖ． 工程ｉｉｉ及びｉｖを３９回繰り返す（すなわち、合計４０サイクル）
ｖｉ． ４℃、保持。

データを、自動的に取得した。検量線は、ヒトゲノムＤＮＡ１μｌあたりに０．０１−１０ｎｇからなる。この実験についての回収率を、図５に示す。

改めて、これにより、セルロース基材上に保持された試料を使用して、ｇＤＮＡを得ることがとでき、マイクロ流体装置において繰り返すことができる手法を使用して回収することができることが証明される。

実施例３：酵素の回収
完全に設定されたＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅコンタミネーションキット（ＤＮａｓｅ＆ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣシステム、カタログコード ＡＭ１９７０及びＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造メーカーの説明書に従って、酵素回収試験を行った。

第１シリーズの実験において、０．５ＵのＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅを、１０μｌ容量においてＷｈａｔｍａｎ Ｉｎｃにより商品名「９０３紙」で販売されている、平坦な未処理のセルロース紙にアプライした。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、以下の表１に概説されるように測定した。

第２シリーズの実験において、上記した１０μｌ容量で９０３紙にアプライした１０⁶個のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ２８）から、直径１．２ｍｍの試料を得た。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの活性を、以下に概説されているように測定した。

第３シリーズの実験において、これらの細胞に添加した０．５ＵのＤＮａｓｅ又は１０μＵのＲＮａｓｅのいずれかを含む約１０⁶個のヒト胚性幹細胞（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７ ＧＥＨＣ２８）から、直径１．２ｍｍの試料を得た。これらの試料を、１０μｌ容量で９０３紙にアプライした。

開裂性蛍光標識ＤＮａｓｅ基質を使用して、ＤＮａｓｅの検出を行った。各試料を、標準的な９６ウェルプレートの別々のウェルに吐出した。凍結乾燥させたＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質を、ＴＥ緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、９６ウェルプレートの試験ウェルに分注した（１０μｌ）。１０×ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ緩衝液（１０μｌ）及びヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験溶液（１００μｌ）を、３７℃で６０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣシステムの基質は、ＤＮａｓｅにより開裂された際にピンク色の蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイについて、蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ５３５／５９５ｎｍ、中間ゲインを使用）において測定した。ＤＮａｓｅを含む溶液は、ピンク色の蛍光を生じさせた。一方、ＤＮａｓｅ活性を有しない溶液は蛍光しなかった。このため、より高いレベルのＤＮａｓｅは、光出力量における増大に対応する。ネガティブコントロールは、試料に代えて、ヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）からなった。

開裂性蛍光標識ＲＮａｓｅ基質を使用して、ＲＮａｓｅの検出を、以下のように行った。試料保持材料片をそれぞれ、９６ウェルプレートの別々のウェルに吐出した。凍結乾燥させたＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ基質を、ＴＥ緩衝液（１ｍｌ）に溶解させ、９６ウェルプレートの試験ウェルに分注した（１０μｌ）。１０×ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ緩衝液（１０μｌ）及びヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験溶液（１００μｌ）を、３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ Ａｌｅｒｔ ＱＣシステムの基質は、ＲＮａｓｅにより開裂された際に緑色の蛍光を発する修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイについて、蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ（励起／発光 ４８５／５３５ｎｍ、中間ゲインを使用）において測定した。ＲＮａｓｅを含む溶液は、緑色の蛍光を生じさせた。一方、ＲＮａｓｅ活性を有しない溶液は蛍光しなかった。このため、より高いレベルのＲＮａｓｅは、光出力量における増大に対応する。ネガティブコントロールは、試料に代えて、ヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）からなった。９０３固体支持体から回収した酵素活性の結果を、表１を示す。顕著な量の酵素活性が、ネイティブの酵素から回収されたことを、データは示している。固体支持体にアプライした細胞及び細胞と酵素は、このマトリクスが、本明細書に概説されている装置に適した試薬保存媒体を提供することを示している。

実施例４：タンパク質の回収
組換えＩＬ−２±担体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれ、Ｃａｔ．２０２−ＩＬ−ＣＦ−１０μｇ、ロット ＡＥ４３０９１１２及びＣａｔ．２０２−ＩＬ−１０μｇ、ロットＡＥ４３０９０８１）を、血液（ＴＣＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、５０ｐｇ又は１００ｐｇ／μｌで溶解させた。

アリコート（０、５０又は１００ｐｇのＩＬ−２を含む１μｌ）を、以下の表２の１列目に基づいてコートされている、数多くのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅろ紙（９０３ Ｎｅｏｎａｔａｌ ＳＴＤカード、Ｃａｔ．１０５３８０６９、ロット６８３３９０９−Ｗ０８２）にアプライした。

