JP2014510518A

JP2014510518A - Ｈｓａ関連組成物および使用方法

Info

Publication number: JP2014510518A
Application number: JP2013553420A
Authority: JP
Inventors: ガオ，チャンショウ; チャウダリー，チェティ; ヤオ，シャオタオ
Original assignee: メディミューン，エルエルシー
Priority date: 2011-02-15
Filing date: 2011-08-09
Publication date: 2014-05-01
Also published as: CA2826683A1; CN103379915A; AU2011359378A1; EP2675471A1; KR20140012094A; EP2675471A4; WO2012112188A1

Abstract

天然ＨＳＡよりも改善された特性がある、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）組成物が提供される。
【選択図】図１７

Description

１関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照によって援用する、２０１１年２月１５日に出願された、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２４８５５号明細書の優先権を主張する。

２配列表への言及
本出願は、２０１１年８月７日に作成され、４５，０５６バイトのサイズを有する、「ＭＥＤ０５５４＿ＰＣＴ２＿ＳＴ２５」と題されたテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本出願と共に提出された配列表を参照によって組み込む。

３発明背景
新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ｐＨ依存性機序によって、特にエンドソームの酸性ｐＨで双方の分子を結合し、それらを再循環して細胞表面に戻し、したがって双方の分子をデフォルトのリソソーム分解経路からそらすことによって、ＩｇＧおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の双方の寿命を延長する。ＦｃＲｎ結合能力は、アルブミンのドメインＩＩＩに内在性であることが示されている。

４発明の概要
本開示は、ＨＳＡ関連組成物および使用方法を提供する。本開示は、新生児ＦｃＲｎ結合断片および異種ポリペプチドまたはその生物活性断片を含んでなる、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含んでなるキメラポリペプチド、ならびに薬学的担体と組み合わされた、キメラポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。このようなキメラポリペプチドを生成するのに有用な構築物もまた、開示される。さらに本開示は、キメラポリペプチドと、それらをコードする構築物を生成する方法を教示する。本開示は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含んでなるポリペプチドをさらに提供し、そのＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなって、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較して、ポリペプチドのＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる。本開示はまた、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含んでなるキメラポリペプチドも提供し、そのＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、および異種タンパク質を含んでなり、キメラポリペプチドは異種タンパク質の機能活性を保持してＦｃＲｎに結合することができ、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことで、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、キメラポリペプチドのＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる。さらに本明細書では、キメラポリペプチドを使用して、例えばタンパク質の血清半減期を増大させる方法が開示される。ポリペプチドの多様な大集団のスクリーニングに有用な、アデノウイルスライブラリーの生成に有用な、方法およびベクターもまた開示される。このような方法は、ＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる、ＨＳＡドメインＩＩＩアミノ酸置換のスクリーニングと同定のために有用である。

特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分を含まない対照ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎ親和性増大と血清半減期増大の片方または双方を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは血清半減期の増大を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦｃＲｎ親和性増大と、血清半減期増大の双方を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）においてＦｃＲｎ親和性増大を有する。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）においてＦｃＲｎ増大を有し、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチドの親和性は、実質的に変化しない。

本開示は、前述の態様および実施形態のいずれかの全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載される実施形態のいずれかとの組み合わせを想定する。

５図面の簡単な説明
本発明を例証する目的で、本発明の特定の実施形態が図面に描写される。しかし本発明は、図面に描写される実施形態の正確な配置、および手段に限定されない。

図１は、ヒトＦｃＲｎに結合する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩの動態および平衡解析を提供する。ｐＨ５．５で固定化ドメインＩＩＩに結合するヒトＦｃＲｎについて、ＳＰＲ由来の結合、解離動態、および平衡結合定数が、ここに提示される。図１Ａは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＨＳＡのドメインＩＩＩ（矢印で示される）の成功裏の発現および精製を実証する、クーマシー染色ＰＡＧＥゲルを表す。図１Ｂは、ＣＭ５チップ固定化ドメインＩＩＩ上への一連のＦｃＲｎ濃度の注入によって作成された、結合センサーグラムを表す。図１Ｃは、定常状態親和性モデルに適合させた、ＦｃＲｎ濃度と対比した、平衡時における結合反応のプロットを表す。図２は、様々な構築物デザインの略図、ならびにＨＳＡ融合ＩｇＧ、およびドメインＩＩＩ融合ＩｇＧの精製および特性解析に関する情報を提供する。図２Ａは、組換えＩｇＧ−ＨＳＡの重鎖のＤＮＡ構築物またはＩｇＧ−ドメインＩＩＩ融合タンパク質、ならびにＹＴＥ変種を表す。図２Ｂは、還元および非還元条件下における、精製融合タンパク質（５μｇ／レーン）のＳＤＳＰＡＧＥ分析を表す。図２Ｃは、精製ＩｇＧ融合タンパク質の分析サイズ排除クロマトグラフィーを表す。ＨＳＡと融合したＩｇＧ、およびドメインＩＩＩと融合したＩｇＧに結合する、ヒトＦｃＲｎのＳＰＲ由来平衡定数を提供する。各ＦｃＲｎ注入について、ヒトＦｃＲｎ濃度と対比して平衡時のＲＵ（Ｒｅｑ）をプロットし、データを定常状態親和性モデルに適合させ、固定化ＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡ融合ＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩ融合ＩｇＧ（パネルＣ）のＫ_Ｄを計算した。挿入図のセンサーグラムは、Ｘ軸上の時間と対比して、Ｙ軸上に空試験を減じた後の固定化リガンドに結合するＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を示す。ＨＳＡと融合したＩｇＧ、およびドメインＩＩＩと融合したＩｇＧに結合する、ヒトＦｃＲｎのＳＰＲ由来平衡定数を提供する。各ＦｃＲｎ注入について、ヒトＦｃＲｎ濃度と対比して平衡時のＲＵ（Ｒｅｑ）をプロットし、データを定常状態親和性モデルに適合させ、固定化ＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡ融合ＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩ融合ＩｇＧ（パネルＣ）のＫ_Ｄを計算した。挿入図のセンサーグラムは、Ｘ軸上の時間と対比して、Ｙ軸上に空試験を減じた後の固定化リガンドに結合するＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を示す。ＨＳＡと融合したＩｇＧ、およびドメインＩＩＩと融合したＩｇＧに結合する、ヒトＦｃＲｎのＳＰＲ由来平衡定数を提供する。各ＦｃＲｎ注入について、ヒトＦｃＲｎ濃度と対比して平衡時のＲＵ（Ｒｅｑ）をプロットし、データを定常状態親和性モデルに適合させ、固定化ＩｇＧ（パネルＡ）、ＨＳＡ融合ＩｇＧ（パネルＢ）、およびドメインＩＩＩ融合ＩｇＧ（パネルＣ）のＫ_Ｄを計算した。挿入図のセンサーグラムは、Ｘ軸上の時間と対比して、Ｙ軸上に空試験を減じた後の固定化リガンドに結合するＦｃＲｎの質量（共鳴単位）を示す。ＦｃＲｎのためのＨＳＡ上のエピトープが、立体構造エピトープであることを示唆する証拠を提供する。３つの異なる様式で処理したセファロース（Ｓ）−ＨＳＡ、Ｓ−ＩｇＧまたはＳ−トリスをヒトＦｃＲｎと共に、ｐＨ５．５でインキュベートした。結合ＦｃＲｎを溶出させて、抗β２−ミクログロブリン抗体を用いた免疫ブロット法によって定量化した。分子量マーカー（Ｍ、ｋＤ単位）の位置が示される。レーン１は、全ての吸着材サンプルに添加された量である、２０μｇのヒトＦｃＲｎを含有する。酵母細胞（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））表面に提示されるＨＳＡおよびドメインＩＩＩが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。図５Ａは、ＦＩＴＣ結合抗ＨＳＡ抗体を使用した、ガラクトース誘導性ｐＹＤ１細胞表面ディスプレイプラスミドにより形質転換された、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞上のＨＳＡまたはドメインＩＩＩのフローサイトメトリー検出を表す。細胞は、表示の時間にわたりガラクトースで誘導された。酵母細胞（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））表面に提示されるＨＳＡおよびドメインＩＩＩが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。図５Ｂは、フローサイトメトリーを使用して抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、４８時間にわたり誘導されたＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞上に提示されたＨＳＡまたはドメインＩＩＩに対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合を表す。ＦＩＴＣならびにフィコエリトリンのバックグラウンド蛍光については、ｓｃｆｖで形質転換された酵母細胞を対照として使用した。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。異なる種（ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマ）からのドメインＩＩＩのアミノ酸配列アラインメントを提供する。パネルＡ〜Ｄのアラインメントがニワトリを含むのに対し、パネルＥ〜Ｈではニワトリは除外されている。異なる種間で保存されたアミノ酸残基を実線で示し、保存されたシステイン残基を点線で示する。網掛けしたアミノ酸残基は、種間で保存されていない。図６のアミノ酸の番号付けは、完全長成熟ＨＳＡに対するドメインＩＩＩの番号に関して示されるのでなく、ヒトドメインＩＩＩのみに関することに留意されたい。図６Ａの続きである。図６Ｂの続きである。図６Ｃの続きである。図６Ｄの続きである。図６Ｅの続きである。図６Ｆの続きである。図６Ｇの続きである。野生型を有するＩｇＧへのＨＳＡの融合が、ＩｇＧ−ＹＴＥ変種で見られるのと同様のレベルに、血清持続を増大させることを示す。血清に残留する注入サンプル％が、経時的にプロットされる（１〜２４０時間）。ｓｃＦｖ−Ｆｃ細胞表面ディスプレイライブラリー侵入ベクターのプラスミドマップを描写する。パネルＡは、プロモーター（ここではＣＭＶプロモーター）と作動可能に連結して、ポリＡ配列（ここではＢＧＨポリＡ配列）で終結する、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットを含有する、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターのプラスミドマップを描写する。ｓｃＦｖ部分は、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位で挟まれて、多様なｓｃＦｖ配列のクローニングを容易にする。ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカー発現カセットの側面に位置する。ｓｃＦｖ−Ｆｃ細胞表面ディスプレイライブラリー侵入ベクターのプラスミドマップを描写する。パネルＢは、パネルＡで示されるベクターをベースとするが、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＧＰＩ−アンカーカセットのポリＡテール後にＯｒｉＰ配列が組み込まれた（図９Ｃを参照されたい）、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰベクターのプラスミドマップを描写する。ＥＢＮＡ−１およびＯｒｉＰの代表例を提供する。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列が、それぞれパネルＡおよびＢに提供される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣで提供される。ＥＢＮＡ−１およびＯｒｉＰの代表例を提供する。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列が、それぞれパネルＡおよびＢに提供される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣで提供される。ＥＢＮＡ−１およびＯｒｉＰの代表例を提供する。ＥＢＮＡ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列が、それぞれパネルＡおよびＢに提供される。ＯｒｉＰの配列は、パネルＣで提供される。対象タンパク質を発現させるための、代表的な一般的アデノウイルス発現ベクターの概略図を提供する。描写されるベクターは、１つまたは複数の対象タンパク質をコードする対象ＤＮＡ配列；ＯｒｉＰ配列、および任意選択的にＥＢＮＡ−１コード領域を含む。これらの構成要素は、ベクター構築のために使用されていてもよいａｔｔ組換え部位で、任意選択的に挟まれる。これらの構成要素は、片側に、本例ではＥ１および／またはＥ３遺伝子が欠失している、アデノウイルスゲノムがあり、側面にＩＴＲ配列がある。３’および５’ＩＴＲ配列が示される。ベクターはまた、構築、増殖、および選択を容易にするための、細菌細胞における複製（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）起源）および抗生物質選択（例えばアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉａｎ）耐性）のための配列も提供し、これらの構成要素は、レスキューアデノウイルスに組み込まれないように位置される。哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）表面に提示されるＨＳＡが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。パネルＡは、ＨＳＡ部分（斜線ボックス）の側面に位置する、ＣＭＶプロモーター（太線）、シグナル配列（太い点線）、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ（細い点線）、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（細い実線）と、ＤＡＦ−ＧＰＩ配列とを含んでなる、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される哺乳類発現構築物を描写する。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）表面に提示されるＨＳＡが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。パネルＢは、ＦＩＴＣ結合抗ＨＳＡ抗体を使用した、ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩ（パネルＡ）から生成されたアデノウイルスに感染させた２９３−Ｆ細胞表面の１６および２４時間後のＨＳＡ、または対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする対照プラスミドのフローサイトメトリー検出を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）表面に提示されるＨＳＡが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを使用して、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、２９３Ｆ細胞上に提示されたＨＳＡに対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）表面に提示されるＨＳＡが、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを示す。パネルＣおよびＤは、フローサイトメトリーを使用して、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、２９３Ｆ細胞上に提示されたＨＳＡに対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ２５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ）の結合を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。２９３Ｆ細胞上に提示される、野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）および２つのＨＳＡ変異ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１およびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２）に対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す。パネルＡは、野生型および変異ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリーに感染させた、２９３Ｆ細胞表面のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を表す。パネルＢは、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、細胞表面のビオチン化ヒトＦｃＲｎ結合ＨＳＡのフローサイトメトリー検出を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、および２つのＨＳＡ変異ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１およびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）を発現する細胞のＦＡＣＳ選別プロファイルを示し、染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）は、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって検出された。野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、および２つのＨＳＡ変異ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１およびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）を発現する細胞のＦＡＣＳ選別プロファイルを示し、染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）は、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって検出された。野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ、パネルＡ）、および２つのＨＳＡ変異ライブラリー（ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１およびＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ２、それぞれパネルＢおよびＣ）を発現する細胞のＦＡＣＳ選別プロファイルを示し、染色されたビオチン化ヒトＦｃＲｎ（１０μｇ／ｍｌ）は、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって検出された。選別前と１回目および２回目の選別後における、細胞表面に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１変異ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す。パネルＡは、選別前と１回目および２回目の選別後における、野生型、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１を発現する２９３Ｆ細胞表面のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。選別前と１回目および２回目の選別後における、細胞表面に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１変異ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す。パネルＢおよびＣは、フローサイトメトリーを使用して、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、同一細胞セットに対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌ）の結合を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。選別前と１回目および２回目の選別後における、細胞表面に野生型ＨＳＡ（ＨＳＡ−ｗｔ）、ＨＳＡ−ＤＩＩＩ−ｌｉｂ１変異ライブラリーを発現する２９３Ｆ細胞に対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの結合プロファイルの変化を示す。パネルＢおよびＣは、フローサイトメトリーを使用して、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって視覚化された、同一細胞セットに対する、ビオチン化ヒトＦｃＲｎ（それぞれ１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌ）の結合を表す。実験は、細胞数と対比して、蛍光強度（対数目盛り）のヒストグラムとして表される。細胞表面に提示される変異ＨＳＡに対するＦｃＲｎの結合が、ｐＨ依存性であることを示す。パネルＡおよびＢは、ｐＨ５．５（０．１μｇ／ｍｌＦｃＲｎ；パネルＡ）およびｐＨ７．２（１０μｇ／ｍｌ；パネルＢ）において、対照ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、野生型ＨＳＡ、および３つの代表的変異（表５を参照されたい）を発現する２９３Ｆ細胞の表面において、抗ストレプトアビジンフィコエリトリンによって検出された、ビオチン化ヒトＦｃＲｎのフローサイトメトリー検出を示す。パネルＣは、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＳＡ抗体を使用した、これらの細胞表面のＨＳＡのフローサイトメトリー検出を示す。フローサイトメトリーによる測定で、大部分の単離ＨＳＡ変異が、より高いＦｃＲｎ親和性を有することを示す。フローサイトメトリーによって、異なる濃度におけるビオチン化ヒトＦｃＲｎ結合について、野生型ＨＳＡおよび選択された変異体パネルを分析した。データはＭＦＩとして、ＦｃＲｎ濃度に対してプロットされる。解析されたＨＳＡ構造体上における、いくつかの変異の位置を描写する（ＰＤＢ受入番号１ＢＭ０）。構造体の大半は、リボン略図として表され、残基Ｌ４６３、Ｅ４９５、Ｔ５０８、Ｉ５２３、およびＫ５３４は、スティックによって表され、矢印で示される。残基４９２〜５３６を包含する、ループ６および７と、へリックス７および８が丸で囲まれる。ホットスポットおよび好ましいスポットの大部分は、この領域に見られるヒトＦｃＲｎ遺伝子組換えマウス中における、いくつかのコンビナトリアル変異ＨＳＡの半減期曲線を示す。これらの結果は、実施例８．１４の表１１にも要約される。

６発明の詳細な説明
６．１緒言
新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ｐＨ依存性機序によって、特にエンドソームの酸性ｐＨで双方の分子を結合し、それらを再循環して細胞表面に戻し、したがって双方の分子をデフォルトのリソソーム分解経路からそらすことによって、ＩｇＧおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の双方の寿命を延長する。ＦｃＲｎ結合能力は、アルブミンのドメインＩＩＩに内在性であることが示されている。本明細書で実証されるように、ＨＳＡのＦｃＲｎ結合断片の付加を使用して、タンパク質の血清半減期を増大させ、および／または抗体、抗体代替物、タンパク質、タンパク質スキャフォールド、およびペプチドなどの治療薬のＦｃＲｎ結合親和性を増大させ得る。特に本明細書で実証されるように、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）ではＦｃＲｎ結合親和性が増大するのに対し、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では親和性は実質的に変化しない。本開示のＦｃＲｎ結合領域変種を含んでなるキメラポリペプチドは、野生型ＦｃＲｎ結合領域よりもなおさらに、タンパク質の血清半減期またはＦｃＲｎ結合親和性を増大させてもよい。本発明のＨＳＡ変種ポリペプチドは、治療標的に結合するスキャフォールドの役割を果たしてもよく、または治療薬と共役してもよい。

本開示は、ドメインＩＩＩの変種を提供する。このようなドメインＩＩＩの変種は、単独で使用され、または追加的なＨＳＡ配列の文脈で使用されて、異種タンパク質および／または非タンパク質作用物質の血清半減期および／またはＦｃＲｎ結合親和性を増大させ得る。

本明細書で開示されるキメラポリペプチドとＨＳＡ変種は、多数の用途を有する。タンパク質およびその他の分子は、時に比較的急速に人体または動物体から除去されると理解される。急速なクリアランスは、動物モデル中でタンパク質およびその他の分子を研究する能力を失わせ得て、治療目的で効果的にそれらを使用する能力を失わせ得る。場合によっては、タンパク質は、非常に急速に除去されるので、それは治療効果を有しない。その他の事例では、タンパク質は頻繁な投与を要する速度で除去される。頻繁な投与は治療法に付随するコストを上昇させて、薬剤投与計画の非服薬遵守のリスクもまた増大させる。場合によっては、タンパク質は、より大きな用量の投与を要する速度で除去される。活性薬剤のより大きな用量は、免疫反応をはじめとする、副作用のリスクを増大させることもある。

本開示のキメラポリペプチドおよび変種ＨＳＡポリペプチドは、血清半減期および／またはＦｃＲｎ親和性を増大させることにより、急速なまたは比較的急速なタンパク質クリアランスに付随する問題に対処するのを助ける。同様に、非タンパク質作用物質は、本開示の変種ＨＳＡポリペプチドと結合して、血清半減期および／またはＦｃＲｎ親和性を増大させ得る。

６．２用語法
本発明のさらに詳細な記述を継続する前に、特定の組成物または工程段階は変動することもあるため、本発明はそれらに限定されないものと理解される。本明細書および添付の特許請求範囲の用法では、文脈上例外が明記されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数指示対象を含むことに留意すべきである。

特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えばＣｏｎｃｉｓｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄｅｄ．，２００２，ＣＲＣＰｒｅｓｓ；ＴｈｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，１９９９，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙＯｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓが、本発明で使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。

アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号のいずれによって参照されてもよい。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められた一文字コードによって参照されてもよい。本明細書の用法では「アミノ酸置換」は、親ポリペプチド配列中の特定位置における、別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。例えば置換Ｌ４６３Ｎは、その中で位置４６３のロイシンが、アスパラギンで置換されている、変種ポリペプチドを指す。

特に断りのない限り、抗体の可変領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）内のアミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＫａｂａｔ定義に従う。この番号方式を使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変領域のＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に相当する、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有してもよい。例えば重鎖可変領域は、Ｈ２の残基５２の後に、単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えばＫａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準」Ｋａｂａｔ番号配列を用いた、抗体配列の相同領域における整列によって、所与の抗体について決定されてもよい。フレームワーク残基の最大の整列は、Ｆｖ領域で使用されるために、番号方式において頻繁に、「スペーサー」残基の挿入を要する。これに加えて、種間のまたは対立遺伝子の多様性のために、任意の所与のＫａｂａｔ部位数の特定の個々の残基の同一性は、抗体鎖毎に変動してもよい。

本明細書の用法では、免疫グロブリンとしてもまた知られている「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、（完全長モノクローナル抗体をはじめとする）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片（例えば二重特異性抗体）から形成された多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性（例えば抗原結合部分）を提示する抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体をはじめとする）、細胞内抗体、および上のいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に抗体としては、免疫グロブリン分子と、例えば少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子などの免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはアロタイプ（例えばＧｍ、例えばＧ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、またはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））であり得る。抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどはじめとするが、これに限定されるものではない任意の哺乳類、または（例えばニワトリなどの）鳥類などのその他の動物に由来してもよい。

本明細書の用法では、「完全長ＨＳＡ」という用語は、成熟完全長ヒト血清アルブミンタンパク質、またはこのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。完全長ＨＳＡタンパク質は、（Ｎ末端プロ−およびプレプロ−配列の除去に続いて）およそ５８５個のアミノ酸である。成熟完全長ＨＳＡ（完全長成熟ＨＳＡとも称される）タンパク質は、配列番号２で記載される。特定の実施形態では、完全長ＨＳＡは、プロ配列がないＨＳＡの成熟完全長形態を指す。（Ｎ末端プロおよびプレプロ配列の除去に先行する）プレプロＨＳＡの配列は、６０９個のアミノ酸であり、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００４６８で記載される。これに加えて、特定の個々の残基の同一性は、対立遺伝子多様性のために、配列番号２で示されるものから変動してもよい。ＨＳＡのドメインＩＩＩ中に生じる対立遺伝子のバリエーションとしては、残基４１０におけるＲ→Ｃ；残基４６６におけるＫ→Ｅ；残基４７９におけるＥ→Ｋ；残基４９４におけるＤ→Ｎ；残基５０１におけるＥ→Ｋ；残基５０５におけるＥ→Ｋ；残基５３３におけるＶ→Ｍ；残基５３６におけるＫ→Ｅ；残基５４１におけるＫ→Ｅ；残基５５０におけるＤ→ＡまたはＤ→Ｇ；残基５６０におけるＫ→Ｅ；残基５６３におけるＤ→Ｎ；残基５６５におけるＥ→Ｋ；残基５７０におけるＥ→Ｋ；残基５７３におけるＫ→Ｅ；残基５７４におけるＫ→Ｅ；残基５７２〜５８５におけるＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ→ＰＴＭＲＩＲＥＲＫ；および５７５〜５８５におけるＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ→ＴＣＣＣＫＳＳＣＬＲＬＩＴＳＨＬＫＡＳＱＰＴＭＲＩＲＥＲＫが挙げられ、番号付けは完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応する。

本明細書の用法では、「ＨＳＡのドメインＩＩＩ」という用語は、完全長成熟ＨＳＡのアミノ酸３８１〜５８５にわたる、およそ２０５個のアミノ酸である、従来のＨＳＡのドメインＩＩＩ、またはこのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。ＨＳＡのドメインＩＩＩはまた、本明細書でドメインＩＩＩまたは単にＤＩＩＩと略される。ドメインＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１で記載される。上述のように特定の個々の残基の同一性は、対立遺伝子の多様性のために、配列番号１で提示されるものから変動してもよい。

本明細書の用法では、「キメラポリペプチド」という用語は、互いに異種でない、少なくとも２つの部分を含んでなるポリペプチドを指す。例えば融合ポリペプチドまたは融合タンパク質とも称されるキメラポリペプチドは、異種タンパク質部分に連結するＨＳＡ部分を少なくとも含んでなる。ＨＳＡ部分および異種タンパク質部分は、それ自身が、例えばＦｃまたはその他の部分との融合物であり得る。ＨＳＡ部分および異種タンパク質部分は、共有結合または非共有結合相互作用によって連結してもよい。一例として、ＨＳＡ部分と異種タンパク質部分は、互いに化学的に結合してもよく、または組換え的に融合してもよい（例えばインフレームの翻訳融合）。

本明細書の用法では、「異種タンパク質」という用語は、ＨＳＡでないタンパク質の全部または一部を指す。「異種タンパク質」という総称が本明細書で使用されるが、用語は、様々な長さの生物活性ペプチド、ならび抗体および抗体断片をはじめとする、完全長または実質的に完全長のタンパク質を包含することが意図される。好ましい異種タンパク質は、治療目的で、使用されまたは研究され得る。異種タンパク質の例示的なクラスとしては、酵素、サイトカイン、および増殖因子が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本明細書の用法では、ＨＳＡポリペプチドとしては、野生型ＨＳＡポリペプチドの様々な生物活性断片および変種、融合タンパク質、および修飾形態が挙げられる。このようなＨＳＡポリペプチドの生物活性断片または変種、融合タンパク質、および修飾形態は、天然ＨＳＡタンパク質とかなりの配列同一性があるアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、少なくとも天然ＨＳＡタンパク質のＦｃＲｎ結合活性を保持する。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドの生物活性断片、変種、または融合タンパク質は、ＨＳＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。本明細書の用法では、「断片」には、ＦｃＲｎ結合活性を示す生物活性断片または生物活性変種が含まれると理解される。適切な生物活性断片を使用してキメラポリペプチド生成し得て、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、このようなキメラポリペプチドを使用し得る。

本明細書の用法では、「変異された」、「変異体」などという用語は、部位特異的変異誘発のための周知の技術、または任意のその他の従来法を使用して、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換を受けた分子、特にＨＳＡポリペプチドを指す。

６．３ＨＳＡドメインＩＩＩ
特定の態様では、本開示は、ＨＳＡドメインＩＩＩを含んでなる、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変種ポリペプチドまたはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を提供し、前記変種ポリペプチドはＦｃＲｎに結合し得て、前記ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換を欠く対照ＨＳＡポリペプチドと比較して、前記変種ポリペプチドの血清半減期を増大させ、またはＦｃＲｎ親和性を増大させる。

特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＨＳＡ変種ポリペプチドの血清半減期を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性と、ＨＳＡ変種ポリペプチドの血清半減期の双方を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）において、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）において、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を増大させるが、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を実質的に変化させない。

特定の実施形態では、ＨＳＡ変種はＦｃＲｎに結合し、前記対照ＨＳＡポリペプチドと異なるオフ速度またはオン速度を有する。例えば特定の実施形態では、ＨＳＡ変種はＦｃＲｎに結合し、より急速なオン速度および／またはより緩慢なオフ速度を有する。別の実施形態では、オン速度はより緩慢であり、および／またはオフ速度はより急速である。

特定の実施形態では、本開示は、ＨＳＡ部分を含むキメラポリペプチドを提供し、そのＨＳＡ部分は、ドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合部分、および異種タンパク質を含んでなり、キメラポリペプチドは異種タンパク質の機能活性を保持する。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、ＨＳＡポリペプチド全体を含んでなり、またはＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなる生物活性断片を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片と、例えばＨＳＡドメインＩの少なくとも一部またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部、またはＨＳＡドメインＩおよびＩＩの少なくとも一部などのＨＳＡの別のドメインの少なくとも一部とを含んでなる。本明細書の用法では、ＨＳＡドメインＩは残基１〜１９７を含んでなり；ＨＳＡドメインＩＩは残基１８９〜３８５を含んでなり；ＨＳＡドメインＩＩＩは残基３８１〜５８５を含んでなり、番号付けは完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応する。

特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分を含まない対照ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎ親和性増大と血清半減期増大の片方または双方を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦｃＲｎ親和性増大を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、血清半減期増大を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＦｃＲｎ親和性増大と、血清半減期増大の双方を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）において、ＦｃＲｎ親和性増大を有する。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）においてＦｃＲｎ増大を有し、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチドの親和性は、実質的に変化しない。

さらに、本明細書に記載されるように、特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種またはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含み、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、キメラポリペプチドのＦｃＲｎ親和性と血清半減期の片方または双方を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチドの親和性を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、キメラポリペプチドの血清半減期を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチドの親和性と、キメラポリペプチドの血清半減期の双方を増大させる。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含む。同様に、ドメインＩＩＩを含んでなるＨＳＡ変種ポリペプチド、またはそのＦｃＲｎ結合部分の文脈で、ドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、そのアミノ酸置換は、対立遺伝子変種中に存在する別の残基への単一アミノ酸の置換だけではない。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩは、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかに、アミノ酸置換を含んでなる：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（ｌ）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；（ｑ）残基５４１および５６１；（ｒ）残基４６３および５２３；（ｓ）残基５０８および５２３；（ｔ）残基５０８および５２４；（ｕ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｖ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｗ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｙ）残基４６３および５２４；（ｚ）残基５２３および５２４；および（ａａ）残基４６３、５２３、および５２４。

