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JP2017048190A - アポトーシス性抗ＩｇＥ抗体 - Google Patents

アポトーシス性抗ＩｇＥ抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】アレルギーの新規治療アプローチの提供。【解決手段】抗ＩｇＥ抗体によってＩｇＥのＭ１'セグメントをターゲティングするとＢ細胞のアポトーシスが誘導されることを利用した、アポトーシス誘導性抗ＩｇＥＭ１'抗体、これをコードする核酸、その治療的組成物、及びＩｇＥが媒介する疾患の治療におけるそれらの使用に関連する。【選択図】なし

Description

（関連出願）
本発明は、米国特許法１１９(ｅ)に基づき、２００７年３月２２日に出願の米国特許第６０／８９６３３９号の優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、アポトーシス性抗ＩｇＥ抗体、これをコードする核酸、その治療的組成物、およびＩｇＥが媒介する疾患の治療におけるそれらの使用に関連する。
（関連技術の説明）
アレルギーは、環境抗原に対する免疫応答により組織炎症および臓器機能不全が引き起こされる特定の疾患を指す。各々のアレルギー性疾患の臨床特徴は、関与する器官又は組織の免疫学的に誘導された炎症反応を反映する。これらの特徴は一般的に、抗原の化学的又は物理的性質とは無関係である。アレルギー性応答の多様性は異なる免疫学的エフェクター経路の関与により生じ、これら経路の各々は炎症の固有のパターンを生じさせる。
アレルギーは全世界に共通である。しかしながら、特定の疾患についての偏向は年齢層、性別および人種間で異なる。特定のアレルゲンに対する感度の罹患率は、遺伝子の偏向と、アレルゲンへの曝露の原因となる地理的及び文化的な因子の両方によって測定される。アレルギーの臨床状態は、各々のアレルゲンに遭遇する個体だけに作用する。アレルゲンへの曝露によるアレルギー性疾患の発症には、前「感作」だけでなく、特定の臓器への反応の局在を決定する他の因子も必要である。
アレルゲン曝露によりアレルギーの疾患に先行する生物学的過程は、「感作」又は感作段階として知られる免疫応答を誘導する。いったん感作が起こると、次のアレルゲンへの曝露があるまで個体は症状を起こさない。感作の効果は免疫記憶としても知られている。
炎症が誘導されるいくつかの一次経路のうち一つが、免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)によるものである。ＩｇＥは、マスト細胞および好塩基球の表面上のアレルゲンレセプターとしての役割によってアレルギーの中心的役割を担う。ＩｇＥ抗体は、Ｆｃ ＲＩと称される高親和性細胞表面レセプターに分子のＦｃ部分で、マスト細胞と好塩基球の表面に固定されている。多価のアレルゲン分子がレセプターを占領している抗体に結合すると、アレルギー反応が起こる。その結果、Ｆｃ ＲＩのブリッジングが起こり、ヒスタミン、ロイコトリエン、化学走性因子、血小板活性化因子およびプロテイナーゼといった炎症のメディエーターの放出と活性化を細胞内に生じさせるシグナルが次々と伝達される。これらの活性化されたメディエーターは局所的に作用し、血管透過、血管拡張、滑らかな筋収縮および粘液腺分泌の増加を引き起こす。これらの事象は臨床的に即時相又は初期段階と称され、アレルゲン曝露の始めの１５〜３０分以内に生じる。その後１２時間にわたって、完全に明らかにされていないが他の化学的メディエーターに応答して、好中球から好酸球、単核細胞に拡がる、炎症細胞の進行性の組織浸潤が生じる。アレルゲン曝露後の６〜１２時間の期間は遅発相と称され、細胞性炎症の臨床症状を特徴とする。即時相反応がない場合に特に肺に遅発相反応が生じることを考えると、遅発相反応が必ずしもＩｇＥに媒介されていないと完全には理解できない。
ＩｇＥは膜結合型及び分泌型で存在する。これらの異なった形態は、スプライス変異体であるようである。第一に分泌型をターゲティングするＩｇＥ(例えば、ＸＯＬＡＩＲ(登録商標)、オマリズマブ)を下方制御することによって治療効果を達成しようとする従来の試みにより、免疫系の更なる「アーミング」が予防されるかまたは和らげられる。ＩｇＥの分泌型は短い形態で、基本的にＦｃ領域がＣＨ４ドメインで終わっている(図１)のに対して、これより長い形態には、Ｍ１／Ｍ１'及びＭ２として知られるエキソンによってコードされるペプチドを含む付加的Ｃ末端残基が含まれる。Ｍ１'として知られる５２アミノ酸セグメントがあるもの及びないものの、膜結合ＩｇＥの２つの異なる形態が報告されているものもあるが[Batista et al., J. Exp. Med. 184: 2197-2205 (1996)]、出願人は、何れの膜結合型がこのＭ１'セグメントを欠いているかを確認することができなかった。ＩｇＥの分泌型に結合する抗ＩｇＥ抗体による従来の治療法は、総血清ＩｇＥでなく、無血清を減少させる。Casale et al., J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1): 110-121 (1997)。
さらに、抗原シグナルがない場合には、交差結合しているＢ細胞レセプター(すなわち、免疫グロブリン)はアポトーシスの傾向があることが述べられている。驚くべきことに、出願人は、抗ＩｇＥ抗体によってＩｇＥのＭ１'セグメントをターゲティングすると、Ｂ細胞のアポトーシスが誘導されうることを発見した。活性化されたＢ細胞のプロジェニーはＩｇＥの分泌型を作製し分泌するプラズマ細胞となるので、アポトーシスを介したＩｇＥ産生Ｂ細胞の枯渇により、アレルギーの治療への新規の治療上のアプローチを提供するものである。
本発明は、アポトーシス性の抗ＩｇＥ抗体ないしはその機能的な断片、及びＩｇＥが媒介する疾患の治療におけるそれらの用途を提供する。本発明は、さらに、ＩｇＥ産生およびＢ細胞からの分泌を阻害する方法及び組成物を提供する。本発明は、さらに、ＩｇＥを生産するＢ細胞を特異的に枯渇させ、総血清ＩｇＥを低下させる方法及び組成物を提供する。
一実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントを特異的に結合し、ＩｇＥを産生するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を提供する。特定の態様では、抗体はＩｇＥを生産するＢ細胞を特異的に枯渇させる。他の特定の態様では、抗体は総血清ＩｇＥを減少させる。さらに他の特定の態様では、抗体は総血清および無血清のＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は、ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルが起源であるＩｇＥに結合する。なお更なる特定の態様では、抗体はキメラである。なお更なる特定の態様では、抗体はヒト化される。なお更なる態様では、抗体はヒトである。
他の実施態様では、本発明は、図５に示すペプチドに対応するＭ１'エピトープの何れか一に特異的に結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を提供する。特定の態様では、抗体は、４７Ｈ４、７Ａ６、２６Ａ１１、４７Ｈ４ｖ５、７Ａ６ｖ１および２６Ａ１１ｖ６からなる群から選択される抗体が結合するエピトープと同じエピトープに特異的に結合する。他の特定の態様では、抗体は、ペプチド４(配列番号：８)、ペプチド５(配列番号：９)、ペプチド７(配列番号：１１)又はペプチド８(配列番号：１２)からなる群から選択されるペプチドに対応するエピトープに結合する。さらに他の特定の態様では、抗体はペプチド４(配列番号：８)に結合する。
さらに他の実施態様では、本発明は、ペプチド４(配列番号：８)、ペプチド５(配列番号：９)、ペプチド７(配列番号：１１)又はペプチド８(配列番号：１２)からなる群から選択されるＩｇＥのＭ１'エピトープを提供する。特定の態様では、Ｍ１'ペプチドはペプチド４(配列番号：８)である。
さらなる実施態様では、本発明は、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４又はこのヒト化変異体のスキャッチャード結合親和性と同等である、ヒトＩｇＥに対するスキャッチャード結合親和性でＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合する抗ＩｇＥ抗体を提供する。特定の態様では、親和性は４７Ｈ５の結合親和性と同等である。他の特定の態様では、親和性は０．３０と０．８３ｎｍとの間である。さらに他の特定の態様では、親和性は４７Ｈ４ｖ５の結合親和性と同等である。さらに特定の態様では、親和性はおよそ１．５ｎｍである。
なお更なる実施態様では、本発明は、図６Ａ−６Ｆ及び図２０−２５の何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を提供する。特定の態様では、抗体は、さらに、図６Ａ−６Ｆ及び図２０−２５の何れかに示す抗体配列の重鎖および軽鎖の可変領域を含む。他の特定の態様では、抗体は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の完全長重鎖及び軽鎖を含む。さらに他の特定の態様では、抗体配列の重鎖および軽鎖は図６Ａ−６Ｆの何れか一に示す。さらに特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はアフコシル化されている。
なお更なる実施態様では、本発明は、少なくとも一の製薬的に許容される担体と組み合わせて、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＮＲを含む抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を含有してなる組成物を提供する。特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。他の特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。さらに他の特定の態様では、抗体はアフコシル化されている。
なお更なる実施態様では、本発明は、抗ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、糖質コルチコイド、ＮＳＡＩＤ、ＴＮＦ−アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体およびＢＡＦＦアンタゴニストからなる群から選択される一又は複数の薬剤と組み合わせて、図８−１３の何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を含んでなる組成物を提供する。特定の態様では、組成物は、少なくとも一の薬学的に許容可能な担体を更に含む。
なお更なる実施態様では、本発明は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖ＨＶＲをコードする単離された核酸を提供する。特定の態様では、単離された核酸は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の軽鎖ＨＶＲをコードする核酸をさらに含む。他の特定の態様では、抗体はキメラである。さらに他の特定の態様では、抗体はヒト化である。更なる態様では、抗体はヒトである。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はアフコシル化されている。なお更なる態様では、核酸は、核酸の発現に適切なベクターを更に含む。なお更なる特定の態様では、ベクターは、核酸の発現に適切な宿主細胞を更に含む。なお更なる特定の態様では、宿主細胞は真核細胞又は原核細胞である。なお更なる特定の態様では、真核細胞はチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)等の哺乳動物細胞である。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体ないしはその機能的な断片の製造方法であって、該抗体ないし断片を製造するのに適した条件下で、発現に適した形態の該抗体ないし断片をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、抗体ないし断片を回収することを含む方法を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は、本明細書中に開示した組成物を包含する容器と、ＩｇＥが媒介する疾患の治療のための用途を示したパッケージ挿入物とを具備する製造品を提供する。特定の態様では、製造品はバイアルである。他の特定の態様では、製造品は予め充填してある注射器である。さらに他の特定の態様では、予め充填してある注射器はさらに注入用デバイス内に内包されている。さらに特定の態様では、注入用デバイスは自動注入機である。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を投与することを含む、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる方法を提供する。特定の態様では、抗体は図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。他の特定の態様では、方法は総血清ＩｇＥを減少させる。さらに他の特定の態様では、方法は無血清および総血清ＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を投与することを含む、ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法を提供する。特定の態様では、抗体は、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる。他の特定の態様では、抗体、総血清ＩｇＥを減少させる。さらに他の特定の態様では、抗体は総及び無ＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。さらに特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。なお更なる特定の態様では、ＩｇＥが媒介する疾患は、アレルギー性鼻炎、喘息(例えばアレルギー性喘息及び非アレルギー性喘息)、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、過敏症(例えばアナフィラキシー、蕁麻疹、食物アレルギーなど)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫病、間質性膀胱炎、高ＩｇＥ症候群、毛細管拡張性運動失調症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、胸腺欠損リンパ異常、ＩｇＥ骨髄腫及び移植片対宿主反応からなる群から選択される。まだなお更なる特定の態様では、ＩｇＥが媒介する疾患は、食物アレルギー、アナフィラキシー、接触皮膚炎およびアレルギー性紫斑病である。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法であって、高ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、糖質コルチコイド、ＮＳＡＩＤ、鬱血除去剤、咳抑制剤、鎮痛剤、ＴＮＦ−アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体およびＢＡＦＦアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも一の薬剤の治療上の有効量と組み合わせて、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。特定の態様では、抗体は、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる。他の特定の態様では、抗体は総血清ＩｇＥを減少させる。さらに他の特定の態様では、抗体は、総及び無ＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法であって、アレルギー性疾患の治療の公知の方法の投与の前、投与と同時に、又は投与の後に、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を投与する併用治療投与計画を含む方法を提供する。特定の態様では、併用には、抗ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、糖質コルチコイド、非ステロイド系抗炎症剤、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、鬱血除去剤、咳抑制剤又は鎮痛剤の投与が含まれる。他の特定の態様では、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、アレルゲン感作(allergen densitization)の治療投薬計画と組み合わせて投与される。特定の態様では、抗体は、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる。他の特定の態様では、抗体は総血清ＩｇＥを減少させる。さらに他の特定の態様では、抗体は、総及び無ＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を投与することを含む、アレルゲン誘導性のＩｇＥ産生を阻害する方法を提供する。特定の態様では、抗体は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。他の特定の態様では、方法は、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる。さらに他の特定の態様では、方法は、総血清ＩｇＥを減少させる。更なる他の特定の態様では、方法は、無血清および総血清ＩｇＥを減少させる。なお更なる特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を投与することを含む、アレルゲン誘導性のＩｇＥ産生を減少する方法を提供する。特定の態様では、抗体は、図６Ａ−６Ｆの何れかに示す抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む。他の特定の態様では、方法は、ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇させる。さらに他の特定の態様では、方法は、総血清ＩｇＥを減少させる。さらに特定の態様では、方法は、無血清および総血清ＩｇＥを減少させる。なお更なる特定の態様では、血清ＩｇＥはアレルゲン特異的である。なお更なる特定の態様では、抗体は、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される。なお更なる特定の態様では、抗体は４７Ｈ４ｖ５である。なお更なる特定の態様では、抗体はＡＤＣＣ活性を有する。
なお更なる実施態様では、本発明は、先に記載した何れかの方法に有用な組成物を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は、先に記載した何れかの方法のための組成物の用途を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は、７Ａ６.１８、１Ｃ１１.１０.２０、４７Ｇ４.６.２、４７Ｈ４.１２.１０、４２Ｈ４.６.９、４２Ａ５.２０.１１、２６Ａ１１.６.５、５１Ｄ２.２２.１５、４５Ｃ１.６.１４、２６Ｂ１１.３.１２、２８Ｅ９.１２.９からなる群から選択される標識で、２００７年３月２１日にＡＴＣＣに寄託されたマウスハイブリドーマを提供する。特定の態様では、本発明は、寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗体を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は、ＩｇＥのヒトＭ１'セグメントを発現するトランスジェニック動物を提供する。
ヒト(配列番号：１、アカゲザル(配列番号：２)およびカニクイザル(配列番号：３)のＩｇＥの選択した定常鎖領域のアラインメントである。ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｍ１'、膜貫通および細胞内ドメインのおよその位置を示す。 ヒト(配列番号：１、アカゲザル(配列番号：２)およびカニクイザル(配列番号：３)のＩｇＥの選択した定常鎖領域のアラインメントである。ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｍ１'、膜貫通および細胞内ドメインのおよその位置を示す。 図２Ａ−２Ｃは、様々な抗Ｍ１'抗体の特異性を示すＦＡＣＳスキャッチャードプロットである。図２Ａ−１から２Ａ−６はＩｇＥの短形(Ｍ１'なし)に対する結合を示すのに対して、図２Ｂ−１から２Ｂ−６は長形(Ｍ１'あり)に対する結合を示す。図２Ｃ−１から２Ｃ−６はＵ２６６細胞株によって発現されるＩｇＥに対する結合を示す。影を付けた曲線はコントロールＡｂの蛍光強度を示し、影を付けていない曲線は試験した抗体の相対的な蛍光を示す。 図２Ｄ−Ｆは、マウスの抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４、２６Ａ１１および７Ａ６の結合特異性を示す。図２Ｄは、４７Ｈ４はヒト(Human、hu)、アカゲザル(Rhesus、Rh)およびカニクイザル(Cyno)のＩｇＥ／Ｍ１'に結合するが、Ｍ１'を欠くＩｇＥには結合しないことを示す。 図２Ｅは、４７Ｈ４はＵ２６６に結合したが、２６Ａ１１および７Ａ６は結合しないことを示す。 図２Ｆは、４７Ｈ４及び７Ａ６はアカゲザル及びカニクイザルのＭ１'を結合するのに対して、２６Ａ１１はアカゲザルのみを結合することを示す。 図２Ｇ−Ｉは、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ５ ｖ.５、２６Ａ１１ ｖ６および７Ａ６ ｖ１の結合特異性を示す。図２Ｇは、３つすべてのヒト化変異体４７Ｈ４ｖ５、２６Ａ１１ｖ６および７Ａ６ｖ１がＩｇＥ-Ｍ１'に特異的であるが、Ｍ１'を欠くＩｇＥには特異的でないことを示す。 図２Ｈは、変異体４７Ｈ４ｖ５および２６Ａ１１ｖ６(しかし、７Ａ６ｖ１ではない)がＵ２６６を結合することを示す。 図２Ｉは、４７Ｈ４ｖ５及び７Ａ６ｖ１はアカゲザル及びカニクイザルのＭ１'を結合するのに対して、２６Ａ１１ｖ６はアカゲザルＭ１'のみを結合することを示す。 図３Ａ−Ｌは、図３Ｍに示す段階希釈物を用いた、様々な抗Ｍ１'抗体の相対的な結合能親和性を示すＦＡＣＳプロット線である。図３Ｎは、各抗体の相対的な親和性を示す。図３Ｏは、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルのＭ１'に対するスキャッチャード分析によって測定される、マウス抗体４７Ｈ４、２６Ａ１１及び７Ａ６の親和性をまとめる。他に示さない限り、示した数は平均値である。図３Ｐは、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルのＭ１'に対するスキャッチャード分析によって測定される、抗体のヒト化変異体４７Ｈ４及び２６Ａ１１の親和性をまとめる。 図４Ａ−Ｄは、抗Ｍ１'抗体の相対的な結合／ブロッキング研究を示す。図４Ａ−１から４Ａ−２０は、結合をブロックしたか又は部分的にブロックした抗体を示すＦＡＣＳプロットである。 図４Ｂは、他の抗体の相対的な結合ブロック能を示す二次元プロットである(１：１モル比を用いた部分的又は完全なもの)。 図４Ｃは、特に示した抗体に注目した二次元プロットであり、ブロック研究は１０:１のモル比で繰り返した。 図４Ｄは、エピトープ結合／ブロッキング研究から得たグループ化を示す概略図である。 図５Ａ−Ｃは、４７Ｈ４、７Ａ６及び２６Ａ１１を用いて行ったエピトープ結合研究を示す。図５Ａは、エピトープ結合を決定するために用いた、隣接したＮ−及びＣ−末端残基(配列番号：３)、及びＭ１'ペプチド１−５(配列番号：５−１９)をそれぞれ含むＭ１'セグメントを示す。図５Ｂ及び５Ｄは、親マウス抗体４７Ｈ４がペプチド４を結合し、７Ａ６がペプチド４及び５を結合し、２６Ａ１１がペプチド７及び８を結合することを示す。図５Ｃ及び５Ｅは、ヒト化変異体４７Ｈ４ｖ５がペプチド４を結合するのに対して、７Ａ６７ｖ１がペプチド４及び５を結合し、２６Ａ１１ｖ６がペプチド７及び８を結合し、それによって親マウス抗体のエピトープ特異性を保持することを示す。 マウス抗体２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４及びこれらの様々なヒト化変異体の可変軽鎖および重鎖の配列を示す。位置はカバットに従って番号付けを行い、可変のコンセンサスネットワークに移植した高頻度可変領域(軽鎖のκＩ、重鎖のサブグループＩＩＩ)を囲みで表す。 ヒトκＩ軽鎖(配列番号：２０)と比較して、２６Ａ１１(配列番号：２１)およびヒト化変異体１、４(配列番号：２２)、変異体２、５(配列番号：２３)、変異体３、６(配列番号：２４)、変異体１３、１５(配列番号：２５)及び変異体１４、１６(配列番号：２６)の可変軽鎖を示す。 ヒトκＩ軽鎖(配列番号：２０)と比較して、７Ａ６(配列番号：２７)及びヒト化変異体１(配列番号：２８)の可変軽鎖を示す。 ヒトκＩ軽鎖(配列番号：２０)と比較して、４７Ｈ４(配列番号：２９)およびヒト化変異体１、３(配列番号：３０)及び変異体２、４−６(配列番号：３１)の可変軽鎖を示す。 ヒトＩＩＩ重鎖(配列番号：３２)と比較して、２６Ａ１１(配列番号：３３)及びヒト化変異体１−３、１３、１４(配列番号：３４)および変異体４−６、１５、１６(配列番号：３５)の可変重鎖を示す。 ヒトの重鎖(配列番号：３４)と比較して、７Ａ６(配列番号：２６)及びヒト化変異体１(配列番号：３７)の可変重鎖を示す。 ヒトＩＩＩ重鎖(配列番号：３２)と比較して、４７Ｈ４(配列番号：３８)、及びヒト化変異体１、２(配列番号：３９)、変異体３−４(配列番号：４０)、変異体５(配列番号：４１)および変異体６(配列番号：４１)の可変重鎖を示す。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。ＩｇＭがＩｇＥより高いレベルで発現されることを基本的に示すＦＡＣＳプロット線である。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。それぞれ、アポトーシスを誘導する際の、架橋抗ＩｇＭ[Ｆ(ａｂ')２]抗体とカンプトセシンの適用の効果を示す。アネキシンについてポジティブであるが、ＰＩについてネガティブに染色する細胞は死にかけているのに対して、アネキシン及びＰＩの両方についてポジティブに染色する細胞は死んでいる。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。すべての観察されたアポトーシスをグラフで表す。ここで、明るい棒はアネキシン−(＋)及びＰＩ−(−)の細胞を示し、暗い棒はアネキシン−(＋)及びＰＩ−(＋)を示す。図７Ｄ−７Ｇは、２５、１０、１、０．１、０．０１および０．００１μｇ／ｍｌの濃度での抗Ｍ１'誘導性アポトーシスをグラフで表す。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。架橋なしの、エピトープグループＡ１のＭ１'抗体、例えば７Ａ６、４７Ｈ４、４７Ｇ４、４２Ａ５、４２Ｈ４(コントロールＭＡＥ-１１およびＧＰ１２０とともに)の適用の結果を示す。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。架橋なしの、エピトープグループＡ２のＭ１'抗体、例えば１Ｃ１１、２６Ａ１１、５１Ｄ２、４５Ｃ１、及び、エピトープグループＢ／ＣのＭ１'抗体、例えば２６Ｂ１１および２８Ｅ９の適用の結果を示す。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。架橋を有するエピトープグループＡ１を示す。 図７Ａ−Ｇは、ＩｇＥ−Ｍ１'形質移入Ｄａｕｄｉ細胞における親抗Ｍ１'抗体のアポトーシス活性を示す。架橋を有するエピトープグループＡ２およびＢ／Ｃを示す。 図８Ａ−Ｂは、２５、１０、１、０．１、０．０１および０．００１μｇ／ｍｌの濃度で様々なヒト化抗Ｍ１'抗体変異体にて処理したＩｇＥ−Ｍ１'を形質移入したダウディ細胞におけるヒト化抗Ｍ１'変異体のアポトーシス活性を示す。図８Ａは、ヒト化変異体４７Ｈ４ｖ５、２６Ａ１１ｖ６および７Ａ６ｖ１がより高い濃度レベル(すなわち１０−２５μｇ／ｍｌの４７Ｈ４および２６Ａ１１変異体、１、１０および２５μｇの７Ａ６変異体)で３０−４０％の範囲のアポトーシスを誘導することを示す。図８Ｂは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ’)２架橋結合抗体の存在下で処理されるＩｇＥ-Ｍ１'形質移入ダウディ細胞に対する同じ抗体のアポトーシス活性を示す。抗体はすべて、７０−９０％の最大のアポトーシスレベルを誘導し、いくつかは高濃度でアポトーシス活性を低減した(例えば４７Ｈ４-ｖ１、-ｖ２、２６Ａ１１-ｖ１、-ｖ１４)。図８Ｃは、野生型およびアフコシル化された４７Ｈ４ｖ５が類似のレベルでアポトーシスを誘導することが可能であったことを示す。 ダウディ−ＩｇＥ／Ｍ１'細胞においてカルシウム流量を誘導するマウス抗Ｍ１'抗体の能力を示す。図９Ａは、抗ＩｇＭおよびＭＡＥ１１の作用を示すコントロールであるのに対して、図９Ｂ１−Ｂ２は、示したマウス抗Ｍ１'抗体の適用の効果を示す。 ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４ ｖ５ ｗｔおよびアフコシル化された変異体のＡＤＣＣ誘導能を示す。ｗｔとアフコシル化された変異体は同等の最大の細胞毒性を引き起こすが、アフコシル化された変異体(「ＡＦ」)は野生型よりも効果が強い(ＥＣ５０ ＡＦ≒０.８３ ｎＭ、ＥＣ５０ ｗｔ≒６.６ ｎＭ)。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体７Ａ６(配列番号：４３および４４)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体４７Ｈ４(配列番号：４５および４６)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体２６Ａ１１(配列番号：４７および４８)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体４５Ｃ１(配列番号：４９および５０)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体２８Ｅ９(配列番号：５１および５２)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 図１１Ａ−Ｆは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の重鎖および軽鎖の完全長配列である。可変領域を斜体で表し、ＨＶＲ(高頻度可変領域)を下線で表す。マウス抗体１Ｃ１１(配列番号：５３および５４)の重鎖および軽鎖をそれぞれ示す。 マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の有するアトピーｈｕ-ＳＣＩＤモデルにおける血清ＩｇＥおよびＩｇＥを産生するプラズマ細胞の産生を阻害する能力を示す。図１２Ａは、実験の設定をグラフで表す。図１２Ｂ−Ｃは、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体による処理によって、ＩｇＥレベルが６５−８４％減少したことを示す。図１２Ｄ−Ｅは、インビボでＩｇＥを産生する細胞の減少が１９−６９％であったことを示す。図１２Ｆ−Ｇは、他の免疫グロブリン(例えば、ＩｇＧ１-４、ＩｇＡ、ＩｇＭ)のレベルが相対的に影響を受けなかったことを示す。図１２Ｈ−Ｉは、脾臓のプラズマ細胞の合計数の減少は観察されなかったことを示す。 アトピーｈｕ-ＳＣＩＤモデルにおける免疫グロブリンレベルに対するヒト化変異体４７Ｈ４ｖ５の効果を示す。図１３Ａは、実験の設定をグラフで表す。図１３Ｂ−Ｄは、血清ＩｇＥが７９％減少し、ＩｇＥを産生するプラズマ細胞が７５％減少したことを示す。図１３Ｅ−Ｆは、他の血清免疫グロブリンレベルの減少はないことを示す。図１３Ｇ−Ｈは、総プラズマ細胞レベルの減少はなかったことから、４７Ｈ４はＩｇＥを産生するプラズマ細胞を特に減少させるが、それは総プラズマ細胞の中で非常に割合が小さいことを示す。 図１４Ａ−ＤはｈｕＭ１'ノックインマウスの作製を示す。マウスＩｇＥ遺伝子座上のＭ１'エキソンの位置を示す。 図１４Ａ−ＤはｈｕＭ１'ノックインマウスの作製を示す。標的対立遺伝子が生じるマウスＩｇＥ遺伝子座の組換えの概略図を示す。 図１４Ａ−ＤはｈｕＭ１'ノックインマウスの作製を示す。ｗｔマウスの６６８ｂｐバンドとＭ１'ノックインの４５７ｂｐバンドのＰＣＲ遺伝子タイピングを示す。 図１４Ａ−ＤはｈｕＭ１'ノックインマウスの作製を示す。ｗｔマウスでの７．４ｋＢのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｈｕ-Ｍ１'ノックインでは３ｋＢの断片になっており、１４．１ｋＢのＢａｍＨＩ断片がｈｕ-Ｍ１'ノックイン対立遺伝子では１８．１の断片になっている、サザンブロットを示す。野生型およびヘテロ接合のマウスの両方を示す。 抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する一次免疫応答でのＩｇＥの生成を予防する能力を示す。図１５Ａは、ＴＮＰ/ＯＶＡ及び抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の投与を含む、実験計画のスケジュールを示す図式である。図１５Ｂは、経時的な抗原特異的ＩｇＥレベルのグラフであり、コントロール動物(すなわちｇｐ１２０)抗原特異的ＩｇＥレベルは８日目と１４日目の間でピークレベルに達したのに対して、抗ＩｇＥ／Ｍ１'は一切の増加を防ぎ、測定された抗原特異的ＩｇＥレベルは免疫化していないマウスとは有意に異なっていたことを示す。図１５Ｃ−Ｄは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置は８日目と１４日目のそれぞれで抗原特異的血清ＩｇＥの増加を防ぎ、免疫化していないマウスと統計学的な違いがなかったことを示す(図１５Ｅ)。図１５Ｆ−Ｉは抗原特異的ＩｇＧ１のレベルは、２８日の実験期間では抗ＩｇＥ／Ｍ１'の影響を有意に受けなかったことを示す。 抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、記憶又は二次の免疫応答での抗原特異的ＩｇＥの生成を防ぐ能力を示す。図１６Ａは、ＴＮＰ−ＯＶＡの二次的追加免疫と抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の投与のスケジュールを示す図式であり、２８日目に始めの投与を行った。図１６Ｂは、経時的な抗原特異的ＩｇＥレベルのグラフであり、２８日目のＴＮＰ−ＯＶＡ追加免疫に対する二次的ＩｇＥ応答は急速なものであり、一次応答の８−９日と比べ、４日後にピークとなることを示す。図１６Ｃ−Ｄは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置動物における抗原特異的ＩｇＥレベルは、アイソタイプコントロールと比べて有意に減少しており、３２日目までに５９−６５％、３５日目までに９０−９３％であることを示す。図１６Ｅは、４２日目(抗ＩｇＥの１２日初期投与)までに、抗原特異的ＩｇＥレベルが、ナイーブコントロールマウスと統計学的に異ならないレベルまでに減少されたことを示す。図１６Ｆ−Ｈは、２８日目と４９日目の間に、抗ＩｇＥ／Ｍ１'の投与により血清ＩｇＥレベルが７４−８４％減少し、抗原特異的ＩｇＥレベルの平均日当たりのレベルも７４−８３％減少したことを示す。図１６Ｉ−Ｋは、抗原特異的ＩｇＧ１のレベルは抗ＩｇＥ／Ｍ１'の影響を有意に受けなかった。 抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、ブラジル鉤虫(「ＮＢ」)感染に応答したＩｇＥの産生を予防的に減少させる能力を示す。図１７Aは、実験の設定を示す図式である。動物は、０日目から開始し２１日目まで週３回処置した。図１７Ｂは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'及びコントロール抗体によるＮＢ感染に応答した経時的なＩｇＥレベルを示す。図１７Ｃ−Ｄは、１５日目に抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置動物が血清ＩｇＥレベルを減少しており、未感染マウスと統計学的な有意さがないことを示す。 抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、ブラジル鉤虫(「ＮＢ」)感染に対するピークのＩｇＥ応答を治療的に処置する能力を示す。図１８Aは、実験の設定を示す図式である。動物は、１１日目と２１日目の間週３回処置した。図１８Ｂは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'及びコントロール抗体によるＮＢ感染に応答した経時的なＩｇＥレベルを示す。図１８Ｃ−Ｄは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'により４日間の処置で８２−８９％の血清ＩｇＥレベルが減少したことを示す。図１８Ｅは、２１日目までに、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置動物のＩｇＥレベルが９７−９８％減少し、未感染コントロール群とは統計学的に有意に異ならないレベルに達したことを示す。図１８Ｆ−Ｇは、リンパ節及び脾臓のＩｇＥ産生プラズマ細胞(エリスポットによって定量される)がそれぞれ８８−９４％及び５７−６６％減少したことを示す。図１８Ｈ−Ｉは、リンパ節及び脾臓の総プラズマ細胞(ＣＤ１３８＋)は未感染マウスと比較してすべての処置群で増加したこと、抗ＩｇＥ／Ｍ１'による処置はいずれの臓器のプラズマ細胞の総数を有意に変化させなかったことを示す。これらの結果は、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、生体内のＩｇＥ産生細胞を枯渇させることによる血清ＩｇＥレベルの低減能を示す。 抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、ブラジル鉤虫(「ＮＢ」)感染への感染サイクルの遅延を生じさせるＩｇＥ応答を治療的に処置する能力を示す。図１９Aは、実験の設定を示す図式であり、ここで動物は４０日目に週３回の処置を開始した。図１９Ｂは、ピークＩｇＥ産生が１５日目辺りに生じたこと、すべての抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が血清ＩｇＥを減少させたことを示す。図１９Ｃ−Ｄは、処置の開始時と比較して、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が、無条件及び正規化した両ＩｇＥレベルをそれぞれ有意に減少させたことを示す。図１９Ｅ−Ｇは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置により、４８日目と５５日目の間に抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１アイソタイプコントロールと比較して、血清ＩｇＥレベルが有意に減少したことを示す。
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本明細書中で示すすべての文献は出典明記によって特別に援用される。
一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用するものであり、これらは当分野の技術の範囲内である。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds 1987, and periodic updates)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)；Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)等の文献において十分に説明されている。
リンパ球発達と活性化
ヒトのリンパ球の２つの主なタイプは、Ｔ(胸腺由来)とＢ(骨髄由来)である。これらの細胞は、リンパ系の発達経路に専従していた胎児肝臓と骨髄の造血性幹細胞から得られる。これらの幹細胞の後代(プロジェニー)は分岐経路を経て、Ｂ又はＴリンパ球に成熟する。ヒトＢリンパ球発達は骨髄内で完全に起こる。一方では、Ｔ細胞は、髄を離れる未成熟な前駆体から発達し、血流を介して胸腺に移動し、そこで増殖して成熟したＴリンパ球に分化する。
胸腺又は骨髄から現れる成熟したリンパ球は静止であるか、「静止」状態にある、すなわち、これらは有糸分裂的に不活性である。血流に分散されると、これらの「ナイーブ」又は「バージン」リンパ球は、様々な二次ないしは末梢リンパ系の器官、例えば脾臓、リンパ節又は扁桃腺に移動する。ほとんどのバージンリンパ球は本質的に寿命が短く、髄又は胸腺を離れて２、３日もせずに死ぬ。しかしながら、このような細胞が抗原の存在を示すシグナルを受け取ると、活性化し、連続した期間の細胞分裂を経る。その後、結果として生じる後代細胞には、休止状態に戻り、基本的には刺激するアレルゲンと次に遭遇するときに備える記憶リンパ球ＢおよびＴ細胞になるものがある。活性化されたバージンリンパ球の他の後代細胞はエフェクター細胞であり、２、３日しか生存しないが、特定の防御活性を発揮する。
リンパ球活性化は、刺激を受けて分化し後代細胞を製造し、その後代細胞のいくつかはエフェクター細胞になるような、静止リンパ球が経る順に連続した事象を指す。完全な応答には、細胞増殖(マイトジェネシス)の誘導および免疫学的機能の発現が含まれる。特定のリガンドがそれらの表面上のレセプターに結合すると、リンパ球は活性化される。リガンドはＴ細胞およびＢ細胞で異なるが、結果として生じる細胞内生理学的メカニズムは類似している。
外来の抗原自体がリンパ球活性化を誘導しうるが、特に大きな多量体抗原はＢ細胞上の表面免疫グロブリン、又はＴ細胞上の他の糖たんぱく質を架橋する。しかしながら、ほとんどの抗原は多量体でなく、多くの数のＢ細胞に直接結合する場合であっても活性化を起こさない。Ｂ細胞は近くで活性化されたヘルパーＴリンパ球と同時に刺激されると、これらのより共通した抗原によって活性化される。このような刺激はＴ細胞によって分泌されたリンホカインから生じてもよいが、あるＢ細胞表面レセプターと相互作用して二次的シグナルを生成する、Ｔ細胞表面タンパク質とＢ細胞との直接接触により効果的に伝達される。
Ｂ細胞
Ｂ細胞の決定的な特徴は免疫グロブリンの合成能である。免疫グロブリン(Ｉｇ)は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる関連した種類のポリペプチドからなる極めて多様なタンパク質のファミリーである。それぞれのＩｇは各々の特定の抗原に高い親和性で特異的に結合する。成熟Ｂ細胞は２つの異なる形態の免疫グロブリンを発現し、それぞれは固有の機能を有している。静止Ｂリンパ球(バージン又はメモリー)では、免疫グロブリンは細胞表面だけに発現され、ここで、基本的に特定の抗原のための膜結合型レセプターとして作用する。対照的に、Ｂ細胞エフェクター細胞(プラズマ細胞)は、周囲の環境に免疫グロブリンを分泌する。このような分泌された免疫グロブリンは、認識して、結合する能力を保持し(静止Ｂ細胞上の膜結合型と比べて)、一般的に抗体と称される。
