JP2016008195A - 抗ヒト心筋トロポニンｔモノクローナル抗体、その製法、ハイブリドーマ、ハイブリドーマの製造方法、ヒト心筋トロポニンｔの測定方法及びヒト心筋トロポニンｔの測定キット - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト心筋トロポニンＴを精度良く測定することができる、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットを提供する。
【解決手段】Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐを含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。
【選択図】なし

Description

本願は、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットに関する。

ヒト心筋トロポニンＴ（Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ；以下、「ＴｎＴ」と略する。）は、心筋の筋原繊維を構成するタンパク質の１つであって、心筋梗塞の発症に伴い血液中のＴｎＴ濃度が上昇する。そのため、血液中のＴｎＴ濃度は、心筋梗塞の診断指標として用いられている。
従来、ＴｎＴは、免疫測定法によってその濃度が測定されている。例えば、特許文献１には、免疫測定法に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体についての開示がある。

特開平０３−７５９７号公報

上述した従来の技術では、より精度良くＴｎＴを測定できる技術が求められていた。本願の限定的ではない例示的な実施形態は、ＴｎＴを精度良く測定することができる、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットを提供する。

本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３のハイブリドーマより産生される抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体である。

本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットによれば、ＴｎＴを精度良く測定することができる。

Ｔｎ−Ｐ１５抗体のＴｎＴに対する結合能の測定結果の一例を示す図である。 Ｔｎ−Ｐ１５抗体のエピトープの特定に用いられた２９種類のペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１〜２９）を示す図である。 Ｔｎ−Ｐ１５抗体のエピトープの特定に用いられた２９種類のペプチドそれぞれに対する結合能の測定結果の一例を示す図である。 ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を用いた免疫測定結果の一例を示す図である。 ＴｎＴ（野生型）のアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す図である。 ＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す図である。

ＴｎＴには、少なくとも６種類のアイソフォーム（Ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在することが知られており、ＴｎＴの多様な変化の一因とされている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：３５３４１−３５３４９を参照。）。
ＴｎＴ（野生型）は分子量が約３９，０００であって、そのアミノ酸配列は図５（配列番号：３０）に示す通りである。一方、ＴｎＴ（アイソフォーム）は、ＴｎＴ（野生型）のＮ末端側から１−４０番目の領域で特有の変化を示し、成人においてはアイソフォーム３がメジャーとされている。アイソフォーム３は、分子量が約３７，０００であって、そのアミノ酸配列（配列番号：３１）は図６に示す通りである。アイソフォーム３は、ＴｎＴ（野生型）のＮ末端側から２４−３３番目のアミノ酸が欠失している点がＴｎＴ（野生型）とは異なる。

一方、ＴｎＴの構造は、急性心筋梗塞患者の血液中において、心筋梗塞の発症からの時間に依存してその動態が変化することが報告されている（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；４０：８５１−８５５を参照。）。具体的には、血液中のＴｎＴ濃度は、心筋梗塞等による心筋の損傷に伴いその濃度が迅速に上昇するが、心筋梗塞の発症からの経過時間に依存して、血液中のＴｎＴが分解し、細分化される。例えば、心筋梗塞の発症から１２時間経過後の患者における血液中には、分子量が約３７，０００の状態のＴｎＴ（アイソフォーム３）はほとんど存在せず、細分化されて分子量が約２５，０００のフラグメントとその他のフラグメントとで存在する。細分化された分子量約２５，０００のフラグメントは、ＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列のＮ末端側から１−２００番目の領域に対応することが確認されている。

本願発明者は、これらのことから血液中のＴｎＴを精度良く測定するためには、ＴｎＴの安定な構造部位のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を用いる必要があると考えた。具体的には、アイソフォーム３でいうと、Ｎ末端側から４１−２００番目の領域部分内のアミノ酸配列に対して特異的に結合する抗体である。

そこで本願発明者は、安定な構造部位のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体について、鋭意検討を行い、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットに関する発明を完成するに至った。本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットは、以下の通りである。

本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする。

本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴを精度良く測定することができる。なぜなら、係る抗体は、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列、野生型でいうとＮ末端側から１１１−１３５番目を含むアミノ酸配列に対する抗原認識部位を有する抗体であるため、分子量が約２５，０００のフラグメントであっても結合することができ、アイソフォームに依存しないため、ＴｎＴの多様な変化に対応することができるからである。

また、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の抗原認識部位は、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴ（Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ）も認識しない。なぜなら、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴも、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）に対応するアミノ酸配列を有さないからである。そのため、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴを精度良く測定することができる。

なお、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体はＩｇＧであるが、当該ＩｇＧそのものだけでなく、その結合特性を保持した機能断片も含まれる（例えば、Ｆ（ａｂ）やＦ（ａｂ’）２）。当該結合特性の典型例としては、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとすることが挙げられる。

さらに、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、上記ＩｇＧ抗体の変異体も含まれる。かかる変異体は、上記ＩｇＧ抗体のアミノ酸配列において、１個〜数個、あるいは１個〜数十個のアミノ酸が置換、欠失、付加されているものであってもよい。かかる変異体は、哺乳動物の抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。かかる変異体もまた、上記ＩｇＧ抗体の結合特性を保持している。

本願の一態様に係るハイブリドーマ（Ｐｅｐ．３ Ｎｏ．１５）は、前述の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を産生するものであって、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、２０１４年６月１７日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３を付与された。