一実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、配列番号１８を含んでなり、その中でＸ_１はロイシンでなく、および／またはＸ_２はスレオニンでなく、および／またはＸ_３はイソロイシンでなく、および／またはＸ_４はリジンでない。特定の実施形態では、Ｘ_１は、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、またはグルタミンであり；Ｘ_２は、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リジン、アルギニン、またはセリンであり；Ｘ_３は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンであり；およびＸ_４は、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、スレオニン、またはバリンである。別の実施形態では、Ｘ_１はフェニルアラニンまたはアスパラギンであり；Ｘ_２はアルギニンまたはセリンであり；Ｘ_３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン、リジン、またはアルギニンであり；および／またはＸ_４はロイシンである。なおも別の実施形態では、Ｘ_１はアスパラギンであり、および／またはＸ_２はアルギニンであり、および／またはＸ_３はグリシンであり、および／またはＸ_４はロイシンである。

特定の実施形態では、ＦｃＲｎ親和性増大および／または血清半減期増大は異なる対照と対比して評価される。例えばキメラポリペプチドの特性は、ＨＳＡ部分不在下で異種タンパク質と対比して評価し得て、またはアミノ酸置換不在下で、および／または異種タンパク質不在下で、同一または類似ＨＳＡ部分と対比して評価し得る。同様にＨＳＡ変種ポリペプチドは、アミノ酸置換を有しないＨＳＡ分子と対比して評価し得る。

特定の実施形態では、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変種ポリペプチドは、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性で、ＦｃＲｎに結合する。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）において、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチド／ＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を増大させる。特定の実施形態では、１〜１８個のアミノ酸置換は、酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）において、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチド／ＨＳＡ変種ポリペプチドの親和性を増大させるが、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）では、ＦｃＲｎに対するキメラポリペプチドの親和性を実質的に変化させない。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、酸性ｐＨにおいてより高い親和性でＦｃＲｎに結合し、血清半減期増大を有する。

特定の実施形態では、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変種ポリペプチドはＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドと異なるオフ速度オン速度を有する。例えば、特定の実施形態では、キメラポリペプチド／ＨＳＡ変種ポリペプチドは、ＦｃＲｎに結合して、より急速なオン速度および／またはより緩慢なオフ速度を有する。別の実施形態では、オン速度はより緩慢であり、および／またはオフ速度はより急速である。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、またはＨＳＡ部分があるキメラポリペプチド）のＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１０個のアミノ酸置換を含んでなり、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎに対するポリペプチドの親和性増大させ、および／またはポリペプチドの血清半減期を増大させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１つのアミノ酸置換を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。特定の実施形態ではＨＳＡドメインＩＩＩは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１０個のアミノ酸置換を含んでなる。

例示的なアミノ酸置換としては、（ｉ）アラニンによる置換；（ｉｉ）保存的アミノ酸置換；（ｉｉｉ）非保存的アミノ酸置換が挙げられる。本開示は、所与のポリペプチドのドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換が全て、これらの置換カテゴリーの１つの構成員であってもよいことが想定され、また所与のポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分があるキメラポリペプチド）のドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換が全て、個々に独立してこれらのカテゴリーから選択されてもよいことも想定される。

特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、ＨＳＡ中の残基のアラニンへの置換である。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、別の中性アミノ酸残基によって、ＨＳＡ中の所与の中性アミノ酸残基を置き換える。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、別の酸性アミノ酸残基によって、ＨＳＡ中の所与の酸性アミノ酸残基を置き換える。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、別の塩基性アミノ酸残基によって、ＨＳＡ中の所与の塩基性アミノ酸残基を置き換える。本開示は、各置換が、前述した置換クラスから独立して選択される、実施形態を想定する。前述の置換カテゴリーの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。

特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：リジン（Ｋ；Ｌｙｓ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）；ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ；アスパラギン酸）およびグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ；グルタミン酸）。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、およびチロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：アラニン（Ａ；Ａｌａ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、およびグリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：システイン、セリン、およびスレオニン。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸。特定の実施形態では、置換（少なくとも１、２、３、４、５、６個などのＨＳＡドメインＩＩＩ置換）は、以下の群内の別のアミノ酸によって、１つのアミノ酸を置き換える。グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。本開示は、各置換が、前述した置換カテゴリーから独立して選択される、実施形態を想定する。前述の置換クラスの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。

特定の実施形態では、ＦｃＲｎ親和性増大、および／または血清半減期増大を有する、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、４０７Ｈ、４０７Ｍ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、４０７Ｒ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｌ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｄ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｍ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｗ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｆ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｌ、Ｖ４２６Ｎ、Ｖ４２６Ｐ、Ｖ４２６Ｑ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｍ、Ｔ５０６Ｎ、Ｔ５０６Ｒ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｄ、Ｆ５０９Ｇ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｐ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｄ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｉ、Ａ５１１Ｒ、Ａ５１１Ｔ、Ａ５１１Ｖ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｍ、Ｄ５１２Ｑ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｄ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｇ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｌ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｔ５１５Ｗ、Ｔ５１５Ｙ、Ｌ５１６Ｃ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２１Ｍ、Ｒ５２１Ｑ、Ｒ５２１Ｔ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｆ、Ｑ５２６Ｈ、Ｑ５２６Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｐ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｖ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｋ、Ｈ５３５Ｌ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｈ５３５Ｓ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｎ、Ｋ５５７Ｓ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。特定の実施形態では、２個以上のアミノ酸置換（例えば２、３、４、５．．．）、またはドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

その他の特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、以下からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

その他の特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、以下からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

その他の特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、以下からなる群から選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｓ５１７Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、残基４６３および５０８；または残基４６３および５２３；または残基４６３および５２４；または残基５０８および５２４；または残基４６３、５０８および５２３；または残基４６３、５０８、および５２４；または５０８、５２３、および５２４、または残基４６３、５０８、５２３、および５２４における、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含み、残基４６３における置換は、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑから選択され；残基５０８における置換は、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓから選択され；残基５２３における置換は、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙから選択され；および残基５２４における置換は、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖから選択される。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩ中に、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（ｊ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｖ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｗ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｘ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｙ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｚ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ａａ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩ中に、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｎ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｏ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｐ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｑ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌおよび（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩ中に、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｅ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｆ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｇ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩ中に、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５０８Ｒ；（ｂ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｄ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ。

これに加えて、断片または変種は、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当該技術分野で公知の技術を使用して化学的に合成し得る。断片または変種を（組換え的にまたは化学合成によって）生成して試験し、例えば天然ＨＳＡタンパク質と同様に良好に、または実質的に同様に機能し得る断片または変種を同定し得る。

特定の実施形態では、本発明は、治療的または予防的効力または安定性（例えば血清半減期、生体外貯蔵寿命、および生体内タンパク質分解に対する耐性）を促進するなどの目的で、ＨＳＡポリペプチドの構造体を修飾することを想定する。このような改変ＨＳＡポリペプチドは、天然に存在する（すなわち天然または野生型）ＨＳＡポリペプチドと、同一のまたは実質的に同一の生物活性を有する。修飾ＨＳＡポリペプチドは、本明細書に記載されるようなその他の治療的部分（例えばタンパク質および非タンパク質作用物質）と結合してもよい。修飾ポリペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失、または付加によって生成され得る。例えばイソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの隔離された置換、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換（例えば保存的アミノ酸置換）が、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想することは、理にかなっている。保存的置換は、それらの側鎖が関連しているアミノ酸ファミリー内で起きるものである。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種を越えて保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数種を越えて保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、類人猿およびサルなどの種からの、ヒトにおいて高度に保存された血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、非哺乳類動物からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、類人猿およびサルなどの種からの、ヒトにおいて高度に保存された血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、非哺乳類動物からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、大多数のヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも２つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも３つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも４つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも５つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、２〜５つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、大多数のヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも２つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも３つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも４つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、少なくとも５つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、２〜５つの種からの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。前述のアミノ酸置換カテゴリーの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種およびキメラポリペプチド）もまた検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３９２、残基３９９、残基４０３、残基４１１、残基４１２、残基４１４、残基４１６、残基４１８、残基４２０、残基４２３、残基４３４、残基４３７、残基４３８、残基４４５、残基４４８、残基４５０、残基４５３、残基４６１、残基４７６、残基４７７、残基４８４、残基４８５、残基４８７、残基４８８、残基４９４、残基４９７、残基５０７、残基５０９、残基５１４、残基５２９、残基５３４、残基５３７、残基５４０、残基５５１、残基５５８、残基５５９、残基５６７、残基５６８、残基５７２。特定の実施形態では、２個以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個）のアミノ酸置換、またはドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の全てさえもが、前述の残基にある。任意の１つまたは複数の前述の残基の中における、アミノ酸置換の全ての組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種およびキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩ中の位置に対応して番号付けされる以下の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３９１、残基４１１、残基４１４、残基４１６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４５０、および残基５０９。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される：Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｄ、Ｆ５０９Ｇ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｐ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、およびＦ５０９Ｙ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩ中の位置に対応して番号付けされる以下の位置のいずれかにある：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。特定の実施形態では、２個以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個）のアミノ酸置換、またはドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の全てさえもが、前述の残基にある。前述の残基の任意の１つまたは複数の中における、アミノ酸置換の全ての組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種およびキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩ中の位置に対応して番号付けされる以下の位置のいずれかにある：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。いくつかの実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種ポリペプチドまたはキメラポリペプチド）のＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、残基４６３および５０８；または残基４６３および５２４；または残基５０８および５２４；または残基４６３、５０８および５２４における、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ２４２Ａ、Ｖ２４２Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｖ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種を越えて保存されていない残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数種を越えて保存されていない残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ラット、イヌ、ウサギ、およびウシからの血清アルブミンタンパク質間で保存されていない残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ラット、イヌ、ウサギ、およびウシの血清アルブミンタンパク質間で保存されない残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ラット、イヌ、ウサギ、およびウシからの血清アルブミンタンパク質間で保存されない残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ラット、イヌ、ウサギ、およびウシからの血清アルブミンタンパク質間で保存されない残基の置換である。前述のアミノ酸置換カテゴリーの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）もまた検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３８２、残基３８５、残基３９０、残基３９７、残基４００、残基４０２、残基４１５、残基４２９、残基４３２、残基４３５、残基４３９、残基４４０、残基４４３、残基４４４、残基４４６、残基４４７、残基４５９、残基４７１、残基４７２、残基４７８、残基４７９、残基４８３、残基４９０、残基４９２、残基４９３、残基５０３、残基５１１、残基５１７、残基５１８、残基５１９、残基５２１、残基５３８、残基５４１、残基５４２、残基５４６、残基５４９、残基５５０、残基５５２、残基５５４、残基５５６、残基５６０、残基５６２、残基５６３、残基５６５、および残基５６６。特定の実施形態では、２個以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個）のアミノ酸置換、またはドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の全てさえもが、前述の残基にある。前述の残基の任意の１つまたは複数の中における、アミノ酸置換の任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基４０２、残基４１５、残基４４７、残基４５９、残基５１１、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５３８、残基５４１、および残基５６６。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、以下からなる群から選択される：Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＴ５６６Ｙ。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接近可能な残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能な残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。特定の実施形態では、２個以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個）のアミノ酸置換、またはドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の全てさえもが、前述の残基にある。前述のアミノ酸置換カテゴリーの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種およびキメラポリペプチド）が、具体的に検討される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒからなる群から選択される。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩの２個以上（例えば２、３、４、５個．．．）のアミノ酸置換、またはアミノ酸置換の全てでさえも、前述の置換から選択される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ４１０Ｃ；Ｋ４６６Ｅ；Ｅ４７９Ｋ；Ｄ４９４Ｎ；Ｅ５０１Ｋ；Ｅ５０５Ｋ；Ｖ５３３Ｍ；Ｋ５３６Ｅ５３６；Ｋ５４１Ｅ；Ｄ５５０ＡまたはＤ５５０Ｇ；Ｋ５６０Ｅ；Ｄ５６３Ｎ；Ｅ５６５Ｋ；Ｅ５７０Ｋ；Ｋ５７３Ｅ；またはＫ５７４Ｅの置換だけではない。

特定の実施形態では、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、ＨＳＡドメインＩＩＩを含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、配列番号１と少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、配列番号１と少なくとも９８％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応する部分と少なくとも８０％、８５％、または少なくとも９０％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応する部分と少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、配列番号２の対応する部分と少なくとも９８％同一である、アミノ酸配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本開示は、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つまたは複数のアミノ酸置換に加えて、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）が、ドメインＩＩＩの外部のＨＳＡ部分中の１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでもよいことを想定する。

特定の実施形態では、本開示は、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つまたは複数のアミノ酸置換に加えて、ポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）が、ドメインＩＩＩ中の１つまたは複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８）のアミノ酸欠失および／または挿入もまた含んでもよいことを想定する。ＨＳＡ部分が１つまたは複数のアミノ酸欠失および／または挿入を含有する場合、このような挿入または欠失残基は、天然ＨＳＡと比較した残基の番号付けを混乱させないように、文字を使用して示され得ることに留意されたい。例えば残基４１４と４１５の間にアミノ酸残基が挿入された場合、このような残基は４１４ａと表記され得る。特定の実施形態では、挿入アミノ酸残基は、表面接近可能なループ中に挿入されて、このようなループのサイズを増大させる。特定の実施形態では、挿入アミノ酸残基は、へリックス中に挿入されて、このようなへリックスのサイズを増大させおよび／または構造を変化させる。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ２中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ３中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜１８個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜１８個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ６中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜６個（１、２、３、４、５、または６個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜６個（１、２、３、４、５、または６個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のへリックス７中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜３個（１、２、または３個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜３個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜３個（１、２、または３個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ７中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜１８個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜６個（１、２、３、４、５、６個など）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中にへリックス８中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４、５個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜５個（１、２、３、４、または５個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ８中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜４個（１、２、３、４個）のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜４個のアミノ酸置換はＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは１〜５個（１、２、３、４個）のアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中に含んでなり、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のループ９中にない１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。上で詳述されるように、各位置で独立して可能なアミノ酸置換は、上で詳述される置換クラス（例えばアラニン、保存的置換など）のいずれかから選択される。前述のアミノ酸置換カテゴリーの任意の組み合わせを含んでなるポリペプチド（例えばＨＳＡ変種およびキメラポリペプチド）もまた検討される。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にない。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にない。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にない。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にない。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも２つのループ中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも３つのループ中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩの少なくとも４つのループ中にない。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換は、へリックス７または８中にない。

特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも２個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩのループおよび／またはへリックスの少なくとも２つの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも３個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩのループおよび／またはへリックスの少なくとも３つの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも４個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩのループおよび／またはへリックスの少なくとも４つの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩのループおよび／またはへリックスの少なくとも５つの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも６個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩのループおよび／またはへリックスの少なくとも６つの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも６個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれの中にある。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩは、少なくとも２個のアミノ酸置換を含んでなり、前記アミノ酸置換は、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７、および８のそれぞれの中にある。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ２中にあり、残基４１５、残基４１６、残基４１７、残基４１８、および残基４１９から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５個）のアミノ酸置換はループ２中にあり、残基４１５、残基４１６、残基４１７、残基４１８、および残基４１９から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ２中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、およびＱ４１６Ｐから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ３中にあり、残基４３９、残基４４０、残基４４１、残基４４２、および残基４４３から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５個）のアミノ酸置換はループ３中にあり、残基４３９、残基４４０、残基４４１、残基４４２、および残基４４３から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ３中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｅ４４２Ｋ、およびＥ４４２Ｒから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ６中にあり、残基４９２、残基４９３、残基４９４、残基４９５、残基４９６、残基４９７、残基４９８、残基４９９、残基５００、残基５０１、残基５０２、残基５０３、残基５０４、残基５０５、残基５０６、残基５０７、残基５０８、および残基５０９から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のアミノ酸置換がループ６中にあり、残基４９２、残基４９３、残基４９４、残基４９５、残基４９６、残基４９７、残基４９８、残基４９９、残基５００、残基５０１、残基５０２、残基５０３、残基５０４、残基５０５、残基５０６、残基５０７、残基５０８、および残基５０９から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ６中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、およびＦ５０９Ｙから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、へリックス７中にあり、残基５１０、残基５１１、残基５１２、残基５１３、残基５１４、および残基５１５から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５、６個）のアミノ酸置換はへリックス７中にあり、残基５１０、残基５１１、残基５１２、残基５１３、残基５１４、および残基５１５から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ７中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、およびＴ５１５Ｓから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ７中にあり、残基５１６、残基５１７、および残基５１８から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３個）のアミノ酸置換はループ７中にあり、残基５１６、残基５１７、および残基５１８から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ７中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、およびＳ５１７Ｙから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはへリックス８中にあり、残基５１９、残基５１８、残基５１９、残基５２０、残基５２１、残基５２２、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５２８、残基５２９、残基５３０、残基５３１、残基５３２、残基５３３、残基５３４、残基５３５、および残基５３６から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のアミノ酸置換はへリックス８中にあり、残基５１９、残基５１８、残基５１９、残基５２０、残基５２１、残基５２２、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５２８、残基５２９、残基５３０、残基５３１、残基５３２、残基５３３、残基５３４、残基５３５、および残基５３６から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩへリックス８中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、およびＨ５３５Ｐから選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ８中にあり、残基５３７、残基５３８、残基５３９、残基５４０、および残基５４１から選択される。特定の実施形態では、２個以上（２、３、４、５個）のアミノ酸置換はループ８中にあり、残基５３７、残基５３８、残基５３９、残基５４０、残基５４１から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つはループ９中にあり、残基５６１、残基５６２、残基５６３、残基５６４から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ８中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙから選択される。特定の実施形態では、２個以上の（２、３、４個）アミノ酸置換はループ９中にあり、残基５６１、残基５６２、残基５６３、残基５６４から選択される。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩループ９中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、およびＡ５６１Ｙから選択される。

さらに例えばＨＳＡドメインＩＩＩループの長さを増大、または低下させるドメインＩＩＩ中の挿入または欠失も検討された。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ２の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ３の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ６の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、へリックス７の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ７の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、へリックス８の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ８の長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ９の長さを変化させる。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、少なくとも２つのループおよび／またはへリックスの長さを変化させる。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、少なくとも３つのループおよび／またはへリックスの長さを変化させる。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、少なくとも４つのループおよび／またはへリックスの長さを変化させる。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ループ２、３、６、７、８、および９、およびへリックス７および８からなる群から選択される、少なくとも５つのループおよび／またはへリックスの長さを変化させる。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記挿入または欠失は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２、３、６、７、８、および９のそれぞれの長さを変化させる。複数ループおよび／またはへリックスが変化する場合、本開示は、１つまたは複数のループ／へリックスが、挿入によって増大してもよく、１つまたは複数のループ／へリックスが欠失によって減少してもよいように、ループおよび／またはへリックスが独立して変化することを想定することに留意されたい。

ドメインＩＩＩがアミノ酸の挿入または欠失を含む実施形態では、本開示は、１つのアミノ酸の挿入または欠失を想定する。２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸など、２個以上のアミノ酸の挿入または欠失もまた検討される。特定の実施形態では、本開示は、１０〜２０、２０〜４０、４０〜５０、５０〜１００個のアミノ酸など、１０個を超えるアミノ酸残基の挿入を想定する。本開示のキメラポリペプチドおよびＨＳＡ変種ポリペプチドで一貫して、挿入または欠失を含む組成物が試験され、それらがＦｃＲｎ結合活性を保持することが確認される。好ましい組成物は、対照と比較して改善された、ＦｃＲｎ結合および／または血清半減期を提供する組成物である。

明確さの目的で、本開示は、具体的に、前述のまたは以下の態様および実施形態のいずれかの組み合わせを想定する。ＨＳＡ部分を含んでなるキメラポリペプチドの文脈で、ならびにＨＳＡ部分を含んでなる変種ＨＳＡポリペプチドの文脈で、このようなＨＳＡ部分は、ドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合部分を含んでなる。さらに本明細書に記載されるように、ＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分のドメインＩＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のアミノ酸置換を含む。例示的なアミノ酸置換としては、（ｉ）アラニンによる置換；（ｉｉ）保存的アミノ酸置換；（ｉｉｉ）非保存的アミノ酸置換が挙げられる。本開示は、所与のポリペプチドのドメインＩＩＩ中の全てのアミノ酸置換が、これらのアミノ酸置換カテゴリーの１つの構成員であってもよいことが想定され、また所与のポリペプチドのドメインＩＩＩ中の各アミノ酸置換が、個々に独立してこれらのカテゴリーから選択されてもよいことも想定される。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の天然システイン残基は保持されて置換されない。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の天然プロリン残基は保持されて置換されない。特定の実施形態では、ドメインＩＩＩ中の天然システイン残基および天然プロリン残基は保持されて置換されない。特定の実施形態では、システイン残基は置換されない（例えばシステインは天然残基を置換するのに使用されない）。特定の実施形態では、プロリン残基は置換されない（例えばプロリンは天然残基を置換するのに使用されない）。別の実施形態では、２０個のアミノ酸のいずれか１つを使用して、所与の天然残基を置換する。

前述のアミノ酸置換クラスの任意の組み合わせを含んでなる、ＨＳＡ変種およびキメラポリペプチドもまた検討される。

本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一配列のアミノ酸を含んでなる、ＨＳＡ部分がある変種およびキメラポリペプチドを包含する。本明細書に記載される配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含んでなる配列が挙げられる。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸と類似した化学および／または物理特性（例えば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸による、第１のアミノ酸の置換を指す。保存的アミノ酸置換としては、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およいグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、ＳおよびＴの各群内における、別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換が挙げられる。

特定の実施形態では、前記ＨＳＡ変種ポリペプチドは実質的に精製されている。特定の実施形態では、前記キメラポリペプチドは実質的に精製されている。特定の態様では、本開示は、本開示のＨＳＡ変種またはキメラポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は無菌組成物である。特定の実施形態では、組成物は非発熱性である。

６．４コンビナトリアルドメインＩＩＩ変異体
本発明は、ドメインＩＩＩを含んでなるＨＳＡ部分のコンビナトリアル変異体セット、ならびにトランケーション変異体を作り出すことをさらに想定し、生物活性変種配列を同定するのに特に有用である。天然ＨＳＡポリペプチドと比較して選択的効力を有する、コンビナトリアルケミストリー由来変種を生成し得る。同様に、変異誘発は、対応する野生型ＨＳＡポリペプチドと劇的に異なる、細胞内半減期を有する変種を生成し得る。例えは変性タンパク質は、対象タンパク質の破壊か、そうでなければ不活性化をもたらす、タンパク質分解またはその他の細胞プロセスに対して、より安定またはより不安定のいずれかにし得る。このような変異を利用してそれらの半減期を調節することで、ＨＳＡポリペプチドレベルを変化させ得る。例えば縮重オリゴヌクレオチド配列から、可能なＨＳＡ変種配列のライブラリーを作成し得る、多数の様式がある。自動ＤＮＡ合成機内で縮重遺伝子配列の化学合成を実施し、次に発現のために、合成遺伝子を適切な遺伝子にライゲートし得る。遺伝子の縮重セットの目的は、可能なポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列を全て、１つの混合物中に提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成については、当該技術分野で周知である（例えばＮａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ．，（１９８１）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄＣｌｅｖｅｌａｎｄＳｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧＷａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ．，（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅｅｔａｌ．，（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。このような技術は、その他のタンパク質の指向性進化において用いられている（例えばＳｃｏｔｔｅｔａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳＵＳＡ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎｅｔａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａｅｔａｌ．，（１９９０）ＰＮＡＳＵＳＡ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，１９８，３４６号明細書、および米国特許第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。

代案としては、その他の変異誘発形態を利用して、コンビナトリアルライブラリーを作成し得る。例えば以下を使用して、ＨＳＡポリペプチド変種を生成し、ライブラリーをスクリーニングして単離し得る：アラニンスキャニング変異誘発（Ｒｕｆｅｔａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔｅｔａｌ．，（１９９３）Ｇｅｎｅ１３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇｅｔａｌ．，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａｅｔａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎｅｔａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｔａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎｅｔａｌ．，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔａｌ．，（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３１６）；ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇｅｔａｌ．，（１９８９）ＭｅｔｈｏｄＣｅｌｌＭｏｌＢｉｏｌ１：１１−１９）；または化学変異誘発をはじめとするランダム変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９９２）ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒｅｔａｌ．，（１９９４）ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＭｏｌＢｉｏｌ７：３２−３４）。特にコンビナトリアル状況における、リンカースキャニング変異誘発は、ＨＳＡポリペプチドのトランケート型（生物活性）形態を同定する魅力的な方法である。ＨＳＡポリペプチド変種のライブラリーを作り出してスクリーニングする追加的な方法が本明細書で提供され、例えば「例証」と題された第８節を参照されたい。特にコンビナトリアルＨＳＡドメインＩＩＩ変異体ライブラリーの作成およびスクリーニングで有用な、特定の方法のための第８．１０節および第８．１１節。

本開示のポリペプチド中のアミノ酸置換について上述した実施形態のいずれかを使用して、ペプチドライブラリーを作成してもよい。特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種が、ＨＳＡドメインＩＩＩの残基中で生成される。特定の実施形態では、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含んでなるトランケート型ＨＳＡまたはキメラポリペプチドの文脈の１つ以上の文脈で、ドメインＩＩＩ変異が導入されてスクリーニングされる。特定の実施形態では、出発ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎ親和性増大および血清半減期増大の片方または双方を有する変種について、ペプチドのライブラリーをスクリーニングする。特定の実施形態では、変種は、本出願に記載される標準生体外アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を使用して評価される。特定の実施形態では、ＦｃＲｎ親和性改善を示す変種が同定される。別の実施形態では、変種をスクリーニングして、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨ（例えばおよそ５．５のｐＨ）のみで起きて、中性ｐＨ（例えばおよそ７．４のｐＨ）で起きないかどうかが判定される。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来の変種は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかに、少なくとも２個のアミノ酸置換を含んでなる。残基４０７、残基４１５、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２６、残基５２７、および残基５５７。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、以下からなる群から選択される少なくとも２個のアミノ酸置換を含んでなる：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｆ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｉ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｄ５１２Ｍ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、およびＴ５５７Ｇ。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来の変種は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置における、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（ｌ）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；（ｑ）残基５４１および５６１；（ｒ）残基４６３および５２３；（ｓ）残基５０８および５２３；（ｔ）残基５０８および５２４；（ｕ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｖ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｗ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｙ）残基４６３および５２４；（ｚ）残基５２３および５２４；および（ａａ）残基４６３、５２３、および５２４。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来の変種は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、（ａ）残基４６３および５０８；（ｂ）残基４６３および５２３；（ｃ）残基５０８および５２３；（ｄ）残基５０８および５２４；（ｅ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｆ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｇ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｈ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｉ）残基４６３および５２３；および（ｊ）残基５２３および５２４からなる群から選択される位置における、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなり、残基４６３における置換は、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑから選択され；残基５０８における置換は、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓから選択され；残基５２３における置換は、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙから選択され；および残基５２４における置換は、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖから選択される。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来の変種は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、（ａ）残基４６３および５２４；（ｂ）残基５０８および５２３；（ｃ）残基５０８および５２４；（ｄ）残基４６３、５０８、および５２３からなる群から選択される位置における、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなり、残基４６３における置換は、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑから選択され；残基５０８における置換は、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓから選択され；残基５２３における置換は、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙから選択され；および残基５２４における置換は、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖから選択される。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩ中に含んでなる：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（ｊ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｖ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｗ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｘ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｙ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｚ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ａａ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩ中に含んでなる：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｅ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｆ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｇ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩ中に含んでなる：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５０８Ｒ；（ｂ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｄ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は配列番号１８を含んでなり、その中でＸ_１はロイシンでなく、および／またはＸ_２はスレオニンでなく、および／またはＸ_３はイソロイシンでなく、および／またはＸ_４はリジンでない。特定の実施形態では、Ｘ_１は、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、またはグルタミンであり；Ｘ_２は、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リジン、アルギニン、またはセリンであり；Ｘ_３は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンであり；およびＸ_４は、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、スレオニン、またはバリンである。別の実施形態では、Ｘ_１はフェニルアラニンまたはアスパラギンであり；Ｘ_２はアルギニンまたはセリンであり；Ｘ_３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン、リジン、またはアルギニンであり；および／またはＸ_４がロイシンである。なおも別の実施形態では、Ｘ_１はアスパラギンであり、および／またはＸ_２はアルギニンであり、および／またはＸ_３はグリシンであり、および／またはＸ_４はロイシンである。

特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、複数種を越えて保存された残基中で生成される。特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、表面接近可能な残基中で生成される。特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基中で生成される。特定の実施形態では、コンビナトリアルケミストリー由来変種は、複数種を越えて保存されているが、ニワトリＨＳＡ中では保存されていない、残基中で生成される。

特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれは、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれは独立して、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。

特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれは、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれは独立して、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存され、ニワトリからの血清アルブミン中では保存されない、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。

特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれは、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれは独立して、表面接近可能な残基である、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。

特定の態様では、本開示は、複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーを提供し、前記複数のポリペプチドのそれぞれは、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれは独立して、（ｉ）表面接近可能であり、また（ｉｉ）ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存されてもいる、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。

特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、前記表面接近可能な残基は、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある：残基３９２、残基３９９、残基４０３、残基４１１、残基４１２、残基４１４、残基４１６、残基４１８、残基４２０、残基４２３、残基４３４、残基４３７、残基４３８、残基４４５、残基４４８、残基４５０、残基４５３、残基４６１、残基４７６、残基４７７、残基４８４、残基４８５、残基４８７、残基４８８、残基４９４、残基４９７、残基５０７、残基５０９、残基５１４、残基５２９、残基５３４、残基５３７、残基５４０、残基５５１、残基５５８、残基５５９、残基５６７、残基５６８、残基５７２。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換の少なくとも１つは、完全長成熟ＨＳＡドメインＩＩＩ中の位置に対応して番号付けされる以下の位置のいずれかにある：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、残基５７６。

