JP2016511280A - 新しいポリペプチド - Google Patents

Abstract

本開示は、新生児のＦｃ受容体（以下、ＦｃＲｎと称する）への結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関し、配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＲ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９を含むＦｃＲｎ結合ポリペプチドを提供する。本開示は、薬物動態学的および薬力学的特性を改変するための薬剤として、および治療薬としてのかかるＦｃＲｎ結合ポリペプチドの使用にも関する。

Description

本開示は、新生児のＦｃ受容体（以下、ＦｃＲｎと称する）への結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関する。本開示は、生体分子の薬物動態学的および薬力学的特性を改変するための薬剤、例えば医薬品として、および治療薬としてのかかるＦｃＲｎ結合ポリペプチドの使用にも関する。

新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、膜貫通ＭＨＣクラスＩ様重鎖（ＦｃＲｎα鎖）およびβ２−ミクログロブリン軽鎖からなるヘテロ二量体のタンパク質であり、β２−ミクログロブリン軽鎖は、ＭＨＣクラスＩ分子の一部も形成する（非特許文献１；非特許文献２）。

ＦｃＲｎは、エンドソームに主に位置しており、ｐＨ≦６．５で血清アルブミンおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合し、ｐＨ≧７．０でそれらを遊離することができる（非特許文献３に概説されている）。

ＦｃＲｎは、哺乳類においていくつかの独特なタスクを行う（上記の文献３に概説されている）。ＦｃＲｎは、飲食されたＩｇＧおよび血清アルブミンの再利用に関与しており、したがって、リソソームにおけるそれらの分解を防ぎ、それらに血液中での他の血清タンパク質より長い半減期およびより高い利用可能性を与える。ＩｇＧ、血清アルブミンおよび他の血清タンパク質が、血液と接触している細胞によって受動的に飲作用された場合、ｐＨは、形成されたエンドソームにおいて次第に低くなり、これによってＦｃＲｎへのＩｇＧおよび血清アルブミンの結合が可能になる。次いで、受容体は、その結合したリガンドとともに、再利用エンドソームを介して輸送されて細胞膜に戻る。細胞膜に戻った後、ｐＨは、７を超えるまで増加し、この時点で、結合したリガンドは遊離される。

ＦｃＲｎは、胎盤、上部気道上皮、血液脳関門および近位小腸のような障壁を通過してＩｇＧを輸送するその能力も認められている。

哺乳類において、ＦｃＲｎの特性は、胎盤を介して母親から胎児へＩｇＧをトランスサイトーシスするために、および母乳から近位小腸における乳児の血流にＩｇＧをトランスサイトーシスするために使用される。

ＦｃＲｎの発現パターンは、種間で異なる。しかしながら、ＦｃＲｎは、大部分の種において、血液脳関門、上部気道上皮、腎臓および血管内皮における細胞によって、および抗原提示細胞によって、ならびに造血起源の他の細胞によって、広く発現される（上記の文献３に概説されている）。

ＦｃＲｎ（非特許文献４、非特許文献５）およびβ２−ミクログロブリン（非特許文献６）への親和性を有する抗体およびペプチドは、内在性ＩｇＧとＦｃＲｎの間の結合を阻害するという見解が展開されてきた。別の手法は、ＦｃＲｎへのより高い親和性を得るために、ＩｇＧのＦｃ領域を変異導入することであった（非特許文献７、非特許文献８）。

Ｆｃドメインへのまたはアルブミンへの融合は、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるために広く使用されている戦略である。しかしながら、大きいサイズのかかる融合タンパク質は、組織透過性に悪影響を及ぼし、融合パートナーへの特異性を減少させる（非特許文献９）。他方では、変異は、非ヒト霊長類に投与される抗体のＦｃ断片において半減期を延長するために行われてきた（非特許文献１０）。しかしながら、この手法は、使用において治療的抗体のみに限定され、問題のタンパク質がＦｃ断片に融合されていない限り、他の治療的タンパク質に外挿することはできず、この融合もまた大きいサイズの分子を生じる。ペグ化およびＩｇＧのＦｃドメインまたはアルブミンへのタンパク質の遺伝子融合のような、いくつかの化学的および組換え方法が考案されて、タンパク質半減期を改善した（非特許文献１１に概説されている）。タンパク質のペグ化はそれらの効力を減少させ、それらの免疫反応性の一因となることが報告された。

Ｆｃ−融合タンパク質は、ＦｃＲｎによって媒介される経口および肺送達にも使用されてきた（非特許文献１２）が、しかしながら、融合分子のサイズにより、組織透過性および減少した特異性に関する同様の問題が残る。

故に、ＦｃＲｎへの高親和性を有する分子の継続した提供のための当分野における大きな必要性がある。特に、融合パートナーとして存在する場合、それらが融合している分子の特性に悪影響を及ぼさず、免疫反応性の一因とならない、小さい結合分子が必要とされている。

Ｓｉｍｉｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｓｔｏｖ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１８４〜７ Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９〜８３ Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：７１５〜２５ Ｌｉｕら（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：２９９９〜３０１１ Ｍｅｚｏら（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：２３３７〜４２ Ｇｅｔｍａｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｈａｓａｒ（２００５）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９４：７１８〜２９ Ｐｅｔｋｏｖａら（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９〜６９ Ｖａｃｃａｒｏら（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：１２８３〜８ Ｖａｌｌｅｓら（２０１１）Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３２：１７８〜１８４ Ｈｉｎｔｏｎら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３〜６ Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：１１８６〜１１９０ Ｌｏｗら、（２００５）Ｈｕｍａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｊｕｌ；２０（７）：１８０５〜１３

生体分子の薬物動態学的および／または薬力学的特性の改変における使用のための新しいＦｃＲｎ結合剤、例えば医薬品を提供することは、本開示の目標である。

それ自体で単独での治療薬としてのまたは組合せ処置としての使用のための新しいＦｃＲｎ結合剤を提供することも、本開示の目標である。

現在の療法の上記のおよび他の欠点を緩和すると同時に、ＦｃＲｎの効率的なターゲティングを可能にする分子を提供することは、本開示の目標である。

本開示から当業者に明白であるこれらおよび他の目標は、添付の特許請求の範囲で特許請求し、本明細書で一般に開示した本発明の種々の態様によって達成される。

したがって、本開示の第１の態様において、ＦｃＲｎ結合モチーフ、ＢＭを含む、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチドであって、そのモチーフが、アミノ酸配列ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；かつ
Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される］
からなる、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド
が提供される。

配列に関連する、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのクラスの上記の定義は、いくつかの異なる選択実験においてＦｃＲｎとのそれらの相互作用に関して選択された、親骨格のいくつかのランダムポリペプチド変異体の統計的分析に基づく。同定されたＦｃＲｎ結合モチーフ、または「ＢＭ」は、親骨格の標的結合領域に相当し、その領域は、３ヘリックス束タンパク質ドメイン（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ）内に２つのαヘリックスを構成する。親骨格において、２つのＢＭヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部との相互作用のための結合表面を構成する。本開示において、結合表面残基のランダムな変動およびその後の変異体の選択は、Ｆｃ相互作用能力を、ＦｃＲｎとの相互作用のための能力と置き換えた。

前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの一実施形態において、ＢＭは、アミノ酸配列
ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＴＸ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５ＫＬＸ_２８Ｄ
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される］
からなる。

本開示の第１の態様の別の実施形態において、前記新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合モチーフ、ＢＭを含み、そのモチーフは、アミノ酸配列ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；かつ
Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される］
からなる。

第１の態様の別の実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄであり；
Ｘ_２１は、Ｖであり；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；かつ
Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される］
が提供される。

第１の態様の別の実施形態において、ＢＭは、
ｉ） ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６ＨＥＩＲ ＷＬＰＮＬＴＸ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５ＫＬＸ_２８Ｄ
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される］
および
ｉｉ） 前記配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる。

前記態様のさらに別の実施形態において、配列ｉ）におけるＢＭは、
ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６ＨＥＩＲ ＷＬＰＮＬＴＸ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５ＫＬＸ_２８Ｄ
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ_３は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、ＲおよびＶから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される］
から選択されるアミノ酸配列からなる。

当業者は理解することになるように、本開示のポリペプチドのＦｃＲｎ結合能力を含めた、任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造次第である。したがって、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列に軽微な変更を行うことが可能である。したがって、本開示は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの改変変異体を包含し、これらの変異体ではＦｃＲｎ結合特徴が保持されている。

したがって、上記のように、ｉ）において定義されたポリペプチドへの９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃＲｎ結合ポリペプチドも、本開示によって包含される。

いくつかの実施形態において、かかる変更は、本明細書で開示したＦｃＲｎ結合ポリペプチドの配列の全ての位置において行うことができる。他の実施形態において、かかる変更は、骨格アミノ酸残基としても表示される、非可変位置においてのみ行うことができる。かかる場合において、変更は、可変位置、すなわち配列ｉ）における「Ｘ」で表示された位置において許容されない。例えば、アミノ酸残基のある官能グループ（例えば疎水性、親水性、極性など）に属しているアミノ酸残基を、同じ官能基からの別のアミノ酸残基と交換することが可能である。

本明細書全体を通して使用される、「％の同一性」という用語は、例えば以下のように計算することができる。問い合わせ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ アルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３〜４６８０）を使用して、標的配列に整列させる。比較を、整列した配列の最も短いものに相当するウインドウ上で行う。いくつかの場合において、整列した配列の最も短いものは、標的配列であり得る。他の場合において、問い合わせ配列は、整列した配列の最も短いものを構成し得る。各位置でのアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一の一致を有する問い合わせ配列における位置の百分率を、％の同一性として報告する。

以下は、アミノ酸残基Ｘ_ｎをさらに特定する実施形態のリストであり、ここでｎは、本明細書で記載したポリペプチド内の前記残基の位置を表示する整数である。明白にするために、ポリペプチド中に含まれるＢＭが、所与のアミノ酸配列または前記所与のアミノ酸配列と少なくとも所与の％の同一性を有するアミノ酸配列からなり得る場合、本明細書で使用するＸ_ｎは、前記所与のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を表す。例えば、適用可能な場合、Ｘ_ｎは、上記の配列ｉ）におけるアミノ酸残基を表す。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ａ、Ｉ、ＬおよびＱから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ｉ、ＬおよびＱから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、ＩおよびＱから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ｉである。

一実施形態において、Ｘ_２は、Ｑである。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｑ，およびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＱおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ｄ、ＥおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、ＤおよびＥから選択される。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ｄである。

一実施形態において、Ｘ_３は、Ｅである。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｋ、ＱおよびＳから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＳから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、ＫおよびＳから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＫから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａ、ＤおよびＫから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、ＡおよびＤから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、ＡおよびＥから選択される。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ａである。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ｄである。

一実施形態において、Ｘ_４は、Ｅである。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、ＲおよびＳから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、ＫおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、ＧおよびＫから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａ、ＧおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、ＡおよびＧから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ａである。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ｇである。

一実施形態において、Ｘ_７は、ＡおよびＨから選択される。

一実施形態において、Ｘ_７は、Ｈである。

一実施形態において、Ｘ_１６は、Ｔである。

一実施形態において、Ｘ_１６は、Ｎである。

一実施形態において、Ｘ_１７は、ＦおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_１７は、Ｆである。

一実施形態において、Ｘ_１８は、Ａ、ＤおよびＥから選択される。

一実施形態において、Ｘ_１８は、ＡおよびＤから選択される。

一実施形態において、Ｘ_１８は、Ｄである。

一実施形態において、Ｘ_２１は、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２１は、Ｖである。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、ＲおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｈ、Ｌ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｈ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｈ、ＲおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｈ、ＬおよびＲから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、ＨおよびＲから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、ＨおよびＶから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２５は、Ｈである。

一実施形態において、Ｘ_２６は、Ｋである。

一実施形態において、Ｘ_２６は、Ｓである。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＷから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａ、ＤおよびＲから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、ＡおよびＲから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、ＤおよびＲから選択される。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ａである。

一実施形態において、Ｘ_２８は、Ｒである。

一実施形態において、Ｘ_２９は、Ｄである。

一実施形態において、Ｘ_２９は、Ｒである。

一実施形態において、Ｘ_６Ｘ_７は、ＡＨおよびＧＨから選択される。

一実施形態において、Ｘ_６Ｘ_７は、ＡＨである。

一実施形態において、Ｘ_６Ｘ_７は、ＧＨである。

一実施形態において、Ｘ_１７Ｘ_１８は、ＦＤおよびＹＤから選択される。

一実施形態において、Ｘ_１７Ｘ_１８は、ＦＤである。

ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのサブクラスを定義するより特定の実施形態において、配列は、６つの条件Ｉ〜ＶＩ：
Ｉ． Ｘ_６が、特にＡのような、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択されること；
ＩＩ． Ｘ_７が、Ｈであること；
ＩＩＩ． Ｘ_１７が、特にＦのような、ＦおよびＹから選択されること；
ＩＶ． Ｘ_１８が、Ｄであること；
Ｖ． Ｘ_２１が、特にＶのような、ＶおよびＷから選択されること；
ＶＩ． Ｘ_２５が、特にＨのような、ＨおよびＲから選択されること
の少なくとも３つを満たす。

第１の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドのいくつかの例において、前記配列は、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも４つを満たす。より明確には、配列は、６つの条件Ｉ〜ＶＩの全てのような、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも５つを満たし得る。

以下の実験の節において詳細に記載するように、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド変異体の選択は、いくつかの個々のＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定につながった。これらの配列は、この態様による個々の実施形態を構成する。個々のＦｃＲｎ結合モチーフの配列を、図１において配列番号１〜３５３として提示する。故に、この態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドの一実施形態において、配列は、配列番号１〜３５３からなる群から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群から選択される。別の実施形態において、配列は、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、配列は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５から選択される。一実施形態において、配列は、配列番号１である。

本開示のいくつかの実施形態において、上記で定義されたＢＭは、３ヘリックス束タンパク質ドメイン「の一部を形成する」。これは、ＢＭが本来のドメインにおける同様の構造モチーフと置き換わるように、ＢＭの配列が、本来の３ヘリックス束ドメインの配列中に「挿入された」またはこの配列上に「移植された」ことを意味すると理解される。例えば、理論によって束縛されることを望むことなく、ＢＭは、３ヘリックス束の３つのヘリックスの２つを構成すると考えられ、したがって、任意の３ヘリックス束内のそのような２ヘリックスモチーフと置き換わることができる。当業者は理解することになるように、２つのＢＭヘリックスによる３ヘリックス束ドメインの２つのヘリックスの置換は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように行わなければならない。つまり、本発明のこの実施形態によるポリペプチドのＣα主鎖の全体的な折り畳みは、例えば同じ順序で二次構造の同じエレメントを有するなど、それが一部を形成する３ヘリックス束タンパク質ドメインの折り畳みと実質的に同じである。したがって、本態様のこの実施形態によるポリペプチドが本来のドメインと同じ折り畳みを有する場合、本開示によるＢＭは、３ヘリックス束ドメインの「一部を形成し」、これは、基本構造の特性が共有されていることを暗示しており、それらの特性は、例えば同様のＣＤスペクトルを生じる。当業者は、関連する他のパラメーターを知っている。

したがって、特定の実施形態において、ＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、前記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内に、相互接続ループを有する２つのαヘリックスを本質的に構成し得る。特定の実施形態において、前記３ヘリックス束タンパク質ドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。かかるドメインの非限定的な例は、ドメインＢのような、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡおよびその誘導体の５つの異なる３ヘリックスドメインである。いくつかの実施形態において、３ヘリックス束タンパク質ドメインは、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺの変異体である。

本発明のＦｃＲｎ結合ポリペプチドが、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、
ｉｉｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ Ｘ_ｄＸ_ｅＸ_ｆＱ；
［配列中、
［ＢＭ］は、本明細書で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ただしＸ_２９は、Ｄであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_ｅは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_ｆは、ＡおよびＳから選択される］
および
ｉｖ） ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。

本発明のＦｃＲｎ結合ポリペプチドが、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、
ｖ） Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ Ｘ_ｄＸ_ｅＸ_ｆＱ；
［配列中、
［ＢＭ］は、本明細書で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ただしＸ_２９は、Ｒであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_ｅは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_ｆは、ＡおよびＳから選択される］
および
ｖｉ） ｖ）によって定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。

上記のように、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、配列ｉｖ）または配列ｖｉ）は、それぞれ、ｉｉｉ）およびｖ）によって定義された配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有する。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ａは、Ａである。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ａは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｂは、Ｎである。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｂは、Ｅである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃは、Ａである。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃは、Ｓである。さらに別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃは、Ｃである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄは、Ｅである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄは、Ｎである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅは、Ｄである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅは、Ｅである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅは、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから選択される。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅは、ＥＳである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅは、ＳＥである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｆは、Ａである。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ａであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｓであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＮＤであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＮＤであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＮＤであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＮＤであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＳＥであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＳＥであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＳＥであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＳＥであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＥＳであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＥＳであり、Ｘ_ｆは、Ａである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＥＳであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅは、ＥＳであり、Ｘ_ｆは、Ｓである。

さらに別の実施形態において、上記のＦｃＲｎ結合ポリペプチドの定義における配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４〜７０６からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４〜３６８、配列番号３７０〜４９３および配列番号７０６からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４〜３５５および配列番号３７０〜４９３からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４〜３５５、配列番号３７０〜４４５、配列番号４４７〜４５６、配列番号４５８〜４７８および配列番号４８０〜４９３からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４〜３６１、配列番号３６６、配列番号３７２〜３７３、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２３、配列番号４２６、配列番号４２８〜４３０および配列番号７０６からなる群から選択される。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２６および配列番号４２８〜４３０からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２８および配列番号４３０から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４、配列番号３７６および配列番号４２８から選択される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号３５４である。

また、別の実施形態において、
ｖｉｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択される］および
ｖｉｉｉ） ｖｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。

代わりに、
ｉｘ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；［配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、Ｘ_ｃは、ＡおよびＣから選択される］および
ｘ） ｉｘ）によって定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。

上記のように、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ｖｉｉ）またはｉｘ）によって定義された配列と、少なくとも９８％のような、少なくとも９６％同一である配列を含むことができる。

いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎ結合モチーフは、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
［配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成することができる。

一実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、
ｘｉ） ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；［配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］および
ｘｉｉ） ｘｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、配列ｘｉ）は、配列番号１０６０〜１０６２からなる群から選択される。

一実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、
ｘｉｉｉ） ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
［配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］および
ｘｉｖ） ｘｉｉｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。