したがって、本願の一形態に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマにより産生される抗体であってもよい。関連する態様において、本発明は、上記ハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の製造方法を提供する。

本願の一態様に係るハイブリドーマの製造方法は、哺乳動物に対し、ヒト心筋トロポニンＴのアイソフォーム３のＮ末端側から４１−２００番目のアミノ酸配列のうち所定数の連続するアミノ酸配列で構成されたペプチドで免疫する工程Ａと、前記ペプチドで免疫された哺乳動物から脾臓細胞を取り出す工程Ｂと、前記脾臓細胞と前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合させてハイブリドーマを得る工程Ｃとを含む。好ましくは、該方法は、前記ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体について、ヒト心筋トロポニンＴに対する結合能を評価する工程Ｄと、前記ヒト心筋トロポニンＴに対して結合能を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する工程Ｅと、をさらに含む。

本願の一態様に係るハイブリドーマの製造方法において、哺乳動物に免疫するペプチドとしては、例えば、１０〜３０個のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列で構成されたペプチドであることが望ましいが、本願はこれに限定されるものではない。ただし、３０より多いアミノ酸で構成されるアミノ酸配列で構成されたペプチドを用いてもよいし、ヒト心筋トロポニンＴのアイソフォーム３のＮ末端側から４１−２００番目のアミノ酸配列そのものを用いてもよい。ただし、１０未満のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列で構成されたペプチドを用いた場合、哺乳動物の生体内で当該ペプチドを抗原と認識できない場合があるので、１０以上のアミノ酸で構成されたペプチドであることが好ましい。さらに好ましくは、該ペプチドは、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むものである。また、該ペプチドは、配列番号：３２のアミノ酸配列において１個〜数個（例えば２個、３個、４個、５個、６個。７個、８個または９個）のアミノ酸が置換、付加または欠失されたアミノ酸配列を含む変異ペプチドであってもよい。配列番号：３２のアミノ酸配列を含むペプチドまたはその変異ペプチドを用いて得られるハイブリドーマは、ＴｎＴを精度良く測定することができるモノクローナル抗体を産生しうる。関連する態様において、本発明は、上記ハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の製造方法を提供する。

本願の一態様に係るＴｎＴの測定方法は、免疫測定方法であって、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いることを特徴とする。

本願の一態様に係るＴｎＴの測定方法は、例えば、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ；以下、「ＥＬＩＳＡ法」と略する。）に代表される酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：以下、「ＥＩＡ法」と略する。）、放射免疫アッセイ（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；以下、「ＲＩＡ法」と略する。）又は蛍光抗体法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）のいずれを用いてもよい。また、化学発光法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ）や電気化学発光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ）を用いてもよい。

また、測定形式としては、代表的なものとしては直接吸着法、サンドイッチ法及び競合法が挙げられるが、いずれを用いてもよい。

本願の一態様に係るＴｎＴの測定キットは、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を含む。通常は、取り扱い説明書をキットに添付する。

なお、本願において、アミノ酸を略号で表示する場合、以下の通りとする。また、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合には、特に明示しない限りＬ−体を示すものとする。
（１） Ａ，Ａｌａ ： アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）
（２） Ｒ，Ａｒｇ ： アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
（３） Ｎ，Ａｓｎ ： アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）
（４） Ｄ，Ａｓｐ ： アスパラギン酸（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ａｃｉｄ）
（５） Ｃ，Ｃｙｓ ： システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）
（６） Ｑ，Ｇｌｎ ： グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）
（７） Ｅ，Ｇｌｕ ： グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ）
（８） Ｇ，Ｇｌｙ ： グリシン（Ｇｌｙｃｉｎ）
（９） Ｈ，Ｈｉｓ ： ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）
（１０） Ｉ，Ｉｌｅ ： イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）
（１１） Ｌ，Ｌｅｕ ： ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）
（１２） Ｋ，Ｌｙｓ ： リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）
（１３） Ｍ，Ｍｅｔ ： メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）
（１４） Ｆ，Ｐｈｅ ： フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）
（１５） Ｐ，Ｐｒｏ ： プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）
（１６） Ｓ，Ｓｅｒ ： セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）
（１７） Ｔ，Ｔｈｒ ： トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）
（１８） Ｗ，Ｔｒｐ ： トリプトファン（Ｔｒｉｐｔｏｐｈａｎ）
（１９） Ｙ，Ｔｙｒ ： チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）
（２０） Ｖ，Ｖａｌ ： バリン（Ｖａｌｉｎｅ）

以下に、実施例を示して、本願の実施の形態の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットについて、図面とともに詳細に説明する。ただし、実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

実施例１ 抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体及びハイブリドーマの調製
本願発明者は、本願の実施の形態の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体及びハイブリドーマを以下の通りにして得た。

１．哺乳動物への免疫
ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列に対応するペプチド（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬＶＳＬＫＤ（配列番号：３２））を準備し、このペプチドを哺乳動物に免疫し、免疫した哺乳動物の体内で抗体産生細胞を産生させた。
免疫の対象となる哺乳動物としては、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ等を用いることができるが、本願発明者はマウスを用いた。また、免疫するマウスの系等には、例えば、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統が挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後の血清に高い抗体力価（Ｔｉｔｅｒ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を示すことが知られており、ＴｎＴとの親和性が高いモノクローナル抗体が得られることが期待されることと、細胞株（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）の確立後に腹水による抗体大量作製において一般的に用いられていることから、本願発明者はこの系統のマウスを用いることとした。

