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JP2016050204A - 抗体薬物コンジュゲートと共に使用する安定性調節用リンカー - Google Patents

抗体薬物コンジュゲートと共に使用する安定性調節用リンカー Download PDF

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JP2016050204A JP2015166643A JP2015166643A JP2016050204A JP 2016050204 A JP2016050204 A JP 2016050204A JP 2015166643 A JP2015166643 A JP 2015166643A JP 2015166643 A JP2015166643 A JP 2015166643A JP 2016050204 A JP2016050204 A JP 2016050204A
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Abstract

【課題】安定性特性が抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のリンカー上の調節用部分によって変更されるＡＤＣの提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるリンカーを用いたＡＤＣ。［Ｍは安定性調節基；Ｐは１つ以上のグルタミン残基を含むペプチド配列；ＱはＰ中のグルタミン残基；Ｅは各々独立に−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが２以上の場合）又は−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが１以上の場合）；Ｒ１はＨ、Ｃ１〜６直鎖／分枝のアルキル、Ｃ２〜６直鎖／分枝のアルケニル又はＣ２〜Ｃ６直鎖／分枝のアルキニル；Ｘ及びＹはアミノ酸；Ｚはスペーサー要素；ｍは０〜５；ｎは１〜５；ｐは０〜２；ｑは０〜１０；ｒは０〜２；ｓは０〜２；ｑ＋ｒ＋ｓ＞＝２；Ｄは細胞傷害性薬剤］【選択図】なし

Description

本発明は、抗体薬物コンジュゲートの細胞外および／または細胞内での安定性を上向きおよび下向きに調節することのできる、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と関連して使用されるリンカーに関する。本発明はまた、臨床上有利なこのような安定性調節型抗体薬物コンジュゲートを用いる治療用途および治療計画に関する。最後に、本発明は、安定性調節用リンカーおよび安定性調節型抗体薬物コンジュゲートの作製方法に関する。
配列表への言及
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂから電子出願しており、電子送信された．ｔｘｔフォーマットの配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、「ＰＣ７２１０８Ａ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの、２０１５年８月１４日に作成され、サイズが１０ＫＢである配列表を収容する。この．ｔｘｔファイルに収められた配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
抗体療法は、がんや免疫疾患などの種々の障害を有する患者における標的治療処置を提供し、したがって、生物学的調査において重要な役割を果たしてきた。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を始めとする、異なる手法の標的抗体療法が探究されている。Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．、およびＷｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．（２０１４）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３、３７９６〜８２７；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．およびＳｉｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．（２０１２）、Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ） ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０、６３１〜７；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．（２０１３）、Ｄｒｕｇ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７６、２４８〜６２。
ＡＤＣ（ある状況では免疫コンジュゲートとも呼ばれる）の場合、多くの場合細胞傷害性低分子（薬物部分）である低分子「ペイロード」が、薬物部分を腫瘍に標的局所送達する抗体に共有結合連結（コンジュゲート）されている。ＡＤＣの従来のコンジュゲーション法には、リシン側鎖アミン、または鎖間ジスルフィド結合の還元により活性化されたシステインスルフヒドリル基のいずれかを介した化学修飾が含まれる。ブレンツキシマブベドチンおよびＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン）は、こうした従来の方法を使用するＡＤＣの２つの例である。
ＡＤＣの作製にトランスグルタミナーゼを使用する酵素的手法も探究されている。トランスグルタミナーゼは、第１級アミンへのアシル付加を触媒する酵素のファミリーに属する。トランスグルタミナーゼを使用するコンジュゲーションでは、高い選択性、簡略化された反応手順、および穏やかな反応条件という利点が得られる。たとえば、Ｓｔｒｏｐら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１６１〜１６７（２０１３）、およびＦａｒｉａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（２）：２４０〜２５０（２０１４）を参照されたい。ＵＳ２０１３−０２３０５４３およびＵＳ２０１３−０１２２０２０は、トランスグルタミナーゼを介する、抗体と低分子の部位特異的コンジュゲーションを記載している。
従来のＡＤＣコンジュゲーション法では、所与の生物学系で固有の安定性を有するＡＤＣが得られる。所望の部位、通常は腫瘍におけるペイロードの送達は、ペイロード、共有結合リンカー、抗体、およびＡＤＣが導入される生物学系の特性に左右される。多くの場合、たとえば血漿中で、安定性が最適に達していないＡＤＣから、かなりの量のペイロードが時期尚早に放出され、したがって、腫瘍部位におけるペイロードへの所望の暴露を実現するために、より高いＡＤＣ投薬レベルが必要となる。他の状況では、過度に安定なＡＤＣが使用された結果、標的腫瘍細胞内でペイロード放出活性が最適に達しない。
ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）殉死要素を用いる、タンパク分解によって切断可能なペプチド系連結は、２００２年に導入されて以来、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）研究において広く使用されている（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５〜８６９）。このような連結は、ＡＤＣが抗体の標的細胞に内部移行し、エンドソームおよびリソソーム系オルガネラにおいて見られる分解性のタンパク分解環境に暴露されて切断を受けると言われている。こうしたジペプチド−ＰＡＢＣリンカーのシステイン連結型バリアントは、特許を取得しており（ＵＳ６，２１４，３４５Ｂ２）、これらおよび他の連結の含アミンバージョンが、微生物トランスグルタミナーゼによって促進される酵素的コンジュゲーションを使用するグルタミン残基への部位特異的なコンジュゲーションに適すること、ならびにこの酵素的コンジュゲーション手法を使用して十分にコンジュゲーションされる非グリコシル化抗体および改変抗体バリアントの使用が示されている（ＷＯ２０１２／０５９８８２Ａ２）。