これらの試料を、周囲の温度及び湿度において一晩乾燥させた。材料の直径３ｍｍディスクを、各紙種から抽出した。Ｈｕｍａｎ ＩＬ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｄ０２５０、ロット２７３２７５）から得られるＩＬ−２マイクロプレートの個々のウェル内に、１つのディスクを入れた。これらのプレートを、ＩＬ−２に対するマウスモノクローナル抗体でコートする。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキットにより提供されたアッセイ緩衝液（１００μｌ）を使用して、ＩＬ−２タンパク質を、ディスクから溶出した。その後の全ての工程を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキットにより提供された説明書に従って行った。アッセイ完了時に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔを使用して、マイクロプレートの光学密度を、４５０ｎｍでモニターした。既知のＩＬ−２濃度の検量線に対して値を比較することにより、ＩＬ−２の回収を判定した。ＩＬ−２の新しい検量線を、各個々の実験について作製した。９０３固体支持体から回収したタンパク質の結果を、表２に示す。顕著な量のタンパク質が、固体支持体から回収されたことが、データから示されている。このことは、このマトリクスが、本明細書に概説されている装置についての試薬又はタンパク質の保存媒体として適しており、支持体をコートすることが、支持体上に置かれた材料の回収率を向上させることを示している。

試料又は試薬安定化混合物が、単独又は組合せで、アプライされた材料に含まれる場合がある。適切な化学物質又は化学物質の混合物は、ビニルポリマー（例えば、ＰＶＡ）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０［Ｔｗｅｅｎ２０］）、ビニルポリマーとタンパク質、非イオン性合成ポリマー（ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰｅＯＸ））と非イオン界面活性剤、非イオン性合成ポリマーとタンパク質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と非イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤とタンパク質、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とタンパク質である。

試薬は、乾燥状態で支持体上に保存されてもよいが、加えて、マイクロ流体装置の表面１５０（図１）上に、乾燥又は安定した状態で保存されてもよい。試料は、マイクロ流体装置のボード上で処理される。かかる処置としては、磁性イオン交換ビーズを使用するタンパク質分離、又は、磁性シリカを使用する核酸調製が挙げられる。

４種類のアッセイについて説明してきたが、上述の装置及び装置は、広い適応性を有し、例えば、以下アッセイに利用することができる。
１）細胞アッセイ、例えば、細胞の精製／分取、細胞アッセイ、幹細胞分化、心臓／肝細胞の分化、細胞クローンの生成、ベクター生成、形質転換クローン選択、標識抗体の生成、単一細胞のゲノム増幅
２）一般的なアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法、ラテラルフローアッセイ、毒物アッセイ、単一細胞のゲル電気泳動アッセイ、酵素アッセイ、細胞溶解、タンパク質生成酵素アッセイ
３）タンパク質処理、例えば、タンパク質の相互作用、タンパク質のコンジュゲーション、タンパク質の標識化、タンパク質／ペプチドの合成、アミノ酸の連続付加、トロポニンＴタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現、連続的なタンパク質精製、イオン交換、沈殿、抗体系精製、組換えタンパク質精製、ワクチン／タンパク質精製のモニター
４）核酸処理、例えば、核酸の合成、オリゴヌクレオチドの連続付加、分子生物学的操作（例えば、酵素消化、ライゲーション）、核酸の精製（例えば、ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）、核酸のオールインワン標識化、ファージディスプレイライブラリの生成
５）人物特定及び法医学、例えば、ＳＴＲ／ＳＮＰ分析に対するＤＮＡ精製、ＦＴＡ／ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ及び間接的な核酸／タンパク質操作、性的暴行試料の処理、並びに／又は
６）診断、例えば、新生児のスクリーニング、免疫細胞化学、遺伝子型分類、感染症の特定、遺伝子スクリーニング、疾患体質の評価
上述のマイクロ流体装置及び装置に対応している公知のアッセイ技術のサイズ／体積を小さくする数多くの目的が存在する。（１）消費される生体材料及び製造過程のコスト低減が、消費者及びビジネスに経費節約をもたらす。（２）現代の研究室環境において必須である全てのアッセイ又は試料処理工程（例えば、試料調製、分析データの取扱い又は操作、結果の作製）の一体化が、簡易化された操作をもたらす。（３）現場での使用の容易性が移動性を可能にする。（４）例えば、ＴａｑＭａｎプローブを使用して行われ得る複数のＰＣＲアプローチもしくは空間ＰＣＲ、プロテオミクス研究又はマルチリードアウト免疫アッセイにおける、多くの種類の検体又は分析のための、複数の同時試験（多重化）についての可能性。（５）危険な固体及び液体の廃棄物及び包装の減少は、環境にポジティブな影響をもたらすであろう。（６）研究者の多くの時間を消費する、手動でのピペット操作、試薬の取扱い、反応／処理の準備及び設備間での試料の物理的移動の除去、（７）本願明細書に記載されている装置及び方法は、研究室での作業方法を変化させるであろうし、作業の流れの単純化をもたらし、必要な手数を取り払うであろう。（８）この開示に記載されている技術は、ピペット操作を無くす可能性のある柔軟な取扱い技術を提案するであろうし、他の一般的な処理、例えば、遠心分離、混合、精製及び電気泳動に対する代替手段を提供するであろう。

Claims (20)