免疫するマウスの齢は、特に限定されるものではないが、一般的には生後４〜１２週齢のものが用いられるが、好ましくは生後６〜１０週齢であり、より好ましくは生後７週齢である。なお、本願発明者は、生後７週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスを用いた。

免疫に用いられるペプチドが合成ペプチドである場合、哺乳動物の生体内において、抗原として認識され難いため、合成ペプチドにキャリアタンパク質を結合したものを免疫に用いることが望ましい。このキャリアタンパク質としては、例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、「ＫＬＨ」と略する。）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；以下、「ＢＳＡ」と略する。）や卵白アルブミン（Ｏｖａａｌｕｂｕｍｉｎｎ；「ＯＶＡ」と略して称する場合もある。）といったアルブミン、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｌｉｎ（「ＴＨＹ」と略して称する場合もある。）等が用いられる。本願発明者は、キャリアタンパク質として、ＫＬＨを用いた。免疫に用いられる合成ペプチドは、総タンパク質に対する純度が通常７０％以上のものが用いられるが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、更に好ましくは９８％以上のものである。

免疫に用いられる合成ペプチドは、アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合したものを用いることが好ましい。なぜなら、合成ペプチドとアジュバントとを混合させたものを用いることで、哺乳動物の抗原に対する免疫応答の増強を期待できるからである。

アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト及びタピオカアジュバントが挙げられる。また、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ等の菌体、細胞壁及びトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）等の菌体成分、グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）、リピドＡ画分、β―グルカン（多糖体）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ベスタチン、レバミゾール等の合成化合物、胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子及びタフトシン等の生体成分由来のタンパク質又はペプチド性物質をアジュバントとして用いることもできる。更に、これらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）をアジュバントして用いてもよい。

これらアジュバントは、哺乳動物に対する投与経路、投与量、投与時期等に依存して免疫応答の増強又は抑制を図ることができる。更にアジュバントの種類によっては、抗原に対する抗体産生、細胞性免疫の誘導及び免疫グロブリンのクラスに差が認められる。それ故、目的とする免疫応答に応じて、適切なアジュバントを選択する必要がある。本願発明者は、完全フロイントアジュバントを用いた。

哺乳動物への免疫は、例えば、哺乳動物の皮下、皮内、静脈又は腹腔内に合成ペプチドを注射することで行われる。免疫応答は、対象となる哺乳動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用する哺乳動物に応じて適宜設定する必要がある。また、哺乳動物への最初の免疫後には、複数回にわたって追加の免疫が行われる。

≪試薬≫
以下（ａ）及び（ｂ）の試薬を調製した。
（ａ）生理食塩水リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ；以下、「ＰＢＳ」と略する。）
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、ＫＨ_２ＰＯ_４を最終濃度がそれぞれ１３７ｍＭ、２．７ｍＭ、８．１ｍＭ、１．４７ｍＭとなるように水に溶解させ、ＰＢＳを調製した。

（ｂ）第１の抗原溶液
キャリアタンパク質としてＫＬＨを結合させた合成ペプチド（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦ ＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬＶＳＬＫＤ（配列番号：３２））を準備し、係る合成ペプチドを最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳを加えて溶解し、第１の抗原溶液を調整した。なお、ＫＬＨを結合させた合成ペプチドは、ＳＩＧＭＡに合成を依頼したものを用いた。

≪手順≫
以下の（１）〜（４）の手順により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスに免疫を行った。
（１）第１の抗原溶液に、アジュバントとして同体積量のヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント（和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を加え、ホモジナイザにより十分に乳化させ（ホモジナイザの回転数は１０００ｒｐｍ）、アジュバントエマルジョン（Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｅｍｕｌｕｓｉｏｎｓ）を調製した。
（２）生後７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウス５匹それぞれに対し、調製したアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。
（３）アジュバントエマルジョンを最初に注射してから２週間後に、これら５匹のマウスそれぞれにアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。
（４）その後、同様に最初の注射から４週間後、６週間後及び８週間後に、これら５匹のマウスそれぞれに対してアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。

２．マウス生体内における抗体産生の確認
哺乳動物への免疫後、生体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した。具体的には、免疫した哺乳動物から血液を採取し、得られた血液を用いてＴｎＴの結合活性（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定することで、哺乳動物の体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した。また、免疫末期には、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃｌａｓｓ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）が起こっていることを確認した。本願発明者は、これら評価をＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスへの２回目の注射から１週間後と、４回目の注射から１週間後とで行った。

結合活性の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法又は蛍光抗体法により確認することができる。本願発明者は、ＴｎＴの結合活性の測定にＥＬＩＳＡ法を採用した。