活性化されたＢリンパ球が分化すると、その後代細胞のいくつかはメモリーＢ細胞となり、残りはプラズマ細胞に分化する。プラズマ細胞は比較的に生存期間が短いので、新しいプラズマ細胞が製造されない限り、細胞集団はすぐに死に絶え、もはや免疫グロブリンが分泌されなくなる。結果として、Ｂ細胞の活性化は典型的に増殖の過渡的な波を引き起こし、その後数日又は数週間にわたって増加した後に弱まる爆発的な抗体の分泌が起こる。Ｂ細胞は、液性免疫か又は組織液を介して媒介される保護効果に関与する主要な細胞種である。本発明の抗ＩｇＥ／Ｍ１’抗体は実際にはメモリーＢ細胞を含むＢ細胞を枯渇させるので、記憶を「リセットする」ために用いられうる。したがってこの効果は、個体のアレルギー応答を制御しているＢ細胞構成成分が取り除かれなかった場合に減弱されるものでありうる。
Ｔ細胞
Ｔリンパ球は免疫グロブリンを発現しないが、その代わりに、Ｔ細胞レセプターと呼ばれる表面タンパク質を介して外来物質の存在を検出する。これらのレセプターは、直接接触によるか、または他の免疫細胞の活性に影響することで抗原を認識する。マクロファージと共に、Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫に関与する主な細胞種である。
Ｂ細胞とは異なり、Ｔ細胞は、特定の関係においてのみ外来物質を検出しうる。特にＴリンパ球は初めに小ペプチドに切断された場合にのみ外来性タンパク質を認識し、その後抗原提示細胞(ＡＰＣ)と呼ばれる、二次宿主細胞の表面上に提示される。
細胞障害性リンパ球(Ｔｃ細胞又はＣＴＬ)とヘルパーＴ細胞(ＴＨ)細胞の２つの有意なＴ細胞サブセットがある。これらはマーカーＣＤ８とＣＤ４の細胞表面発現を基におおよそ識別されうる。
免疫応答
他の体の防衛能力とは区別される哺乳類の免疫系の３つの主な機能的特性には以下のものがある。(１)特異性−膨大な数の標的分子の中から個別に認識して応答するか否かの能力、(２)識別−無数のタンパク質と他の有機成分のすべてと平和に共存するために自己と非自己を決定し、なおかつ体内に導入される外来性成分に対して積極的に応答する能力、(３)記憶−特定の外来性病原体と次に遭遇したときに、初めて遭遇した時よりもより迅速かつ積極的に応答できるように、経験によって養われる能力。
ＡＰＣによって捕獲される外来性抗原は抗原プロセシングと称される連続した変更を受ける。このプロセシング、特にタンパク質性の免疫原は、変性と部分的なタンパク質分解を伴い、免疫原は短いペプチドに切断される。
前述の様式でＴＨ細胞が活性化される間、Ｂ細胞の中には抗原レセプターを介して免疫源を結合するものもあり、これは後に分泌する抗体の膜結合型である。Ｔ細胞とは異なり、Ｂ細胞はフリーでプロセシングされない形態で免疫原を認識する。特定の抗原結合によりＢ細胞活性化を引き起こしうるある種のシグナルが生じる。
ＩｇＥ／マスト細胞／仲裁経路
ＩｇＥ抗体は、Ｆｃ ＲＩと称される高親和性の細胞表面レセプターへの分子のＦｃ部分で、マスト細胞と好塩基球の表面に固定される。多価のアレルゲン分子がこれらレセプターを占めている抗体に結合すると、アレルギー応答が始まる。結果としてＦｃ ＲＩの架橋が生じ、次に、ヒスタミン、ロイコトリエン、化学走性因子、血小板活性化因子およびプロテイナーゼ等の、炎症のメディエーターの放出および活性化が細胞内に生じるシグナルが伝達される。これらの活性化されたメディエーターは局所的に作用し、血管透過の増加、血管拡張、平滑筋収縮および粘液腺分泌を引き起こす。このような現象は、臨床的に即時性又は早期段階と呼ばれ、アレルギー曝露後、始めの１５−３０分以内に起こる。その後１２時間にわたって、完全に解明されていないが他の化学的メディエーターに応答して、炎症性細胞の進行性の組織浸潤があり、好中球から単核細胞に対する好酸球まで進展する。このアレルギー曝露後６−１２時間の期間は後期と称し、細胞の炎症の臨床上の兆候を特徴とする。特に肺の後期応答は初期応答がなく生じるので、後期応答が必然的にＩｇＥに媒介されるとすると、依然として完全には解明されていない。
このメカニズムは、主にアナフィラキシー、蕁麻疹およびアトピー性疾患、例えばアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎およびアレルギー性胃腸疾患の原因となる。
エフェクターＴリンパ球／リンホカイン経路
特定のアレルギー性疾患は、前回の曝露により特定のアレルゲンに対する感作を受けたエフェクターＴリンパ球とのアレルゲン応答によって媒介される。アレルゲンと遭遇すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は活性化されてリンホカインを生成するようになり、この結果、数日の期間にわたって単核細胞の浸潤が堆積する。
Ｉ．定義
「アレルゲン」又は「免疫原」は免疫応答を誘発しうる任意の分子である。ここで使用しているように、この用語は、抗原性分子自体又はその供与源、例えば花粉粒、動物の鱗屑、昆虫毒物又は食品を包含する。これに対して、抗原なる用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞レセプターによって特異的に認識される分子を指す。免疫応答を誘導することが可能な任意の外来物質もアレルゲンとなりうる。天然及び合成の起源の多くの異なる化学物質はアレルゲン性であることが知られている。複雑な天然有機化学物質、特にタンパク質は抗体が媒介するアレルギーを引き起こしうるのに対して、単純な有機化合物、無機化合物及び金属はＴ細胞が媒介するアレルギーをより選択的に引き起こす。場合によって、同じアレルゲンは、複数の種類のアレルギーの原因となりうる。アレルゲンへの曝露は、吸入、注射、注入又は皮膚接触によるものであってもよい。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、抗ＬＹ６モノクローナル抗体(アンタゴニスト及び中和抗体)、多エピトープ特異性を有する抗ＬＹ６抗体成分、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＬＹ６抗体、多特異性抗体(例えば、二重特異性)及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは上に列挙した抗体の全ての抗原結合断片(下記参照)を含む。「免疫グロブリン」(Ｉｇ)という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
「ネイキッド抗体」なる用語は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」又は「全抗体」なる用語は交換可能に用いられ、抗体断片とは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体を指す。特に全抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものが含まれる。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えばヒトの天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。場合によって、インタクトな抗体は一又は複数のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体(米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
本発明の抗体の「機能的断片」は、一般に、ＦｃＲ結合能を保持する抗体のＦｃ領域又は抗体の抗原結合領域ないし可変領域を含む、インタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例には、線形抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当分野で公知の様々な技術を用いて製造することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載の方法もヒトモノクローナル抗体の調整のために有用である。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つの高頻度可変領域のうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これら高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
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高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４７−６５(好適な実施態様)(Ｈ２)及び９３−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々の拡大高頻度可変領域を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。ある実施態様では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみ起こり、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、上掲のKabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (H1)(配列番号:55), WVRQAPGKGLEWVA (配列番号:56)(H2), RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (配列番号:57)(H3), WGQGTLVTVSS (配列番号:58)(H4)
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:59)(L1), WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:60)(L2), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:61)(L3), FGQGTKVEIKR (配列番号:62)(L4)
特定位置、例えば、Ｆｃ領域「におけるアミノ酸修飾」とは、特定されたアミノ酸残基の置換もしくは欠失、または特定されたアミノ酸残基の隣接位置に少なくとも一つのアミノ酸を挿入することを指す。特定されたアミノ酸残基の「隣接位置」への挿入とは、１または２残基以内の挿入を意味する。その挿入は、特定された残基のN末端側、もしくはC末端側の場合があり得る。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
「ブロッキング(ブロック)抗体」又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、減弱するものである。好適なブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にないしは完全に阻害する。
「アポトーシスを誘発する」ＧＤＭアンタゴニストとは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成（アポトーシス性本体と呼ばれる）により決定される、神経膠腫細胞のプログラムされた細胞死を誘発するものである。細胞は通常、ＧＤＭポリペプチドを過剰発現する細胞である。様々な方法を使用して、アポトーシスに関連する細胞イベントを評価することができる。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位置をアネキシン結合により測定することができ、ＤＮＡ断片化をＤＮＡラダーリングにより評価することができ、核／染色質凝縮及びＤＮＡ断片化を、低二倍体性細胞の増加により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体、オリゴペプチド、又はその他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて、処理しない細胞に対し、約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、及び最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するものである。
「総血清ＩｇＥ」なる用語は、結合パートナー(例えば、抗ＩｇＥ抗体、ＩｇＥ保持Ｂ細胞)と複合体化しているＩｇＥと、無ないしは結合していないＩｇＥを含む、試料中に存在するＩｇＥの総量を指す。「無血清ＩｇＥ」は結合パートナーに結合していないＩｇＥを指す。
「アレルゲン特異的ＩｇＥ」なる用語は、アレルギー感作として知られる過程でアレルゲンに始めに曝露されることによって生じる、特定の抗原に特異的であるＩｇＥを指し、マスト細胞及び好塩基球の表面を結合し、その結果、同アレルゲンに後に曝露したときにマスト細胞及び好塩基球が活性化されるものある。ウイルス(例えばサイトメガロウイルス−ＣＭＶ)、細菌(例えばブドウ球菌)、ぜん虫(例えばカイチュウ属、シストソーマ属)および空気汚染中のアジュバント因子(例えばタバコの煙およびディーゼル排気)のいくつかのマイトジェン因子は、何れかのアレルゲン特異的ＩｇＥ-感作を起こすことなくＩｇＥ分子の産生を刺激する。ゆえに、ＩｇＥレベルは亢進するが、これによって常に宿主がＩｇＥが媒介する疾患に罹りやすくなるわけではないので、アレルゲン特異的ＩｇＥレベルは臨床評価に用いられることもある。
「ＩｇＥを産生するＢ細胞を特異的に枯渇する」なる用語は、ＩｇＥを特異的に分泌するＢ細胞(すなわちプラズマ細胞)の数又は効果を特異的に減少させるが、他の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡおよびＩｇＭを分泌するＢ細胞の数又は効果には有意に影響しない能力を意味する。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用されるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
ＩｇＧ中のＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にある。本発明の治療方法に有用なＣＤ２０結合及びＢＲ３結合抗体は、Ｆｃ領域を有する前述の抗体の任意のものの組成物を含み、ここで組成物中の抗体の約８０〜１００％(好ましくは約９０〜９９％)は糖タンパク質のＦｃ領域に結合したフコースを欠く成熟コア糖鎖構造を含む。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcore(登録商標)-2000又はBIAcore(登録商標)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
ここで用いる「実質的に減少」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値、ＨＡＭＡ応答)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の、好ましくは約１０％より大きく、より好ましくは約２０％より大きく、さらにより好ましくは約３０％より大きく、より好ましくは約４０％より大きく、最も好ましくは約５０％より大きい。
ここで用いる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」という句は、当業者が２つの数値(一般に、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％以下、より好ましくは約４０％以下、さらにより好ましくは約３０％以下、さらにより好ましくは約２０％以下、及び最も好ましくは約１０％以下である。
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社によって作製され、ＡＬＩＧＮ-２のソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、本明細書中に示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
ここに示すポリペプチド及び抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、生成された環境に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸はその生成環境に関連するすべての他の成分を含まない。ここに示すポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、天然に見出される形態或いは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したここに示すポリペプチド又は抗体を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に換えてここに示すポリペプチド又は抗体ドメインの置換を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。
「安定な」製剤とは、その中に含まれるタンパク質がその物理的、化学的安定性及び保存に対する完全性を本質的に保持するもののことである。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析的技術は、当該技術分野において利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs.(1991)及びJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)中に概説されている。安定性は選択された温度及び選択された期間測定することができる。迅速なスクリーニングを行うために、製剤を２週間から１ヶ月間、４０℃にて保存し、時間安定性を測定してもよい。製剤が２−８℃にて保存される場合、一般に、製剤は３０℃又は４０℃で少なくとも１ヶ月間安定、及び／又は２−８℃で少なくとも２年間安定である必要がある。製剤が３０℃にて保存される場合、一般に、製剤は３０℃で少なくとも２年間安定で、及び／又は４０℃で少なくとも６ヶ月間安定である必要がある。例えば、凍結乾燥及び保存後の凝集の程度は、タンパク質安定の指標として用いることができる。従って、「安定な」製剤は、該タンパク質の約１０％未満及び好ましくは約５％未満が製剤中に凝集体として存在してもよい。他の実施態様において、凍結乾燥製剤の凍結乾燥及び保存後の凝集体形成の如何なる増大も定量することができる。
「再構成された」製剤は、凍結乾燥タンパク質又は抗体製剤を希釈液中に溶解させ、タンパク質が全体に分散されることによって調製されるものである。再構成された製剤は、目的のタンパク質で治療される患者に投与（例えば、非経口投与）するのに適するもの、本発明のある実施態様においては、皮下投与に適するものであってもよい。
「等張な」製剤は、ヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を持つものである。等張な（アイソトニック）製剤は、一般に約２５０から３５０ｍＯｓｍの浸透圧を持つ。「低張な」なる用語は、ヒトの血液の浸透圧より低い浸透圧を持つ製剤を表す。同様に、「高張な」なる用語は、ヒトの血液の浸透圧より高い浸透圧を持つ製剤を表す。等張性は、例えば、蒸気圧又は氷−凍結（ice-freezing）型浸透圧計を用いて測定することができる。本発明の製剤は、塩及び／又はバッファーの添加の結果、高張となる。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
「薬学的に許容される酸」は、それらが製剤化される濃度及び方法において無毒性である無機及び有機酸を含む。例えば、適切な無機酸には、塩酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸などが含まれる。適切な有機酸には、直鎖及び分岐鎖アルキル、芳香族、環状、環状脂肪族、アリール脂肪族、複素環式、飽和、不飽和、モノ−、ジ−、及びトリ−カルボン酸で、例えば、蟻酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパンジオイン酸（propandioic）、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタン プロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタンジオイン酸（butandioic）、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、アスコルビン酸、ケイ皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グライコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサール酸、シュウ酸、メシリン酸（mesylic）、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモイン酸（palmoic）、パルメイン酸（palmeic）、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルフホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−コロベンゼンスルホン酸（chorobenzenesulfonic）、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルバイシクロ[２．２．２]−オクト−２−エン−１−カルボキシル酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボキシル酸）、ヒドロキシナフトイン酸（hydroxynapthoic）を含む。
「薬学的に許容な塩基」には、それらが製剤化される濃度及び方法において無毒性である無機及び有機塩基を含む。例えば、適切な塩基には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジンなどの無機塩基形成金属、及び第一級、第二級、第三級アミン、置換アミン、環状アミンを含む有機無毒性塩基、及び塩基性イオン交換レジン、[例えば、Ｎ(Ｒ’)４ ＋（ここでＲ’は別個にＨ又はＣ１−４アルキル基、例えばアンモニウム、トリス）]、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン（hydrabamine）、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミンレジン及び類似物から形成されるものが含まれる。特に、好ましい有機無毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
本発明に使用可能な、さらなる薬学的に許容可能な酸及び塩基には、アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギンに由来するものが含まれる。
「薬学的に許容可能な」バッファー及び塩には、前記された酸及び塩基の塩を付加された酸及び塩基に由来するものが含まれる。具体的なバッファー及び又は塩には、ヒスチジン、コハク酸及び酢酸が含まれる。
「薬学的に許容される糖」は、目的のタンパク質と結合したときに保存に対してタンパク質の化学的及び／又は物理学的不安定性を著しく予防又は減少する分子である。製剤が凍結乾燥して再構成することを意図したものであるとき、「薬学的に許容される糖」もまた「リオプロテクタント」として周知のものである。例示的糖及びそれらに同一の糖アルコールには：グルタミン酸１ナトリウム又はヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの溶媒変性塩；三価アルコール又はそれより大きな分子量の糖アルコールなどの多価アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ピューロニクス（登録商標）；及びそれらの組合わせが含まれる。更なる例示的リオプロテクタントには、グリセリン及びゼラチン、及び糖、メリビオース、メレチトース、ラフィノース、マンノトリオース及びスタキオースが含まれる。還元糖の例には、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロース及びラクツロースが含まれる。非還元糖の例には、糖アルコール及び他の直鎖ポリアルコールから選択されたポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが含まれる。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、特にラクトース、マルトース、ラクツロース及びマルツロースなどのジサッカライドの還元によって得られる化合物である。グリコシド側鎖はグルコシド又はガラクトシドのいずれかであり得る。糖アルコールの更なる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール及びイソ−マルツロースである。好ましい薬学的に受容される糖には非還元糖トレハロース又はスクロースである。
薬学的に許容される糖は、タンパク質が保存の間（例えば、再構成及び保存の後）その物理学的及び化学的安定性と完全性を本質的に保つような「保護量」（例えば、凍結乾燥前）で製剤に添加する。
ここでの目的における「希釈液」は、薬学的に許容な（ヒトへの投与に関し安全で無毒性）もので、凍結乾燥後に再構成される製剤などの、液性製剤の調製に有用である。典型的な希釈液には、滅菌水、注射のための静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸バッファー生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液が含まれる。これに代わる実施態様において、希釈液は塩及び／又はバッファーの水溶液を含み得る。
「保存剤」は、バクテリアの作用を減少させるために、ここにおける製剤に添加され得る化合物である。保存剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の生産を促進する。潜在的保存剤の例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。保存剤の他のタイプには、フェノールなどの芳香族アルコール、ブチル及びベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。ここで最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。
本明細書中で用いる「治療」は、治療される個体又は細胞の自然な経過を変更するための臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の経過の間のいずれかの時期に実施されうる。治療の所望の効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的ないしは間接的な病理的影響の低減、転移の予防、疾患進行の割合の低減、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解ないしは予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患又は障害の発達を遅延させるために用いる。本発明の方法による治療的な量の本発明の抗体を服用した後に、被検体が特定の疾患の一又は複数の兆候及び症状の観察可能な及び／又は測定可能な程度の低減ないし欠如を示す場合には、例えば自己免疫性疾患について被検体は成功裏に「治療され」ている。
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
個体に所望する反応を引き出すための本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量を含む。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
「慢性（長期）の」と投与とは、最初の効果、例えば抗肥大効果を長期間維持すべく、急性の方法とは反対の継続的方法によって薬剤を投与することを意味する。
治療のための「哺乳動物」は、哺乳類として分類される任意の動物、例えばヒト、家庭および畜産動物、および動物園、スポーツ用、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを指す。哺乳動物はヒトであることが望ましい。
「薬学的製剤」なる用語は、活性材料の生物学的活性が有効になるような形態であり、及び製剤が投与されうる被検体に許容不可能な毒性を示す付加的成分を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌である。
「無菌の」製剤は防腐処理をしているか、すべての生きている微生物およびそれらの胞子を含んでいない。
本明細書中で用いる「およそ」なる用語は、この技術分野の熟練した人に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。
ここで用いられる「抗ヒスタミン剤」は、ヒスタミンの生理的効果に拮抗する薬剤である。そのレセプター、Ｈ１及びＨ２にヒスタミンが結合すると、特徴的なアレルギー症状及び、かゆみ、赤み、はれあがりなどが起こる。多くの抗ヒスタミン剤は、そのレセプター、Ｈ１及びＨ２にヒスタミンが結合するのを阻害することによって作用する；しかしながら、他は、ヒスタミンの放出を抑制することによって作用すると考えられている。抗ヒスタミン剤の例として、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、クロモリンナトリウム、アステミゾール、アザタジンマレイン酸塩、ブロフェニラミンマレイン酸塩、カルビノキサミンマレイン酸塩、塩酸セチレジン（cetirizine hydrochloride）、クレマスチンフマル酸塩、シプロヘプタジン塩酸塩、d-マレイン酸ブロムフェニラミン、d-マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒドラミン、ドキシラミン琥珀酸塩、塩酸ヘキソフェンダジン（fexofendadine hydrochloride）、塩酸テルフェナジン（terphenadine hydrochloride）、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン（loratidine）、塩酸メクリジン、クエン酸トリペレナミン、塩酸トリペレナミン、塩酸トリプロリジンがある。
ここで用いられる「気管支拡張剤」は、結果として肺気量の減少や呼吸の短縮になる一般的には初期の喘息反応を起こす気管支収縮、生理学的症状に拮抗する又は無効にする薬剤を指す。気管支拡張薬の例には、エピネフリン、広域作用性α及びβアドレナリン作動性、及びβアドレナリン作動性アルブテロール、ピルブテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、及びイソエタリンを含む。また、気管支拡張は、アミノフィリン及びテオフィリンを含むキサンチンの投与によって達成することもできる。
ここで用いられる「糖質コルチコイド」は抗炎症性活性を有するステロイドベースの薬剤を指す。糖質コルチコイドは、一般的に後期喘息反応を減弱させるために用いられる。糖質コルチコイドの例には、プレドニゾン、ベクロメタゾン二プロピオン酸塩、トリアムシノロンアセトニド、フルニソリド、ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニゾリド（flunisolide）、フルチカゾン（fluticasone）プロピオン酸塩、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン及びトリアムシノロンが含まれる。
ここで用いられる「非ステロイド性抗炎症剤」または「ＮＳＡＩＤ」は、ステロイドベースでない抗炎症性活性を有する薬剤を指す。ＮＳＡＩＤの例には、アセトアミノフェン、アスピリン、ブロムフェナク（bromfenac）ナトリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン（phenylbutzone）、ピロキシカム、スリンダク、トルメチンナトリウムが含まれる。
「ＩｇＥが媒介する疾患」なる用語には、多くの共通して天然に生じる吸入及び摂取した抗原に免疫学的に応答する全身性遺伝性性質とＩｇＥ抗体の継続的な産生と特徴とする、アトピー性疾患が含まれる。具体的なアトピー性疾患には、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎(結膜炎)、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アナフィラキシー、接触皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症およびアレルギー性紫斑病(ヘノッホ-シェーンライン)が含まれる。アトピー性患者は複数のアレルギーを有することが多く、季節性、通年性及び職業性のアレルゲンを含む多くの環境アレルゲンに対するＩｇＥ抗体及びそれらによる症状を有する。季節性アレルゲンの例には花粉(例えば草、木、ライ麦、オオアワガエリ、ブタクサ)が含まれ、一方、通年性アレルゲンには真菌類(例えば糸状菌、糸状菌胞子)、羽毛、動物(例えばペット又は他の動物の鱗屑)および昆虫(例えば粉塵ダニ)細片が含まれる。職業性のアレルゲンの例には、動物(例えばマウス)および植物の抗原、並びに薬剤、界面活性剤、金属およびイソシアネート等の免疫促進剤も含まれる。ＩｇＥが媒介する反応を生じさせうる抗原以外の特定の刺激には、感染、煙等の刺激物、燃焼臭気、ディーゼル排気分子および二酸化硫黄、運動、寒さおよび感情的なストレスが含まれる。ある遺伝的バックグラウンドを有するアトピー性及び非アトピー性の個体の具体的な過敏性反応は、食物(例えば豆類、ピーナッツ)中のタンパク質、毒物(例えば昆虫、ヘビ)、ワクチン、ホルモン類、抗血清、酵素、ラテックス、抗生物質、筋弛緩物質、ビタミン、細胞毒素、アヘン剤および多糖類、例えばデキストリン、鉄デキストランおよびポリゲリンへの曝露により生じうる。
ＩｇＥが媒介していると思われ、本発明の製剤により治療可能である、亢進したＩｇＥレベルに関連する他の疾患には、毛細血管拡張性運動失調、チャーグ-ストラウス症候群、湿疹、腸炎、胃腸疾患、移植片対宿主反応、高ＩｇＥ(ジョブ)症候群、過敏症(例えばアナフィラキシー型過敏症、カンジダ症、血管炎)、ＩｇＥ骨髄腫、炎症性腸疾患(例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、未確定の大腸炎および感染性大腸炎)、粘膜炎(例えば口内粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎および直腸炎)、壊死性全腸炎および食道炎、寄生虫病(例えばトリパノソーマ症)、過敏性血管炎、蕁麻疹およびウィスコット‐アルドリッヒ症候群が含まれる。
さらに、疾患自体が亢進したＩｇＥに関連しているか否かにかかわらず、ＩｇＥレベルを下げることによって治療可能であるので、「ＩｇＥが媒介する疾患」の範囲内であるとみなす疾患には、アジソン病(慢性副腎皮質不全)、脱毛症、遺伝性血管性浮腫、血管性浮腫(バニスター病、血管神経性浮腫)、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、動脈炎、アミロイドーシス、免疫不全、例として、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性多内分泌不全症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血球減少症、自己免疫性糸球体腎炎、ベーチェット病、気管支炎、バージャー病、類天疱瘡、カプラン症候群(リウマチ様塵肺)、心臓炎、脂肪便症、チェディアック-ヒガシ症候群、慢性閉塞性肺病(ＣＯＰＤ)、コーガン-リーゼ症候群(虹彩角膜の内皮症候群)、ＣＲＥＳＴ症候群、疱疹状皮膚炎(デューリング病)、真正糖尿病、好酸性筋膜炎、好酸性腎炎、上強膜炎、外因性アレルギー性肺胞炎、家族性発作性漿膜炎、フェルティー症候群、線維性肺胞炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、顆粒球減少症、肉芽腫、肉芽腫症、肉芽腫筋炎、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群(多発性神経炎)、橋本甲状腺炎(リンパ腫性甲状腺腫)、ヘモクロマトーシス、組織球増殖症、高好酸球症候群、過敏性大腸症候群、若年性関節炎、角膜炎、ハンセン病、紅班性狼瘡、ライエル病、ライム病、混合性結合組織病、単発神経炎、多発性単神経炎、マックル-ウェルズ症候群、皮膚粘膜リンパ系症候群(川崎病)、多中心性網状組織球増殖症、多発性硬化症、重症筋無力症、菌状息肉腫、脂肪組織炎、類天疱瘡、ペンフィグス、心外膜炎、多発性神経炎、結節性多発動脈炎、乾癬、乾癬の関節炎、肺関節炎、肺腺腫症、肺線維形成、再発性多発軟骨炎、リウマチ熱、関節リウマチ、鼻副鼻腔炎(副鼻腔炎)、サルコイドーシス、強膜炎、硬化性胆管炎、血清病、セザリー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス-ジョンソン症候群、全身性肥満細胞症、移植拒絶反応、血小板減少性紫斑病、胸腺リンパ形成不全症、ブドウ膜炎、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症が含まれる。
本明細書中の「自己免疫性疾患」は、個体の自己組織ないしは臓器又は同時分離したものに対する及びそれらから生じる疾患又は症状、又はその徴候又は結果として生じるその症状である。これら多くの自己免疫性及び炎症性疾患において、多くの臨床用及び研究用のマーカーが存在してもよく、限定するものではないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原抗体複合体蓄積、副腎皮質ステロイド又は免疫抑制性治療の利点、及び、罹患組織中のリンパ系細胞の凝集塊が含まれうる。Ｂ細胞が媒介する自己免疫性疾患に関して何か一つの理論に限定されるものではないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状及びＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、及び病巣への異所性新リンパ形成を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。各々のこれらの経路は、自己免疫性疾患の病状の程度の違いに寄与しうる。
「自己免疫性疾患」は、臓器特異的疾患(すなわち、免疫応答が、内分泌系、造血系、皮膚、循環器系、胃腸及び肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などといった臓器系に対して特異的である)又は、複数の臓器系に影響しうる全身性疾患(例えば全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、関節リウマチ(ＲＡ)、多発性筋炎など)でありうる。好適な前記疾患には、自己免疫性リウマチ性疾患(例えばＲＡ、シェーグレン症候群、強皮症、狼瘡、例えばＳＬＥおよびループス腎炎、多発性筋炎-皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群および乾癬の関節炎)、自己免疫性胃腸及び肝疾患(例として、例えば炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病)、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎および小児脂肪便病)、血管炎(例として、例えばＡＮＣＡネガティブ血管炎およびＡＮＣＡ関連血管炎、例えばチャーグ-シュトラウス血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症および顕微鏡的多発性血管炎)、自己免疫性神経学的疾患(例として、例えば多発性硬化症、眼球クローヌス筋硬直症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病および自己免疫性多発性神経炎)、腎臓疾患(例として、例えば糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルジェ病)、自己免疫性皮膚疾患(例として、例えば乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、類天疱瘡および皮膚紅班性狼瘡)、血液学的な疾患(例として、例えば血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病および自己免疫溶血性貧血)、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例として、例えば内耳疾患および聴力障害)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植および自己免疫性内分泌性疾患(例として、例えば糖尿病関連の自己免疫性疾患、例えばインシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、アジソン病および自己免疫性甲状腺病(例えばグレーブス病および甲状腺炎))が含まれる。より好ましくは前記疾患には、例えば、ＲＡ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎および糸球体腎炎が含まれる。