かかるポリペプチドにおける配列ｘｉｉｉ）は、例えば、配列番号７０７〜１０５９からなる群から選択することができる。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７〜７２１、配列番号７２３〜８４６および配列番号１０５９からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７〜７０８および配列番号７２３〜８４６からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７〜７０８、配列番号７２３〜７９８、配列番号８００〜８０９、配列番号８１１〜８３１および配列番号８３３〜８４６からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７〜７１４、配列番号７１９、配列番号７２５〜７２６、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７７９、配列番号７８１〜７８３および配列番号１０５９からなる群から選択される。別の実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７９および配列番号７８１〜７８３からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７８１および配列番号７８３から選択される。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７、配列番号７２９および配列番号７８１から選択される。一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号７０７である。

また、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ｘｉ）またはｘｉｉｉ）によって定義された配列と、少なくとも９８％のような、少なくとも９６％同一である配列を含むことができる。

本明細書において使用される、「ＦｃＲｎ結合」および「ＦｃＲｎへの結合親和性」という用語は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーまたはＥＬＩＳＡの使用によって試験することができるポリペプチドの特性を表す。

例えば以下の例において記載したように、ＦｃＲｎ結合親和性を、ＦｃＲｎ、またはその正しく折り畳まれた断片を機器のセンサーチップ上に固定化し、試験するポリペプチドを含有するサンプルを、チップ上を通過させる実験において試験することができる。代わりに、試験するポリペプチドを、機器のセンサーチップ上に固定化し、ＦｃＲｎ、またはその正しく折り畳まれた断片を含有するサンプルを、チップ上を通過させる。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、ＦｃＲｎへのポリペプチドの結合親和性の定性的測定値を少なくとも樹立することができる。定量的測定値が望ましい場合、例えば相互作用に関するＫ_Ｄ値を決定するために、表面プラズモン共鳴法も使用することができる。結合値は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）機器において定義することができる。ＦｃＲｎを、機器のセンサーチップ上に適切に固定化し、その親和性を決定するポリペプチドのサンプルを、連続希釈によって調製し、ランダムな順序で注入する。次いで、Ｋ_Ｄ値を、例えばＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、または機器製造業者によって提供される、他の適したソフトウェアを使用して、結果から計算することができる。

代わりに、以下の例において記載したように、ポリペプチドのサンプルを、抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉し、ビオチン化ＦｃＲｎを加え、その後ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＨＲＰを加える実験においてＦｃＲｎ結合親和性を試験することができる。ＴＭＢ基質を加え、Ｖｉｃｔｏｒ^３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のような、マルチウェルプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、ＦｃＲｎへのポリペプチドの結合親和性の定性的測定値を少なくとも樹立することができる。定量的測定値が望ましい場合、例えば相互作用に関するＫ_Ｄ値（最大半量有効濃度）を決定するために、ＥＬＩＳＡも使用することができる。ビオチン化ＦｃＲｎの希釈系列に対するポリペプチドの応答を、上記のＥＬＩＳＡを使用して測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈することができ、Ｋ_Ｄ値を、例えばＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５および非線形回帰を使用して、結果から計算することができる。

一実施形態において、相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍであるように、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに結合する能力があるＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。この実施形態によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、例えばリソソームにおいて、ｐＨ６．０のような酸性ｐＨ条件で、ＦｃＲｎに結合するかまたは結合したままである。かかるポリペプチドが、次第に酸性になる細胞内環境に入る場合、それは、そのＦｃＲｎとの相互作用を通して細胞膜に再利用され、したがって分解を避ける。

一実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも高い。したがって、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、より高い親和性でＦｃＲｎに結合する。一実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄ値は、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも、少なくとも５倍高いような、少なくとも１０倍高いような、少なくとも５０倍高いような、少なくとも１００倍高いような、少なくとも２倍高い。

一実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値は、少なくとも１×１０^−７Ｍのような、少なくとも１×１０^−６Ｍのような、少なくとも１×１０^−５Ｍのような、少なくとも１×１０^−８Ｍである。いくつかの実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用に関する唯一の基準は、より酸性の条件の間にＦｃＲｎに結合した任意のＦｃＲｎ結合ポリペプチドが、ｐＨ値が増加した場合にＦｃＲｎからより速く遊離するということである。

別の実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄが、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄと同じかまたはこれより低い、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。この実施形態によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、酸性ｐＨ条件で、例えばリソソームにおいて、および例えば細胞膜上で、中性またはわずかに塩基性のｐＨ条件で、ＦｃＲｎに結合するかまたは結合したままである（すなわち遊離を避けるために十分遅い、ｐＨ６．０でのオフ速度を有する）。より特定の実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄ値は、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも、少なくとも５倍低いような、少なくとも１０倍低いような、少なくとも５０倍低いような、少なくとも１００倍低いような、少なくとも２倍低い。

別の実施形態において、相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍであるように、ｐＨ７．４でＦｃＲｎに結合する能力があるＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。この実施形態によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、例えば細胞膜上で、ｐＨ７．４のような、中性またはわずかに塩基性のｐＨ条件で、ＦｃＲｎに結合するかまたは延長された時間結合したままである。「結合したままである」という用語は、所与の条件で遅いオフ速度を有する相互作用を意味すると理解されるべきである。

一般に、当業者は、相互作用のＫ_Ｄ値が、オフ速度（ｋ_ｏｆｆ）とオン速度（ｋ_ｏｎ）の比として定義されることを知っている。したがって、高いＫ_Ｄ値は、高いｋ_ｏｆｆ、低いｋ_ｏｎまたはその両方に起因し得、逆に、低いＫ_Ｄ値は、低いｋ_ｏｆｆ、高いｋ_ｏｎま
たはその両方に起因し得る。

当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、特定の適用に本明細書で開示した任意の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドを合わせるために、ポリペプチドに様々な改変および／または付加を行うことができることを理解することになる。

例えば、一実施形態において、そのポリペプチドがＣ末端および／またはＮ末端で１つまたはそれ以上のアミノ酸によって伸長されている、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。かかるポリペプチドは、ポリペプチド鎖におけるまさに最初および／またはまさに最後の位置で、１つまたはそれ以上の追加のアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解されるべきである。したがって、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、任意の適した数の追加のアミノ酸残基、例えば少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むことができる。各追加のアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製、精製、安定化、カップリング、または検出を改善するために、個々にまたは集団的に付加することができる。かかる追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。この一例は、システイン残基の付加である。かかる追加のアミノ酸残基は、タグに特異的な抗体との相互作用またはヘキサヒスチジンタグの場合における固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためのＨｉｓ_６タグまたは「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグまたは「ＦＬＡＧ」タグのような、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」も提供することができる。

上記のように、別のアミノ酸を、（既知の有機化学的方法を使用して）化学的コンジュゲーションによって、または融合タンパク質としてのＦｃＲｎ結合ポリペプチドの発現のような、任意の他の手段によってＦｃＲｎ結合ポリペプチドに結合することができるか、または直接的にもしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して、任意の他の様式で連結することができる。

上記のように、別のアミノ酸は、例えば、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを含むことができる。別のポリペプチドドメインは、例えば別の結合機能、もしくは酵素機能、もしくは毒性機能もしくは蛍光シグナル伝達機能、またはそれらの組合せのような、別の機能を有するＦｃＲｎ結合ポリペプチドを提供することができる。

別のポリペプチドドメインは、同じＦｃＲｎ結合機能を有する別のＦｃＲｎ結合部分をさらに提供することができる。したがって、別の実施形態において、多量体形であるＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。前記多量体は、そのアミノ酸配列が同じかまたは異なっていてもよい、単量体単位として本明細書で開示した少なくとも２つのＦｃＲｎ結合ポリペプチドを含むことが理解される。ポリペプチドの多量体形は、それぞれがＦｃＲｎ結合モチーフを有し、かつそれぞれが多量体内で単量体を形成する、適した数のドメインを含むことができる。これらのドメインは、同じアミノ酸配列を有することができるが、代わりに、それらは異なるアミノ酸配列を有することができる。換言すれば、本発明のＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ多量体、例えばホモまたはヘテロ二量体を形成することができる。一実施形態において、前記単量体単位がともに共有結合している、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド単量体単位が、融合タンパク質として発現される。一実施形態において、二量体形であるＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。

さらに、本明細書で記載したＦｃＲｎ結合ポリペプチドまたはその多量体が、第１のドメインまたは第１の部分を構成し、第２のおよび別の部分が、ＦｃＲｎに結合する以外の機能を有する、「異種遺伝子型の」融合ポリペプチドまたはタンパク質、またはコンジュゲート体も企図され、本開示の範囲内である。かかるタンパク質における融合ポリペプチドまたはコンジュゲート体の第２のおよび別の部分は、望ましい生物活性を適切に有する。

したがって、本開示の第２の態様において、第１の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドからなる第１の部分、および望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。別の実施形態において、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体は、第２の部分の生物活性と同じかまたは異なっていてもよい望ましい生物活性を含む、別の部分をさらに含むことができる。

かかる異種遺伝子型の融合ポリペプチドを使用して、高次のヘテロ多量体の複合体も作られる。一例は、それぞれが、別の部分と融合している本開示によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドを含む、２つの融合ポリペプチドのヘテロ二量体の複合体である。かかる複合体は、例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでヘテロ二量体を形成し、非共有結合性および／または共有結合性相互作用によってともに保持される。かかる複合体の特定の例は、軽鎖と重鎖の両方が、それぞれ１つのＦｃＲｎ結合ポリペプチドと融合して作製され、ドメイン間ジスルフィド結合を含むことができる、Ｆａｂフラグメントである。当業者に既知である、多くの生物学的に関連のあるヘテロ二量体の複合体を、単量体単位としてＦｃＲｎ結合融合タンパク質を使用して構築することができる。

前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の一実施形態において、分子の全体のサイズは、哺乳類の対象への投与時の効率的な腎クリアランスのための閾値未満である。

前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の別の実施形態において、分子の全体のサイズは、哺乳類の対象への投与時の効率的な腎クリアランスのための閾値を超える。

一実施形態において、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、それ自体で望ましい生物活性を有するポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも長い、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。

望ましい生物活性の非限定的な例は、治療活性、結合活性、および酵素活性を含む。

一実施形態において、前記望ましい生物活性は、選択された標的への結合活性である。

かかる結合活性の一例は、融合タンパク質またはコンジュゲート体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる結合活性である。この融合タンパク質またはコンジュゲート体は、少なくとも１つの別の部分を含むことができる。特定の一実施形態において、前記標的は、アルブミンであり、それへの結合は、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる。一実施形態において、前記アルブミン結合活性は、連鎖球菌のプロテインＧまたはその誘導体のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）によって提供される。例えば、少なくとも１つの別の部分を含む前記融合タンパク質またはコンジュゲート体は、［ＦｃＲｎ結合ポリペプチド部分］−［アルブミン結合部分］−［選択された標的への親和性を有する部分］を含むことができる。この例における３つの部分をポリペプチドのＮからＣ末端まで任意の順序で配列することができることが理解されるべきである。

一実施形態において、標的と本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体の複合体が、ｐＨ６．０のような酸性ｐＨで形成される（または維持される）場合、標的は、リソソーム分解による排除から救済される。したがって、標的半減期は、延長される。半減期延長は、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体と相互作用している場合、標的の排除速度が、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の非存在下での標的分子の排除速度よりも遅いことを暗示している。さらに、この実施形態において、融合タンパク質またはコンジュゲート体による標的の結合が、標的の機能に実質的に干渉しないことが望ましい。

他方では、標的と本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体の複合体が、酸性ｐＨで維持されないまたは形成されない場合、標的は、細胞内リソソームに向けられ、そこで分解される。

一実施形態において、対象からの選択された、望ましくない標的の排除の速度が増加される、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。望ましくない標的の増加した排除は、それ自体での、すなわち融合タンパク質またはコンジュゲート体との前もっての相互作用を有さない標的分子の「通常の」排除速度と比較した、多細胞生物の体からの標的の増加した排除速度を暗示している。

別の実施形態において、選択された望ましくない標的の結合は、標的の機能を失活させ、それによって、これが望ましい状況においてその生物活性を遮断する。かかる生物活性は、例えば受容体の活性化もしくは遮断または酵素のもしくはさもなければ毒性のもしくは望ましくない活性とすることができる。かかる望ましくない標的は、内在性ホルモン、酵素、サイトカイン、ケモカインまたはいくつかの他の生物活性を有する標的とすることができる。失活のための標的結合を使用することによって、標的が分解のために送達され、低いｐＨ値で遊離されるまで生物活性が遮断され、標的結合融合タンパク質が、循環へ再利用される。標的結合融合タンパク質のこの再利用（そのＦｃＲｎ結合部分を介した）により、選択された望ましくない標的の１つを超える分子の除去をそれが「触媒する」ことが可能になる。

望ましくない標的は、例えば医学的状態の後で血漿中で上昇したレベルを示し、治療効果がこれらのタンパク質の排除によって達成される、外来性タンパク質および化合物、または天然に発現されたタンパク質とすることができる。望まれない標的は、血漿中で必ずしも均等に分布するわけではなく、いくつかの領域、例えば腫瘍の周囲または炎症の部位で濃縮され得る。

標的の非限定的な例は、アレルゲン、アミロイド、抗体、自己抗原、血液凝固因子、ホルモン、腫瘍細胞、薬物分子、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼ、過敏性メディエーター、炎症促進性因子、細菌毒素およびヘビ毒のような毒素；汚染物質、金属および抗酸化剤からなる群から選択される標的である。

いくつかのがん疾患におけるようないくつかの状態下で、内在性分子、例えばＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦおよび他の増殖刺激ホルモンを除去することが望ましい。かかる分子も、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体における結合機能によって標的とされる。

いくつかの免疫疾患におけるような他の状態下で、選択されたインターロイキンまたはＴＮＦのような内在性分子を一過性に除去することが望まれ得る。かかる分子も、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体における結合機能によって標的とされる。

一実施形態において、望ましい生物活性を有する第２の部分は、治療活性のあるポリペプチドである。治療活性のあるポリペプチドの非限定的な例は、酵素、例えばアルガシダーゼ（ａｌｇａｓｉｄａｓｅ）αおよびβ、グルコセレブロシダーゼ、ラロニダーゼ、アリールスルファターゼ、アグルコシダーゼ（ａｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）−α、アスパラギナーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘａ因子；ホルモンおよび増殖因子、例えば成長ホルモン、形質転換増殖因子−β２、エリスロポエチン、インスリン、インスリン様増殖因子１、ミオスタチン、骨由来増殖因子およびグルカゴン様ペプチド１；ケモカイン、例えばＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＸＣＬ１およびＣＸＣ３ＣＬ１；およびサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ、および顆粒球／マクロファージＣＳＦからなる群から選択される分子のような、生体分子である。

当業者は理解するように、第１の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、融合タンパク質においてまたは任意の他の部分へのコンジュゲートパートナーとして有用であり得る。したがって、治療活性のあるポリペプチドの上記のリストは、いかなる方法においても限定するものとして解釈すべきではない。

融合ポリペプチドまたはコンジュゲート体を作るための他の可能性も企図される。したがって、本発明の第１の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、標的結合に加えてまたはこの代わりに他の機能を示す第２のまたは別の部分に共有結合していてもよい。一例は、１つまたはそれ以上のＦｃＲｎ結合ポリペプチドとレポーターまたはエフェクター部分として役立つ酵素的に活性なポリペプチド間の融合物である。

本開示によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドを組み込んでいる融合タンパク質またはコンジュゲート体の上記の記載に関して、第１の、第２のおよび別の部分という命名は、一方での本開示によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドと、他方での他の機能を示す部分とを区別するための明瞭さが理由で行われていることに注目すべきである。これらの命名は、融合タンパク質またはコンジュゲート体のポリペプチド鎖における種々のドメインの実際の順序を表すことは意図されていない。したがって、例えば、前記第１の部分は、制限なく、融合タンパク質またはコンジュゲート体のＮ末端で、中央において、またはＣ末端で現れ得る。

一実施形態において、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合が少なくとも部分的に阻害されるようにＦｃＲｎに結合する、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。この阻害は、ＩｇＧと同じ、または少なくとも部分的に重複しているＦｃＲｎの領域へのＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体の結合に起因し得る。代わりに、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体は、ＩｇＧとは異なるＦｃＲｎの領域に結合するが、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を立体的に妨げることができる。したがって、循環系からのＩｇＧの排除またはクリアランスの速度は、ＩｇＧの増加したリソソーム分解に起因して増加するが、これはなぜならＩｇＧのＦｃＲｎ媒介再利用が、本開示によるＦｃＲｎ結合ポリペプチドによるＦｃＲｎ結合部位の占有に起因して全体的または部分的に利用できないからである。換言すれば、本開示によるＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または組成物の投与は、循環ＩｇＧ抗体の異化を増加させるように作用することになる。

一実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値は、ＩｇＧとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄよりも低い。この関連性は、ｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方で、またはｐＨ６．０のみで当てはまり得る。

上記の態様は、第１の態様によるＦｃＲｎ結合ポリペプチド、または第２の態様による融合タンパク質またはコンジュゲート体に含まれるＦｃＲｎ結合ポリペプチドが、蛍光色素および金属、発色団色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される標識のような、標識をさらに含むポリペプチドをさらに包含する。かかる標識は、例えばポリペプチドの検出に使用することができる。

他の実施形態において、標識化ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、望ましい生物活性を有する第２の部分も含むかつ／または上記の結合機能を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体における部分として存在する。標識は、いくつかの場合において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのみに、いくつかの場合において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドとコンジュゲート体または融合タンパク質の第２の部分との両方に結合していてもよい。さらに、標識が、第２の部分のみに結合しており、ＦｃＲｎ結合部分には結合していなくてもよいこともあり得る。故に、さらに別の実施形態において、前記標識が第２の部分のみに結合している、第２の部分を含むＦｃＲｎ結合ポリペプチドが提供される。

標識化ポリペプチドを参照する場合、これは、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドならびに第２のおよび場合により別の部分を含む融合タンパク質およびコンジュゲート体を含めた、本明細書に記載のポリペプチドの全ての態様への参照として理解されるべきである。したがって、標識化ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドおよび例えば、キレート化されているかまたはＦｃＲｎ結合ポリペプチドに共有結合していてもよい治療的放射性核種のみを含有するか、またはＦｃＲｎ結合ポリペプチド、治療的放射性核種および例えば治療的効能を生じる、望ましい生物活性を有する小分子のような、第２の部分を含有することができる。

ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体が放射標識されている実施形態において、かかる放射標識されたポリペプチドは、放射性核種を含むことができる。放射性核種の大部分は、金属性を有し、イオン形で使用され、タンパク質およびペプチドにおいて提示されるエレメントと安定な共有結合を形成する能力が典型的にない。この理由により、放射性金属でのタンパク質およびペプチドの標識化は、キレートと称される、金属イオンとの非共有結合性化合物を形成する、キレート剤、すなわち多座配位子を使用して行う。ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体の実施形態において、放射性核種の組込みは、それを通して放射性核種がポリペプチドに配位し、キレート化するまたは錯体化することができる、キレート化環境の提供を通して可能になる。