≪試薬≫
以下（ｃ）〜（ｈ）の試薬を新たに調製した。
（ｃ）ＰＢＳ−Ａｚ溶液
ＰＢＳに最終濃度が０．０４重量％となるようにアジ化ナトリウムを加え、ＰＢＳ−Ａｚ溶液を調製した。
（ｄ）ＴｎＴ溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液に最終濃度が０．１μｇ／ｍｌとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、ＴｎＴ溶液を調製した。
（ｅ）ブロッキング溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液にスキムミルクを５重量％となるように加え、ブロッキング溶液を調製した。
（ｆ）ＰＢＳＴ溶液
ＰＢＳに最終濃度が０．０５体積％となるようにＴｗｅｅｎ２０（和光純薬製、１６７−１１５１５）を加え、ＰＢＳＴ溶液を調製した。
（ｇ）ＢＳＡ溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液に最終濃度が１重量％となるようにウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；以下、「ＢＳＡ」と略する。）（シグマ製、Ａ７８８８）を加え、ＢＳＡ溶液を調製した。
（ｈ）標識抗体溶液
ＢＳＡ溶液に最終濃度が０．２μｇ／ｍｌとなるようにペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）を溶解させ、標識抗体溶液を調製した。

≪手順≫
＜マウスの血液を用いたＴｎＴの結合活性の測定＞
以下の（１）〜（１１）の手順により、免疫したマウスの血液を用いてＴｎＴの結合活性を測定した。
（１）マウスへの２回目の注射から１週間後と、４回目の注射から１週間後のマウス（５匹分）それぞれから血液を採取し、当該血液から血清を得た。
（２）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（３）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（４）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（５）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（６）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（７）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（８）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（９）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製 ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１０）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１１）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。

＜ＩｇＧへのクラススイッチの確認＞
ＩｇＧへのクラススイッチは、前述により得たマウスへの４回目の注射から１週間後のマウスから得た血清に対し、抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）への結合反応性により確認した。

≪結果≫
＜マウスの血液を用いたＴｎＴの結合活性の測定＞
得られた血液のＴｎＴの結合活性は、ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍの波長）が、明確な発色が認められるか否かで評価した。すなわち、明確な発色が認められれば、得られた血液に対応するＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの生体内で抗体産生が行われているということである。

結果、免疫を行った５匹全てのマウスについて、抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体の産生が認められた。特に２匹のマウスについては、力価が高かったため、後述の実験においてはこの２匹を用いることとした。

＜ＩｇＧへのクラススイッチの確認＞
前述により得たマウスへの４回目の注射から１週間後のマウスから得た血清に対し、抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）への結合反応性を確認した結果、いずれのマウスの血液においてもＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認した。

３．免疫原の追加注射
前述のＴｎＴの結合活性の測定により、生体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した後、当該マウスに対して免疫原を追加注射（以下、「ブースト」と称する。）を行うことで、マウスの脾臓を肥大させた。

ブーストで投与される合成ペプチドの量は、特に限定されるものではないが、最初に免疫を行った合成ペプチドの量の４〜５倍量であることが好ましい。また、ブーストには、通常、合成ペプチドとアジュバントとが乳化したエマルジョンが用いられるが、最終免疫（後述のハイブリドーマ作成による細胞融合数日前に行う追加注射）においてはアジュバントを用いず、合成ペプチドのみを用いることが好ましい。また、マウスへのＴｎＴの投与経路としては、皮下、皮内、静脈、又は腹腔内それぞれによって、ＴｎＴに対して異なった部位を認識する抗体が得られる可能性がある。

≪試薬≫
以下（ｉ）の試薬を新たに調製した。
（ｉ）第２の抗原溶液
キャリアタンパク質としてＫＬＨを結合させた合成ペプチド（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦ ＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬ ＶＳＬＫＤ）を準備し、係る合成ペプチドを最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳを加えて溶解し、第２の抗原溶液を調整した。

≪手順≫
３匹のマウスそれぞれについて、最初の免疫から３ヶ月後に第２の抗原溶液１００μｌをマウスの腹腔内に注射することで、免疫原の追加注射を行った。

４．ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の作成
マウスへの最終免疫を行った後、マウスから脾臓細胞を摘出し、摘出した脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合させ、ハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマの増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、増殖能力が優れた骨髄腫由来の細胞株を選択する必要がある。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来との適合性を勘案する必要がある。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０ ＢＵ．l、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１が挙げられる。本願発明者は、骨髄腫由来の細胞株として、ハイブリドーマの増殖能力が優れていることが知られているＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を選択した。

脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合する手法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法が挙げられる。本願発明者は、細胞毒性も少なく、融合操作も容易であり、再現性の高いポリエチレングリコール法を採用した。

≪手順≫
以下の（１）〜（４）の手順により、ハイブリドーマを作成した。
（１）最終免疫を行ってから３日後に対象となるマウスの脾臓細胞を摘出した。
（２）ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）（ＭＥＲＣＫ社製、８０７４８９、平均分子量１，５００）を用いて脾臓細胞とＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とを融合させ、ハイブリドーマを作成した。
（３）ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ：以下、「ＦＣＳ」と略する。）が１５重量％含有するイシコフ培地で調製したヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）／アミノプテリン（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）／チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地（以下、「ＨＡＴ培地」と称する。）にハイブリドーマを浮遊させた。
（４）マイクロプレートにハイブリドーマを分注後、ＣＯ_２インキュベータ（三洋電機製、ＭＣＯ−４０ＡＩＣ）内で、１週間培養を行った。この際、ハイブリドーマの培養開始時の成長因子であるフィーダー細胞として、同じマウス固体の脾臓細胞を用いた。なお、ハイブリドーマの培養条件は、ＣＯ_２濃度が５体積％、温度３７℃、湿度９５％である。以下の実験において、ハイブリドーマの培養は特に明示しない限り、この条件で培養を行っている。

５．細胞選別及びクローニング
作成したハイブリドーマから産生された抗体のＴｎＴに対する結合能を評価することで、目的の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリドーマのクローニングを行った。