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、および／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６)、化学治療薬、および細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)およびブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)およびバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団および関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセートおよび５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)およびアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)およびアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)およびタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵおよびリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))および細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)およびエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロおよび／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、およびトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、およびアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, MendelsohnおよびIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、および黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；上皮性増殖因子；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-αおよび-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-αおよびＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子IおよびII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；および顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、 ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、 ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のインターロイキン(ＩＬ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質および天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
「ホルモン」なる用語は通常管を有する腺性器官によって分泌されるポリペプチドホルモンを表す。そのようなホルモンには、例えば、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；エストラジオール；ホルモン補充療法；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン又はテストラクトン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；プロラクチン、胎盤ラクトゲン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド性腺刺激ホルモン放出ホルモン；インヒビン；アクチビン；ミュラー阻害物質；及びトロンボポエチンなどがある。本明細中で用いるように、ホルモンなる用語は、天然源由来又は組み換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列ホルモンの生物学的活性な相当物、例えば合成して産生した小分子成分及び製薬的に許容可能な誘導体及びその塩類が含まれる。
「増殖因子」なる用語は増殖を促進するタンパク質を表し、例えば、肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；血管内皮増殖因子；神経成長因子、例えばＮＧＦ-β；血小板由来増殖因子；トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)、例えばＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β；インスリン様成長因子-I及び-II；エリトロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β、及び-γ；及び、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)、顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)などがある。本明細書中で用いられる、増殖因子なる用語には、天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列増殖因子の生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。
「インテグリン」なる用語は、細胞の細胞外基質への結合と応答の両方をさせるレセプタータンパク質であり、創傷治癒、細胞分化、腫瘍細胞のホーミング及びアポトーシスなどの様々な細胞性機能に関与するものを表す。これらは細胞-細胞外基質及び細胞間相互作用に関与する細胞接着レセプターの大きなファミリーの一部である。機能的なインテグリンは、α及びβと称する２つの膜貫通性グリコプロテインサブユニットから成り、非共有的に結合している。βサブユニットのように、αサブユニットはすべて互いにいくらかの相同性がある。レセプターは常に１のα鎖及び１のβ鎖を含有する。例えば、α６β１、α３β１、α７β１、ＬＦＡ-１などがある。本明細書中で用いられる、インテグリンなる用語には、天然源由来あるいは組換え細胞培養物由来のタンパク質及び天然配列インテグリンの生物学的に活性な等価物、例えば合成して産生された小分子構成要素及び製薬的に受容可能な誘導体及びその塩類を含む。
「ＴＮＦアンタゴニスト」又は「ＴＮＦインヒビター」は、本明細書中では、インビトロ、インサイツ、及び／又は好ましくはインビボでのＴＮＦα活性を低減する、ブロックする、阻害する、無効にする、又は干渉する分子として定義される。このような薬剤は、一般にＴＮＦαに結合してその活性を中和することによってＴＮＦαの生物学的な機能をある程度阻害する。また、好適なＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦのＲＮＡ、ＤＮＡないしはタンパク質合成、ＴＮＦα放出、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達、膜ＴＮＦα切断、ＴＮＦα活性、及びＴＮＦα産生及び／又は合成を低減、ブロック、無効、干渉、阻止、及び／又は阻害することができる。このようなＴＮＦアンタゴニストには、限定するものではないが、抗ＴＮＦα抗体、その抗原結合断片、ＴＮＦαへの結合時に、哺乳動物のＴＮＦαを発現する細胞を破壊するか枯渇する、及び／又はこれら細胞の一又は複数の機能を干渉する、ＴＮＦαに特異的に結合する特定の変異体ないしドメイン、可溶性ＴＮＦレセプター(例えばｐ５５、ｐ７０又はｐ８５)ないしは断片、その融合ポリペプチド、小分子ＴＮＦアンタゴニスト、例えばＴＮＦ結合プロテインＩ又はＩＩ(TBP-I又はTBP-II)、nerelimonmab、CDP-571、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRATM)、CDP-571、CDP-870、アフェリモマブ、レネルセプトなど)、その抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合するレセプター分子、ＴＮＦα合成、ＴＮＦα放出又は標的細胞に対する作用を阻止及び／又は阻害する化合物、例えばサリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼインヒビター(例えば、ペントキシフィリンおよびロリプラム)、Ａ２ｂアデノシンレセプターアゴニスト、およびＡ２ｂアデノシンレセプターエンハンサー、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達を阻止及び／又は阻害する化合物、例としてマイトジェン活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼインヒビター、膜ＴＮＦα切断をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばメタロプロテイナーゼインヒビター、ＴＮＦα活性をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばアンジオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒビター(例えばカプトプリル)、及びＴＮＦα産生及び／又は合成をブロック及び／又は阻害する化合物、例えばＭＡＰキナーゼインヒビターが含まれる。好適なアンタゴニストには抗体又はイムノアドヘシンが含まれる。本明細書中に具体的に包含されるＴＮＦアンタゴニストの例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、及びアダリムマブ(HUMIRATM)である。
本明細書中の「腫瘍壊死因子α」又は「ＴＮＦα」又は「ＴＮＦアルファ」は、Pennica et al., Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal et al., J. Biol. Chem., 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含むヒトＴＮＦα分子を指す。
「インテグリンアンタゴニスト」は、例えばインテグリンに対する抗体を含む、任意のメカニズムによってインテグリンを阻害するか又は拮抗する分子である。本明細書中の「インテグリンアンタゴニスト又は抗体」の例として、ＬＦＡ-１抗体、例としてGenentechから市販のエファリズマブ(RAPTIVA(登録商標))、又は他のＣＤ１１／１１ａ及びＣＤ１８抗体、又はα４インテグリン抗体、例としてBiogenから入手可能なナタリズマブ(ANTEGREN(登録商標))、又は、ジアザサイクリックフェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／８９４１０号)、フェニルアラニン誘導体(国際公開第２００３／７０７０９号、国際公開第２００２／２８８３０号、国際公開第２００２／１６３２９号及び国際公開第２００３／５３９２６号)、フェニルプロピオン酸誘導体(国際公開第２００３／１０１３５号)、エナミン誘導体(国際公開第２００１／７９１７３号)、プロパン酸誘導体(国際公開第２０００／３７４４４号)、アルカノン酸誘導体(国際公開第２０００／３２５７５号)、置換型フェニール誘導体(米国特許第６６７７３３９号及び同第６３４８４６３号)、芳香族アミン誘導体(米国特許第６３６９２２９号)、ＡＤＡＭディスインテグリンドメインポリペプチド(米国公開公報２００２／００４２３６８号)、αｖβ３インテグリンに対する抗体(欧州特許第６３３９４５号)、アザ架橋された二環式アミノ酸誘導体(国際公開第２００２／０２５５６号)などが含まれる。
ここで補助治療として用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書中で治療される哺乳動物の免疫系を抑制する又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、２-アミノ-６-アリル-５-代替ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照)；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル；タクロリムス、糖質ステロイド、例としてコルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例としてシクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；trocade(Ｒｏ３２−３５５)；末梢シグマレセプターアンタゴニスト、例えばＩＳＲ−３１７４７；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド (米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質ステロイド類似体などのステロイド、例としてプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、例えばSOLU-MEDROL(登録商標) メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、リメキソロン及びデキサメタゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例としてメトトレキサート(経口又は皮下)；クロロキン及びヒドロキシクロロキンなどの抗マラリア剤；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン放出インヒビター、例えばＳＢ−２１０３９６及びＳＢ−２１７９６９モノクローナル抗体及びＭＨＣ ＩＩアンタゴニスト、例えばＺＤ２３１５；ＰＧ１レセプターアンタゴニスト、例えばＺＤ４９５３；ＶＬＡ４接着ブロッカー、例えばＺＤ７３４９；抗サイトカイン又は抗サイトカインレセプター抗体、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、インターロイキン−１(ＩＬ−１)ブロッカー、例えば組み換えＨｕＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｂインヒビター、抗インターロイキン２(ＩＬ-２)抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；ＩＬ−２融合毒素；抗Ｌ３Ｔ４抗体；レフルノミド；異種性抗リンパ球グロブリン；ＯＰＣ−１４５９７；ＮＩＳＶ(免疫応答モディファイヤー)；必須脂肪酸、例えばγリノレン酸又はエイコサペンタイン酸；ＣＤ−４ブロッカー及びパンＴ抗体、好ましくは抗ＣＤ３ないしは抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；同時刺激モディファイヤー(例えばＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合、ABATACEPTTMとしても知られる)；抗インターロイキン６(ＩＬ-６)レセプター抗体及びアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(国際公開第９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＩＬ−１０；トランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦ-β)；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；enlimomab；CDP-855；PNPインヒビター；CH-3298；GW353430；4162W94、クロランブシル；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner等, Science 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号)；ＢＡＦＦ抗体及びＢＲ３抗体などのＢＡＦＦアンタゴニスト；ｚＴＮＦ４アンタゴニスト(Mackay及びMackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002))；Ｔ細胞ヘルパーシグナルを阻害する生物学的な薬剤、例として抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)、例えばＣＤ４０-ＣＤ４０リガンドに対する阻止抗体(例えば、Durie等, Science, 261: 1328-30 (1993)；Mohan等, J. Immunol., 154: 1470-80 (1995))及びＣＴＬＡ４-Ｉｇ(Finck等, Science, 265: 1225-7 (1994))；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。本明細書中に記載のいくつかの好適な免疫抑制剤には、シクロホスファミド、クロランブシル、アザチオプリン、レフルノミド、ＭＭＦ又はメトトレキサートが含まれる。
「疾患変更性抗リウマチ剤」又は「ＤＭＡＲＤ」の例には、クロロキン、ヒドロキシクロロキノン、ｍｙｏｃｒｉｓｉｎ、オーラノフィン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ(プラス経口及び皮下用メトトレキセート)、アザチオプリン、Ｄ-ペニシラミン、ゴールド塩類(経口)、ゴールド塩類(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリンＡ及び局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ(Goodyear 及びSilverman, J. Exp. Med., 197, (9), p1125-39 (2003))、これらの塩類及び誘導体を含むものなどがある。
「Ｂ細胞」は骨髄内で成熟するリンパ球であり、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、又はエフェクターＢ細胞(プラズマ細胞)などがある。本明細書中のＢ細胞は正常又は非悪性のＢ細胞でもよい。
本明細書中の「Ｂ細胞表面マーカー」又は「Ｂ細胞表面抗原」は、それに対して結合するアンタゴニストによって標的とされうるＢ細胞の表面上に発現される抗原である。例示的なＢ細胞表面マーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面マーカーが含まれる(解説について、The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New Yorkを参照のこと)。他のＢ細胞表面マーカーには、ＲＰ１０５、ＦｃＲＨ２、Ｂ細胞ＣＲ２、ＣＣＲ６、Ｐ２Ｘ５、ＨＬＡ-ＤＯＢ、ＣＸＣＲ５、ＦＣＥＲ２、ＢＲ３、Ｂｔｉｇ、ＮＡＧ１４、ＳＬＧＣ１６２７０、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＡＴＷＤ５７８、ＦｃＲＨ３、ＩＲＴＡ１、ＦｃＲＨ６、ＢＣＭＡ、及び２３９２８７が含まれる。好適なＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比較してＢ細胞上に優先して発現されており、前駆体および成熟Ｂ細胞上に発現されてもよい。最も好適な前記マーカーはＣＤ２０およびＣＤ２２である。
「ＣＤ２０」抗原又は「ＣＤ２０」は、末梢血又はリンパ系器官に由来するＢ細胞の９０％以上の表面にみられるおよそ３５ｋＤａの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞だけでなく悪性のＢ細胞上にも存在し、幹細胞には発現しない。ＣＤ２０を意味する文献中での他の名称には、「Ｂリンパ球限定抗原(B-lymphocyte-restricted antigen)」及び「Ｂｐ３５」などがある。ＣＤ２０抗原は、例としてClark等 PNAS (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。好適なＣＤ２０は非ヒト霊長類又はヒトのＣＤ２０であり、最も好ましくはヒトＣＤ２０である。
ＢＬ-ＣＡＭ又はＬｙｂ８としても知られる「ＣＤ２２」抗原又は「ＣＤ２２」は、およそ１３０ｋＤ(還元型)から１４０ｋＤ(非還元型)の分子量を有するタイプ１完全膜糖タンパク質である。それはＢリンパ球の細胞質及び細胞膜に発現される。ＣＤ２２抗原は、Ｂ細胞リンパ球分化の初めにＣＤ１９抗原とおよそ同じ段階で現れる。他のＢ細胞マーカーと異なり、ＣＤ２２膜発現は成熟Ｂ細胞(ＣＤ２２＋)とプラズマ細胞(ＣＤ２２−)の間の後期分化段階に限定される。ＣＤ２２抗原は、例えば、Wilson 等 J. Exp. Med. 173: 137 (1991)及びWilson 等 J. Immunol. 150:5013 (1993)において記述されている。
「Ｂ細胞表面マーカーに対する抗体」とは、Ｂ細胞表面マーカーに結合し、例えば、Ｂ細胞に誘導される体液性反応を低減又は阻害することによって、哺乳動物のＢ細胞を破壊又は枯渇させる、及び／又は一以上のＢ細胞機能を妨げる抗体である。好ましくは、アンタゴニストは、それによって治療される哺乳動物のＢ細胞を枯渇する(すなわち、循環中のＢ細胞レベルを下げる)ことができる。そのような枯渇は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)、Ｂ細胞増殖の阻害及び／又はＢ細胞死の誘導(例えば、アポトーシスを介する)等の多様な機能を介して達成されるであろう。
ＣＤ２０抗体の例には以下のものが含まれる：現在では「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５，７３６，１３７号)及びＣＤ２０への結合能を保持するその断片；「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」ゼバリン(登録商標)と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体、IDEC Pharmaceuticals, Inc.から市販(米国特許第５，７３６，１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８としてＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」またはCorixaから市販の「ヨードＩ131 Tositumomab」抗体(BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５，５９５，７２１号も参照のこと)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及びそれらの変異体、例として「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公報０３／００２６０７, Leung, S；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第５，６７７，１８０号)；ヒト化２Ｈ７(国際公報2004/056312 (Lowman 等)及び以下に挙げるもの)；Ｂ細胞の細胞膜のＣＤ２０分子を標的としたｈｕＭａｘ-ＣＤ２０ＴＭ完全ヒト、高親和性抗体(Genmab, Denmark；例としてGlennie及びvan de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)とCragg 等, Blood 101: 1045-1052 (2003)を参照)；国際公報２００４／０３５６０７(Teeling 等)に記載のヒトモノクローナル抗体；ＡＭＥ-１３３ＴＭ抗体(Applied Molecular Evolution)；ＧＡ１０１(GlycArt；米国公開2005/0123546)；キメラ又はヒト化Ａ２０抗体(それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０)などのＡ２０抗体又はその変異形(米国公開番号２００３／０２１９４３３、免疫医学)；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手のモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, 440頁, Oxford University Press (1987))。本明細書中の好適なＣＤ２０抗体は、キメラＣＤ２０抗体、ヒト化ＣＤ２０抗体またはヒトＣＤ２０抗体、より好ましくはリツキシマブ、ヒト化２Ｈ７、キメラないしはヒト化Ａ２０抗体(Immunomedics)、及びＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ ヒトＣＤ２０抗体(Genmab)である。
本明細書中の「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝的に操作したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、出典明記によって本明細書中に組み込まれる米国特許第５７３６１３７号に記載の「Ｃ２Ｂ８」を表すものであり、ＣＤ２０を結合する能力を有するその断片を含む。
単に本願明細書中の目的のために、特別に明記しなければ、「ヒト化２Ｈ７」は、ヒト化ＣＤ２０抗体又はその抗原結合断片を意味し、該抗体がインビボで霊長類のＢ細胞を枯渇させる効果を有する。抗体には、米国公開2006/0062787及びその図に記載のものが含まれ、米国公開2006/0188495に示される配列を有する抗体が含まれる。また、米国公開2006/0034835及び米国公開2006/0024300も参照のこと。本発明の様々な好適な実施態様をまとめると、米国公開2006/0062787に開示される２Ｈ７バージョン１６に基づく変異体のＶ領域は、以下の表に示すアミノ酸置換の位置以外はｖ１６のアミノ酸配列であるだろう。特に明記しない限りは、２Ｈ７変異形はｖ１６のＬ鎖と同じである。
Figure 2017048190
好適なヒト化２Ｈ７はバージョン１６、又は上記のいずれかのバージョンの配列を有するインタクト抗体又は抗体断片である。
本明細書中の「ＢＡＦＦアンタゴニスト」はＢＡＦＦ又はＢＲ３の活性をブロックする任意の分子である。これらには、ＢＡＦＦを結合するＢＲ３、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの一部を含むイムノアドヘシン、又はＢＡＦＦを結合するその変異体が含まれる。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＢＡＦＦ抗体である。「ＢＡＦＦ抗体」は、ＢＡＦＦを結合する抗体であり、好ましくは該抗体はヒトＢＡＦＦの残基１６２−２７５を含むヒトＢＡＦＦの領域内でＢＡＦＦを結合する。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＢＲ３抗体である。「ＢＲ３抗体」はＢＲ３を結合する抗体であり、好ましくはヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むヒトＢＲ３の領域内でＢＲ３を結合するものである。ヒトＢＡＦＦ及びヒトＢＲ３の配列は、例えば米国公開2006/0062787に見られる。ＢＡＦＦ結合ポリペプチド又はＢＡＦＦ抗体の他の例は、例えば国際公開2002/092620、国際公開2003/014294、Gordon et al., Biochemistry 42(20):5977-5983 (2003)、Kelley et al., J. Biol. Chem.,279(16):16727-16735 (2004) 、国際公開1998/18921、国際公開2001/12812、国際公開2000/68378、及び国際公開2000/40716に見られうる。
「抗ＩｇＥ抗体」には、ＩｇＥがマスト細胞及び好塩基球上の高親和性レセプターに結合したときに架橋結合を引き起こさない様式でＩｇＥに特異的に結合する任意の抗体が含まれる。例示的な抗体には、本発明の抗体並びにｒｈｕＭａｂＥ２５(Ｅ２５、ＸＯＬＡＩＲ(登録商標))、Ｅ２６、Ｅ２７、並びにＣＧＰ-５１０１(Ｈｕ-９０１)およびＨＡ抗体が含まれる。ヒト化抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５、Ｅ２６およびＥ２７の重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、例えば米国特許第６１７２２１３号および国際公開９９／０１５５６に開示される。ＣＧＰ-５１０１(Ｈｕ-９０１)抗体は、Corne et al., (1997) J. Clin. Invest. 99(5): 879-887、国際公開９２／１７２０７およびＡＴＣＣ寄託番号ＢＲＬ−１０７０６、ＢＲＬ−１１１３０、ＢＲＬ−１１１３１、ＢＲＬ−１１１３２およびＢＲＬ−１１１３３に記載されている。ＨＡ抗体は、ＵＳＳＮ６０／４４４２２９、国際公開２００４／０７００１１および国際公開２００４／０７００１０に記載されている。
ＩＩ．本発明を実施するための様式
Ａ．組み換え調製
本発明の抗体は技術とすぐに入手可能な材料を用いて組み換えて生成することができる。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離されるか合成されて、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
(１) シグナル配列成分
この発明の抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
(２) 複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
(３) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞(例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６)である。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
(４) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(５) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
(６) 転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(７) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(８) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(９) 抗体精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
Ｂ．抗体の調製
１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。用いられるアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルLipid A、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。免疫の方法は、過度の実験をすることなく当業者によって選択することができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
２）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団から得られるが、つまり、該集団を含む個々の抗体は、少量存在する起こりうる自然発生的突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。従って、「モノクローナル」という形容詞は、別個の抗体の混合物ではないとの抗体の特徴を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はハムスターなどのその他の適当な宿主動物を上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
免疫化剤は、典型的には抗原タンパク質又はそれらの融合変異型を含む。一般には、ヒト起源の細胞が望まれる場合において末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が用いられるか、又は非ヒト哺乳動物ソースが望まれる場合において脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられるかのいずれかである。次に、リンパ球を、ハイブリドーマ細胞を調製するためにポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press (1986), pp.59-103。
通常、不死化細胞はトランスフォームされた哺乳動物細胞であり、実用的にはげっ歯類、ウシ及びヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスミエローマ細胞株が用いられる。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親のミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失する場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有することになろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性の細胞である。これらの中でも、好ましいミエローマ株化細胞は、マウスミエローマ株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAより入手し得るＭＯＰC-２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAより入手し得るＳＰ-２細胞由来のものである。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
ハイブリドーマ細胞を培養している培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定できる。このような技術及びアッセイは当業者に周知である。結合親和性は、例えば、Munsonら., Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, 上掲)。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等のような従来の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離することができる。
また、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号などに記載される及び前述に記載のような組み換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、定法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に分離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一度単離されれば、該ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次に、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は他にイムノグロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
さらなる実施態様では、抗体は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離について記述している。次の刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、該ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又はイムノグロブリンコード配列に非イムノグロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。典型的には、かかる非イムノグロブリンポリペプチドは抗体の定常領域の代わりに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有するある抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
ここに示すモノクローナル抗体は一価性であり、その調整方法は当業者に周知である。例えば、免疫グロブリンの軽鎖及び修飾重鎖の組み換え発現を伴う方法がある。一般的に重鎖はＦｃ領域の任意の場所で切断して重鎖の交差組み換え（クロスリンク）を予防する。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基に置き換えたり、交差組み換えを防ぐために欠損させてもよい。また、一価抗体の調製に好適なインビトロの方法がある。当業者によくある技術を用いて抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生することができる。
また、キメラ又はハイブリッド抗体はクロスリンク剤を伴う方法を含む合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロにおいても調製される。例えば、免疫毒素はジスルフィド置換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成させることにより構築される。当該目的にとって適切な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
３）ヒト化抗体
本発明の抗体には、さらにヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒトイムノグロブリン由来の最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒトイムノグロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、また典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、この場合、ＣＤＲ領域の全て若しくは実質的に全てが、非ヒトイムノグロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て若しくは実質的に全てが、ヒトイムノグロブリンコンセンサス配列である。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトのイムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的には、Winter及び共同研究者、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)の方法に従うか、又は齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することにより実施される。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受容される。Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987)。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる。Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993)。
さらに、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持したまま、抗体をヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法に従って、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析過程によりヒト化抗体を調製する。三次元イムノグロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補イムノグロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を観察することで、候補イムノグロブリン配列の機能における残基の想定され得る役割の分析、すなわち候補イムノグロブリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体の様々な形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１抗体であってもよい。
４）ヒト抗体
ヒト化の代わりにヒト抗体を産生することができる。例えば、内在性のイムノグロブリン産生がない状態で、ヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例としてJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号及び国際公開９７／１７８５２を参照。
あるいは、ファージディスプレイ技術を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227:381(1991)。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして表出する。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
また、Cole等及びBoerner等の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985）及びBoerner等, J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)）。同様に、トランスジェニック動物、例えば、内在性のイムノグロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されているマウスなどに、ヒトイムノグロブリン遺伝子座を導入することによりヒト抗体を作製することができる。免疫すると、遺伝子再構成、構築及び抗体レパートリーを含め、あらゆる観点においてヒトで観察されるものと近似したヒト抗体の産生が観察される。本アプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；5,545,806号、5,569,825号,、5,625,126号、5,633,425号、5,661,016号及び以下の特定の刊行物中に記載されている：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)、Fishwild等, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern, Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。
最後に、また、ヒト抗体は活性化Ｂ細胞によりインビトロで産生してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照）。
５）抗体フラグメント（抗体断片）
ある状況では、全抗体を用いるよりもむしろ抗体フラグメントを用いる方が有利なことがある。より小さいサイズのフラグメントは急速にクリアランスを受け、固形腫瘍にアクセスしやすい。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体フラグメントはすべて大腸菌内で発現され分泌されるため、これらフラグメントを大量に産生することが容易である。抗体フラグメントは上記した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'-ＳＨフラグメントは大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２フラグメントを形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２は米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