本明細書で引用するすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の各刊行物、特許、および特許出願が参照によりそのように援用されると詳細かつ個別に示されたかのごとく、一切が全体として参照により本明細書に援用される。限定はしないが、定義された用語、用語の用法、記載の技術などを含めて、援用される文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なるまたは矛盾する事象では、本出願が統制をなす。
ＵＳ２０１３−０２３０５４３ ＵＳ２０１３−０１２２０２０ ＵＳ６，２１４，３４５Ｂ２ ＷＯ２０１２／０５９８８２Ａ２ 米国仮特許出願６１／９３２，１１８ 国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５６２３４ ＵＳ７，７５４，６８１Ｂ２ 米国特許第４，８１６，５６７号 米国特許第６，７３７，０５６号 米国特許第５，５００，３６２号 第５，８２１，３３７号 ＷＯ２０１５／０１５４４８ 米国特許第５，６６３，１４９号 米国出願第２０１３／０１２９７５３号 ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６ ＷＯ００／３４３１７ ＵＳ２０１１００２１４８２ 米国仮特許出願第６２／１４６，８４３号
Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．、およびＷｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．（２０１４）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３、３７９６〜８２７ Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．およびＳｉｅｖｅｒｓ，Ｅ．Ｌ．（２０１２）、Ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ） ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０、６３１〜７ Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．（２０１３）、Ｄｒｕｇ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７６、２４８〜６２ Ｓｔｒｏｐら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１６１〜１６７（２０１３） Ｆａｒｉａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（２）：２４０〜２５０（２０１４） Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２、１３、８５５〜８６９ Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２０００） Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２） Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９９８） Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３） ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０） Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２） Ｓｔｒｏｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０（３）：２０４〜２１９（２０１２） Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５（１９８４） Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６） Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８） Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２） ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８） Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５〜１０３８（１９９５） ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４） Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、ニューヨーク州）（第４版、１９９９） Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７）、６：４０７〜４１５ Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２ Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国国立保健研究所Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、メリーランド州ベセズダ、１９９１ Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６ Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６） ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２ Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４ ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：２〜４ Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７ Ｋｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９ Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５（１９６９） Ｐｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５、１９９８ ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：３６４２〜３６４９（１９９５） Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜１００５（１９７５） 「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２２版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１２）
本発明は、一般に、トランスグルタミナーゼを介するコンジュゲーションを用いて通常は作製される、ＡＤＣのリンカー上にある調節用部分の存在によって変更される安定性特性を有するＡＤＣに関する。発明者らは、意外にも、ＡＤＣリンカー上の特定の位置に配置されたこのような調節用部分、より詳細には、こうした調節用部分に組み込まれたある特定の化学的特徴が、ＡＤＣの安定性を望みどおりに増大または低下させる能力を有する結果、所望の作用部位においてより多いまたはより少ない割合のＡＤＣペイロードが放出されることを発見した。
