JP2016192960A - 血小板分離基材および血小板製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】巨核球と、巨核球から産生された血小板との効率的な分離を実現する血小板分離基材を提供する。【解決手段】巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔質体からなる分離基材であって、前記多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である血小板分離基材。【選択図】なし

Description

本発明は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための分離基材および当該分離基材を用いた血小板製剤の製造方法に関する。

血小板製剤は、骨髄抑制や急性白血病、再生不良性貧血や骨髄異形成症候群等の患者に投与するものである。現行の血小板製剤は、ボランティアからの献血に完全に依存している。しかしながら、超高齢化社会の到来に伴い献血可能年齢層の人口が減少し続けており、２０２７年には日本における必要献血延べ人数が約５４５万人に対して約８５万人の献血延べ人数が不足すると予測されている（非特許文献１）。血小板の保存期間は約４日間とされており、血小板製剤を長期且つ大量に備蓄することは極めて困難であり、継続的に新鮮な血小板製剤を得ることが強く望まれている。つまり、現行の献血に完全に依存した血小板製剤では、将来的な血液の供給不足を解消することは極めて困難である。

上記課題を解決する一つの手法として、血小板を産生する巨核球を幹細胞から分化させ、大量培養することで、献血に依存せずに血小板製剤を製造する技術が研究されている。この技術の特徴として、患者由来（自家）細胞はもちろん、ヒト血小板抗原（ＨＰＡ）が適合するボランティア由来（他家）細胞を用いて血小板を産生できることが挙げられる。また現行の血小板製剤は白血球が含まれるためヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合しない場合、重篤な副作用が懸念されるが、幹細胞由来の血小板を製造できれば白血球や赤血球が含まれることはないため、上記副作用のリスクを払拭することができる。

しかしながら、幹細胞から分化させ目的の細胞を得ようとした場合、ほとんどの場合、目的の細胞以外に未分化な幹細胞等が混在した状態となる。よって得られた細胞を治療に用いるためには、目的の細胞を分離する必要がある。例えば巨核球から分化させた血小板を製剤化する場合、巨核球と血小板を分離する必要がある。

血液から血小板を分離する方法としては遠心分離が一般的に用いられている（特許文献１）。遠心分離は現行の血小板製剤の精製にも用いられている。また、白血球と血小板を高精度に分離するため、濾材表面の白血球との親和性を向上させ、吸着分離する技術も報告されている（特許文献２）。

特表２０１４−５０７２５５号公報 特開２００４−１３００８５号公報

「我が国における将来推計人口に基づく輸血用血液製剤の供給本数等と献血者数のシミュレーション（２０１４年試算）」， 日本赤十字社血液事業本部

血液から血小板を分離する方法として一般的に用いられる遠心分離は、密度が近似する細胞同士を分離することが難しい。一方、吸着分離法では、目的の細胞を吸着させ最終的に回収する方法や目的の細胞以外の細胞を吸着させ目的の細胞のみを回収する方法があり、効率よく純度の高い細胞液を回収できる一方で、表面性状が近似する細胞同士（例えば巨核球と血小板）を分離することが難しい。そのため、これらの手法は、密度も表面性状もともに近似する血小板と巨核球を効率的に分離する手法としては不十分であった。本発明は、巨核球と、巨核球から産生された血小板との効率的な分離を実現することを課題とする。

上記課題を解決するための本発明は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔質体からなる分離基材であって、前記多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である血小板分離基材である。

本発明によれば、巨核球と血小板とを効率的に分離することでき、培養細胞由来の血小板製剤の製造に寄与する。

本発明において多孔質体とは、小さな空隙を多数内部に有する平均孔径２０μｍ以下の構造体であり、例えば繊維構造体、スポンジ体、多孔膜及びこれらの積層体、ビーズ充填カラムからなる群より選択されるいずれかで構成されるものが挙げられる。なお、本発明において、多孔質体の平均孔径とは、バブルポイント法（ＡＳＴＭＦ３１６−８６、ＪＩＳ Ｋ３８３２）によって少なくとも３回測定した結果の平均値とする。測定装置の例としては、Ｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｉｎｃ．製のＡｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｒｍ Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒが挙げられ、例えば試験液としてＧａｌｗｉｃｋを用いることができる。