６）抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、本発明の方法に有用な酵素には、グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒトリゾチーム、ヒトグルクロニダーゼ、ホスフェート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリルサルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２及びカルボキシペプチダーゼＡ）及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なβガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体は、本発明のプロドラッグを、遊離の活性薬剤に変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば前述部分で検討したヘテロ二官能性クロスリンク剤を使用することにより、ここに示すポリペプチド又は抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えば、Neuberger等, Nature 312:604-608 (1984)を参照のこと)。
７）二重特異性及び多重特異性抗体
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、同じまたは異なるタンパク質上のエピトープを含む少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。あるいは、一つのアームは標的抗原に結合するものであり、他方のアームは、白血球上のトリガー分子、例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ３）又はＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）のＦｃレセプターに結合して、標的抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機能を集中及び局在化させることができる。このような抗体は、全長抗体又は抗体又は抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)から誘導することができる。
また、標的抗原を発現する細胞に細胞障害性剤を局在化させるために二重特異性抗体を用いてもよい。そのような抗体は、所望の抗原に結合するアームと細胞障害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン-ａ、ビンカアルコロイド（vinca alkoloid）、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性活性同位体ハプテン）に結合するアームを持つ。周知の二重特異性抗体の例には、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩＩＩ (国際公開９６／１６６７３)、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩ (米国特許第 ５８３７２３４)、抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３ (米国特許第５８２１３３７)がある。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野において知られている。全長二重特異性抗体の従来の生産は、二つのイムノグロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づいているが、この場合二つの鎖は異なる特異性を持っている。Millstein等, Nature, 305:537-539(1983)。イムノグロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうち一つだけが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる目的の分子の精製はかなり煩雑で、収率は低い。同様の方法がWO93/08829及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なるアプローチにより、望ましい結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)をイムノグロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は、好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインと行われる。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。イムノグロブリン重鎖の融合、望まれるならばイムノグロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、構築に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率である場合、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がない場合は、２または３全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、WO94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開９６／２７０１１又は米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体に再転換して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
Ｆａｂ'フラグメントを直接大腸菌から回収して、これは化学的に結合させて二重特異性抗体を形成してもよい。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
また、組換え細胞培養から直接的に二価抗体断片を作成し単離する様々な技術も記述されている。例えば、二価ヘテロ二量体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性／二価抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、短かすぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成ができないリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は対象の分子上の２つの異なるエピトープ上に結合する。あるいは、抗タンパク質アームは、細胞の防御機構を特定のタンパク質を発現する細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ２８又はＢ７）、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）等の白血球上の誘因分子に結合するアームと組合わせてもよい。また、二重特異性抗体を特定のタンパク質を発現する細胞に細胞障害性薬剤を局在化させるために用いてもよい。そのような抗体は、タンパク質−結合アーム、及び細胞障害性薬剤又はＥＯＴＵＢＥ，ＤＰＴＡ，ＤＯＴＡ，ＴＥＴＡなどの放射性核種キレート剤に結合するアームを保持する。その他の目的たる二重特異的抗体は、対象のタンパク質に結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
８）多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
９）ヘテロコンジュゲート抗体
また、ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体はアビジンに結合し、他方はビオチンに結合可能である。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせることが、米国特許第４６７６９８０号、及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている。国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号。該抗体は、クロスリンク剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は簡便なクロスリンク法を用いて作製してもよい。好適なクロスリンク剤は当業者に周知であり、クロスリンク技術の番号と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
１０）エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、癌治療の際の抗体の効果を亢進させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
１１）イムノコンジュゲート(免疫複合体)
また、本発明は、化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）とコンジュゲートしている抗体を含むイムノコンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)に関する。このようなＡＤＣは許容可能な安全性質を示さなくてはならない。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、例えば癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体-薬剤コンジュゲートを用いると（Syrigos及びEpenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999)；Niculescu-Duvaz及びSpringer, Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172 (1997)；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤部分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Baldwin等, Lancet, 603-05 (1986)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等（編）, pp. 475-506 (1985)）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている（Rowland等, Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87 (1986)）。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒、ゲルダナマイシン（Mandler等, J. Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581 (2000)；Mandler等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000)；及びMandler等, Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)）、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号；Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623 (1996)）、及びカリケアマイシン（Lode等, Cancer Res., 58:2928 (1998)；Hinman等, Cancer Res., 53:3336-3342 (1993)）などの小分子毒素などのが含まれる。いかなる理論にも制限されることなく、該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含むメカニズムにより、その細胞障害性及び細胞分裂停止性効果を発揮しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
そのような免疫複合体の生成の際に有用な化学治療剤にはＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アドリアマイシン及び５-フルオロウラシルが含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992))。
更に、小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号）、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５も、本発明の製剤に使用する包合可能な毒素と考えられる。一実施態様では、完全長抗体又はその抗原結合断片は一又は複数のメイタンシノイド分子（例えば、抗体分子当たり約１〜約１０メイタンシノイド分子）と結合できる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。天然源からの単離又は化学的に調製したメイタンシノイドには、メイタンシン、メイタンシナール及び誘導体と、例として米国特許第５，２０８，０２０号及びここに挙げた文献（ｃｏｌ．２、５３行目からｃｏｌ．３、１０行目を参照）及び米国特許第３８９６１１１号及び同第４１５１０４２号に記載の類似体が含まれる。また、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの調整方法は米国特許第5,208,020号にも記載されている。好ましい実施態様では、メイタンシノイドはジスルフィド又は他の硫黄含有リンカー基を介して抗体に結合する。例えば、メイタンシンをMay-SS-Meに変換し、それをMay-SH3に還元して、修飾抗体に再作用させてメイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを生成してもよい。Chari等, Cancer Res. 52: 127-131 (1992)。抗体は周知の方法にて修飾し、ついで遊離型又は保護したチオール基を含む抗体をメイタンシノイドを含むジスルフィドに再作用させてコンジュゲートを生成する。抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害活性は周知の方法及びIC50決定法によりインビボ又はインビトロで測定できる。
カリケアマイシンは対象となるもう一つの免疫コンジュゲートである。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998))が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
抗体と核溶解活性（例えば、リボヌクレアーゼ又は、デオキシリボヌクレアーゼやＤＮアーゼ等のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する化合物の間で形成される免疫コンジュゲートも考えられる。
本発明のＡＤＣにおいて、リンカー（Ｌ）を介して、抗体（Ａｂ）を、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：（１）共有結合を介してＡｂ-Ｌを形成し、その後に薬剤部分Ｄと反応させるための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び（２）共有結合を介してＤ-Ｌを形成し、その後に抗体の求核基と反応させるための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ 式Ｉ
抗体上の求核基は、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
また、本発明の抗体-薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入することによって生成してよく、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤（Domen等, J. Chromatog., 510:293-302 (1990)）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。別の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する（Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem., 3:138-146 (1992)；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基は、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸、及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含む、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル、及びアリールヒドラジド基。
別法として、抗体及び細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする各領域を含有する。
さらに別の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、次いで細胞障害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
本明細書に記載のＡＤＣは、あるいは、架橋剤、例えば市販（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより）のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、スルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル-（４-ビニルスルホン）安息香酸塩）を用いて調製される。Applications Handbook and Catalog, 467-498ページ, 2003-2004を参照。
また、抗体は高い放射活性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例として、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｉ１３１、Ｉｎ１３１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ｎｍｒ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含むなど適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばＴｃ９９又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN（登録商標）法は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)。放射性核種の他の方法は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
別法として、抗体及び細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
１２）他のアミノ酸配列修飾
本発明の抗体およびポリペプチドのアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。本発明の抗体およびポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、それらをコードする核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、本発明の抗体およびポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有するとするならば、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終コンストラクトに達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの、本発明の抗体およびポリペプチドの翻訳後プロセスを変更しうる。
突然変異誘発の好ましい位置である本発明の抗体およびポリペプチドの所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と抗原（例として抗組織因子抗体）との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗体又はポリペプチド変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体ないしポリペプチド又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗ＡＡＴＦ抗体ポリペプチドの他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗ＡＡＴＦ抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体又はポリペプチド分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
表Ａ
アミノ酸置換
Figure 2017048190
ポリペプチドおよび抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の親水性：cys、ser、thr、
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
抗体ないしポリペプチドの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特にここでの抗体は抗体断片、例としてＦｖ断片である）。
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗組織因子抗体の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
本発明の抗体およびポリペプチドのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された変異体又は本発明の抗体およびポリペプチドの非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
１３）他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここに組み込まれる。例えば、抗体を種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共ポリマーに結合させてもよい。また、抗体は、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術及び他の好適な製剤はRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)に開示されている。
Ｃ．薬理学的製剤
治療用製剤は任意の製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより、調製され保管される(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990])。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、異性重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張剤(isotonicifier)、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；ＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は非イオン性界面活性剤を含む。
治療剤として抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持した抗体断片又はペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
緩衝液（バッファ）は、特にｐＨに依存して安定する場合に、治療的有効性が最適になる範囲にｐＨを調節するために用いる。緩衝液は約５０ｍＭから２５０ｍＭの濃度範囲であるのが好ましい。本発明の使用のために好適な緩衝剤には、有機及び無機酸の両方とそれらの塩が含まれる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。更に、緩衝液はトリスのようなヒスチジン及びトリメチルアミンからなり得る。
防腐剤（保存剤）は細菌の成長を遅らせるために一般的に０．２％−１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で添加される。本発明の使用に好適な保存剤には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化合物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチル及びベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。
時に「安定剤」としても知られる緊張剤は、液体成分の緊張性を調節又は維持するためにある。タンパク質や抗体のような大きな、荷電した生体分子と共に用いる場合、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用して分子内及び分子間相互作用を潜在的に減少させるのでたびたび「安定剤」と呼称される。緊張剤は重量にして０．１％〜２５％、好ましくは１〜５％の間で、他の成分との相対的な量を考慮して任意の量で加える。緊張剤には、多価糖質アルコール類、好ましくは三水素又はより高い糖質アルコール類、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。
更なる賦形剤には、以下のうちの一以上の役割をする薬剤が含まれる：（１）充填剤、（２）溶解亢進剤、（３）安定剤及び（４）変性や容器壁への付着を防止する作用剤。安定剤は活性なタンパク質又は抗体の重量当たり０．１〜１００００分の１の範囲で加えることができる。一般的な安定剤には：多価糖質アルコール類（上記を列挙した）；アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、その他；有機糖質または糖質アルコール類、例えば蔗糖、ラクトース、ラクチトール(lactitol)、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイノシトース(myoinisitose)、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール）；硫黄を含んでいる還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコール酸塩、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びナトリウムチオ硫酸塩；低分子量のタンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、ブドウ糖）；二糖類（例えばラクトース、マルトース、蔗糖）；三糖類（例えばラフィノース）；及び多糖類（例えばデキストリンまたはデキストラン）が含まれる。
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）は、攪拌誘導性凝集から治療的タンパク質を保護するだけでなく治療的薬剤を溶解するのを促進し、それによって製剤が曝され、活性な治療的タンパク質又は抗体の変性の原因となることなく表面ストレスを剥奪する。非イオン性界面活性剤は約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で加える。
好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０，４０，６０，６５，８０，等）、ポリオキサマー（１８４，１８８，等）、ピューロニック(Pluronic)（登録商標）、ポリオルズ(polyols)、トリトン（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（トゥイーン（登録商標）−２０、トゥイーン（登録商標）−８０、等）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化されたヒマシ油１０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用可能な陰イオン洗剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート及びジオクチルナトリウムスルホン酸塩が含まれる。陽イオン洗剤には、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれる。
製剤をインビボ投与に用いるために、滅菌しなければいけない。滅菌濾過膜に濾過することによって製剤を無菌的に精製してもよい。ここでいう医薬組成物は一般的に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、静脈溶液バッグ又は皮下注射針によって穴を開けることができる栓を有するバイアルに納めてある。
投与方法は公知で適応できる方法に従う、例として、単回又は複数回のボーラス投与、又は好適な方法での長時間をかけての輸液、例えば、皮下、静脈内、腹膜内、筋肉内、動脈内、病巣内、関節内による注入又は輸液、局所投与、吸入、又は持続的除放あるいは伸展的除放方法による。
また、ここでいう製剤は、治療する特定の症状に必要な一以上の活性な化合物、好ましくはお互い悪影響を示さない相補的活性を有する化合物を含んでよい。あるいは又は加えて、化合物は細胞障害性剤、サイトカイン又は成長阻害性剤を含んでよい。そのような分子は意図する目的に有効な量で適切に組み合わせる。
また、活性成分は、例としてコアセルベーション技術または界面重合法により調製したマイクロカプセル、例として、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）における又はマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタクリラート）マイクロカプセルに包含してよい。これらの技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示されている。
ここで開示したタンパク質及び抗体の安定性は、非毒性の「水溶性多価金属塩」の使用により亢進されるであろう。例として、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、Ａｌ２＋、及びＡｌ３＋が含まれる。上記多価金属陽イオンと共に水溶性塩を形成する陰イオンの例には、無機酸及び／又は有機酸によって形成されるものが含まれる。このような水溶性塩は水（２０℃）に少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、或いは１００ｍｇ／ｍｌ、或いは２００ｍｇ／ｍｌの溶解度を持つ。
「水溶性多価金属塩」を形成するのに使用可能な好適な無機酸には、塩酸、酢酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸及びリン酸が含まれる。使用可能な好適な有機酸には、脂肪族カルボン酸及び芳香族の酸が含まれる。この定義の範囲内の脂肪族の酸は、飽和又は不飽和Ｃ２−９カルボン酸（例えば、脂肪族モノ-、ジ-及びトリ-カルボン酸）と定義してよい。例として、この定義の範囲内の例示的モノカルボン酸には、飽和Ｃ２−９モノカルボン酢酸(monocarboxylic acids acetic)、プロピオン酸、酪酸、バレリアン酸、カプロン酸、エナント酸、カプリルペラルゴン酸及びカプリオニック(capryonic)酸、及び不飽和Ｃ２−９モノカルボン酸アクリル(monocarboxylic acids acrylic)、プロピオン酸、メタクリル酸、クロトン酸及びイソクロトン酸が含まれる。例示的ジカルボン酸には、飽和Ｃ２−９ジカルボン酸マロン(dicarboxylic acids malonic)、コハク酸、グルタル酸、脂肪酸及びピメリン酸が含まれ、一方、不飽和Ｃ２−９ジカルボン酸にはマレイン酸、フマル酸、シトラコニック(citraconic)酸及びメサコン酸が含まれる。例示的トリカルボン酸には、不飽和Ｃ２−９トリカルボン酸トリカルバリル酸及び１,２,３-ブタネトリカルボキシル酸が含まれる。更にまた、この定義のカルボン酸は、ヒドロキシカルボン酸を形成するように一又は二の水酸基を持つ。例示的ヒドロキシカルボン酸には、グリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸が含まれる。この定義の範囲内の芳香族の酸は、安息香酸性及びサリチル酸酸を含む。
本発明のカプセル化ポリペプチドを安定化を亢進するために使用可能な一般的に用いられる水溶性多価金属塩には、例として：（１）ハロゲン化物（例えば塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩及びチオシアン酸塩の無機酸性金属塩類；（２）脂肪族カルボン酸金属塩（例えば酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、カルシウムプロピオン酸、亜鉛グリコール酸塩、カルシウム乳酸塩、亜鉛乳酸塩及び亜鉛酒石酸塩）；及び（３）ベンゾアートの芳香族のカルボン酸金属塩（例えば亜鉛ベンゾアート）及びサリチル酸塩が含まれる。
Ｄ．治療方法
疾患の予防又は治療のために、活性剤の適量は、上記のように治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び過程、予防を目的としてか治療を目的として薬剤を投与するのか、現在の治療法、患者の病歴、及び薬剤への反応、注意深い医師の判断により決定されるであろう。一時又は一連の治療を通じて患者に薬剤を好適に投与する。
好ましい治療方法は、ＩｇＥ媒介疾患の治療である。ＩｇＥ媒介疾患にはアトピー性疾患が含まれ、アトピー性疾患は多くの共通の天然に生じる吸入性及び経口摂取性の抗原と連続的に産生されるＩｇＥ抗体に対して免疫学的応答を遺伝的に起こすことに特徴がある。特定のアトピー性疾患には、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎及びアレルギー性胃腸疾患が含まれる。アトピー患者はたびたび複数のアレルギーをもつ、これは、花粉、真菌（例えば、カビ）、動物及び虫の死骸、とある種の食物に対するＩｇＥ抗体とそれによる症状を有することを意味する。
しかしながら、亢進したＩｇＥレベルに関する疾患は遺伝的（アトピー性）の原因のものに限らない。ＩｇＥ媒介性のようであり、本発明の製剤によって治療可能である亢進したＩｇＥレベルに関する他の疾患には、過敏症（例えば、アナフィラキシー性過敏症）、湿疹、蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫病、高ＩｇＥ症候群、毛細血管拡張性運動失調、ウィスコット-アルドリッヒ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫及び対宿主性移植片反応が含まれる。
アレルギー性鼻炎；アレルギー性鼻結膜炎又は枯草熱としても知られる、は、吸入性のアレルゲンに対する最も一般的なアトピー反応の症状であり、その重症度や持続期間はたびたびアレルゲンへの曝露の強度および長さに相関する。何歳でも発症しうるが、通常は小児期又は青年期に発症する慢性疾患である。典型的な発作は、おびただしい水性鼻漏、発作的なくしゃみ、鼻閉塞及び鼻と口蓋の痒みからなる。また、後鼻腔の粘液排出により咽頭炎、咽頭痰及び咳が起こる。また、結膜及び眼瞼の強い痒み、赤み、流涙及び羞明を伴うアレルギー性眼瞼結膜炎の症状もある。重症発作ではたびたび、全身性不快感、脱力感、疲労、時には激しいくしゃみの連続後の筋肉苦痛を伴う。
喘息；可逆的閉塞性気道疾患としても知られる、は、可逆的に自然発症するまたは治療が必要な呼吸器刺激及び気管支収縮剤化学物質に対する気道の過剰反応、喘鳴発作の発起、呼吸困難、胸部圧迫、及び咳に特徴付けられる。気道全体を含む慢性疾患であるが、時々の軽い一過性の発症から重い慢性の生命を脅かす気道閉塞まで重症度は様々である。喘息とアトピーは共存し、喘息患者の半分ほどはアトピーを持ち、さらに少ない割合のアトピー患者もまた喘息を持つ。アトピーと喘息は完全に非依存性のものであるが、特に小児期の間に、非アトピー性患者よりもアトピー患者により頻繁に喘息が起こる。さらに喘息は歴史的に２つのサブグループ、外因性喘息と内因性喘息に分けられている。
アレルギー性、アトピー性または免疫性喘息としても知られる外因性喘息は、通常、乳児期又は小児期の人生の初期に普遍的に喘息になった患者を指す。湿疹又はアレルギー性鼻炎を含むアトピーの他の症状は、たびたび共存する。喘息発作は、花粉の季節、動物の存在、ハウスダスト、羽毛枕又は他のアレルゲンへの曝露によって起こる。皮膚検査は原因となるアレルゲンに対して陽性の膨疹・発赤反応を示す。興味深いことに、全血清中のＩｇＥ濃度はしばしば上昇するが時に正常である。
非アレルギー性又は特発性喘息として知られる内因性喘息は、一般的には成人期の呼吸器感染症後又は顕性時期に最初に発症する。症状は、花粉の季節又は他のアレルゲンへの曝露に関係のない慢性又は再発性気管支閉塞を含む。皮膚検査では通常のアトピー性アレルゲンに陰性であり、血清中のＩｇＥ濃度は正常である。更なる症状には、痰血及び好酸球増加が含まれる。アスピリン感受性か、運動誘発性か、感染症か及び心理学的なものかなどの、喘息をサブグループに分類する他のスキームは、他の患者よりもある特定の患者に影響する外因性のトリガー因子を単に規定する。
最後に、重要なことには、歴史的に関連したＩｇＥ依存性のアレルギー性喘息のみを分類したものがあるが、現在では、ＩｇＥと喘息（アレルギー性及び非アレルギー性の両方）に相関関係を示す統計学的に有意なデータがあることを注記する。Chapter 27, 「The Atopic Diseases」, A.I. Terr in Medical Immunology, 9th Ed., Simon and Schuster, Stites等, 編集. (1997)。結果として、この明細書の目的としての「ＩｇＥ媒介疾患」の用語はアレルギー性及び非アレルギー性喘息の両方を含む。
喘息発作の身体的特徴には、呼吸促迫、聞こえる程度の喘鳴、及び呼吸の付属筋の使用が含まれる。また、速い脈拍と上昇した血圧が一般的にあり、末梢血及び鼻腔内分泌物中の好酸球レベルの上昇がある。肺機能では、流量及び１秒強制呼気量（ＦＥＶ１）の減少がみられる。全肺気量及び余剰肺気量は一般的に正常またはわずかに増加しているが、極度の気管支痙攣により減少しうる。
喘息の病理は即時型反応と遅発型反応に分けられる。即時型反応は、平滑筋収縮、浮腫及び分泌過多に特徴があり、一方後期反応は細胞性炎症に特徴がある。喘息は、感染症（例として、ウイルス性呼吸器感染症）、物理学的要因（例として、運動、過換気、深呼吸、心理的要因）、大気要因（例えば二酸化硫黄、アンモニア、冷気、オゾン、蒸留された水蒸気）、経口抗原（例えばプロプラノロール、アスピリン、非ステロイド性の抗炎症剤）、経験的吸入抗原（例えば高緊張の溶液、クエン酸、ヒスタミン、メタコリン、プロスタグランジンＦ２α）及び職業吸入抗原（例えばイソシアン酸塩）により引き起こされる。アレルギー性喘息の原因となる様々な更なる職業的または環境的アレルゲンには、動物産生物、昆虫粉塵、海生物、植物性製品、果物、種、葉及び花粉、有機染料及びインク、微生物薬品、酵素、治療薬、滅菌剤、無機及び有機化学製品が含まれる。
湿疹、神経皮膚炎、アトピー性湿疹または Besnier’s 痒疹としても知られているアトピー性皮膚炎は、アトピーの家族性及び免疫性特徴をもつ患者のサブセットに特異的な一般的な慢性皮膚疾患である。基本的な特徴は掻痒性真皮炎症性反応であり、それは特定の部位に対する偏向を有する左右対称的に分布した特徴的な皮膚の発疹を誘発する。また、高頻度にＢリンパ球からのＩｇＥ過剰産生がある。アトピー性皮膚炎はアレルギー性鼻炎及び喘息及び高ＩｇＥレベルが関与するのでアトピーの皮膚型として分類されるが、皮膚炎の重症度は必ずしも皮膚試験時のアレルゲンへの曝露に相関はしておらず、減感作（他のアレルギー疾患と異なって）は効果的な治療方法ではない。高血清ＩｇＥにより確実にアレルギー性喘息が診断され、正常値ではそれが除外される。疾患の発症はいつの年代でも起こり、病変は急性の紅斑性浮腫性丘疹又は鱗屑を有するプラークから始まる。かゆみにより滲出及び痂皮を生じて、慢性苔蘚化に至る。細胞レベルでは、急性病変は浮腫性であり、真皮に単核細胞であるＣＤ４リンパ球が浸潤している。好中球、好酸球、血漿細胞及び好塩基球はまれであるが、脱顆粒性肥満細胞は存在する。慢性病変は表皮過形成、角質増殖及び不全角化症を特徴とし、真皮には単核細胞、Langerhans’細胞及びマスト細胞が浸潤する。また、小型神経の神経周膜の関係を含む線維症の病巣領域がありうる。
好酸性胃腸疾患としても知られるアレルギー性胃腸疾患は、多数のＩｇＥ食物感受性が局所の消化管粘膜反応と関係している異常なアトピー性症状である。成人ではまれであり、乳児ではより一般的で一時的である。症状は摂取された食物アレルゲンが空腸粘膜の局所性ＩｇＥ抗体に反応して、マスト細胞伝達物質を解放するときに起こり、結果として食事の直後に胃腸症状となる。継続して曝露すると慢性的な炎症となり、結果として胃腸タンパク質損失及び低タンパク質性の(hypoproteinemic)浮腫になった。炎症性腸粘膜からの失血により、十分鉄欠乏症貧血症を引き起こしうる。アレルギー反応は、アレルゲン曝露後に上部消化管粘膜に局所的に起こり、アレルゲン回避により回復する。
アナフィラキシー及び蕁麻疹は明らかにＩｇＥ媒介性であるが、一般的な決定因子に欠け、アトピー性個体に偏向性はない。アナフィラキシーは急性で、さまざまな器官系、通常は心血管、呼吸器、皮膚及び胃腸が同時に関与する一般的なアレルギー反応である。反応は免疫学的な媒介であり、既に感作を受けている個体がアレルゲンに曝露すると起こる。蕁麻疹及び血管浮腫は、ヒスタミンが表在性皮膚血管上のレセプターを刺激した結果生じる物理的なはれあがり、紅斑及び掻痒感を指し、全身性アナフィラキシーの皮膚特徴である。全身性アナフィラキシーは、薬、昆虫毒物または食物から生じる、多数の器官に同時に起こるＩｇＥ-媒介反応である。それは急に、誘導されたアレルゲン、ＩｇＥを持つ肥満細胞によって生じ、さまざまな重要な器官の機能が深く致命的に変更される。必ずしも同じ程度とは限らないが、血管虚脱、急性気道閉塞、皮膚血管拡張及び浮腫、及び胃腸と尿生殖器の筋けいれんがほぼ同時に起こる。
アナフィラキシーの病理は、気道及び局所性の肺拡張不全の粘液性のつまりを伴う、血管浮腫及び高度に膨張した肺を含む。細胞レベルでは、気管支の粘膜下腺の分泌過多、粘膜及び粘膜下浮腫、気管支周囲の脈管うっ血、及び、気管支の壁の好酸球増加が、急性喘息発作中などに、同様に肺に現れる。肺水腫及び出血はありうる。気管支筋けいれん、高度膨張及びさらに肺胞の断裂もまた、起こりうる。ヒトアナフィラキシーの重要な特徴には、喉頭、気管、喉頭蓋及び下咽頭の基底膜の浮腫、脈管うっ血及び好酸球増加が含まれる。