したがって、本明細書では、得られるＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿安定性およびｉｎ ｖｉｖｏ暴露に顕著な影響を及ぼしうる、多くの場合リシンのアシル化誘導体である、含アミンコンジュゲーションハンドル上での特定の置換が提供される。含アミンコンジュゲーションハンドル上に存在する置換基の性質を変化させることにより、コンジュゲート安定性を調節できること、さらに、置換基を選択して、独特な各コンジュゲーション部位の安定性を最適化できることが実証されている。したがって、本発明によって、ＡＤＣ安定性のｉｎ ｖｉｖｏでの微調整が可能になり、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性および安全性に影響を及ぼすパラメーターの調節が可能になり、したがって、ＡＤＣの治療指数の最適化が可能になる。
様々な部位において、アミノ−カプロイル（Ｃ６）ｖｃＡｕｒ０１０１細胞傷害性ペイロードとコンジュゲートされたキメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性研究を示すグラフである。 ＬＣＱ０４およびＬ１１Ｂ部位において、実施例２、３および５のリンカー−ペイロードとコンジュゲートされたキメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性研究を示すグラフである。 Ｔｒｏｐ２抗体上のＬＣＱ０４部位を介して連結された、実施例１２および１４のＡＤＣ化合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を示すグラフである。破線は、ペイロード濃度を表し、実線は、抗体濃度を表す。 Ｔｒｏｐ２抗体上のＬＣＱ０４部位を介して連結された、実施例１６および１３のＡＤＣ化合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を示すグラフである。破線は、ペイロード濃度を表し、実線は、抗体濃度を表す。 Ｔｒｏｐ２抗体上のＬＣＱ０４部位を介して連結された、実施例１１、１８および１７のＡＤＣ化合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を示すグラフである。破線は、ペイロード濃度を表し、実線は、抗体濃度を表す。 マウスノックアウト系統ｃ５６／ｂｌ６ ｃｅｓ１ｃ−／−、ヘテロ接合系統ｃ５６／ｂｌ６ ｃｅｓ１ｃ＋／−、および野生型系統ｃ５６／ｂｌ６ ｃｅｓ１ｃ＋／＋を比較することにより、マウスカルボキシルエステラーゼ１ｃが、血漿中でｖｃ−ｐａｂｃリンカー切断を担う酵素であることが確認されることを示すグラフである。
本発明は、一般に、安定性の度合いが設計されている抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。詳細には、本発明は、式（Ｉ）の化合物を提供する。
Figure 2016050204
 式中、
Ｍは、安定性調節基であり、
Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
Ｄは、細胞傷害性薬剤もしくは他の治療剤であり、またはＤは、画像処理剤である。
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物も包含する。
Figure 2016050204
 式中、
Ｍは、安定性調節基であり、
Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
Ｄは、細胞傷害性薬剤もしくは他の治療剤であり、またはＤは、画像処理剤である。
追加の実施形態は、抗体薬物コンジュゲートの製造に有用な、式（ＩＩＩ）の化合物を包含する。
Figure 2016050204
 式中、
Ｍは、安定性調節基であり、
各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
Ｄは、細胞傷害性薬剤もしくは他の治療剤であり、またはＤは、画像処理剤である。
本発明の実施形態は、Ｍが−Ｍ１−Ｍ２である、本明細書に記載のとおりの化合物を包含し、ここで、Ｍ１は、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１−Ｓ（Ｏ）２−、または不在であり、Ｍ２は、置換メチル、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキル、−Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロアルキル、−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、カルボキシ、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、および−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリルからなる群から選択され、Ｍ２は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＮＯ２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル、カルボキシ、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４アリール）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール）、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル）、−Ｓ（Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル）、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−ＯＨ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基でさらに置換されていてもよく、但し、Ｍ１が−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、−（Ｃ（Ｒ１）２）ｒ−Ｅｑ−（Ｃ（Ｒ１）２）ｓ−が直鎖Ｃ４−アルキルであるとき、Ｍ２は、非置換メチルではない。
本発明の実施形態は、Ｍが−Ｍ１−Ｍ２である、本明細書に記載のとおりの化合物を包含し、ここで、Ｍ１は、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１−Ｓ（Ｏ）２−、または不在であり、Ｍ２は、−Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、および−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリルからなる群から選択され、Ｍ２は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、および−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基でさらに置換されていてもよい。
追加の実施形態は、Ｍ２が、
Figure 2016050204
 からなる群から選択される、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、修飾アシル調節用部分を有する、リシンベースのリンカー系を含み、修飾アシル調節用部分は、
Figure 2016050204
 である。
一部の実施形態では、ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を調節する方法であって、前記化合物の細胞外での安定性を調節しうる調節基Ｍを選択するステップと、前記調節基Ｍを前記コンジュゲートに組み込むステップと、前記コンジュゲートを患者に投与するステップとを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、安定性は、標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が増大するように調節される。