繊維構造体とは繊維が絡み合って一つの構造をなしているものであり、例えば、織物、編物、組紐、不織布および繊維をカラムに充填したものが挙げられるが、作製の容易性の点から特に不織布が好ましい。不織布の製法としては乾式法、湿式法、スパンボンド法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、ニードルパンチ法などが挙げられるが、生産性と汎用性の点から湿式法とメルトブロー法、エレクトロスピニング法が特に好ましい。

スポンジ体とは全体に無数の孔を有するものであり、具体的には、焼結多孔質プラスチック、合成樹脂スポンジ等が挙げられる。スポンジ体の製法としては相分離法、発泡法、放射線やレーザー光などを照射するエッチング法、ポロジェン法、凍結乾燥法などが挙げられる。

多孔膜とは平膜に無数の孔を有するものであり、例えばレーザー穿孔したポリカーボネート膜が挙げられる。

ビーズ充填カラムとは、カラム内にビーズを充填させることでビーズ間に空隙を形成したものであり、本明細書においては多孔質体に含めるものとする。ビーズの粒径は均一であるものが望ましく、ビーズの粒径によってビーズ間の空隙を孔径として制御し易い。

本発明の血小板分離基材として用いられる多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である。巨核球と血小板を分離する場合、巨核球と血小板の平均粒径は各々８〜１２μｍと３〜６μｍであるため、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下であることにより血小板は巨核球よりも早く多孔質体を通過できる。

巨核球と血小板を効率的に分離するためには、多孔質体の処理厚みを拡大することで、両者の通過速度の差を大きくすることが考えられる。しかし、平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下の多孔質体の処理厚みを単純に拡大した場合、巨核球の目詰まりが起こり分離時に巨核球と血小板にかかる圧力が大きくなって巨核球が破砕して不要成分が増大する、血小板機能（凝集能や表面抗原）が劣化する等の問題がある。そのため、本発明においては、流入側の平均孔径を１０μｍ以上２０μｍ以下とする。流入側に平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下の多孔質体を設置することで、分離時の圧力上昇を抑えることができる。

なお、本発明において、多孔質体の流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的に減少するとは、多孔質体を処理液の流れる方向に切断した断面において、流入側から流出側に向かって多孔質体の孔径が漸減する態様を指す。また、多孔質体の流入側から流出側に向かって平均孔径が段階的に減少するとは、同様に切断した断面において、均一な平均孔径を有する複数枚の多孔質体を平均孔径の大きさ順に積層した態様を指す。

多孔質体としては、単一の部材で流入側と流出側の平均孔径を上記所定の範囲に制御するとともに、流入側から流出側にかけて平均孔径が連続的または段階的に減少するように構成したものを用いることがきる。このような多孔質体は、例えば多孔質体として不織布を用いる場合、不織布を製造した後もしくは、一旦製造した不織布をプレス加工した後、再度製造ラインに載せその上に平均孔径の大きい不織布を製造することもでき、所望の平均孔径サイズになるまで更に上に平均孔径の大きい不織布を必要な回数製造することでも構成できる。

また、多孔質体として、平均孔径が異なる複数の部材を積層することにより、流入側と流出側の平均孔径を上記所定の範囲に制御したものを用いてもよい。このような多孔質体は、例えば多孔質体として不織布を用いる場合、平均孔径の異なる不織布を独立して製造した後、平均孔径の異なる不織布を単純に重ねることで平均孔径が連続的または段階的に減少するように構成できる。この場合、懸濁液が多孔質体を通過する際に層間が剥離しない限り積層法は特に限定されないが、縁を熱もしくは超音波で溶着する方法、縁をゴム製のリングで押さえながら圧力で挟み込む方法、ニードルパンチ法で層間を密着させる方法などが挙げられる。

該多孔質体の厚みは特に限定しないが、機械的強度と精密な構造を維持するため、１０μｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、１００μｍ以上５ｍｍ以下が特に好ましい。

巨核球及び巨核球から産生された血小板が含まれる懸濁液を本発明の分離基材に通過させることで、巨核球は分離基材に捕捉され、血小板は通過するため、血小板のみを分離して血小板製剤を製造することができる。また本発明の血小板分離基材は、血小板を分離回収した後、基材内に捕捉された巨核球を、分離時の送液方向と逆方向へ送液することで、巨核球を回収することもできる。