アレルゲンへの曝露は、摂取、注射、吸入、又は皮膚または粘膜への接触を介するものでもよい。反応は、アレルゲンへの曝露の後、数秒または数分以内で始まる。初めにショック又は差し迫った死の感覚があり、その後に急速に一つ以上の標的器官系の症状が続く：心血管、呼吸器、皮膚及び胃腸。
アナフィラキシーに寄与するアレルゲンは、一般的にアトピーに関与するものとは異なる。食物、薬物、昆虫毒物又はゴム製品が一般的原因である。食物アレルゲンには、甲殻類、軟体動物（例えばロブスタ、エビ、カニ）、魚、マメ科植物（例えばピーナッツ、エンドウ、豆、甘草）、種（例えばゴマ、綿実、キャラウェー、マスター、フラックスシード、ヒマワリ）、ナッツ、ベリー、卵白、ソバ及び牛乳の中にあるものが含まれる。薬物アレルゲンは、異種タンパク質及びポリペプチド、つまり多糖類及びハプテン薬の中にあるものを含む。昆虫アレルゲンは、ミツバチ、スズメバチ(yellow jacket, hornet, wasp)及びフシアリを含む膜翅目昆虫を含む。
エピネフリンがアナフィラキシーのための代表的な処置である一方、抗ヒスタミン剤または他のヒスタミン遮断剤は一般的により重症でない蕁麻疹又は血管性浮腫反応に処方される。
Ｅ．併用療法
本発明の方法は、ＩｇＥ媒介疾患の公知の処置方法、すなわち併用又は追加的処置工程としてか、治療用製剤の追加的成分としての何れかで併用できる。
例えば、抗ヒスタミン、特に非鎮痛性抗ヒスタミンを、本発明の抗ＩｇＥ抗体と同時、先立って又は投与前に投与してもよい。好適な抗ヒスタミン剤には、アルキルアミン（例えば、クロルフェニラミン）、エタノールアミン（例えば、ジフェンヒドラミン）及びフェノチアジン（例えば、プロメタジン）が含まれる。多くの抗ヒスタミンはエフェクター細胞上にあるレセプター部位を遮断することによってヒスタミンの薬理学的効果に拮抗するが、他の一般的な抗ヒスタミン剤は、感作を受けてアレルゲン特異的ＩｇＥ（例えば、クロモグリク酸ナトリウム）を備えている肥満細胞からのヒスタミン放出を遮断することによって作用する。抗ヒスタミン剤の例には、アステミゾール、アザタジンマレイン酸塩、ブロフェニラミンマレイン酸塩、カルビノキサミンマレイン酸塩、塩酸セチリジン、クレマスチンフマル酸塩、シプロヘプタジン塩酸塩、d-マレイン酸ブロムフェニラミン、d-マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒドラミン、ドキシラミン琥珀酸塩、塩酸フェクソフェナジン、塩酸テルフェナジン、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン(loratidine)、塩酸メクリジン、クエン酸トリペレナミン、塩酸トリペレナミン、塩酸トリプロリジンが含まれる。
ＩｇＥ媒介疾患の特徴的な症状（例えば、即時型反応）は、交感神経模倣薬又は気管支拡張効果を持つ薬剤により寛解することができる。エピネフリンは広範作用性α及びβアドレナリン性であり、しばしば１：１００の水溶液０．２−０．５ｍｌの用量で皮下的に投与する。また、長時間の持続効果が望まれるときは、１：２００で混合している長時間作働性エピネフリン（すなわち、テルブタリン）を用いる。適切な付加的なβ-アドレナリン作動性物質には、経鼻投与（例えば、携帯ネビュライザ、断続的な陽圧呼吸装置または単位用量加圧吸入器）又は経口投与のためのアルブテロール、ピルブテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、イソエタリン及びフォルモテロールが含まれる。
また、特にそれらが上記の交感神経作動性薬物と組み合わせて投与されるときに、キサンチンの投与によって気管支拡張症が起こりうる。キサンチンの例には、アミノフィリン（静注、２５０−５００ｍｇ）及びテオフィリン（経口、１０−２０μｇ／ｍｌの血清濃度）が含まれる。
多様なＩｇＥ媒介疾患（例えば遅発型反応）による他の症状は、糖質コルチコイド又は抗炎症性効果を有する他の薬物による処置によって軽減することができる。ベクロメタゾン二プロピオン酸塩、トリアムシノロンアセトニド及びフルニソリドは長期の維持療法としてエアロゾル化した形で投与するが、プレドニゾン（３０−６０ｍｇ毎日）は重症発作のために全身的に投与する。更に、抗炎症性効果を有する副腎皮質ステロイドは、以下から成る：ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルチカゾン(fluticasone)プロピオン酸塩、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン。
また、本発明の治療法と組み合わせて用いることができる非ステロイド性の抗炎症剤には、アセトアミノフェン、アスピリン、ブロムフェナクナトリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン(phenylbutzone)、ピロキシカム、スリンダク、トルメチンナトリウムが含まれる。
さらにまた、最大の治療的効果は、鬱血除去薬（例えばフェニレフリン、フェニルプロパノラミン、シュードエファドリン(pseudoephadrin)）、咳抑制剤（例えばデキストロメトルファン、コデインまたはヒドロコドン）または鎮痛薬（例えばアセトアミノフェン、アスピリン）の投与によって達成されることができる。
アレルゲン脱感作は、アレルギー反応を減弱又は排除することを目的として患者にアレルゲンを注入する治療方法である。それは、また、アレルゲン免疫治療、減感作又はアレルギー注入治療として知られている。頻繁ではないが、一次処置として、他のアレルギー処置と組み合わせてしばしば用いられる。アレルゲン回避が不可能なときに、成功裏に行われている。代表的なアレルゲン脱感作処置は、注射部位に一過性の小さくて局所性の炎症領域ができるまで、服用回数を週に一回又は２回に増やして無菌のアレルゲンを皮下注射することを含む。そうして２−４週に一度のスケジュールで服用する。アレルギー性脱感作は、アナフィラキシーの治療にも成功するが、多くの場合アレルギー性喘息及びアレルギー性鼻炎の処置において用いられる。また、脱感作は、アジュバント、例えば、鉱油の水性抗原のエマルジョンである不完全なフロイントアジュバント、の使用によって効果的に用いられる。生理的効果により、アレルゲンの液滴が段階的に放出される不溶性の液貯蔵所が作られる。アレルゲン脱感作の他の形は、免疫原性の効果的程度を保持する一方で比較的低いアレルギー性（すなわち、アレルギー性反応を引き起こす）を有する分子をつくるためにグルタルアルデヒドを有する単量体アレルゲンを重合させることである。
Ｆ．薬剤用量：
本発明の医薬品組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定する特定の使用によって変化する。適当な用量の測定または投与のルートは、当分野の技術の範囲内でよい。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定のための確実な手引きとなる。有効量の異種間スケーリングは、Mordenti, J. 及び Chappell, W. 「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」, In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 等, 編集, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46.に記載の原理に従って行うことができる。
本願明細書において記載されているポリペプチドまたは抗体のインビボ投与が用いられるとき、正常な用量は投与のルートによって、哺乳動物体重量にして１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以下又はそれより多く、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日と異なる。特定の用量及び運搬の方法に関する手引きは、文献に示される；例として、米国特許第4,657,760号；5,206,344；又は5,225,212を参照。異なる製剤が異なる処置及び異なる疾患のために効果的であること、及び特定の器官または組織を治療することを目的とする投与は他の器官または組織への投与と異なる方法で運搬する必要があることは本発明の範囲内である。さらに、用量は、一つ以上の別々の投与によって、又は持続性点滴によって投与することができる。数日以上にわたる繰り返し投与の処置は、症状に応じて、疾患症状が希望通りに抑制されるまで継続する。しかしながら、他の投与計画は有効でありうる。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
Ｇ．製剤の投与
限定はしないが、再構成される製剤を含む本発明の製剤は、タンパク質による治療を必要としている哺乳動物、好ましくはヒト、に対して、ボーラス又はある期間にわたる連続的注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、腱鞘内、口内、局部的又は吸入経路による既知の方法に従い投与される。
好ましい実施態様において、製剤は皮下（すなわち、皮膚の下）投与によって哺乳動物に投与される。かかる目的のため、製剤はシリンジを用いて注射される。しかし、製剤の投与のための他の装置、例えば、注射装置（例えば、Inject-easeTM及びGenjectTM装置）；インジェクターペン（GenPenTMなど）；自動インジェクター装置、針なし装置（例えば、MediJectorTM及びBioJectorTM）；及び皮下パッチ送達システムなどが利用可能である。
特定の実施態様では、本発明は、単回用量投与単位のキットに関する。そのようなキットには、単一又は複数のチャンバーを有するあらかじめ充填したシリンジを包含する、治療用タンパク質又は抗体の液体製剤の容器を含む。あらかじめ充填したシリンジの例には、Vetter GmbH, Ravensburg, Germanyから入手したものがある。
タンパク質の適当な投与量（「治療上有効量」）は、例えば、治療される状態、該タンパク質が予防的又は治療的目的で投与される状態の重篤性及び経過、治療歴、患者の病歴及び該タンパク質に対する反応性、使用されるタンパク質のタイプ、主治医の判断に依存するであろう。タンパク質は、一時期に又は一連の治療にわたり適切に投与され、その後の診断による任意の時期に患者に投与される。タンパク質は、単一の治療として又は他の薬物又は問題の状態を治療するのに有用な療法と併せて投与してもよい。
選択されるタンパク質が抗体の場合、例えば、一回又は複数回に分けての投与のいずれであっても、患者への投与に関する初回の推奨される投与量は、約０．１−２０ｍｇ／ｋｇである。しかし、他の投与計画が有効な場合もある。本治療の進捗は、従来の技術によって容易にモニターすることができる。
抗ＩｇＥ製剤（例えば、ｒｈｕＭＡｂＥ−２５、ｒｈＭＡｂＥ−２６、Ｈｕ−９０１）の使用には、例えば、ＩｇＥを介したアレルギー性疾患、寄生虫感染、間質性膀胱炎及び喘息の治療又は予防法が含まれる。治療されるべき疾病又は疾患に依存して、抗ＩｇＥ抗体の治療上有効量（例えば、約１−１５ｍｇ／ｋｇ）が患者へ投与される。
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様では、製剤を含有する製造品が提供され、好ましくはその使用のための説明書を提供する。製造品は容器を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル（例えば、二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は製剤及び該容器の上又は該容器に付随したラベルを保持し、再構成及び／又は使用のための指示を表示する。さらに、該ラベルは製剤が皮下投与にとって有用であること、又は意図されることを表示する。製剤を収容する容器は、多目的使用バイアルであってもよく、再構成された製剤の繰り返し（例えば、２−６投与）投与を可能ならしめる。さらに、製造品は適切な希釈液（例えば、ＢＷＦＩ）を含む第二の容器を包含してもよい。希釈液と凍結乾燥製剤を混合すると、再構成された製剤中の最終タンパク質濃度は、通常、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌになるであろう。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明に関する添付文書を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
本発明は以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかし、それらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。本開示を通して全ての引例は、ここに出典により明確に取り込まれる。
他の実施態様では、本発明は、自動インジェクター装置での投与のためにここに記載の製剤を含む製造品を提供する。自動インジェクター装置は、作動すると患者又は投与する者の付加的必須の動作をすることなく内容物が運ばれる注射装置である。特に、投与量が一定で、投与回数が数回より多いときの、治療用製剤の自己投薬に適している。
実施例１
霊長類ＩｇＥの単離
ヒトＩｇＥはヒトＩｇＥ骨髄腫細胞株Ｕ２６６からクローニングした(ATCC, Manassas, VA、ＴＩＢ＃１９６)。アカゲザルおよびカニクイザルのＩｇＥ配列は、ＩｇＥスイッチ細胞を生成するように刺激されたアカゲザル及びカニクイザルの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から得たｃＤＮＡからクローニングして配列決定した。フォワード及びリバースプライマー(下記)は、ヒトＩｇＥ配列から設定した。上流のフォワードプライマーはＣＨ２ドメインのちょうど上流に設定した。リバースプライマーは膜貫通ドメインの末端に設定した。アカゲザルおよびカニクイザルのＰＢＭＣは、California National Primate Research Center(Davis, CA)から入手した。５×１０６のＰＢＭＣをＩＬ−４(１００ｎｇ／ｍｌ)およびＣＤ４０Ｌ(３μｇ／ｍｌ)(R&D Systems, Minneapolis, MN、それぞれ＃２０４−ＩＬ及び＃６１７−ＣＬ)とともに４日間培養した。次いで細胞を回収し、ＲＮＡを調製し(RNeasy Miniキット、＃74106、Qiagen, Valencia, CA)、BD Sprint Powerscript oligo dTプライミングキット(BD Biosciences, San Jose, CA、＃639558)を用いてｃＤＮＡを作製した。次いで、ＲＴ−ＰＣＲを行った［９４℃ ２分；９４℃ １５秒；６０℃ ３０秒；６８℃ ２分；３０サイクル；６８℃ １０分］。ＴＡクローニングのためにＡオーバーハングを付加するために、Ｔａｑポリメラーゼを示したサイクルの後に添加した(７２℃ １０分)(Invitrogen, Carlsbad, CA、＃４５−０６４１)。ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングによってクローニングし、その後クローンの配列を確認した(Genentech, Inc.)。ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルの配列は構内の分析プログラム(Genentech, Inc.)を使用して配列比較した。以下の相同性はＣＨ２および膜貫通ドメイン間の配列についてである。アカゲザル(４３２アミノ酸)とカニクイザル(４３１アミノ酸)との間では、６の相違があり、およそ９８．６％相同である。ヒトとアカゲザルとの間では、５３の相違があり、８７．７％相同に等しかった。ヒトとカニクイザルでは、５６の相違があり、８７％相同に等しかった(図１を参照)。
クローニングに用いたプライマー：
ＣＨ２配列の上流のフォワードプライマー：
5'−ccgcccaccgtgaagatcttacagtc (配列番号：６３)
膜貫通ドメインの終わりのリバースプライマー：
5'−cggctcgagactaggcgtggggctggaggacgttg (配列番号：６４)
実施例２
抗ＩｇＥ／Ｍ１'Ａｂの単離
ＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃ融合タンパク質の生成
ヒトＩｇＥ ＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＥ ＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'ドメインに、Ｕ２６６細胞から調製したｃＤＮＡのＭ１'ドメインのすぐ下流の更なる１５アミノ酸を付加してＰＣＲ増幅させて生成した(ATTC Manassas, VA、ＴＩＢ＃１９６)。ＲＮＡはＵ２６６細胞から調製し(ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット、＃７４１０６、Qiagen, Valencia, CA)、BD Sprint Powerscript oligo dTプライミングキット(BD Biosciences, San Jose, CA、＃６３９５５８)を用いてｃＤＮＡを作製した。ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングによってクローニングした(Invitrogen, Carlsbad, CA、＃４５−０６４１)。哺乳動物細胞内での発現のためにＰＣＲ突然変異誘発によってＮ末端シグナル配列を加え、シグナル配列＋ＣＨ３＋ＣＨ４＋Ｍ１'＋１５アミノ酸を発現ベクター(ｐＲＫ ｈｕＩｇＧ1 Ｆｃ；Genentech)にクローニングし、ヒトＩｇＧ1 Ｆｃ領域とのＣ末端融合を生成した。シグナル配列およびヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含む最終的なタンパク質の配列は、以下の通りである。
MGWSCIILFLVATATGVHSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQQGLPRAAGGSVPHPRCHCGAGRADWPGPPELDVCVEEAEGEAPWRAQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：６５)
タンパク質はＣＨＯ細胞(Genentech)の一過性の形質移入によって製造され、標準的なプロテインＡセファロースカラムクロマトグラフィ技術を用いて細胞培養物上清からタンパク質を精製した。
免疫化およびハイブリドーマの作製
ヒトＩｇＥ−Ｍ１'のＭ１'部位を選択的に結合する全特異的抗体のパネルを、ＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃタンパク質を使用して生成した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの各後足蹠に、３日から４日の間隔で、一リン酸化リピドＡおよびトレハロースｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ(ＭＰＬＴＭ＋ＴＤＭ)アジュバント(Corixa, Hamilton, MT)に再懸濁した１μｇのＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃを注入した。８回の追加免疫の後に血清を採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)及び蛍光標示式細胞分取及びフローサイトメトリー(ＦＡＣＳスクリーニング、次のセクションを参照)によって力価を測定し、マウスがＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃに対して良好に免疫応答したことを確認した最後の追加免疫の３日後に、膝窩節細胞をマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ．Ｕ．１と融合させた(例としてChuntharapai et al., 1997, Methods Enzymol. 288:15-27を参照のこと)。融合したハイブリドーマ細胞は、ClonaCell(登録商標)ハイブリドーマ選択キット(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada)のメディウムＤ中のヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(ＨＡＴ)選択を用いて融合していない膝窩節又はミエローマ細胞から選択し、４２２４クローンの生成を得た。
全特異的抗ヒトＭ１'抗体についてのスクリーニング
上記のように生成したハイブリドーマクローンは、ＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃタンパク質のＭ１'領域、Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞株の表面上に安定して発現されるヒトＩｇＥ−Ｍ１'のＭ１'領域(ＩｇＥ−Ｍ１'／Ａ２０)、及びＢＪＡＢヒトＢ細胞リンパ腫細胞株の表面上に安定して発現されるヒトＩｇＥ−Ｍ１'のＭ１'領域(ＩｇＥ−Ｍ１’／ＢＪＡＢ)に結合するモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングした。ネガティブコントロールには、ヒトＣＤ−４／Ｆｃ、Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞株の表面に安定して発現されるヒトＩｇＥ(ＩｇＥ／Ａ２０)、Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞株(Ａ２０)、ＢＪＡＢヒトＢ細胞リンパ腫細胞株の表面に安定して発現されるヒトＩｇＥ(ＩｇＥ／ＢＪＡＢ)、およびＢＪＡＢヒトＢ細胞リンパ腫細胞株(ＢＪＡＢ)を含めた。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
４２２４クローンを選別するために、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を一般的にBaker et al., 2002, Trends Biotechnol., 20:149−156に記載されているように行った。アッセイは、３８４−および９６−ウェルプレートで行った。簡単にいうと、３８４−(又は９６−)ウェルのプレートを、２μｇ／ｍｌの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(MP Biomedicals, Irvine, CA)を含む５０μｌのコーティングバッファ(０.０５Ｍ 炭酸バッファ、ｐＨ９.６)にてコートし、密閉して、４℃で終夜保存した。コーティング溶液を除去した後、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)中に０．５％ウシ血清アルブミンと０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)２０を含む８０μｌ(又は９６ウェルプレートには２００μｌ)のアッセイ／ブロック溶液(ＥＬＩＳＡ希釈液)を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間撹拌しながら培養した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)２０を含む１００μｌ(又は９６ウェルプレートには３００μｌ)のＰＢＳにてウェルを３回洗浄した。
洗浄工程の後、ＥＬＩＳＡ希釈液中に０．４μｇ／ｍｌのＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃ又はヒトＣＤ−４／Ｆｃを含む５０μｌ(又は９６ウェルプレートには１００μｌ)の抗原溶液を各ウェルに添加し、プレートを撹拌しながら室温で１時間培養した。前記のように洗浄バッファにてウェルを３回洗浄した。それぞれＣＨ３−ＣＨ４−Ｍ１'／Ｆｃを有する１ウェルとヒトＣＤ−４／Ｆｃを有する１ウェルに、単一ハイブリドーマクローンからの５０μｌ(又は９６ウェルプレートには１００μｌ)の上清を含むように、各々のハイブリドーマクローンの上清を加えた。室温で撹拌しながら１時間プレートをインキュベートし、上記のように洗浄バッファにてウェルを３回洗浄した。
洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングさせたヒツジ抗マウスＩｇＧ(ヒトＩｇＧ(MP Biomedicals)とは交差反応しない)をＥＬＩＳＡ希釈液にて１：１０００に希釈したものを５０μｌ(又は９６ウェルプレートには１００μｌ)各ウェルに加えた。室温で撹拌しながら１時間プレートをインキュベートし、上記のように洗浄バッファにて３回洗浄し、たたくようにして乾燥させた。５０μｌ(又は９６ウェルプレートには１００μｌ)のテトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)マイクロウェルペルオキシダーゼ基質(BioFX Laboratories, Owing Mills, MD、カタログ＃ＴＭＢＷ−０１００−０１)を各ウェルに添加してウェルを反応させ、５〜１０分間、又は良好な色の変化が観察されるまで室温でインキュベートした。５０μｌ(又は９６ウェルプレートには１００μｌ)のＴＭＢストップ溶液(BioFX Laboratories、カタログ＃ＢＳＴＰ−０１００−０１)を各ウェルに加えて反応を止めた。Sunriseプレート読み取り機(Tecan US, Inc., Research Triangle Park, NC)により６５０ｎｍにてプレートを分析した
プレブレッドとポリセラをコントロールとして用いた。プレブレッド試料は免疫化前のマウス血清を含み、ポリセラ試料は１０の免疫化処置の後に得られたマウス抗血清を含む。
ＦＡＣＳスクリーニング
実施例１で生成した３２２１クローンを選別するために、ＩｇＥ−Ｍ１'／Ａ２０およびＩｇＥ−Ｍ１'／ＢＪＡＢ細胞株を用いて蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)を行った。ＩｇＥ／Ａ２０、ＩｇＥ／ＢＪＡＢ、Ａ２０およびＢＪＡＢ細胞株をネガティブコントロールとした。細胞を再懸濁し、４℃で５分間、５００ｇで遠心分離した。培地を吸引し、細胞を１％ウシ胎児血清を含む４℃のＦＡＣＳＦｌｏｗ(BD Biosciences, San Jose, CA)バッファ(細胞染色バッファ)に再懸濁した。前記のように細胞を遠心分離し、培地を吸引し、細胞を４℃の細胞染色バッファ１ｍｌ当たり２×１０６細胞で再懸濁した。５０μｌ／ウェル(１×１０５細胞／ウェル)の細胞を９６ウェル丸底プレートに加え、各ハイブリドーマ上清が１ウェルが各細胞株を含んでインキュベートされるように、各ハイブリドーマクローンの１００μｌの上清を各ウェルに加えた。プレートを３０分間氷上でインキュベートした。プレートを４℃で５分間、５００ｇにて遠心分離し、上清を吸引した。各ウェルは４℃の２００μｌの細胞染色バッファに再懸濁し、プレートを前記のように遠心分離した。細胞染色バッファは吸引した。
洗浄工程の後、各ウェルの細胞を、Ｒ−フィコエリトリン(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)にカップリングさせたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを４℃の細胞染色バッファにて１：１０００に希釈したもの１００μｌに再懸濁し、プレートを暗所にて氷上で３０分間インキュベートした。プレートを４℃で５分間、５００ｇにて遠心分離し、上清を吸引した。各ウェルを４℃の２００μｌの細胞染色バッファに再懸濁し、プレートを前記のように遠心分離した。細胞染色バッファは吸引した。各ウェルの細胞を４℃の２００μｌの細胞染色バッファに再懸濁し、１．２ｍｌのマイクロタイターチューブ(Quality Scientific Plastics, Petaluma, CA)に移した。ＦＡＣＳｃａｎ又はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences)にてＦＡＣＳを行った。
Ｎ末端配列決定／ＲＮＡの単離／配列決定およびクローニング
抗体は、抗ＩｇＥ／Ｍ１'ハイブリドーマの上清から精製し、リン酸緩衝生理食塩水のクローナリティ測定のためのＮ末端配列決定について分析した。各抗体は、還元条件下でＰｒｅｃａｓｔ ４−２０％ トリスＨＣｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ (Invitrogen, Carlsbad, CA)にて分離した。分析された重鎖(ＨＣ)および軽鎖(ＬＣ)をそれぞれ、Henzel et al. Analytical Biochemistry 267, 148−160 (1999)に記載されているように、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４Ｎ末端シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)にて２０分のサイクルを用いてＮ末端配列決定を行った。始めの２５残基を配列決定して、モノクローナル性を確認した。ＡｂのＨＣ又はＬＣ鎖が、Ｎ末端アミノ酸をエドマン配列決定できなくさせたピログルタミル基にてブロックされた場合には、配列決定の前にブロック基の除去を行った。Pham et al. Electrophoresis 2005, 26 4243-4251に記載されるプロトコールを用いて、ピログルタミル基は、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ酵素(ＰＧＡＰ、Sigma, St Louis, MO)にて除去した。
重鎖(ＨＣ)および軽鎖(ＬＣ) Ｍ１'抗体７Ａ６、１Ｃ１１、４７Ｈ４、２６Ａ１１、４５Ｃ１および２８Ｅ９の配列を決定すると以下の通りであった。
７Ａ６
ＨＣ QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS (配列番号：６６)
ＬＣ DIVMSQSPSSLTVSVGEKVTLSCKS (配列番号：６７)
１Ｃ１１
ＨＣ QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS (配列番号：６８)
ＬＣ DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKS (配列番号：６９)
４７Ｈ４
ＨＣ EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS (配列番号：７０)
ＬＣ DVVLTQTPLSLPVSLGDQASI (配列番号：７１)
２６Ａ１１
ＨＣ EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS (配列番号：７２)
ＬＣ DIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRS (配列番号：７３)
４５Ｃ１
ＨＣ QIQLVQSGPELKKPGETVK (配列番号：７４)
ＬＣ DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCK (配列番号：７５)
２８Ｅ９
ＨＣ EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATS (配列番号：７６)
ＬＣ DIQMTQSPASLSVSVGETVTFTCR (配列番号：７７)
完全長配列を決定するために、Ｎ末端アミノ酸配列と既知のＩｇ遺伝子セグメントから５'縮重プライマーを設定し、縮重下流重鎖及び軽鎖保存配列にてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー
７Ａ６
ＨＣ ＦＯＲ.ＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctcaggttcagctgcagcaatctggggctgagctgg (配列番号：７８)
ＬＣ ＦＯＲ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatcgtgatgtcccagtctccctcctccctaac (配列番号：７９)
１Ｃ１１
ＨＣ ＦＯＲ.ＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctcaggttcaattgcagcagtctggggctgagctgg (配列番号：８０)
ＬＣ ＦＯＲ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatcgtaatgtctcagtctccttcctccctagc (配列番号：８１)
４７Ｈ４
ＨＣ ９.１ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctgaggtgaagttggtggagtctgggggaggcttag (配列番号：８２)
ＬＣ ４７Ｈ４ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatcgtgctgactcagactccactctccctgcc (配列番号：８３)
２６Ａ１１
ＨＣ Ｃ７Ｆ７ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctgaggtccagctccagcagtctggacctgagc (配列番号：８４)
ＬＣ ２Ｂ４ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatccagatgacccaaactacatcctccctg (配列番号：８５)
４５Ｃ１
ＨＣ ２Ｇ６ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctcagatccagttggtgcagtctggacctgagctg (配列番号：８６)
ＬＣ ９Ｃ１０ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatcgtgatgacgcagactccactcactttgtcgg (配列番号：８７)
２８Ｅ９
ＨＣ ９.１ＨＣＦＢｓｉＷＩ 5'−tcgacgtacgctgaggtgaagctggtggagtctgaaggaggcttgg (配列番号：８８)
ＬＣ ５Ｅ１０.ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ 5'−gatcgatatccagatgacccagtctccagcctccctatc (配列番号：８９)

リバースプライマー
重鎖プライマー(ＨＣＲ) 5'−ctggacagggatccagagttccaggtcactgtcactggctcaggg (配列番号：９０)
軽鎖プライマー(遅発皮膚反応) 5'−ctgtaggtgctgtctttgctgtcctgatcagtccaactg (配列番号：９１)
抗ＩｇＥ／Ｍ１'ハイブリドーマ(RNeasy Miniキット、＃７４１０６、Qiagen, Valencia, CA)からＲＮＡを回収し、BD Sprint Powerscript oligo dTプライミングキット(BD Biosciences, San Jose, CA、＃６３９５５８)を用いてｃＤＮＡを調製した。上記プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡキット(Invitrogen, Carlsbad, CA、＃４５−０６４１)を使用してクローニングした。Platinum Pfx High Fidelityポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA、＃１１７０８−０３９)を用いて、以下のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。［９４℃ ２分；９４℃ １５秒；６０℃ ３０秒；６８℃ ２分；３０サイクル；６８℃ １０分］。クローンをインサートについてスクリーニングし、複数のクローンを配列決定して(Genentech, Inc.)、元の抗ＩｇＥ／Ｍ１'の重鎖及び軽鎖の遺伝子配列を確認した。
抗Ｍ１'抗体可変ドメインを異なるＦｃ領域とともに発現ベクターにサブクローニングし、異なる種および／またはアイソタイプＦｃのＦｃを有するキメラ抗体を生成した。マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ａ−ＤＡＮＡおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に可変ドメイン(ＣＤＲ＋フレームワーク)をクローニングするためにプライマーを設定した。
重鎖および軽鎖配列とともに制限部位を組み込むようにプライマーを設定した。重鎖は、ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩを用いてクローニングした。軽鎖は、ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩを用いてクローニングした。次いで、新規のＰＣＲ産物を消化して、重鎖又はｍＫａｐｐａ(ＬＰＧ２)ないしはｈｕＫａｐｐａ発現ベクター(Genentech, Inc.)のためにｍＩｇＧ２ａ(ＬＰＧ１０)、ｍＩｇＧ２ａ−ＤＡＮＡ(ｐＥｒｋ−Ｅ２７ＤＡＮＡ)又はｈｕＩｇＧ１にライゲーションした。最終的なクローンを配列確認した(Genentech, Inc.)。
可変ＣＤＲ配列のクローニングのための３'プライマーとフォワード及びリバースプライマーの組合せは、以下の通りである。
リバースプライマー
７Ａ６
ＨＣ ＲＥＶ.ＡｐａＩ 5'−accgatgggcccttggtggaggctgaagagactgtgag (配列番号：９２)
ＬＣ ＲＥＶ.ＫｐｎＩ 5'−ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataatattg (配列番号：９３)
１Ｃ１１
ＨＣ ＲＥＶ.ＡｐａＩ 5'−gaccgatgggcccttggtggaggctgaggagactgtg (配列番号：９４)
ＬＣ ＲＥＶ.ＫｐｎＩ 5'−ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataa (配列番号：９５)
４７Ｈ４
ＨＣ ４７Ｈ４ＨＣＲ.ＡｐａＩ 5'−tgggcccttggtggaggctgaggagacggtgactgag (配列番号：９６)
ＬＣ ４７Ｈ４ＬＣＲ.ＫｐｎＩ 5'−ttccaacttggtacctccacc (配列番号：９７)
２６Ａ１１
ＨＣ ７Ｇ８ＨＣＲ.ＡｐａＩ 5'−gaccgatgggcccttggtggargctgcagagacagtgaccagag (配列番号：９８)
ＬＣ ４７Ｈ４ＬＣＲ.ＫｐｎＩ 5'−ttccaacttggtacctccacc (配列番号：９９)
４５Ｃ１
ＨＣ ４５Ｃ１ＨＣＲ.ＡｐａＩ 5'−cgatgggcccttggtggargckgaggagacggtgagaatg (配列番号：１００)
ＬＣ ５Ｃ２ＬＣＲ.ＫｐｎＩ 5'−agcttggtaccccctccg (配列番号：１０１)
２８Ｅ９
ＨＣ ２８Ｅ９.ＨＣ.ＲＥＶ.ＡｐａＩ 5'−cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggcgactgag (配列番号：１０２)
ＬＣ １Ｄ５.２ＬＣＲ,ＫｐｎＩ 5'−ttccaacttggtacccgagccg (配列番号：１０３)
プライマー組合せ：
フォワード リバース
７Ａ６：ＨＣ ７Ａ６.ＦＯＲ.ＢｓｉＷＩ −−− ７Ａ６.ＲＥＶ.ＡｐａＩ
ＬＣ ７Ａ６.ＦＯＲ.ＥｃｏＲＶ −−− ７Ａ６.ＲＥＶ.ＫｐｎＩ

１Ｃ１１：ＨＣ １Ｃ１１.ＦＯＲ.ＢｓｉＷＩ −−− １Ｃ１１.ＲＥＶ.ＡｐａＩ
ＬＣ １Ｃ１１.ＦＯＲ.ＥｃｏＲＶ −−− １Ｃ１１.ＲＥＶ.ＫｐｎＩ

４７Ｈ４：ＨＣ ９.１.ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ−−−７Ｈ４ＨＣＲ.ＡｐａＩ
ＬＣ＊ ４７Ｈ４.ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ−−−４７Ｈ４.ＬＣＲ.ＫｐｎＩ

２６Ａ１１ ＨＣ Ｃ７Ｆ７.ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ−−−７Ｇ８.ＨＣＲ.ＡｐａＩ
ＬＣ ２Ｂ４.ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ −−−４７Ｈ４.ＬＣＲ.ＫｐｎＩ

４５Ｃ１ ＨＣ ２Ｇ６.ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ −−−４５Ｃ１.ＨＣＲ.ＡｐａＩ
ＬＣ ９Ｃ１０.ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ−−−５Ｃ２.ＬＣＲ.ＫｐｎＩ

２８Ｅ９ ＨＣ ９.１.ＨＣＦ.ＢｓｉＷＩ−−−２８Ｅ９.ＨＣＲ.ＡｐａＩ
ＬＣ ５Ｅ１０.ＬＣＦ.ＥｃｏＲＶ−−−１Ｄ５２.ＬＣＲ.ＫｐｎＩ
４７Ｈ４軽鎖は、ｍＫａｐｐａおよびｈｕＫａｐｐａ発現ベクターへの直接クローニングを妨げる内部のＫｐｎＩ部位があった。内部のＫｐｎＩ部位はQuick Change XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene, Cedar Creek, Texas、＃２００５１７−５)を用いて変異させた。［９５℃ １分；９５℃ ５０秒；６０℃ ５０秒；６８℃ ４．５分；６８℃ ７分］。キットの必要性に応じてプライマーを設定し、アミノ酸配列を変化させないＫｐｎＩ部位内の単一ヌクレオチドを変異させた。ＴＡＣは、その位置でのチロシン(Ｙ)を保存するＴＡＴに変異させた。最終的なクローンを配列確認した(Genentech, Inc.)。
突然変異誘発に使用するプライマーは、以下の通りであった。
ＦＯＲ 5'−cc tat tta cat tgg tat ctg cag aag cca ggc c (配列番号：１０４)
ＲＥＶ 5'−ggc ctg gct tct gca gat acc aat gta aat agg (配列番号：１０５)
実施例２Ａ
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体のヒト化
この実施例は、マウスの抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４のヒト化を記載する。
材料と方法
膜結合のヒトＩｇＥのＭ１'ドメインは、ＣＨＯ細胞のＦｃ融合として発現させ、従来の方法によって精製した。抗体２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４を発現するハイブリドーマは、組換えＭ１'−Ｆｃ融合タンパク質にてマウスを免疫化して得、Ｍ１'−Ｆｃにてコートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡにて同定した。機能的抗体は、Ｍ１'発現細胞への結合能及びアポトーシス促進能によって同定した。