特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つを含んでなるＨＡＳドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にあり、ループ２中にないＨＳＡドメインＩＩＩの１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中に含んでなり、ループ３中にないＨＳＡドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的な置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中に含んでなり、ループ６中にないＨＳＡドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中に含んでなり、へリックス７中にないＨＳＡドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中に含んでなり、ループ７中にないドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中に含んでなり、へリックス８中にないＨＳＡドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、少なくとも１つのアミノ酸置換をＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中に含んでなり、ループ８中にないＨＳＡドメインＩＩＩ中に、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、ＨＳＡドメインＩＩＩ中に少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなり、ループ９中にないＨＳＡドメインＩＩＩに、１つまたは複数の追加的なアミノ酸置換をさらに含む。

前述の特定の実施形態では、または以下の態様または実施形態のいずれかでは、アミノ酸置換は、残基のアラニンへの変化であってもよい。前述のいずれかの特定の実施形態では、または以下の態様または実施形態では、アミノ酸置換は、残基が同様の電荷およびその他の特性の残基で置換されている、保存的アミノ酸置換であってもよい。前述のいずれかの特定の実施形態では、または以下の態様または実施形態では、アミノ酸置換は、残基が、同様の電荷またはその他の特性を有しない残基で置換されている、非保存的アミノ酸置換であってもよい。前述の特定の実施形態では、または以下の態様または実施形態のいずれかでは、アミノ酸置換は、残基のその他の任意の残基への変化であってもよい。ＨＳＡ部分が２個以上のアミノ酸残基を含む場合、置換は、前述のアミノ酸置換カテゴリーの任意の１つまたは任意の組み合わせに分類されもよいことが検討される。例えば全ての置換は、アラニンへの変化であってもよく、または保存的アミノ酸置換であってもよく、または非保存的アミノ酸置換であってもよい。代案としては、アミノ酸置換は、例えば、１つのアラニンへの変化、１つの保存的アミノ酸置換、および１つの非保存的アミノ酸置換などの任意の組み合わせを含んでもよい。

点変異およびトランケーションによって作成された、コンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、さらに言えば、一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範囲に及ぶ技術が、当該技術分野で公知である。このような技術は、概して、ＨＳＡポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって作成された遺伝子ライブラリーの急速なスクリーニングのために、応用できる。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く利用されている技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローンするステップと、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換するステップと、所望の活性の検出がその生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下において、コンビナトリアル遺伝子を発現するステップとを含んでなる。後述する例証的アッセイのそれぞれは、コンビナトリアル変異誘発技術によって生成される多数の縮重配列のスクリーニングに必要なハイスループット分析を受け入れやすい。

特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドは、ペプチドとペプチド模倣薬を含んでもよい。本明細書の用法では、「ペプチド模倣薬」という用語は、非天然アミノ酸、ペプトイドなどを含有する、化学修飾ペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチド模倣薬は、ペプチドと比べて、対象への投与時の改善された安定性をはじめとする、様々な利点を提供する。ペプチド模倣薬を同定する方法は、当該技術分野で周知であり、可能なペプチド模倣薬のライブラリーを含有するデータベースのスクリーニングが挙げられる。例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＤａｔａｂａｓｅは、既知の結晶構造を有する３００，０００を超える化合物のコレクションを含有する（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＳｅｃｔｉｏｎＢ，３５：２３３１（１９７９））。利用できる標的分子の結晶構造がない場合、例えばプログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成し得る。別のデータベースＡｖａｉｌａｂｌｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＤｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｓｉｇｎＬｉｍｉｔｅｄ，ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓＳｙｓｔｅｍｓ；ＳａｎＬｅａｎｄｒｏＣａｌｉｆ．）は、市販される約１００，０００個の化合物を含有し、ＨＳＡポリペプチドの可能なペプチド模倣薬を検索して同定し得る。

特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含んでなってもよい。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボース化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖付加または疎水性基付加が挙げられる。その結果、修飾ＨＳＡポリペプチドは、脂質、多糖類または単糖類、およびリン酸などの非アミノ酸要素を含有してもよい。このような非アミノ酸要素のＨＳＡポリペプチドの機能性に対する影響は、例えばそのＦｃＲｎ結合能力などのその生物学的活性について試験されてもよい。天然ＨＳＡポリペプチドがグリコシル化され得ることを前提として、特定の実施形態では、本開示に従ったキメラポリペプチドで使用されるＨＳＡポリペプチドは、グリコシル化される。特定の実施形態では、グリコシル化のレベルおよびパターンは、天然ＨＳＡポリペプチドと同一であり、または実質的に同一である。別の実施形態では、グリコシル化のレベルおよび／またはパターンは、天然ＨＳＡポリペプチドと異なる（例えば過小グリコシル化、過剰グリコシル化、非グリコシル化）。

本発明の特定の実施形態では、ＨＳＡ部分（例えばＨＳＡ変種またはキメラポリペプチド）を含んでなるポリペプチドは、非タンパク質作用物質と結合してもよい。このような非タンパク質作用物質としては、核酸分子、化学薬剤、有機分子などが挙げられるが、これに限定されるものではなく、そのそれぞれが例えば天然物スクリーニングなどの天然起源に由来してもよく、または化学的に合成されてもよい。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、非タンパク質作用物質と化学的に結合している。

本発明の特定の一実施形態では、ＨＳＡポリペプチドは、非タンパク性ポリマーによって修飾されてもよい。特定の一実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；米国特許第４，４９６，６８９号明細書；米国特許第４，３０１，１４４号明細書；米国特許第４，６７０，４１７号明細書；米国特許第４，７９１，１９２号明細書または米国特許第４，１７９，３３７号明細書に記載されるようなポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは良く知られている水溶性ポリマーであり、それは市販され、または当該技術分野で周知の方法に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製し得る（ＳａｎｄｌｅｒａｎｄＫａｒｏ，ＰｏｌｙｍｅｒＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ１３８−１６１）。

特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドの断片または変種は、好ましくは、天然ＨＳＡポリペプチドに付随する生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持する。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドの断片または変種は、天然タンパク質の半減期と比較して、改善された半減期（ｔ_１／２）を有する。半減期が改善された実施形態では、ＨＳＡ断片または変種の半減期は、天然ＨＳＡタンパク質の半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、または１０００％にさえ至って改善される。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、緩衝食塩水中または血清中などの生体外で測定される。別の実施形態では、タンパク質の半減期は、動物の血清またはその他の体液中のタンパク質の半減期などの生体内半減期である。

特定の態様では、ＨＳＡ部分を含んでなるポリペプチドは、融合タンパク質であってもよく、それは１つまたは複数の融合ドメインをさらに含んでなる。このような融合ドメインの周知の例としては、特に親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に有用である、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。親和性精製の目的で、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−またはコバルト−共役樹脂などの親和性クロマトグラフィーのための妥当なマトリックスが使用される。融合ドメインはまた、それに対する特異的抗体が入手できる、通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」も含む。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手できる、周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。場合によっては、融合ドメインは、Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有して、それは妥当なプロテアーゼが、融合タンパク質を部分的に消化できるようにし、それによって組換えタンパク質をそれから遊離させる。次に引き続くクロマトグラフ分離によって、遊離タンパク質を融合ドメインから単離し得る。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドは、ポリペプチドを安定化できる、１つまたは複数の修飾を含有してもよい。例えばこのような修飾は、ポリペプチドの生体外半減期を増大させ、ポリペプチドの循環半減期を増大させ、またポリペプチドのタンパク質分解を低下させる。同様に、キメラポリペプチドの文脈で、前述の修飾タイプは、それに加えて、または代案として、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分に付加されてもよい。

いくつかの実施形態では、ＨＳＡ部分を含んでなるポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域の全部または一部がある融合タンパク質であってもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃＲｎ結合領域またはその断片を含んでなる。同様に特定の実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ領域の全部または一部をリンカーとして使用して、異種タンパク質のＨＳＡ部分に連結させ得る。既知のように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５つのドメインを含んでなる。ドメインは、順次、次のように命名される：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラス間で交雑相同性を有し、例えばＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと、およびＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同的である。本明細書の用法では、「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部のカルボキシル末端部分を意味すると理解される。例えば免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含んでなってもよい。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含んでなり、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。一実施形態では、それに重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３、または４）である。免疫グロブリンのその他のクラスＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用してもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号明細書、および米国特許第５，７２６，０４４号明細書で詳細に考察される。特定の結果を達成するための、特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該技術分野の技術レベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくはＦｃγのヒンジドメインの少なくとも一部、および好ましくはＣＨ_３ドメインの少なくとも一部、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのいずれかの中の相同ドメインを含んでなる。さらに免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本発明の実施に有用であってもよいことが検討される。一例は、Ｆｃ受容体への親和性が低下しているＦｃ変種をもたらす、上部ＣＨ２領域へのアミノ酸置換の導入である（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学技術を使用して、このような構築物を調製し得る。同様にキメラポリペプチドの文脈で、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分に、それに加えて、または代案として、前述の修飾タイプが付加されてもよい。

特定の態様では、ＨＳＡポリペプチドは、スキャフォールドであってもよい。特定の実施形態では、標的に特異的に結合し得るタンパク質フレームワークを選択またはデザインするために、タンパク質が使用される。スキャフォールドからタンパク質をデザインする際、フレームワークの好ましい特性に重要なアミノ酸残基が保持される一方で、その他の残基は変動してもよい。特定の実施形態では、スキャフォールドは、異なる特性を有するタンパク質誘導体間で変動する５０％以下のアミノ酸残基と、このような誘導体間で不変の５０％以上の残基とを有してもよい。特定の実施形態では、スキャフォールドは、異なる特性を有するタンパク質誘導体間で変動する、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の残基と、このような誘導体間で不変の４５％、４０％、３５、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下のアミノ酸残基とを有してもよい。特定の実施形態では、スキャフォールドは、異なる特性を有するタンパク質誘導体間で変動する、４５％、４０％、３５、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以上のアミノ酸残基と、このような誘導体間で不変の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下の残基とを有してもよい。特定の実施形態では、これらの不変残基は、それらの特性にかかわらず、全ての変種ドメインに同じ全体的三次元折り畳みをもたらす。特定の実施形態では、本開示のその他の態様および実施形態で考察されるように、ＨＳＡポリペプチドスキャフォールドは、修飾または置換されてもよい。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドスキャフォールドは、治療薬であってもよい。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドスキャフォールドは、標的に対して作動性であってもよい。特定の実施形態では、ＨＳＡポリペプチドスキャフォールドは、標的に対して拮抗性であってもよい。

６．５キメラポリペプチド
本開示のＨＳＡ変種ポリペプチドをはじめとするＨＳＡ部分を含んでなるポリペプチドは、任意の異種タンパク質と結合してもよい。特定の実施形態では、異種タンパク質は治療薬である。特定の実施形態では、治療薬は抗体またはペプチドである。特定の実施形態では、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分は、抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域をさらに含んでなる。特定の実施形態では、異種タンパク質は、非抗体治療用タンパク質を含んでなる。特定の実施形態では、キメラポリペプチドの異種タンパク質部分は、増殖因子またはサイトカインを含んでなる。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、エピトープをさらに含んでなる。例えば検出および／または精製に有用なエピトープ（例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなど）。

特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、異種タンパク質と化学的に結合している。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、異種タンパク質と組換え的に結合している。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分と異種タンパク質の双方をコードする組換えベクターを使用して生成される。

特定の実施形態では、ＨＳＡ変種は、原核生物または真核細胞中で生成される。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、原核生物または真核細胞中で生成される。特定の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から選択される。

本発明のキメラポリペプチドは、様々な様式で作られる。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分のＣ末端は、異種タンパク質（例えば抗体または治療用ペプチド）のＮ末端に連結し得る。代案としては、異種タンパク質（例えば抗体または治療用ペプチド）のＣ末端が、ＨＳＡ部分のＮ末端に連結し得る。特定の実施形態では、ＨＳＡ部分は、異種タンパク質の内部アミノ酸と結合している。特定の実施形態では、可能な立体配置は、必要に応じて抗体の重鎖および軽鎖配列のトランケート部分の使用を含んで、付着ＨＳＡ部分および／または付着異種タンパク質の機能的統合性を維持する。特定のその他の実施形態では、ＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片、およびＨＳＡドメインＩ、またはＨＳＡドメインＩＩ、またはＨＳＡドメインＩおよびＩＩの少なくとも一部を含んでなる。さらになおも、異種タンパク質は、ＨＳＡ部分またはその変種の露出内部（非末端）残基に連結し得る。さらなる実施形態では、ＨＳＡ−異種タンパク質立体配置の任意の組み合わせを用い得て、それによって１：１を超えるＨＳＡ：異種タンパク質比がもたらされる（例えば１つの異種タンパク質に対して２つのＨＳＡ分子）。

ＨＳＡ部分と異種タンパク質は、互いに直接結合してもよい。代案としては、それらは、各ドメインがその二次および三次構造に適切に折り畳まれることを確実にするのに十分な距離に、ＨＳＡ部分と異種タンパク質とを隔てるリンカー配列を介して互いに連結してもよい。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。好ましいリンカーは、（１）可撓性の伸長コンフォメーションを取るべきであり、（２）ＨＳＡポリペプチドまたは異種タンパク質の機能ドメインと相互作用し得る、規則正しい二次構造を生じる性向を示してはならず、（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進し得る、疎水性または荷電特徴が最小であるべきである。

特定の実施形態では、リンカー長さは、少なくとも８０オングストローム（Å）、または少なくとも１００Å、または少なくとも１２０Å、または少なくとも１４０Å、または少なくとも１６０Å、または少なくとも１８０Å、または少なくとも２００Åである。特定の実施形態では、リンカー長さは、約８０Å〜約２００Å、または約１００Å〜約１８０Å、または約１２０Å〜約１６０Åである。

特定の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。特定の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーであり、ペプチドリンカーは、以下の特性の１つまたは複数を有する：ａ）それは異種タンパク質配列とＨＳＡ部分が互いに回転できるようにする；ｂ）それはプロテアーゼ消化に対する耐性を示し；ｃ）それは異種タンパク質配列またはＨＳＡ部分と相互作用しない。可撓性のタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒが挙げられる。Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列についての上の基準を満たすことが予期される。ＴｈｒおよびＡｌａなどのその他のほぼ中性のアミノ酸もまた、リンカー配列中で使用し得る。特定の実施形態では、ペプチドリンカー中の各アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、およびＡｌａからなる群から選択される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒ要素を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは１つまたは複数のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を含んでなる。特定の実施形態では、リンカーは１、２、３、４、５、６または７個のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を含む。特定の実施形態では、約２０個のアミノ酸のリンカー配列長を使用して、機能性タンパク質ドメインの適切な隔たりを提供し得るが、より長いまたはより短いリンカー配列もまた使用してもよい。ＨＳＡポリペプチドと異種タンパク質を隔てるリンカー配列の長さは、５〜５００アミノ酸長、より好ましくは５〜１００アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、約５〜６０または約５〜３０のアミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカー配列は、約５〜約２０個のアミノ酸、有利には約１０〜約３０個のアミノ酸である。別の実施形態では、ＨＳＡ部分と異種タンパク質を連結するリンカーは、抗体（例えば抗体のＦｃ領域全部または一部）の定常領域であり得る。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。

特定の実施形態では、本発明のキメラポリペプチドは、良く知られている架橋試薬とプロトコルを使用して生成し得る。例えば当業者に知られている、異種タンパク質（例えば抗体）によるＨＳＡポリペプチドの架橋に有用な多数の化学的架橋剤がある。例えば架橋剤は、分子を段階的様式で連結するのに使用し得る、ヘテロ二機能性架橋剤である。ヘテロ二機能性架橋剤は、タンパク質を結合させるためのより特異的な共役法をデザインする能力を提供し、それによってホモタンパク質ポリマーなどの望まれない副反応の発生を低下させる。スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ｔｏｌｕｎｅ）（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）をはじめとする、多種多様なヘテロ二機能性架橋剤が当該技術分野で公知である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、概してより大きな水溶性を有する、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドアナログとして得られる。さらに生体内におけるリンカー切断量を低下させるように、アルキル誘導体の代わりに、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤を合成し得る。ヘテロ二機能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性および光反応性架橋剤をはじめとする、いくつかのその他の架橋剤が存在する。スベリン酸ジスクシンイミジル（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、およびジメチルピメルイミド酸・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）が、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）が、本発明で使用される有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質共役技術の最近のレビューについては、本明細書で参照によって援用する、Ｍｅａｎｓｅｔａｌ．（１９９０）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１：２−１２を参照されたい。

上に含まれる、特に有用なヘテロ二機能性架橋剤の１つのクラスは、一級アミン反応基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性アナログ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含有する。アルカリｐＨでは一級アミン（リジンε基）はプロトン化されず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに対する求核攻撃によって反応する。この反応は、アミド結合の形成、および副産物としてのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの放出をもたらす。ヘテロ二機能性架橋剤の一部として有用な別の反応基は、チオール反応基である。一般的チオール反応基としては、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、わずかに酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）条件下で、遊離スルフヒドリル（システイン残基）と分単位で特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理学的ｐＨにおいて−ＳＨ基と反応する。これらの反応基は、どちらも安定したチオエーテル結合の形成をもたらす。ヘテロ二機能性架橋剤の第３の構成要素は、スペーサーアームまたは架橋である。架橋は、２つの反応性末端を結合する構造である。架橋の最も明白な属性は、立体障害に対するその影響である。場合によっては、より長い架橋は、２つの複雑な生体分子を連結するのに必要な距離に、より容易に広がり得る。

ヘテロ二機能性試薬を使用したタンパク質複合体の調製は、アミン反応およびスルフヒドリル反応を伴う二段法である。第一段階であるアミン反応では、選択されたタンパク質は一級アミンを含有すべきである。これは、ほとんどのタンパク質のＮ末端に見られる、リジンεアミンまたは一級αアミンであり得る。タンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含有してはならない。結合する双方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含有する場合、例えばＮ−エチルマレイミドを使用して、全てのスルフヒドリルが、ブロックされるように、片方のタンパク質を修飾し得る（本明細書で参照によって援用する、Ｐａｒｔｉｓｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を使用して、特定タンパク質中のスルフヒドリルの量を計算し得る（例えば本明細書で参照によって援用する、Ｅｌｌｍａｎｅｔａｌ．（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３およびＲｉｄｄｌｅｓｅｔａｌ．（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５を参照されたい）。

特定の実施形態では、本発明のキメラポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔＧ．Ａ．（ｅｄ．），ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ：ＡＵｓｅｒ’ｓＧｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）に記載されるものなどの標準タンパク質化学技術を使用して生成し得る。これに加えて、自動ペプチド合成機が市販される（例えばＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈＭｏｄｅｌ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）。ＨＳＡを異種タンパク質に化学的に結合させる、前述の架橋方法のいずれにおいても、切断可能なドメインまたは切断可能なリンカーを使用し得る。切断は、異種タンパク質とＨＳＡポリペプチドとを分離できるようにする。例えばキメラポリペプチドの細胞への侵入に続く、切断可能なリンカーの切断は、ＨＳＡを異種タンパク質から分離できるようにする。

特定の実施形態では、本発明のキメラポリペプチドは、連続ポリペプチド鎖として発現される、ＨＳＡ部分と異種タンパク質（例えば抗体または治療用ペプチド）とを含有する、融合タンパク質として生成し得る。このようなキメラポリペプチドは、本明細書で組換え的に結合すると言及される。このような融合タンパク質の調製では、ＨＳＡ部分と異種タンパク質とをコードする核酸、および任意選択的にＨＳＡ部分と異種タンパク質に広がるペプチドリンカー配列を含んでなる、融合遺伝子が構築される。翻訳生成物が所望の融合タンパク質である、融合遺伝子を生成するための組換えＤＮＡ技術の使用については、当該技術分野で公知である。遺伝子のコード配列およびその調節領域のどちらも再デザインして、タンパク質生成物の機能特性、タンパク質生成量、またはその中でタンパク質が生成される細胞型を変化させ得る。遺伝子のコード配列は、例えばその一部を異なる遺伝子のコード配列に融合させ、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を生成することにより、大幅に変化させ得る。融合タンパク質を生成する方法の例については、本明細書で参照によって援用する、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７号明細書、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５号明細書、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３９：６８に記載される。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じた付着端充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いて、従来の技術に従って実施される。代案としては、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成され得る。別の方法では、２つの連続的遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施し得て、それを引き続いてアニールして、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。融合遺伝子によってコードされるキメラポリペプチドは、当該技術分野で周知のように、様々な発現系を使用して組換え的に生成してもよい（下記もまた参照）。

組換え的に結合しているキメラポリペプチドとしては、その中でＨＳＡ部分が異種タンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合している、実施形態が挙げられる。

いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号明細書に記載されるように、キメラポリペプチドに広がる接合部領域内の候補Ｔ細胞エピトープを同定して、接合部領域内のアミノ酸を変化させることで、キメラポリペプチドの免疫原性を低下させてもよい。

キメラタンパク質という用語は、これらの部分がどのように相互連結されるか（例えば化学的結合、組換え的結合）に関係なく、（ＨＳＡ変種ポリペプチドなどの）ＨＳＡ部分と異種タンパク質とを含んでなる、タンパク質を指すのに使用される。したがってキメラタンパク質、融合タンパク質、および複合タンパク質という用語は、同義的に使用される。

異種タンパク質の例示的なカテゴリーとしては、酵素、増殖因子、およびサイトカインが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、異種タンパク質は抗体である。

ＨＳＡ部分を含んでなるキメラポリペプチドで使用される異種タンパク質は、増殖因子、酵素、骨形成タンパク質、および可溶性受容体断片などの治療用タンパク質、またはその断片であってもよい。例示的な異種ポリペプチドとしては、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ；ＥＧＦファミリー増殖因子構成員）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ＦＧＦファミリー増殖因子構成員）、形質転換増殖因子（例えばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；例えばＶＥＧＦ−２）などの増殖因子；インターフェロン（例えばＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β）；インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２）；サイトカイン；およびインシュリンが挙げられる。その他の例示的な異種タンパク質としては、酵素が挙げられる。その他の例示的な異種ポリペプチドとしては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ；ＢＭＰタンパク質ファミリー構成員）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ミオスタチン、および腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−α）が挙げられる。その他の例示的な異種ポリペプチドとしては、細胞受容体の任意の天然細胞外ドメインをはじめとする、膜貫通受容体の細胞外ドメイン、ならびに（変異体、断片およびペプチド模倣形態をはじめとする）その任意の変種が挙げられる。

ＨＳＡ部分を含んでなるキメラポリペプチド中で使用される異種タンパク質は、抗体またはその抗原結合部分をはじめとする、治療用タンパク質、またはその断片であってもよい。例示的な抗体および抗体断片としては、ヒュミラ（登録商標）、レミケード（登録商標）、シンポニー（登録商標）、リツキサン（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、アバスチン（登録商標）、アービタックス（登録商標）；シナジス（登録商標）、マイロターグ（登録商標）、キャンパス（登録商標）、セラＣＩＭ（登録商標）、ベクティビックス（登録商標）、タイサブリ（登録商標）、レオプロ（登録商標）、ルセンティス（登録商標）、シムジア（登録商標）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

６．６ＨＳＡ関連核酸および発現
特定の態様では、本開示は、本開示のポリペプチド（例えばＨＳＡ変種、ＨＳＡ部分のあるキメラポリペプチド）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸構築物を提供する。さらに本発明は、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチド（例えばそれらの生物活性断片、変種、および融合物をはじめとするＨＳＡ部分）を生成するために、このような核酸を利用する。ある特定の実施形態では、本発明の組換えキメラタンパク質を生成するために、核酸は、異種タンパク質（例えば抗体または治療用ペプチド）をコードするＤＮＡをさらに含んでなってもよい。これらの核酸は全て、集合的にＨＳＡ核酸と称される。

特定の態様では、本開示は、（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物を提供し、そのＨＳＡ部分は、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、そのＨＳＡドメインＩＩＩは、（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、核酸構築物は異種タンパク質の機能活性を保持して、ＦｃＲｎに結合し得る、キメラポリペプチドをコードして、前記キメラポリペプチドは、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、血清半減期および／またはＦｃＲｎ親和性の増大を有する。

特定の実施形態では、核酸構築物によってコードされるキメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性で、ＦｃＲｎに結合する。特定の実施形態では、核酸構築物によってコードされるキメラポリペプチドは、前記対照キメラポリペプチドと比較して、増大した血清半減期を有する。特定の実施形態では、核酸構築物によってコードされるキメラポリペプチドは、これらの特性の双方を有する。

特定の実施形態では、（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、そのＨＳＡ部分はＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、そのＨＳＡドメインＩＩＩは１〜１８（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）個のアミノ酸置換を含んでなる。

特定の実施形態では、核酸構築物によってコードされるＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、複数種を越えて保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数種を越えて保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接近可能な残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能な残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である。

特定の実施形態では、（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％同一であるＨＳＡドメインＩＩＩをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる。特定の実施形態では、（ｉ）配列番号１と少なくとも９５％同一であるＨＳＡドメインＩＩＩをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる。特定の実施形態では、（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％同一であるＨＳＡドメインＩＩＩをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる。

特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある。特定の実施形態では、前記アミノ酸置換の少なくとも１つは、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある。

特定の実施形態では、（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、その異種タンパク質は抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる。特定の実施形態では、（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、その異種タンパク質は治療用タンパク質を含んでなる。

特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域をさらにコードする。

特定の実施形態では、（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、その異種タンパク質は増殖因子またはサイトカインを含んでなる。特定の実施形態では、核酸構築物は、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる。

核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。特定の実施形態では、本開示は、ＨＳＡ配列（例えば配列番号１および２）の同一領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＨＳＡ部分をコードする、単離または組換え核酸配列に関する。さらなる実施形態では、ＨＳＡ核酸配列は、単離、組換え、および／または異種ヌクレオチド配列との融合であり、またはＤＮＡライブラリー中にあり得る。

特定の実施形態では、ＨＳＡ核酸はまた、高度にストリンジェントな条件下で、上述の天然ＨＳＡヌクレオチド配列、またはその補体配列のいずれかとハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する、適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解するであろう。例えば約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）と、それに続く５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄のハイブリダイゼーションを実施し得る。例えば洗浄ステップの塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーより選択し得る。これに加えて、洗浄ステップの温度は、約２２℃の室温の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件に上昇させ得る。温度および塩のどちらも変動してもよく、または温度または塩濃度が一定に保たれる一方で、別の変数が変化してもよい。一実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣと、それに続く室温で２×ＳＳＣの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。

遺伝コード中の縮重のために天然ＨＳＡ核酸と異なる単離核酸もまた、本発明の範囲内である。例えばいくつかのアミノ酸は、２つ以上のトリプレットによって指定される。同一アミノ酸を指定するコドンまたは同義コドン（例えばＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異をもたらしてもよい。しかし対象タンパク質のアミノ酸配列変化をもたらすＤＮＡ配列多型性が、哺乳類細胞の間に存在することが予測される。当業者は、天然対立遺伝子の多様性のために、特定タンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（最高で約３〜５％のヌクレオチド）中のこれらの多様性が、所与の種の個体間に存在してもよいことを理解するであろう。ありとあらゆるこのようなヌクレオチドの多様性、および結果として生じるアミノ酸の多型性は、本発明の範囲内である。

特定の実施形態では、組換えＨＳＡ核酸は、発現構築物中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列と、作動可能に連結してもよい。調節ヌクレオチド配列は、発現のために使用される宿主細胞に、一般に適切である。多様な宿主細胞について、適切な発現ベクターの多数のタイプおよび適切な制御配列が、当該技術分野で公知である。典型的に、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、およびエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。当該技術分野で公知の構成的または誘導性プロモーターが、本発明によって検討される。プロモーターは、天然プロモーター、または２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであってもよい。プラスミドなどの発現構築物が、細胞中のエピソーム上に存在してもよく、または発現構築物が染色体中に挿入されてもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含有して、形質転換宿主細胞を選択できるようにする。選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。特定の態様では、本発明は、ＨＳＡポリペプチドをコードして、少なくとも１つの制御配列と作動可能に連結する、ヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターに関する。制御配列は技術分野で認められ、コードされたポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現調節因子を含む。例示的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、および／または発現が所望されるタンパク質タイプなどの要素に左右されてもよいものと理解すべきである。さらにベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意のその他のタンパク質の発現もまた、考慮すべきである。

本発明はまた、本発明のＨＳＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする組換え遺伝子で形質移入された、宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物または真核細胞であってもよい。例えばＨＳＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、（例えばバキュロウイルス発現系を使用する）昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞中で発現されてもよい。その他の適切な宿主細胞が、当業者に知られている。