キレート剤の一例は、キレート剤のポリアミノポリカルボキシレート型である。かかるポリアミノポリカルボキシレートキレート剤の２つのクラスを、区別することができる：大環状および非環式キレート剤。

一実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体は、システイン残基のチオール基またはリジン残基のイプシロンアミン基を介してＦｃＲｎ結合ポリペプチドにコンジュゲートしたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されたキレート化環境を含む。

インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、ラジオアクチニドおよびラジオランタニドのラジオアイソトープのための最も一般に使用される大環状キレート剤は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）の種々の誘導体である。一実施形態において、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体のキレート化環境は、ＤＯＴＡまたはその誘導体によって提供される。より明確には、一実施形態において、本開示によって包含されるキレート化ポリペプチドは、ＤＯＴＡ誘導体１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）を前記ポリペプチドと反応させることによって得る。

さらに、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）およびその誘導体を、キレート剤として使用することができる。故に、一実施形態において、ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはその誘導体である、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。

最も一般に使用される非環式ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸）の種々の誘導体である。故に、ジエチレントリアミンペンタ酢酸またはその誘導体によって提供されるキレート化環境を有するポリペプチドも、本開示によって包含される。

別の実施形態において、ポリヌクレオチドの発現を通して組換えでまたは合成的に作製されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、例えばその流体力学半径を増加させるために、１つまたはそれ以上の合成ポリマーにコンジュゲートしている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、この目的のために一般に使用されるが、他のポリマーも、当技術分野において使用されてきた。かかる「ペグ化」を使用して、本明細書で記載した型のいずれかのＦｃＲｎ結合ポリペプチドのサイズを、効果的な腎排泄のための閾値を超えるサイズに増加させることができる。

一実施形態において、合成ポリマーは、１つまたはそれ以上の化学的に合成された、単量体のＦｃＲｎ結合ポリペプチドにコンジュゲートしている。他の官能性も、同じ合成ポリマーにコンジュゲートしていてもよい。ＦｃＲｎ結合ポリペプチドおよび他の構成要素が化学的に合成されている場合、構成要素のいずれも、これが望ましくない場合、生物系において作られていなくてもよいことになる。

好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上の合成的にまたは生物学的に製造されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、効率的な腎クリアランスと関連しているサイズを超えるサイズを達成するために、合成ポリマーにコンジュゲートしており、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断するために使用される。各ＦｃＲｎ結合ポリペプチドにおけるユニークなシステインを、部位特異的コンジュゲーション、例えばこの目的のために導入されたＣ末端に位置するシステインに使用することができる。分岐合成ポリマー、２つを超えるＦｃＲｎ結合部分を、同じポリマーにコンジュゲートして、アビディティー、したがって遮断効力を増強することができる。

本開示の第３の態様において、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および発現ベクターを含む宿主細胞を発現させることを含む、上記のポリペプチドまたは融合タンパク質を作製する方法も、本開示によって包含される。

前記宿主細胞をその発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現に許容的な条件下で培養すること、およびポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドを作製する方法も、包含される。

本開示のＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、代わりに、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用して、非生物学的ペプチド合成によって作製することができ、非生物学的ペプチド合成は、
−保護された反応性側鎖を有する第１の態様によるポリペプチドを形成するためのアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の段階的なカップリング、
−ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、および
−水溶液中でのポリペプチドの折り畳み
を含む。

本開示の第４の態様において、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体および少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤または担体を含む組成物が提供される。その一実施形態において、前記組成物は、少なくとも２つの追加の活性薬剤のような、少なくとも３つの追加の活性薬剤のような、少なくとも１つの追加の活性薬剤をさらに含む。かかる組合せにおいて有用であると判明し得る追加の活性薬剤の非限定的な例は、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗菌剤および酵素である。

この態様の一実施形態において、前記組成物は、経口投与、鼻腔内投与、肺投与、膣投与、直腸投与、静脈内注入、腹腔内注入、筋肉内注入、皮下注入および皮内注入からなる群から選択される経路による投与に適応される。

本明細書では、「全身投与」という用語は、全身が影響されるように、目的の物質が循環系中に入る、投与の経路を表す。当業者は、全身投与が、腸内投与（胃腸管を通しての薬物の吸収）または非経口投与（一般的に注入、輸注または移植）を介して起こり得ることを認識している。

一実施形態において、前記組成物を、全身的または局所的投与に適応する。いくつかの実施形態において、前記化合物の全身投与を使用することができる。別の実施形態において、前記組成物を、局所経路による投与に適応する。例えば、局所投与は、軟膏、ペースト、泡またはクリームでの外用であってもよい。別の実施形態において、前記組成物を、内皮または上皮層を通過しての投与に適用する。ここで、組成物を、前記層を通過して経細胞輸送することができる。

一実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体を含む組成物の取込みの速度は、それ自体で第２のまたは別の部分に相当するポリペプチドの取込みの速度よりも高い。一実施形態において、取込みの速度は、それ自体で第２のまたは別の部分の取込みの速度よりも、少なくとも５倍高いような、少なくとも１０倍高いような、少なくとも２５倍高いような、少なくとも２倍高い。

上記の開示から、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または組成物は、例えば、治療薬として、および／または融合パートナーのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するための手段として、および／または望ましくない標的の排除の速度を増加させるための手段として有用であり得ることが理解されるべきである。

故に、本開示の第５の態様において、医薬としての使用のための本明細書で開示したＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物が提供される。

本開示の関連する第６の態様において、治療活性のある量の本明細書で開示したＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物を投与する工程を含む、それを必要としている対象の処置の方法が提供される。

これら最後の２つの態様のいずれか１つの一実施形態において、医薬または方法は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドが少なくとも部分的にＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断する能力が開拓される処置、すなわちＩｇＧ抗体の増加した異化が望まれる処置を目的とする。一実施形態において、かかる処置が指示され得る状態は、自己免疫状態である。指示される状態の非限定的な例として、重症筋無力症、ギランバレー症候群、自己免疫性辺縁系脳炎、連鎖球菌感染症と関連する小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、神経性筋強直症（アイザックス症候群）、モルヴァン症候群、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、硬化性苔癬、抗リン脂質抗体症候群、再発性多発軟骨炎、自己免疫性貧血、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｒｏｍｂｏｃｙｔｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、自己免疫性グレーブス病、拡張型心筋症、血管炎、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスが挙げられる。

別の実施形態において、循環からの望ましくない標的の遮断または除去における使用のための、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物が提供される。一実施形態において、前記望ましくない標的は、アレルゲン、アミロイド、抗体、自己抗原、血液凝固因子、ホルモン、腫瘍細胞、薬物分子、サイトカイン、ケモカイン、過敏性メディエーター、炎症促進性因子、細菌毒素およびヘビ毒のような毒素、汚染物質、金属および抗酸化剤を含む群から選択される。

本発明を様々な例示的な態様および実施形態を参照して記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物をそのエレメントの代わりに用いることができることは、当業者によって理解されることになる。さらに、多くの改変を、その本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適応するために行うことができる。したがって、本発明は企図されたいかなる特定の実施形態にも限定されず、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲内にある全ての実施形態を含むことになることが意図されている。

本発明のＦｃＲｎ結合ポリペプチドに含まれるＦｃＲｎ結合モチーフの例（配列番号１〜３５３）、本開示による４９−ｍｅｒ ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの例（配列番号３５４〜７０６）、本開示による５８−ｍｅｒ ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの例（配列番号７０７〜１０６２）のアミノ酸配列ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号１０６３）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号１０６４）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号１０６５）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号１０７０）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号１０６６）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号１０６７）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号１０６８）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号１０６９）のアミノ酸配列の一覧である。 図１Ａの続き。 図１Ｂの続き。 図１Ｃの続き。 図１Ｄの続き。 図１Ｅの続き。 図１Ｆの続き。 図１Ｇの続き。 図１Ｈの続き。 図１Ｉの続き。 図１Ｊの続き。 図１Ｋの続き。 図１Ｌの続き。 図１Ｍの続き。 図１Ｎの続き。 図１Ｏの続き。 図１Ｐの続き。 図１Ｑの続き。 図１Ｒの続き。 図１Ｓの続き。 図１Ｔの続き。 図１Ｕの続き。 図１Ｖの続き。 図１Ｘの続き。 図１Ｙの続き。 図１Ｚの続き。 図１ＡＡの続き。 図１ＢＢの続き。 図１ＣＣの続き。 図１ＤＤの続き。 図１ＥＥの続き。 図１ＦＦの続き。 図１ＧＧの続き。 図１ＨＨの続き。 図１ＩＩの続き。 図１ＪＪの続き。 図１ＫＫの続き。 図１ＬＬの続き。 図１ＭＭの続き。 Ａ〜Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体およびＩｇＧに関するｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合およびｐＨ６．０および７．４での解離を示す図である。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号７０７）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号７１０）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号７０９）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号７０８）および（Ｅ）ＩｇＧに関して示す。 図２Ａの続き。 図２Ｂの続き。 図２Ｃの続き。 図２Ｄの続き。 実施例４において記載した、ヒト（上部のパネル）およびマウス（下部のパネル）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ ＨｅＬａ細胞へのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合のフローサイトメトリー分析からのドットプロットである。ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの不均一な発現のために、細胞をＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ発現レベルに従ってゲートで制御した。ゲートＨにおける細胞は、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性であると考えられ、ゲートＩにおける細胞は、陽性であると考えられる。Ａｌｅｘａ６４７標識化Ｚ変異体でのインキュベーションは、Ａｌｅｘａ６４７とｅＧＦＰの両方に関して陽性の集団を生じたが、緩衝液でのインキュベーション（緩衝液対照）は、生じなかった。図は、３種の変異体Ｚ０７９６０（配列番号７１０）、Ｚ０７９３０（配列番号７１２）およびＺ０７９１８（配列番号７０７）がヒトＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎに結合することを示している。ｙ軸は、Ａｌｅｘａ６４７強度を示し、ｘ軸は、ｅＧＦＰ活性を示す。 実施例４において記載した、細胞結合アッセイにおいて測定された、Ａｌｅｘａ６４７標識化Ｚ０７９６０（配列番号７１０）、Ｚ０７９３０（配列番号７１２）およびＺ０７９１８（配列番号７０７）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す図である。ダイヤグラム（Ａ）は、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰで形質導入されたＨｅＬａ細胞からのＭＦＩを示し、ダイヤグラム（Ｂ）は、マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰで形質導入されたＨｅＬａ細胞からのＭＦＩを示す。 実施例５において記載した、ヒト（上部のパネル）およびマウス（下部のパネル）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ ＨｅＬａ細胞に結合するヒトまたはマウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ６４７のフローサイトメトリー分析からのドットプロットである。ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの不均一な発現のために、細胞表面上のＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの存在量に従って細胞にゲートをかけた。ゲートＭにおける細胞は、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性であると考えられ、ゲートＮにおける細胞は、陽性であると考えられる。ＦｃＲｎ形質導入ＨｅＬａ細胞への１００ｎＭヒトまたはマウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７の結合を、左パネル（０ｎＭ）に示す。図は、ＩｇＧ結合が、Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ０７９１８（配列番号：７０７）によって用量依存的（１、１０、１００および１０００ｎＭ）に遮断されたことを示している。ｙ軸は、Ａｌｅｘａ６４７強度を示し、ｘ軸は、ｅＧＦＰ活性を示す。 実施例５において記載した、（Ａ）ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞および（Ｂ）マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞上での、種々の濃度のＨｉｓ_６−タグを付けたＺ０７９１８（配列番号７０７）の存在下でのＩｇＧ Ａｌｅｘａ６４７のＦｃＲｎ結合から生じた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す図である。図は、Ｚ変異体によるＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合の用量依存性遮断を示す。 Ａ〜Ｃは、実施例６において記載した、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用した、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの３種のＺ変異体の結合の動態を示す図である。アルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３（配列番号１０６３）および対照Ｚ変異体分子Ｚ０３６３８（配列番号１０６４；ＦｃＲｎに特異的ではない）と融合した、それぞれ、（Ａ）Ｚ１１９４８（配列番号１０６０）、（Ｂ）Ｚ１１９４６（配列番号１０６１）および（Ｃ）Ｚ１１９４７（配列番号１０６２）の濃度系列に関するセンサーグラムを示す。６４０ｎＭ（破線）、１６０ｎＭ（点線）および４０ｎＭ（灰色の実線）からの曲線を、ラングミュア１：１結合モデルを使用して、動態解析に供した。動態パラメーターおよび親和性を、近似曲線（黒の実線）から計算し、表５に示す。 図７Ａの続き。 図７Ｂの続き。 実施例６において記載したように得られたアルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３に融合した、３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関する薬物動態学的プロファイルを示す図である。Ｚ変異体Ｚ１１９４７（配列番号１０６２、開いた四角形）、Ｚ１１９４６（配列番号１０６１、開いた三角形）およびＺ１１９４８（配列番号１０６０、開いたひし形）は、陰性対照ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８（開いた円）と比較して、全て延長された半減期を示した。 実施例１０において記載したようにアッセイした、それぞれ、Ｈｉｓ_６−Ｚ０７９１８（配列番号７０７；黒の円）、ＩＶＩｇ（灰色の四角形）およびＳＣＩｇ（灰色の三角形）による、ヒトＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ結合の遮断を示す図である。 マウスにおけるＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体でのＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断が、ＩｇＧの減少したレベルを生じることを示すグラフである。実施例１１においてさらに記載したように、マウスを、ビヒクル（＋）、ＡＢＤ融合Ｚ変異体Ｚ０７９１８−ＰＰ０１３（開いた四角形）およびＺ１１９４８（配列番号１０６０；閉じた円）の５回の毎日の注入で処置した。内在性ＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。２４、７２、１２０および１６８時間での、個々のマウスにおけるＩｇＧの濃度は、０時間でのレベルと関連しており、したがって結果を０時間でのＩｇＧの百分率として提示する。

実施例
概要
以下の実施例は、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的とする新規なＺ変異体分子の開発を開示する。Ｚ変異体を、ファージディスプレイテクノロジーを使用して得た。本明細書で記載したＦｃＲｎ結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、相当するアミノ酸配列を、図１において列挙し、識別名配列番号７０７〜１０５９によって表示した。また、これらの選択された結合変異体の推定される結合モチーフを、配列識別名配列番号１〜３５３で図１において列挙した。

ヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の作製
この実施例において、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号１０６６）との複合体であるヒトαＦｃＲｎ（配列番号１０６５）（ＦｃＲｎと表示する複合体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および非複合型であるヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍと表示する）を、可溶性タンパク質として作製した。この実施例において作製されたヒトＦｃＲｎおよびＢ２Ｍを、実施例２および３において、ファージ選択、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅアッセイに使用した。

材料および方法
同時発現に使用されるヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築：ヒトαＦｃＲｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ００８７３４．２）およびヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０３２５８９．１）をコードする遺伝子を、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。ＰＣＲ重複伸長を使用して、ヒトαＦｃＲｎ（αＦｃＲｎ_ＥＣＤ）（配列番号１０６５）のアミノ酸２４〜２９０をコードする遺伝子断片を、ａｔｔＢ１−部位／Ｋｏｚａｋ配列、それに続くＩｇカッパ鎖リーダー配列、ｈＦｃＲｎ_ＥＣＤ、ＧＳリンカーおよびｆｌａｇタグをコードする遺伝子、それに続くａｔｔＢ２部位からなる構築物に増幅した。ヒトＢ２Ｍ（配列番号１０６６）のアミノ酸２１〜１１９をコードする遺伝子断片を含有する、Ｈｉｓ_６タグがｆｌａｇタグに置き換わっていること以外は同様の構築物を作製した。構築物を、製造業者の推奨に従って、Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１１７８９０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）を使用した組換えによって、プラスミドｐＤＯＮＯＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１２５３６−０１７）中に挿入した。正確な配列の検証後、ヒトαＦｃＲｎ_ＥＣＤ構築物を、プロモーター含有プラスミドｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ（Ｔａｉら（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（９）：ｅ４６２６９）とともに、ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇを使用して、２Ｋ７_ｂｓｄ（Ｓｕｔｅｒら（２００６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：６１５〜６２３）中に挿入し、ベクター２Ｋ７_ｂｓｄ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ_ＥＣＤを生じた。ヒトＢ２Ｍ遺伝子構築物を、同様に２Ｋ７_ｎｅｏ（上記のＳｕｔｅｒら）中に挿入し、ベクター２Ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍを得た。

細胞培養、組換えレンチウイルスベクターの調製およびＳＫＯＶ−３細胞系中への遺伝子挿入：ＨＥＫ２９３ＴおよびＳＫＯＶ−３細胞系を、ＡＴＣＣから得た。細胞を、５％ＣＯ_２の存在下で、加湿インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系のための完全培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＡ）および１％ＭＥＭ Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＥＡＡ）で補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。ＳＫＯＶ−３細胞系のための完全培地は、１０％ＦＢＳおよび１％ＡＡで補充した、ＭｃＣｏｙ’５Ａ培地であった。

プラスミド２Ｋ７_ｂｓｄ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ_ＥＣＤおよび２Ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍを、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミドとと
もに、塩化カルシウムトランスフェクション（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（９）：８７１〜５；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ８４：５８〜６７）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に別々にコトランスフェクトした。それぞれ、ヒトαＦｃＲｎ_ＥＣＤおよびヒトＢ２Ｍ導入遺伝子を有する、形成されたレンチウイルス粒子を含有するＨＥＫ２９３培養物上清を、遠心分離およびろ過によって細胞片から取り除いた。レンチウイルス粒子の２つの型を使用して、ＳＫＯＶ−３細胞を順次形質導入した。ヒトαＦｃＲｎ_ＥＣＤとＢ２Ｍ遺伝子の両方を含有する成功的な二重の組込み体を、細胞を２週間継代している間に、培地へのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＧ４１８サルフェート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加によって選択した。生じた、安定に形質導入されたＳＫＯＶ−３細胞系を、ＳＫＯＶ−３ ｈＦｃＲｎ_ＥＣＤ／ｈＢ２Ｍと表示した。

組換えヒトＦｃＲｎの発現：ヒトＦｃＲｎを生じるヒトαＦｃＲｎ_ＥＣＤおよびＢ２Ｍを同時発現するＳＫＯＶ−３細胞を増殖させ、１．５×１０^７細胞を、５６０ｍｌ完全増殖培地におけるＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。５日後、細胞が定着し、増加した際に、培地をＦＢＳを有さない完全増殖培地に交換した。５日後、培養を終結し、上清を採取し、４５μｍフィルターを通過させ、−８０℃で凍結した。