〔製造例〕
不織布Ａ：メルトブロー法により作製したポリプロピレン製の不織布（平均孔径６．８μｍ）を直径２５ｍｍにポンチで刳り抜いた。（平均繊維径：２．０μｍ、厚み：０．２５ｍｍ、目付：３０ ｇ／ｍ^２）
不織布Ｂ：メルトブロー法により作製したポリプロピレン製の不織布（平均孔径８．９μｍ）を直径２５ｍｍにポンチで刳り抜いた。（平均繊維径：２．０μｍ、厚み：０．２４ｍｍ、目付：３０ｇ／ｍ^２）
不織布Ｃ：メルトブロー法により作製したポリプロピレン製の不織布（平均孔径１２．２μｍ）を直径２５ｍｍにポンチで刳り抜いた。（平均繊維径：２．０μｍ、厚み：０．３３ｍｍ、目付：３０ｇ／ｍ^２）
不織布Ｄ：メルトブロー法により作製したポリプロピレン製の不織布（平均孔径１５．９μｍ）を直径２５ｍｍにポンチで刳り抜いた。（平均繊維径：２．３μｍ、厚み：０．１９ｍｍ、目付：２０ｇ／ｍ^２）
［実施例１］
分離基材として、不織布Ａ３枚、不織布Ｄ３枚を、縁をゴム製のＯ−リングで押さえながら圧力で挟み込むことにより積層したものを用いた。この分離基材をミリポア社製シリンジタイプホルダーへ、ホルダー入り口側（流入側）が不織布Ｄとなるようにセットした。予め、リンゲル液で分離基材及びホルダー内部を洗浄した後、ホルダー内部の気泡を除去した。ｉＰＳ細胞から分化誘導した巨核球から血小板を産生させた後の巨核球及び血小板の懸濁液を、リンゲル液が充填されたホルダー内の分離基材に、ローラーポンプを用いて１３．３ｍｌ／ｍｉｎで送液した。分離前後の巨核球数及び血小板数はＦＡＣＳを用いて計測し、巨核球通過率と血小板回収率を下記式より算出した。

巨核球通過率（％）＝（分離後巨核球数）／（分離前巨核球数）×１００
血小板回収率（％）＝（分離後血小板数）／（分離前血小板数）×１００
［実施例２］
分離基材として不織布Ａ２枚、不織布Ｄ１枚を、実施例１と同様に不織布Ｄが流入側となるようにセットし、分離を行った。

［実施例３］
分離基材として不織布Ａ１枚、不織布Ｄ２枚を、実施例１と同様に不織布Ｄが流入側となるようにセットし、分離を行った。

［実施例４］
分離基材として不織布Ａ１枚、不織布Ｂ１枚、不織布Ｃ１枚を、実施例１と同様に流入側から不織布Ｃ、不織布Ｂ、不織布Ａの順になるようにセットし、分離を行った。

［実施例５］
分離基材として不織布Ａ２枚、不織布Ｃ１枚を、実施例１と同様に不織布Ｃが流入側となるようにセットし、分離を行った。

［実施例６］
分離基材として不織布Ａ１枚、不織布Ｃ２枚を、実施例１と同様に不織布Ｃが流入側となるようにセットし、分離を行った。

［比較例１］
分離基材として不織布Ｄを３枚積層したものを用いた以外は実施例１と同様に分離を行った。

［比較例２］
分離基材として不織布Ｄを６枚積層したものを用いた以外は実施例１と同様に分離を行った。

各実施例、比較例で作製した分離基材の巨核球通過率と血小板回収率の数値を表１に示す。

Claims (4)

1. 巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔質体からなる分離基材であって、前記多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である血小板分離基材。
2. 前記多孔質体が、繊維構造体、スポンジ体、多孔膜の積層体およびビーズ充填カラムからなる群より選択されるいずれかで構成される、請求項１に記載の血小板分離基材。
3. 前記多孔質体が不織布である、請求項２に記載の血小板分離基材。
4. 巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液を、請求項１〜３のいずれかに記載の血小板分離基材に通過させることを特徴とする血小板の分離方法。