本発明は、本発明のＨＳＡポリペプチド、異種タンパク質、および／またはキメラポリペプチドを生成する方法にさらに関する。例えばＨＳＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする発現ベクターで形質移入された宿主細胞が、ポリペプチドを発現できるようにする適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは分泌されて、細胞とポリペプチド含有培地との混合物から単離されてもよい。代案としては、ポリペプチドは細胞質内にまたは膜画分内に保持され、細胞が収集、溶解されて、タンパク質が単離されてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地、およびその他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は、当該技術分野で周知である。ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびポリペプチド（例えばＨＳＡポリペプチド）の特定エピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製をはじめとする、タンパク質精製のための当該技術分野で公知の技術を使用して、細胞培養液、宿主細胞、またはその双方から単離し得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する、融合タンパク質である。

組換えＨＳＡ核酸は、クローン遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）、またはその双方のいずれかの発現に適するベクター中に連結することで、生成され得る。組換えポリペプチド生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよびその他のベクターが挙げられる。例えば適切なベクターとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物細胞中での発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミドタイプのプラスミドが挙げられる。好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌中におけるベクター増殖を容易にする原核生物配列と、真核生物細胞中で発現される１つまたは複数の真核生物転写単位との双方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来ベクターが、真核生物細胞の形質移入に適する哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列により改変されて、原核生物と真核生物細胞の双方で、複製および薬剤耐性選択を容易にする。代案としては、真核生物細胞中におけるタンパク質の一過性発現のために、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を使用し得る。プラスミド調製および宿主生物形質転換で用いられる様々な方法は、当該技術分野で周知である。原核生物および真核生物細胞の双方のためのその他の適切な発現系、ならびに一般的組換え手順については、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ｅｄ．ｂｙＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ１６ａｎｄ１７を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用によって、組換えポリペプチドを発現することが望ましいことがある。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（ｓ−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が挙げられる。

融合遺伝子を生成する技術は、良く知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じた付着端充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いて、従来の技術に従って実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機をはじめとする従来の技術によって合成され得る。代案としては、２つの連続的遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施し得て、それを引き続いてアニールして、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。

６．７処置方法
特定の実施形態では、本開示は、本開示のキメラ融合物の異種タンパク質を使用して、処置可能な病的状態を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、前記タンパク質をＨＳＡ部分に結合させるステップを含んでなり、そのＨＳＡ部分が、ドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなる、対象中のタンパク質の血清半減期を増大させ、および／またはＦｃＲｎ結合親和性を増大させる方法を提供する。特定の実施形態では、ＨＳＡドメインＩＩＩは、１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、得られる対照ポリペプチドと比較して、相対的キメラポリペプチドのＦｃＲｎ親和性、および血清半減期の片方または双方を増大させる。これらの方法は、上述したようなキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの治療有効量をそれを必要とする個体に投与するステップを伴う。特定の実施形態では、方法は、（ａ）ＨＳＡ部分またはその生物活性断片と、（ｂ）異種タンパク質とを含んでなる、キメラポリペプチドを投与するステップを含んでなる。これらの方法は、特に動物、およびより具体的にはヒトの治療的および予防的処置を目的としている。

処置し得る特定の疾患および病的状態は、キメラタンパク質の異種タンパク質部分に依存することに留意されたい。さらに本開示は、特定の疾患または病的状態の処置に適する異種タンパク質を含むキメラポリペプチドが、特定の疾患または病的状態の処置に適する１つまたは複数のその他の化合物またはその他の治療方法と共に、薬剤投与計画の一部として投与され得ることを想定する。さらに本開示は、キメラポリペプチドが、患者の年齢、体重、健康、疾患重症度などを考慮して、医学的に適切な処置と調和した様式で投与されることを想定する。

一例として、異種タンパク質がヒュミラであれば、キメラポリペプチドは、例えば関節リウマチ、乾癬、若年性関節炎、およびクローン病の処置で使用されてもよい。異種タンパク質がインシュリンであれば、キメラポリペプチドは、例えばインシュリン治療で使用されてもよい。

「処置」、「処置する」などの用語は、一般に所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために、本明細書で使用される。効果は、疾患、病的状態、またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点から予防的であってもよく、および／または疾患または病的状態、および／または疾患または病的状態に帰属される悪影響の部分的または完全治癒の観点から治療的であってもよい。「処置」は、本明細書の用法では、哺乳類、特にヒトの疾患または病的状態の任意の処置をカバーして、以下を含む：（ａ）疾患または病的状態の素因があってもよいが、なおもそれにかかっていると診断されていない対象において、疾患または病的状態が発生するのを予防する；（ｂ）疾患または病的状態を抑制する（例えばその進行抑止）；または（ｃ）疾患または病的状態を軽減する（例えば疾患または病的状態の退縮を引き起こし、１つまたは複数の症状の改善を提供する）。任意の病的状態の改善は、標準法および当該技術分野で公知の技術に従って容易に評価し得る。疾患方法によって処置される対象集団としては、望ましくない病的状態または疾患を患っている対象、ならびに病的状態または疾患を発症するリスクがある対象が挙げられる。

「治療有効用量」または「有効量」という用語は、それがそのために投与される、所望の効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処理の目的に左右され、既知の技術を使用して、当業者によって確かめられるであろう（例えばＬｌｏｙｄ（１９９９）ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。

特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、一緒に（同時）または異なる時間に（逐次）投与され得る。これに加えて、本発明のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、同一疾患または症状を処置するための１つまたは複数の追加的な化合物または治療法と組み合わせて、投与し得る。例えば１つまたは複数の治療用化合物と併せて、１つまたは複数のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを同時投与し得る。併用療法は、同時のまたは交互の投与を包含してもよい。これに加えて、組み合わせは、急性または慢性投与を包含してもよい。任意選択的に、疾患または症状の処置のために、本発明のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドと追加的な化合物が、相加的または相乗的様式で作用する。併用療法で使用される追加的な化合物としては、小型分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに併用療法はまた、その他の非薬剤治療法と共に、本明細書で開示される方法を含む。組み合わせ治療法の性質次第で、その他の治療法を投与する間に、および／またはその後に、本発明のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの投与を継続してもよい。キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの投与は、単回投与、または複数回投与で行ってもよい。場合によっては、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの投与は、その他の治療法の少なくとも数日前に開始される一方、その他の事例では、投与は、その他の治療法の直前または投与時のいずれかに開始される。

６．８投与方法
特定の実施形態では、前記対象への投与は、ＨＳＡ変種またはキメラポリペプチドを全身投与するステップを含んでなる。特定の実施形態では、前記対象への投与は、ＨＳＡ変種またはキメラポリペプチドを経口的に投与するステップを含んでなる。特定の実施形態では、前記対象への投与は、前記ＨＳＡ変種またはキメラポリペプチドを静脈内投与するステップを含んでなる。

特定の態様では、本開示は、本開示のＨＳＡ変種またはキメラポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は無菌組成物である。特定の実施形態では、組成物は非発熱性である。

例えばリポソーム内カプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスなどの様々な送達系が知られており、本開示のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを投与するのに使用し得る（例えばＷｕａｎｄＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法は、腸内；または皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻腔内、眼内、硬膜外、局所、および経口経路をはじめとするが、これに限定されるものではない非経口であり得る。特定の実施形態では、非経口導入としては、筋肉内、皮下、静脈内、血管内、および心膜内投与が挙げられる。

キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、例えば輸液またはボーラス投与、上皮層または皮膚粘膜層（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収などの任意の都合良い手段によって投与されてもよく、その他の生物学的活性作用物質と共に投与されてもよい。投与は、全身性または局所性であり得る。例えば吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤との調合物の使用によって、肺投与もまた用い得る。

特定の実施形態では、処置を必要とする領域（例えば筋肉）に、本発明のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを局所的に投与することが望ましいことがあり；これは限定を意図せず、例えば外科手術中の局所注入、例えば注射による、カテーテルの手段による、または移植片の手段による局所施用によって達成されてもよく、移植片は、シラスティック膜などの膜、繊維、または市販の皮膚代替物をはじめとする、多孔性、非多孔性、またはゼラチン質材料である。

別の実施形態では、本開示のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、小胞、特にリポソームに送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。さらに別の実施形態では、本開示のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、放出制御系中で送達され得る。別の実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、前出、を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用し得る（Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本開示のキメラまたは変種ポリペプチドは、静脈内送達され得る。

特定の実施形態では、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは静脈輸液によって投与される。特定の実施形態では、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、または少なくとも３０分間にわたって輸液される。別の実施形態では、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、少なくとも６０分間、９０分間、または１２０分間にわたって輸液される。輸液期間に関わりなく、本開示は、各輸液が、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドが一定のスケジュール（例えば毎週、毎月など）に従って投与される全治療計画の一部であることを想定する。

６．９評価方法
本開示のキメラポリペプチドは、（ｉ）異種タンパク質の機能を実質的に保持して、（ｉｉ）非修飾ＨＳＡ部分に結合したキメラポリペプチドと比較して、または別の適切な対照と比較して、ＦｃＲｎ親和性が増大し、および／または血清半減期が増大することに基づいて特徴付けられる。本開示のＨＳＡ変種ポリペプチドは、天然ＨＳＡ部分と比較して、または別の適切な対照と比較して、ＦｃＲｎ親和性が増大し、および／または血清半減期増大することに基づいて特徴付けられる。キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの特性は、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎｖｉｖｏ）の任意の１つまたは複数の適切なアッセイで評価してもよい。

一例として、例えば実施例に記載される任意の１つまたは複数のアッセイ、またはその他の結合アッセイを使用して、ＦｃＲｎ親和性（Ｋａおよび／またはＫｄ）を生体外で評価してもよい。同様に、例えば実施例に記載される任意の１つまたは複数のアッセイ、またはその他の結合アッセイを使用して、ｋ_ｏｆｆおよび／またはｋ_ｏｎを生体外で評価してもよい。

抗原と抗体間の結合の親和定数および特異性の測定は、抗ＨＳＡ抗体を使用した、治療法、診断法、および研究法の有効性を判定する際の中心要素である。「結合親和性」は、一般に、分子の単一結合部位（例えば抗体、ＨＳＡ部分）と、その結合パートナー（例えば抗原、ＦｃＲｎ）間の非共有結合の相互作用強度の合計を指す。特に断りのない限り、本明細書の用法では、「結合親和性」は、結合対構成員（例えば抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に平衡解離定数（ＫｄまたはＫ_Ｄ）によって表され、それは比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算される。例えばＣｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，（１９９９）Ｊ．ＭｏｌＢｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照されたい。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅなどの本明細書で記載され例示されるものをはじめとする、当該技術分野で公知の一般的方法によって測定し得る。低親和性抗体が、概して抗原に緩慢に結合して容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、概して抗原により急速に結合してより長く結合する傾向がある。結合親和性を測定する多様な方法は、当該技術分野で公知であり、そのいずれかを本発明の目的で使用し得る。

特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたは変種ＨＳＡポリペプチドは、対照と比較して、ほぼ１．５、２、２．５、３、４、またはほぼ５倍改善されたＦｃＲｎ親和性を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドは、対照と比較して、５倍を上回り、または１０倍さえ上回って改善された親和性を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、対照と比較して、２０、２５、４０倍を上回り、または５０倍を上回って改善された親和性を有する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、対照と比較して、ほぼ５〜１０倍、ほぼ１０〜２０倍、ほぼ２５〜４０倍、ほぼ４０〜５０倍、ほぼ５０〜７５、またはほぼ７５〜１００倍改善された親和性を有する。Ｋａの計算によって親和性を評価すると、これらの親和性改善は、Ｋａの増大（例えば上で概説されるように２倍、５倍、１０倍など）に変換される。Ｋｄの計算によって親和性を評価すると、これらの親和性改善は、Ｋｄの低下（例えば上で概説されるように２倍、５倍、１０倍など）に変換される。

特定の実施形態では、低ｐＨ（例えば約５．５のｐＨ）におけるＦｃＲｎ親和性が改善される。特定のその他の実施形態では、低ｐＨにおけるＦｃＲｎ親和性が改善され、中性ｐＨ（例えば約７．２のｐＨ）における親和性は変化しない。

さらなる例として、ヒトまたは動物モデルにおいて血清半減期を測定してもよい。（ヒトＦｃＲｎを有する遺伝子組換え動物をはじめとするが、これに限定されるものではない）任意の動物モデル中の血清半減期の増大は、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドが、対照と比較して、血清半減期増大を有すると特徴付けるのに十分である。

一実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、１０日間以上、好ましくは約１４日間以上、および最も好ましくは天然血清アルブミンタンパク質またはその相同体の半減期の５０％以上の血中半減期を有する。別の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドと比較して、ほぼ１．５、２、２．５、３、４、またはほぼ５倍増大する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドと比較して、５倍を上回り、または１０倍さえ上回って増大する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドと比較して、２０、２５、４０倍を上回り、または５０倍を上回って増大する。特定の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの半減期は、対照ポリペプチドと比較して、ほぼ５〜１０倍、ほぼ１０〜２０倍、ほぼ２５〜４０倍、ほぼ４０〜５０倍、ほぼ５０〜７５倍、またはほぼ７５〜１００倍増大する。

キメラポリペプチドが異種タンパク質の機能を実質的に保持するかどうかを評価するための適切なアッセイは、異種タンパク質とその固有の機能に左右される。しかし機能は、動物モデルをはじめとする任意の適切な生体外または生体内アッセイで、評価してもよい。例示的な機能としては、（ｉ）特定の受容体に結合する能力；（ｉｉ）特定の情報伝達経路を介したシグナル伝達を誘発または阻害する能力；（ｉｉｉ）アポトーシスを誘発または阻害する能力；（ｉｖ）血管新生を誘発または阻害する能力；（ｖ）細胞増殖を刺激または阻害する能力；（ｖｉ）細胞分化を促進または阻害する能力；（ｖｉｉ）細胞生存を促進する能力；および（ｖｉｉｉ）別のタンパク質因子の分泌を促進または阻害する能力が挙げられるが、これに限定されるものではない。

特定の実施形態では、生物学的に活性の異種タンパク質を含んでなる本開示のキメラポリペプチドは、例えばＨＳＡ部分に融合していない、生物学的に活性の異種タンパク質それ自体よりも強力である。例えばキメラポリペプチドは、生物学的に活性のタンパク質配列単独よりも、例えば１、２、または３桁にさえ至ってより高い活性など、２倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、または１０００倍にさえ至って活性が高くてもよい。したがって生物学的に活性のペプチド配列が、生物学的活性を阻害する実施形態では、キメラポリペプチドのＩＣ_５０は、生物学的に活性のタンパク質単独のＩＣ_５０よりも１０倍低く、１００倍低く、または１０００倍にさえ至ってより低くあってもよく、および生物学的に活性のタンパク質配列が、生物学的活性を誘導または促進する実施形態では、キメラポリペプチドのＥＣ_５０は、生物学的に活性のペプチド単独のＥＣ_５０よりも１０倍低く、１００倍低く、または１０００倍にさえ至ってより低くあってもよい。生物学的に活性のタンパク質配列が、核酸、ペプチド、または炭水化物などの生体分子に結合する実施形態では、キメラポリペプチドとそれが結合する生体分子の解離定数Ｋ_ｄは、生体分子と生物学的に活性のタンパク質単独のＫ_ｄよりも１０倍低く、１００倍低く、または１０００倍にさえ至ってより低くあってもよく、例えば２つの実体の結合がそれらの解離よりもいっそう支持される。

６．１０医薬組成物
特定の実施形態では、本開示の対象キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体と配合される。１つまたは複数のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、単独でまたは製剤処方（組成物）の成分として投与し得る。キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、医学または獣医学で使用するために、任意の都合良い投与方法のために配合されてもよい。ラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤；ならびに着色剤、剥離剤、コート剤、甘味剤、着香料および芳香剤、保存料および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。

対象キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチド製剤としては、経口、経鼻、局所、非経口、直腸、および／または膣内投与に適するものが挙げられる。製剤は、好都合には単位投与形態で提供されてもよく、薬学技術分野で周知の任意の方法で調製されてもよい。単回投与形態を製造するために担体材料と組み合わせ得る活性成分量は、処置される宿主と特定の投与様式次第で変動する。単回投与形態を製造するために担体材料と組み合わせ得る活性成分量は、一般に治療効果を生じる化合物量である。

特定の実施形態では、これらの製剤または組成物を調製する方法は、別のタイプの治療薬と担体、そして任意選択的に、１つまたは複数の副成分を組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、液体担体、または超微粒子固体担体、またはその双方を用いて調製され、次に必要ならば製品に整形される。

経口投与のための製剤は、それぞれ活性成分として所定量の対象ポリペプチド治療薬を含有する、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントであるフレーバー基礎原料使用）、粉末、顆粒、または水性または非水性液中の溶液または懸濁液、または水中油または油中水型液体エマルション、またはエリキシル剤またはシロップ、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤使用）、および／または口内洗浄液などの形態であってもよい。懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物などの懸濁剤を含有してもよい。

経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣丸、粉末、顆粒など）では、本発明の１つまたは複数のポリペプチド治療薬と、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかなどの１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体とが混合されてもよい：（１）デンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどのバインダー；（３）グリセロールなどの湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶液遅延剤；（６）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリンなどの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、医薬組成物は、緩衝剤もまた含んでもよい。乳糖または乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、類似タイプの固体組成物もまた、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に許容可能なエマルション、微小エマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体投薬形態は、水またはその他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有してもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香料、着色料、芳香剤、および保存料などのアジュバントを含み得る。

非経口投与に適する医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤または増粘剤を含有してもよい、１つまたは複数の薬学的に許容可能な無菌等張水性または非水性溶液、分散体、懸濁液またはエマルション、または使用直前に無菌注射液または分散体に戻されてもよい無菌粉末と組み合わさった、１つまたは複数のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを含んでなってもよい。本発明の医薬組成物中で用いられてもよい適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持される。

これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントもまた含有してもよい。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって、微生物の活動防止を確実にしてもよい。組成物に、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましいこともある。これに加えて、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の包含によって、注射用医薬製剤の持続的吸収をもたらしてもよい。

特定の実施形態では、医薬組成物をはじめとする本開示の組成物は、非発熱性である。換言すれば、特定の実施形態では、組成物は実質的に発熱物質を含有しない。一実施形態では、本発明の製剤は、実質的に内毒素および／または関連発熱性物質がない、発熱性物質を含まない製剤である。内毒素としては、微生物中に閉じ込められて、微生物が分解または死滅した場合にのみ放出される毒素が挙げられる。発熱性物質としてはまた、細菌およびその他の微生物の外膜からの発熱誘導熱安定性物質（糖タンパク質）が挙げられる。ヒトに投与した場合、これらの物質はどちらも、発熱、血圧低下、およびショックを引き起こし得る。可能な有害効果のために、少量の内毒素でさえも、静脈内投与される医薬品溶液から除去されなくてはならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬剤用途について、１時間の１期間内のキログラム体重用量あたり５内毒素単位（ＥＵ）という上限を設定している（ＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，ＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌＦｏｒｕｍ２６（１）：２２３（２０００））。抗体がそうであるように、治療用タンパク質が、１キログラムの体重あたり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、有害かつ危険な内毒素は痕跡量でさえも除去しなくてはならない。ある特定の実施形態では、組成物中の内毒素および発熱性物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、１ＥＵ／ｍｇ未満、０．１ＥＵ／ｍｇ未満、０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。

注射用デポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで、１つまたは複数のポリペプチド治療薬の微小カプセル化マトリックスを形成することで製造される。薬剤とポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質次第で、薬剤放出速度が制御され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体組織に適合するリポソームまたは微小エマルション中に薬剤を封入することによっても調製される。

特定の実施形態では、本開示のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドは、ヒトへの静脈内投与に適応された医薬組成物として、日常手順に従って配合される。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤およびリドカインなどの局所麻酔薬を含んで、注射部位の疼痛を緩和してもよい。組成物が輸液によって投与される場合、それは無菌製薬等級水または生理食塩水を含有する輸液ボトルによって、分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されてもよいように、無菌注射用水または生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。

組織関連病的状態または疾患の処置において効果的な本開示のキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドの量は、標準臨床技術によって判定し得る。これに加えて、生体外アッセイを任意選択的に用いて、最適投与量範囲の同定を助けてもよい。配合中で用いられる正確な用量はまた、投与経路および病的状態の重篤性にも左右され、施術者の判断と各対象の状況に従って決定すべきである。しかし静脈内投与のための適切な投与量範囲は、一般に体重１キログラムあたり、約２０〜５０００マイクログラムの活性キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドである。鼻腔内投与に適する投与量範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量は、生体外または動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿されてもよい。

６．１１製品およびキット
特定の実施形態では、本開示は、本開示の少なくとも１つのキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドで充填された、１つまたは複数の容器を含んでなる医薬品包装またはキットもまた提供する。特定の実施形態では、本開示の製剤は、異種タンパク質、異種ポリペプチド、異種ペプチド、大分子、小分子、マーカー配列、診断用薬または検出可能作用物質、治療成分、薬剤成分、放射性金属イオン、第２の抗体、および固体担体をはじめとするが、これに限定されるものではない別の部分と、組換え的に融合または化学的に結合する、キメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、本開示の製剤は、無菌液体として単回投与バイアルに調合される。本開示の製剤は、目標体積１．２ｍＬの３ｃｃＵＳＰＩ型ホウケイ酸褐色バイアル（ＷｅｓｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｅｒｉｃｅｓ；パーツ番号６８００−０６７５）で提供されてもよい。例示的な容器としては、バイアル、ボトル、充填済みシリンジ、ＩＶバッグ、ブリスター包装（１つまたは複数の丸薬を含んでなる）が挙げられるが、これに限定されるものではない。医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関によって規定される形式の注意書きは、このような容器に任意選択的に付随してもよく、その注意書きは、行政機関によるヒトの診断および／または投与のための製造、使用または販売認可を反映する。

特定の実施形態では、例えば治療薬の血清半減期を増大させ、またはＦｃＲｎ結合親和性を増大させるなどの様々な目的のために有用なキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを含んでなるキットもまた提供される。試薬の単離および精製のために、キットはビーズ（例えばセファロースビーズ）と共役しているポリペプチドを含有してもよい。例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいて、生体外で標的を検出および定量化するための、ポリペプチドを含有するキットが提供されてもよい。製造品と同様に、キットは、容器と、容器上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含んでなる。容器は、本開示の少なくとも１つのキメラまたはＨＳＡ変種ポリペプチドを含んでなる組成物を収容する。例えば希釈剤および緩衝液、対照診断試薬を含有する、追加的な容器が含まれてもよい。ラベルまたは添付文書が、組成物の説明、ならびに意図される生体外または診断用途のための指示を提供してもよい。

６．１２アデノウイルスベクターおよび方法
宿主細胞からの組換えアデノウイルス粒子の生成に有用なＤＮＡベクターは、当該技術分野で周知であり、市販の試薬が容易に入手できる（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのカタログ番号Ｖ４９３−２０およびＶ４９４−２０を参照されたい）。本開示は、アデノウイルス粒子の生成に有用なＤＮＡベクター中にＯｒｉＰ配列を組み込むことで、組換えアデノウイルス（本明細書中でアデノウイルスベクターとも称される）の生成を促進する方法を提供する。ＯｒｉＰ含有アデノウイルスベクターは、ＥＢＮＡ−１タンパク質の発現のための配列をさらに含んでなってもよく、または代案としては、ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する宿主細胞が、組換えアデノウイルス粒子を生成するために使用される。ＯｒｉＰ含有アデノウイルスベクターは、対象ＤＮＡ配列（例えばＨＳＡドメインＩＩＩ変種をコードするＤＮＡ配列）の多様な／複合体ライブラリーを含んでなる、組換えアデノウイルスの集団を生成するのに特に有用である。

ＯｒｉＰ配列は、当該技術分野で既知の多数の技術を使用して、任意の既知のアデノウイルスベクターに容易に組み入れ得る。例えばＧａｔｅｗａｙ組換え系を利用する場合、ＯｒｉＰ配列は、エントリーベクターまたはアデノウイルス目的ベクターのａｔｔ組換え部位間に位置するべきである。アデノウイルスベクターに配列を追加する場合、アデノウイルスＤＮＡの複製またはアセンブリーに干渉する部位に挿入するのを回避するように留意すべきである。代案としては、または任意選択的に、ＯｒｉＰ配列を含有するアデノウイルスベクターを改変して、ＥＢＮＡ−１タンパク質もまた発現させてもよい（図１０を参照されたい）。アデノウイルスベクターからＥＢＮＡ−１タンパク質を直接発現させることで、宿主細胞にＥＢＮＡ−１遺伝子を発現させる必要がなくなる。

本発明のアデノウイルスベクターは、ＯｒｉＰ配列とアデノウイルスゲノム配列を含んでなる。本発明のアデノウイルスベクターは、以下の要素の１つまたは複数をさらに含んでなってもよい：
（ｉ）別のベクターによる組換えクローニングのための組換え部位（例えばａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２）、このような部位は、当該ベクターから作成された組換えアデノウイルス中における発現のために、対象ＤＮＡ配列のクローニングをもたらすのに有用である；
（ｉｉ）選択および／または対抗選択に有用な抗生物質／薬剤（例えばクロラムフェニコール）耐性遺伝子および／または毒素発現遺伝子（例えばｃｃｄＢ遺伝子）；
（ｉｉｉ）対象ＤＮＡ配列のサブクローニングに有用なクローニング部位（マルチクローニング部位であってもよい）；
（ｉｖ）１つまたは複数の対象タンパク質をコードする、１つまたは複数の対象遺伝子を含んでなってもよい対象ＤＮＡ；
（ｖ）幅広い哺乳類細胞（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター）中における対象遺伝子発現のためのプロモーター、プロモーターは、構成的であってもまたは誘導性であってもよい；
（ｖｉ）対象タンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグ（例えばＨｉｓ６Ｘエピトープ）。エピトープタグは、対象組換えタンパク質の５’または３’末端のいずれに存在してもよい；
（ｖｉｉ）ｍＲＮＡの効率的な転写終結、およびポリアデニル化のためのポリアデニル化（ポリＡ）配列（例えばシミアンウイルス４０ポリＡ配列）；
（ｖｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミドの高コピー数複製と維持のための複製起点；
（ｉｘ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中における選択のための抗生物質耐性遺伝子；
（ｘ）ベクターの線形化のための制限酵素部位（例えばＰａｃＩ）、制限酵素部位は要素（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）の側面に位置してもよい；および
（ｘｉ）ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列。

プラスミドＤＮＡ合成のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）起点ｏｒｉＰは、多様な高等真核生物細胞中におけるＤＮＡ合成を効率的に支持する。代表的ＯｒｉＰ配列を図９Ｃに提供する。この起点が１つのウイルスタンパク質ＥＢＮＡ−１のみを使用する一方、その他の要素は全て細胞によって提供される。特定の実施形態では、ＥＢＮＡ−１タンパク質は宿主細胞（例えば２９３Ｅ細胞）によって提供される。別の実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターは、要素（ｘｉ）ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列、をさらに含んでなる。代表的ＥＢＮＡ−１タンパク質およびＤＮＡ配列をそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに提供する。

アデノウイルスの適切なパッケージングと生成に必要である、アデノウイルスゲノム配列（例えばヒトアデノウイルス５型配列は、遺伝子およびその他の要素（例えば左右逆方向末端反復（ＩＴＲ）、カプシド形成シグナル配列、後期遺伝子をコードする）が特に検討される。（Ｈｉｔｔｅｔａｌ．，１９９９，ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ），ｐｐ．６１−８６；Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２５７３−２６０４）。アデノウイルスゲノム配列は、完全アデノウイルスゲノムをコードしてもよい。代案としては、アデノウイルスゲノム配列は、トランスに提供される１つまたは複数のタンパク質および／または調節因子を除く、全てのタンパク質およびその他の調節因子をコードして、複製能力がないアデノウイルスを生成してもよい。例えばＥ１タンパク質をコードするＥ１領域（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）が、本発明のアデノウイルスベクターから除外されてもよい（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，２５７３−２６０４）。次に欠損タンパク質および／またはその他の要素は、例えばＥ１領域のゲノムのコピーを含有する２９３細胞系などの、アデノウイルを生成するのに使用される宿主によって通常、トランスに提供される。特定の実施形態では、アデノウイルスゲノム配列は、野生型配列１〜４５８および３５１３〜３５９３５に相当する、ヒトアデノウイルス５型配列を含んでなる、またはそれから本質的になる。

特定の要素が、組み合わせで提供され、および／またはその他の要素を組み込んでもよいことが、当業者によって理解され、例えば要素（ｉｖ）は、要素（ｖ）〜（ｖｉｉ）を組み込んでもよい。その他の要素に対して５’および／または３’に、特定の要素が提供されることがさらに理解され、例えば要素（ｘ）は、アデノウイルスベクターの直線化のために有用であってもよく、要素（ｘ）は直線化のために組み込まれる場合、５’ＩＴＲに対して５’および／または３’ＩＴＲに対して３’で提供されるべきである。同様に、存在する場合、要素（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）は、一般に、レスキューされるアデノウイルスにそれらが組み込まれないように位置し、例えばこれらの要素は、５’ＩＴＲに対して５’および３’ＩＴＲに対して３’に位置してもよい。存在する場合、ＯｒｉＰおよび要素（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、３’ＩＴＲを含むアデノウイルスゲノム配列が片側に配置され、別の側には５’ＩＴＲ配列が配置される（例えば図１０）。

要素（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉｉｉ）〜（ｘ）、および任意選択的に（ｘｉ）を組み込んだ、本発明の代表的アデノウイルスベクターが、図１０に提供される。