マウスの２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４可変ドメインのクローニング− 標準的な分析法を用いて２６Ａ１１、７Ａ６又は４７Ｈ４を産生するハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)ドメインは、重鎖および軽鎖に対する縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにて増幅した。フォワードプライマーは、ＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ、ＬＣおよびＨＣリバースプライマーを設定して、種間で高い保存性を有する定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）内の領域にアニールさせた。インサートのポリヌクレオチド配列は、慣例的な配列決定法を使用して決定した。２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４のＶＬとＶＨアミノ酸配列は、それぞれ図６Ａと６Ｄ、６Ｂと６Ｅ、および６Ｃと６Ｆに示す。
アクセプターヒトコンセンサスフレームワークへの直接高頻度可変領域移植片− この実験に用いたファジミドは一価性Ｆａｂ−ｇ３ディスプレイベクターであり、単一ｐｈｏＡプロモーターの制御下の２つのオープンリーディングフレームからなる。第一のオープンリーディングフレームはアクセプター軽鎖のＶＬ及びＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列からなり、第二のオープンリーディングフレームはアクセプター重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインに融合したｓｔＩＩシグナル配列とその後に続くマイナーファージコートタンパク質Ｐ３からなる。
マウスの２６Ａ１１、７Ａ６又は４７Ｈ４抗体(ｍｕ２６Ａ１１、ｍｕ７Ａ６又はｍｕ４７Ｈ４)のＶＬおよびＶＨドメインを、ヒトＶＬκＩ(ｈｕＫＩ)及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ(ｈｕＩＩＩ)コンセンサス配列と配列比較した。ＣＤＲ移植片を作製するために、ｈｕＩ及びｈｕＩＩＩコンセンサスアクセプターフレームワーク内にｍｕ２６Ａ１１、ｍｕ７Ａ６又はｍｕ４７Ｈ４の高頻度可変領域を移植して、直接のＣＤＲ−移植片(２６Ａ１１.ｖ１、７Ａ６.ｖ１又は４７Ｈ４.ｖ１)を生成した(図６Ａ−６Ｆ)。ＶＬドメインでは、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプターに融合させた。位置２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)および８９−９７(Ｌ３)。ＶＨドメインでは、位置２６−３５(Ｈ１)、４９−６５(Ｈ２)および９４−１０２(Ｈ３)を融合させた。MacCallum et al. [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))]は、抗体と抗原複合体結晶構造を分析して、重鎖の位置４９と９４が接触領域の一部であることを発見したので、抗体をヒト化する場合にＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３の定義にこれらの位置が含まれると考えられる。
各高頻度可変領域について別々のオリゴヌクレオチドを用いたＬＣ及びＨＣ発現ベクターのキュンケル突然変異誘発により、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体２６Ａ１１．ｖ１、７Ａ６．ｖ１及び４７Ｈ４．ｖ１を、ＩｇＧ抗体として生成した。安定性を増やすためのアミノ酸変化もまた、キュンケル突然変異誘発を使用して行った。Kunkel et al., J. Biol. Chem. 263(29): 14784−14789 (1988)。正しいクローンは、ＤＮＡ塩基配列決定によって識別した。
ＩｇＧ産生− スクリーニングのために、始めにＩｇＧ変異体を２９３細胞内で産生させた。ＶＬおよびＶＨ(２５μｇ)をコードするベクターを、ＦｕＧｅｎｅシステムを使用して２９３細胞内へ形質移入した。５００μｌのＦｕＧｅｎｅを、ＦＢＳを含まない４．５ｍｌのＤＭＥＭ培地と混合して、室温で５分間インキュベートした。それぞれの鎖(２５μｇ)をこの混合物に添加して、室温で２０分間インキュベートし、次いで、形質移入のために５つのＴ−１５０フラスコに移して、５％ＣＯ２下、３７℃に終夜置いた。次の日、形質移入混合物を含む培地を取り除き、０．１ｍｌ／Ｌの微量元素(Ａ０９３４)と１０ｍｇ／Ｌのインスリン(Ａ０９４０)を含む２３ｍｌのＰＳ０４培地に置き換えた。さらに５日間細胞をインキュベートし、その後、１０００ｒｐｍで５分間かけて培地を集め、０．２２μｍ低タンパク−結合フィルターを使用してフィルター滅菌した。１２５ｍｌの培地に対して２．５ｍｌの０．１％ＰＭＳＦを添加した後、試料を４℃で保存することができる。
親和性測定− スキャッチャード分析、細胞結合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＡ１００を用いた表面プラスモン共鳴によって親和性測定を行った。
スキャッチャード分析 − ダウディ−ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルＩｇＥ／Ｍ１'細胞は、基本培地からなる冷たい結合バッファに結合のために調製し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および２％ＦＢＳ並びに４０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧとした。１．７×１０６細胞／ｍｌの濃度に細胞を希釈し、アッセイに添加するまで氷上に置く。タンパク質／抗体は、ヨード法によってヨード化する。様々な濃度の冷たいタンパク質を、飽和濃度から０の濃度までの１：２希釈により、計１４の濃縮物として、３通りずつ調製する。単一の濃度の温かいタンパク質をすべての希釈物に加え、冷たいタンパク質と競合させる。最後に、細胞を温かいタンパク質と冷たいタンパク質の混合物に加え、１試料当たり２５００００細胞を用いた。アッセイは、振とうさせながら４℃に４時間保った。次いで各試料を集め、メンブランにて濾過し、少なくとも３回結合バッファにて洗浄し、乾燥させ、その後Perkin Elmer Wizard 1470自動ガンマカウンターを用いて１分間計測した。
競合的電気化学発光細胞結合アッセイ− ヒト化変異体の相対的な結合親和性は、競合的電気化学発光細胞結合アッセイを用いて測定した。ＩｇＥ−Ｍ１'を発現する形質移入ＢＪＡＢ細胞(ＢＪＡＢ−ＩｇＥ／Ｍ１')(long)又はＭ１'を発現しないコントロール形質移入細胞(BJAB-IgE)(short)を、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて洗浄し、９６ウェルMULTI-ARRAY High Bindプレート(Meso Scale Discovery)に２５μｌのＰＢＳ中２５０００細胞／ウェルで密閉した。細胞をプレート上で室温で１時間インキュベートして、細胞をウェルに接着させた。非特異的結合をブロックするために、３０％ＦＢＳを含む２５μｌのＰＢＳを各ウェルに添加した。次いで、プレートを緩やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。ブロック溶液を静かに注ぎ、一定量のビオチン化抗ＩｇＥ Ｍ１'抗体(３３．３ｎＭの２６Ａ１１又は４７Ｈ４)を含む２５μｌの２％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加したヒト化変異体の段階希釈物(０．０２２−１３３３ｎＭ)を添加した。緩やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした後、マイクロプレート洗浄機(ELx405 Select, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)を用いて、ＰＢＳ(３００μｌ／ウェル)にてプレートを３回洗浄した。結合した抗体は、２５μｌの０．２５μｇ／ｍｌルテニウム標識ストレプトアビジンをアッセイバッファに添加して検出した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴｒｉｓベースのＲｅａｄバッファＴ(１×、界面活性物質なし)(Meso Scale Discovery)を添加した(１５０μｌ／ウェル)。電気化学発光シグナルは、Sector Imager 6000読み取り機(Meso Scale Discovery)を使用して記録した。
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００− ２つの測定を用いた。Ｍ１'−Ｆｃ又は特定の抗体変異体を固定し(およそ１００ＲＵ、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ４．８中、ＣＭ５センサーチップ上に)、対応するリガンド(それぞれ抗体変異体又はＭ１'Ｆｃ)を分析物とした(３０μｌ／分の流速で注入し、ＰＢＳＴの０．５から１０００ｎＭの２倍段階希釈物を用いる)。各々の試料は、３分の会合と１０分の解離によって分析した。各注入の後、チップは、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．７を使用して再生した。
ＢｉａｃｏｒｅＡ−１００− Ｍ１'を固定し(およそ１００ＲＵ、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ４．８中、ＣＭ５センサーチップ上に)、抗体変異体を分析物とした(３０μｌ／分の流速で注入し、ＰＢＳＴの０．５から１０００ｎＭの２倍段階希釈物を用いる)。各々の試料は、５分の会合と５分の解離によって分析した。各注入の後、チップは、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．７を使用して再生した。
結合応答は、コントロールフローセルを１８Ｆ７変異体ＩｇＧフローセルから減算することによって修正した。ｋｏｎとｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルを動態分析のために用いた。
結果と考察
２６Ａ１１、７Ａ６および４７Ｈ４のＣＤＲ移植− ヒト化のために用いたヒトアクセプターフレームワークはコンセンサスヒトκＩＶＬドメインと、コンセンサスヒトサブグループＩＩＩＶＨドメインに基づく。ｍｕ２６Ａ１１、ｍｕ７Ａ６およびｍｕ４７Ｈ４のＶＬおよびＶＨドメインを、ヒトκＩおよびサブグループＩＩＩドメインと配列比較した。各々の相補性決定領域(ＣＤＲ)が同定され、ヒトアクセプターフレームワークに移植し、ＩｇＧとして発現されうるＣＤＲ移植片を生成した(図６Ａ−６Ｆ)。
親和性評価− ２６Ａ１１．ｖ１、７Ａ６．ｖ１および４７Ｈ４．ｖ１は、細胞結合ＥＬＩＳＡと表面プラスモン共鳴を用いて評価した(表１)。これらのアッセイは、ＣＤＲ移植片が各々のハイブリドーマ抗体と非常に類似した親和性を有したことを示した。
２６Ａ１１及び４７Ｈ４のＣＤＲ−Ｌ１内の潜在的脱アミドとイソアスパラギン酸形成部位の除去− 起こりうる製造上の問題を避けるために、４７Ｈ４．ｖ１のＣＤＲ−Ｌ１内の潜在的イソアスパラギン酸形成部位であるＡｓｎ２８−Ｇｌｙ２９と２６Ａ１１．ｖ１のＣＤＲ−Ｌ１内のＡｓｎ３１−Ｓｅｒ３２を、これらの位置で他の抗体に見られる残基をサンプリングすることによって除去した(図６Ａ、６Ｃ、表Ｉ)。４７Ｈ４．ｖ１(４７Ｈ４．ｖ２および４７Ｈ４．ｖ５)のＣＤＲ−Ｌ１内のＧｌｙ２９をＡｌａ２９に、２６Ａ１１(２６Ａ１１．ｖ３および２６Ａ１１．ｖ６)のＣＤＲ−Ｌ１内のＳｅｒ３２をＴｙｒ３２に、又はＡｌａ３２(２６Ａ１１．ｖ２又は２６Ａ１１．ｖ５)に変化させるのが好適な置換であることがわかった。さらに、Ａｓｎ３１をＳｅｒ３１に(２６Ａ１１．ｖ１３又は２６Ａ１１．ｖ１５)又はＧｌｎ３１に(２６Ａ１１．ｖ１４又は２６Ａ１１．ｖ１６)変化させることも、脱アミドとイソアスパラギン酸形成の可能性を取り除くのに役立ち、それぞれのハイブリドーマ抗体と同様な親和性をもつ候補物質が得られた。
２６Ａ１１．ｖ１又は４７Ｈ４．ｖ１のＣＤＲ−Ｈ１内のＭｅｔ３４の酸化の可能性は、Ｍ１'結合に影響を及ぼすことなく、両抗体内のこの残基をＩｌｅ３４に変化させることによって、回避させた。
実施例３
抗Ｍ１'Ａｂの特異性
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体クローンの特異性は、Ｍ１'配列を有するＩｇＥ(「ロング型」)又はＭ１'配列を欠くＩｇＥ(「ショート型」)を形質移入したヒトＢ細胞株ＢＪＡＢ(ATCC Manassas, VA、＃ＨＢ−１３６)にて試験した。ＩｇＥ ＢＪＡＢ細胞株は、ｐＭＳＣＶ発現ベクター(Washington University, St. Louis, MO)を用いたＢＪＡＢ細胞のレトロウイルスの形質導入によって生成された。ヒトＩｇＥ Ｂ細胞レセプターの完全長重鎖および軽鎖のｃＤＮＡは、ヒトＩｇＥミエローマ細胞株Ｕ２６６(ATCC, Manassas, VA、ＴＩＢ＃１９６)から得、ＩＲＥＳ(Internal Ribosomal Entry Sequence)と組み合わせてレトロウイルスベクター内にサブクローニングし、抗体重鎖および軽鎖のバイシストロン性の同時形質移入と同時発現を可能にした。レトロウイルスの形質導入の方法の更なる解説を下記に示す。
ＰＧ１３内包細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６)を、１０ｃｍ組織培養プレートに２×１０６細胞／プレート(ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン)で２４時間播いた。細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６を用いてｐＭＳＣＶ ＤＮＡコンストラクトを形質移入し、３７℃、５％ＣＯ２にて２日間培養した。レトロウイルス粒子を含む細胞培養上清を回収し、０．４マイクロフィルターにて濾過した。無菌の硫酸プロタミンを１０μｇ／ｍｌの終濃度まで加え、４ｍｌの上清を用いて、３２℃で９０分間のスピン感染によりおよそ１×１０６のＢＪＡＢ細胞を感染させ、その後レトロウイルス上清中で５％ＣＯ２、３７℃で３−４時間培養を続けた。感染したＢＪＡＢ細胞を回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地(ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ(Hyclone, Logun, UT, ＃ＳＨ３００７１．０３)、ペニシリン、ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン)に移し、分類のために拡げた。ポジティブに形質移入した細胞は、表面ＩｇＥを検出するためのＭＡＥ１１(Genentech)抗ヒトＩｇＥ抗体を用いたフローサイトメトリーによって同定した。
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、ＢＪＡＢ ＩｇＥショート及びロング型の細胞株のフローサイトメトリー染色によって決定されるように、膜ＩｇＥのロング型に特異的であったがショート型には特異的でなかった。抗ヒトＩｇＥ(Ｍａｅ１１)抗体(Genentech, Inc.)は、ＩｇＥのロング型及びショート型の結合能に関するポジティブコントロールとして用いた。抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１又は抗ブタクサｍＩｇＧ２ａ抗体は、アイソタイプコントロール(Genentech, Inc)として用いた。
ＢＪＡＢ細胞はＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳ (Hyclone, Logun, UT, #SH30071.03)、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Genentech, Inc.)中で生育させた。０．５×１０６のＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ又はＢＪＡＢ−ｓｈｏｒｔの細胞は、１００μｌのＦＡＣｓ洗浄バッファ(２％ ＦＢＳを含む１×ＰＢＳ(Genentech, Inc.))中で氷上で１５分かけて、マウス血清(１０μｌ)(VWR, #RLD108-0100)及びヒト血清(１０μｌ)(Sigma, St. Louis, MO, #S-2257)にてブロックした。次いで、細胞を、１μｇ／ｍｌの各抗Ｍ１'抗体にて氷上にさらに２０分置いて染色し、その後１ｍｌのＦＡＣｓ洗浄バッファにて洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を１００μｌのＦＡＣｓ洗浄バッファに再懸濁し、その後ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ(５μｌ)(Caltag/Invitrogen, Carlsbad, CA, #M30004-4)にて氷上に２０分置いて染色した。細胞を前記のように洗浄し、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ機(BD, Inc, Franklin Lakes, NJ)による分析のために１ｍｌのＦＡＣｓ洗浄バッファに再懸濁した。試験したすべての抗体はＩｇＥのロング型に特異的であり、アイソタイプコントロールを超えてＢＪＡＢ−ＩｇＥ／ショート細胞を結合しなかった。発明者等は染色強度に基づいて広い範囲の相対的な親和性を観察した。
発明者等はまた、細胞表面上に低レベルのＭ１'含有ヒトＩｇＥを天然に発現するＵ２６６細胞株(ATCC, Manassas, VA, #TIB196)に結合する抗Ｍ１'抗体を評価した。Ｕ２６６細胞は、ハイブリドーマ培地［ＲＰＭＩ１６４０、１５％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４．５ｇ／ｌ グルコース、１．５ｇ／ｌ 重炭酸塩］中で高密度(１−２×１０６／ｍｌ)に維持される。Ｕ２６６細胞は１μｇ／ｍｌの抗Ｍ１'抗体にて染色した。４７Ｈ４、４７Ｇ４および４２Ａ５は、Ｍａｅ１１と同等のレベルでＵ２６６を染色した。抗体４２Ｈ４、４５Ｃ１および２８Ｅ９は、非常に低いレベルでＵ２６６を染色した。７Ａ６、１Ｃ１１、２６Ａ１１、５１Ｄ２及び２６Ｂ１１はＵ２６６を染色しなかった。(図２Ｃ)
実施例３Ａ
マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'結合特異性
図２Ｄ−Ｆは、ヒト、アカゲザル又はカニクイザルのＩｇＥ／Ｍ１'を発現する細胞株の集団に対する、マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４、２６Ａ１１及び７Ａ６の結合を示す。
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体クローンの特異性は、レトロウイルスに感染させて、Ｍ１'配列を有するＩｇＥのロング型又はＭ１'配列を欠くＩｇＥのショート型を発現させているヒトＢ細胞株ＢＪＡＢ(ATCC Manassas, VA、＃ＨＢ−１３６)及びダウディ(ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２１３)にて試験した。ＢＪＡＢ細胞はＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳ (Hyclone, Logun, UT, #SH30071.03)、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(Genentech, Inc.)中で生育させた。０．５×１０６のＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ又はＢＪＡＢ−ｓｈｏｒｔの細胞は、１００μｌのＦＡＣｓ洗浄バッファ(２％ ＦＢＳを含む１×ＰＢＳ(Genentech, Inc.))中で氷上で１５分かけて、マウス血清(１０μｌ)(VWR, #RLD108-0100)及びヒト血清(１０μｌ)(Sigma, St. Louis, MO, #S-2257)にてブロックした。次いで、細胞を、１μｇ／ｍｌの各抗Ｍ１'抗体にて氷上にさらに２０分置いて染色し、その後１ｍｌのＦＡＣｓ洗浄バッファにて洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を１００μｌのＦＡＣｓ洗浄バッファに再懸濁し、その後ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ(５μｌ)(Caltag/Invitrogen, Carlsbad, CA, #M30004-4)にて氷上に２０分置いて染色した。細胞を前記のように洗浄し、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ機(BD, Inc, Franklin Lakes, NJ)による分析のために１ｍｌのＦＡＣｓ洗浄バッファに再懸濁した。試験したすべての抗体はＩｇＥのロング型に特異的であり、アイソタイプコントロールを超えてＢＪＡＢ−ＩｇＥ／ショート細胞を結合しなかった。発明者等は染色強度に基づいて広い範囲の相対的な親和性を観察した。
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体クローンの特異性は、レトロウイルスを感染させてＭ１'配列を有する膜ＩｇＥ(ロング型)又はＭ１'配列を欠く膜ＩｇＥ(ショート型)を発現させているヒトＢ細胞株ダウディにて試験した。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体(４７Ｈ４、２６Ａ１１、７Ａ６)はロング型に特異的であったが、ショート型には特異的でなかった(図２Ｄ)。抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１は、アイソタイプコントロールとして用いた(Genentech, Inc)。
ヒトＢ細胞株ダウディに、アカゲザル又はカニクイザル又はヒトのＩｇＥ／Ｍ１'のためのヒトＩｇＥ／霊長類Ｍ１'カセットを含むレトロウイルスを形質導入した。形質導入後、ヒト、アカゲザル又はカニクイザルのＩｇＥ／Ｍ１'を発現する細胞を、３〜４回の分類により９８％より高い純度にまでＦＡＣｓ分類機により分類した。
図２Ｆは、アカゲザルおよびカニクイザルのＭ１'を結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の能力を示す。４７Ｈ４及び７Ａ６はアカゲザル及びカニクイザルのＭ１'を結合するのに対して、２６Ａ１１はアカゲザルＭ１'のみを結合する。
ダウディ形質移入細胞株に加えて、発明者等は、ヒトＩｇＥメラノーマ細胞株(ATCC, Manassas, VA、#TIB196)であるＵ２６６に結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を評価した。Ｕ266細胞は、ハイブリドーマ培地［ＲＰＭＩ１６４０、１５％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４．５ｇ／ｌ グルコース、１．５ｇ／ｌ 重炭酸塩］中で高密度(１−２×１０６／ｍｌ)に維持される。Ｕ２６６細胞は１μｇ／ｍｌの抗Ｍ１'抗体にて染色した。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４はＵ２６６を結合したのに対して、２６Ａ１１及び７Ａ６は結合しなかった(図２Ｅ)。
実施例３Ｂ
ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'結合特異性
実施例３Ｂは、ヒト、アカゲザル又はカニクイザルのＩｇＥ／Ｍ１'を発現する細胞株の集団に対する、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の結合を示す。
実施例３Ａにおいて検討したヒト、アカゲザル又はカニクイザルＭ１'を過剰発現する同じダウディ又はＢＪＡＢヒトＢ細胞株を用いて、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体クローンの特異性は、レトロウイルスに感染させて、Ｍ１'配列を有するＩｇＥのロング型又はＭ１'配列を欠くＩｇＥのショート型を発現させているヒトＢ細胞株ダウディにて試験した。ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体(４７Ｈ４ｖ５、２６Ａ１１ｖ６、７Ａ６ｖ１)はロング型に特異的であり、ショート型(Ｍ１'なし)には特異的でない(図２Ｇ)。ハーセプチン(登録商標)抗Ｈｅｒ２ ＭＡｂ ｈｕＩｇＧ１をアイソタイプコントロールとして用いた(Genentech, Inc.)。さらに、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体(４７Ｈ４ｖ５および２６Ａ１１ｖ６)はＵ２６６細胞株に結合する(図２Ｈ)。
図２Ｉは、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の、アカゲザルおよびカニクイザルのＭ１'への結合能を示す。抗体４７Ｈ４ｖ５及び７Ａ６ｖ１はアカゲザル及びカニクイザルのＭ１'を結合するのに対して、２６Ａ１１ｖ６はアカゲザルＭ１'のみを結合する。
実施例４
抗Ｍ１'抗体の相対的な結合親和性
発明者等は、１μｇ／ｍｌでの抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の広い範囲の結合強度を観察した。ＩｇＥ−ｌｏｎｇレセプターに対するこれら抗体の相対的な親和度を評価するために、発明者等は、ＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ細胞を抗Ｍ１'抗体の段階希釈物(１、０．１、０．０１、０．００１μｇ／ｍｌ)にて染色した。ＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ細胞は、マウスおよびヒトの血清(１０μｌ)にて氷上で２０分かけてブロックした。細胞は、適量の抗Ｍ１'抗体、又は抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１ないしは抗ブタクサｍＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールにてさらに２０分かけて染色した。次いで、細胞をＦＡＣｓ洗浄バッファ(１ｍｌ)にて洗浄し、遠心分離をし(１２００ｒｐｍにて５分間)、その後検出のために、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ抗体(５μｌ)(Caltag/Invitrogen, Carlsbad, CA, #M30004-4)を有する１００μｌのＦＡＣｓ洗浄バッファに再懸濁した。細胞を上記のように再び洗浄し、その後ＦＡＣ Ｃａｌｉｂｕｒ機(BD, Inc, Franklin Lakes, NJ)にて分析した。電圧環境は、０．００１μｇ／ｍｌアイソタイプコントロールに基づいた。これらの結果から、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体候補は、相対的な結合親和性に従って以下のようにランク付けした。
４２Ｈ４ ＞ ７Ａ６、４７Ｈ４、４７Ｇ４ ＞ ４２Ａ５、２６Ａ１１、４５Ｃ１ ＞ ５１Ｄ２、２６Ｂ１１ ＞ １Ｃ１１ ＞ ２８Ｅ９
抗体力価およびＦＡＣｓ検出による相対的な親和性測定に加えて、発明者等は、スキャッチャード分析を用いて、ＩｇＥロング型を発現するＢＪＡＢ細胞株に対する選択した抗Ｍ１'抗体の親和性も決定した。ＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ細胞は、基本培地からなる冷たい結合バッファに結合のために調製し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および２％ＦＢＳ並びに４０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧとした。１．７×１０６細胞／ｍｌの濃度に細胞を希釈し、アッセイに添加するまで氷上に置く。抗体は、ヨード法によってヨード化する。様々な濃度の非標識抗体を、飽和濃度から０の濃度までの１：２希釈により、計１４の濃縮物として、３通りずつ調製した。単一濃度のヨード化抗体を、競合非標識抗体のすべての希釈物に加えた。最後に、２５００００のＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ細胞を、ヨード化抗体及び非標識抗体の各々の混合物に加えた。試料は、振とうしながら４℃で４時間インキュベートした。次いで各試料を集め、メンブランにて濾過し、結合バッファにて少なくとも３回洗浄し、乾燥させて、その後Perkin Elmer Wizard 1470自動ガンマ計測器を用いて１分間測定した。
実施例４Ａ
マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体のスキャッチャード親和性
Ｍ１'を有する又は有さない様々な形態のＩｇＥ(ヒト、アカゲザル、カニクイザル)を発現するＢＪＡＢ細胞又はダウディ細胞は、基本培地からなる冷たい結合バッファに結合のために調製し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４および２％ＦＢＳ並びに４０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧとした。１．７×１０６細胞／ｍｌの濃度に細胞を希釈し、アッセイに添加するまで氷上に置く。タンパク質／抗体は、ヨード法によってヨード化する。様々な濃度の冷たいタンパク質を、飽和濃度から０の濃度までの１：２希釈により、計１４の濃縮物として、３通りずつ調製した。単一の濃度の温かいタンパク質をすべての希釈物に加え、冷たいタンパク質と競合させる。最後に、細胞を温かいタンパク質と冷たいタンパク質の混合物に加え、１試料当たり２５００００細胞を用いた。アッセイは、振とうさせながら４℃に４時間保った。次いで各試料を集め、メンブランにて濾過し、少なくとも３回結合バッファにて洗浄し、乾燥させ、その後Perkin Elmer Wizard 1470自動ガンマカウンターを用いて１分間計測した。
図３Ｏは、スキャッチャード分析によって測定される、マウス抗Ｍ１'抗体の親和性をまとめたものである。マウス抗体４７Ｈ４ ｍＩｇＧ１は、ヒト、アカゲザル、カニクイザルのＭ１'を、それぞれ０.７９、０.７７及び０.９７ｎＭの親和性で結合した。マウス抗体２６Ａ１１ ｍＩｇＧ１及び７Ａ６ ｍＩｇＧ１は、ヒトＭ１'を、それぞれ２．３及び０．６４ｎＭの親和性で結合した。
図３Ｐは、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルのＭ１'に対する、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の結合親和性をまとめたものである。ヒト化抗体４７Ｈ４ｖ５ ｈｕＩｇＧ１は、ヒト、アカゲザル及びカニクイザルのＭ１'を、それぞれ１．５、１．３及び２．５ｎｍの親和性で結合した。ヒト化抗体４７Ｈ４ ｖ２、４７Ｈ４ ｖ１、２６Ａ１１ ｖ６、２６Ａ１１ ｖ１４および２６Ａ１１ ｖ１は、ヒトＭ１'を、それぞれ０．５４、０．３７、１．８５、１．５および１．０６の親和性で結合した。
実施例５
抗ＩｇＥ／Ｍ１'エピトープ結合／ブロック実験
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体候補物質間でブロック実験を行い、オーバーラッピング又は明らかな結合エピトープを決定した。ブロック及び検出抗体が異なるアイソタイプ(すなわち、ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ)のものである場合、これらのアイソタイプの相違を活かして、アイソタイプ特異的二次抗体(CALTAG/Invitrogen, Carlsbad, CA、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ #32004、又はヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ #M32204)にて検出することによってブロックの程度を決定した。ブロック及び検出抗体が同じアイソタイプのものである場合、抗体をビオチン(Pierce, Rockford, IL, EZ-link-sulfo-NHS-LC- Biotin #CAS 127062-220)にコンジュゲートさせ、ストレプトアビジン−ＰＥ(BD #554061)にて検出するか、Ａｌｅｘａ−６４７(Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA, #A20173)にコンジュゲートさせた。まず最初に、ブロック抗体と検出抗体を１:１の比率(１０μｇ／ｍｌ)で用いた(図４Ａ−４Ｂ)。始めに全く又は一部のみのブロックを示す抗体組合せを、検出抗体に対するブロック抗体の比率を１０：１にして更なる試験を行った。ＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ細胞をマウス及びヒトの血清にてブロックし(上記のように)、その後ブロック抗体(１０μｇ／ｍｌ)を含むＦＡＣｓ洗浄バッファ(２％ＦＢＳ／１×ＰＢＳ)にて氷上で２０分かけて染色した。細胞をＦＡＣｓ洗浄バッファにて洗浄し、その後、１:１(１０μｇ／ｍｌ)又は１０：１(１μｇ／ｍｌ)の検出抗体にて氷上で２０分間かけて染色した。細胞を上記のように再度洗浄し、その後ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機(BD, Inc, Franklin Lakes, NJ)にて分析した。染色された細胞は、抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１ (Genentech, Inc.)又は抗ブタクサｍＩｇＧ２ａ(Genentech, Inc.)何れかのアイソタイプコントロール抗体と比較した(図４Ｃ)。比較のために、可能な場合コンジュゲートしていない同じ抗体にて染色して完全ブロックを決定した。
ブロック実験により、３つの主な結合グループＡ及びＢ及びＣが明らかとなった。グループＡは、部分的にオーバーラップしているエピトープに基づいてさらに２つのグループＡ１(４７Ｈ４、４７Ｇ４、４２Ｈ４、４２Ａ５)及びＡ２(４５Ｃ１、５１Ｄ２、２６Ａ１１)に分類された(図４Ｄ)。グループＣ(２６Ｂ１１)は他の抗体候補物質とほとんどオーバーラップしていなかった。３つの候補物質は他の候補物質よりも広くオーバーラップしていた。１Ｃ１１は、グループＡ１とＡ２と結合をオーバーラップしているようであり、グループＢ(２８Ｅ９)により部分的にのみブロックされた。７Ａ６は主にグループＡ１に属しているが、グループＡ２候補物質と一部相互作用を有していた。２８Ｅ９はそれのみで一のグループに属する。２８Ｅ９はグループＡ２候補物質と一部のみ相互作用した。
実施例５Ａ
エピトープマッピング
図５Ａ−Ｅは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を用いて行ったエピトープ結合実験を示す。マウス抗体４７Ｈ４、７Ａ６および２６Ａ１１を図５Ｂおよび５Ｄに示し、ヒト化変異体４７Ｈ４ｖ５、７Ａ６ｖ１および２６Ａ１１ｖ６を図５Ｃ及び５Ｅに示す。
エピトープマッピング実験：マウス候補物質
ヒトＭ１'を囲む及び内包する配列を繋ぐ１５ペプチドを生成した(Clifford Quan)(図５Ａ)。ペプチドをｄＨ２Ｏ又は５０％ＤＭＳＯに再懸濁した。ペプチドは、コーティングバッファ(０．０５Ｍ 炭酸／炭酸水素(ｐＨ９．６)(１００μｌ／ウェル))中に１μｇ／ｍｌで９６ウェルプレート(NUNC Maxisorp high protein-binding capacity ELISA plates #44-2404)上にコートした。Ｍ１'−Ｆｃ融合タンパク質を結合についてのポジティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロールには、ヒトＩｇＥ(Ｕ２６６)でコートしたウェルと非コートウェルを用いた。ペプチドを４℃に終夜置いてコートさせた。次の朝にプレートを洗浄バッファ(ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０(ｐＨ ７．４))にて３回洗浄した。次いで、プレートをブロックバッファ(ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ(ｐＨ ７．４))中で緩やかに撹拌しながら１時間ブロックした。試験する抗体(４７Ｈ４ ｍＩｇＧ１、４７Ｈ４ｖ５ ｈｕＩｇＧ１、２６Ａ１１ ｍＩｇＧ１、２６Ａ１１ｖ６ ｈｕＩｇＧ１、７Ａ６ ｍＩｇＧ１、７Ａ６ｖ１ ｈｕＩｇＧ１)の希釈(４０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌ)は、マジックバッファ［ＰＢＳ(ｐＨ７．４)、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｐｐｍ Ｐｒｏｃｌｉｎ.、０．２％ ＢｇＧ、０．２５％ Ｃｈａｐｓ、５ｍＭ ＥＤＴA、０．３５Ｍ ＮａＣｌ］にて行った。抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１およびハーセプチン(登録商標)ｈｕＩｇＧ1抗体を、それぞれマウス及びヒトの抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体に対するコントロールとして用いた。プレートを十分にブロックした後(０．５％ ＢＳＡ／１×ＰＢＳ)、プレートを３回洗浄し、その後抗体を３通りずつプレートに添加した(１００μｌ／ウェル)。プレートは、それから室温で、２時間暖められた。マウス抗体プレートを３回洗浄し、その後抗マウスＩｇＧ１−ビオチン(BD Biosciences (A85-1) #553441)を添加して(１：１００００、１００μｌ／ウェル)、室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、ＳＡ−ＨＲＰ(BD Biosciences＃554066)を加え(１:２０,０００、１００μｌ／ウェル)、１時間インキュベートした。ヒトＩｇＧ1抗体プレートを前記のように洗浄し、抗ｈｕＩｇＧ.Ｆｃ−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch(#109-036-098))を加え(１:１００００、１００μｌ／ウェル)、室温で１時間インキュベートした。二次インキュベートが完了したら、プレートを６回洗浄し、ＴＭＢ基質(BD OptEIA #555214)を加えた(１００μｌ／ウェル)。基質−ＨＲＰ反応は４分以内に１Ｍ Ｈ３ＰＯ４にて止めた。その後プレートを４５０／６５０で読み取った。データは相対的なＯＤ(ＯＤ４５０／ＣＤ６５０)として表された。
図５Ｂ及び５Ｄは、マウスの４７Ｈ４、２６Ａ１１および７Ａ６抗ＩｇＥ／Ｍ１'候補物質のＭ１'ペプチドへの結合を示す。これらの候補物質の結合は、抗体ブロック実験で示されたエピトープグループ分けと相関している。４７Ｈ４ ｍＩｇＧ１はペプチド４(SAQSQRAPDRVLCHS)(配列番号：８)を結合した。７Ａ６ ｍＩｇＧ１はペプチド４(SAQSQRAPDRVLCHS)(配列番号：８)と５(RAPDRVLCHSGQQQG)(配列番号：９)を結合した。２６Ａ１１ ｍＩｇＧ１はペプチド７(GQQQGLPRAAGGSVP)(配列番号：１１)と８(PRAAGGSVPHPRCH)(配列番号：１２)を結合した。
図５Ｃ及び５Ｅは、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体のＭ１'ペプチドへの結合を示す。異なる二次抗体を用いたことを除いて、前記のように、対応するマウス抗体についてエピトープマッピングを行った。ヒトＩｇＧ1抗体プレートを前記のように洗浄し、抗ＩｇＧ.Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体(Jackson ImmunoResearch(#109-036-098)を加え(１:１０,０００、１００μｌ／ウェル)、室温で１時間インキュベートした。エピトープ結合は親マウス抗体により観察されるものと同等である。４７Ｈ４ ｖ５はペプチド４(SAQSQRAPDRVLCHS)(配列番号：８)を結合する。７Ａ６ ｖ１はペプチド４(SAQSQRAPDRVLCHS)(配列番号：８)と５(RAPDRVLCHSGQQQG)(配列番号：９)を結合した。２６Ａ１１ ｍＩｇＧ１はペプチド７(GQQQGLPRAAGGSVP)(配列番号：１１)と８(PRAAGGSVPHPRCH)(配列番号：１２)を結合した。
実施例６
ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞におけるマウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'によるアポトーシスの誘導
ダウディ−Ｌｏｎｇ(ＩｇＥ／Ｍ１')細胞を用いて、アポトーシスの誘導に対する架橋した表面ＩｇＥの効果を試験した。ダウディ細胞(ATCC, Manassas, VA、#CCL-213)は、ＢＣＲ架橋に応答してアポトーシスを起こしやすいことが知られているヒトバーキットリンパ腫細胞株である。ＩｇＥのロング型を発現するダウディ細胞は、Ｍ１'を有するＩｇＥのＵ266重鎖および軽鎖のレトロウイルス形質導入によって生成した。ＢＪＡＢ ＩｇＥ Ｌｏｎｇ細胞の生成については上記の通りである。内在性ＩｇＭ及び形質移入したＩｇＥ Ｂ細胞レセプターに対する抗体を用いたダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞のフローサイトメトリー分析はＩｇＥよりもＩｇＭの高い発現を示す。ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞のアポトーシスは、培養培地［ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ(Hyclone, Logun, UT, #SH30071.03)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #15140-122)、２ｍＭ グルタミン(Genentech, Inc.)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(７．２)(Genentech, Inc.)、１ｍＭ ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #11360)、１．５９ｇ／ｌ 炭酸水素ナトリウム溶液(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #25080-094)］中で０．２×１０６／１．５ｍｌの密度にまで培養した細胞において試験した。アポトーシスアッセイを始める前に、フィコール勾配(GE Healthcare #17-1440-03)により死んでいる細胞(dead cell)を除去し、アッセイにおける細胞死のバックグラウンドレベルを減らした。０．２×１０６の細胞を、抗Ｍ１'抗体又はコントロール抗体のある場合とない場合３通りずつ、溶液中で７２時間培養した。次いで細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ(BD Biosciences, San Jose, CA＃556547)を用いてアポトーシスのレベルを分析した。細胞を冷たいＰＢＳ(Genentech, Inc.)にて２回洗浄し、その後１００μｌの１×結合バッファ(０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ/ＮａＯＨ(ｐＨ７．４)、１．４Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２)(BD Biosciences, San Jose, CA, #51-66121E)に再懸濁した。次いで細胞を、２．５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体(BD Biosciences, San Jose, CA＃51-65874X)と５μｌのヨウ化プロピジウム(ＰＩ)(BD Biosciences, San Jose, CA#51-66211E)にて暗所で染色した。１５分後に、４００μｌの１×結合バッファを各チューブに加え、細胞をＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー機(BD, Inc. Franklin Lakes, NJ)にて分析した。各試料についておよそ１０−２００００の事象が集められた。死にかけている細胞(dying cell)は、アネキシン−ＶポジティブかつＰＩネガティブとして定義される。死んでいる細胞は、アネキシン−ＶおよびＰＩの両方についてポジティブである。各集団(dead及びdying)の割合はFlowJo FACs分析ソフトウェア(Tree Star, Inc., Ashland, Oregon)を用いて算出した。３通りのデータを平均し、標準偏差を算出した。％アポトーシスは、dead及びdying細胞の合計として算出し、エクセル(Microsoft, Inc.)を用いてグラフにした。