1. マイクロ流体装置に供給するための試薬及び生体試料供給装置であって、当該装置が、概ね非溶解性であるが、材料を通して液体を流すことのできる多孔度を有する材料からなる固体支持体と、１箇所以上の試薬位置で支持体の表面に保存された１種以上の乾燥試薬とを備えており、支持体が、１箇所以上の試薬位置から離隔した１箇所以上の試料位置で生体試料材料を乾燥状態で保存するのにも適している、装置。
2. 固体支持体が繊維質であり、例えば、セルロース繊維材料又はガラス繊維／ミクロ繊維材料である、請求項１記載の装置。
3. 固体支持体が、多孔質ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ナイロン）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ニトロセルロース、酢酸セルロース、酸化アルミニウムのような多孔質膜材料、或いはアルギネート、セルロースもしくは変性セルロースのような多糖類である、請求項１記載の装置。
4. 支持体が略平面であり、周辺支持枠（例えばカード又はプラスチックシートからなるもの）を含んでいて、試料及び試薬マウントを形成している、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の装置。
5. マウントが平坦な直進型である、請求項４記載の装置。
6. マウントが回転可能なディスクである、請求項４記載の装置。
7. １以上の窪み又はディンプルが、例えばエンボス加工により、平面材料に形成されている、請求項４記載の装置。
8. 支持体が、直交マトリックス又は円形アレイとして配置された複数の位置を含んでおり、例えば、複数のアッセイを実施できるように、回転などによって装置の共働部分と順次位置合わせされるように配置されている、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の装置。
9. 試薬が溶液中で支持体上に堆積されるか或いは液体賦形剤中に含まれていて適宜スポッティング又は上塗りによって塗工した後その場で乾燥させるか、或いは予備乾燥試薬を支持体に塗工し、適宜ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）接着剤のような接着剤を用いて保持されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の装置。
10. 溶液中の試薬が、例えば適当な糖（例えばデキストロース、ラクトースなど）又はタンパク質の存在下で、凍結乾燥される、請求項９記載の装置。
11. 支持体表面が化学物質で含浸されており、化学物質が、弱塩基、キレート剤、陰イオン界面活性剤及び／又はカオトロピック剤を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の装置。
12. 支持体が、生体試料及び／又は試薬の回収率を向上させる１種以上の材料でコートされている、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の装置。
13. 回収率を向上させる１種以上の材料が、ポリ−２−エチル−２−オキサゾリン（ＰｅＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルピロリドンと非イオン界面活性剤（例えばポリソルベート２０）、ポリビニルピロリドンとアルブミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰｅＯＸと非イオン界面活性剤、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とアルブミン、又は非イオン界面活性剤とアルブミンを含む、請求項４記載の装置。
14. 支持体が、ｉ）内在性成分、ｉｉ）バイオ医薬品もしくはバイオ新薬その他の医薬品、（ｉｉｉ）核酸、（ｉｖ）ペプチド、タンパク質もしくは抗体、又はｖ）細胞もしくは組織を含むか或いはそれらからなる生体試料を含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の装置。
15. 支持体が、乾燥した、血液、血漿その他の血液成分、尿、脳培養培地、細胞試料、細胞培養物又は組織滲出液を含むか或いはそれらからなる生体試料を含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の装置。
16. マイクロ流体装置と協働する請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の試薬供給装置を含むマイクロ流体装置であって、試薬供給装置が、第１の位置にある１種以上の乾燥試薬と、第１の位置とは別の第２の位置にある乾燥生体試料材料とを保持している、マイクロ流体装置。
17. 乾燥試薬を溶解させるための液体ディスペンサを含んでいるとともに、溶解した試薬を、支持体からマイクロ流体装置に輸送するための液体輸送体を含んでおり、適宜、当該マイクロ流体装置が、溶解した試薬を受容するための流体受容領域を有する流体処理ゾーンをさらに含んでいて、流体受容領域が、マイクロ流体装置の電気部品と電気的に接続されていて、マイクロ流体装置を電子コントローラ又はモニタに接続させるための電気的接続を有する、請求項１６記載のマイクロ流体装置。
18. １種以上の試薬を実質的に乾燥状態で保持している第１マウントと、生体試料を乾燥保存するのに適した第２マウントとマイクロ流体装置の組合せであって、マイクロ流体装置が、第１及び第２マウント受容領域と、領域から液体処理領域への液体経路を含む、組合せ。
19. 以下の工程を任意の順序で含むアッセイ方法。
    ａ）１種以上の試薬を第１の固体支持体上に堆積させ、試薬が乾燥状態にない場合には、試薬を乾燥させる工程と、
    ｂ）生体試料を第１の固体支持体上又は別個の第２の固体支持体上のいずれかに堆積させる工程と、
    ｃ）各固体支持体を受容するための１以上の受容領域を有するマイクロ流体装置を用意する工程と、
    ｄ）試料及び／又は各試薬を溶解又は溶出させる工程と、
    ｅ）所定のアッセイに従って、適宜、第１６頁に記載されたアッセイ１）〜６）のいずれかに記載された通り、溶解又は溶出した試料及び試薬を処理する工程と、
    ｆ）適宜、マイクロ流体装置内に収容された追加の試薬で工程ｅ）を実施する工程と
20. 適宜図面を参照して、本願明細書に実質的に記載された試薬供給装置、マイクロ流体装置、組合せ又はアッセイ方法。