７実施形態
１．（ａ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分と、（ｂ）異種タンパク質とを含んでなるキメラポリペプチドであって、そのＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなり、キメラポリペプチドが異種タンパク質の機能活性を保持してＦｃＲｎに結合し得て、前記ＨＳＡドメインＩＩＩが１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなって、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、キメラポリペプチドのＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる、キメラポリペプチド。

２．キメラポリペプチドが、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合する、実施形態１のキメラポリペプチド。

３．キメラポリペプチドが、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合し、前記親和性が酸性ｐＨで測定される、実施形態１または２のキメラポリペプチド。

４．酸性ｐＨが５．０〜６．０である、実施形態３のキメラポリペプチド。

５．酸性ｐＨが５．５±０．２である、実施形態４のキメラポリペプチド。

６．キメラポリペプチドが、酸性ｐＨにおいて、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合するが、そのキメラポリペプチドが、中性ｐＨでは、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合しない、実施形態１〜３のいずれか１つのキメラポリペプチド。

７．中性ｐＨが６．９〜７．９である、実施形態６のキメラポリペプチド。

８．中性ｐＨが７．４±０．２である、実施形態７のキメラポリペプチド。

９．キメラポリペプチドがＦｃＲｎに結合して、前記対照キメラポリペプチドと異なるオフ速度またはオン速度を有する、実施形態１〜６のいずれかのキメラポリペプチド。

１０．キメラポリペプチドがＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドと比較して、オン速度増大および／またはオフ速度低下を有する、実施形態９のキメラポリペプチド。

１１．キメラポリペプチドがＦｃＲｎに結合し、前記対照ポリペプチドと比較して、オフ速度増大を有する、実施形態９のキメラポリペプチド。

１２．ＨＳＡドメインＩＩＩが、１〜１０個のアミノ酸置換を含んでなり、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、キメラポリペプチドの血清半減期を増大させる、実施形態１〜１１のいずれかのキメラポリペプチド。

１３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態１〜１２のいずれかのキメラポリペプチド。

１４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態１３のキメラポリペプチド。

１５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態１〜１３のいずれかのキメラポリペプチド。

１６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態１５のキメラポリペプチド。

１７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表５に列挙されるものから選択される、実施形態１〜１５のいずれかのキメラポリペプチド。

１８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１〜１５のいずれかのキメラポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。

１９．キメラポリペプチドが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置にあるＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１〜１５のいずれかのキメラポリペプチド：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（ｌ）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；（ｑ）残基５４１および５６１；（ｒ）残基４６３および５２３；（ｓ）残基５０８および５２３；（ｔ）残基５０８および５２４；（ｕ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｖ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｗ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｙ）残基４６３および５２４；（ｚ）残基５２３および５２４；および（ａａ）残基４６３、５２３、および５２４。

２０．キメラポリペプチドが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置にあるＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１〜１５のいずれかのキメラポリペプチド：（ａ）残基４６３および５０８；（ｂ）残基４６３および５２３；（ｃ）残基５０８および５２３；（ｄ）残基５０８および５２４；（ｅ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｆ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｇ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｈ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｉ）残基４６３および５２３；および（ｊ）残基５２３および５２４。

２１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１〜１５、または１８〜２０のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、４０７Ｈ、４０７Ｍ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、４０７Ｒ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｌ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｄ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｍ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｗ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｆ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｌ、Ｖ４２６Ｎ、Ｖ４２６Ｐ、Ｖ４２６Ｑ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｍ、Ｔ５０６Ｎ、Ｔ５０６Ｒ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｄ、Ｆ５０９Ｇ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｐ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｄ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｉ、Ａ５１１Ｒ、Ａ５１１Ｔ、Ａ５１１Ｖ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｍ、Ｄ５１２Ｑ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｄ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｇ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｌ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｔ５１５Ｗ、Ｔ５１５Ｙ、Ｌ５１６Ｃ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２１Ｍ、Ｒ５２１Ｑ、Ｒ５２１Ｔ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｆ、Ｑ５２６Ｈ、Ｑ５２６Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｐ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｖ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｋ、Ｈ５３５Ｌ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｈ５３５Ｓ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｎ、Ｋ５５７Ｓ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。

２２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１〜１５、または１８〜２０のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。

２３．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１〜１５、または１８〜２０のいずれかのキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。

２４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態２２のキメラポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。

２５．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２３のキメラポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。

２６．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１〜１４、または１８〜２０のいずれかのキメラポリペプチド：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ、（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（ｊ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｖ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｗ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｘ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｙ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｚ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ａａ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２７．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２６のキメラポリペプチド：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｎ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｏ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｐ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｑ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌおよび（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２８．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２６のキメラポリペプチド：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｅ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｆ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｇ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２９．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２６のキメラポリペプチド：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５０８Ｒ；（ｂ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｄ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ。

３０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク間質で保存されているが、ニワトリ血清アルブミン中では保存されていない残基の置換である、実施形態１〜１５のいずれかのキメラポリペプチド。

３１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存されているが、ニワトリ血清アルブミン中では保存されていない残基の置換である、実施形態３０のキメラポリペプチド。

３２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１５のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

３３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態３２のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３９１、残基４３４、残基４４２、残基４４５、および残基４５０。

３４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態３３のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、およびＥ４５０Ｅ。

３５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態３２のキメラポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。

３６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態３０のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。

３７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態３６のキメラポリペプチド：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。

３８．ＨＳＡドメインＩＩＩが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置における、アミノ酸置換を含んでなる、実施形態３７のキメラポリペプチド：残基４６３および５０８；残基４６３および５２４；残基５０８および５２４；残基４６３、５０８および５２４。

３９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態３７または３８のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、およびＡ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ。

４０．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態３２のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

４１．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態３６のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。

４２．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態３２または３６のキメラポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８３、残基３８７、残基３８９、残基３９１、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１０、残基４１７、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２５、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４４２、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６５、残基４６６、残基４６７、残基４６８、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８６、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基４９９、残基５００、残基５０２、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２０、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３２、残基５３５、残基５３６、残基５３９、残基５４３、残基５４４、残基５４７、残基５７１、および残基５７６。

４３．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態４２のキメラポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４２４、残基４４２、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。

４４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態４３のキメラポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ，Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。

４５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能な残基の置換である、実施形態１〜４４のいずれかのキメラポリペプチド。

４６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能な残基である、実施形態４５のキメラポリペプチド。

４７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態１〜１２のいずれかのキメラポリペプチド。

４８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態４７のキメラポリペプチド。

４９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態４７または４８のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

５０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態４９のキメラポリペプチド：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。

５１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態４９のキメラポリペプチド：Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、およびＥ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ。

５２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態４９のキメラポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。

５３．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態１〜５２のいずれかのキメラポリペプチド。

５４．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態５３のキメラポリペプチド。

５５．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態５３のキメラポリペプチド。

５６．ＨＳＡ部分が、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態１〜５２のいずれかのキメラポリペプチド。

５７．ＨＳＡドメイン部分が、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態５６のキメラポリペプチド。

５８．ＨＳＡドメイン部分が、配列番号２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態５６のキメラポリペプチド。

５９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態１〜５８のいずれかのキメラポリペプチド。

６０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態１〜２３、３０〜３２、３５、３６、４０〜４２、４５〜４９、または５２〜５９のいずれかのキメラポリペプチド。

６１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態５９または６０のキメラポリペプチド。

６２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態１〜５９のいずれかのキメラポリペプチド。

６３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態１〜２３、３０〜３６、４０〜５８、または６２のいずれかのキメラポリペプチド。

６４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態６２または６３のキメラポリペプチド。

６５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態１〜５９または６２のいずれかのキメラポリペプチド。

６６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態１〜２３、３０〜３２、３５、３６〜４９、５２〜５８または６５のいずれかのキメラポリペプチド。

６７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態６５または６６のキメラポリペプチド。

６８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態１〜５９、６２、または６５のいずれかのキメラポリペプチド。

６９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態１〜２３、３０〜３２、３５、３６〜４９、５２〜５８または６８のいずれかのキメラポリペプチド。

７０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜３個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜６個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態７１または７２のキメラポリペプチド。

７１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態１〜５９、６２、６５、６８のいずれかのキメラポリペプチド。

７２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態１〜２３、３０〜３２、３５、３６〜４９、５２〜５８または７１のいずれかのキメラポリペプチド。

７３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜３個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜３個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態７１または７２のキメラポリペプチド。

７４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態１〜５９、６２、６５、６８、または７１のいずれかのキメラポリペプチド。

７５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態１〜２３、３０〜３１、４１、４２〜４５、４８〜５３または７４のいずれかのキメラポリペプチド。

７６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態７４または７５のキメラポリペプチド。

７７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態１〜５９、６２、６５、６８、７１、または７４のいずれかのキメラポリペプチド。

７８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態１〜２３、３０〜３１、４１、４２、４５〜４８、５３〜５８または７７のいずれかのキメラポリペプチド。

７９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態７７または７８のキメラポリペプチド。

８０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態１〜５９、６２、６５、６８、７１、７４、または７７のいずれかのキメラポリペプチド。

８１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態１〜２３、３０〜３１、４５〜４８、５３〜５８または８０のいずれかのキメラポリペプチド。

８２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜４個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜４個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態８０または８１のキメラポリペプチド。

８３．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アラニンによるアミノ酸残基の置換を含んでなる、実施形態１〜８２のいずれかのキメラポリペプチド。

８４．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、保存的アミノ酸置換を含んでなる、実施形態１〜８３のいずれかのキメラポリペプチド。

８５．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８４のいずれかのキメラポリペプチド。

８６．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８５のいずれかのキメラポリペプチド。

８７．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の中性アミノ酸による中性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８７のいずれかのキメラポリペプチド。

８８．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８７のいずれかのキメラポリペプチド：リジン、アルギニン、およびヒスチジン。

８９．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８８のいずれかのキメラポリペプチド：アスパラギン酸およびグルタミン酸。

９０．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜８９のいずれかのキメラポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン。

９１．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜９０のいずれかのキメラポリペプチド：アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシン。

９２．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜９１のいずれかのキメラポリペプチド：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。

９３．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜９２のいずれかのキメラポリペプチド：システイン、セリン、およびスレオニン。

９４．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜９３のいずれかのキメラポリペプチド。

９５．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１〜９４のいずれかのキメラポリペプチド：グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。

９６．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、非保存的置換を含んでなる、実施形態１〜９５のいずれかのキメラポリペプチド。

９７．前記アミノ酸置換の全部が、アミノ酸残基のアラニンによる置換を含んでなる、実施形態８３のキメラポリペプチド。

９８．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、保存的アミノ酸置換を含んでなる、実施形態８４のキメラポリペプチド。

９９．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態８５のキメラポリペプチド。

１００．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態８７のキメラポリペプチド。

１０１．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の中性アミノ酸による中性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態８７のキメラポリペプチド。

１０２．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態８８のキメラポリペプチド：リジン、アルギニン、およびヒスチジン。

１０３．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態８９のキメラポリペプチド：アスパラギン酸およびグルタミン酸。

１０４．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９０のキメラポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン。

１０５．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９１のキメラポリペプチド：アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシン。

１０６．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９２のキメラポリペプチド：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。

１０７．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９３のキメラポリペプチド：システイン、セリン、およびスレオニン。

１０８．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９４のキメラポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸。

１０９．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態９５のキメラポリペプチド：グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。

１１０．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、非保存的置換を含んでなる、実施形態９６のキメラポリペプチド。

１１１．異種タンパク質が、抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる、実施形態１〜１１０のいずれかのキメラポリペプチド。

１１２．異種タンパク質が、治療用タンパク質を含んでなる、実施形態１〜１１１のいずれかのキメラポリペプチド。

１１３．ＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域をさらに含んでなる、実施形態１〜１１２のいずれかのキメラポリペプチド。

１１４．ＨＳＡ部分が異種タンパク質と化学的に結合する、実施形態１〜１１３のいずれかのキメラポリペプチド。

１１５．ＨＳＡ部分が異種タンパク質と組換え的に結合する、実施形態１〜１１３のいずれかのキメラポリペプチド。

１１６．キメラポリペプチドが、ＨＳＡ部分と異種タンパク質の双方をコードする組換えベクターを使用して生成される、実施形態１１５のキメラポリペプチド。

１１７．キメラポリペプチドが、原核生物または真核細胞中で生成される、実施形態１１５または１１６のキメラポリペプチド。

１１８．真核細胞が、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞から選択される、実施形態１１７のキメラポリペプチド。

１１９．ＨＳＡ部分と異種タンパク質が互いに直接結合する、実施形態１１４〜１１８のいずれかのキメラポリペプチド。

１２０．ＨＳＡ部分と異種タンパク質がリンカーを介して結合する、実施形態１１４〜１１８のいずれかのキメラポリペプチド。

１２１．リンカーが、１つまたは複数のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を含んでなる、実施形態１２０のキメラポリペプチド。

１２２．ＨＳＡ部分が異種タンパク質のＮ末端アミノ酸に結合する、実施形態１〜１２１のいずれかのキメラポリペプチド。

１２３．ＨＳＡ部分が異種タンパク質のＣ末端アミノ酸に結合する、実施形態１〜１２１のいずれかのキメラポリペプチド。

１２４．ＨＳＡ部分が異種タンパク質の内部アミノ酸に結合する、実施形態１〜１２１のいずれかのキメラポリペプチド。

１２５．ＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部と、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含んでなる、実施形態１〜１２４のいずれかのキメラポリペプチド。

１２６．前記キメラポリペプチドが実質的に精製されている、実施形態１〜１２５のいずれかのキメラポリペプチド。

１２７．実施形態１〜１２６のいずれかのキメラポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物。

１２８．無菌組成物である、実施形態１２７の前記組成物。

１２９．前記組成物が非発熱性である、実施形態１２７または１２８の組成物。

１３０．実施形態１〜１２６のいずれかに従ったキメラポリペプチド、または実施形態１２７〜１２９のいずれかに従った組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、対象を治療する方法。

１３１．実施形態１〜１２６のいずれかに従ったキメラポリペプチドをそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、対象中でタンパク質の血清半減期を増大させる方法。

１３２．前記対象に投与するステップが、前記キメラポリペプチドを全身投与するステップを含んでなる、実施形態１３０または１３１の方法。

１３３．前記対象に投与するステップが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、血管内、心膜内、皮下、肺、鼻腔内、眼内、硬膜外、局所、および経口からなる群から選択される手段によって、前記キメラポリペプチドを投与するステップを含んでなる、実施形態１３０または１３１の方法。

１３４．前記対象に投与するステップが、前記キメラポリペプチドを静脈内投与するステップを含んでなる、実施形態１３０または１３１の方法。

１３５．実施形態１〜１２５のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸構築物。

１３６．ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）変種ポリペプチドであって、前記変種ポリペプチドがＦｃＲｎに結合し得て、前記ＨＳＡドメインＩＩＩが１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、前記置換を欠く対照ＨＳＡポリペプチドと比較して、前記変種ポリペプチドのＦｃＲｎ親和性を増大させる、ポリペプチド。

１３７．変種ポリペプチドが、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合し、前記親和性が酸性ｐＨで測定される、実施形態１３６の変種ポリペプチド。

１３８．酸性ｐＨが５．０〜６．０である、実施形態１３６または１３７の変種ポリペプチド。

１３９．酸性ｐＨが５．５±０．２である、実施形態１３８の変種ポリペプチド。

１４０．変種ポリペプチドが、酸性ｐＨにおいて、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合するが、その変種ポリペプチドが、中性ｐＨでは、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合しない、実施形態１３６のいずれかの変種ポリペプチド。

１４１．中性ｐＨが６．９〜７．９である、実施形態１４０の変種ポリペプチド。

１４２．中性ｐＨが７．４±０．２である、実施形態１４１の変種ポリペプチド。

１４３．変種ポリペプチドが、前記対照ＨＳＡポリペプチドよりも長い血清半減期を有する、実施形態１３６のいずれかの変種ポリペプチド。

１４４．ＨＳＡドメインＩＩＩが１〜１０個のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１３６〜１４３のいずれかの変種ポリペプチド。

１４５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態１３６〜１４４のいずれかの変異ポリペプチド。

１４６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態１４５の変種ポリペプチド。

１４７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態１３６〜１４４のいずれかの変種ポリペプチド。

１４８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態１４７の変種ポリペプチド。

１４９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表５に列挙されるものから選択される、実施形態１３６〜１４７のいずれかの変種ポリペプチド。

１５０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１３６〜１４７のいずれかの変種ポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。

１５１．変種ポリペプチドが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置にあるＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１３６〜１４７または１５０のいずれかの変種ポリペプチド：（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（ｌ）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；（ｑ）残基５４１および５６１；（ｒ）残基４６３および５２３；（ｓ）残基５０８および５２３；（ｔ）残基５０８および５２４；（ｕ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｖ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｗ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｙ）残基４６３および５２４；（ｚ）残基５２３および５２４；および（ａａ）残基４６３、５２３、および５２４。

１５２．変種ポリペプチドが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置にあるＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１５１の変種ポリペプチド：（ａ）残基４６３および５０８；（ｂ）残基４６３および５２３；（ｃ）残基５０８および５２３；（ｄ）残基５０８および５２４；（ｅ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｆ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｇ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｈ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｉ）残基４６３および５２４；（ｊ）残基５２３および５２４；（ｋ）残基４６３、５２３、および５２４。

１５３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１３６〜１４８、または１５０〜１５２のいずれかの変種ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、４０７Ｈ、４０７Ｍ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、４０７Ｒ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｌ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｄ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｍ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｗ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｆ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｌ、Ｖ４２６Ｎ、Ｖ４２６Ｐ、Ｖ４２６Ｑ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｍ、Ｔ５０６Ｎ、Ｔ５０６Ｒ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｄ、Ｆ５０９Ｇ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｐ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｄ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｉ、Ａ５１１Ｒ、Ａ５１１Ｔ、Ａ５１１Ｖ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｍ、Ｄ５１２Ｑ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｄ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｇ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｌ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｔ５１５Ｗ、Ｔ５１５Ｙ、Ｌ５１６Ｃ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２１Ｍ、Ｒ５２１Ｑ、Ｒ５２１Ｔ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｆ、Ｑ５２６Ｈ、Ｑ５２６Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｐ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｖ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｋ、Ｈ５３５Ｌ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｈ５３５Ｓ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｎ、Ｋ５５７Ｓ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。

１５４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１３６〜１４８、または１５０〜１５３のいずれかの変種ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。

１５５．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１３６〜１４８、または１５０〜１５３のいずれかの変種ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。

１５６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１５４の変種ポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。

１５７．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１５５の変種ポリペプチド：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。

１５８．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１３６〜１４７、または１５０〜１５２のいずれかの変種ポリペプチド：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（ｊ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｖ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｗ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｘ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｙ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｚ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ａａ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

１５９．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１５８の変種ポリペプチド：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｎ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｏ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｐ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｑ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌおよび（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

１６０．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１５８の変種ポリペプチド：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｅ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｆ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｇ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

１６１．変種ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態１５８の変種ポリペプチド：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５０８Ｒ；（ｂ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｄ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ。

１６２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存されているが、ニワトリ血清アルブミン中では保存されていない残基の置換である、実施形態１３６〜１４７のいずれかの変種ポリペプチド。

１６３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存されているが、ニワトリ血清アルブミン中では保存されていない残基の置換である、実施形態１６２の変種ポリペプチド。

１６４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ（配列番号２）中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１４７の変種ポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

１６５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１６４の変種ポリペプチド：残基３８３、残基３９１、残基４３４、残基４４２、残基４４５、および残基４５０。

１６６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｅ４５０Ｄ、およびＥ４５０Ｅからなる群から選択される、実施形態１６５の変種ポリペプチド。

１６７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１６４の変種ポリペプチド：残基４１７、残基４４２、残基４９９、および残基５０２。

１６８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１６２の変種ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。

１６９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１６８の変種ポリペプチド：残基３８１、残基４０１、残基４２４、残基４５７、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。

１７０．ＨＳＡドメインＩＩＩが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置における、アミノ酸置換を含んでなる、実施形態１６９の変種ポリペプチド：残基４６３および５０８；残基４６３および５２４；残基５０８および５２４；残基４６３、５０８および５２４。

１７１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１６９または１７０の変種ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、およびＡ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ。

１７２．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態１６４の変種ポリペプチド。残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

１７３．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態１６８の変種ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８７、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６６、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基５００、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３５、残基５３９、残基５４４、残基５４７、および残基５７６。

１７４．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態１６４または１６８の変種ポリペプチド：残基３８０、残基３８１、残基３８４、残基３８３、残基３８７、残基３８９、残基３９１、残基３９６、残基４０１、残基４０４、残基４０５、残基４０６、残基４０９、残基４１０、残基４１７、残基４１９、残基４２１、残基４２２、残基４２４、残基４２５、残基４２８、残基４３０、残基４３１、残基４３３、残基４４１、残基４４２、残基４５７、残基４５８、残基４６３、残基４６４、残基４６５、残基４６６、残基４６７、残基４６８、残基４６９、残基４７０、残基４７４、残基４７５、残基４８０、残基４８１、残基４８６、残基４８９、残基４９１、残基４９５、残基４９９、残基５００、残基５０２、残基５０８、残基５１０、残基５１５、残基５１６、残基５２０、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２８、残基５３１、残基５３２、残基５３５、残基５３６、残基５３９、残基５４３、残基５４４、残基５４７、残基５７１、および残基５７６。

１７５．前記アミノ酸置換の全部が、以下からなる群の構成員から選択される、実施形態１７４の変種ポリペプチド：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４２４、残基４４２、残基４６３、残基４９５、残基５０８、残基５１５、残基５１６、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５３１、残基５３５、および残基５３９。

１７６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１７５の変種ポリペプチド：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ，Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｐ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、およびＡ５３９Ｖ。

１７７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能な残基の置換である、実施形態１３６〜１７４のいずれかの変種ポリペプチド。

１７８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能な残基である、実施形態１７７の変種ポリペプチド。

１７９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態１３６〜１７４のいずれかの変種ポリペプチド。

１８０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態１７９の変種ポリペプチド。

１８１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１７９または１８０の変種ポリペプチド：残基３８３、残基３８９、残基３９１、残基４１０、残基４１７、残基４２５、残基４４２、残基４６５、残基４６７、残基４６８、残基４８６、残基４９９、残基５０２、残基５２０、残基５３２、残基５３６、残基５４３、および残基５７１。

１８２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態１８１の変種ポリペプチド：残基３８３、残基３９１、および残基４４２。

１８３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態１８２の変種ポリペプチド：Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、およびＥ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ。

１８４．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態１３６〜１８０のいずれかの変種ポリペプチド。

１８５．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態１８４の変種ポリペプチド。

１８６．ＨＳＡドメインＩＩＩが、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、実施形態１７７１８５の変種ポリペプチド。

１８７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態１３６〜１８６のいずれかの変種ポリペプチド。

１８８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１６８、１７２〜１７４、１７７〜１８１または１８４〜１８７のいずれかの変種ポリペプチド。

１８９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態１８７または１８８の変種ポリペプチド。

１９０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態１３６〜１８７のいずれかの変種ポリペプチド。

１９１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６８、１７２〜１７４〜１８６、または１９０のいずれかの変種ポリペプチド。

１９２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態１９０または１９１の変種ポリペプチド。

１９３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態１３６〜１７３または１９０のいずれかの変種ポリペプチド。

１９４．ＨＳＡドメイン中のＩＩＩ前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１６７〜１８１、１８４〜１８６、または１９３の変種ポリペプチド。

１９５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態１９３または１９４の変種ポリペプチド。

１９６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態１３６〜１７３、１９０または１９３のいずれかの変種ポリペプチド。

１９７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１６７〜１８１、１８４〜１８６、または１９６の変種ポリペプチド。

１９８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜３個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜６個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態１９６または２００の変種ポリペプチド。

１９９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態１３６〜１７３、１９０、１９３、または１９６のいずれかの変種ポリペプチド。

２００．ＨＳＡドメイン中のＩＩＩ前記アミノ酸置換の全部が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１６７〜１８１、１８４〜１８６、または１９９の変種ポリペプチド。

２０１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜３個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜３個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態１９９または２００の変種ポリペプチド。

２０２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態１３６〜１７３、１９０、１９３、１９６、または１９９のいずれかの変種ポリペプチド。

２０３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１７３〜１７４、１７７〜１８１、１８４〜１８６、または２０２の変種ポリペプチド。

２０４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜１８個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態２０２または２０３の変種ポリペプチド。

２０５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態１３６〜１７３、１９０、１９３、１９６、１９９、または２０２のいずれかの変種ポリペプチド。

２０６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２〜１６４、１７３〜１７４、１７７〜１８１、１８４〜１８６または２０５の変種ポリペプチド。

２０７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の１〜５個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜５個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態２０５または２０６の変種ポリペプチド。

２０８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態１３６〜１７３、１９０、１９３、または２０５のいずれかの変種ポリペプチド。

２０９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全てが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態１３６〜１５５、１６２、１６３、１７７〜１８０、１８４〜１８６、または２０８のいずれかの変種ポリペプチド。

２１０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中に１〜４個のアミノ酸置換を含んでなり、前記１〜４個のアミノ酸置換がＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態２０８または２０９の変種ポリペプチド。

２１１．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、アラニンによるアミノ酸残基の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１０のいずれかの変種ポリペプチド。

２１２．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、保存的アミノ酸置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１１のいずれかの変種ポリペプチド。

２１３．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１２のいずれかの変種ポリペプチド。

２１４．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１３のいずれかの変種ポリペプチド。

２１５．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、別の中性アミノ酸による中性アミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１４のいずれかの変種ポリペプチド。

２１６．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１５のいずれかの変種ポリペプチド：リジン、アルギニン、およびヒスチジン。

２１７．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１６のいずれかの変種ポリペプチド：アスパラギン酸およびグルタミン酸。

２１８．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１７のいずれかの変種ポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン。

２１９．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１８のいずれかの変種ポリペプチド：アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシン。

２２０．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２１９のいずれかの変種ポリペプチド：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。

２２１．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２２０のいずれかの変種ポリペプチド：システイン、セリン、およびスレオニン。

２２２．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２２１のいずれかの変種ポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸。

２２３．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下の群内の別のアミノ酸による、１つのアミノ酸の置換を含んでなる、実施形態１３６〜２２２のいずれかの変種ポリペプチド：グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。

２２４．前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、非保存的置換を含んでなる、実施形態１３６〜２２３のいずれかの変種ポリペプチド。

２２５．前記アミノ酸置換の全部が、アミノ酸残基のアラニンによる置換を含んでなる、実施形態２１１の変種ポリペプチド。

２２６．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、保存的アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１２の変種ポリペプチド。

２２７．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１３の変種ポリペプチド。

２２８．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１４の変種ポリペプチド。

２２９．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、別の中性アミノ酸による中性アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１５の変種ポリペプチド。

２３０．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１６の変種ポリペプチド：リジン、アルギニン、およびヒスチジン。

２３１．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１７の変種ポリペプチド：アスパラギン酸およびグルタミン酸。

２３２．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１８の変種ポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン。

２３３．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２１９の変種ポリペプチド：アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、およびグリシン。

２３４．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２２０の変種ポリペプチド：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。

２３５．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２２１の変種ポリペプチド：システイン、セリン、およびスレオニン。

２３６．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２２２の変種ポリペプチド：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸。

２３７．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、以下の群内の別のアミノ酸による１つのアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２２３の変種ポリペプチド：グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。

２３８．前記アミノ酸置換の全部が、独立して各位置に、非保存的置換を含んでなる、実施形態２２４の変種ポリペプチド。

２３９．ＨＳＡ部分がＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部と、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含んでなる、実施形態１３６〜２３８のいずれかの変種ポリペプチド。

２４０．前記変種ポリペプチドが実質的に精製されている、実施形態１３６〜２３９のいずれかの変種ポリペプチド。

２４１．標的上のエピトープへの結合部位をさらに含んでなる、実施形態１３６〜２４０のいずれかの変種ポリペプチド。

２４２．結合部位が前記標的と拮抗する、実施形態２４１の変種ポリペプチド。

２４３．結合部位が前記標的を刺激する、実施形態２４１の変種ポリペプチド。

２４４．実施例１３６〜２４３のいずれかの変種ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物。

２４５．無菌組成物である、実施形態２４４の組成物。

２４６．前記組成物が非発熱性である、実施形態２４４または２４５の組成物。

２４７．実施形態１３６〜２４３のいずれかの変種ポリペプチドを前記プロテインに結合させるステップを含んでなる、タンパク質の血清半減期を増大させる方法。

２４８．実施形態２４１〜２４３のいずれかの変種ポリペプチドをそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、対象を処置する方法。

２４９．実施例１３６〜２３９のいずれかに記載の変種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸構築物。

２５０．（ａ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物であって、そのＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、そのＨＳＡドメインＩＩＩが、（ｂ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する１〜１８個のアミノ酸置換を含んでなり、核酸構築物が、異種タンパク質の機能活性を保持してＦｃＲｎに結合できるキメラポリペプチドをコードして、前記キメラポリペプチドが、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照キメラポリペプチドと比較して、血清半減期増大および／またはＦｃＲｎ親和性増大を有する、核酸構築物。

２５１．キメラポリペプチドが、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合する、実施形態２５０の核酸構築物。

２５２．キメラポリペプチドが、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合し、前記親和性が酸性ｐＨで測定される、実施形態２５０または２５１の核酸構築物。