カンプトセシン(Sigma−Aldrich, St. Louis, MO、#C9911-１００ｍｇ)と抗ＩｇＭ抗体(JacksonImmuno Research, West Grove, PA、＃109−006−120)を、Ｄａｕｄｉ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞株におけるアポトーシス誘導についてのポジティブコントロールとして用いた。抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１又は抗ブタクサｍＩｇＧ１抗体(Genentech, Inc.)を、このアッセイのネガティブコントロールとして用いた。ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞は、一定の範囲の抗ＩｇＥ／Ｍ１'又はアイソタイプコントロール抗体濃度(２５、１０、１、０．１、０．０１、０．００１μｇ／ｍｌ)で培養した。試験した抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、７Ａ６、４７Ｈ４、４７Ｇ４、４２Ａ５、４２Ｈ４、１Ｃ１１、２６Ａ１１、５１Ｄ２、４５Ｃ１、２６Ｂ１１および２８Ｅ９(Genentech, Inc.)であった。抗ヒトＩｇＥ抗体(Ｍａｅ１１−ｍＩｇＧ１)も比較のために用いた。
アイソタイプコントロール抗ｇｐ１２０及び抗ブタクサ抗体は未処理の細胞を超えるアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスのバックグラウンドレベルは、各実験について１０−１５％の範囲であった。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体７Ａ６(＞１０μｇ／ｍｌ)、４７Ｈ４(＞１０μｇ／ｍｌ)および４７Ｇ４(２５μｇ／ｍｌ)は、ダウディＩｇＥｌｏｎｇ細胞のアポトーシスを誘導した。２６Ａ１１は、同程度のアポトーシスを誘導したが(３０−５０％以下)、さらに低い濃度(＞０．１μｇ／ｍｌ)であった。４２Ａ５、５１Ｄ２、４５Ｃ１、２６Ｂ１１及び２８Ｅ９はバックグラウンドレベルを超えるほどのアポトーシスを誘導しなかった。またＭａｅ１１はバックグラウンドレベルを超えるほどのアポトーシスを誘導しなかった。
また、発明者等は、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２二次抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA#115-006-062)の存在下でアポトーシスアッセイを行い、ダウディ細胞株上のＩｇＥ Ｂ細胞レセプターを強く架橋させた。架橋実験は、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２抗体(３０μｇ)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA、#115-006-062)の存在下で行った。２６Ｂ１１(３０％)を除いて、すべての抗体は、異なる濃度であるが７０−８０％の最大アポトーシスレベルを誘導した。これらの抗体は２つのグループに分類されうる。７Ａ６、１Ｃ１１、２６Ａ１１、５１Ｄ２、４５Ｃ１および２８Ｅ９は、最も高い濃度で最大アポトーシスを誘導した。他方のグループの４７Ｈ４、４７Ｇ４、４２Ａ５、及び４２Ｈ４、とＭＡＥ１１は高い濃度ほどアポトーシスの低減を示した。
実施例６Ａ
Ｄａｕｄ／ＩｇＥ−ｌｏｎｇ細胞におけるヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体のアポトーシスの誘導
ダウディ−Ｌｏｎｇ(ＩｇＥ／Ｍ１')細胞を用いて、この細胞株におけるアポトーシスの誘導に対する架橋した表面ＩｇＥの効果を試験した。ダウディ細胞(ATCC, Manassas, VA、#CCL-213)は、ＢＣＲ架橋に応答してアポトーシスを起こしやすいことが知られているヒトバーキットリンパ腫細胞株である。ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞は、培養培地［ＲＰＭＩ、１０％ ＦＢＳ(Hyclone, Logun, UT, #SH30071.03)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #15140-122)、２ｍＭ グルタミン(Genentech, Inc.)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(７．２)(Genentech, Inc.)、１ｍＭ ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #11360)、１．５９ｇ／ｌ 炭酸水素ナトリウム溶液(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA #25080-094)］中で０．２×１０６／１．５ｍｌの密度にまで一晩培養し、その後翌日dead細胞をフィコール勾配(GE Healthcare #17-1440-03)にて取り除いた。これによりアッセイ中の細胞死のバックグラウンドレベルを低減した。０．２×１０６の細胞を、抗Ｍ１'抗体又はコントロール抗体のある場合とない場合３通りずつ、溶液中で７２時間培養した。次いで細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ(BD Biosciences, San Jose, CA＃556547)を用いてアポトーシスのレベルを分析した。細胞を冷たいＰＢＳ(Genentech, Inc.)にて２回洗浄し、その後１００μｌの１×結合バッファ(０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ(ｐＨ７．４)、１．４Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２)(BD Biosciences, San Jose, CA, #51-66121E)に再懸濁した。次いで細胞を、２．５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体(BD Biosciences, San Jose, CA#51-65874X)と５μｌのヨウ化プロピジウム(ＰＩ)(BD Biosciences, San Jose, CA#51-66211E)にて暗所で染色した。１５分後に、４００μｌの１×結合バッファを各チューブに加え、細胞をＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー機(BD, Inc. Franklin Lakes, NJ)にて分析した。各試料についておよそ１０−２００００の事象が集められた。dying細胞は、アネキシン−ＶポジティブかつＰＩネガティブとして定義される。dead細胞は、アネキシン−ＶおよびＰＩの両方についてポジティブである。各集団(dead及びdying)の割合はFlowJo FACs分析ソフトウェア(Tree Star, Inc., Ashland, Oregon)を用いて算出した３通りのデータを平均し、標準偏差を算出した。％アポトーシスは、dead及びdying細胞の合計として算出し、エクセル(Microsoft, Inc.)を用いてグラフにした。
抗ＩｇＭ抗体(JacksonImmuno Research, West Grove, PA、#109-006-120)を、Ｄａｕｄｉ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞株におけるアポトーシス誘導についてのポジティブコントロールとして用いた。ハーセプチン(登録商標)ｈｕＩｇＧ１(Genentech, Inc.)を、このアッセイのためのネガティブコントロールとして用いた。ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞は、一定の範囲の抗ＩｇＥ／Ｍ１'又はアイソタイプコントロール抗体濃度(２５、１０、１、０．１、０．０１、０．００１μｇ／ｍｌ)で培養した。二次架橋実験はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２抗体(５０μｇ)(Biosource#AHI1301)の存在下で行った。試験した抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、４７Ｈ４ｖ５、２６Ａ１１ ｖ６、７Ａ６ｖ１ ｈｕＩｇＧ１であった。
アイソタイプコントロールハーセプチン(登録商標)ｈｕＩｇＧ１は未処理細胞を超えてアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスのバックグラウンドレベルは、各実験について１０−１５％の範囲であった。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４ ｖ５、２６Ａ１１ｖ６および７Ａ６ｖ１は、３０−４０％の範囲のアポトーシスを誘導した(図８Ａ)。
発明者等は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２二次抗体(Biosource#AHI1301)の存在下で同様のアッセイを繰り返し、ダウディ細胞株上のＩｇＥレセプターを架橋した。すべての抗体は７０−９０％の最大アポトーシスレベルを誘導し、いくつかは高濃度の一次抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体でアポトーシス活性が減少した(図８Ｂ)。
二次的に架橋することなくアポトーシスを誘導する際の野生型対アフコシル化の４７Ｈ４ｖ５
４７Ｈ４ ｖ５のアフコシル化(ＡＦ)バージョンは、ＢＩＯＷＡ細胞株(Genentech, Inc.)を用いて製造した。４７Ｈ４ ｖ５のＷＴおよびＡＦバージョンは、同様のレベルまでアポトーシスを誘導することができた(図８Ｃ)。
表１ ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'結合親和性
Figure 2017048190
実施例７
誘導されたカルシウム流動
発明者等は、抗Ｍ１'抗体がＩｇＥ Ｂ細胞レセプターの下流の細胞性シグナル伝達を誘導することができる証拠として、抗Ｍ１'抗体の、ダウディ−ＩｇＥ／Ｌｏｎｇ細胞におけるカルシウム流動の誘導能を調べた。ＩｇＥ／Ｍ１'のロング型を過剰発現するダウディ細胞(ATCC, Manassas, VA, #CCL-213)を０．２×１０６／ｍｌの薄い濃度で終夜培養した。翌朝dead細胞をフィコール勾配(GE Healthcare #17-1440-03)にて除去した。細胞は、Ｉｎｄｏ−1とともに大量に流し(load)、すべての刺激群間で同等な負荷(loading)とした。細胞は、培養培地(ＲＰＭＩ−１０％ ＦＢＳ (Hyclone)、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン)中で５×１０６／ｍｌで再懸濁し、カルシウム検出色素Ｉｎｄｏ−１(５μＭ)(Molecular probes/Invitrogen, Carlsbad, CA, #I1223)と組み合わせた。次いで細胞を培養培地にて洗浄し、１０６／ｍｌで再懸濁した。１刺激群につき１０６細胞を用いた。試料を３７℃の水槽中で５分間温め、ＦＡＣｓ Ｖａｎｔａｇｅ機(BD, Inc, Franklin Lakes, NJ)にて実行した。まず最初に試料を１分間実行して基準を生成させ、その後、抗ＩｇＭ(１０μｇ)を除いて２０μｇの各抗体により試料を刺激した。８−１０分間、データを集めた。ＦｌｏｗＪｏ ＦＡＣｓ分析ソフトウェア(Tree Star, Inc., Ashland, Oregon)にて動態解析を行った。Ｉｎｄｏ−１ ４０５Ｂｏｕｎｄ／Ｉｎｄｏ−１ １５３０Ｆｒｅｅの比率としてデータを示す。すべての抗Ｍ１'抗体は、アイソタイプコントロール抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１(２０μｇ)と比較した。抗ヒトＩｇＭ(Jackson Immuno−Research, West Grove, PA、#109-005-129)と抗ＩｇＥ(Ｍａｅ１１、Genentech, Inc.)をポジティブコントロールとして用いた。７Ａ６、４７Ｈ４、４７Ｇ４、２６Ａ１１および１Ｃ１１は、ダウディＩｇＥｌｏｎｇ細胞においてカルシウム流動を誘導した。２８Ｅ９および４２Ａ５は低いレベルのカルシウム流動を誘導した。４５Ｃ１、２６Ｂ１１及び５１Ｄ２はカルシウム流動を誘導しなかった。
実施例８
抗ＩｇＥ／Ｍ１' ４７Ｈ４ ｖ５ ｗｔおよびアフコシル化によるＡＤＣＣの誘導
抗体依存性細胞媒介性毒性により、細胞障害性細胞は抗原結合標的細胞に(抗体を介して)結合し、その後細胞毒性により標的細胞を殺すことができる。ＡＤＣＣ活性又は亢進したＡＤＣＣ活性を有する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、ＩｇＥが媒介する疾患の治療における治療的値を向上するかもしれない。
アフコシル化されている哺乳動物細胞において産生される抗体がＡＤＣＣ活性を亢進していたことを発見した。以下の実験は、アフコシル化された抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の産生を記述した。
ＮＫ細胞は１００ｍｌの全血(RosetteSep #15065, Stem Cell Technologies)から単離した。ＮＫ細胞の純度は抗ヒトＣＤ５６染色にて決定した。７０％より大きな純度のＣＤ５６+ ＮＫ細胞を各アッセイに用いた。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体およびハーセプチン(登録商標)抗Ｈｅｒ２ ＭＡｂ ｈｕＩｇＧ１アイソタイプコントロールは、連続的に力価測定した。これら抗体(５０μｌ)は、細胞表面上にヒトＩｇＥ／Ｍ１'を過剰発現するＢＪＡＢ細胞とともに、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０(フェノールレッドなし)(BioWhitaker #12-918F)中で、室温で３０分間インキュベートした(細胞株は上記に概説したように生成された)。次いで、ＮＫ細胞(５０μｌ)を１５：１の比で細胞株に添加した(１５００００のＮＫ細胞対１００００標的(ＢＪＡＢ−Ｌｏｎｇ))。アッセイは３通りずつ行った。次いでＢＪＡＢ−ｈｕＬｏｎｇ、抗体及びＮＫ細胞を３７℃で４時間インキュベートした。培養の後、９６ウェル丸底プレートを回転させ、上清を回収した(１００μｌ)。次いで上清は、ＬＤＨ反応アッセイ(Roche＃1644793)を用いてＬＤＨ放出について試験した。標的のみ及び溶解した標的を用いて％細胞毒性を算出した。上清は、製造業者によって概説されるように、ＬＤＨ反応混合物と同じ体積で３０−６０分間インキュベートした。次いでプレートを４９０ｎｍで読み取った。％細胞毒性は以下の通りに算出した。＝（Ｅｘｐ値−標的のみ）／標的溶解物−標的のみ）。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈを用いてデータをプロットし、ベストフィット曲線を用いてＥＤ５０値を求めた。
図１０では、ハーセプチン(登録商標)ｈｕＩｇＧ1アイソタイプコントロール抗体は、低レベルの細胞毒性を誘導した。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は特異的な細胞毒性を誘導した。抗ＩｇＥ／Ｍ１' ４７Ｈ４ｖ５の野生型およびアフコシル化型は、同等の最大％細胞毒性(７０−８０％以下)を誘導した。アフコシル化４７Ｈ４ｖ５は野生型よりも強力であった(アフコシル化４７Ｈ４ｖ５のＥＣ５０は０．８３ｎＭ以下であり、野生型４７Ｈ４ｖ５のＥＣ５０は６．６ｎＭ以下であった)。
実施例９
アトピーｈｕ−ＳＣＩＤマウスにおけるマウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の効果
図１２Ａおよび１３Ａは、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体(それぞれマウス及びヒト化の両方)の有するアトピーｈｕ-ＳＣＩＤモデルにおける血清ＩｇＥおよびＩｇＥを産生するプラズマ細胞の産生を阻害する能力を示す。実験１(＃０７−０３７７)はマウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'候補物質を試験し、実験２(＃０７−１２３２)はヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'を試験した。
ドナーは、ハウスロイコパック血液ドナープログラムにおいて我々から血清ＩｇＥレベルについて検索した。アトピーｈｕ−ＳＣＩＤモデルに細胞を提供するために選択された２つのドナーは、アレルギーがあると識別され、１６９６および１１５２ｎｇ／ｍｌの血清ＩｇＥレベルを有していた。通常、正常ドナーは１００−３００ｎｇ／ｍｌ未満のＩｇＥを有する。
ｈｕ−ＳＣＩＤ実験は図１２Ａ及び１３Ａに概説する。ＰＢＭＣは白血球フェレーシス及びフィコール密度勾配(GE Healthcare #17-1440-03)によって単離し、計数した。１０８のＰＢＭＣ細胞(１０８／１００μｌ)を０日目に放射線照射したＳＣＩＤベージュマウス内に腹腔内投与した。ＩｇＥ産生に対する応答をゆがめるために、マウスは、０及び３日目に抗ＩＦＮ(BD Biosciences, San Jose, CA、＃554698)及び抗ＩＬ１２抗体(１００μｇ／用量)(BD Biosciences, San Jose, CA、＃554659)にて、２、３、４日目にｒｈＩＬ−４(１００ｎｇ／用量)(R&D Systems, Minneapolis, MN、#204-IL-010)にて処置した。マウスは、実験の０日目から終わるまで、週３回(およそ３日おき)に、実験的抗体(すなわち抗ＩｇＥ／Ｍ１')にて処置した。７日からマウスを安楽死させた１４日までヒト細胞を増やした(expand)。７日目と実験の最後に血液を採取した。実験の最終日にマウスを安楽死させ、脾細胞を単離した。単一細胞懸濁液をＩｇＥエリスポットアッセイ及びＦＡＣｓに用いて、ヒト細胞再構成およびＩｇＥプラズマ細胞枯渇の程度を決定した。
データは平均±標準偏差として表す。Ｐ値はＪＭＰ統計ソフトウェアを用いて算出した。ダネットの試験はグループ平均を比較するものであり、すべての実験群は参照群に対して試験される。各対のスチューデントｔ検定はスチューデントｔ検定を用いて各群の対を比較する。その後、ボンフェローニ補正を行い、各対のスチューデントｔ検定のｐ値を調製し、一対比較を防いだ。すべてのｐ値の閾値は０．０５である。図１２Ａ−Ｉ及び１３Ａ−Ｈに示されるデータの％変化は、基準レベルに正規化することなく、処置群とコントロール群の間で算出した。
フリーＩｇＥレベルはヒトＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。この方法では、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４-ウェルＥＬＩＳＡプレート(Nalge Nunc International, Rochester, NY)を１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＭＡＥ１１を含む５０ｍＭ 炭酸バッファ, ｐＨ９.６にて、４℃で終夜をかけてコートし、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温で１時間かけてブロックした。０.５%ウシ血清アルブミン、０.０５%ポリソルベート２０、１０百分率(ｐ.ｐ.ｍ) Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００ (Supelco, Bellefonte, PA)、０.２５% ＣＨＡＰＳ(Sigma, St. Louis, MO)。０.２%ウシｇグロブリン(Biocell, Rancho Dominguez, CA)及び５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の標準物質(０.０９８−１２.５ｎｇ／ｍｌ)と試料の３倍段階希釈物(任意の血清効果を妨げるために１：１０を最小希釈とする)を、プレート上で室温で１時間インキュベートした。結合したＩｇＥは、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)をウェル中で１時間インキュベートして検出した。基質３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加え、１Ｍ リン酸を加えて反応を止めた。工程の間でプレートを洗浄した。Titertek stacker読み取り機(ICN, Costa Mesa, CA)にて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。標準曲線を４パラメーター非線形回帰曲線フィッティングプログラム(Genentechにて開発)を用いてフィットさせた。標準曲線の線形範囲内のデータポイントを、試料のＩｇＥ濃度を算出するために用いた。
ヒト免疫グロブリンアイソタイプパネルは、マウスモノクローナル抗体(Ａｂ)をヒトＩｇＧ１(クローン２Ｃ１１、Abcam Inc., Cambridge, MA)として行い、０．０５Ｍ 炭酸ナトリウムバッファ, ｐＨ９．６にて４ｕｇ／ｍｌに希釈し、４℃で終夜インキュベートしてＥＬＩＳＡプレート(384-well, high-bind plates, Greiner Bio One, Monroe, NC)上にコートした。洗浄バッファ(ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０)にて３回洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)にて１−２時間かけてブロックした。これと他のすべてのインキュベートは室温で環状に振とうしながら実施した。マウス血清試料は、アッセイバッファ(ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／０．２５％ ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１５ＰＰＭ Ｐｒｏｃｌｉｎ)を用いて１：１００に希釈した後、段階的に１：３希釈を行った。同じバッファを使用して、標準曲線のためにＩｇＧ１の階段希釈物を調製した(１２．２０−１５６０ｎｇ／ｍｌ)。標準曲線の高い、真ん中、低い領域の予め希釈した凍結コントロールを解凍した。ブロック工程の後、プレートを洗浄し、試料、標準物質およびコントロールを３８４ウェルプレートに加え、２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ヒトＩｇＧ１に対するビオチン化マウスｍＡｂ(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)をアッセイバッファにて１:５００に希釈し、洗浄したプレートに加えて１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＳＡ−ＨＲＰ)(GE Healthcare, Piscataway, NJ)は、アッセイプレートにて１:４００００に希釈し、洗浄後プレートに加えた。３０分のインキュベートと最終的な洗浄工程の後に、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加え、１０−１５分間発色させた。１Ｍ リン酸を加えて反応を止めた。マイクロプレート読み取り機を用いて光学密度を求め(４５０ｎｍ、６５０ｎｍ参照波長)、標準曲線の４-パラメーターフィットから試料濃度を算出した。マウス血清試料中のヒトＩｇＧ１の最小の定量化可能濃度は、１．２２ｕｇ／ｍｌであった。
上記の全体のＥＬＩＳＡ法は他のＩｇアイソタイプの分析にも用いた。
ＩｇＧ２
マウス抗ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂ(γ２鎖特異的) (Southern Biotech, Birmingham, AL)を、４ｕｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレート上にコートした。ヒトＩｇＧ２標準曲線範囲は１２．２０−１５６０ｎｇ／ｍｌであった。ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂ(γ２鎖特異的) (Southern Biotech)を０．５μｇ／ｍｌに希釈して、検出抗体として用いた。ＳＡ−ＨＲＰは、１:１００００の希釈で３８４ウェルプレートに加えた。マウス血清試料中のヒトＩｇＧ２の最小定量化可能濃度は１．２２μｇ／ｍｌであった。
ＩｇＧ３
マウス抗ヒトＩｇＧ３ ｍＡｂ(Zymed Laboratories)を１μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにコートした。ヒトＩｇＧ３標準曲線範囲は０．７８−１００ｎｇ／ｍｌであった。ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ３ ｍＡｂ(γ３鎖特異的) (Southern Biotech)を０．１μｇ／ｍｌに希釈し、検出抗体として用いた。ＳＡ−ＨＲＰは１:２００００の希釈で３８４ウェルプレートに加えた。マウス血清試料中のヒトＩｇＧ３の最小定量化可能濃度は７８．１ｎｇ／ｍｌであった。
ＩｇＧ４
精製したマウス抗ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ(BD Pharmingen, San Jose, CA)を０．２５ｕｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにコートした。ヒトＩｇＧ４標準曲線範囲は０．２０−２５ｎｇ／ｍｌであった。ビオチンコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ(BD Pharmingen)を０．２５μｇ／ｍｌに希釈し、検出抗体として用いた。ＳＡ−ＨＲＰは１:２００００の希釈で３８４ウェルプレートに加えた。マウス血清試料中のヒトＩｇＧ４の最小定量化可能濃度は３９．１ｎｇ／ｍｌであった。
ＩｇＡ
精製したマウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２ ｍＡｂ(BD Pharmingen)を２μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにコートした。ヒトＩｇＡ標準曲線範囲は０．２０−２５ｎｇ／ｍｌであった。ビオチンコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＡ１／Ａ２ ｍＡｂ(BD Pharmingen)を１μｇ／ｍｌに希釈し、検出抗体として用いた。ＳＡ−ＨＲＰは１:８００００の希釈で３８４ウェルプレートに加えた。マウス血清試料中のヒトＩｇＡの最小定量化可能濃度は３９．１ｎｇ／ｍｌであった。
ＩｇＭ
精製したマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ(BD Pharmingen)を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにコートした。ヒトＩｇＭ標準曲線範囲は０．７８−１００ｎｇ／ｍｌであった。ビオチンコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ(BD Pharmingen)を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、検出抗体として用いた。ＳＡ−ＨＲＰは１:４００００の希釈で３８４ウェルプレートに加えた。マウス血清試料中のヒトＩｇＭの最小定量化可能濃度は１５６ｎｇ／ｍｌであった。
Ｈｕ−ＳＣＩＤ脾細胞、マウス脾細胞又はリンパ節細胞は、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(BD (San Jose, CA))上のＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ ＹＧミクロスフィア(Polysciences, Inc. #18862)を用いて計数した。
エリスポットアッセイを用いて、ｒｈｕＩＬ−４、抗ＩＦＮおよび抗ＩＬ−12抗体にて１５日間処置した後、ｈｕ−ＳＣＩＤマウスのＩｇＥ産生プラズマ細胞の頻度を決定した。エリスポットプレート(Millipore, Billerica, MA, #MSIPS4510, clear)は、コートバッファ[Genentech, Inc. (A3323)](１００μｌ／ウェル)での一次非コンジュゲート抗ヒトＩｇＥ抗体(AXXORA, San Diego, CA, #BET-A80-108A)の１：５００希釈物にて４℃で終夜をかけてコートした。次いで、一次抗体溶液を注ぎ、洗浄バッファ(１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０)にてプレートを２回洗浄した。メンブランを２００μｌ／ウェルの０．５％ＢＳＡ含有１×ＰＢＳにて３７℃で０．５−１時間かけてブロックした。ブロック溶液を除去し、ポジティブコントロール細胞又はｈｕ−ＳＣＩＤ脾細胞をプレートに加えた。ヒトミエローマＩｇＥ産生Ｕ２６６細胞株(ATCC, Manassas, VA、#TIB196)をポジティブコントロールとして用いた。Ｕ２６６細胞は、３０００細胞／０．１ｍｌ(＝０．０３２×１０６／ｍｌ)のハイブリドーマ培地[ＲＰＭＩ１６４０、１５％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４．５ｇ／ｌ グルコース、１．５ｇ／ｌ 重炭酸塩]の濃度から、７の階段希釈物(１:２)でプレートに加えた。全脾臓単一細胞懸濁液は１ｍｌの培地に再懸濁した。１００μｌを第一ウェルに加えた。次いで７つの１:２段階希釈を行った。Ｕ２６６ハイブリドーマ及び脾細胞を３７℃で終夜インキュベートした。翌日洗浄バッファ（１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０)にてプレートを３回洗浄し、その後１００μｌ／ウェルの二次抗体、抗ヒトＩｇＥ−アルカリンフォスファターゼコンジュゲート(Sigma, St. Louis, MO, A-3525)を、０．５％ ＢＳＡ／１×ＰＢＳにて１：２０００で各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、その後ｄｄＨ２Ｏ(Genentech, Inc.)にて１回すすいだ。１００μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液(R&D Systems, Minneapolis, MN, Elispot Blue Color Module、#SEL002)を各ウェルに加え、暗所にて３０分間インキュベートした。次いでプレートをｄｄＨ２Ｏにて１回すすぎ、プレートを室温で乾燥させた。プレートは計数のためにBD Biosciencesに送った(BD, Inc., Franklin Lakes, NJ)。プラズマ細胞の数は、検出したスポットの数、希釈倍率(細胞インプット)及び総脾細胞数を用いて算出した。
ヒトプラズマ細胞は、抗体処置したｈｕ−ＳＣＩＤマウスから１５日目に脾臓を摘出して調製した。単一細胞懸濁液を調製して濾過した。５×１０６細胞は、ヒト血清(Sigma, St. Louis, MO, #S-2257)及びマウス血清(VWR, #RLD108-0100)にてブロックし、その後、抗ヒトＣＤ３８ ＰＥ抗体(BD Biosciences, San Jose, CA, #555460)及び抗ヒトＰＥ ＦＩＴＣ抗体(Dakocytomation, Glostrup, Denmark, #K2311)を含むＦＡＣｓ洗浄バッファ(２％ ＦＢＳ、１×ＰＢＳ)にて氷上に２０分置いて染色した。次いで細胞を洗浄し、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ機(BD, Inc., Franklin Lakes, NJ)にて分析した。ヒトＣＤ３８発現を成功ヒトＰＢＭＣ転移についてのポジティブコントロールとして用いた。プラズマ細胞はＣＤ３８ ｈｉｇｈ, ＰＣ＋と定義された。
実験＃０７−０３７７(図１２Ａ)では、３つの抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体(４７Ｈ４、２６Ａ１１および７Ａ６)が、アイソタイプコントロール抗ｇｐ１２０−ｍｕＩｇＧ１に対して試験された。アイソタイプコントロール処置マウスは、９日目までに高レベルのヒトＩｇＥを生成した。抗ＩｇＥ／Ｍ１'候補物質による処置により、ＩｇＥレベルが６５−８４％減少した(図１２Ｂ−Ｃ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置によっても、インビボのＩｇＥ産生細胞が１９−６９％減少した(図１２Ｄ−Ｅ)。他の血清Ｉｇは抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置の作用を相対的に受けなかった(ｈｕＩｇ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対するいくつかの抗Ｍ１'抗体において３０％以下の減少が観察された)(図１２Ｆ−Ｇ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置により、脾臓の総プラズマ細胞の割合の減少は観察されなかった(図１２Ｈ−Ｉ)。
実験＃０７−１２３２(図１３Ａ)では、ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'(４７Ｈ４ｖ５)が、アイソタイプコントロール抗体ハーセプチン(登録商標)−ｈｕＩｇＧ１に対して試験された。アイソタイプコントロール処置マウスは、８日目までに高レベルの血清ＩｇＥを生成した。抗ＩｇＥ／Ｍ１' ｈｕＩｇＧ１による処置により、ＩｇＥレベルが７９％(図１３Ｂ−Ｄ)、そしてＩｇＥ産生プラズマ細胞が７５％(図１３Ｃ−Ｄ)減少した。他の血清Ｉｇ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ）(図１３Ｅ−Ｆ)にも脾臓中の総プラズマ細胞の割合にも減少が観察されなかった(図１３Ｇ−Ｈ)。これらの実験から、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が血清ＩｇＥとＩｇＥ産生細胞を特異的に減少させるが、他のアイソタイプの免疫グロブリンはを減少させないことが示唆される。
実施例１０
ヒトＭ１'トランスジェニックマウス
ｈｕＭ１'トランスジェニック「ノックイン」マウスの作製
マウスはヒトと同様なＭ１'ドメインを通常発現しないので、ヒトＭ１'ドメインをマウスＩｇＥ遺伝子座「にノックイン」したマウスを作製した。ヒトＭ１'配列は、上流のマウスＭ１スプライスアクセプター部位を使用し、その後下流のマウスＭ１配列に融合する(図１４B)。ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰｐＡ−Ｎｅｏカセットも、マウスＭ２配列の３'にノックインした。このノックインにより、ＩｇＥ＋Ｂ細胞の表面上にヒトＭ１'ドメインを有するマウスＩｇＥの発現が可能となる。Ｍ１'配列は分泌されたＩｇＥには発現されないであろう。
Ｍ１'ノックイン系統のスクリーニング(ＰＣＲ)
ヒトＭ１'ノックインマウスを、マウスＩｇＥ遺伝子座及びヒトＭ１'配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって遺伝子タイピングを行った。用いたプライマーは以下の通りである。
ＷＴ ＦＯＲ 5'-GGCCAAAGACCCTAAGACAGTC (配列番号：１０６)
ｈｕＭ1' ＦＯＲ 5'-GGGCTGGCTGGCGGCTCCGC (配列番号：１０７)
ＷＴ ＲＥＶ 5'-CTATGCCCTGGTCTGGAAGATG (配列番号：１０８)
精製したゲノムＤＮＡは、３２サイクルの以下のプログラムを使用して上記のプライマーにて分析した［９４℃ ４分；９４℃ １分；６０℃ ３０秒；７２℃ １分(３０サイクル)；７２℃ １０分］。次いでＰＣＲ産物を２％アガロース０．５×ＴＢＥゲルに流した。野生型ＰＣＲ遺伝子型は６６８ｂｐの産物を示し、ｈｕ−Ｍ１'ノックインは４５７ｂｐの産物を生成した(図１４Ｃ)。
Ｍ１'ノックイン系統のスクリーニング(サザン)
ｈｕＭ１'ノックインＥＳ細胞と最終マウス系統をスクリーニングし、サザンブロットにて確認した。１０μｇの精製したＥＳ細胞またはＴａｉｌゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩにて左アーム又はＢａｍＨＩにて右アームを終夜消化した。次いで消化したＤＮＡを０．８％アガロース１×ＴＡＥゲルに流した。次いでＤＮＡを、変性バッファ(１．５Ｍ ＮａＣｌ; ０．５Ｍ ＮａＯＨ)を用いてナイロンメンブラン(Roche #1417240)に終夜転移させた。メンブランをすすいで、ＵＶ架橋させ、その後DIG Easy Hyb 溶液(Roche #1585762)に回転させながら４６℃で４時間浸漬させた。製造業者の指示の通りにＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット(Roche＃11636090910)を用いたＰＣＲによってプローブを生成した。
左アームのプライマーは以下の通りである。
ＦＯＲ 5'-TGTCTGGTGGTGGACCTGGAAAGCG (配列番号：１０９)
Ｒｅｖ 5'-TCCTCGCTCTCCTCCTCTGGTGGTG (配列番号：１１０)
右アームのプライマーは以下の通りである。
ＦＯＲ 5'-CCATGCAACCTAGTATCCTATTCTC (配列番号：１１１)
Ｒｅｖ 5'-CTTTATACAGGAGAACCTAGCCCAG (配列番号：１１２)
非標識のＰＣＲ産物に対してプローブを試験し、サイズを大きくし、良好にＤＩＧ標識させた。次いで回転させながらプローブを４６℃で終夜温め、ブロットを終夜検索した。翌日ブロットを洗浄し、製造業者の指示に従って抗ＤＩＧ抗体にて反応させた。ブロットは１５−２０分間フィルムにさらした。図１４Ｄはサザンの結果を示す。野生型マウスは、左アームの７．４ｋＢのＨｉｎｄＩＩＩ断片を生成するが、これはｈｕ−Ｍ１'ノックイン対立遺伝子では３ｋＢの断片になる。野生型マウスは、右アームの１４．１ｋＢのＢａｍＨＩ断片を生成するが、これはｈｕ−Ｍ１'ノックイン対立遺伝子では１８．１ｋＢの断片になる。野生型およびヘテロ接合のマウスを示す(図１４Ｄ)。
実施例１１
Ｈｕ−Ｍ１'トランスジェニックモデル：ＴＮＰ−ＯＶＡ免疫化
この実験は、ＴＮＰ−ＯＶＡに対する免疫一次応答(Exp. ＃０７−０２３４Ｆ；図１５Ａ−Ｉ)又はメモリー応答(Exp. ＃０７−０２３４Ｂ；図１６Ａ−Ｋ)免疫応答におけるＴＮＰ−ＯＶＡによって刺激されて生じるＩｇＥの生成を阻害する抗ＩｇＥ／Ｍ１'候補物質の能力を示す。ＴＮＰ−ＯＶＡ又はトリニトロフェニル−卵白アルブミンは、強力な抗体免疫応答を生成させるために用いられることが多い非常に強い免疫原である。
データは平均±標準偏差として表す。ＪＭＰ統計ソフトウェアを用いてＰ値を算出した。ダネットの試験はグループ平均を比較するものであり、すべての実験群は参照群に対して試験される。各対のスチューデントｔ検定はスチューデントｔ検定を用いて各群の対を比較する。その後、ボンフェローニ補正を行い、各対のスチューデントｔ検定のｐ値を調製し、一対比較を防いだ。すべてのｐ値の閾値は０．０５である。一次応答(図１５Ａ−Ｉ)及びメモリー免疫応答(図Ａ−Ｋ)について示されたデータ内の％変化は、各々のマウス値から非感染又は非免疫化群の平均値を減じて算出し、群の平均は算出し直し、次いで％変化は各時点のコントロール群に対して算出した。
ヒトＩｇＥ／Ｍ１'ノックインマウス(Ｃ５７ＢＬ／６)のＴＮＰ−ＯＶＡ免疫化によりインビボでのＴｈ１／Ｔｈ２応答が均衡化される。一次免疫および抗原投与後の抗原特異的ＩｇＥレベルは、１０−２００ｎｇ／ｍｌ以下のレベルに達する。実験＃０７−０２３４Ｆでは、ｈｕＭ１'ノックインマウス(Ｃ５７Ｂｌ／６)は、０日目にＴＮＰ−ＯＶＡ(Biosearch Technologies, Novato, CA)(１００μｇ、１マウス当たり２ｍｇのミョウバン中、腹腔内投与)にて免疫化した。次いで、マウスは、０から２８日目まで、０．１ｍｇ／ｋｇの抗体を週３回投与した(図１５Ａ)。実験＃０７−０２３４Ｂでは、(前述同様に)０日目にＴＮＰ−ＯＶＡ／ミョウバンにてｈｕＭ１'ノックインマウス(Ｃ５７Ｂｌ／６)を免疫化し、その後２８日目にＴＮＰ−ＯＶＡ(１マウス当たり１００μｇ)にて追加免役した(図１６Ａ)。２８から４９日目に１０ｍｇ／ｋｇの抗体にてマウスを処置した(図１６Ａ)。免疫応答の経過中にマウスの採血を行い、抗原特異的血清ＩｇＥ及びＩｇＧ１レベルをモニターした。