一部の実施形態では、安定性は、標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が低下するように調節される。
一部の実施形態では、安定性は、標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が増大するように調節される。
一部の実施形態では、安定性は、標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が低下するように調節される。
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ＡＤＣをクロマトグラフィーステップによって精製する精製ステップをさらに含む。
一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、微生物、精製、または改変トランスグルタミナーゼである。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりの１種または複数のＡＤＣを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において腫瘍の成長または進行を抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんに罹患している疑いのある対象においてがんを診断する方法であって、ａ）対象の試料を、ＡＤＣががん関連タンパク質と結合する条件下で、本明細書に記載のとおりのＡＤＣと接触させるステップと、ｂ）ＡＤＣのがん関連タンパク質への結合を判定するステップとを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のとおりのＡＤＣ中の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片である。
本発明の実施形態は、細胞傷害性薬剤Ｄが、アントラサイクリン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、スプリセオスタチン（ｓｐｌｉｃｅｏｓｔａｔｉｎ）、ＣＢＩ／ＣＰＩ二量体（米国仮特許出願６１／９３２，１１８に記載のとおりの、ＣＢＩおよびＣＰＩ両方の成分を含む「混合型」二量体を含める）、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ヘミアステリン、カンプトテシン、コンブレタスタチン、ドラスタチン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン二量体、およびプラジエノリド（ｐｌａｄｉｅｎｏｌｉｄｅ）、ならびにこれらの立体異性体、同配体、類似体、または誘導体からなる群から選択される、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。たとえば、細胞傷害性薬剤Ｄが、ドレスタチン（ｄｏｌｅｓｔａｔｉｎ）、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＦ−０６３８０１０１、ＰＦ−０６４６３３７７、およびＰＦ−０６４５６７８０からなる群から選択されるアウリスタチンである。
本発明の追加の実施形態は、たとえば、Ｄが、ペプチド、タンパク質、核酸、成長因子、抗ウイルス剤、もしくは免疫剤を含めて、治療特性を有する部分（すなわち、治療剤）である場合において、Ｄが、細胞傷害性薬剤以外の或るものであるもの、またはＤが、蛍光体もしくは他の画像処理剤であるものを包含する。Ｄが細胞傷害性薬剤である場合のように、本発明は、Ｄが細胞傷害性薬剤以外である化合物の安定性調節を包含する。
本発明の追加の実施形態は、Ｐが、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＡ（配列番号２４）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号３３）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号３４）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号３５）、およびＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである化合物を包含する。
本発明の実施形態は、Ｐが、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号３７）［Ｘは、任意のアミノ酸である］を含むペプチドである、本明細書に記載のとおりの化合物も包含する。
本発明の実施形態は、前記調節基Ｍをもたない対応する化合物と比較して、安定性が、少なくとも１、５、１０、２５、５０、７５、または１００分の１に低下している、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、前記調節基Ｍをもたない対応する化合物と比較して、安定性が、少なくとも１、５、１０、２５、５０、７５、または１００倍に増大している、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、Ｘ−Ｙが、Ｇｌｙ、β−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−Ｎｉｔｒｏ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ａｌａ、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎからなる群から選択される、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、Ｐが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および抗体断片からなる群から選択される、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、抗体が、トラスツズマブ、トラスツズマブ変異体（たとえば、本明細書または国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５６２３４で開示されているトラスツズマブ変異体）、オレゴボマブ、エドレコロマブ、セツキシマブ、ビトロネクチン受容体（αｖβ３）に対するヒト化モノクローナル抗体、アレムツズマブ、非ホジキンリンパ腫治療用のヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を始めとする抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、１３１Ｉ Ｌｙｍ−１、非ホジキンリンパ腫治療用のマウス抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体を始めとする抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体、抗ｃｄ３３抗体、ホジキン病または非ホジキンリンパ腫治療用のヒト化抗ＣＤ２２ ｍＡｂを始めとする抗ｃｄ２２抗体、ラベツズマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、イピリムマブ、およびゲムツズマブから選択される、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の追加の実施形態は、各Ｑが、独立に、ペプチド配列Ｐに内在するグルタミンの残基、または前記ペプチド配列Ｐ上にある改変タグ配列に設けられたグルタミンの残基である（ここで、タグは、グルタミンを含んでいる複数のアミノ酸の配列でも、グルタミンのみでもよい）、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明のさらに別の態様において、抗体は、安定性調節型切断可能リンカーを介したペイロードＤの制御放出を促進する、標的送達の特色を備えたまたは備えない巨大分子担体として働く。