ヒトＩｇＧクロマトグラフィーを使用した、組換えヒトＦｃＲｎの精製：タンパク質精製を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行った。１０ｍｇ／ｍｌの濃度での０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３、０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．３における、ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを、製造業者の指示に従って、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。ＳＫＯＶ−３細胞由来の組換えヒトＦｃＲｎを含有する上清を解凍し、ｐＨをＨＣｌで５．８に調整した。その後、上清を、１００ｍｌのバッチで、２０ｍＭビストリスｐＨ５．８で前もって平衡したカラム上へ充填した。カラムを、２０ｍＭビストリスｐＨ５．８ ２０ｍｌで洗浄し、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．１を使用して、１ｍｌの画分で溶出した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１０ｍＭフォスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）への緩衝液交換を、透析を使用して行った。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：タンパク質精製からの溶出画分の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色によって、分析した。ウエスタンブロットを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｃ Ｅｘｔｒａニトロセルロース膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。膜を、ＴＢＳ＋Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８）における５％脱脂粉乳（Ｓｅｍｐｅｒ）で１時間ブロッキングし、次いでＴＢＳ＋Ｔ中の０．１５μｇ／ｍｌの濃度でのウサギ抗ＦＣＧＲＴポリクローナル抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および０．２３μｇ／ｍｌの濃度でのウサギ抗Ｂ２Ｍポリクローナル抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の混合物で探索した。その後、膜をＴＢＳ＋Ｔにおいて１：１０，０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲートしている安定化ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートした。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後、膜の画像をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で取得した。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍを、ＧＢＸ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒおよびＧＢＸ ｆｉｘｅｒ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、加工した。

ヒトＢ２Ｍの非複合型の作製：ヒトＢ２Ｍを大腸菌において作製した。発現および精製を、本質的にＳａｎｄａｌｏｖａら（２００５）Ａｃｔａ Ｃｈｒｙｓｔ Ｆ６１：１０９０〜１０９３およびＭｉｃｈａｅｌｓｓｏｎら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：７３２７〜７３３４において報告されているように行った。尿素におけるヒトＢ２Ｍのアミノ酸２１〜１１９からなる精製タンパク質を、以下のようにアルギニン再折り畳みに供した；Ｂ２Ｍ ０．５ｍｇを、２ｍｌ再折り畳み緩衝液（２０ｍｌ １Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１６．８７ｇ Ｌ−アルギニン（ＨＣｌで緩衝された）、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、６１ｍｇ ＧＳＳＧ、３０７ｍｇ ＧＳＨおよび２００ｍｌ、ｐＨ８．０の最終体積までミリＱ水、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１１ ８７３ ５８０ ００１）で補充した）に急速に加えた。再折り畳み手順を、４℃で４時間の間行った。再び折り畳まれたＢ２Ｍタンパク質を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。

結果
同時発現に使用されるヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築：ヒトＦｃＲｎのα鎖の細胞外ドメイン（αＦｃＲｎ_ＥＣＤ）およびヒトＢ２Ｍをコードする遺伝子を、それぞれ、レンチウイルストランスファープラスミド２Ｋ７_ｂｓｄおよび２Ｋ７_ｎｅｏ中に挿入した。両方の場合において、挿入された遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあった。生じたタンパク質が、小胞体を通しての培地への排出のためのタンパク質を標的とするためのＮ末端におけるＩｇカッパ鎖リーダー配列を有するように、遺伝子が伸長された（シグナル配列が分泌時に切断された）。さらに、αＦｃＲｎ_ＥＣＤは、潜在的な検出のためのＦＬＡＧ−タグが後に続くＣ末端スペーサー配列を有した。ヒトＢ２Ｍは、潜在的な検出のためのＨｉｓ_６タグが後に続くＣ末端スペーサー配列を有した。スペーサー配列は、タグの利便性を増強するために加えた。レンチウイルストランスファープラスミドは、両方の構築物が挿入された細胞の選択を可能にするための２つの異なる抗生物質耐性遺伝子も含有した。

組換えヒトＦｃＲｎの発現および精製：αＦｃＲｎ_ＥＣＤおよびＢ２Ｍをコードする遺伝子を、レンチウイルスによってＳＫＯＶ−３のゲノム中に挿入し、生じたＦｃＲｎタンパク質を、培地中に分泌させた。保持されたｐＨ依存ＩｇＧ結合を有するＦｃＲｎのみを捕捉するために、固定化ＩｇＧを使用したアフィニティークロマトグラフィーを使用し、受容体がｐＨ５．８で捕捉され、ｐＨ８．１で溶出された。捕捉されたタンパク質を、３つの画分において溶出した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：作製されたＦｃＲｎタンパク質の２つのペプチド鎖（αＦｃＲｎ_ＥＣＤおよびＢ２Ｍ）の存在を調査するために、および溶出された材料の純度を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を溶出画分に行った。ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎで染色されたゲルに関して、２つのバンドが、それぞれ、１２および３６ｋＤａの分子量で検出された。これは、Ｂ２Ｍに関する１２ｋＤａおよびαＦｃＲｎ_ＥＣＤに関する３１ｋＤａの非グリコシル化ペプチド鎖の理論上の分子量にほぼ相当する。タンパク質のαＦｃＲｎ_ＥＣＤ部は、１つのグリコシル化部位を含有し、したがって、その分子質量が３１ｋＤａよりも高いことが予想された。ゲルに銀染色もして、感受性を増加させ、できる限り不純物を検出した。約６６ｋＤａのバンドが、第１の溶出画分において検出され、これは、細胞接着から生じるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に相当した。画分２および３において回収されたタンパク質の総量は、１．４ｍｇ／ｌ培地に相当した。プールされた材料へのウエスタンブロット分析を行い、これは、本質的に２つの主要なバンドのみを示し、さらに分解産物に相当する１２ｋＤａ未満の非常に弱いバンドを示した。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の選択およびＥＬＩＳＡ結合
この実施例において、ヒトＦｃＲｎを、Ｚ変異体のファージライブラリーを使用した、ファージディスプレイ選択における標的として使用した。選択されたクローンを、ＤＮＡ配列決定し、大腸菌ペリプラズム画分において作製し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）においてＦｃＲｎに対してアッセイした。

材料および方法
標的タンパク質ＦｃＲｎおよびＢ２Ｍのビオチン化：実施例１において記載したように作製した、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＢ２Ｍを、製造業者の推奨に従って、それぞれ、３１×（ＦｃＲｎ）および１０×（Ｂ２Ｍ）モル過剰でＮｏ−Ｗｅｉｇｈ ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．２１３２７）を使用して、ビオチン化した。反応を、室温（ＲＴ）で３０分間行った。それに続くＰＢＳへの緩衝液交換を、製造業者の指示に従って、Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（ＦｃＲｎ；Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６６３８０、１０，０００ＭＷＣＯおよびＢ２Ｍ；Ｐｉｅｒｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６６３３３、３，５００ＭＷＣＯ）を使用して、行った。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：本質的にＧｒｏｎｗａｌｌら（２００７）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２８：１６２〜１８３において報告されているように、バクテリオファージ上に表示され、ファージミドｐＡＹ０２５９２において構築された、プロテインＺのランダム変異体のライブラリーを使用して、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を選択した。このライブラリーにおいて、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ、連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのＧＡ３）を、Ｚ変異体への融合パートナーとして使用した。ライブラリーは、Ｚｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩと表示され、１．５×１０^１０ライブラリーメンバー（Ｚ変異体）のサイズを有した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩを含有するグリセリンストックからの大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞（Ｒｕｔｈｅｒら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：５７６５〜５７７２）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充した、定義されたプロリンを含まない培地２０ｌ［リン酸水素二カリウム７ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／ｌ、ウラシル０．０２ｇ／ｌ、ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）６．７ｇ／ｌ、グルコース一水和物５．５ｇ／ｌ、Ｌ−アラニン０．３ｇ／ｌ、Ｌアルギニン一塩酸塩０．２４ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１１ｇ／ｌ、Ｌ−システイン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．３ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン０．１ｇ／ｌ、グリシン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩０．２５ｇ／ｌ、Ｌ−メチオニン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−セリン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−トレオニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−チロシン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−バリン０．１ｇ／ｌ］に播種した。培養物を、発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ、ＢＲ２０）において３７℃で増殖させた。細胞が６００ｎｍ（ＯＤ_６００）での０．７５の光学濃度に達したとき、培養物約２．６ｌを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｎ０３１５Ｓ）の１０×モル過剰を使用して、感染させた。細胞を、３０分間インキュベートし、そこで発酵槽を、発現の誘発のための１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌカルベニシリンで補充したＴＳＢ−ＹＥ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ；３０ｇ／ｌ ＴＳＢ、５ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）で２０ｌまで満たし、３０℃で２２時間増殖させた。培養物における細胞を、１５，９００ｇでの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子を、上清からＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）において２回沈澱させ、ろ過し、上記のＧｒｏｎｗａｌｌらにおいて報告されているようにＰＢＳおよびグリセリンに溶解した。ファージストックを、使用前に−８０℃で保管した。

ビオチン化ヒトＦｃＲｎに対する選択を、２個の異なるトラックに分けた４つのサイクルで行った。ファージストック調製および選択手順を、本質的にＷＯ２００９／０７７１７５において別のビオチン化標的に対する選択に関して報告されているように行った。選択サイクル間のファージの増幅を、大腸菌ＲＲＩΔＭ１５をファージに感染させ、次いで以下のように溶液中で培養を行うことによって行った。溶出したファージおよび細菌と比較してＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージの１０×過剰を、回転なしで３７℃で３０分間、その後ゆっくり回転させながら３０分間、対数期細菌に同時に感染させておいた。感染に先立って、細菌を、上記の定義されたプロリンを含まない培地において対数期まで増殖させた。感染させた細菌を、４，３００ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充した２００ｍｌ ＴＳＢ＋ＹＥ培地に再懸濁し、ファージ作製のために３０℃で終夜培養した。

選択緩衝液は、塩化水素でｐＨ５．５に調整し、０．１％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充した、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなった。選択において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ａｌｂｕｃｕｌｔ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を、１．５μＭの最終濃度まで選択緩衝液に加えた。バックグラウンド結合剤の量を減少させるために、事前選択を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ−ｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ、ｃａｔ．ｎｏ．１１２．０６）での、ＲＴで１時間のファージストックのインキュベーションによって行った。第２の事前選択を、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ、ｃａｔ．ｎｏ．４４４４７４）において固定化されたヒトＢ２Ｍに対してＲＴで３０分間に行った。炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ．０６８Ｋ８２１４）におけるヒトＢ２Ｍ ５μｇ／ｍｌを、チューブにおいて７℃で＞１時間、固定化した。水道水で２回洗浄した後、チューブを、使用前に、ＰＢＳ＋０．５％カゼイン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ８６５４）でＲＴで３０分間ブロッキングした。選択において使用する全てのチューブおよびビーズを、ＰＢＳ＋０．１％ゼラチンで前もってブロッキングした。選択を、溶液においてＲＴで行い、その後、２．９μｇビオチン化ＦｃＲｎ毎に１ｍｇビーズを使用して、ＳＡ−ビーズ上で標的−ファージ複合体の捕捉を行った。選択のサイクル１において、１００ｎＭビオチン化ＦｃＲｎを使用し、各２分の２回の洗浄を、選択緩衝液を使用して行った。増加したストリンジェンシーを、低下した標的濃度および回数が増加した洗浄を使用して、それに続くサイクルに適用した：５０ｎＭ／５洗浄、２５ｎＭ／８洗浄および１０ｎＭ／１２洗浄を、それぞれ、サイクル２、３および４に適用した。洗浄後、結合したファージを、２つの異なる手順；１）５００μｌ ０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、その後の５０μｌ １Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および４５０μｌ ＰＢＳでの即時の中和、または；２）１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０ ５００μｌならびに５００μｌ ＰＢＳでの中和を使用して、２個の選択トラックから溶出した。

配列決定：ＰＣＲ断片を、標準的なＰＣＲプログラムおよびプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ（配列番号１０７１））およびＡＦＦＩ−２２（５’−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号１０７２））を使用して、単一コロニーから増幅した。増幅された断片の配列決定を、製造業者のプロトコールに従って使用した、ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号１０７３））およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。配列決定反応物を、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して、磁性ストレプトアビジンをコーティングしたビーズ（Ｄｅｔａｃｈ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｅａｄｓ、Ｎｏｒｄｉａｇ、ｃａｔ．ｎｏ．２０１２−０１）への結合によって精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析した。

ＥＬＩＳＡのためのＺ変異体の作製：配列決定されたＺ変異体を、選択からの単一のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧで補充した１０ｍｌ ＴＳＢ−ＹＥ培地中に接種し、３７℃で２４時間インキュベートすることによって作製した。細胞を遠心分離によってペレット化し、２ｍｌ ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充したＰＢＳ）に再懸濁し、−８０℃で凍結し、水浴で解凍して、細胞のペリプラズム画分を遊離した。凍結解凍手順を７回繰返し、次いで細胞を遠心分離によってペレット化した。ペリプラズム抽出物の上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧ（上記のＧｒｏｎｗａｌｌら）として発現される、ＡＢＤへの融合物としてのＺ変異体を含有した。Ｚ＃＃＃＃＃は、個々の、５８アミノ酸残基Ｚ変異体を表す。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ分析：ＦｃＲｎへのＺ変異体の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）において希釈した抗ＡＢＤヤギ抗体２μｇ／ｍｌ（内部で作製した）で４℃で終夜コーティングした。抗体溶液を捨て、ウェルをＰＢＳＣ １００μｌ（０．５％カゼインで補充したＰＢＳ）で、ＲＴで１．５時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、１：４で希釈した５０μｌペリプラズム溶液をウェルに加え、ゆっくりとした振とう下でＲＴで１．５時間インキュベートした。溶液を捨て、ウェルを０．０５％ＰＣＴ緩衝液、ｐＨ６．０（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）または０．０５％ＰＣＴ緩衝液、ｐＨ７．４（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で、４回洗浄した。標的タンパク質、ビオチン化ヒトＦｃＲｎを、それぞれ、ＰＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４（０．５％カゼインで補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）において希釈した、２μｇ／ｍｌ（４５ｎＭ）から０．３ｎｇ／ｍｌ（６．９ｐＭ）の１：３希釈濃度系列でウェルに加えた。プレートをＲＴで１．５時間インキュベートし、その後上記のように洗浄した。ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｎ１００）を、それぞれ、ＰＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４において１：３００００に希釈し、ウェルに加え、その後４５分間インキュベートした。上記の洗浄後、５０μｌ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．３４０２１）をウェルに加え、プレートを製造業者の推奨に従って処置した。吸光度を、マルチウェルプレートリーダー、Ｖｉｃｔｏｒ^３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍで測定した。無関係のタンパク質に結合しているＺ変異体を陰性対照として使用し、ブランクを、ペリプラズム工程を省略することによって作り出した。予備実験においてＦｃＲｎに結合したＺ変異体（Ｚ０７９１８、配列番号７０７）を、陽性対照として使用した。相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）を決定するために、測定値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）および非線形回帰を使用して分析した。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ特異性分析：別のＥＬＩＳＡ実験において、Ｚ変異体の特異性を、それらを２μｇ／ｍｌビオチン化ヒトタンパク質Ｂ２Ｍ、ＰＳＭＡ（内部で作製した）およびＩｇＧ（ポリクローナル、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に対して、ならびにそれぞれ、ＰＣＣ緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４に対してアッセイすることによって試験した。アッセイを、上記のように、それぞれ、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で行った。ビオチン化タンパク質または緩衝液を、標的タンパク質工程においてＦｃＲｎの代わりにウェルに加えた。

結果
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：個々のクローンを、ビオチン化ヒトＦｃＲｎに対するファージディスプレイ選択の４つのサイクル後に得た。

配列決定：配列決定を、選択ラウンド４からランダムに採取したクローンに行った。各Ｚ変異体に、ユニークな同定番号＃＃＃＃＃を与え、個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と称した。５８アミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、配列番号７０７〜７２２および配列番号１０５９として図１において列挙した。

これらのＺ変異体の推定されるＦｃＲｎ結合モチーフを、配列番号１〜１６および配列番号３５３として図１において列挙した。これらのＺ変異体のそれぞれ内で完全な３ヘリックス束を構成することが予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３５４〜３６９および配列番号７０６として図１において列挙した。

Ｚ変異体でのＥＬＩＳＡアッセイ：１６種のクローンを、大腸菌においてＡＢＤ融合タンパク質として作製した。ペリプラズム画分を、ヒトＦｃＲｎの希釈系列に対するＥＬＩＳＡにおいて使用した。クローンは：Ｚ０７９０９（配列番号７１９）、Ｚ０７９１８（配列番号７０７）、Ｚ０７９３０（配列番号７１２）、Ｚ０７９６０（配列番号７１０）、Ｚ１０１０９（配列番号７０９）、Ｚ１０１１１（配列番号７１４）、Ｚ１０１２７（配列番号７１８）、Ｚ１０１２９（配列番号７１５）、Ｚ１０１４０（配列番号７１１）、Ｚ１０１４１（配列番号７１６）、Ｚ１０１４５（配列番号７２１）、Ｚ１０１５２（配列番号７２０）、Ｚ１０１５６（配列番号７１７）、Ｚ１０１６１（配列番号７２２）、Ｚ１０１８３（配列番号７１３）およびＺ１０１９３（配列番号７０８）であった。Ｋ_Ｄ値を、ｐＨ６．０で全ての変異体に関して、およびｐＨ７．４で３種の変異体に関して決定した（表１）。１３種の変異体に関して、データを、ｐＨ７．４でのＫ_Ｄ分析に関して得なかった。ヒトＢ２Ｍ、ＩｇＧまたはＰＳＭＡに対してアッセイした場合、１６種の変異体のいずれも、非特異的結合を示さなかった。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の作製および特徴付け
この実施例において、１７種のＺ変異体を大腸菌において作製し、精製し、ＢｉａｃｏｒｅにおいてヒトＦｃＲｎに対してアッセイした。前記変異体のサブセットを、マウスＦｃＲｎに対してもアッセイした。円二色性（ＣＤ）分光法を、それらの二次構造の調査のために、Ｚ変異体のサブセットに関して行った。

材料および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：１７種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（配列番号７０７〜７２２および配列番号１０５９）のＤＮＡを、ライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグを有する単量体のＺ変異体分子の構築のためのサブクローニング戦略を、（本質的に別の標的に結合するＺ変異体に関してＷＯ２００９／０７７１７５において詳細に報告されているように）標準的な分子生物学的技法を使用して、適用した。Ｚ遺伝子断片を、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを生じる発現ベクターｐＡＹ０１４４８中にサブクローニングした。

さらに、ＦｃＲｎ結合変異体Ｚ０７９１８（配列番号７０７）であるが、アミノ酸ＶＤの代わりにＡＥで始まり、Ｚ１１９４８（配列番号１０６０）と表示したものを、Ｚ変異体間の２つの異なるリンカーおよびそれに続くＣ末端Ｈｉｓ_６タグを有するホモ二量体構築物としてクローニングした。これを、ＤＮＡ増幅、適した制限酵素での制限およびＤＮＡのライゲーションを含めた従来の分子生物学的方法を使用して行った。２つのリンカーを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。Ｚ遺伝子断片を、それぞれ、コードされた配列［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＴ−（Ｇ_４Ｓ）−ＰＲ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＬＥＨＨＨＨＨＨおよび［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＴ−（Ｇ_４Ｓ）_３−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＬＥＨＨＨＨＨＨを生じる発現ベクター（ｐＥＴ−２６ ｏｒｉｇｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングした。