結合能の評価は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法により確認することができるが、本願発明者は、ＥＬＩＳＡ法を採用した。
ＴｎＴの測定に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴに対して高い結合能を有する必要がある。一方、ＴｎＴの測定に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、骨格筋トロポニンＴに対して結合能を有さないか、若しくは低い結合能を有する必要がある。したがって、本願発明者は、得られたそれぞれのハイブリドーマから産生された抗体について、ＴｎＴに対する結合能及び骨格筋トロポニンに対する結合能のそれぞれを評価し、目的の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。

なお、本願でいう「ＴｎＴに対して高い結合能を有する抗体」とは、後述の実験手順で示すＥＬＩＳＡ法（詳細には「インヒビションＥＬＩＳＡ法」。）において、ＴｎＴとの抗原抗体反応においてインヒビションがかかり、算出されたインヒビションの半値が１．０×１０^−９Ｍ以下であることを意味する。
また、本願でいう「インヒビションがかかる」とは、固相に固定されたＴｎＴに結合する抗体の量が、競合物質（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の存在下で、競合物質の不存在下と比較して減少することをいう。一方、「インヒビションがかからない」とは、固相に固定されたＴｎＴに結合する抗体の量が、競合物質の存在下及び不存在下で同等（実質的に同等である場合も含む。）であることをいう。
本願でいう「インヒビションの半値」とは、競合物質の不存在下における吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。

ハイブリドーマの選別は、例えば、限界希釈法や軟寒天法により行うことができる。本願発明者は、操作が容易で再現性の高い限界希釈法により、ハイブリドーマのクローニングを行った。なお、細胞融合により得られた多くのハイブリドーマの中から、効率よく有用な細胞を選択するために、クローニングの初期の段階から細胞選別を行うことが好ましい。最終的に選別されたハイブリドーマは、液体窒素中で半永久的に保存することができる。

≪試薬≫
以下（ｊ）の試薬を新たに調製した。
（ｊ）細胞保存液
ＦＣＳ１０体積部とジメチルスルフォキシド９０体積部とを混合させ、細胞保存液を調製した。

≪手順≫
以下の手順により、細胞選別及びクローニングを行った。
＜第１段階の選別＞
（１）ハイブリドーマの培養から１週間後、マイクプレートの各ウェル中における培養上清を１００μｌ採取した。一方、各ウェルに残存する培養液を２４ウェルプレートに継代し、各ウェルにＦＣＳが１５重量％含有するヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を１ｍｌずつ加えた。
（２）２４ウェルプレートにハイブリドーマを継代して４日後、その培養上清を１ウェルに対し１５０μｌずつ採取した。ハイブリドーマの培養から１週間後と継代して４日後の培養上清は、以下の（３）〜（１２）に示すＥＬＩＳＡ法によりＴｎＴに対する結合能の測定に用いられた。
（３）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（４）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（５）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（９）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（１０）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製 ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１１）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１２）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
（１３）吸光度の測定結果に基づき、ＴｎＴに対して高い結合能を有し、増殖状態の良いウェルを選別した。
（１４）選別したウェル中のハイブリドーマを６ウェルプレートに継代し、各ウェルにＦＣＳが１５重量％含有するヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を４ｍｌずつ加え、２日間培養した。

＜第２段階の選別＞
（１）６ウェルプレートにハイブリドーマを継代して２日後、その培養上清を１ウェルに対し１５０μｌずつ採取した。この培養上清は、以下の（２）〜（１２）に示すインヒビションＥＬＩＳＡ法によるＴｎＴに対する結合能の測定に用いられた。
（２）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（３）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（４）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（５）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（６）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（７）各ウェルについて１ウェルに対してインヒビターとしてＴｎＴ溶液を２５μｌずつ注入し、更に標識抗体溶液を２５μｌずつ注入し、常温にて１時間放置した。
（８）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（９）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製 ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１０）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１１）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
（１２）吸光度の測定結果に基づき、インヒビションのかかったウェルを選別した。
（１３）選別された各ウェルの細胞について、それぞれ中フラスコ（５０ｍｌ）に継代した。培地は、ＦＣＳが１５重量％含有するＨＴ培地を４５ｍｌずつ加え、３日間培養した。

＜ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定＞
ＴｎＴに対する結合能の測定については、前述の第２段階の選別で行ったインヒビションＥＬＩＳＡ法と同様であるので、説明を省略する。また、骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定については、マイクロプレート中に固定化する抗原及びインヒビターを、ＴｎＴから骨格筋トロポニンＴに変えただけであるので、説明を省略する。

＜限界希釈法によるハイブリドーマの単離及び選定＞
（１）選別した各ウェルに含まれるハイブリドーマについて、ＦＣＳが１５重量％含有のＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に限界希釈し、各希釈液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに分注した。
（２）フィーダー細胞として、生後４週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの胸線細胞を用いて、ハイブリドーマの初期増殖を促進させた。
（３）各ウェル中のハイブリドーマについて、適宜、継代培養を繰り返すことで、培養スケールを上げ、継代の都度、前述の「第１段階の選別」で行ったＴｎＴに対する結合能の測定（ＥＬＩＳＡ法）を行うことでスクリーニングを繰り返した。
（４）継代培養を繰り返すことでスクリーニングを行い、最終的に２００ｍｌの培地中におけるハイブリドーマが約５．０×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌとなるまで増殖させた。
（５）スクリーニングを繰り返すことで、目的の機能を有するハイブリドーマを選定した。