５０ｍＭ 炭酸ナトリウム／炭酸水素, ｐＨ９．６にて０．５μｇ／ｍｌに希釈した２５μｌ／ウェルのＴＮＰ−ＯＶＡ(１３：１の比のＴＮＰ：ＯＶＡ)(Biosearch Technologies, Novato, CA)にて、２−８℃で１２−１８時間かけてコートしたＥＬＩＳＡプレート(MaxiSorpTM表面を有する３８４ウェル、Nunc, Neptune, NJ)を用いて、ＴＮＰ−ＯＶＡ特異的ＩｇＥ ＩｇＧ１を測定した。次いでプレートを移し、拭き取って乾燥させた。ブロックバッファ(ＰＢＳ, ０．５％ ＢＳＡ, ｐＨ ７．２, ５０μｌ／ウェル)をプレートに加えて１−２時間置いた。これ以降のインキュベートは緩やかに撹拌しながら室温で行った。試料をアッセイ希釈液(ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００)にて１／５０に希釈した後、段階的に１１時点にわたって１／３希釈を行った。標準物質は、１ｎｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＯＶＡ ＩｇＧ１及び３ｎｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＯＶＡ ＩｇＥで初めて、アッセイ希釈液にて、７時点にわたって２倍に段階的に希釈した。プレートは洗浄バッファ(ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０, ｐＨ７．２)にて３回洗浄し、標準物質、試料及びコントロールを加えて(２５μｌ／ウェル)、ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプを別々に検出するためにプレートを複製した。１．５−２時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファにて６回洗浄した。ビオチン化ラット抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＥ ｍＡｂ (BD Biosciences, San Diego, CA)は、ＩｇＧ1の場合には０．５μｇ／ｍＬ又はＩｇＥの場合には１．０μｇ／ｍＬにアッセイ希釈液にて希釈し、適切なプレートに加えた(２５μｌ／ウェル)。プレートを１−１．５時間インキュベートし、洗浄バッファにて６回洗浄した。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(AMDEX, GE Healthcare, Piscataway, NJ)を、ＩｇＧ１の場合には１／８００００又はＩｇＥの場合には１／５０００に希釈し、プレートに加えて３０分置いた(２５μｌ／ウェル)。洗浄バッファにて６回洗浄した後、プレートに、２５μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加えてＩｇＧ１の場合には１５分間、ＩｇＥの場合には２５分間インキュベートして反応させた。２５μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を加えて反応を止め、６２０ｎｍを参照として４５０ｎｍの吸光度を読み取った。未知の試料の結果は標準曲線の４パラメーターフィットのものを用いた。
最初に、脾臓又はリンパ節からのマウスプラズマ細胞をＣＤ１３８＋細胞を分離することによって識別した。これらＩｇＥを産生するプラズマ細胞はエリスポット法によって定量化した。総ＩｇＥ産生細胞には、１ウェル当たり５０μｌのＥＬＩＳＡコーティングバッファを用いて、１：２の希釈で抗ＩｇＥ抗体(BD OptEIA mIgE set #555248から)をMultiScreen HTSプレート(Millpore #MSIPS4W10)にコートした。。４℃で終夜をかけてコートした。翌朝、組織培養フードにてmultichannelピペットを用いて２００μｌの滅菌ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ ２０(０．０５％)にてプレートを５回洗浄した。次いで、３００μｌのＰＢＳ／５％ ＢＳＡ又は細胞培養培地(ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ ＦＢＳ)中で室温で２時間かけてプレートをブロックした。脾臓又はリンパ節から単一細胞懸濁液を調製し、(上記のように)細胞をＦＡＣＳにて計数した。細胞は、１０７細胞の後、ＴＮＰ−ＯＶＡ免疫化モデルのために３−４倍に希釈するか、又はニッポストロンギルス感染モデルのためには４×１０６細胞の後２倍希釈して、プレーティングのために調製した。マウスＡ２０ Ｂ細胞株はネガティブコントロールとして用い、ＴＩＢ−１４１細胞株はポジティブコントロールとして用いた。細胞希釈物は、細胞培養培地(ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ ＦＢＳ)において調製した。ブロック工程の後、プレートを細胞培養培地にて１回洗浄し、吸引した。１ウェル当たり１００μｌで細胞をプレートに播いた。次いで、５％ＣＯ２、３７℃でプレートを終夜インキュベートした。翌日、SkanWasher 300 (Molecular Devices (Sunnyvale, CA))を用いてＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ ２０ (0.05%)にてプレートを６回洗浄した。次いで、BD OptEIA mIgE set (#555248)のビオチン化二次抗体を製造業者の示す濃度で、通常１００μｌ／ウェル中１：２５０−１：５００で用いた。二次抗体をＰＢＳ／１％ ＢＳＡにて調製した。次いで、プレートを室温で１時間インキュベートし、その後SkanWasher300を用いてＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ ２０(０．０５％)にて６回洗浄した。次いで、ストレプトアビジンＡＰを１ウェル当たり１００μｌ中１：６０の希釈で加え、再びＰＢＳ／１％ ＢＳＡにて調製し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを上記のように３回洗浄し、その後ＤＩ水にて２回すすいだ。液体が残っていればペーパータオルで拭き取った。次いで、反応試薬であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ(１００μｌ／ウェル)を加え、プレートを暗所、室温で３０分間インキュベートした。次いで基質を別の容器へ移し、プレートをＤＩ水にて２回すすいだ。プレートを逆さまにして、過剰な水分を除去し、乾燥させた。解剖顕微鏡を用いてスポットを定量化した。
実験＃０７−０２３４Ｆでは、ＴＮＰ−ＯＶＡ一次免疫に対するＩｇＥ応答を阻害する、抗ＩｇＥ／Ｍ１'の能力を試験した。抗ｇｐ１２０アイソタイプコントロール処置マウスは血清ＩｇＥを生成し、８から１４日目にピークのレベルに達した(２５ｎｇ／ｍｌ以下)(図１５Ｂ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置により、８日目(９８％)および１４日目(９９％)までに血清ＩｇＥの増加が妨げられた(図１５Ｃ−Ｄ)。この減少はアイソタイプ処置動物とは有意に異なり、非免疫化マウスとは有意な違いはなかった(図１５Ｃ−Ｅ)。抗原特異的ＩｇＧ１のレベルは、２８日の実験中に抗ＩｇＥ／Ｍ１'の作用をわずかにしか受けなかった(図１５Ｆ−Ｉ)。
実験＃０７−０２３４Ｂでは、ＴＮＰ−ＯＶＡに対する二次／メモリーＩｇＥ応答を阻害する、抗ＩｇＥ／Ｍ１'の能力を試験した。２８日目のＴＮＰ−ＯＶＡ追加免疫に対する二次ＩｇＥ応答は即時的であり、一次応答で８−９日間であったのに対して４日後にピークに達した(図１６Ｂ)。２８日目の追加免疫を始めとした抗ＩｇＥ／Ｍ１'候補物質による処置により、２８日目と３５日目の間のＩｇＥの増加が減少した(図１６B)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置ＩｇＥレベルは、アイソタイプコントロールと比較して有意に減少し、３２日目までに５９−７５％、３５日目までに９０−９３％であった(図16Ｃ−Ｄ)。３５−４２日目まで、ＩｇＥレベルは非免疫化マウスとは有意な違いがなかった。さらに、２８日目と４９日目との間のこれら処置群の濃度曲線下面積の分析から、抗ＩｇＥ／Ｍ１'は血清ＩｇＥレベルを７４−８４％低減し、抗原特異的ＩｇＥの日当たり平均レベルも７４−８３％減少したことが示された(図１６Ｆ−Ｈ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'による処置後に抗原特異的ＩｇＧ１の有意な減少は観察されなかった(図１６Ｉ−Ｋ)。
実施例１２
Ｈｕ−Ｍ１'トランスジェニックモデル：ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)感染モデル
この実験は、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が有する、ＩｇＥ産生の阻害能、並びに既にブラジル鉤虫感染を起こしている場合のＩｇＥ産生を治療的に低減する能力を示す。ＩｇＥ産生の減少は、免疫応答のピークＩｇＥ時(図１８Ａ−Ｉ)及び免疫応答の遅発時(図１９Ａ−Ｇ)の両方で抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の投与により促進した。
ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)はラット及びマウスに感染する胃腸管系の線虫である。その卵は、糞便において孵化して、感染段階である幼虫Ｌ３に成長する。Ｌ３幼虫は皮膚を介して宿主に入り、血管へ移動し、その後１−２日後に肺へ移動する。肺においてＬ４段階の幼虫に成長した後、宿主の気管および食道に沿って移動し、２〜３日で空腸に達する。幼虫は成虫となり交配して、およそ５日で産卵する。ブラジル鉤虫の卵は糞便とともに宿主外に排泄される。
ブラジル鉤虫に感染したマウスは、最初の自然免疫応答を示し、その後強力な２型免疫が続き感染を除去する。感染の初期段階では補体およびフィブロネクチン沈着が見られ、白血球動員および付着が促される。エフェクター細胞、例えば好酸球性、好塩基およびＣＤ４＋Ｔｈ２細胞は肺に動員されて、感染と戦う。Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、肺の免疫応答を維持する際に必須の役割を果たし、腸内の虫クリアランスに必要である。２型応答は、ＩｇＥを含む抗体産生のレベルが高いことを特徴とする。
ヒトＩｇＥ／Ｍ１'ノックインマウス(Ｃ５７ＢＬ／６)は、１５−２０日にピークとなるブラジル鉤虫感染に対して強いＩｇＥ応答を示す。その後血清ＩｇＥレベルは下がるが、高いレベルに維持される。０日目にマウスにブラジル鉤虫を感染させた。３つすべてのブラジル鉤虫感染実験は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＩｇＥ／Ｍ１' ｍＩｇＧ１抗体又は抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１アイソタイプコントロールにて処置した。予防研究では(図１７Ａ)、ｈｕＭ１'ノックインマウスは、０日目から２１日目まで週３回処置した。ピーク産生研究では(図１８Ａ)、ｈｕＭ１'ノックインマウスは、１１日目から２１日目まで週３回処置した。後期介入研究では(図１９Ａ)、ｈｕＭ１'ノックインマウスは、４１日目から６２日目まで週３回処置した。
データは平均±標準偏差として表す。Ｐ値はＪＭＰ統計ソフトウェアを用いて算出した。ダネットの試験はグループ平均を比較するものであり、すべての実験群は参照群に対して試験される。各対のスチューデントｔ検定はスチューデントｔ検定を用いて各群の対を比較する。その後、ボンフェローニ補正を行い、各対のスチューデントｔ検定のｐ値を調製し、一対比較を防いだ。すべてのｐ値の閾値は０．０５である。予防研究及びピーク産生研究において示されたデータ内の％変化は、各々のマウス値から非感染又は非免疫化群の平均値を減じて算出し、群の平均は算出し直し、次いで％変化は各時点のコントロール群に対して算出した。後期介入研究では、％変化は４８日目と５５日目を４１日目と比較して各処置群内で算出した。
実施例１２において既に記載したように、ＩｇＥを産生するプラズマ細胞を定め、エリスポットによって評価した。
予防研究は、一次ブラジル鉤虫感染に応答したＩｇＥの増加を予防する抗ＩｇＥ／Ｍ１'の能力を試験した。コントロール(アイソタイプ処置)マウスは、感染後１５日までに高レベルのＩｇＥ産生に達した(３０００ｎｇ／ｍｌ以下)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置マウスは感染後のＩｇＥ産生を低減させ(抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１と比較して９３−９４％減)、それは非感染マウスと有意な違いがなかった(図１７Ｂ−Ｄ)。
ピーク産生研究は、ブラジル鉤虫感染に対するＩｇＥ応答のピーク時のＩｇＥレベルを治療的に低減する抗ＩｇＥ／Ｍ１'の能力を試験した。すべての処置群は、ブラジル鉤虫感染後１１日までに高いレベルのＩｇＥに達した(２０００ｎｇ／ｍｌ)(図１８Ｂ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置はこの応答のピーク時の１１日目に開始した。抗ＩｇＥ／Ｍ１' ｍＩｇＧ1候補物質は、処置の４日以内で血清ＩｇＥレベルを８２−８９％減少した(図１８Ｃ−Ｄ)。２１日目までに、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置マウスにおけるＩｇＥレベルは、９７−９８％減少し、非感染コントロール群と統計学的な相違がないレベルとなった(図１８Ｅ)。ＩｇＥを産生するプラズマ細胞は、抗ＩｇＥエリスポットによって定量化した。ブラジル鉤虫感染により、腸間膜リンパ節(４×１０６当たり３０細胞以下；図１８Ｆ)及び脾臓(４×１０６当たり１０細胞以下；図１８Ｇ)に有意な数のＩｇＥ産生細胞が誘導された。２１日目までに、抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置により、腸間膜リンパ節では８８−９４％、脾臓では５７−６６％のＩｇＥ産生細胞が減少した。腸間膜リンパ節及び脾臓での総プラズマ細胞(ＣＤ１３８＋細胞)の頻度は、非感染マウスと比較してすべての処置群において増加し、抗ＩｇＥ／Ｍ１'による処置のためにいずれの臓器でも総プラズマ細胞頻度の有意な変化はなかった(図１８Ｈ−Ｉ)。これらの結果は、ＩｇＥ産生レベルがピークの時であっても、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体が、インビボのＩｇＥ産生細胞を枯渇することによってわずかなレベルに血清ＩｇＥを低減する能力を示す。
後期介入研究は、感染サイクルの後期に達する低レベルに維持されたＩｇＥを低減する抗ＩｇＥ／Ｍ１'の能力を試験した。すべての処置群は１５日頃にＩｇＥ産生のピークに達した。４１日目の抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置の開始により、処置群間で血清ＩｇＥレベルがいくらか異なった(図１９Ｂ−Ｃ)。これは４１日目を１００％として正規化した(図１９Ｄ)。抗ＩｇＥ／Ｍ１'処置により、４８日目から５５日目に抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ1アイソタイプコントロールと比較して、血清ＩｇＥレベルが有意に減少した(図１９Ｅ−Ｇ)。４８日目及び５５日目までに、ＩｇＥレベルは、それぞれ２０％及び３７％減少したアイソタイプコントロール(抗ｇｐ１２０ ｍＩｇＧ１)と比較して、それぞれ６４−７５％および７５−８４％減少した(図１９Ｆ−Ｇ)。処置群間の平均ＩｇＥレベルの相違は、抗ＩｇＥ／Ｍ１'治療の開始前のアイソタイプコントロール群(ｇｐ１２０)と有意な差はなかった(図１９Ｅ)。しかしながら、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体による処置は、４８日及び５５日までにコントロール群で観察されるレベルよりも血清ＩｇＥレベルのより劇的かつ有意な減少を示した(図１９Ｇ)。％変化及びｐ値(４１日)は、４８日又は５５日の各処置群を、治療前の４１日の同じ群の開始時の値に比較して算出した。
実施例１３
哺乳動物細胞における抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、所望のタンパク質又は抗体のグリコシル化されうる形態の調製を例示する。
ベクター、ｐＲＫ５(１９８９年３月１５日発行の欧州特許第３０７２４７号を参照)を発現ベクターとして用いた。場合によって、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡを、上掲のSambrook et al.に記載されるようなライゲーション法を用いて該ＤＮＡの挿入が可能なように制限酵素が選択されたｐＲＫ５内にライゲートする。
一実施態様では、選択した宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３)は、胎仔ウシ血清及び場合によって栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地を含む組織培養プレート内で集密になるまで生育させる。ｐＲＫ５内にライゲートした抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体をコードする、およそ１０μｇのＤＮＡは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡおよそ１μｇと混合し[Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)]、５００μｌの１ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.３５)、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍＭ ＮａＰＯ４を滴下して加え、２５℃に１０分おいて沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加え、３７℃におよそ４時間静置する。培養培地を吸引して除き、２０％グリセロールを含む２ｍｌのＰＢＳを３０秒加える。次いで２９３細胞を無血清培地にて洗浄し、新鮮な培地を加え、およそ５日間細胞をインキュベートした。
形質移入のおよそ２４時間後に、培地を除去し、培地(単独)又は２００μＣｉ／ｍｌ ３５Ｓ−システインと２００μＣｉ／ｍｌ ３５Ｓ−メチオニンを含む培地と交換する。１２時間のインキュベートの後、条件培地を回収し、スピンフィルターにて濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに流した。処理したゲルを乾燥させ、選択した時間の間フィルターに露光させて、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の存在を明らかにしてもよい。形質移入させた細胞を含む培養物をさらにインキュベートして(無血清培地中で)、培地を選択したバイオアッセイにて試験してもよい。
代替技術では、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体は、Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)によって記述されるデキストラン硫酸方法を用いて過渡的に２９３細胞に導入されてもよい。２９３細胞はスピナーフラスコ内での最大の密度にまで生育させ、ｐＲＫ５内にライゲートした抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体をコードする７００μｇのＤＮＡを加えた。始めに遠心分離によってスピナーフラスコから細胞を濃縮し、ＰＢＳにて洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。２０％グリセロールにて９０秒間細胞を処理し、組織培養培地にて洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに移す。およそ４日後に、条件培地を遠心分離し、濾過して細胞および細片を取り除く。次いで、発現された抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を含む試料は、濃縮され、透析および／またはカラムクロマトグラフィ等の任意の選択された方法によって精製されてもよい。
他の実施態様では、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体はＣＨＯ細胞において発現されてもよい。ｐＲＫ５にライゲートされた抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体をコードするＤＮＡは、公知の試薬、例えばＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランを用いてＣＨＯ細胞に形質移入されてもよい。前記の通り、細胞培養物をインキュベートし、培地を、培養培地(単独)又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地と交換してもよい。抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の存在を決定した後に、培養培地を無血清培地と交換してもよい。好ましくは、培養物はおよそ６日間インキュベートし、条件培地を回収する。次いで、発現された抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を含む培地は濃縮され、任意の選択された方法によって精製されてもよい。
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体のエピトープタグ付加変異体もまた、宿主ＣＨＯ細胞において発現されてもよい。ｐＲＫ５内にライゲートされる抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体をコードするＤＮＡはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングされてもよい。サブクローンインサートは、バキュロウイルス発現ベクター内のポリｈｉｓタグのような選択されたエピトープタグとインフレームに融合するようにＰＣＲを行うことができる。次いで、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体インサートをコードするポリｈｉｓタグ付加ＤＮＡは、安定クローンを選択するためのＤＨＦＲのような選択マーカーを含むＳＶ４０作動性ベクター内にサブクローニングしてもよい。最後に、ＣＨＯ細胞に、(前記の通り)ＳＶ４０作動性ベクターを形質移入させてもよい。発現を確認するために、前記のように標識を行ってもよい。次いで、発現したポリＨｉｓタグ付加抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体を含む培養培地を濃縮して、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィなどの選択された方法によって精製されてもよい。
抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体はまた、過渡的発現手順によってＣＨＯおよび／またはＣＯＳ細胞において発現されてもよいし、他の安定発現手順によってＣＨＯ細胞において発現されてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定発現は以下の手順を使用して実行される。タンパク質はＩｇＧコンストラクト(イムノアドヘシン)として発現される。このとき、それぞれのタンパク質の可溶型(例えば細胞外ドメイン)のコード配列は、ヒンジ、ＣＨ2およびＣＨ2ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合され、および／またはポリＨｉｓがタグ化された形態である。
ＰＣＲ増幅後、それぞれのＤＮＡは、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されるように、標準的な技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングされる。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡが簡便に輸送されるように、対象のＤＮＡの５'及び３'に互換性のある制限酵素部位を有するように構築される。ＣＨＯ細胞内での発現に用いられるベクターは、Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774−1779 (1996)に記載されている通りであり、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いて対象のｃＤＮＡとジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)の発現を作動する。ＤＨＦＲ発現により形質移入後にプラスミドを安定して維持しているものを選択することができる。
１２μｇの所望のプラスミドＤＮＡは、市販の形質移入試薬ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ(登録商標)(Quiagen)、ＤＯＳＰＥＲ(登録商標)又はＦＵＧＥＮＥ(登録商標)(Boehringer Mannheim)を用いておよそ１０００００００のＣＨＯ細胞に導入される。細胞は上掲のLucas et al.に記載のように生育させる。およそ３×１０−７細胞は、後述する更なる成長および産生のためにアンプルに凍結する。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルは水槽内で解凍し、ボルテックスにて混合する。内容物は、１０ｍｌの培地を含む遠心チューブ内でピペッティングされ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離される。上清を吸引し、細胞は１０ｍｌの選択培地(５％の０．２μｍ濾過した胎仔ウシ血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０)に再懸濁する。次いで細胞は、９０ｍｌの選択培地を含む１００ｍｌのスピナーに等分する。１−２日後、細胞は、１５０ｍｌの選択増殖培地を満たした２５０ｍｌスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後に、２５０ｍｌ、５００ｍｌおよび２０００ｍｌのスピナーに、３×１０５細胞／ｍｌを播く。細胞培地は、遠心分離をして産生培地に再懸濁して新鮮培地と交換する。好適なＣＨＯ培地を用いるが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載される産生培地を用いてもよい。３Ｌの産生スピナーには１．２×１０６細胞／ｍＬで播く。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーを抽出し、除菌空気の散布を開始した。２日目に、スピナーを抽出し、３３℃に温度を変え、３０ｍｌの５００ｇ／Ｌグルコースと０．６ｍｌの１０％消泡剤(例えば、35%ポリジメチルシロキサン乳剤, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)を用いる。製造全体にわたって、ｐＨはおよそ７．２に保たれるように、必要に応じて調整される。１０日後、あるいは生存度が７０％以下に低下するまで、細胞培養物は、遠心分離と０．２２μｍフィルターによる濾過によって回収する。濾液は、４℃で保存するか又は精製のためにカラムにすぐに流した。
ポリＨｉｓタグ付加コンストラクトの場合、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、条件培地に、５ｍＭの濃度になるまでイミダゾールを加える。条件培地は、０.３Ｍ ＮａＣｌ及び５ ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７.４バッファにて４℃で平衡化した６ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、４−５ｍｌ／分の流速で流す。負荷の後、カラムは付加的な平衡化バッファにて洗浄し、タンパク質を、０．２５Ｍ イミダゾールを含む平衡化バッファにて溶出する。次に、高度に精製したタンパク質は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ０.１４Ｍ ＮａＣｌ及び４%マンニトール, ｐＨ６.８を含む貯蔵バッファ中で脱塩し、２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ(Pharmacia)カラムにて−８０℃で保存する。
イムノアドヘシン(Ｆｃ含有)コンストラクトは、以下の通りに条件培地から精製される。条件培地を、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．８に平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム(Pharmacia)に流し込む。負荷の後、カラムを平衡化バッファにて広く洗浄し、その後１００ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．５にて溶出する。溶出されたタンパク質は、２７５μｌの１Ｍ トリスバッファ、ｐＨ９を含むチューブに１ｍｌの分画を集めることによって、直ちに中和する。その後、高度に精製されたタンパク質は、ポリ−Ｈｉｓタグ付加タンパク質のために前記の通りに貯蔵バッファ内で脱塩される。均質性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって、そして、エドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって評価する。
材料の寄託
以下の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 20110-2209, USA(ATCC)に寄託した：
材料 ＡＴＣＣ寄託番号 寄託日
７Ａ６．１８ ＰＴＡ−８２６８ ２００７年３月２１日
１Ｃ１１．１０．２０ ＰＴＡ−８２６７ ２００７年３月２１日
４７Ｇ４．６．２ ＰＴＡ−８２６６ ２００７年３月２１日
４７Ｈ４．１２．１０ ＰＴＡ−８２７０ ２００７年３月２１日
４２Ｈ４．６．９ ＰＴＡ−８２６０ ２００７年３月２１日
４２Ａ５．２０．１１ ＰＴＡ−８２６５ ２００７年３月２１日
２６Ａ１１．６．５ ＰＴＡ−８２６２ ２００７年３月２１日
５１Ｄ２．２２．１５ ＰＴＡ−８２６４ ２００７年３月２１日
４５Ｃ１．６．１４ ＰＴＡ−８２６９ ２００７年３月２１日
２６Ｂ１１．３．１２ ＰＴＡ−８２６１ ２００７年３月２１日
２８Ｅ９．１２．９ ＰＴＡ−８２６３ ２００７年３月２１日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願のいずれか早いものの公開時に、寄託培養物の後代が永久かつ非制限的に一般に入手可能となることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１.１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者が後代を入手できることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されているときに死亡もしくは損失又は破壊された場合、通知時に材料を同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。本発明の権利範囲は本明細書中に示す実施例によって限定されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。

Claims (58)

  1. ＩｇＥのＭ１'セグメントを特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  2. ヒト、アカゲザルおよびカニクイザルの起源であるＩｇＥを結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. 治療上有効量が哺乳動物にインビボ投与されると、ＩｇＥのＭ１'セグメントを特異的に結合し、ＩｇＥ産生Ｂ細胞を特異的に枯渇させる抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  4. 総血清ＩｇＥを減少させる、請求項３の抗体。
  5. 無血清ＩｇＥを減少させる、請求項４に記載の抗体。
  6. ＩｇＥがアレルゲン特異的である、請求項４に記載の抗体。
  7. キメラである、請求項３に記載の抗体。
  8. ヒト化される、請求項３に記載の抗体。
  9. ヒトである、請求項３に記載の抗体。
  10. ４７Ｈ４、７Ａ６、２６Ａ１１、４７Ｈ４ｖ５、７Ａ６ｖ１および２６Ａ１１ｖ６からなる群から選択された抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに特異的に結合する、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  11. エピトープが、ペプチド４(配列番号：８)、ペプチド５(配列番号：９)、ペプチド７(配列番号：１１)又はペプチド８(配列番号：１２)からなる群から選択されるペプチドに対応する、請求項１０に記載の抗体。
  12. エピトープがペプチド４(配列番号：８)に対応する、請求項１１に記載の抗体。
  13. ペプチド４(配列番号：８)、ペプチド５(配列番号：９)、ペプチド７(配列番号：１１)又はペプチド８(配列番号：１２)からなる群から選択されるペプチド。
  14. マウス抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４のスキャッチャード結合親和性と同等であるスキャッチャード結合親和性でＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  15. 親和性が０．３０と０．８３ｎｍの間である、請求項１４に記載の抗体。
  16. ヒト化抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体４７Ｈ４ｖ５のスキャッチャード結合親和性と同等であるスキャッチャード結合親和性でＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  17. 親和性がおよそ１．５ｎｍである、請求項１６に記載の抗体。
  18. ２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ.１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される抗体ないしこれらの抗原結合断片の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含んでなる、抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体。
  19. ２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ.１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される抗体ないしこれらの抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の可変領域を含んでなる、請求項１８に記載の抗体。
  20. 47Ｈ4ｖ1-６の抗体ないしこれらの抗原結合断片又は重鎖および軽鎖ＨＶＲを含んでなる、請求項１８に記載の抗体。
  21. アフコシル化された、請求項１８に記載の抗体。
  22. 少なくとも一の製薬的に許容される担体と組み合わせて請求項１から２１のいずれか一の抗体を含んでなる組成物。
  23. 抗ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン剤、気管支拡張薬、糖質コルチコイド、ＮＳＡＩＤ、ＴＮＦ−アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体およびＢＡＦＦアンタゴニストからなる群から選択される一又は複数の薬剤と少なくとも一の製薬的に許容される担体とを組み合わせて、請求項１から２１のいずれか一の抗体を含んでなる組成物。
  24. ２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択されるアポトーシス性抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体ないしこれらの抗原結合断片の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含んでなる抗体ないしこれらの抗原結合断片をコードする単離された核酸。
  25. ２６Ａ１１、２６Ａ１１ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される抗体配列の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸をさらに含む、請求項２４に記載の核酸。
  26. コードされた抗体がアフコシル化されている、請求項２５に記載の核酸。
  27. 請求項２５に記載の核酸が作用可能に結合しているベクター。
  28. 請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  29. 哺乳類である、請求項２８に記載の宿主細胞。
  30. チャイニーズハムスター卵巣である、請求項２９に記載の宿主細胞。
  31. 抗体ないし断片の発現に適切な条件下で請求項２８に記載の宿主細胞を培養し、抗体ないし断片を回収することを含む、アポトーシス性抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体ないし機能的断片の製造方法。
  32. 請求項２２に記載の組成物とＩｇＥが媒介する疾患の治療のための使用を示すパッケージ挿入物とを具備する製造品。
  33. バイアルである、請求項３２に記載の製造品。
  34. 予め満たしてあるシリンジである、請求項３２に記載の製造品。
  35. 注入用デバイスをさらに含む、請求項３４に記載の製造品。
  36. 自動注入器である、請求項３５に記載の製造品。
  37. ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥ発現Ｂ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、ＩｇＥ産生Ｂ細胞を特異的に枯渇する方法。
  38. 抗体が、２６Ａ１１、２６Ａ１１ ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される抗体の重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 総血清ＩｇＥの減少を更に含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 無血清ＩｇＥの減少を更に含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ＩｇＥがアレルゲン特異的である、請求項３９に記載の方法。
  42. 抗体がＡＤＣＣ活性を有する、請求項３８に記載の方法。
  43. ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥ発現Ｂ細胞のアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を投与することを含む、ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法。
  44. 抗体がＩｇＥを発現するＢ細胞を特異的に枯渇させる、請求項４３に記載の方法。
  45. 抗体が総血清ＩｇＥを減少させる、請求項４３に記載の方法。
  46. 抗体が無血清ＩｇＥを減少させる、請求項４５に記載の方法。
  47. ＩｇＥがアレルゲン特異的である、請求項４５に記載の方法。
  48. 抗体が、２６Ａ１１、２６Ａ１１ｖ１-１６、７Ａ６、７Ａ６ｖ１、４７Ｈ４、４７Ｈ４ｖ１-６からなる群から選択される抗体又は重鎖及び軽鎖ＨＶＲを含む、請求項４３に記載の方法。
  49. ＩｇＥが媒介する疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸疾患、アナフィラキシー、蕁麻疹、食物アレルギー、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫病、間質性膀胱炎、高ＩｇＥ症候群、毛細管拡張性運動失調症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、胸腺欠損リンパ異常、ＩｇＥ骨髄腫、移植片対宿主反応およびアレルギー性紫斑病からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  50. ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法であって、高ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、糖質コルチコイド、ＮＳＡＩＤ、鬱血除去剤、咳抑制剤、鎮痛剤、ＴＮＦ−アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体およびＢＡＦＦアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも一の薬剤の治療上の有効量と組み合わせて、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞にアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上の有効量を含む方法。ある態様では、抗体はＩｇＥを生産するＢ細胞を特異的に枯渇させる。
  51. ＩｇＥが媒介する疾患の治療方法であって、アレルギー性疾患の治療の公知の方法の投与の前、投与と同時に、又は投与の後に、ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞のアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を投与する併用治療投与計画を含む方法。
  52. アレルギー性疾患のための公知の治療には、抗ＩｇＥ抗体抗ヒスタミン剤、気管支拡張剤、糖質コルチコイド、非ステロイド系抗炎症剤、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、鬱血除去剤、咳抑制剤又は鎮痛剤の投与が含まれる、請求項５１に記載の方法。
  53. アレルギー性疾患のための公知の治療にはアレルゲン感作の治療投薬計画が含まれる、請求項５１に記載の方法。
  54. ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞のアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を投与することを含む、アレルゲン誘導性のＩｇＥ産生を阻害する方法。
  55. ＩｇＥのＭ１'セグメントに特異的に結合し、ＩｇＥを発現するＢ細胞のアポトーシスを誘導する抗ＩｇＥ／Ｍ１'抗体の治療上有効量を投与することを含む、アレルゲン誘導性のＩｇＥ産生を減少させる方法。
  56. ＰＴＡ-８２６０、ＰＴＡ-８２６１、ＰＴＡ-８２６２、ＰＴＡ-８２６３、ＰＴＡ-８２６４、ＰＴＡ-８２６５、ＰＴＡ-８２６６、ＰＴＡ-８２６７、ＰＴＡ-８２６８、ＰＴＡ-８２６９、ＰＴＡ-８２７０からなる群から選択される、２００７年３月２１日にＡＴＣＣに寄託されたマウスハイブリドーマ。
  57. 請求項５２に記載のハイブリドーマによって分泌される抗体。
  58. ＩｇＥのヒトＭ１'セグメントを発現するトランスジェニック動物。
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