培養および精製：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、各それぞれのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の遺伝子断片を含有するプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補充したＴＳＢ−ＹＥ培地８００または１０００ｍｌにおいて３７℃で培養した。ＯＤ_６００＝２で、ＩＰＴＧを加えて、０．１７または０．２ｍＭの最終濃度で発現を誘発し、培養物をさらに５時間３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取した。

各細胞ペレット約２〜５ｇを、１５Ｕ／ｍｌの濃度までＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、ｃａｔ．ｎｏ．１．０１６５４．０００１）で、および０．５ｍｇ／ｍｌの濃度までＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ−７６５１）で補充した１０〜２５ｍｌ結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁した。３つの凍結解凍サイクルまたは超音波処理による細胞破壊後、細胞片を遠心分離によって除去し、各上清を１ｍｌ Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１１−００３３−９９）上に適用した。混入物を、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０または６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することによって除去し、その後ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、溶出緩衝液１（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）または溶出緩衝液２（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．５）で溶出した。精製Ｚ変異体を、製造業者のプロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、およびそれぞれのタンパク質の消衰係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の純度を、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各精製ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の同一性を、ＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認した。

ＣＤ分析：精製されたＨｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体を、ＰＢＳにおいて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。各希釈されたＺ変異体に関して、２５０〜１９５ｎｍまたは２５０〜１９０ｎｍでのＣＤスペクトルを、２０℃で得た。さらに、可変温度測定（ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＶＴＭ）を行って、融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭにおいて、吸光度を、温度を５℃／分の温度勾配で２０から９０℃まで上げながら、２２１ｎｍで測定した。新しいＣＤスペクトルを、Ｚ変異体の再折り畳み能力を研究するために、加熱手順後に２０℃で得た。ＣＤ測定を、１ｍｍの光路長を有する細胞を使用して、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ）上で行った。

Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：ヒトＦｃＲｎとのＦｃＲｎ結合Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体の相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において分析した。ヒトＦｃＲｎを、ＣＭ５チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において固定化した。固定化を、製造業者のプロトコールに従ってアミンカップリング化学作用を使用して、およびランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。チップ上の１つのフローセル表面を、分析物注入中にブランクとしての使用のために活性化し、非活性化した。以下に提示する２つの結合実験において、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０（０．００５％ＰＣＴ）で補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ６．０を、ランニング緩衝液として使用した。全ての実験において、５０μｌ／分の流速を使用した。

一実験において、ｐＨ６．０での解離を、ｐＨ７．４での解離と比較した。Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体およびヒトモノクローナルＩｇＧ１を、それぞれ、２５０ｎＭまたは２．５ｎＭの最終濃度まで、ランニング緩衝液において希釈し、同時注入手順を使用して、１分間ＦｃＲｎチップ上に注入した。相互作用の解離フェーズを代表する、同時注入手順の第２の注入は、ランニング緩衝液（ｐＨ６．０）または０．００５％ＰＣＴ ｐＨ７．４を含有した。Ｚ変異体を、ランニング緩衝液における５分間の表面平衡化の前に、Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３を除いて１分間解離させておき、Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３は４分間解離させておいた。ＩｇＧを、平衡化の前に４分間解離させておいた。緩衝液注入を、同様の方法で行った；緩衝液ｐＨ６．０の同時注入その後ｐＨ６．０または緩衝液ｐＨ６．０の同時注入その後ｐＨ７．４。結果を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において分析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線から減算した。さらに、緩衝液注入の曲線を、Ｚ変異体曲線からおよびＩｇＧ曲線から減算して、緩衝液効果に関して調整した。

別の実験において、近似の速度定数（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）および親和性（Ｋ_Ｄ）を、Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体のサブセットに関して決定した。Ｚ変異体の３つの濃度を１分間注入し、その後ランニング緩衝液において１分間解離させた。表面を、次のサイクルの開始前に７．５分間、ランニング緩衝液で平衡化した。注入した濃度は、６７５ｎＭ、２２５ｎＭおよび７５ｎＭ（Ｚ１０１４０、Ｚ１０１５６およびＺ１０１８３）または２２５ｎＭ、７５ｎＭおよび２５ｎＭ（Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３）であった。速度定数を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のラングミュア１：１モデルを使用して、センサーグラムから計算した。

別個の実験において、それぞれ、ｈＦｃＲｎ（配列番号１０６５）およびｍＦｃＲｎ（配列番号１０７０）へのＺ変異体の相互作用の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で測定した。ｈＦｃＲｎおよびｍＦｃＲｎを、ｍＦｃＲｎの作製のためにヒトＳＫＯＶ−３細胞の代わりにマウス３Ｔ３細胞を使用して、本質的に実施例１において記載したように作製し、ｐＨ４．６５でのアセテート緩衝液においてＣＭ５チップ上の別個のフローセル上で固定化した。固定化レベルは、両方の受容体に関して、約１０００ＲＵであった。参照フローセルを、活性化および非活性化によって作り出した。０．００５％ＰＣＴ ｐＨ６．０または７．４をランニング緩衝液としておよび分析物の希釈のために使用した。全ての分析を、２５℃で行った。Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号７０７）、Ｚ０７９６０（配列番号７１０）およびＺ１０１９３（配列番号７０８）に関する親和性定数を、１０２４ｎＭから０．５ｎＭ（ｐＨ６．０）または１０２４０ｎＭから５ｎＭ（ｐＨ７．４）の希釈系列を注入することによって決定した。親和性を、１つの部位結合飽和モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して、引き出した。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：Ｚ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する潜在力を、ＥｎＳｐｉｒｅマルチプレートリーダー２３００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。ヒトＩｇＧ（Ｒｏａｃｔｅｍｒａ）を、製造業者の推奨に従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．６７７２００２）上で固定化した。２５０ｎＭから３８ｐＭの最終濃度への、Ｈｉｓ−タグを付けたＺ変異体の段階的な連続希釈１：３を、３８４ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ６００５３５０）において行い、ＨＣｌを使用してｐＨ６．０に調整したＡｌｐｈａＬＩＳＡ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＬ０００Ｆ）において、１０ｎＭビオチン化ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ｏｒｂ８４３８８；本質的に実施例２において記載したようにビオチン化した）で４５分間インキュベートした。ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズを、１０μＭの最終濃度まで加え、４５分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．６７７２００２）を、４０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションを、暗所においてＲＴで行った。プレートを、ＥｎＳｐｉｒｅ機器において分析し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用して計算した。

結果
培養および精製：Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグとともに構築された、１７種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（配列番号７０７〜７２２および配列番号１０５９）を、大腸菌において作製した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定された、約２〜５ｇ細菌ペレットからのＩＭＡＣ−精製タンパク質の量は、種々のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関して約１０ｍｇから２０ｍｇの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらがＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な同一性および分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。

ＣＤ分析：６種のＺ変異体に関して決定したＣＤスペクトルは、それぞれが２０℃でαヘリックス構造を有したことを示した。この結果を、可変温度測定においても検証し、ここで融解温度（Ｔｍ）が決定された（表２）。９０℃への加熱前および後に測定したスペクトルをオーバーレイした場合、可逆的な折り畳みが６種のＺ変異体に関して見られた。

Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：ヒトＦｃＲｎへの１７種のＺ変異体の結合および種々のｐＨでの解離を、ＦｃＲｎを含有するチップ表面上に、ｐＨ６．０でのＺ変異体のそれぞれおよび緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４を順次注入することによって、Ｂｉａｃｏｒｅ機器において試験した。表面のリガンド固定化レベルは、１６６８ＲＵヒトＦｃＲｎであった。１７種のＺ変異体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を示し、全ての変異体に関して、より速いオフ速度が、ｐＨ６．０と比較してｐＨ７．４で見られた。ＩｇＧに関する結果は同様であり、ｐＨ７．４でのより速いオフ速度を示した。変異体Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３は、最も遅い解離曲線を示した。変異体およびＩｇＧのサブセットに関するセンサーグラムを、図２Ａ〜Ｅに示す。

ｐＨ６．０でＦｃＲｎと相互作用する５種のＺ変異体の速度定数を決定した（表３参照）。表面の固定化レベルは、２０１５ＲＵヒトＦｃＲｎであった。各Ｚ変異体に関して、速度定数を、３つの注入した濃度の曲線セットを使用して計算した。

親和性（Ｋ_Ｄ）定数も、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でヒトおよびマウスＦｃＲｎと相互作用するＨｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号７０７）、Ｚ０７９６０（配列番号７１０）およびＺ１０１９３（配列番号７０８）に関して決定した（表４）。３つ全ての変異体に関して、Ｋ_Ｄ値は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０で低かった。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：１７種のＨｉｓ_６−タグを付けた単量体のＺ変異体（配列番号７０７〜７２２および配列番号１０５９）および２種の二量体の変異体、Ｚ１１９４８−Ｇ_４Ｓ−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ_４Ｓ）_３−Ｚ１１９４８が、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を阻害する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイにおいて試験した。Ｚ変異体の連続希釈物を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎでインキュベートし、各それぞれの変異体の遮断能力を、ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズの添加およびその後のストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズの添加後に測定した。阻害は、陽性Ｚ変異体に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントの減少として測定される。このアッセイにおいてＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが示された、１０種の単量体の変異体および２種の二量体の変異体に関して計算されたＩＣ５０値を、表５に示す。

ヒトまたはマウスＦｃＲｎ／ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞へのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合
この例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合能力を調査した。ヒトおよびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞の作製およびＡｌｅｘａ６４７標識化Ｚ変異体でのフローサイトメトリー分析に関するこれらの細胞の使用を、記載する。

材料および方法
ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびＢ２Ｍウイルスベクターのクローニング：マウスＦｃＲｎ（ｍＦｃＲｎ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ００３７８６．１、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびマウスＢ２Ｍ（ｍＢ２Ｍ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＢＣ０８５１６４．１、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をコードする遺伝子を、実施例１において記載したヒトＦｃＲｎおよびヒトＢ２Ｍに関する遺伝子と同様の方法で増幅した。ヒトおよびマウスＦｃＲｎならびにＢ２Ｍ遺伝子を、以下のように増幅した：ｈＦｃＲｎに関して、アミノ酸１〜３６５（配列番号１０６８）をコードする配列を増幅し；ｈＢ２Ｍに関して、アミノ酸２１〜１１９（配列番号１０６６）をコードする配列を増幅し；ｍＦｃＲｎに関して、アミノ酸１〜３６９（配列番号１０６９）をコードする配列を増幅し；ｍＢ２Ｍに関して、アミノ酸２１〜１１９（配列番号１０６７）をコードする配列を増幅した。ベクターｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ７３：８７６〜８５）およびＦｃＲｎ ＰＣＲ単位複製配列（ヒトおよびマウス）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（ヒト）またはＢｃｌＩ（マウス）およびＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、それぞれ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｒ０１３６Ｍ、Ｒ０１６０ＬおよびＲ０１９８Ｌ）を使用して切り、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ０２０２Ｍ）を使用してライゲートした。ライゲーション混合物を、大腸菌ＲＲＩΔＭ１５中に化学的に形質転換し、アンピシリンプレート上で広げた。コロニーを採取し、適したプライマー対でスクリーニングした。細胞質側末端で本来のシグナルペプチド、ヒトまたはマウスＦｃＲｎおよびｅＧＦＰをコードする構築物を、配列決定によって検証し、それぞれ、ｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰと表示した。

ヒトおよびマウスＢ２Ｍ ＰＣＲ単位複製配列を、製造業者の推奨に従って、Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１１７８９０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）を使用して、組換えによってプラスミドｐＤＯＮＯＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１２５３６−０１７）中に挿入した。正確な配列の検証後、ヒトまたはマウスＢ２Ｍを、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ（上記のＴａｉら）を含有するプロモーターとともにｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１１７９１０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）を使用して、ｐ２ｋ７＿ｇｔｃ（上記のＳｕｔｅｒら）中に挿入し、それぞれ、ベクター２ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍおよび２ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｍＢ２Ｍを生じた。

ＨｅＬａ細胞のレンチウイルス形質導入：ベクター対２ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｈＢ２ＭおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰまたは２ｋ７_ｎｅｏ−ＣＭＶ−ｍＢ２ＭおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰを、塩化カルシウムトランスフェクション（上記のＺｕｆｆｅｒｅｙら；上記のＪａｋｏｂｓｓｏｎら（２００６））を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミドとともに同時トランスフェクトした。それぞれＦｃＲｎおよびＢ２Ｍ導入遺伝子とともに形成されたレンチウイルス粒子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ培養物上清を使用して、低い継代数で順次ＨｅＬａ Ｃｅｒｖｉｘ腺がん細胞（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ）に形質導入した。生じた２つの安定に形質導入されたＨｅＬａ細胞系を、以下でｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ（ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｈＢ２Ｍに関する遺伝子で形質導入された）およびｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ（マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｍＢ２Ｍに関する遺伝子で形質導入された）と表示する。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＡｌｅｘａ６４７標識化：３種のＨｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体Ｚ０７９１８、Ｚ０７９３０およびＺ０７９６０を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸サクシニミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２０１０６）で標識化した。標識化前に、緩衝液を、１０，０００ｇで回転させたＶｉｖａｓｐｉｎ５００遠心ろ過機ユニット（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃａｔ．ｎｏ．５１２−２８３８）を使用して、０．２Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ８．３に交換した。標識化を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００において行い、Ａｌｅｘａ６４７サクシニミジルエステル色素１μｌ（１．３×モル過剰に相当するＤＭＳＯにおける４０μｇ／μｌ）を２００μｇ／２５μｌ Ｚ変異体に加えた。混合物を、小刻みに揺れるｒｏｔａ ｍｉｘｅｒにおいて暗所においてＲＴで４０分間インキュベートした。その後、反応混合物を３．５時間氷上に置き、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００において１５×１００μｌ ＰＢＳで洗浄することによって、遊離の色素を除去した。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を有するヒトおよびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞の免疫蛍光染色：ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ ＨｅＬａ細胞を、トリプシン処置によって採取し、計数する前にｐＨ６．０でＰＢＳにおいて２回洗浄した。ｖ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ｃａｔ ｎｏ ２７７１４３）のウェル当たり１００，０００細胞をピペットで取り、その後プレートにおける細胞を、１，７００ｒｐｍで４℃で４分間ペレット化した。上清を除去し、細胞をＲＴで１０分間、ｐＨ６．０でのＰＢＳにおける２％ホルムアルデヒド５０μｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｆ８７７５）で固定した。その後細胞を２×１００μｌ ＰＢＳ ｐＨ６．０で洗浄し、カゼイン（ＰＢＳＣ）で飽和させ、Ａｌｅｘａ６４７標識化Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体；Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８ ６２０ｎＭを含有するＰＢＳＣプラス０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ｃａｔ ｎｏ Ａ４５１８．０１００）に再懸濁した。緩衝液単独でインキュベートした形質導入ＨｅＬａ細胞を、対照として使用した。細胞を暗所において振盪機上で８℃で１時間インキュベートし、２×１００μｌ ＰＢＳＣで洗浄し、ＰＢＳ ｐＨ６．０プラス１％ＢＳＡ １８０μｌ（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、Ｍｅｒｃｋ、ｃａｔ．ｎｏ． １．１２０１８．０１００）に再懸濁した。１０，０００細胞／ウェルを、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において分析し、データを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。

結果
フローサイトメトリー分析を利用して、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体がヒトまたはマウスＦｃＲｎ／ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞上のヒトおよび／またはマウスＦｃＲｎに結合するかどうかを決定した。実験を、Ａｌｅｘａ６４７標識化Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８（それぞれ、配列番号７１０、７１２および７０７）でｐＨ６．０で行った。ドットプロット分析（ｙ軸：Ａｌｅｘａ６４７、ｘ軸：ｅＧＦＰ）は、形質導入細胞集団が、ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の不均一な発現を示す（図３）、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性および陽性集団（図３、それぞれ、ゲートＨおよびＩ）に分けられることを示した。したがって、ゲートＩにおけるＡｌｅｘａ６４７に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、ゲートＨにおけるＡｌｅｘａ６４７のバックグラウンドＭＦＩ値によって減算した。計算されたＭＦＩ値を、図４において提示する。結果は、Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８がヒト（図４Ａ）またはマウス（図４Ｂ）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰを示すＨｅＬａ細胞に結合する能力があることを示している。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８でのＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断
この例において、ＦｃＲｎへの結合に関するＩｇＧとのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の潜在的な競合を、細胞に基づくアッセイにおいて調査した。かかる結合は、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断を生じることになる。

材料および方法
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ免疫蛍光染色のブロッキング：ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４において記載したように調製した。固定された細胞を、１００ｎＭ Ａｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたヒトまたはマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、それぞれ、ｃａｔ．ｎｏ．００９−６００−００３および０１５−６００−００３）およびＰＢＳ−カゼイン、ｐＨ６．０、プラス０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）において希釈した１０００、１００、１０、１または０（緩衝液対照）ｎＭ Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ０７９１８の混合物５０μｌに再懸濁した。細胞を、暗所において振盪機上で３７℃で１時間インキュベートし、２×１００μｌ ＰＢＳ−カゼインｐＨ６．０で洗浄し、ＰＢＳ、ｐＨ６．０、プラス１％ＢＳＡ １８０μｌに再懸濁した。１０，０００細胞／ウェル（マウス１００ｎＭ ｍＩｇＧ−Ａｌｅｘａ６４７に関していくらか少ない細胞を除いて）からのデータを、Ｇａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。

結果
実験を行って、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８（配列番号７０７）がＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するかどうかを決定した。ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ヒトまたはマウスＡｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたＩｇＧでインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識Ｚ０７９１８で遮断した。形質導入ＨｅＬａ細胞（実施例４において記載した）によるＦｃＲｎの不均一な発現により、各サンプルのゲートＮにおけるＡｌｅｘａ６４７に関するＭＦＩ値を、ゲートＭにおける相当するＭＦＩ値によって減算した（図５）。ＩｇＧ Ａｌｅｘａ６４７結合百分率を、種々のＭＦＩ値をブランク対照に関するＭＦＩで割ることによって計算した。結果は、Ｚ０７９１８が用量依存的にｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧ結合を効果的に遮断したことを示した（図６Ａ）。さらに、Ｚ０７９１８は、ｍＦｃＲｎへのｍＩｇＧ結合も遮断した（図６Ｂ）が、ｈＩｇＧ結合と比較して、効率性は低かった。

３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の薬物動態学的研究
この例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体が非特異的Ｚ変異体の血清半減期を延長する能力を、マウスにおいて行った薬物動態学的研究によって調査した。