＜ハイブリドーマの保存＞
（１）選定したハイブリドーマは、遠心分離（１６００ｒｐｍ、５分）し、その培養上清を取り除いた。
（２）遠心分離により培養上清が取り除かれたハイブリドーマに対し、ハイブリドーマが約１．０×１０^７ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように細胞保存液に浮遊させた。なお、ハイブリドーマの１ｍｌあたりのｃｅｌｌ数の調整は、血球計算盤により単位面積当たりの細胞数をカウントすることにより行われた。
（３）細胞保存液に浮遊されたハイブリドーマは、−８０℃で予備凍結し、その後、液体窒素中に保存した。

≪結果≫
＜第１段階の選別＞
２回採取した培養上清のうち、定性的な判断でＴｎＴに対して高い結合能を有し、増殖状態の良かった４５ウェル中のハイブリドーマを第２段階の選別に用いることとした。

＜第２段階の選別＞
培養上清中にＴｎＴに結合する抗体が存在するウェルには、インヒビターとして添加されたＴｎＴと結合し、マイクロプレートに固定化されたＴｎＴへの結合が阻害されるため、ＥＬＩＳＡ法の発色反応による発色が抑制される。従って、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりインヒビションがかかった１８ウェルを選別し、ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定に用いることとした。

＜ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定＞
第２段階の選別により選別された１８ウェル中のハイブリドーマについて、ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定を行い、ＴｎＴでのみインヒビションがかかり、骨格筋トロポニンＴでインヒビションがかからなかった８ウェルを選別し、限界希釈法によるハイブリドーマの単離に用いることとした。

＜限界希釈法によるハイブリドーマの単離及び選定＞
最終的にＴｎＴに対して高い結合能を有し、かつ、骨格筋トロポニンＴに対して結合能を有さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを１株選定した。
この選定したハイブリドーマを、Ｐｅｐ．３ Ｎｏ．１５と命名し、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、平成２６（２０１４年）年６月１７日に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３を付与された。以後の説明においては、Ｐｅｐ．３ Ｎｏ．１５が産生するモノクローナル抗体のことをＴｎＴ−Ｐ１５抗体と称することとする。

６．抗体の精製
前述の細胞選別及びクローニングにより得られたハイブリドーマを大量培養し、大量培養されたハイブリドーマから産生される抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を精製した。

ハイブリドーマの大量培養法としては、インビボ（Ｉｎ ｖｉｖｏ）及びインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）により行う方法がある。インビボでの大量培養法の例としては、マウスの腹腔内にハイブリドーマを注射して、マウス腹水中にハイブリドーマを増殖させる方法が挙げられる。これにより、マウス腹水中に抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を大量に産生させることができる。一方、インビトロの培養では、ハイブリドーマを無血清培地（味の素社製、ＡＳＦ培地）中で培養する方法が挙げられる。これにより、培養液中に抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を大量に産生させることができる。本願発明者は、インビボにより大量倍量を行った。

得られた腹水を用いて抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を精製した。抗体の精製法としては、ＤＥＡＥ（「Ｄｉｅｔｙｌａｍｉｎｏ Ｅｔｙｌ」の略である。）陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、硫安分画法（Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ；以下「ＰＥＧ」と略する。）分画法（ＰＥＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、エタノール分画法（Ｅｔｈａｎｏｌ Ｆｒａｇｔｉｏｎａｔｉｏｎ）等が挙げられる。また、これら精製法を適宜組み合わせて用いることもできる。本願発明者は、アフィニティークロマトグラフィーにより抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の精製を行った。

抗体の精製においては、総タンパク質に対する抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の純度が、９０％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の純度であることが好ましい。

≪試薬≫
以下（ｋ）及び（ｌ）の試薬を新たに調製した。
（ｋ）結合緩衝液
グリシン、ＮａＣｌの最終濃度がそれぞれ１．５Ｍ、３Ｍとなるように水に溶解させ、ｐＨ８．９に調整することで、結合緩衝液を調製した。
（ｌ）溶出緩衝液
クエン酸を最終濃度が１００ｍＭとなるように水に溶解させ、ｐＨ４．０に調整することで、溶出緩衝液を調製した。

≪手順≫
以下の（１）〜（８）の手順により、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体及びＴｎＴ−Ｐ３２抗体それぞれの精製を行った。
（１）ハイブリドーマ（Ｐｅｐ．３ Ｎｏ．１５）それぞれを７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの腹腔内に注射した。
（２）腹腔内への注射から腹水の貯留状態を確認しながら、生存しているマウスから順次、蓄積した腹水を採取した。
（３）プロテインＡ結合ゲル（ＧＥヘルスケア製、プロテインＡセファロース４ＦＦ）を充填したカラムを、結合緩衝液で平衡化した。
（４）採取した腹水を結合緩衝液で３倍に希釈し、平衡化したカラムにアプライした。
（５）カラムからの溶出液を２８０ｎｍの波長における吸光度でモニターし、不純物の溶出が終了するまでカラムを結合緩衝液で洗浄した。
（６）カラムの洗浄後、溶出緩衝液をカラムにアプライ（線流速が２０ｃｍ／ｈｏｕｒ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。
（７）回収したＩｇＧ含有溶出液の精製分画それぞれについて、２８０ｎｍの波長における吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体濃度を算出した。
（８）回収したＩｇＧ含有溶出液の精製分画それぞれについて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、標準タンパク質（タンパク質マーカー）との比較を行った。