２５３．酸性ｐＨが５．０〜６．０である、実施形態２５２の核酸構築物。

２５４．酸性ｐＨが５．５±０．２である、実施形態２５３の核酸構築物。

２５５．キメラポリペプチドが、酸性ｐＨにおいて、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合するが、そのキメラポリペプチドが、中性ｐＨでは、前記対照キメラポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合しない、実施形態２５０〜２５５のいずれかの核酸構築物。

２５６．中性ｐＨが６．９〜７．９である、実施形態２５５の核酸構築物。

２５７．中性ｐＨが７．４±０．２である、実施形態２５６の核酸構築物。

２５８．（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、そのＨＳＡ部分が、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、そのＨＳＡドメインＩＩＩが、１〜１０個のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２５０のいずれかの核酸構築物。

２５９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態２５０〜２５８のいずれかの核酸構築物。

２６０．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、複数の種を越えて保存された残基の置換である、実施形態２５９の核酸構築物。

２６１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態２５０〜２５８のいずれかの核酸構築物。

２６２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された残基の置換である、実施形態２６１の核酸構築物。

２６３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表５に列挙されるものから選択される、実施形態２５０〜２６２のいずれかの核酸構築物。

２６４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下の位置のいずれかにある、実施形態２５０〜２６２のいずれかの核酸構築物：残基３８１、残基３８３、残基３９１、残基４０１、残基４０２、残基４０７、残基４１１、残基４１３、残基４１４、残基４１５、残基４１６、残基４２４、残基４２６、残基４３４、残基４４２、残基４４５、残基４４７、残基４５０、残基４５４、残基４５５、残基４５６、残基４５７、残基４５９、残基４６３、残基４９５、残基５０６、残基５０８、残基５０９、残基５１１、残基５１２、残基５１５、残基５１６、残基５１７、残基５１９、残基５２１、残基５２３、残基５２４、残基５２５、残基５２６、残基５２７、残基５３１、残基５３５、残基５３８、残基５３９、残基５４１、残基５５７、残基５６１、残基５６６、残基５６９。

２６５．ＨＳＡドメインＩＩＩが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置における、アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２５０〜２６２のいずれかの核酸構築物：。（ａ）残基３８３および４１３；（ｂ）残基４０１および５２３；（ｃ）残基４０７および４４７；（ｄ）残基４０７および４４７および５３９；（ｅ）残基４０７および５０９；（ｆ）残基４０７および５２６；（ｇ）残基４１１および５３５；（ｈ）残基４１４および４５６；（ｉ）残基４１５および５６９；（ｊ）残基４２６および５２６；（ｋ）残基４４２および４５０および４５９；（ｌ）残基４６３および５０８；（ｍ）残基５０８および５１９および５２５；（ｎ）残基５０９および５２７；（ｏ）残基５２３および５３８；（ｐ）残基５２６および５５７；（ｑ）残基５４１および５６１；（ｒ）残基４６３および５２３；（ｓ）残基５０８および５２３；（ｔ）残基５０８および５２４；（ｕ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｖ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｗ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｘ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｙ）残基４６３および５２４；（ｚ）残基５２３および５２４；および（ａａ）残基４６３、５２３、および５２４。

２６６．ＨＳＡドメインＩＩＩが、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、以下からなる群から選択される位置における、アミノ酸置換を含んでなる、実施形態２５０〜２６２のいずれかの核酸構築物：（ａ）残基４６３および５０８；（ｂ）残基４６３および５２３；（ｃ）残基５０８および５２３；（ｄ）残基５０８および５２４；（ｅ）残基４６３、５０８、および５２３；（ｆ）残基４６３、５０８、および５２４；（ｇ）残基５０８、５２３、および５２４；（ｈ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４；（ｉ）残基４６３および５２４；（ｊ）残基５２３および５２４；および（ｋ）残基４６３、５２３、および５２４。

２６７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態２５０〜２６２または２６４〜２６６のいずれかの核酸構築物：Ｖ３８１Ｎ、Ｖ３８１Ｑ、Ｅ３８３Ａ、Ｅ３８３Ｇ、Ｅ３８３Ｉ、Ｅ３８３Ｌ、Ｅ３８３Ｖ、Ｎ３９１Ａ、Ｎ３９１Ｇ、Ｎ３９１Ｉ、Ｎ３９１Ｌ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｄ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｋ４０２Ｇ、Ｋ４０２Ｉ、Ｋ４０２Ｌ、Ｋ４０２Ｖ、Ｌ４０７Ｆ、４０７Ｈ、４０７Ｍ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｑ、４０７Ｒ、Ｌ４０７Ｗ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｙ４１１Ｎ、Ｋ４１３Ｃ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１４Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｖ４１５Ｌ、Ｖ４１５Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｑ４１６Ｈ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｄ、Ｖ４２４Ｇ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｌ、Ｖ４２４Ｍ、Ｖ４２４Ｎ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２４Ｗ、Ｖ４２６Ｄ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｆ、Ｖ４２６Ｈ、Ｖ４２６Ｌ、Ｖ４２６Ｎ、Ｖ４２６Ｐ、Ｖ４２６Ｑ、Ｇ４３４Ｃ、Ｇ４３４Ｓ、Ｇ４３４Ｔ、Ｅ４４２Ｋ、Ｅ４４２Ｒ、Ｒ４４５Ｆ、Ｒ４４５Ｗ、Ｒ４４５Ｙ、Ｐ４４７Ｓ、Ｐ４４７Ｔ、Ｅ４５０Ｄ、Ｅ４５０Ｅ、Ｓ４５４Ｃ、Ｓ４５４Ｍ、Ｓ４５４Ｔ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５５Ｑ、Ｖ４５６Ｎ、Ｖ４５６Ｑ、Ｌ４５７Ｆ、Ｌ４５７Ｗ、Ｌ４５７Ｙ、Ｑ４５９Ｋ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｆ、Ｔ５０６Ｍ、Ｔ５０６Ｎ、Ｔ５０６Ｒ、Ｔ５０６Ｗ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｃ、Ｆ５０９Ｄ、Ｆ５０９Ｇ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｌ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｐ、Ｆ５０９Ｖ、Ｆ５０９Ｗ、Ｆ５０９Ｙ、Ａ５１１Ｄ、Ａ５１１Ｆ、Ａ５１１Ｉ、Ａ５１１Ｒ、Ａ５１１Ｔ、Ａ５１１Ｖ、Ａ５１１Ｗ、Ａ５１１Ｙ、Ｄ５１２Ｆ、Ｄ５１２Ｍ、Ｄ５１２Ｑ、Ｄ５１２Ｗ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｃ、Ｔ５１５Ｄ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｅ、Ｔ５１５Ｇ、Ｔ５１５Ｈ、Ｔ５１５Ｌ、Ｔ５１５Ｎ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｔ５１５Ｗ、Ｔ５１５Ｙ、Ｌ５１６Ｃ、Ｌ５１６Ｆ、Ｌ５１６Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｌ５１６Ｙ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｆ、Ｓ５１７Ｍ、Ｓ５１７Ｔ、Ｓ５１７Ｗ、Ｓ５１７Ｙ、Ｋ５１９Ａ、Ｋ５１９Ｇ、Ｋ５１９Ｉ、Ｋ５１９Ｌ、Ｋ５１９Ｖ、Ｒ５２１Ｆ、Ｒ５２１Ｈ、Ｒ５２１Ｍ、Ｒ５２１Ｑ、Ｒ５２１Ｔ、Ｒ５２１Ｗ、Ｒ５２１Ｙ、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｇ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｌ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ａ、Ｑ５２６Ｃ、Ｑ５２６Ｆ、Ｑ５２６Ｈ、Ｑ５２６Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｐ、Ｑ５２６Ｓ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｖ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｆ、Ｔ５２７Ｗ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｅ５３１Ｉ、Ｅ５３１Ｌ、Ｅ５３１Ｖ、Ｈ５３５Ｄ、Ｈ５３５Ｅ、Ｈ５３５Ｋ、Ｈ５３５Ｌ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｈ５３５Ｓ、Ｋ５３８Ｆ、Ｋ５３８Ｗ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ａ５３９Ｌ、Ａ５３９Ｖ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５４１Ｗ、Ｋ５４１Ｙ、Ｋ５５７Ａ、Ｋ５５７Ｇ、Ｋ５５７Ｉ、Ｋ５５７Ｌ、Ｋ５５７Ｎ、Ｋ５５７Ｓ、Ｋ５５７Ｖ、Ａ５６１Ｆ、Ａ５６１Ｗ、Ａ５６１Ｙ、Ｔ５６６Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、Ｔ５６６Ｙ、Ａ５６９Ｈ、およびＡ５６９Ｐ。

２６８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態２５０〜２６２または２６４〜２６６のいずれかの核酸構築物：Ｖ３８１Ｎ、Ｅ３８３Ｇ、Ｎ３９１Ｖ、Ｙ４０１Ｅ、Ｋ４０２Ａ、Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｙ４１１Ｑ、Ｋ４１４Ｓ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４１５Ｃ、Ｑ４１６Ｐ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｇ４３４Ｃ、Ｅ４４２Ｋ、Ｒ４４５Ｗ、Ｐ４４７Ｓ、Ｅ４５０Ｄ、Ｓ４５４Ｃ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４５７Ｆ、Ｑ４５９Ｒ、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｍ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｑ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓ、Ｆ５０９Ｉ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｐ、Ｔ５１５Ｑ、Ｔ５１５Ｓ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｃ、Ｓ５１７Ｗ、Ｋ５１９Ｉ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｙ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖ、Ｋ５２５Ｖ、Ｑ５２６Ｔ、Ｑ５２６Ｍ、Ｑ５２６Ｙ、Ｔ５２７Ｙ、Ｅ５３１Ｉ、Ｈ５３５Ｎ、Ｈ５３５Ｐ、Ｋ５３８Ｙ、Ａ５３９Ｉ、Ｋ５４１Ｆ、Ｋ５５７Ｇ、Ａ５６１Ｆ、Ｔ５６６Ｗ、およびＡ５６９Ｐ。

２６９．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、以下からなる群から選択される、実施形態２６８の核酸構築物：Ｌ４０７Ｎ、Ｌ４０７Ｙ、Ｖ４１５Ｔ、Ｖ４２４Ｉ、Ｖ４２４Ｑ、Ｖ４２６Ｅ、Ｖ４２６Ｈ、Ｐ４４７Ｓ、Ｖ４５５Ｎ、Ｖ４５６Ｎ、Ｌ４６３Ｎ、Ｅ４９５Ｄ、Ｔ５０６Ｙ、Ｔ５０８Ｒ、Ｆ５０９Ｍ、Ｆ５０９Ｗ、Ａ５１１Ｆ、Ｄ５１２Ｙ、Ｔ５１５Ｑ、Ｌ５１６Ｔ、Ｌ５１６Ｗ、Ｓ５１７Ｗ、Ｒ５２１Ｗ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒ、Ｋ５２４Ｌ、Ｑ５２６Ｍ、Ｔ５２７Ｙ、Ｈ５３５Ｐ、およびＫ５５７Ｇ。

２７０．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２５０〜２６２、または２６４２６９のいずれかの核酸構築物：（ａ）Ｅ３８３Ｇ／Ｋ４１３Ｓ；（ｂ）Ｙ４０１Ｅ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｄ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｅ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｆ）Ｌ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；（ｇ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｈ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｉ）Ｖ４１５Ｔ／Ａ５６９Ｐ；（ｊ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｋ）Ｅ４４２Ｋ／Ｅ４５０Ｄ／Ｑ４５９Ｒ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５１９Ｉ／Ｋ５２５Ｖ；（ｎ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｏ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｐ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｑ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｖ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｗ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｘ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｙ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｚ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ａａ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２７１．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２７０の核酸構築物：（ａ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ；（ｂ）Ｌ４０７Ｎ／Ｐ４４７Ｓ／Ａ５３９Ｉ；（ｃ）Ｌ４０７Ｎ／Ｆ５０９Ｍ；（ｄ）Ｙ４１１Ｑ／Ｈ５３５Ｎ；（ｅ）Ｋ４１４Ｓ／Ｖ４５６Ｎ；（ｆ）Ｖ４２６Ｈ／Ｑ５２６Ｙ；（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｈ）Ｆ５０９Ｉ／Ｔ５２７Ｙ；（ｉ）Ｉ５２３Ｑ／Ｋ５３８Ｙ；（ｊ）Ｑ５２６Ｍ／Ｋ５５７Ｇ；（ｋ）Ｋ５４１Ｆ／Ａ５６１Ｆ；（ｌ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｍ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｎ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｏ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｐ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｑ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｒ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；（ｓ）Ｌ４６３Ｎ／Ｉ５２３Ｇ；（ｔ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌおよび（ｕ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２７２．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２７０の核酸構築物：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｅ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｆ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；（ｇ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ。

２７３．キメラポリペプチドが、以下からなる群から選択される、ＨＳＡドメインＩＩＩ中のアミノ酸置換を含んでなる、実施形態２７０の核酸構築物：（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５０８Ｒ；（ｂ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；（ｃ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；および（ｄ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ。

２７４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能な残基の置換である、実施形態２５０〜２６２のいずれかの核酸構築物。

２７５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能な残基である、実施形態２７４の核酸構築物。

２７６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態２５０〜２５８のいずれかの核酸構築物。

２７７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の全部が、表面接近可能であり、また複数の種を越えて保存されてもいる残基の置換である、実施形態２７６の核酸構築物。

２７８．（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％同一である、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、実施形態２５０〜２７７のいずれかの核酸構築物。

２７９．（ｉ）配列番号１と少なくとも９５％同一である、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、実施形態２７８の核酸構築物。

２８０．（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％同一である、ＨＳＡドメインＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、実施形態２７９の核酸構築物。

２８１．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態２５０〜２８０のいずれかの核酸構築物。

２８２．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態２５０〜２８１のいずれかの核酸構築物。

２８３．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態２５０〜２８２のいずれかの核酸構築物。

２８４．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態２５０〜２７２のいずれかの核酸構築物。

２８５．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態２５０〜２８４のいずれかの核酸構築物。

２８６．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態２５０〜２８５２８３のいずれかの核酸構築物。

２８７．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態２５０〜２８６のいずれかの核酸構築物。

２８８．ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態２５０〜２８７のいずれかの核酸構築物。

２８９．（ｉｉ）異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、その異種タンパク質が抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる、実施形態２５０〜２８８のいずれかの核酸構築物。

２９０．リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、実施形態２５０〜２８９のいずれかの核酸構築物。

２９１．ヌクレオチド配列が、１つまたは複数のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を含んでなるリンカーをコードする、実施形態２９０の核酸構築物。

２９２．ＨＳＡ部分がＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部と、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含んでなる、実施形態２５０〜２９１のいずれかの核酸構築物。

２９３．複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存された、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、ライブラリー。

２９４．複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存され、ニワトリからの血清アルブミン中で保存されない、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、ライブラリー。

２９５．複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、表面接近可能な残基である、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、ライブラリー。

２９６．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態２９５のライブラリー。

２９７．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態２９５または２９６のライブラリー。

２９８．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態２９５〜２９７のいずれかのライブラリー。

２９９．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態２９５〜２７３のいずれかのライブラリー。

３００．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態２９５〜２９９のいずれかのライブラリー。

３０１．前記表面接近可能な残基が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態２９５〜３００のいずれかのライブラリー。

３０２．複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、（ｉ）表面接近可能であり、また（ｉｉ）ヒト、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからの血清アルブミンタンパク質間で保存されてもいる、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、ライブラリー。

３０３．複数のポリペプチドを含んでなるライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはそのＦｃＲｎ結合断片を含んでなり、前記複数のポリペプチドのそれぞれが独立して、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ中の残基の少なくとも１つのアミノ酸の、ブタ、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマからなる群から選択される、ヒト以外の２種以上からの血清アルブミンタンパク質間で保存されたアミノ酸への置換を含んでなる、ライブラリー。

３０４．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ２中にある、実施形態３０２または３０３のライブラリー。

３０５．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ３中にある、実施形態３０２〜３０４のいずれかのライブラリー。

３０６．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ６中にある、実施形態３０２〜３０５のいずれかのライブラリー。

３０７．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス７中にある、実施形態３０２〜３０６のいずれかのライブラリー。

３０８．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ７中にある、実施形態３０２〜３０７のいずれかのライブラリー。

３０９．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのへリックス８中にある、実施形態３０２〜３０８のいずれかのライブラリー。

３１０．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ８中にある、実施形態３０２〜３０９のいずれかのライブラリー。

３１１．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＨＳＡドメインＩＩＩのループ９中にある、実施形態３０２〜３１０のいずれかのライブラリー。

３１２．実施形態２９３〜３１１のいずれかのライブラリーであって、前記複数のポリペプチドのそれぞれが、ＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部と、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含んでなる、ライブラリー。

３１３．ライブラリーがディスプレイライブラリーである、実施形態２９３〜３１２のいずれかのライブラリー。

３１４．ディスプレイライブラリーのタイプが、酵母、ファージ、および哺乳類からなる群から選択される、実施形態３１３のライブラリー。

３１５．（ａ）スクリーニングのために複数のポリペプチドを選択するステップと；（ｂ）ＦｃＲｎ結合親和性増大または血清半減期増大があるポリペプチドをスクリーニングするステップと；（ｃ）ＦｃＲｎ結合親和性増大または血清半減期増大があるポリペプチドを配列決定するステップとを含んでなる、実施形態２９３〜３１４のいずれかのライブラリーをスクリーニングする方法。

８例証
ここで本発明を一般的に記述し、それは、本発明の特定の態様および実施形態の単なる例証のみを目的とし、本発明の限定を意図しない、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろう。例えば本明細書で開示される特定の構築物および実験デザインは、適切な機能を検証するための例示的なツールと方法に相当する。したがって開示される特定の構築物および実験計画のいずれかを本開示の範囲内で置換し得ることは、容易に分かるであろう。さらに使用される特定の装置と試薬、サイズ、製造会社などの特定の一覧または説明は、特にそうである旨の断りのない限り、本発明の限定と見なされないことが理解されるであろう。同様に機能するその他の装置および試薬で容易に置換してもよいことが、さらに理解されるであろう。

８．１実施例１：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩＩＩに結合するヒトＦｃＲｎの動態および親和性解析
本実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒトＦｃＲｎに対するＨＳＡのドメインＩＩＩの結合、解離、および平衡親和定数を測定する。ドメインＩＩＩ（「ＤＩＩＩ」とも略記される）は、アミノ酸残基３８１〜５８５に及ぶ、ヒト血清アルブミンタンパク質断片である。ドメインＩＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１で記載される。完全長成熟ＨＳＡのアミノ酸配列は、配列番号２で記載される。これらの実験で使用するために、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＰｉｃｈｉａＰａｔｏｒｉｓ）からドメインＩＩＩを発現させて精製した。

８．１．１組換えタンパク質発現および精製
ドメインＩＩＩ遺伝子をコードする組換えプラスミドは、ＧｅｎｅａｒｔＡＧ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを使用して、供給業者が提供するベクターからドメインＩＩＩ遺伝子を摘出し、ｐＰＩＣＺ−α−Ａピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｖ１９５−２０）にクローニングした。組換えドメインＩＩＩタンパク質は、製造会社の使用説明書に概説される様式で発現させた。組換えドメインＩＩＩタンパク質は培地中に分泌され、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７５１９７０１）からのＨｉＴｒａｐブチルセファロース・ファストフロー・カラム上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製された。簡単に述べると、培養液の塩分およびｐＨは、１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に、最初に調節した。培養液を濾過してブチルセファロースカラムに通過させ、低塩ｐＨ７．０ナトリウムリン酸緩衝液を使用して、結合ドメインＩＩＩを溶出した。５０℃に保たれる循環水ジャケット付きヒドロキシアルコキシプロピルデキストラン（ＨｙｄｒｏｘｙａｌｏｘｙｐｓｏｐｙｌＤｅｘｔｒａｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｈ６２５８）カラムに、精製タンパク質の画分を通過させて脱脂した。クマシーブルー染色による４〜１２％ＳＤＳＰＡＧＥによる視覚化で、脱脂および非脱脂形態双方の純度は９９％であった（図１Ａ）。タンパク質濃度は、Ａ２８０で測定した。これまで公表された測定と密な相関性がある、近紫外線ＣＤおよび遠紫外線ＣＤの測定によって、精製ドメインＩＩＩの適切な折り畳みが確認された。（例えばＧｉａｎｃｏｌａｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０（１９９７）１９３−２０４を参照されたい）。

８．１．２反応速度測定
ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００装置（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で、２５℃で平衡、結合、および解離速度定数を測定し、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアｖ．１．１（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してデータを分析した。標準アミン共役（ＢＩＡｃｏｒｅＨａｎｄｂｏｏｋ、２００２）によって、ＣＭ４（カタログ番号ＢＲ−１００５−３９）またはＣＭ５チップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）上に、ドメインＩＩＩの非脱脂および脱脂の双方の形態をそれぞれ１０１６および１１８４ＲＵの共役密度で、共有結合的に固定化した。フローセルの１つは、同一固定化プロトコルを使用して、タンパク質なしで模擬共役させて空試験とした。全ての注入は、ｐＨ５．５、５０ｍＭリン酸および１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液中で作成し、チップ表面をｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、注入と注入の間に再生した。結合定数（ｋ_ｏｎ）、解離定数（ｋ_ｏｆｆ）、および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を単一実験で測定するために、固定化ドメインＩＩＩタンパク質上に、増大する濃度のヒトＦｃＲｎ（３９ｎＭ〜４０μＭ）を５０μＬ／分で注入した（図１Ｂ、左パネル）。結合を平衡に至らせて、運動定数ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆは、曲線の結合相（４分間）および解離相（１分間）の双方を１：１ラングミュアモデルに同時に適合させることで誘導した。Ｋ_Ｄは、非線形回帰分析を使用して、検体濃度と対比される平衡結合応答（Ｒｅｑ）プロットを定常状態親和性モデルに適合させることで誘導した（図１Ｂ、右パネル）。ドメインＩＩＩの脱脂および非脱脂双方の形態は、同様の結合センサーグラム、およびＲｅｑ対リガンド濃度プロットを示した。

ＦｃＲｎとドメインＩＩＩの相互作用は、急速な結合（ｋ_ｏｎ≒７ｅ^３）と、解離（ｋ_ｏｆｆ≒４ｅ^−２）動態を示す（表１）。ドメインＩＩＩのＦｃＲｎのＫ_Ｄは、５〜８μＭであり、それは完全長ＨＳＡのＦｃＲｎのほぼ７倍大きい（例えばより大きな解離定数）（表１）。このＫ_Ｄの差は、ＨＳＡと比較して、ドメインＩＩＩのより急速なｋ_ｏｆｆが主因である一方で、双方の分子のｋ_ｏｎは同等である。ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆから誘導されたＫ_Ｄは、実験的に得られた値と密接に一致し、それによって反応速度測定を裏付ける。さらに可変カルボキシ部分がある２つの異なる種類のセンサーチップ（ＣＭ４およびＣＭ５）が、同様の親和性を与えた。運動定数および平衡定数は、ドメインＩＩＩの脱脂および非脱脂形態の間で同等であり、脂質分子がドメインＩＩＩのＦｃＲｎ結合を媒介または促進しないことが示唆される。

８．２実施例２：完全長ＨＳＡまたはドメインＩＩＩのみとの融合はヒトＩｇＧのＦｃＲｎ親和性を高める
この実験は、ＨＳＡのドメインＩＩＩと治療用タンパク質または抗体、またはその変種との融合が、相互作用のｐＨ依存性に影響を及ぼすことなく、酸性ｐＨにおける、治療用タンパク質／抗体のＦｃＲｎに対する親和性を改善することを実証した。これはｐＨ５．５におけるＦｃＲｎの親和性を増大させ、血清半減期増大につながると思われる（例えば生体内または適切なモデル系中の寿命改善）。例えば、ヒトＦｃＲｎ遺伝子の単一コピーを発現する（が、マウスＦｃＲｎを欠く）遺伝子組換えマウス中において、治療用タンパク質に融合したドメインＩＩＩを含んでなるＨＳＡ部分の薬物動態学的半減期測定を実施して、野生型または変種ドメインＩＩＩを含んでなる部分との融合の半減期に対する影響を評価してもよい。

８．２．１構築物デザイン
代表的タンパク質としてヒトＩｇＧ１を使用し、ＩｇＧ単独と、ＨＳＡまたはドメインＩＩＩに融合したＩｇＧとの間で、ＦｃＲｎ親和性を比較した。ＨＳＡまたはドメインＩＩＩは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの４つの反復単位を含んでなるリンカーを介して、ヒトＩｇＧ１重鎖のＣ末端に融合させた（図２Ａ）。ＦｃＲｎ上のＩｇＧ結合部位とＨＳＡ結合部位の間の距離に基づいて、リンカーの長さをデザインし、双方のリガンドをそれぞれの結合部位に同時に結合させた。天然ＩｇＧと比較して、１０倍改善されたＦｃＲｎ親和性を示す、以前記載されているＩｇＧの高親和性変種（ＩｇＧ−ＹＴＥ、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔａｌ．，２００２，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，１６９：５１７１−５１８０を参照されたい）のＨＳＡおよびドメインＩＩＩ融合バージョンもまた、同様にして生成した。したがって以下の構築物が生成されて、使用された：
ＩｇＧ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）
ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡ
ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡ
ＩｇＧ（ＹＴＥ）−（Ｇ４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩ

８．２．２精製および特性解析
簡単に述べると、全ての６つの構築物を発現ベクターにクローンして、２９３Ｆ細胞（ＧＩＢＣＯカタログ番号Ｒ７９００７）中における一過性発現によってタンパク質を精製した。ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡアフィニティカラム（カタログ番号１７−０４０３−０３）を使用して、培養液中に分泌されたＩｇＧ１および融合タンパク質を精製した。還元および非還元の双方の条件下で、ＳＤＳＰＡＧＥによって精製タンパク質を分離し、クーマシー染色で視覚化して９９％の純度を観察した（図２Ｂ）。

ＩｇＧ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ＨＳＡ融合タンパク質の推定分子量が２８４キロダルトン（ＫＤａ）であるのに対し、ＩｇＧ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩの推定分子量は１９６ＫＤａである。観察された分子量は、これらの推定値と非常に良好な相関性があった。それらのより大きなサイズまたは物理化学的特性変化が原因で、これらの融合タンパク質が凝集体を形成するかどうかを評価するために、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２００シリーズＳＥＣを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって融合タンパク質を分析した（図２Ｃ）。ＩｇＧ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ＨＳＡおよびＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩのどちらもＡ２８０対滞留時間（分）プロット上で、モノマーに相当する単一ピークを示し、融合タンパク質が、いかなる測定可能な程度にも凝集しないことが示唆される。ＩｇＧ−ＹＴＥ変種の融合タンパク質のＳＥＣプロファイルは、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡまたはＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡキメラタンパク質と識別不能であった。

８．２．３平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）の測定
融合タンパク質のヒトＦｃＲｎの親和性（Ｋ_Ｄ）をＢＩＡｃｏｒｅＴ１００装置（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で測定した。簡単に述べると、ヒトＩｇＧ、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩ、ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡ、ＩｇＧ−ＹＴＥ、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩ、およびＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡは、装置製造会社により概説されるようにして、標準アミノ共役化学を使用して、２つのＳｅｒｉｅｓ５センサーチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の別個のフローセルに高密度で固定化した。最終表面ＩｇＧ密度は、それぞれ５１１６、５２５８、６０９７、５２５６、５５６１、および５５３１ＲＵであった。参照フローセルもまた、いかなるタンパク質もなしに同一固定化プロトコルを使用して、各センサーチップ上で調製した。タンパク質共役セルと参照セル双方の表面に、５０ｍＭのＰ０_４、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ５．５中の５．８６ｎＭ〜３０００ｎＭの範囲にわたるヒトＦｃＲｎの２倍連続希釈液を５μＬ／分の流速で注入した。５０分間にわたり結合データを収集し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水の複数回の６０秒間の注入による再生がそれに続いた。ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアｖ．１．１（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、各注入の平衡結合応答（Ｒｅｑ）を濃度に対してプロットし、定常状態親和性モデル（図３）に適合させて、平衡結合定数Ｋ_Ｄを得た。挿入図は、固定化リガンドに対する、一連の濃度のＦｃＲｎの結合を表す。ＩｇＧ−ＹＴＥ変種と、対応する融合タンパク質のＫ_Ｄもまた、同一様式で誘導された（データ示さず）。

ＩｇＧ−（Ｇ４Ｓ）_４−ＨＳＡのＫ_Ｄは１８３ｎＭであり、ＩｇＧ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩのＫ_Ｄは３０５ｎＭであり、ＩｇＧ単独の１．５１μＭと比較して、ＨＳＡまたはドメインＩＩＩをＩｇＧに融合させることで、ＦｃＲｎ親和性がそれぞれ１０倍および５倍改善することが実証される（表２）。同様であるがあまりはっきりしない傾向は、ＹＴＥ変種でもまた観察され、ＩｇＧ−ＹＴＥと比較して、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ＨＳＡは３．８倍（４２．５ｎＭ）、ＩｇＧ−ＹＴＥ−（Ｇ_４Ｓ）_４−ドメインＩＩＩは２．５倍（６５．１ｎＭ）の親和性改善を示す（表２）。