材料および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：Ｚ変異体（Ｚ０７９１８、Ｚ０７９６０およびＺ１０１９３）のサブセットを、第２のサブクローニングにかけた。実施例３においてサブクローニングされたＨｉｓ_６−タグを付けた変異体からのＤＮＡを、鋳型として使用した。最初に、適したプライマー対を使用したＰＣＲ増幅を行って、アミノ酸ＶＤの代わりにＡＥで始まるＺ変異体をコードする遺伝子を作った。変異導入したＺ変異体を、図１において列挙し、それぞれ、変異導入したＺ０７９１８、Ｚ０７９６０およびＺ１０１９３に相当する、Ｚ１１９４８（配列番号１０６０）、Ｚ１１９４６（配列番号１０６１）およびＺ１１９４７（配列番号１０６２）と表示した。新しいＺ変異体をコードする遺伝子を制限切断し、［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＡＰ（Ｇ_４Ｓ）_４ＴＳ−［ＰＰ０１３］−ＧＴ（Ｇ_４Ｓ）_４ＰＲ−［Ｚ０３６３８］（「Ｚ＃＃＃＃＃−ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８」または「ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８と融合したＺ変異体」とも表示した）をコードする遺伝子融合物を生じる、スペーサー配列を有するアルブミン結合変異体ＰＰ０１３（配列番号１０６３）およびＺ０３６３８（配列番号１０６４）をコードする遺伝子を有するベクター中にライゲートした。陰性対照分子［Ｚ０３６３８］−ＧＡＰ（Ｇ_４Ｓ）_４ＴＳ−［ＰＰ０１３］を、Ｚ０３６３８を（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーおよびＰＰ０１３に関する配列を含有するベクター中にライゲートすることによって同様の方法でサブクローニングした。大腸菌中へのベクター形質転換に関するそれに続く工程を、実施例３におけるように行った。

培養および精製：ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８と融合したＺ変異体を、実施例３において記載したように大腸菌において作製した。各細胞ペレット約３ｇを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）で補充した３０ｍｌ ＴＳＴ−緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に再懸濁した。超音波処理による細胞破壊および遠心分離による清澄化後に、各上清を、抗ＡＢＤリガンド（内部で作製した）とともに固定化した５ｍｌアガロースを有する重力流カラム上に適用した。ＴＳＴ−緩衝液および５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ緩衝液、ｐＨ５．５での洗浄後、Ｚ変異体を、０．１Ｍ ＨＡｃで溶出した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を、１０％の最終濃度まで抗ＡＢＤアガロースアフィニティークロマトグラフィー精製工程からの溶出画分に加え、サンプルを、ＲＰＣ溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１０％ＡＣＮ、９０％水）で前もって平衡化した、３ｍｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。ＲＰＣ溶媒Ａでのカラム洗浄後、結合したタンパク質を、６０ｍｌ中に直線勾配０〜５０％ＲＰＣ溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮ、２０％水）で溶出した。純粋なＺ変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。ＲＰＣ精製後、プールの緩衝液を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに交換した。最後に、Ｚ変異体を、１ｍｌ ＥｎｄｏＴｒａｐ ｒｅｄカラム（Ｈｙｇｌｏｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３２１０６３）上で精製して、低いエンドトキシン含有量を保証した。

各精製Ｚ変異体のタンパク質濃度、純度および同一性を、実施例３において記載したように分析した。

Ｂｉａｃｏｒｅ分析：ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合した、発現され、精製されたＺ変異体を、本質的に実施例３において動態解析に関して記載したように、ｐＨ６．０でヒトＦｃＲｎに対してアッセイした。Ｚ変異体および陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３を、１分間の間に４０ｎＭ、１６０ｎＭおよび６４０ｎＭで注入し、その後２．５分間解離させ、１分間平衡化した。速度定数および親和性を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｚ変異体に関して決定した。

薬物動態学的研究：ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合したＺ１１９４７、Ｚ１１９４６およびＺ１１９４８を、９２ｎｍｏｌ／体重ｋｇの用量で雄性ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、 Ｇｅｒｍａｎｙ）に静脈内に（ｉ．ｖ．）に投与した。３匹のマウスの群からの血清を、０．０８、６、１８、７８、１２０、１６８および２４０時間で得た。それぞれのＺ変異体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。

ＥＬＩＳＡ：ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）において４μｇ／ｍｌに希釈したＺ特異的ヤギ抗体（内部で作製した）５０μｌ／ウェルで４℃で終夜コーティングした。抗体溶液を捨て、ウェルをＰＢＳＣ １００μｌでＲＴで１．５時間ブロッキングした。血清を、希釈プレートにおいて２倍希釈系列で１：１００から１：５１，２００にＰＢＳＣプラス１％マウス血清（マトリックス）において希釈した。マトリックスにおいて希釈したそれぞれのＺ変異体および４つの質対照（非常に低い、低い、中間および高い対照）に関する標準的な滴定を、各プレート上に含んだ。希釈物５０μｌをウェル毎に移し、ＥＬＩＳＡプレートをＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＺ変異体を、ＰＢＳＣにおいて４μｇ／ｍｌに希釈したウサギ抗ＰＰ０１３ Ｉｇ ５０μｌ／ウェル（内部で作製した）で検出した。その後、プレートをＲＴで１．５時間インキュベートし、その後上記のように洗浄した。ＰＢＳＣにおいて１：２０，０００に希釈した、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得たＨＲＰをコンジュゲートしたロバ抗ウサギＨＲＰ（ｃａｔ．ｎｏ．７１１−０３５−１５２）を加え、プレートを１時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質５０μｌをウェルに加え、プレートを、製造業者の推奨に従って、展開した。１５分間の展開の後、吸光度を、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ^３）を使用して、４５０ｎｍで測定した。吸光度値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用して分析して、濃度（三次スプラインカーブフィット）および曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。次いで、濃度を、時間に対するそれらの自然対数としてプロットした。生じた曲線は、２つの区画モデルに従い、終末相半減期を、最後３つの時点に基づく勾配によって分けたｌｎ２として計算した。

結果
培養および精製：Ｚ＃＃＃＃＃−ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８、および陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３として構築された、３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ１１９４７、Ｚ１１９４６およびＺ１１９４８（配列番号１０６２、１０６１および１０６０）を、大腸菌において作製した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約３ｇの細菌のペレットからの精製タンパク質の量は、種々のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関して約１０から２５ｍｇの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、それらが、それぞれのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な分子量を、ＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。

Ｂｉａｃｏｒｅ分析：ＦｃＲｎへの結合を、３種のＰＰ０１３−Ｚ０３６３８融合Ｚ変異体に関して分析した。表面の固定化レベルは、ヒトＦｃＲｎの５４８ＲＵであった。生じた大まかな速度定数およびｐＨ６．０での標的結合に関する親和性を、表６に示す。近似曲線を、図７Ａ〜Ｃに示す。陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３は、ＦｃＲｎに対して陰性であった。

薬物動態学的研究：ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合したＺ変異体の上記の構築物の薬物動態学的プロファイルを、マウス薬物動態学的研究における陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３と比較した。例えばＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０１６０４３において報告されているように、以前の研究において、ＡＢＤ融合タンパク質は、血清アルブミンへのＡＢＤ結合によって引き起こされる、血清における長い半減期を有することが示されている。以前の結果と一致して、ＡＢＤ−融合Ｚ変異体分子（Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３）の終末相半減期は、約４３時間であったが、これはマウスアルブミンの半減期（３５時間）に匹敵する。ＡＢＤに加えてＦｃＲｎ結合Ｚ変異体分子を含有する構築物の終末相半減期は、２から３倍長かった（図８）。計算された終末相半減期は、９９時間（Ｚ１１９４７）、６９時間（Ｚ１１９４６）および５８時間（Ｚ１１９４８）であり、これは、Ｚ変異体のＦｃＲｎ結合が延長された半減期の一因となったことを示している。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の成熟ライブラリーの設計および構築
この実施例において、成熟したライブラリーを構築した。ライブラリーを、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の選択のために使用した。成熟したライブラリーからの選択は、増加した親和性を有する結合剤を生じることが通常予想される（Ｏｒｌｏｖａら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（８）：４３３９〜４８）。この研究において、ランダム化された一本鎖リンカーを、合成における望ましい位置における定義されたコドンの組込みを可能にするスプリットプール合成を使用して、産出した。

材料および方法
ライブラリー設計：ライブラリーは、表１における、実施例２〜６においてさらに記載したヒトＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の１６種の配列に基づいた。新しいライブラリーにおいて、Ｚ分子骨格における１３個の可変位置は、配列番号７０７〜７２２において定義されたＺ変異体の結合モチーフに主に基づいた戦略に従って、いくつかのアミノ酸残基に向かって偏っていた。ＤＮＡリンカーを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）から注文した、制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩが隣接したアミノ酸配列：５’−ＡＡ
ＡＴＡ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＧＣＣ
ＡＡＡ ＧＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＧ ＡＴＣ
ＮＮＮ ＮＮＮ ＴＴＡ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＣＣ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＡ
ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＮＮＮ ＡＡＡ ＴＴＡ ＮＮＮ ＧＡＴ
ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＴＴ Ａ−３’（配列番号１０７４；ランダム化されたコドンを、ＮＮＮとして例示する）の１４７ｂｐの部分的にランダム化されたヘリックス１および２を含有するスプリットプール合成を使用して産出した。Ｚ分子骨格における８つの可変のアミノ酸位置（９、１０、１１、１３、１４、２４、３２および３５）および５つの定常アミノ酸位置（１７、１８、２５、２７および２８）を含む新しいライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論上の分布を、表７に示す。生じた理論上のライブラリーサイズは、５．３×１０^８変異体である。

ライブラリー構築：ライブラリーを、１２サイクルのＰＣＲ中にＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ．ｎｏ．４３１１８１６）を使用して増幅し、プールされた産物を、供給業者の推奨に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．ｎｏ．２８１０６）で精製した。ランダム化されたライブラリー断片の精製プールを、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｒ０１４６Ｌ、およびｃａｔ．ｎｏ．Ｒ３１５６Ｍ）で消化し、ＰＣＲ精製キットを使用して、濃縮した。その後
、産物を、調製用２．５％アガロース（Ｎｕｉｓｉｅｖｅ ＧＴＣ アガロース、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル電気泳動に供し、供給業者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ．ｎｏ．２８７０６）を使用して精製した。

ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２を（本質的に上記のＧｒｏｎｗａｌｌらにおいて報告されたｐＡｆｆｉ１のように）、同じ酵素で制限し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を使用して精製した。制限された断片および制限されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ｃａｔ．ｎｏ．ＥＬ００１１）でＲＴで２時間、５：１のモル比でライゲートし、その後４℃で終夜インキュベートした。ライゲートしたＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって回収し、その後１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５に溶解した。したがって、それぞれがアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に融合している、ベクターｐＡＹ０２５９２がコードしたＺ変異体において生じたライブラリーは、連鎖球菌のプロテインＧに由来した。

ライゲーション反応物（約１６０ｎｇ ＤＮＡ／形質転換）を、エレクトロコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８細胞（５０μｌ、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）中に電気穿孔した。電気穿孔後すぐに、回復培地約１ｍｌ（ＥＲ２７３８細胞で補充した）を加えた。形質転換細胞を、３７℃で６０分間インキュベートした。サンプルを、滴定のためおよび形質転換体の数の決定のために採取した。その後、細胞をプールし、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充した、ＴＳＢ−ＹＥ培地１ｌにおいて、３７℃で終夜培養した。細胞を、４，０００ｇで７分間ペレット化し、ＰＢＳ／グリセリン溶液（約４０％グリセリン）に再懸濁した。細胞をアリコートし、−８０℃で保管した。Ｚ変異体のライブラリーからのクローンを、内容を検証するためおよびライブラリー設計に対して構築されたライブラリーの成果を評価するために配列決定した。配列決定を、実施例１において記載したように行い、アミノ酸分布を検証した。

ファージストックの調製：ファージミドライブラリーを含有するファージストックを、２０ｌ発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ）において調製した。ファージミドライブラリーを含有するグリセリンストックからの細胞を、１ｇ／ｌグルコース、１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンで補充したＴＳＢ−ＹＥ １０ｌ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ；３０ｇ／ｌ ＴＳＢ、５ｇ／ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）に接種した。細胞が６００ｎｍでの０．６の光学濃度（ＯＤ６００）に達したとき、培養物約１．５ｌを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージの５×モル過剰を使用して感染させた。細胞を、３０分間インキュベートし、それからすぐ発酵槽を、複合発酵培地［２．５ｇ／ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；５．０ｇ／ｌ酵母抽出物；３０ｇ／ｌトリプトン、２ｇ／ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４；３ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２５ｇ／ｌ；Ｎａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ；Ｂｒｅｏｘ ＦＭＴ３０消泡剤０．１ｍｌ／ｌ］で１０ｌまで満たした。以下の構成要素を加えた：１０ｍｌカルベニシリン２５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｌカナマイシン５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｌ １Ｍイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；３００ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４ １７．５ｍｌ／ｌ、および微量元素溶液５ｍｌ［１．２Ｍ ＨＣｌに溶解した、３５ｇ／ｌ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ；１０．５６ｇ／ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；２．６４ｇ／ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；１３．２ｇ／ｌ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；１３．８４ｇ／ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ］。グルコース制限流加培養を開始し、６００ｇ／ｌグルコース溶液を反応器に供給した（開始時に３．５ｇ／時間、２０時間後および培養の終わりまで３７．５ｇ／時間）。ｐＨを、２５％ＮＨ_４ＯＨの自動添加を通してｐＨ７で調節し、空気を補充し（５ｌ／分）、撹拌機を５００ｒｐｍに設定した。２４時間の流加培養後、ＯＤ６００は、３３．２であった。培養物における細胞を、１５，９００ｇでの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子を、実施例２におけるように、ＰＥＧ／ＮａＣｌにおいて２回上清から沈澱させ、ろ過し、ＰＢＳおよびグリセリンに溶解した。ファージストックを、選択における使用まで−８０℃で保管した。

結果
ライブラリー構築：新しいライブラリーを、検証された結合特性を有する１６種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（実施例２〜６）のセットに基づいて設計した。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、５．３×１０^８Ｚ変異体であった。大腸菌ＥＲ２７３８細胞への形質転換後の滴定によって決定された、ライブラリーの実際のサイズは、４．５×１０^９形質転換体であった。

ライブラリー品質を、９６形質転換体の配列決定によっておよびそれらの実際の配列を理論上の設計と比較することによって試験した。設計されたライブラリーと比較した、実際のライブラリーの内容は、申し分のないものであることが示された。したがって、ＦｃＲｎへの潜在的な結合剤の成熟したライブラリーは、成功的に構築された。

成熟したライブラリーからのＺ変異体の選択およびスクリーニング
材料および方法
成熟したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：標的タンパク質ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ｏｒｂ８４３８８）およびマウスＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｃａｔ．ｎｏ．ｏｒｂ９９０７６）を、１０×モル過剰でビオチンを使用して、本質的に実施例２において記載したように、ビオチン化した。実施例７において記載したＺ変異体分子の新しいライブラリーを使用して、ファージディスプレイ選択を、本質的に実施例２においてのように、しかし以下の例外を伴って、ヒトＦｃＲｎまたはマウスＦｃＲｎに対する４つのサイクルで行った。選択緩衝液は、それぞれ、０．１％ＰＣＴＧ緩衝液、ｐＨ５．５（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ゼラチンで補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．５）または０．１％ＰＣＴＧ緩衝液、ｐＨ７．４、（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ゼラチンで補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）であった。選択に先立って、ＨＳＡを、１．５μＭの最終濃度まで選択緩衝液に加えた。選択において使用する全てのチューブおよびビーズを、２つの異なる選択緩衝液のどちらかで前もってブロッキングした。ＳＡ−ビーズでの４５分間のファージストックのインキュベーションによる事前選択工程を、サイクル１において行った。ファージ−標的複合体の捕捉のために、１．１μｇビオチン化ヒトＦｃＲｎまたは１．６μｇビオチン化マウスＦｃＲｎ当たり１ｍｇビーズを使用した。洗浄を、表７において概要を述べたように、それぞれ、２５ｎＭ ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または１０ｎＭ ＩｇＧで補充した０．１％ＰＣＴを使用したトラック２−１−２−１および２−１−２−２を除いて、０．１％ＰＣＴ緩衝液ｐＨ５．５またはｐＨ７．４で行った。

サイクル１における５個のトラック（１〜５）を、第２から第４のサイクルで分け、全体でサイクル２における７個のトラック（１−１から５−１）、サイクル３における１１個のトラック（１−１−１から５−１−１）およびサイクル４における１４個のトラック（１−１−１−１から５−１−１−１）を生じた。結合したファージ粒子を、実施例２において記載したように溶出した。

低下した標的濃度および増加した数の洗浄を使用した、それに続くサイクルにおける増加したストリンジェンシーを記載した、選択戦略の概要を、表８に示す。

ファージ粒子の増幅：選択サイクル１と２の間のファージ粒子の増幅を、以下の例外を伴って、本質的に実施例２において記載したように行った。大腸菌ＥＲ２７３８をファージ増幅に使用し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、５×過剰で使用した。選択サイクル２と４の間のファージ粒子の増幅を、以下のように、溶液において細菌の感染を行うことによって行った。ファージ粒子での対数期大腸菌ＥＲ２７３８の感染後、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充したＴＳＢを加え、その後回転させながら３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細菌を、５×過剰でＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させた。感染した細菌を、遠心分離によってペレット化し、１００μＭ ＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充したＴＳＢ−ＹＥ培地に再懸濁し、３０℃で終夜増殖させた。終夜培養物を、遠心機においてペレット化し、上清におけるファージ粒子を、ＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液で２回沈澱させた。最後に、次の選択サイクルに入る前に、ファージ粒子を選択緩衝液に再懸濁した。

最終選択サイクルにおいて、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて使用する単一のコロニーを形成するために、０．２ｇ／ｌアンピシリンで補充したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース血液寒天ベース、Ｏｘｏｉｄ ｃａｔ．ｎｏ．ＣＭＯ２３３Ｂ）上に広げる前に、対数期細菌を溶出液に感染させ、希釈した。