≪結果≫
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体の精製分画はいずれも分子量が約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。

実施例２ 抗体の評価
精製により得られたＴｎＴ−Ｐ１５抗体について、ＴｎＴに対する結合能を測定した。
≪手順≫
前述の「細胞選別及びクローニング」のおける「第２段階の選別」で行ったインヒビションＥＬＩＳＡ法と同様であるため、説明を省略する。

≪結果≫
図１は、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体のＴｎＴに対する結合能の測定結果を示すグラフである。
図１に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度（図１中には「ＯＤ４５０」と記載している。）であり、横軸はＴｎＴ濃度（Ｍ）の対数値を示している。

図１の結果に基づきＴｎＴ−Ｐ１５抗体のインヒビションの半値を算出した結果、１．０×１０^−９であった。前述で説明した通り、インヒビションの半値が１．０×１０^−９以下の抗体は、ＴｎＴに対する結合能が高い抗体であるので、ＴｎＴに対して高い結合能を有することが分かる。

８．エピトープの特定
ＴｎＴ−Ｐ１５抗体の抗原認識部位の特定を行った。まず、ＴｎＴのアミノ酸配列に含まれる１０〜２０程度のアミノ酸からなるペプチドを複数準備し、これらペプチドを用いてＥＬＩＳＡ法によりエピトープの特定を行った。エピトープの特定には、図２に示す２９種類のペプチドと免疫源に使用したペプチドの配列（ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列に対応するペプチド（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬＶＳＬＫＤ（配列番号：３２））のペプチド断片が用いられた。

≪試薬≫
以下（ｍ）及び（ｎ）の試薬を新たに調製した。
（ｍ）抗原溶液
２９種類のペプチドとヒト由来トロポニンＴ及び免疫源ペプチド配列に相当するペプチド断片（ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列に対応するペプチド（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬＶＳＬＫＤ）について、ＰＢＳ−Ａｚ溶液にて最終濃度が０．１μＭとなるように調製した。
（ｎ）ＴｎＴ−Ｐ１５抗体溶液
ＰＢＳ溶液に、最終濃度が０．１μＭとなるようにＴｎＴ−Ｐ１５抗体を加え、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体溶液を調製した。

≪手順≫
以下の（１）〜（１０）の手順により、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体のエピトープの特定を行った。
（１）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）に各抗原溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（２）一晩保存したマイクロプレート中の抗原溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（３）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（４）各ウェルについて１ウェルに対してＴｎＴ−Ｐ１５抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（５）マイクロプレート中の抗体溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製 ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（９）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１０）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。

≪結果≫
図３は、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体の各ペプチド及びトロポニンに対する結合能の測定結果を示すグラフである。図３に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度であり、横軸は抗原の種類（２９種類のペプチドのペプチドナンバー等）である。図３の横軸のペプチドナンバーは、図２のペプチドナンバーに対応している。また、横軸のＴｎＴはコントロールである。

図３の結果から明らかなように、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体は、トロポニンＴ及び免疫したペプチド配列（ＥＬＱＡＬＩＥＡＨＦＥＮＲＫＫＥＥＥＥＬＶＳＬＫＤ）には特異的な結合能を有する一方、他のいずれのペプチド断片に対しても結合能を有さなかった。
ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列に対応するペプチドは、上記評価に使用したペプチドのペプチドナンバー１２と１３及び１１と１４の一部に該当する。

図３の結果から明らかなように、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体は、免疫源に使用したペプチド（ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列）には結合能を有している一方、ペプチドナンバー１１から１４のいずれにも結合能を示しておらず、少なくともＴｎＴ−Ｐ１５抗体のエピトープは、ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１０６番目のアミノ酸配列及び、１２２−１２５番目のアミノ酸配列には限定されないこと、ペプチドナンバー１２もしくは１３の領域に限定されるものではないこと、が伺える。このことから、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体のエピトープは、ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列に対応するものと推定される。

これらのことから、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体は、ＴｎＴの経時変化に伴い細分化された分子量が約２５，０００のフラグメントであっても結合することができ、アイソフォームに依存しないため、ＴｎＴの多様な変化に対応することができ、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を用いることで、ＴｎＴを精度良く測定することができるといえる。

また、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体は、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴも特異的に結合しない。なぜなら、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴにも心筋ＴｎＴ（アイソフォーム３）のＮ末端側から１０１−１２５番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有さず、前述の「細胞選別及びクローニング」において骨格筋トロポニンＴに対する結合能を有さなかったことからも示されているからである。

なお、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体はＩｇＧであるが、ＩｇＧそのものだけでなく、その結合特性を保持した機能断片も含まれる（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２）。また、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、その結合特性を保持した変異抗体も包含する。

実施例３ ＴｎＴ−Ｐ１５抗体によるＴｎＴの測定
本願発明者は、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を用い、ＥＩＡ法によりＴｎＴの測定を行った。本実施例で行ったＥＩＡ法とは、具体的には、ＥＬＩＳＡ法（比色測定、サンドイッチ法）である。