しかしｐＨ５．５における親和性の改善は、中性ｐＨにおけるＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさない。これは同一固定化表面に、ｐＨ７．２で１μＭのＦｃＲｎを注入することで試験された。ＩｇＧ／ＩｇＧ−ＹＴＥ対照と比較して、融合タンパク質共役表面のいずれかとＦｃＲｎの結合中に、測定可能な差は検出されなかった（データ示さず）。

酸性ｐＨ（約５．５〜６．０）におけるＨＳＡ融合物のＦｃＲｎへの結合、および中性ｐＨ（約７．４）における遊離は、このような特性が生体内結合を模倣することから、生体内有効性と相関する。したがって好ましいＨＳＡ変種は、（ｉ）天然ＨＳＡ、または天然ＨＳＡを含む抱合体と比較して、親和性が改善された変種、および（ｉｉ）酸性ｐＨで親和性改善が観察される変種である。さらに中性ｐＨおけるＦｃＲｎへの結合親和性増大がある変種は、有効性を損なって、酸性ｐＨにおける親和性増大の有益な効果を低下させることもある。

８．３実施例３：完全長ＨＳＡとの融合はヒトＩｇＧの血清持続を高める
この実験は、ＨＳＡと抗体の融合が、抗体の血清半減期を増大させることを実証した。図７に示されるように、実施例１に記載されるＩｇＧ−ＨＳＡ融合体の血清持続は、ＩｇＧ単独と比較して増大した。血清半減期増大は、ＩｇＧ−ＹＴＥ変種で見られたのと同等であった。しかしこの研究では、ＩｇＧ−ＹＴＥ変種へのＨＳＡの付加は、ＹＴＥ単独を上回る著しい増強をもたらさないようであった。

マウス新生児Ｆｃ受容体（ｍＦｃＲｎ）が、単一コピーのヒトＦｃＲｎ（ｈｕＦｃＲｎ）で置換されている、４〜５ヶ月齢のヒトＦｃＲｎＣ５７ＢＬ／６遺伝子組換えマウス（ＪＡＸｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＰＫ試験を実施した。マウスに、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２中で希釈された適切なタンパク質の１５ｍｇ／ｋｇ用量を尾静脈を介して注射する。注射の１時間後に、全ての動物を眼窩後方神経叢から出血させて、（７５μｌ）血清を採取し、循環に注入された実際の量を判定する。次に注射の２４、７２、１６８、および２４０時間後に、血清サンプルを採取して−８０℃で保存する。血清中に残留する、示されるタンパク質の量をＥＬＩＳＡによって分析する。簡単に述べると、抗ＨＳＡ被覆プレートを使用して、様々なＩｇＧ融合構築物を捕捉し、抗κ検出抗体を使用して検出する。ＩｇＧおよびＹＴＥ構築物では、抗原被覆プレートを使用してＩｇＧを捕捉し、抗重鎖検出抗体を使用して検出する。時間と対比して、注入量（１時間サンプル）の画分として、血清中に残留するタンパク質％をプロットする。

８．４実施例４：ＦｃＲｎに対するＨＳＡ上のエピトープは立体構造である
ヒトＦｃＲｎは、抗β−２ミクログロブリン抗体を用いた免疫ブロット法によって視覚化されるように、濃度依存様式で、天然ＨＳＡウェルに結合することが観察された。しかし同様の実験条件下で試験された変性ＨＳＡを使用して、同様の結果は観察されなかった。

Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；カタログ番号Ａ−８７６３）とヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ；カタログ番号Ｉ−４５０６）、およびトリス緩衝液をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）上に、１０ｍｇタンパク質／ｍｌのセファロースで固定化した。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂの反応基を０．１ＭのＴｒｉｚｍａ塩基、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８でブロックして、セファロース−トリスを調製した。ＨＳＡ、ｈＩｇＧまたはトリスに連結したセファロースビーズ（２０μｌのビーズは約１８０μｇの連結タンパク質に相当する）は、還元（１％２−メルカプトエタノール）または非還元条件下で、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液（６０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、２．３％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）存在下において、１０分間煮沸され、または未処理のままにされた。このように処理されたタンパク質またはトリス共役ビーズを０．１％アイシングラス（ＢＩＯＦＸＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ；カタログ番号ＰＦＧＰ−１０００−０１）を含有する、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ５．５で洗浄し、次に２００μｌのｐＨ５．５緩衝液中の様々な濃度のヒトＦｃＲｎ（０〜２０μｇ）と共に、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ５．５の緩衝液を使用して、非結合タンパク質を洗い流した。１％２−メルカプトエタノールを含有する、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液と共に沸騰して、結合タンパク質を溶出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析して、抗β２ミクログロブリン抗体（Ａｂｃａｍ；カタログ番号Ａｂ６６０８）による免疫ブロット法がそれに続いた。

ＦｃＲｎ濃度範囲全体において、セファロース−ＨＳＡへのヒトＦｃＲｎの結合は、天然ＨＳＡに対して最大であった。しかし還元および非還元条件の双方の下でＨＳＡを変性させると、結合は大幅に減少し、ＦｃＲｎに対するＨＳＡ上のエピトープが、立体構造エピトープである見込みが高いことが示唆された。（図４）。予期されたように、セファロース−ＩｇＧがヒトＦｃＲｎに結合した一方で、トリスブロックされたビーズはいかなる条件下でもＦｃＲｎに結合しなかった。

８．５実施例５：ＨＳＡおよびドメインＩＩＩは、酵母細胞表面に提示され得て、提示タンパク質はＦｃＲｎ結合能力を保持する
本実施例は、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩが成功裏に、酵母細胞表面に発現され得て、また酸性ｐＨで実施された修正フローサイトメトリーで評価されるように、これらの提示タンパク質がｐＨ依存様式でＦｃＲｎに結合もし得ることを実証する。したがって酵母細胞上の発現は、ドメインＩＩＩにバリエーションを含有する構築物（例えばドメインＩＩＩのみ、完全長ＨＳＡ、トランケート型ＨＳＡ、または少なくともドメインＩＩＩを含んでなるキメラポリペプチド）をスクリーニングして、このような構築物が、例えば（ｉ）ＦｃＲｎに結合する能力、および（ｉｉ）非変種構築物と比較して増大した親和性でＦｃＲｎに結合する能力を評価する１つの方法を提供する。

８．５．１酵母細胞表面ディスプレイ
ＨＳＡ、ドメインＩＩＩまたは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃｆｖ）をｐＹＤ１酵母ディスプレイベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｖ８３５−０１）にクローンして、酵母細胞表面における提示のために、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換した。ｐＹＤ１は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タンパク質Ａｇａ２ｐとのＣ末端融合として、対象タンパク質を提示する。全ての実験的手順は、供給業者のマニュアルに記載されるようにして実施した。形質転換細胞は、栄養要求性選択マーカーであるウラシルおよびトリプトファンを使用して選択し、適切な選択培地中で培養した（ＴｅｋｎｏｖａＩｎｃ．；カタログ番号Ｃ８１４０）。培養物をガラクトースで最高４８時間誘導し、Ａｇａ２ｐ融合タンパク質を発現させた。細胞を０、２４、および４８時間目に試料採取した。０．１％アイシングラスを含有するｐＨ７．２のＰＢＳで、細胞サンプルを洗浄してブロックし、ＦＩＴＣ結合ウサギポリクローナル抗ＨＳＡ抗体（ＡｂｃａｍＩｎｃ．；カタログ番号ＡＢ３４６６９）で染色して、フローサイトメトリーにより分析した。

０時間目には、ＨＳＡまたはドメインＩＩＩの細胞表面発現は、観察されなかった一方、２４時間目には酵母細胞上で双方のタンパク質の発現が観察された。このような発現は、誘導後４８時間維持された。発現は、陽性ＦＩＴＣ染色によって視覚化した。図５Ａは、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩの双方が、酵母細胞表面で成功裏に発現され得ることを示す。予期されたように、ｓｃｆｖ形質転換細胞は抗ＨＳＡで染色されなかった（例えば陰性であった）。したがってｓｃｆｖ形質転換細胞は、陰性対照の役割を果たした。

８．５．２表面発現されたＨＳＡまたはドメインＩＩＩのＦｃＲｎ結合能力
ＨＳＡ、ドメインＩＩＩまたはｓｃｆｖを発現し、ガラクトースで４８時間誘導された酵母細胞を、０．１％アイシングラスを含有するｐＨ５．５、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液とも称される）で、１時間ブロックした。次にｐＨ５．５リン酸緩衝液中のビオチン化ＦｃＲｎ（７０μＭ）と共に細胞をインキュベートし、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＰＥ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．）を使用して、結合ＦｃＲｎを視覚化した。このように染色された細胞を、慣例的に使用されるＰＢＳの代わりに、ｐＨ５．５、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて、フローサイトメトリーによって分析した。

ｓｃｆｖと比較したヒストグラム中の移行から分かるように、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩ発現細胞が、どちらもＰＥについて陽性に染色されたのに対し、陰性対照ｓｃｆｖ発現細胞は染色されず、（図５Ｂ）、酵母細胞表面で発現されるＨＳＡおよびドメインＩＩＩがＦｃＲｎ結合能力を保持し、したがって機能性であることが実証された。別途の実験では、ＦｃＲｎ結合の低ｐＨフローサイトメトリーと同様に細胞を処理し、ハイスループット試料採取技術ＨｙｐｅｒＣｙｔ（登録商標）システム（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してアッセイし、同様の結果を得た。

８．６実施例６高度多様性ライブラリーを作成するための、ＯｒｉＰを含んでなるアデノウイルス哺乳類細胞表面ディスプレイベクター
遺伝子操作されてｐＥＮＤｉｓｐｌａｙと称されるｓｃＦｖ−Ｆｃ発現カセット（図８Ａを参照されたい）を含有するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクター中で、ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質の表面ディスプレイのために、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを使用する哺乳類表面ディスプレイライブラリーを構築した。異なるｓｃＦｖ配列のライブラリーが、Ｓｆｉ／ＮｏｔＩ部位に容易に挿入される。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクター中のライブラリーは、製造会社に従って、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｖ４９４−２０）ベクターと組み合わされて、アデノウイルス発現ライブラリーが作成され、合計約５×１０^６個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）が得られた。アデノウイルスを生成するために、トランスに組換えアデノウイルスを生成するのに必要なＥ１タンパク質（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）を提供する、安定して組み込まれたＥ１遺伝子のコピーを含有する２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｒ７０５０７）に、直線化されて左右逆方向末端反復（ＩＴＲ）が露出されるアデノウイルス発現ライブラリーを形質移入した。ＦＡＣＳ分析によって、直線化アデノウイルスライブラリーで直接形質移入された２９３Ａ細胞の少なくとも５０％が、それらの表面に抗体を提示することが分かった。しかしアデノウイルス生成のために、直線化アデノウイルスライブラリーを２９３Ａ細胞に形質移入すると、１１０ｍｍ（径）のシャーレあたり５０個を下回るプラークが得られた。アデノウイルスを１０日目に収穫してウイルスＤＮＡを単離し、ＰＣＲを使用してｓｃＦｖコード領域を増幅し、それをｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターに再度クローンして戻し、９６個のコロニーを拾って配列決定した。１４個のみの特有のＶＨ配列が、９６個のクローン分析から同定された。プラーク回収の低効率は、直線化アデノウイルスベクターの分解に起因することもあり、アデノウイルスライブラリー複雑度の著しい低下をもたらす。

エプスタイン・バー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有して、プラスミドなどのＯｒｉＰ含有核酸に結合する。ＥＢＮＡ−１タンパク質（図９Ａを参照されたい）は、ＮＬＳを介して、ＯｒｉＰ含有核酸が核に移行するのを助け、エピソームの維持を増強してもよい。エピソーム維持は、アデノウイルスレスキューに必須とは考えられないが、ＯｒｉＰ配列（図９Ｃを参照されたい）は、ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙベクターのａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２配列間のｓｃＦｖ−ＦｃカセットのポリＡ配列の後ろに導入される。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰと称される新しいベクターは、図８Ｂに描写される。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰ中のライブラリーは、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｖ４９４−２０）ベクターと組み合わされて、これもまた約５×１０^６ｃｆｕを有する、第２のアデノウイルス発現ライブラリーが作成された。ｐＥＮＤｉｓｐｌａｙ−ＯｒｉＰベクターから生成されたライブラリーを直線化して、エプスタイン・バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ−１）とアデノウイルスＥ１ａタンパク質を安定して発現する２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｒ６２０−０７）に形質移入し、１１０ｍｍ（径）シャーレあたり１０，０００個を優に超えるプラークがもたらされた。ウイルスを７日目に収穫して、９６個のクローンを上述したように分析した。ＯｒｉＰ部位なしの第１のライブラリーから単離された特有のクローンの低い数とは対照的に、全ての９６ＶＨ配列分析は特有であった。総合してこれらの結果は、アデノウイルス発現ライブラリーベクターへのＯｒｉＰ配列の付加が、ＥＢＮＡ−１発現細胞からのアデノウイルスレスキューと、アデノウイルスライブラリーの多様性の双方を大幅に改善することを実証する。

アデノウイルスベクターへのＯｒｉＰ配列（例えば図９Ｃ）の付加は、ＥＢＮＡ−１タンパク質存在下における、宿主細胞からの組換えアデノウイルス粒子の生成効率を高める。アデノウイルス発現ライブラリーを構築する際に、ウイルス生成の改善された効率は、クローン損失数を低下させることにより、ライブラリーの多様性／複雑度を維持する。下の実施例７は、本質的に上述したように、ＯｒｉＰ配列をアデノウイルス発現ベクターに組み込む、ＨＳＡドメインＩＩＩ変種を発現する、哺乳類表面ディスプレイライブラリーの構築とスクリーニングについて詳述する。

図１０は、対象タンパク質の発現のための、代表的な一般的アデノウイルス発現ベクターの概略図を提供する。本実施例では、Ｅ１および／またはＥ３部分が欠失した、変異アデノウイルスゲノムが提供される。欠損ウイルス遺伝子は、ウイルスレスキューに使用される宿主細胞によってトランスに提供される。欠失は、対象タンパク質発現に使用される宿主細胞中において、アデノウイルスの複製を妨げる。対象ＤＮＡは、コード配列、プロモーター配列、終結シグナル、ポリＡ配列などをはじめとするが、これに限定されるものではない、タンパク質の発現に必要な全ての構成要素を含む。対象タンパク質は可溶性であってもよく、あるいは膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーシグナルなどのタンパク質を細胞表面に固着させる配列を含んでもよい。本明細書で例示されるように、アデノウイルスベクターは、変種タンパク質のライブラリーを発現するようにデザインされてもよい。図１０に描写されるアデノウイルス発現ベクターは、構築のためのＧａｔｅｗａｙ（商標）エントリーおよびデスティネーションプラスミドを使用して得られる、ａｔｔ組換え部の位置を提供する。ＥＢＮＡ−１ＤＮＡ配列が位置し得る、１つの可能な位置もまた描写される。ベクター構成要素のその他の位置および方向が検討される。ベクター領域の方向および／または相対的位置は、変動してもよいことが、当業者によって理解される。

８．７実施例７ＨＳＡおよびドメインＩＩＩのためのその他のディスプレイプラットフォームの使用
ファージディスプレイおよび哺乳類細胞表面提示技術もまた、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩの可能なディスプレイプラットフォームとして評価された。ファージディスプレイプラットフォームは、恐らくこれらの分子中の多数のジスルフィド結合のために、細菌細胞表面にＨＳＡおよびドメインＩＩＩのどちらも発現しなかった（データ示さず）。しかし２９３−Ｆ細胞中の一過性の表面発現を使用する、哺乳類細胞ディスプレイシステムは、崩壊促進因子からのグリコシルホスファチジルイノシトール（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｉｓｏｔｏｌ）（ＧＰＩ）アンカーシグナルによって媒介され（例えば米国特許出願公開第２００７／０１１１２６０号明細書に記載される変異ＤＡＦ）、ＨＳＡおよびドメインＩＩＩを成功裏に提示した。提示されるタンパク質は、ＦｃＲｎ結合能力を保持した（データ示さず）。

ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称される追加的な哺乳類発現構築物が生成され、その中ではエピトープタグ（例えばＦｌａｇタグ）が二重染色のために付加され、リンカーがＨＳＡの５’および３’の双方に付加されて、融合タンパク質の可撓性を増大させてＨＳＡのＦｃＲｎへの結合を促進し（図１１Ａ）、この構築物は一過性形質移入のために直接使用され、またはｐＡｄ−ＨＳＡ−ＧＰＩと称されるＯｒｉＰ配列もまた組み込むアデノウイルス発現ベクターの生成のために使用される。機能性ＨＳＡは、双方の一過性形質移入アッセイで（データ示さず）、アデノウイルス発現系を使用して、哺乳類細胞（例えば２９３Ｆ細胞）表面で、この構築物から発現された。図１１は、抗ＨＳＡ（図１１Ｂ）、または２５μｇ／ｍｌおよび５μｌ／ｍｌのＦｃＲｎ（それぞれ図１１Ｃおよび１１Ｄ）で染色された細胞のヒストグラムにおける、結果として生じた移行を示す。したがってＨＳＡおよびドメインＩＩＩ変種を発現して、このような変種を（ｉ）ＦｃＲｎへの結合、および（ｉｉ）例えば非変種構築物と比較して、増大した親和性でＦｃＲｎに結合する能力について、スクリーニングする、いくつかの可能なシステムが存在する。

細胞表面にＨＳＡを提示するための２９３Ｆ細胞の形質移入：１．５μｇのプラスミドおよび２．２５μｌの２９３フェクチンを別個の試験管内の１００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加して、室温で５分間インキュベートし、次に２つの構成要素を共に合わせた。室温でさらに２０分間インキュベーションした後、混合物を２４穴ディープウェルプレート内において、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で、２ｍｌの２９３Ｆ細胞に添加した。８％ＣＯ_２の存在下、２５０ｒｐｍで形質移入細胞を２４時間培養した。

アデノウイルス発現ベクターの生成と使用：Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、エントリーベクター（ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩ）中のＨＳＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎデスティネーションベクターに組換えて、アデノウイルス発現ベクターを生成した。簡単に述べると、１５０ｎｇのｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩベクター、３００ｎｇのｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌのＬＲＣｌｏｎａｓｅＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴＥ緩衝液を合計１０μｌの反応混合物に添加した。２５℃で一晩の培養後、２μｌの反応混合物を使用し、製造会社のプロトコルに従って、Ｏｎｅ−ｓｈｏｔＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換ＴＯＰ１０細胞をアンピシリンプレート上に播種して、３７℃で一晩培養した。単一コロニーを拾ってＬＢ培地に入れ、プラスミドを調製した。アデノウイルス発現ベクターを含有するＨＳＡ遺伝子をＰａｃＩで直線化してから、形質移入してアデノウイルスを生成した。２μｇの直線化アデノウイルスベクターおよび６μｌのｌｉｐｏｆｅｃａｔｉｎｅ−２０００を使用して、２９３Ｅ細胞を形質移入してアデノウイルスを生成した。形質移入後７日目に、２〜３回、交互に凍結（−８０℃）および解凍（３７℃）することにより、アデノウイルスを形質移入細胞から放出した。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞残骸を除去し、アデノウイルス含有上清を新しい試験管内に等分して、−８０℃で保存した。製造会社の使用説明書に従って、Ａｄｅｎｏ−ＸＴＭｒａｐｉｄｔｉｔｅｒｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：ＰＴ３６５１−２）を使用してウイルス力価を判定した。ＨＳＡ構築物発現のために、アデノウイルスをＭＯＩ＝１で使用した。

８．８実施例８：ＦｃＲｎ結合エピトープを同定するためのＤＩＩＩ上の表面露出ループのアラニンスキャニング変異誘発
本実施例は、ＨＳＡへのＦｃＲｎ結合仲介における、ドメインＩＩＩ上の表面露出ループの役割を描写する。

ドメインＩＩＩは２０５個のアミノ酸残基から構成され、９つのループを介して連結し、６個のジスルフィド結合を通じて安定化される１０個のへリックスをコードする（Ｓｕｇｉｏｅｔａｌ．１９９９，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１２：４３９−４６、およびＰＤＢ：１ＢＭ０）。これらのループを構成するアミノ酸残基の位置、ならびに各ループの長さを下に列挙する。アミノ酸の番号付けは、完全長成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号２）中のループの位置に対する。
ループ１：残基３９８〜４００＝３個のアミノ酸
ループ２：残基４１５〜４１９＝５個のアミノ酸
ループ３：残基４３９〜４４３＝５個のアミノ酸
ループ４：残基４６８〜４７０＝３個のアミノ酸
ループ５：残基４８０〜４８２＝３個のアミノ酸
ループ６：残基４９２〜５０９＝１８個のアミノ酸
ループ７：残基５１６〜５１７＝２個のアミノ酸
ループ８：残基５３７〜５４１＝５個のアミノ酸
ループ９：残基５６１〜５６４＝４個のアミノ酸

ループ番号２、３、６、８、および９は、溶媒接近可能であり、分子表面に露出する（Ｓｕｇｉｏｅｔａｌ．同所、およびＰＤＢ：１ＢＭ０）。

特定の実施例では、個々の表面接近可能なループ中の交互のアミノ酸をアラニンに変異させ（変異されないプロリンおよびシステインを除く）、１つのセットでは奇数の残基を変異させ、別のセットでは偶数の残基を変異させる。実験デザインを適合させるために１つの構築物のみを要するループ９を除いて、このような変異セットをループあたり２つ生成する。細胞表面提示のために、合計９つのこのような構築物をベクター中で生成し（例えばｐＹＤ１酵母ディスプレイベクター）、ＦｃＲｎ結合能力について評価する。変種は、出願に記載される標準生体外アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を使用して評価してもよい。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を提示する変種が、同定される。各変種はまた、スクリーニングされて、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨのみで起きて、中性ｐＨで起きないどうかが判定されてもよい。酸性ｐＨでは改善されるが、中性ｐＨでは改善されないＦｃＲｎ親和性は、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含んでなるトランケート型ＨＳＡまたはキメラポリペプチドの文脈で試験されてもよい。前述の事項は、野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、または変異なしのキメラポリペプチドと比較される。

特定の実施例では、前述のスクリーニング事項から得られる情報は、ＦｃＲｎ結合能力を保持しながら（または改善さえしながら）、バリエーションを受け入れやすい、表面接近可能なループ中の残基を同定する。その中で、このような同定された位置が他の２０個のアミノ酸のそれぞれに変異される、一連の変種が構築され、このような変種はまた、スクリーニングもされる。２つ以上の位置に変異を含むさらなる変種が、引き続いて構築され、スクリーニングされる。

特定の実施例では、変種のライブラリーが作成され評価される。

８．９実施例９：保存的表面露出残基のアラニンスキャニング変異誘発
アミノ酸配列アラインメントによって、１３の異なる動物種間において、ドメインＩＩＩ中で保存された表面接近可能なアミノ酸残基が同定された。このような保存された残基をアラニンに単独に変異させて、ＦｃＲｎ結合中におけるそれらの役割を判定する。

ＨＳＡのドメインＩＩＩアミノ酸配列は、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ウサギ、ブタ、ニワトリ、ロバ、スナネズミ、ヒツジ、ネコ、およびウマをはじめとする１２の異なる種からの血清アルブミンドメインＩＩＩ配列と比較され、全てのこれらの種間で保存された残基が同定された（図６Ａ〜Ｄ）。ニワトリＨＳＡは哺乳類ＨＳＡタンパク質と異なるので、哺乳類のみの第２のアラインメントが提供される（図６Ｅ〜Ｈ）。ブタ、ラット、マウス、イヌ、ヒツジ、ウサギ、およびウシからの血清アルブミンについては、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法、およびＳＰＲによって、ヒトＦｃＲｎに結合することが既に示されている（データ示さず）。別途の分析において、ドメインＩＩＩ中の表面露出残基は、インターネット上のＧＥＴＡＲＥＡ１．０βソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ）を使用して同定された。このソフトウェアは、個々の原子の接近可能表面積およびそれらの勾配を計算して、それぞれ接近不能および接近可能を示す「ｉ」または「ｏ」として表される、表面接近可能性について各アミノ酸残基をスコアする（表３）。これらの異なる全種間で保存され、また表面が露出してもいることがソフトウェアによって計算されてＨＳＡ結晶構造の手動検査によって確認されたアミノ酸が、同定された（表３の囲み）。

このように同定された全ての１８個のアミノ酸残基を単独にアラニンに変異させ、細胞表面ディスプレイ（例えばｐＹＤ１酵母ディスプレイシステム）を使用して、ＦｃＲｎ結合に対する影響について評価した。ドメインＩＩＩ単独、全長ＨＳＡタンパク質、トランケート型ＨＳＡ、または少なくともドメインＩＩＩを含んでなるキメラポリペプチドの１つまたは複数の文脈で、ドメインＩＩＩ変異が導入されてスクリーニングされる。保存された表面露出システインおよびプロリンは、分析に含まれない。

別の実施例では、全ての１８個のアミノ酸残基（またはアラニン実験が特定位置が置換に耐えないことを示唆する場合は、全１８個を下回る）をその他の１９個のアミノ酸残基のそれぞれに単独に変異させ、ｐＹＤ１酵母ディスプレイシステム（または別のディスプレイシステム）を使用して、ＦｃＲｎ結合に対する影響について評価する。

別の実施例では、変異組み合わせを含む変種を構築して評価する。変種は、出願に記載される標準生体外アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を使用して評価してもよい。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を提示する変種が、同定される。各変種はまた、スクリーニングされて、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨのみで起きて、中性ｐＨで起きないどうかが判定されてもよい。酸性ｐＨでは改善されるが、中性ｐＨでは改善されないＦｃＲｎ親和性は、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）少なくともドメインＩＩＩを含んでなるトランケート型ＨＳＡまたはキメラポリペプチドの文脈の１つまたは複数で試験されてもよい。前述の事項は、野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、または変異なしのキメラポリペプチドと比較される。

表３．表は、ドメインＩＩＩ中の全アミノ酸の溶媒接近性パラメータを描写する。図６Ａ〜Ｄで配列比較された全種間で保存された残基（配列番号２で提示される、成熟完全長ＨＳＡ配列に関して番号付けされる）を太字で示して（＃＃）で示し、表面接近可能であり、また配列比較された全種間で保存されてもいる残基を枠で囲んだ。ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ．さらに、ニワトリを除く、図６Ｅ〜Ｈで配列比較された全種間で保存された残基は（＠＠）で示した。残基は（ｉ）および（ｏ）として注釈され、それぞれ表面接近可能および表面接近不能を表示する。

８．１０実施例１０：単一アミノ酸変異体ライブラリーを作成するためのドメインＩＩＩ上の各残基の全ての可能なアミノ酸への変異誘発
システインおよびプロリンを除く、ドメインＩＩＩ中の全てのアミノ酸を全ての２０個のアミノ酸に変異させ（すなわち野生型アミノ酸および全ての１９個の非野生型アミノ酸）、個々の変異体が単一変異を１つの位置にのみ有するように、変異体ライブラリーを作成する。２０５個のアミノ酸の全長が、ライブラリー構築によってカバーされ；したがって１８４個の残基は個々に変異して、３４９６種の全ライブラリー多様性がもたらされる。ドメインＩＩＩ単独、全長ＨＳＡタンパク質、トランケート型ＨＳＡ、または少なくともドメインＩＩＩを含んでなるキメラタンパク質の１つまたは複数の文脈で、ドメインＩＩＩ変異が導入されてスクリーニングされる。標準変異誘発法を利用して、ドメインＩＩＩ変異体ライブラリーを作成し得る。任意選択的にまたは代案としては、ＧｅｎｅａｒｔＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙなどの商業施設によって、ドメインＩＩＩ変異体のライブラリーが、作成される。組換えアデノウイルスの生成改善のためにＯｒｉＰ配列を含んでなる（ＯｒｉＰを含んでなる汎用エントリーベクターの概略図については図１０を参照されたい）、上述される、ｐＹＤ１酵母ディスプレイベクターまたは哺乳類ディスプレイベクターｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩなどのディスプレイベクターに、変異体ライブラリーをクローンして、本出願に記載されるに標準生体外アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を使用して、ＦｃＲｎ結合能力についてスクリーニングする。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を提示する変種が、同定される。各変種はまた、スクリーニングされて、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨのみで起きて、中性ｐＨで起きないかどうかが判定されてもよい。酸性ｐＨでは改善されるが、中性ｐＨでは改善されないＦｃＲｎ親和性は、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）キメラポリペプチドの文脈で試験されてもよい。前述の事項は、野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、または変異なしのキメラポリペプチドと比較される。実験デザインは、ＦｃＲｎ親和性を改善する変異がある結合エピトープを同定できるようにする。