潜在的な結合剤の配列決定：種々の選択トラックからの個々のクローンを、配列決定のために採取した。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて走らせた全てのクローンを配列決定した。遺伝子断片の増幅および遺伝子断片の配列分析を、本質的に実施例２において記載したように行った。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｚ変異体（実施例２において記載したＺ変異体ＡＢＤ融合タンパク質として発現される）を含有する単一のコロニーを、ＦｃＲｎ成熟したライブラリーの選択されたクローンからランダムに採取し、本質的に実施例２において記載したように、１ｍｌ培養物において増殖させた。ペリプラズム上清の調製を、８つの凍結解凍サイクルで実施例２におけるように行い、ペリプラズム画分を、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて無希釈で使用した。ＥＬＩＳＡスクリーニングを、各ウェルにおいて２ｎＭの濃度でビオチン化ヒトＦｃＲｎを使用して、本質的に実施例２において記載したようにｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方で行った。主要なＦｃＲｎ結合剤Ｚ１０１９３（配列番号７０８；上記の実験においてアッセイした）のペリプラズム画分を、陽性対照として使用した。ＡＢＤ部分のみを含有するペリプラズムを、陰性対照として使用した。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ分析：ＦｃＲｎ結合剤の選択を、上記のようにｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方でＥＬＩＳＡを使用して、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの希釈系列に対する応答の分析に供した。ビオチン化ヒトＦｃＲｎを、３０ｎＭの濃度で加え、１４ｐＭまで段階的に１：３希釈した。バックグラウンド対照として、全てのＺ変異体も、標的タンパク質を加えずにアッセイした。主要なＦｃＲｎ結合剤Ｚ０７９１８（配列番号７０７）を含有するペリプラズムサンプルを含み、陽性対照として分析した。ＡＢＤ部分のみを含有するペリプラズムを、陰性対照として使用した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用して分析し、非線形回帰およびＫ_Ｄ値（最大半量有効濃度）を計算した。

結果
成熟したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：選択を、それぞれ４つのサイクルを含有する全体で１４個の類似したトラックにおいて行った。種々の選択トラックは、標的濃度、標的型（ヒトＦｃＲｎまたはマウスＦｃＲｎ）、選択時間、および洗浄条件が異なった。

潜在的な結合剤の配列決定：ランダムに採取したクローンを、配列決定した。各個々のＺ変異体に、実施例２において記載したように、同定番号、Ｚ＃＃＃＃＃を与えた。全体で、４４５種の新しいユニークなＺ変異体分子を同定した。

５８アミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、図１において配列番号７２３〜１０５８として配列表に一覧表にした。これらのＺ変異体の推定されるＦｃＲｎ結合モチーフを、図１において配列番号１７〜３５２として配列表に列挙した。これらのＺ変異体のそれぞれ内で完全な３ヘリックス束を構築することが予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、図１において配列番号３７０〜７０５として配列表に列挙した。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：４つの選択サイクル後に得たクローンを、９６ウェルプレートにおいて作製し、ＥＬＩＳＡを使用して、ＦｃＲｎ結合活性をスクリーニングした。全てのランダムに採取したクローンを分析した。ｐＨ６．０で、４４５種のユニークなＺ変異体のうちの３３３種が、２ｎＭの濃度でヒトＦｃＲｎに対して０．３ＡＵ以上の応答（少なくとも３×陰性対照に相当する）を示すことが見出された。ｐＨ７．４で、４４５種のユニークなＺ変異体のうちの２７８種が、２ｎＭの濃度でヒトＦｃＲｎに対して０．３ＡＵ以上の応答（少なくとも３×陰性対照に相当する）を示すことが見出された。ヒトＦｃＲｎに対して陽性シグナルを有するクローンが、１−１−１−１を除く全てのトラック（マウス標的でのものを含めた）において見出された。陰性対照は、それぞれ、０．０７０〜０．０９６ＡＵ（ｐＨ６．０）および０．０６０〜０．１１２ＡＵ（ｐＨ７．４）の吸光度を有した。ブランク対照の平均応答は、０．０７０ＡＵ（ｐＨ６．０）および０．０６２（ｐＨ７．４）であった。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ Ｋ_Ｄ分析：Ｚ変異体のサブセットを、上記のＥＬＩＳＡ実験における結果（ｐＨ６．０および／またはｐＨ７．４での最も高いＥＬＩＳＡ値）に基づいて選択し、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける標的滴定に供した。ペリプラズムサンプルを、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの連続希釈でインキュベートした。主要な結合剤Ｚ０７９１８（配列番号７０７）を有するペリプラズムサンプルも、陽性対照としてアッセイした。取得した値を分析し、それらのそれぞれのＫ_Ｄ値を計算した（表９）。

成熟したライブラリーからのＺ変異体の作製および特徴付け
この実施例において、１２種のＺ変異体を、大腸菌において作製し、精製し、ＦｃＲｎへの結合に関しておよびＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の阻害に関してアッセイした。

材料および方法
発現ベクター中へのＺ変異体のサブクローニング：１２種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（Ｚ１３５７７（配列番号７２５）、Ｚ１３５７８（配列番号７２６）、Ｚ１３５８３（配列番号７２９）、Ｚ１３５９２（配列番号７３４）、Ｚ１３６１６（配列番号７４７）、Ｚ１３６２１（配列番号７５０）、Ｚ１３６５４（配列番号７７１）、Ｚ１３６６３（配列番号７７６）、Ｚ１３６６９（配列番号７７９）、Ｚ１３６７４（配列番号７８１）、Ｚ１３６７５（配列番号７８２）およびＺ１３６７６（配列番号７８３））のＤＮＡを、ライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。サブクローニングを、実施例３において記載したように行った。Ｚ遺伝子断片を、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを生じる発現ベクターｐＡＹ０１４４８中にサブクローニングした。

Ｚ変異体の作製：Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体の培養および精製を、本質的に実施例３において記載したように行った。

Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：ヒトＦｃＲｎとのＦｃＲｎ結合Ｈｉｓ_６−タグを付けたＺ変異体の相互作用を、本質的に実施例３において記載したようにＢｉａｃｏｒｅ２０００機器において分析した。Ｂｉｏｒｂｙｔ（ｃａｔ．ｎｏ．ｏｒｂ８４３８８）から購入したヒトＦｃＲｎを、標的タンパク質として使用した。分析物を、３０μｌ／分で２分間注入した。解離フェーズは４分であり、分析物注入間の平衡化時間は、３０分であった。

一実験において、Ｚ変異体を、同時注入手順を使用して、ｐＨ６．０で注入し、その後、それぞれ、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４の緩衝液において解離させた。Ｚ変異体の濃度は、１００ｎＭであった。

別の実験において、近似の速度定数（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）および親和性（Ｋ_Ｄ）を、Ｚ変異体のサブセットに関して決定した。注入した濃度は、５４０ｎＭ、１８０ｎＭ、６０ｎＭ、２０ｎＭおよび６．７ｎＭであった。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：Ｚ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する潜在力を、実施例３において記載したＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。

結果
Ｚ変異体の作製：Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグとともに構築された１２種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、大腸菌において作製した。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらが、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な同一性および分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。

Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：ヒトＦｃＲｎへの１２種のＺ変異体の結合および異なるｐＨでの解離を、ＦｃＲｎを含有するチップ表面上にｐＨ６．０でのＺ変異体のそれぞれおよび緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４を順次注入することによって、Ｂｉａｃｏｒｅ機器において試験した。表面のリガンド固定化レベルは、８９０ＲＵヒトＦｃＲｎであった。１２種のＺ変異体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を示し、全ての変異体に関して、より速いオフ速度が、ｐＨ６．０と比較して、ｐＨ７．４で見られた。

ｐＨ６．０でＦｃＲｎと相互作用するＺ変異体Ｚ１３５７７（配列番号７２５）およびＺ１３６２１（配列番号７５０）の速度定数を決定した（表１０参照）。速度定数を、それぞれ、Ｚ１３５７７およびＺ１３６２１の２つまたは４つの注入した濃度の曲線セットを使用して、計算した。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断分析：１２種の成熟したＨｉｓ_６−タグを付けた単量体のＺ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を阻害する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイにおいて試験した。Ｚ変異体の連続希釈物を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎでインキュベートし、各それぞれの変異体の遮断能力を、ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズおよびその後ストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズの添加後に測定した。阻害は、陽性Ｚ変異体に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントの減少として測定される。１２種の全ての試験したＺ変異体は、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが示され、計算されたＩＣ５０値を、表１１に示した。

ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断能力の比較
この例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ_６−Ｚ０７９１８（配列番号７０７）のＩｇＧ遮断能力を、いくつかの自己免疫障害の処置において現在使用されている静脈免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）および皮下免疫グロブリン（ＳＣＩｇ）と比較した。

材料および方法
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ免疫蛍光染色のブロッキング：ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４において記載したように調製した。固定された細胞を、それぞれ、５０ｎＭ Ａｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．００９−６００−００３）およびＨｉｓ_６−タグを付けたＺ０７９１８、ＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）またはＳＣＩｇ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の混合物５０μｌに再懸濁し、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０、プラス２．５％ＦＣＳ（Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）において１０００、１００、１０、１、０．１または０（緩衝液対照）ｎＭの濃度で希釈した。細胞を、暗所において３７℃で１時間インキュベートし、２×１００μｌ ＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０、プラス２．５％ＦＣＳ（Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ）ｐＨ６．０で洗浄し、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０、プラス１％ＢＳＡ １８０μｌに再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析した。

結果
実験を行って、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ_６−Ｚ０７９１８（配列番号７０７）が、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するかどうかを決定し、ＩＶＩｇおよびＳＣＩｇと遮断効果を比較した。ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ヒトＡｌｅｘａ６４７をコンジュゲートしたＩｇＧでインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識Ｈｉｓ_６−Ｚ０７９１８、ＩＶＩｇまたはＳＣＩｇで遮断した。結果は、Ｈｉｓ_６−Ｚ０７９１８が、ＩＶＩｇまたはＳＣＩｇと同程度までｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧ結合を効果的に遮断したことを示した（図９）。

マウスにおけるＦｃＲｎ結合Ｚ変異体による増加したＩｇＧ異化
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８がＦｃＲｎへのＩｇＧ結合をｉｎ ｖｉｔｒｏで遮断する能力が、実施例１０において示された。この例において、同じＺ変異体の遮断能力を、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断は、増加したＩｇＧ異化および随伴するＩｇＧの減少したレベルにつながることになる（上記のＭｅｚｏ２００８）。

材料および方法
動物試験：ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ１１９４８（配列番号１０６０）およびＺ０７９１８−ＰＰ０１３（ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１０６３）と融合した、Ｚ１１９４８と同一であるが、アミノ酸ＡＥの代わりにＶＤで始まるＮ末端を有するＺ０７９１８（配列番号７０７））またはビヒクル（ＰＢＳ緩衝液）を、１６．３μｍｏｌ／ｋｇの用量で雄性ＮＭＲＩ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に投与した。マウスを、０、２４、４８、７２および９６時間で与えた５つの静脈内注入で処置した。血清サンプルを、０、７２、１２０および１６８時間（試験の終結）で採取し、−２０℃で保管した。血清におけるマウスＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。

マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ：マウス血清サンプルにおけるマウスＩｇＧの濃度を、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（Ｍａｂｔｅｃｈ ３８２５−１ＡＤ−６）を、製造業者によって報告されているように行うことにより、分析した。ｍＩｇＧの濃度を、非線形回帰式を使用して、提供された標準曲線およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５から計算した。２４、７２、１２０および１６８時間での個々のマウスにおけるＩｇＧの濃度は、０時間でのレベルと関連があり、したがって、結果を、ＩｇＧ（０時間）の百分率として提示した。

結果
結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体で処置したマウスにおけるマウスＩｇＧ濃度の減少を示した。Ｚ１１９４８とＡＢＤ−融合変異体Ｚ０７９１８−ＰＰ０１３の両方が、マウスにおける内在性ＩｇＧの濃度をｉｎ ｖｉｖｏで低下させた。最も顕著な効果は、ＡＢＤ−融合変異体で１２０時間後に得られた。したがって、結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体が、ＩｇＧの再利用を遮断し、マウスにおける増加したＩｇＧ異化およびそれに続くＩｇＧの低いレベルを生じたことを示している。

ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスサイトーシス
この例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで上皮または内皮細胞を通して輸送されるまたはＦｃＲｎによって再利用されるそれらの能力に関して試験した。トランスサイトーシスの力を有するＺ変異体を含有する薬物は、例えば経口または肺投与後に、薬物取込みを促進することになる。

材料および方法
ＦｃＲｎの内在性または組換え発現を有するかまたは有さない細胞、例えばＴ８４、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＣａＣｏ２、ＣａＬｕ−１および／またはＣａＬｕ−３細胞を、トランスウェルにおける膜上のそれぞれの増殖培地において増殖させて、単層を形成した。単層の完全性は、電気抵抗を測定することまたは細胞単層上で透過することができないまたは活発に輸送されることができないプローブを加えることによって評価することができる。細胞の定義された単層を、適したｐＨおよび温度でのＨＢＳＳ（ハンクス液、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｈ９２６９）または増殖培地のような緩衝液におけるＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドを有する頂端または側底側からパルスし、反対側上で適したｐＨおよび温度でのＨＢＳＳまたは増殖培地のような緩衝液で追跡した。

このアッセイの変異体において、リガンドを、投与と同じ側上で適したｐＨおよび温度で、ＨＢＳＳまたは増殖培地のような緩衝液で追跡して、再利用されたリガンドも測定することができる。これを、トランスウェルにおいてまたは細胞培養皿において行うことができる。細胞を、トランスウェルまたは細胞培養皿中に播種し、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドでパルスした。飲食されたリガンドは、ＦｃＲｎに結合し、それらが充填されたのと同じまたは反対側の細胞表面に戻ることになる。パルス後、遊離のリガンドを、冷たい緩衝液で細胞を洗浄することによって除去した。リガンドを追跡するために、温かい緩衝液または培地を細胞に加え、１０分から数時間の範囲にわたる期間後、緩衝液または培地を除去し、リガンドの存在に関してアッセイした。

このアッセイの変異体において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドを使用して、他のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドによるＦｃＲｎへの結合を、それらを細胞に同時または順次投与することによって、遮断することができた。

リガンドの量は、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ−ＭＳ、蛍光色素または放射標識のような方法によって、定量化することができた。

上記の実験の結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで経細胞輸送され得かつ／または再利用され得ることを示すことが予想された。

実施形態を項目にした一覧
１．ＦｃＲｎ結合モチーフＢＭを含む、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドであって、該モチーフが、アミノ酸配列
ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；かつ
Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される］
からなる、前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２．互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄであり；
Ｘ_２１は、Ｖであり；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；かつ
Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される、
項目１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３．ＢＭが、
ｉ） ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６ＨＥＩＲ ＷＬＰＮＬＴＸ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５ＫＬＸ_２８Ｄ
［配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される］
および
ｉｉ） ｉ）によって定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる、項目１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４．Ｘ_２が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される、項目１〜３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５．Ｘ_２が、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される、項目４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６．Ｘ_２が、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＶおよびＷから選択される、項目５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７．Ｘ_２が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される、項目５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８．Ｘ_２が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択される、項目７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９．Ｘ_２が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＶおよびＷから選択される、項目６または８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０．Ｘ_２が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、ＶおよびＷから選択される、項目９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１．Ｘ_２が、Ａ、Ｉ、ＬおよびＱから選択される、項目１０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２．Ｘ_２が、Ｉ、ＬおよびＱから選択される、項目１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３．Ｘ_２が、ＩおよびＱから選択される、項目１２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４．Ｘ_２が、Ｉである、項目１３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５．Ｘ_２が、Ｑである、項目１３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される、項目１または３〜１５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。１７．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される、項目２または１６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１８．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される、項目１６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１９．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目１８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２０．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目１９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。