≪試薬≫
以下の試薬を新たに調製した。
（ｏ）固相抗体溶液
サンドイッチ反応用の固相抗体として、本発明のＴｎＴ−Ｐ１５抗体をＰＢＳ溶液を用いて、最終濃度が０．１μＭとなるよう調製した。
（ｐ）液相抗体溶液
サンドイッチ反応用の液相抗体として、トロポニンＴ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、１０−Ｔ８５Ａ）を下記の手順にてビオチン化を行った。
ＰＢＳにて２μＭに調製したトロポニンＴ抗体溶液１ｍｌに対して、最終濃度２０ｍＭになるようＰＢＳ溶液にて調製したＮＨＳ-Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ製、２１４２５）を２μＬ添加し、３０分間室温にて転倒混和した後、ブロッキングＢｕｆｆｅｒ（０．５Ｍグリシン・０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．３）を１ｍｌ加え、３０分間室温にて転倒混和したものをビオチン化抗体とした。（グリシン：和光純薬製、０７７−００７３５、ＮａＣｌ：和光純薬製、１９１−０１６６５）
このビオチン化抗体をＰＢＳ溶液を用いて、最終濃度が０．１μＭとなるよう調製したものを、液相抗体溶液として用いた。
（ｑ）反応用抗原溶液
抗原溶液として、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に最終濃度が、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０ｎＭとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、６種類の濃度のＴｎＴ溶液を調製した。

≪手順≫
以下の（１）〜（１２）の手順により、ＴｎＴの測定を行った。
（１）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、品番 ４４９８２４）に固相抗体溶液を１ウェルに対して５０μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（２）一晩保存したマイクロプレート中の抗体溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（３）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（４）各ウェルについて１ウェルに対して１２種類の反応用抗原溶液をそれぞれ５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（５）マイクロプレート中の抗原溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて、１ウェルに対して液相抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の抗体溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対してストレプトアビジン標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（９）マイクロプレート中のストレプトアビジン標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（１０）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製 ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１１）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１２）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。

≪結果≫
図４は、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を用いたサンドイッチ反応の測定結果を示すグラフである。図４に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度（図４中には「ＯＤ４５０」と記載している。）であり、横軸はＴｎＴ濃度（ｎＭ）の対数値を示している。

図４の結果から、本発明のＴｎＴ−Ｐ１５抗体と今回用いた市販トロポニンＴ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、１０−Ｔ８５Ａ）とのサンドイッチ反応によって、０．０１ｎＭからのトロポニンＴの検出が可能であること、図４により得られた検量線を用いれば、未知の濃度のトロポニンＴを含む溶液中のトロポニンＴ濃度の定量演算が可能であることがわかる。

以上のように、本発明の抗体を用いる事で、高感度なトロポニンＴの検出及び定量が可能であることが伺える。

なお、本実施例では、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を用いたＴｎＴの測定として、ＥＬＩＳＡ法（比色測定、サンドイッチ法）により行ったが、本願はこれに限定されるものではない。
シグナル検出手法としては、本実施例で示した酵素による比色反応を用いた系だけでなく、その他、例えば、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、化学発光法及び電気化学発光法が挙げられる。
また、測定形式としては、本実施例ではサンドイッチ法によるものを示したが、本願はこれに限定されるものではなく、例えば、測定検体を固相に吸着させて測定する直接吸着法や競合法を用いてもよい。

さらに、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体は、本実施例で示したように固相に固定化された抗体として用い、固相抗体に結合したＴｎＴに対する抗原抗体反応に市販抗体を用いたが、本願はこれに限定されるものではなく、例えば、ＴｎＴ−Ｐ１５抗体を液相に配した状態で用いてもよい。
さらにまた、液相抗体は、本実施例ではビオチン化したものを用いたが、それ以外の標識化を行ってもよい。抗体に標識されるものとしては、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素、化学発光物質や電気化学発光物質等のシグナル物質が挙げられる。

本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、ハイブリドーマ、ＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットによれば、ＴｎＴを精度良く測定することができる。

ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３

配列番号：１〜２９はＴｎＴ−Ｐ１５抗体のエピトープの特定に用いられたペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３０はＴｎＴ（野生型）のアミノ酸配列である。
配列番号：３１はＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列である。
配列番号：３２はＴｎＴ−Ｐ１５抗体のエピトープに含まれるアミノ酸配列である。

Claims (11)

1. Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。
2. 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３のハイブリドーマより産生される請求項１に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。
3. 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３であるハイブリドーマ。
4. 哺乳動物に対し、ヒト心筋トロポニンＴのアイソフォーム３のＮ末端側から４１−２００番目のアミノ酸配列のうち所定数の連続するアミノ酸配列で構成されたペプチドで免疫する工程Ａと、
   前記ペプチドで免疫された哺乳動物から脾臓細胞を取り出す工程Ｂと、
   前記脾臓細胞と前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合させてハイブリドーマを得る工程Ｃと、
   を含むハイブリドーマの製造方法。
5. 前記ペプチドは、１０〜３０個のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列で構成されたペプチドである請求項４に記載のハイブリドーマの製造方法。
6. 前記ペプチドは、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むペプチドである請求項４に記載のハイブリドーマの製造方法。
7. 請求項２に記載のハイブリドーマ、または請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法により得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の製造方法。
8. 免疫測定方法であって、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いることを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴの測定方法。
9. 前記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である請求項８に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴの測定方法。
10. Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を含むヒト心筋トロポニンＴ測定キット。
11. 前記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−０１８６３のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である請求項１０に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴ測定キット。