６×１０ｅ４個の独立した形質転換体を有する合成ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）ライブラリーが、上述したように作成された。ライブラリーは、個々の変異体が単一変異を１つの位置のみに有するようにデザインされたが、いくつかの二重変異、および三重変異でさえも生成された。合成ＤＩＩＩライブラリーをＰＣＲ増幅し、オーバーラップＰＣＲによってＤＩおよびＤＩＩと共に組み立てて、完全長ＨＳＡライブラリーを形成した。ＰＣＲをＳｆｉＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、同様に消化されたベクターｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩにクローンしたが、これは上述したようなＯｒｉＰ配列を含んでなる、改善された哺乳類ディスプレイＧａｔｅｗａｙ（商標）エントリーベクターである（例えば図８Ｂおよび１０を参照されたい）。ＤＩＩＩライブラリーを増幅するのに使用されたプライマーは、ＮおよびＣ末端に６個の野生型アミノ酸残基を有し、したがってドメインＩＩＩのこれらの１２個のアミノ酸の多様性は撤廃される。２つのライブラリーがｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩベクター中に作成され、相当するアデノウイルスライブラリーは、１２μｇのＰＡＣＩ直線化アデノウイルス発現ベクターがライブラリー作成に使用されたこと以外は、本質的に上述したように作成される。各ライブラリーのサイズが、（表４）に示される。ｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩライブラリーの多様性をライブラリー１中で調べたところ、約５０％のクローンが野生型であったのに対し、ライブラリー２では約３０％のクローンが野生型であった。

野生型ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリー１、またはＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリー２を発現するアデノウイルスによって感染された細胞は、本質的に上の実施例５に記載されるように、抗ＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体とＦｃＲｎ−ビオチンで染色され（ＳＡ−ＰＥにより検出）、後述するようにＦＡＣＳによって分析／スクリーニングした。野生型ＨＳＡおよび２つのライブラリーの発現レベルは、同等であった（図１２Ａ）。１０μｇ／ｍｌのＦｃＲｎで染色した際に、ＨＳＡ−ＤＩＩＩライブラリーを発現する細胞集団のみがヒストグラム中で移行を示した（図１２Ｂ）。図１３は、対応する二重染色ＦＡＣＳプロファイルを示す。選別から回収された富化細胞集団は、増幅されて、選別により２回目の富化を受け、または後述するように個々のクローンを単離するのに使用された。図１４Ａのヒストグラムに見られるように、野生型ＨＳＡ、出発ライブラリー、およびソートされたライブラリーの発現レベルは同等である。しかしＦｃＲｎによる染色は、１回および２回ソートされたライブラリーが、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌにさえ至る低濃度で存在する、ＦｃＲｎと結合し得るＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体を発現する細胞について、富化されていることを示す（図１４ＢおよびＣ）。

いくつかの個々のクローンは、（後述されるように）単離され、実験をｐＨ７．２で実施したこと以外は、本質的に上の実施例２に記載されるようにして、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合についてスクリーニングされる。図１５は、ｐＨ５．５（パネルＡ）およびｐＨ７．２（パネルＢ）における、対照細胞、野生型ＨＳＡ、およびいくつかの代表的クローンの代表的ヒストグラムを示す。これらのＨＳＡ変異体と野生型ＨＳＡの発現レベルは、同等である（図１５Ｃ）。図１６に示されるように、ｐＨ依存性結合（すなわち低ｐＨにおける優先的な結合）を保持すると同定されたクローンを配列決定し、いくつかのＦｃＲｎ濃度（例えば０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌのＦｃＲｎ−ビオチン）を使用して、野生型ＨＳＡおよび対照細胞と共に、追加的ＦＡＣＳ分析を実施し、ＦｃＲｎに対する変異体の相対的親和性を分析してもよい。さらに、任意のその他の特性解析に先だって。富化集団からの約１１００個のクローンを配列決定した。表５は、ライブラリーから単離および／または配列決定されたクローン中において同定された、アミノ酸置換の概要を提供する。太字の位置は、約１〜５％のクローンではこの位置に置換が見られ、「好ましいスポット」であると称されてもよいことを示す。太字下線の位置は、５％を超えるクローンではこの位置に置換が見られ、「ホットスポット」であると称されてもよいことを示す。斜体で列挙されるアミノ酸置換（置換ＡＡの列）は、二重／三重変異の文脈でのみ同定された。５個以上のクローンで見られるアミノ酸置換（置換ＡＡの列）は、太字で示される。３つ以上のクローンで見られる組み合わせもまた太字で示され、同定されたクローン数が括弧内に示される。アミノ酸番号は、配列番号２で提供される成熟完全長ＨＳＡに関する。同一アミノ酸置換を同一位置に、および／または異なるアミノ酸置換を同一位置に含有する複数クローンが単離され（表５を参照されたい）、これらの位置が、変異ホットスポットに相当してもよいことが示唆される。

ＨＳＡの解析された構造体上における、いくつかの好ましいスポットおよび／またはホットスポットの位置が、図１７に示される。アミノ酸４０７、４１５、および４６３を除く、ホットスポットおよび好ましいスポットの大部分は、ループ６および７（それぞれ残基４９２〜５０９および５１６〜５１８を包含する）およびへリックス７および（それぞれ残基５１０〜５１５および５１９〜５３６を包含する）中に見られ、図１６中で丸で囲まれる。

このように同定されたいくつかの変異体は、部位特異的変異誘発によって、可溶性タンパク質として生成され、さらなる分析のために後述するようにして精製された。結合親和性（ｐＨ５．５においてＫ_Ｄ）およびｐＨ依存性（７．２対５．５）は、（後述するような）ＰｒｏｔｅＯｎおよび／または（本質的に上述したような）ＢＩＡｃｏｒｅによって測定された。表６は、結合研究の概要を提供し、これらの研究のタンパク質密度を含む。いくつかの変異体は、ｐＨ５．５において、表６中で太字表記されるＬ４０７Ｙ／Ｑ５２６Ｔ；Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；Ｉ５２３Ｇ；Ｖ４２４Ｑ；Ｌ８３Ｎ／１２８Ｒ／Ｉ１４３Ｇ；およびＫ１４４をはじめとする、結合強化を有することが分かった。これらの試験された中で、ｐＨ５．５で結合増強を示した全てが、ｐＨ依存性結合を維持することもまた分かった（表６の最後の列を参照されたい）。いくつかのアッセイされた変異体は、ｐＨ５．５において、無変化であり、またはＫ_Ｄが増大さえすることが分かった（すなわち無変化またはより劣る結合）。このようなクローンが同定されるいくつかの可能な理由があり、例えばこれらの変異は、ディスプレイシステム中におけるタンパク質の発現または安定性を高めてもよい。また提示に使用されるＧＰＩアンカーが、結合に何らかの影響を及ぼす可能性もあり、変異ＨＳＡが可溶性分子として発現される場合に、複製されないものをこれらの変異体が代償し得る。さらにスクリーニング手順のデザインは、オフ速度安定化変異体を捕捉するために最適化され、それが全体的な親和性改善に変換されても、されなくてもよい。それはまた、これらの変異が、１つまたは複数のその他の変異と組み合わされた場合に、増強を提供することを反映してもよい。いくつかの変異は、組み合わさって見られた（表５を参照されたい）。

細胞染色およびＦＡＣＳ分析および選別：密度１×１０^６／ｍｌの３０００万個の２９３Ｆ細胞に、ＭＯＩ＝１でＨＳＡアデノウイルスライブラリーを感染させた。遠心分離による形質導入の１６時間後に細胞を収集し、冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、約１×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁した。１回目の選別のために、ビオチン化ＦｃＲｎを１０μｇ／ｍｌ（２１２ｎＭ）で添加した。４℃で６０分間の培養後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：５００の希釈でストレプトアビジン−ＰＥに再懸濁した。４℃で３０分間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄して、ＦｃＲｎ結合についてソートした後、ｐＨ５．５でＦｃＲｎに結合する細胞を富化した。ソートされた細胞を追加的なスクリーニングのために増幅した。２回目の選別では、１μｇ／ｍｌ（２１．２ｎＭ）でビオチン化ＦｃＲｎを使用したこと以外は、本質的に上述したようにして富化細胞集団をソートし、高親和性ＨＳＡ変異体をさらに富化した。富化ライブラリーの追加的な分析は、０．１μｇ／ｍｌ（２．１２ｎＭ）でもまた実施され、例えば図１４を参照されたい。いくつかのスクリーニングでは、１回目または２回目のスクリーニングに、「除外」ステップが組み込まれ、その中で富化細胞集団がソートされて、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）でＦｎＲｃに結合するものが除去された。個々のクローンを同定するために、ウイルスＤＮＡが富化細胞集団から抽出され、２９３Ｆ細胞の一過性形質移入のために、ＤＩＩＩＨＳＡ変種を哺乳類発現ベクターにクローンされる。本質的に上述したように、ｐＨ５．５およびｐＨ７．４において、フローサイトメトリーによって、個々のクローンをｐＨ依存性結合についてスクリーニングする。

ＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体の生成および発現：特異的変異誘発プライマーを使用して、哺乳類発現ベクター中で標準プロトコル（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩＸＬ部位特異的変異誘発キット、Ａｇｉｌｅｎｔ；カタログ番号２００５２１）を使用して、野生型ＨＳＡを変異させていくつかのＤＩＩＩ変異体を生成する。製造会社のプロトコルに従って、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｓｋｕ１２３４７−０１９）を用いた一過性形質移入によって、変異体が２９３Ｆ細胞中で発現され、変異体は標準手順を使用して、抗ＦＬＡＧＭ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ２２２０）上で精製される。このように精製された全ての変異体をＳＤＳＰＡＧＥ、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、純度と凝集を評価した。全ての変異体は約９９％純粋と判定され、著しい凝集はなかった（単量体が９５％を上回る）（データ示さず）。

ＰｒｏｔｅＯｎ解析：ＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）上で、ＨＳＡ変種に対するヒトＦｃＲｎの親和性（ＫＤ）を測定した。簡単に述べると、製造会社によって概説されるように、ＰｒｏｔｅＯｎアミン共役キットを使用して、ＨＳＡ変種をＰｒｏｔｅＯｎＧＬＭセンサーチップ上の別個のフロー表面に高密度で固定化した。最終表面ＨＳＡ密度は、３７４０〜３９５０ＲＵであった。参照フロー表意もまた、いかなるタンパク質もなしに同一固定化プロトコルを使用して、チップ上で調製した。共役タンパク質と参照セル表面の双方の上に、５０ｍＭのＰ０４、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ５．５中の５．８６ｎＭ〜１００００ｎＭの範囲にわたるヒトＦｃＲｎの２倍連続希釈液を２５μＬ／分の流速で注入した。８分間にわたり結合データを収集し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水の複数回の６０秒間の注入による再生がそれに続いた。各注入の平衡結合応答（Ｒｅｑ）を濃度に対してプロットして、ＰｒｏｔｅＯｎＭａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して、定常状態親和性モデルに適合させて平衡結合定数ＫＤを導出した。

この分析に基づいて、同定された組み合わせ変異のさらなる分析を実施して、個々の変異の活性を評価した。それに加えて、変異の異なる組み合わせ（例えばスクリーニング中に直接同定されなかった、２つ以上の位置に変異を有する構築物）が、ＦｃＲｎに対する親和性改善を提供するかどうかを同定する、さらなるスクリーニングが行われる。

８．１１実施例１１：ドメインＩＩＩ上の選択された残基のコンビナトリアル変異誘発
実施例１０（上記）で同定される最も頻度の高い変異の組み合わせを調べるために、残基４０７；４１５；４６３；４９５；５０８；５０９；５１１；５１２；５１５；５１６；５１７；５２１；５２３；５２４；５２６；５２７；および５５７が、表７に示される残基に変異されるように、合成ドメインＩＩＩライブラリーを作成して、個々の変異体が２〜４個の変異を有するように、変異体ライブラリーを作成する。代案としては、列挙される各残基が、全ての２０個のアミノ酸（すなわち野生型アミノ酸と全ての１９個の非野生型アミノ酸）に変異されるようにライブラリーを作成して、より大規模な組み合わせのセットを調べてもよい。

ドメインＩＩＩ単独、全長ＨＳＡタンパク質、トランケート型ＨＳＡ、または少なくともドメインＩＩＩを含んでなるキメラタンパク質の１つまたは複数の文脈で、ドメインＩＩＩコンビナトリアル変異が導入されてスクリーニングされる。標準変異誘発法を利用して、ドメインＩＩＩ変異体ライブラリーを作成し得る。任意選択的にまたは代案としては、ＧｅｎｅａｒｔＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙなどの商業施設によって、ドメインＩＩＩ変異体のライブラリーが、作成される。

コンビナトリアル変異体のライブラリーは、上述したようなｐＹＤ１酵母ディスプレイベクターまたは哺乳類ディスプレイベクターｐＥＮ−ＨＳＡ−ＧＰＩなどのディスプレイベクターにクローンされ、本出願に記載される標準生体外アッセイ（例えばフローサイトメトリー）を使用して、ＦｃＲｎ結合能力についてスクリーニングされる。実施例１０に記載されるものなどの陽性および／または負の選択法を用いてもよい。ＦｃＲｎに対する親和性改善を提示するコンビナトリアル変種が、同定される。各コンビナトリアル変種はまた、スクリーニングされて、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨのみで起きて、中性ｐＨで起きないどうかが判定されてもよい。酸性ｐＨでは改善されるが、中性ｐＨでは改善されないＦｃＲｎ親和性は、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）キメラポリペプチドの文脈で試験されてもよい。前述の事項は、野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、または変異なしのキメラポリペプチドと比較されてもよい。代案としては、または任意選択的に、コンビナトリアル変異をドメインＩＩＩ、完全長ＨＳＡ、または各変異を単独に含んでなるキメラポリペプチドと比較して、組み合わせが、ＦｃＲｎ親和性および／または血清半減期をさらに高めるかどうかを判定もよい。実験デザインは、ＦｃＲｎ親和性を改善しおよび／または血清半減期改善するコンビナトリアル変異を同定できるようにする。

８．１２実施例１２：ＦｃＲｎ親和性改善についてスクリーニングされる、単一アミノ酸変異体をもたらすドメインＩＩＩ上の残基の変異誘発
１８個の単一アミノ酸がドメインＩＩＩ中の保存アミノ酸から選択され、本出願に記載される標準法を使用して、各変種が単一変異を１つの位置のみに有するように、単独にアラニンに変異させる。１８個の変種を導入して、全長ＨＳＡタンパク質の文脈で、または代案としてはトランケート型ＨＳＡ、または少なくともドメインＩＩＩを含んでなるキメラタンパク質中でスクリーニングする。本出願に記載されるｉ標準生体外アッセイを使用して、ＦｃＲｎ結合能力について１８個の変種をスクリーニングする。ＦｃＲｎに対する親和性改善を提示する変種が、同定される。各変種はまた、スクリーニングされて、ＦｃＲｎ親和性改善が酸性ｐＨのみで起きて、中性ｐＨで起きないどうかが判定される。酸性ｐＨでは改善されるが、中性ｐＨでは改善されないＦｃＲｎ親和性は、（ｉ）変種ドメインＩＩＩ構築物のみ；（ｉｉ）完全長ＨＳＡの文脈で提示される変異ドメインＩＩＩ構築物；または（ｉｉｉ）キメラポリペプチドの文脈で試験されてもよい。前述の事項は、野生型ドメインＩＩＩ、野生型完全長ＨＳＡ、または変異なしのキメラポリペプチドと比較される。

この分析に基づいて、変異の組み合わせ（例えば２つ以上の位置に変異を有する構築物）が、ＦｃＲｎ親和性改善を提供するかどうかを同定するためのさらなるスクリーニングが実施される。

８．１３追加的な「ホットスポット」変種およびコンビナトリアル変種
位置４６３、５０８、５２３、および５２４を全ての１９個の非野生型アミノ酸に別々に変異させ、本質的に上述したように、７６個の個々の点変異のセットをクローンして発現させた（「ＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体の生成および発現」と題された上の節を参照されたい）。チップと共役している抗ＨＳＡ（非ドメインＩＩＩバインダー）を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施し、細胞上清からＨＳＡ変種を捕捉した。次にヒトＦｃＲｎをチップ上に通過させてｐＨ５．５で結合させ、ｐＨ５．５における結合と解離を測定した。この構成では、解離定数（ｋｄ（１／ｓ））が、結合定数よりもさらに正確である。野生型ＨＳＡよりも少なくとも２．５倍遅いオフ速度を有する単一変異体の結合定数が、表８に提供される。表８を見ても分かるように、これらの位置における多数の置換が、野生型ＨＳＡと比較して、より緩慢なオフ速度と、ＦｃＲｎ結合改善をもたらす。

実施例１０（上記）で同定された「ホットスポット」変異のそれぞれが合わさった一連の二重、三重、四重のＨＳＡ変異組み合わせが生じた。「ホットスポットコンビナトリアル」変異体をクローンして発現させ、本質的に上述したようにして、平衡結合定数およびｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合（ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓｍｏｎｋｅｙ））を測定した（「ＨＳＡ−ＤＩＩＩ変異体の生成および発現」および「反応速度測定」と題された上記の節を参照されたい）。ｐＨ５．５および７．４において、流速５μｌ／分で３μＭのＦｃＲｎを注入し、ｐＨ５．５と比較したｐＨ７．４における平衡時の応答率を導出し、ＦｃＲｎ結合のｐＨ依存性を計算した。表９に要約されるように、「ホットスポット」コンビナトリアル変異のそれぞれは、結合親和性に少なくとも２〜３倍の改善を示し、四重変異が最大の改善（２０〜７５倍）を示した。これに加えて、変異体のいくつかは、ほぼ野生型レベルのｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を維持した（Ｌ４６３Ｎ／Ｔ１２８Ｒ；Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；およびＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ）。いくつかの「ホットスポット」コンビナトリアルＨＳＡ変種のＳＰＲ由来運動定数および平衡定数が、表１０に提供される。これに加えて、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓｍｏｎｋｅｙ）ＦｃＲｎに対するいくつかの「ホットスポット」コンビナトリアル変種のＳＰＲ由来平衡定数およびｐＨ依存性（表１０）は、ヒトＦｃＲｎで見られたのと同様であることが示された（表９）。

８．１４半減期測定
改善されたＦｃＲｎ結合ＨＳＡ変異体が、長期の半減期を有するという概念実証を試験するために、目下利用できる唯一のマウスモデルは、ｈｕＦｃＲｎｔｇｎマウスである（マウス遺伝子の同型接合ＫＯ、およびヒト遺伝子の異型接合ＫＩ）（ＰｅｔｋｏｖａＳ．Ｂｅｔａｌ，（２００６）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１２，ｐｐ．１７５９−１７６９）。このモデルは、ＨＳＡ半減期測定の観点から、ＷｔＨＳＡよりも１０倍高い親和性で、ヒトＦｃＲｎと結合する、マウス血清アルブミン（６００μＭ）の非常に高い循環濃度という、重大な限界を有する。しかしこのモデルは、試験されたＨＳＡ変種が、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と成功裏に競合できれば使用し得る。

生体外Ｂｉａｃｏｒｅ競合実験をデザインし、親和性改善を示す変異体がｈｕＦｃＲｎ結合について、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と成功裏に競合できるかどうかを予測した。これらの実験は、１μＭのＦｃＲｎを一連の濃度（４１ｎＭ〜１００μＭ）のＭＳＡと予備混合して、変異ＨＳＡ表面上に注入して実施し、ＭＳＡがＦｃＲｎ結合についてＨＳＡ変種と競合する能力を試験した。データを単一クラス競合的結合部位モデルに適合させて、ＩＣ_５０を計算した。

Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；およびＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇの３つの変異体が最初に試験され、これらの変異体のそれぞれが、ＦｃＲｎへの親和性改善を示し、ｐＨ依存性を維持した（表８を参照されたい）。Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３ＧおよびＬ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌは、ＷｔＨＳＡまたはＭＳＡよりも１０〜１５倍高いＩＣ_５０値を有することが分かった（表１１）。これらのＩＣ_５０値はオフ速度測定値に合致し、Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３ＧおよびＬ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌが、ＦｃＲｎとより安定した複合体を形成することが示唆された。

次にこれらの３つの各変異体の半減期が、ｈｕＦｃＲｎｔｇｎマウス中で生体内測定された（下のＰＫ解析を参照されたい）。表１１に示されるように、このモデル系変異体Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌは、半減期に５時間の改善を示し、変異体Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇは３時間の改善を示す。しかし変異体Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇは、モデル中でＷｔよりも急速に除去された。Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇのより急速なクリアランスは、上述のように、マウスモデルの限界に起因する人為結果であってもよい。代案としては、変異が、タンパク質の生体内安定性に影響を及ぼしてもよく、またはその生体内分布に影響を及ぼしてもよい。Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４ＬおよびＴ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇの半減期の値は、変異体のオフ速度プロファイルと一致する。またこれらのデータは、ＭＳＡとの競合実験を使用して実施されたＩＣ_５０測定値ともと一致する。

ＰＫ解析：野生型ＨＳＡ（ＷｔＨＳＡ）またはＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ、Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ、Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ変種が、Ｎ末端Ｈｉｓ１０タグを保有するように生成された。全てのタンパク質は、既述のように２９３Ｆ細胞中で発現され、製造会社の説明に従って、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−５２４８−０２）からのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムを使用して精製された。ｈｕＦｃＲｎｔｇｎマウスに、１５ｍｇ／ＫｇのＷｔＨＳＡまたはＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ、Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ、Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ変種を尾静脈を介して静脈内輸液し、１、１６、２４、４８、７２、９６、および１２０時間の時点において、５匹のマウス／時点／群を使用して血清サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡによって、マウスからの血清サンプルを分析した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを（当施設内で生成された）抗ＨｉｓｍＡｂでコーティングし、血清サンプルの適切な希釈液とのインキュベーションがそれに続き、ウサギ抗ＨＳＡポリクローナル抗体（ＡｂＣａｍ；カタログ番号ＡＢ６０１９１）およびロバ抗ウサギ−ＩｇＧＨＲＰ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号７１１−０３５−１５２）を用いて、血清中に残留するＨＳＡ／変種の量を検出した。全ての動物実験は、施設内審査委員会によって認可された。

ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖ５．２；ＰｈａｒｓｉｇｈｔＣｏｒｐ．）を使用して、ノンコンパートメント解析を実施して、平均血清タンパク質濃度時間プロファイルから、薬物動態学的パラメータを判定した。Ｃ_{ｐ，ｌａｓｔ}／λ_ｚ（式中、λ_ｚは、最小二乗によって、排除の最終相に適合された線の傾斜であった）から、最後の測定値を超える面積（Ｃ_{ｐ，ｌａｓｔ}）を推定して、対数台形法を使用して、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。タンパク質のクリアランス（ＣＬ）値は、ＣＬ＝用量／ＡＵＣから計算され、用量は輸液されたｃｐｍであった。半減期（ｔ_１／２）は、ｌｎ２／λ_ｚから計算された。

９配列
配列番号１−ヒトＨＳＡＤＩＩＩタンパク質配列

配列番号２−ヒト完全長ＨＳＡタンパク質配列

配列番号１８

図６は、様々な種からの血清アルブミンタンパク質のドメインＩＩＩのアラインメントを提供する。

ラット血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号３として記載される。ラット血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号４として記載される。ウシ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号５として記載される。ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号２として記載される。イヌ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号６として記載される。ウサギ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号７として記載される。ブタ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号８として記載される。ニワトリ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号９として記載される。ロバ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号１０として記載される。スナネズミ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号１１として記載される。ヒツジ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号１２として記載される。ネコ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号１３として記載される。ウマ血清アルブミンのドメインＩＩＩの野生型アミノ酸配列は、図６で配列番号１４として記載される。

本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、あたかも個々の出版物または特許を具体的に個々に参照によって援用すると示されるように、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。これに加えて、２０１０年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／３０４，９５４号明細書；および２０１０年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／３６４，５０３号明細書は、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって援用する。

主題発明の特定の実施形態を考察したが、上の明細書は例示的であり、限定は意図されない。本発明の多数のバリエーションは、本明細書および下の請求項を検討すれば、当業者には明白である。本発明の全範囲は、このようなバリエーションと共に、その同等物の完全な範囲および明細書と共に、特許請求の範囲を参照して判定されるベきである。

Claims

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分を含んでなるポリペプチドであって、そのＨＳＡ部分がＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片を含んでなり、前記ＨＳＡドメインＩＩＩ、またはその新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合断片が、完全長成熟ＨＳＡ中の位置に対応して番号付けされた、
（ａ）残基４６３および５０８；
（ｂ）残基４６３および５２３；
（ｃ）残基４６３および５２４；
（ｄ）残基５０８および５２３；
（ｅ）残基５０８および５２４；
（ｆ）残基５２３および５２４；
（ｇ）残基４６３、５０８、および５２３；
（ｈ）残基４６３、５０８、および５２４；
（ｉ）残基４６３、５２３、および５２４；
（ｊ）残基５０８、５２３、および５２４；および
（ｋ）残基４６３、５０８、５２３、および５２４
からなる群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含んでなり、前記置換が、ＨＳＡ部分が前記アミノ酸置換を含まない対照ポリペプチドと比較して、前記ポリペプチドのＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる、ポリペプチド。
Ｘ_１がロイシンでなく、および／またはＸ_２がスレオニンでなく、および／またはＸ_３がイソロイシンでなく、および／またはＸ_４がリジンでない、配列番号１８を含んでなるポリペプチドであって、Ｘ_１がロイシンであり、Ｘ_２がスレオニンであり、Ｘ_３がイソロイシンであり、Ｘ_４がリジンである対照ポリペプチドと比較して、ＦｃＲｎ親和性増大および血清半減期増大の片方または双方を有するポリペプチド。
Ｘ_１が、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、セリン、またはグルタミンであり；Ｘ_２がシステイン、グルタミン酸、イソロイシン、リジン、アルギニン、またはセリンであり；Ｘ_３が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンであり；およびＸ_４が、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、スレオニン、またはバリンである、請求項２に記載のポリペプチド。
Ｘ_１がアスパラギンであり、および／またはＸ_２がアルギニンであり、またはＸ_３がグリシンであり、および／またはＸ_４がロイシンである、請求項２に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、前記対照ポリペプチドよりも高い親和性でＦｃＲｎに結合し、前記親和性が酸性ｐＨで測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
残基４６３における置換が、Ｌ４６３Ｃ、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｇ、Ｌ４６３Ｈ、Ｌ４６３Ｉ、Ｌ４６３Ｎ、Ｌ４６３Ｓ、Ｌ４６３Ｑから選択され；残基５０８における置換が、Ｔ５０８Ｃ、Ｔ５０８Ｅ、Ｔ５０８Ｉ、Ｔ５０８Ｋ、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓから選択され；残基５２３における置換が、Ｉ５２３Ａ、Ｉ５２３Ｃ、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｈ、Ｉ５２３Ｉ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｌ、Ｉ５２３Ｍ、Ｉ５２３Ｎ、Ｉ５２３Ｐ、Ｉ５２３Ｑ、Ｉ５２３Ｒ、Ｉ５２３Ｓ、Ｉ５２３Ｔ、Ｉ５２３Ｖ、Ｉ５２３Ｗ、Ｉ５２３Ｙから選択され；および残基５２４における置換が、Ｋ５２４Ａ、Ｋ５２４Ｆ、Ｋ５２４Ｇ、Ｋ５２４Ｈ、Ｋ５２４Ｉ、Ｋ５２４Ｌ、Ｋ５２４Ｍ、Ｋ５２４Ｑ、Ｋ５２４Ｔ、Ｋ５２４Ｖから選択される、請求項１、または請求項５〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
残基４６３における置換が、Ｌ４６３Ｆ、Ｌ４６３Ｎから選択され；残基５０８における置換が、Ｔ５０８Ｒ、Ｔ５０８Ｓから選択され；残基５２３における置換が、Ｉ５２３Ｄ、Ｉ５２３Ｅ、Ｉ５２３Ｆ、Ｉ５２３Ｇ、Ｉ５２３Ｋ、Ｉ５２３Ｒから選択され；残基５２４における置換がＫ５２４Ｌである、請求項７に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換が、
（ａ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ；
（ｂ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ；
（ｃ）Ｌ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌ；
（ｄ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；
（ｅ）Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；
（ｆ）Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；
（ｇ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ；
（ｈ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌ；
（ｉ）Ｌ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；
（ｊ）Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ；および
（ｋ）Ｌ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌ
からなる群から選択される、請求項７または８に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＴ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＴ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＴ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
ＨＳＡドメインＩＩＩ中の前記アミノ酸置換がＬ４６３Ｎ／Ｔ５０８Ｒ／Ｉ５２３Ｇ／Ｋ５２４Ｌである、請求項９に記載のポリペプチド。
配列番号のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
前記ポリペプチドが、異種タンパク質の機能活性を保持してＦｃＲｎに結合でき、異種タンパク質を含んでなる請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記異種タンパク質が、抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる、請求項２１に記載のポリペプチド。
前記異種タンパク質が、治療用タンパク質を含む、請求項２１または２２に記載のポリペプチド。
前記異種タンパク質が、前記ＨＳＡ部分と化学的にまたは組換え的に結合している、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、異種非タンパク質作用物質の機能活性を保持しＦｃＲｎに結合できる、非タンパク質作用物質に結合する請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記異種タンパク質または前記非タンパク質作用物質が、前記ＨＳＡ部分のＮ末端アミノ酸に、前記ＨＳＡ部分のＣ末端アミノ酸に、または前記ＨＳＡ部分の内部アミノ酸に結合している、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ＨＳＡ部分がＨＳＡドメインＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部；またはＨＳＡドメインＩの少なくとも一部と、ＨＳＡドメインＩＩの少なくとも一部をさらに含んでなる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物。
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項２８に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含んでなる、それを必要とする対象を治療する方法。
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、核酸構築物。
タンパク質を請求項１〜１５または２７のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合させるステップを含んでなる、タンパク質のＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる方法。
非タンパク質作用物質を請求項１〜１５または２７のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合させるステップを含んでなる、非タンパク質作用物質のＦｃＲｎ親和性および血清半減期の片方または双方を増大させる方法。