２１．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目１９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２２．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＱおよびＴから選択される、項目２１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２３．Ｘ_３が、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＱおよびＴから選択される、項目２２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２４．Ｘ_３が、Ｄ、ＥおよびＴから選択される、項目２３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２５．Ｘ_３が、ＤおよびＥから選択される、項目２４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２６．Ｘ_３が、Ｄである、項目２５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２７．Ｘ_３が、Ｅである、項目２５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
２８．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択される、項目１または３〜２７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。２９．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択される、項目２８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３０．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択される、項目２または２８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３１．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される、項目３０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３２．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目３１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３３．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｉ、Ｋ、ＱおよびＳから選択される、項目３２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３４．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＳから選択される、項目３２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３５．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、ＫおよびＳから選択される、項目３３または３４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３６．Ｘ_４が、Ａ、Ｄ、ＥおよびＫから選択される、項目３４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３７．Ｘ_４が、Ａ、ＤおよびＫから選択される、項目３５または３６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３８．Ｘ_４が、ＡおよびＤから選択される、項目３７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
３９．Ｘ_４が、ＡおよびＥから選択される、項目３６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４０．Ｘ_４が、Ａである、項目３８または３９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４１．Ｘ_４が、Ｄである、項目３８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４２．Ｘ_４が、Ｅである、項目３９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４３．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択される、項目１または４〜４２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４４．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択される、項目３または４３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４５．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、Ｋ、ＲおよびＳから選択される、項目２または４４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４６．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＶから選択される、項目４４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４７．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、ＫおよびＶから選択される、項目４６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４８．Ｘ_６が、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択される、項目４５または４６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
４９．Ｘ_６が、Ａ、ＧおよびＫから選択される、項目４７または４８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５０．Ｘ_６が、Ａ、ＧおよびＶから選択される、項目４７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５１．Ｘ_６が、ＡおよびＧから選択される、項目４９または５０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５２．Ｘ_６が、Ａである、項目５１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５３．Ｘ_６が、Ｇである、項目５１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５４．Ｘ_７が、ＡおよびＨから選択される、項目１、２または４〜５３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５５．Ｘ_７が、Ｈである、項目５４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５６．Ｘ_１６が、Ｔである、項目１、２または４〜５５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５７．Ｘ_１６が、Ｎである、項目１、２または４〜５５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５８．Ｘ_１７が、ＦおよびＹから選択される、項目１または３〜５７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
５９．Ｘ_１７が、Ｆである、項目１〜５８のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６０．Ｘ_１８が、Ａ、ＤおよびＥから選択される、項目１または３〜５９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６１．Ｘ_１８が、ＡおよびＤから選択される、項目６０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６２．Ｘ_１８が、Ｄである、項目６１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６３．Ｘ_２１が、ＶおよびＷから選択される、項目１または３〜６２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６４．Ｘ_２１が、Ｖである、項目６３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６５．Ｘ_２５が、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される、項目１または４〜６４のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６６．Ｘ_２５が、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される、項目６５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６７．Ｘ_２５が、Ｈ、Ｌ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される、項目２、３または６６のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６８．Ｘ_２５が、Ｈ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される、項目６７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
６９．Ｘ_２５が、Ｈ、ＲおよびＶから選択される、項目６８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７０．Ｘ_２５が、Ｈ、ＬおよびＲから選択される、項目６７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７１．Ｘ_２５が、ＨおよびＲから選択される、項目６９または７０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７２．Ｘ_２５が、ＨおよびＶから選択される、項目６９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７３．Ｘ_２５が、Ｈである、項目７１または７２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７４．Ｘ_２６が、Ｋである、項目１、２または４〜７３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７５．Ｘ_２６が、Ｓである、項目１、２または４〜７３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７６．Ｘ_２８が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される、項目１および３〜７５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７７．Ｘ_２８が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される、項目７６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７８．Ｘ_２８が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される、項目７７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
７９．Ｘ_２８が、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＷから選択される、項目２または７７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８０．Ｘ_２８が、Ａ、ＤおよびＲから選択される、項目７８または７９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８１．Ｘ_２８が、ＡおよびＲから選択される、項目８０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８２．Ｘ_２８が、ＤおよびＲから選択される、項目８０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８３．Ｘ_２８が、Ａである、項目８１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８４．Ｘ_２８が、Ｒである、項目８１または８２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８５．Ｘ_２８が、Ｄである、項目８２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８６．Ｘ_２９が、Ｄである、項目１、２または４〜８５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８７．Ｘ_２９が、Ｒである、項目１、２または４〜８５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８８．Ｘ_６Ｘ_７が、ＡＨおよびＧＨから選択される、項目１、２または４〜８７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
８９．Ｘ_６Ｘ_７が、ＡＨである、項目８８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９０．Ｘ_６Ｘ_７が、ＧＨである、項目８８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９１．Ｘ_１７Ｘ_１８が、ＦＤおよびＹＤから選択される、項目１〜９０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９２．Ｘ_１７Ｘ_１８が、ＦＤである、項目９１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９３．配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩ：
Ｉ． Ｘ_６が、特にＡのような、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択されること；
ＩＩ． Ｘ_７が、Ｈであること；
ＩＩＩ． Ｘ_１７が、特にＦのような、ＦおよびＹから選択されること；
ＩＶ． Ｘ_１８が、Ｄであること；
Ｖ． Ｘ_２１が、特にＶのような、ＶおよびＷから選択されること；
ＶＩ． Ｘ_２５が、特にＨのような、ＨおよびＲから選択されること
の少なくとも３つを満たす、項目１〜９２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９４．配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも４つを満たす、項目９３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９５．配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも５つを満たす、項目９４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９６．配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの全てを満たす、項目９５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９７．配列が、配列番号１〜３５３からなる群から選択される、項目１〜９６のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９８．配列が、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群から選択される、項目９７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
９９．配列が、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群から選択される、項目９８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１００．配列が、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される、項目９９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０１．配列が、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群から選択される、項目９８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０２．配列が、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される、項目１００または１０１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０３．配列が、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群から選択される、項目１０２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０４．配列が、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される、項目１０３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０５．配列が、配列番号１である、項目１０４に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０６．前記ＦｃＲｎ結合モチーフが、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する、項目１〜１０５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０７．前記ＦｃＲｎ結合モチーフが、前記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内に、相互接続ループを有する２つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目１０６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０８．前記３ヘリックス束タンパク質ドメインが、細菌の受容体ドメインから選択される、項目１０７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１０９．前記３ヘリックス束タンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡまたはその誘導体のドメインから選択される、項目１０８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１０．ｉｉｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ Ｘ_ｄＸ_ｅＸ_ｆＱ；
［配列中、
［ＢＭ］は、ここで定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ただしＸ_２９は、Ｄであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_ｅは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_ｆは、ＡおよびＳから選択される］
および
ｉｖ） ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１１．ｖ） Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ Ｘ_ｄＸ_ｅＸ_ｆＱ；
［配列中、
［ＢＭ］は、ここで定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ただしＸ_２９は、Ｒであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_ｅは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_ｆは、ＡおよびＳから選択される］
および
ｖｉ） ｖ）によって定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１２．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ａが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１３．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ａが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１４．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｂが、Ｎである、項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１５．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｂが、Ｅである、項目１１０〜１１３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１６．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃが、Ａである、項目１１０〜１１５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１７．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃが、Ｓである、項目１１０〜１１５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１８．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｃが、Ｃである、項目１１０〜１１５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１１９．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄが、Ｅである、項目１１０〜１１８のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２０．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄが、Ｎである、項目１１０〜１１８のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２１．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄが、Ｓである、項目１１０〜１１８のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２２．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅが、Ｄである、項目１１０〜１２１のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２３．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅが、Ｅである、項目１１０〜１２１のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２４．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｅが、Ｓである、項目１１０〜１２１のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２５．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅが、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥおよびＳＳから選択される、項目１１０〜１１９、１２１、１２３または１２４のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２６．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅが、ＥＳである、項目１２５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２７．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｄＸ_ｅが、ＳＥである、項目１２５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２８．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｆが、Ａである、項目１１０〜１２７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１２９．配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸ_ｆが、Ｓである、項目１１０〜１２７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３０．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ａであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３１．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３２．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｓであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３３．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３４．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＮＤであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３５．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＮＤであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３６．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＮＤであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３７．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＮＤであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３８．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＳＥであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１３９．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＳＥであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４０．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＳＥであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４１．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＳＥであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４２．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ａであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＥＳであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４３．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ａであり；Ｘ_ｂが、Ｎであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＥＳであり、Ｘ_ｆが、Ａである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４４．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｓであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＥＳであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４５．配列ｉｉｉ）またはｖ）において、Ｘ_ａが、Ｓであり；Ｘ_ｂが、Ｅであり；Ｘ_ｃが、Ｃであり；Ｘ_ｄＸ_ｅが、ＥＳであり、Ｘ_ｆが、Ｓである、項目１１０または１１１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４６．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４〜７０６からなる群から選択される、項目１１０または１１２〜１４５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４７．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４〜３６８、配列番号３７０〜４９３および配列番号７０６からなる群から選択される、項目１４６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。１４８．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４〜３５５および配列番号３７０〜４９３からなる群から選択される、項目１４７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１４９．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４〜３５５、配列番号３７０〜４４５、配列番号４４７〜４５６、配列番号４５８〜４７８および配列番号４８０〜４９３からなる群から選択される、項目１４８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５０．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４〜３６１、配列番号３６６、配列番号３７２〜３７３、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２３、配列番号４２６、配列番号４２８〜４３０および配列番号７０６からなる群から選択される、項目１４７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５１．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２６および配列番号４２８〜４３０からなる群から選択される、項目１４９または１５０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５２．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２８および配列番号４３０からなる群から選択される、項目１５１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５３．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４、配列番号３７６および配列番号４２８からなる群から選択される、項目１５２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５４．配列ｉｉｉ）が、配列番号３５４である、項目１５３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５５．ｖｉｉ） ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
［配列中、［ＢＭ］は、項目１〜１０５のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択される］および
ｖｉｉｉ） ｖｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５６．ｉｘ） ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
［配列中、［ＢＭ］は、項目１〜１０５のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、Ｘ_ｃは、ＡおよびＣから選択される］および
ｘ） ｉｘ）によって定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５７．
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
［配列中、［ＢＭ］は、項目１〜１０５のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１０９に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５８．ｘｉ） ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
［配列中、［ＢＭ］は、項目１〜１０５のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
および
ｘｉｉ） ｘｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１５７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１５９．配列ｘｉ）が、配列番号１０６０〜１０６２からなる群から選択される、項目１５８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６０．ｘｉｉｉ） ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
［配列中、［ＢＭ］は、項目１〜１０５のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
および
ｘｉｖ） ｘｉｉｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１５９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６１．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜１０５９からなる群から選択される、項目１６０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６２．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜７２１、配列番号７２３〜８４６および配列番号１０５９からなる群から選択される、項目１６１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６３．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜７０８および配列番号７２３〜８４６からなる群から選択される、項目１６２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６４．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜７０８、配列番号７２３〜７９８、配列番号８００〜８０９、配列番号８１１〜８３１および配列番号８３３〜８４６からなる群から選択される、項目１６３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６５．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜７１４、配列番号７１９、配列番号７２５〜７２６、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７７９、配列番号７８１〜７８３および配列番号１０５９からなる群から選択される、項目１６２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６６．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７９および配列番号７８１〜７８３からなる群から選択される、項目１６３または１６５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６７．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７８１および配列番号７８３からなる群から選択される、項目１６６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６８．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７、配列番号７２９および配列番号７８１からなる群から選択される、項目１６７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１６９．配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７である、項目１６８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７０．相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍであるように、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに結合する能力がある、項目１〜１６９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７１．ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも少なくとも２倍高いような、少なくとも５倍高いような、少なくとも１０倍高いような、少なくとも５０倍高いような、少なくとも１００倍高いような、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも高い、項目１〜１７０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７２．ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄ値が、少なくとも１×１０^−７Ｍのような、少なくとも１×１０^−６Ｍのような、少なくとも１×１０^−５Ｍのような、少なくとも１×１０^−８Ｍである、項目１〜１７１のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７３．ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄ値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値以下である、項目１〜１７０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７４．ｐＨ７．４での前記相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍである、項目１〜１７０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペ
プチド。
１７５．Ｃ末端および／またはＮ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含む、項目１〜１７４のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７６．前記少なくとも１つの追加のアミノ酸伸長が、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製、精製、安定化、カップリングまたは検出を改善する、項目１７５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７７．そのアミノ酸配列が同じであるかまたは異なっていてもよい、少なくとも２つのＦｃＲｎ結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形である項目１〜１７６のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７８．前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド単量体単位が、ともに共有結合している、項目１７７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１７９．ＦｃＲｎ結合ポリペプチド単量体単位が、融合タンパク質として発現される、項目１７７に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１８０．二量体形である、項目１７７〜１７９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
１８１．−項目１〜１８０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
−望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８２．前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、それ自体で望ましい生物活性を有するポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも長い、項目１８１に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８３．前記望ましい生物活性が、治療活性である、項目１８１〜１８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８４．前記望ましい生物活性が、選択された標的への結合活性である、項目１８１〜１８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８５．前記選択された標的が、アルブミンである、項目１８４に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８６．前記アルブミン結合活性が、連鎖球菌のプロテインＧ、またはその誘導体のアルブミン結合ドメインによって提供される、項目１８５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８７．前記アルブミン結合活性が、融合タンパク質またはコンジュゲート体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる、項目１８５〜１８９のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８８．前記望ましい生物活性が、酵素活性である、項目１８１〜１８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１８９．望ましい生物活性を有する第２の部分が、治療活性のあるポリペプチドである、項目１８１〜１８３のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９０．望ましい生物活性を有する第２の部分が、酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカインおよびサイトカインからなる群から選択される、項目１８１〜１８３または１８８〜１８９のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９１．ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する、項目１〜１９０のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９２．前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、ＩｇＧとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値よりも低い、項目１９１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９３．標識をさらに含む、項目１〜１９２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９４．前記標識が、蛍光色素および金属、発色団色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される、項目１９３に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９５．システイン残基のチオール基またはリジン残基のアミン基を介して、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドにコンジュゲートしているポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されるキレート化環境を含む、項目１〜１９４のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９６．ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸またはその誘導体である、項目１９５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９７．１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸誘導体が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである、項目１９６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９８．ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはその誘導体である、項目１９５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
１９９．ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、ジエチレントリアミンペンタ酢酸またはその誘導体である、項目１９５に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
２００．項目１〜１９２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２０１．項目２００に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
２０２．項目２０１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
２０３．−前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現に許容的な条件下で、項目２０２に記載の宿主細胞を培養すること、および
−前記ポリペプチドを単離すること
を含む、項目１〜１９２のいずれか１項に記載のポリペプチドを作製する方法。
２０４．項目１〜１９９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体および少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤または担体を含む組成物。
２０５．少なくとも１つの追加の活性薬剤をさらに含む、項目２０４に記載の組成物。
２０６．経口投与、鼻腔内投与、肺投与、膣投与、直腸投与、静脈内注入、腹腔内注入、筋肉内注入、皮下注入および皮内注入からなる群から選択される経路による投与に適用される、項目２０４〜２０５のいずれか１項に記載の組成物。
２０７．医薬としての使用のための、項目１〜１９９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または項目２０４〜２０６のいずれか１項に記載の組成物。
２０８．前記医薬が、自己免疫状態の処置を目的とする、項目２０７に記載の使用のための、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
２０９．前記医薬が、重症筋無力症、ギランバレー症候群、自己免疫性辺縁系脳炎、連鎖球菌感染症と関連する小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、神経性筋強直症（アイザックス症候群）、モルヴァン症候群、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、硬化性苔癬、抗リン脂質抗体症候群、再発性多発軟骨炎、自己免疫性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性グレーブス病、拡張型心筋症、血管炎、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群から選択される状態の処置を目的とする、項目２０７または２０８に記載の使用のための、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
２１０．それを必要としている対象に、治療活性のある量の項目１〜１９９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または項目２０４〜２０６のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、対象の処置の方法。
２１１．自己免疫状態の処置のための、項目２１０に記載の方法。
２１２．前記対象が、重症筋無力症、ギランバレー症候群、自己免疫性辺縁系脳炎、連鎖球菌感染症（ＰＡＮＤＡＳ）と関連する小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、神経性筋強直症（アイザックス症候群）、モルヴァン症候群、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、硬化性苔癬、抗リン脂質抗体症候群、再発性多発軟骨炎、自己免疫性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性グレーブス病、拡張型心筋症、血管炎、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群から選択される状態に罹っている、項目２１０または２１１に記載の方法。

Claims (22)

1. ＦｃＲｎ結合モチーフＢＭを含む、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドであって、該モチーフが、アミノ酸配列
   ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＲ ＷＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｘ_２９
   ［配列中、互いに独立して、
   Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_６は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
   Ｘ_７は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
   Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
   Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
   Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
   Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
   Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；かつ
   Ｘ_２９は、ＤおよびＲから選択される］
   からなる、前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
2. ＢＭが、
   ｉ） ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６ＨＥＩＲ ＷＬＰＮＬＴＸ_１７Ｘ_１８ＱＲ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５ＫＬＸ_２８Ｄ
   ［配列中、互いに独立して、
   Ｘ_２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
   Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
   Ｘ_６は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
   Ｘ_１７は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
   Ｘ_２１は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
   Ｘ_２５は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
   Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される］
   および
   ｉｉ） 前記配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
3. 配列ｉ）が、６つの条件Ｉ〜ＶＩ：
   Ｉ． Ｘ_６が、特にＡのような、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択されること；
   ＩＩ． Ｘ_７が、Ｈであること；
   ＩＩＩ． Ｘ_１７が、特にＦのような、ＦおよびＹから選択されること；
   ＩＶ． Ｘ_１８が、Ｄであること；
   Ｖ． Ｘ_２１が、特にＶのような、ＶおよびＷから選択されること；
   ＶＩ． Ｘ_２５が、特にＨのような、ＨおよびＲから選択されること
   の少なくとも３つを満たす、請求項１または２に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
4. 配列が、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群から選択されるような、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群から選択されるような、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択されるまたは配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群から選択されるような、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択されるような、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群から選択されるような、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択されるような、配列番号１であるような、配列番号１〜３５３からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
5. 前記ＦｃＲｎ結合モチーフが、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
6. ｉｉｉ） Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ Ｘ_ｄＸ_ｅＸ_ｆＱ；
   ［配列中、
   ［ＢＭ］は、ここで定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ただしＸ_２９は、Ｄであり；
   Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
   Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
   Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
   Ｘ_ｄは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
   Ｘ_ｅは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
   Ｘ_ｆは、ＡおよびＳから選択される］
   および
   ｉｖ） ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
7. 配列iii）が、配列番号３５４〜３６８、配列番号３７０〜４９３および配列番号７０６からなる群から選択されるような、配列番号３５４〜３５５および配列番号３７０〜４９３からなる群から選択されるような、配列番号３５４〜３５５、配列番号３７０〜４４５、配列番号４４７〜４５６、配列番号４５８〜４７８および配列番号４８０〜４９３からなる群から選択されるまたは配列番号３５４〜３６１、配列番号３６６、配列番号３７２〜３７３、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２３、配列番号４２６、配列番号４２８〜４３０および配列番号７０６からなる群から選択されるような、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３８１、配列番号３９４、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２６および配列番号４２８〜４３０からなる群から選択されるような、配列番号３５４、配列番号３７６、配列番号３９７、配列番号４１８、配列番号４２８および配列番号４３０からなる群から選択されるような、配列番号３５４、配列番号３７６および配列番号４２８からなる群から選択されるような、配列番号３５４であるような、配列番号３５４〜７０６からなる群から選択される、請求項６に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
8. ｘｉ） ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
   ［配列中、［ＢＭ］は、請求項１〜４のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
   および
   ｘｉｉ） ｘｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
9. 配列ｘｉ）が、配列番号１０６０〜１０６２からなる群から選択される、請求項８に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
10. ｘｉｉｉ） ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
    ［配列中、［ＢＭ］は、請求項１〜４のいずれか１項において定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである］
    および
    ｘｉｖ） ｘｉｉｉ）において定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
11. 配列ｘｉｉｉ）が、配列番号７０７〜７２１、配列番号７２３〜８４６および配列番号１０５９からなる群から選択されるような、配列番号７０７〜７０８および配列番号７２３〜８４６からなる群から選択されるような、配列番号７０７〜７０８、配列番号７２３〜７９８、配列番号８００〜８０９、配列番号８１１〜８３１および配列番号８３３〜８４６からなる群から選択されるまたは配列番号７０７〜７１４、配列番号７１９、配列番号７２５〜７２６、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７６、配列番号７７９、配列番号７８１〜７８３および配列番号１０５９からなる群から選択されるような、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７３４、配列番号７４７、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７７９および配列番号７８１〜７８３からなる群から選択されるような、配列番号７０７、配列番号７２９、配列番号７５０、配列番号７７１、配列番号７８１および配列番号７８３からなる群から選択されるような、配列番号７０７、配列番号７２９および配列番号７８１からなる群から選択されるような、配列番号７０７であるような、配列番号７０７〜１０５９からなる群から選択される、請求項１０に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
12. 相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍであるように、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに結合する能力がある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
13. ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも少なくとも２倍高いような、少なくとも５倍高いような、少なくとも１０倍高いような、少なくとも５０倍高いような、少なくとも１００倍高いような、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫ_Ｄ値よりも高い、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
14. ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、少なくとも１×１０^−７Ｍのような、少なくとも１×１０^−６Ｍのような、少なくとも１×１０^−５Ｍのような、少なくとも１×１０^−８Ｍである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
15. ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間の相互作用のＫ_Ｄ値が、最大１×１０^−７Ｍのような、最大１×１０^−８Ｍのような、最大１×１０^−９Ｍのような、最大１×１０^−１０Ｍのような、最大１×１０^−６Ｍである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド。
16. −請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
    −望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
    を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
17. ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
19. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体および少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤または担体を含む組成物。
20. 医薬としての使用のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または請求項１９に記載の組成物。
21. 前記医薬が、自己免疫状態の処置を目的とする、請求項２０に記載の使用のための、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
22. 前記医薬が、重症筋無力症、ギランバレー症候群、自己免疫性辺縁系脳炎、連鎖球菌感染症と関連する小児自己免疫性神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、神経性筋強直症（アイザックス症候群）、モルヴァン症候群、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、妊娠性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、硬化性苔癬、抗リン脂質抗体症候群、再発性多発軟骨炎、自己免疫性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性グレーブス病、拡張型心筋症、血管炎、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスからなる群から選択される状態の処置を目的とする、請求項２０または２１に記載の使用のための、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。

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