本発明の実施形態は、各Ｑが、前記ペプチド配列Ｐに内在するグルタミンの残基である、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、各Ｑが、前記ペプチド配列Ｐ上にある改変タグ配列に設けられたグルタミンの残基である（再びここで、タグは、グルタミンを含んでいる複数のアミノ酸の配列でも、グルタミンのみでもよい）、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の別の実施形態は、式（ＩＩ）の抗体薬物複合体：
Figure 2016050204
 ［式中、
Ｍは、安定性調節基であり、
Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
Ｄは、細胞傷害性薬剤である］
のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を調節する方法であって、
前記化合物の細胞外での安定性を調節しうる調節基Ｍを選択するステップと、
前記調節基Ｍを前記コンジュゲートに組み込むステップと、
前記コンジュゲートを患者に投与するステップと
を含む方法を包含する。
本発明の実施形態は、標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が増大する、本明細書に記載のとおりの治療方法を包含する。
本発明の実施形態は、標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が低下する、本明細書に記載のとおりの治療方法を包含する。
本発明の実施形態は、標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が増大する、本明細書に記載のとおりの治療方法を包含する。
本発明の実施形態は、標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率が低下する、本明細書に記載のとおりの方法を包含する。
本発明の別の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2016050204
 ［式中、
Ｍは、安定性調節基であり、
Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
ｍは、０〜５であり、ｎは、０〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
Ｄは、細胞傷害性薬剤である］を合成する方法であって、
構造
Figure 2016050204
 である量の第１の化合物を用意するステップと、
グルタミンが組み込まれているペプチド配列を含む一定量の第２の化合物を用意するステップと、
前記ある量の第１の化合物と第２の化合物をトランスグルタミナーゼの存在下で反応させるステップと
を含む方法を包含する。
本発明の実施形態は、Ｚが、ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジル−カルバモイル）、ＰＡＢ−ＯＨ（ｐ−アミノカルバモイルオキシ）、
Figure 2016050204
 からなる群から選択され、
Ｔは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。
本発明の実施形態は、ＺがＺ１−Ｚ２であり、Ｚ１は、ｐ−アミノベンジル−カルバモイル（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルオキシ、ｏ−アミノベンジル−カルバモイル、ｏ−アミノベンジルオキシ、−ＮＨ−Ｕ−Ｃ（Ｒ１）２ＯＣＯ−、および−ＮＨ−Ｕ−Ｃ（Ｒ１）２Ｏ−からなる群から選択され、Ｚ２は、不在であるか、または−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−ＯＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−Ｎ（Ｒ１）２ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−ＳＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−シクロアルキレン）−ＯＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−シクロアルキレン）−Ｎ（Ｒ１）２ＣＯ−および−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−アルキレン）−ＳＣＯ−からなる群から選択され、Ｕは、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＮＯ２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル、カルボキシ、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４アリール）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール）、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル）、−Ｓ（Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル）、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−ＯＨ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択される５個までの追加の置換基で置換されていてもよい、Ｃ５〜Ｃ２０芳香族環またはヘテロ芳香族環である、本明細書に記載のとおりの化合物を包含する。Ｕ上の−ＮＨ−と−Ｃ（Ｒ１）２ＯＣＯ−または−Ｃ（Ｒ１）２Ｏ−の置換パターンは、Ｙ−Ｚ結合が切断されてＺ２−Ｄが効率的に除去可能になるように整えるべきである。たとえば、ＵＳ７，７５４，６８１Ｂ２およびＵＳ６２１４３４５Ｂ２を参照されたい。
用語「アルキル」とは、それ自体で、または別の用語の一部として、示された数の炭素原子を有する、直鎖または分枝の飽和炭化水素を指す（たとえば、「Ｃ１〜Ｃ８」アルキルとは、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基を指す）。炭素原子の数が示されないとき、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する。代表的な直鎖Ｃ１〜Ｃ８アルキルとしては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルが挙げられ、分枝Ｃ１〜Ｃ８アルキルとしては、限定はしないが、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、および−２−メチルブチルが挙げられ、不飽和Ｃ２〜Ｃ８アルキルとしては、限定はしないが、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニルおよび３−メチル−１−ブチニルが挙げられる。
用語「ヘテロアルキル」とは、それ自体で、または別の用語との複合語で、別段記載しない限り、記載された数の炭素原子とＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される１個〜３個のヘテロ原子とからなり、窒素および硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、場合により四級化されていてもよい、完全に飽和であるまたは１〜３度の不飽和を含んでいる、安定な直鎖もしくは分枝鎖状炭化水素、またはその組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、およびＳは、ヘテロアルキル基の内部のどの位置に配置されてもよい。ヘテロ原子Ｓｉは、アルキル基が分子の残部に結合している位置を含めて、ヘテロアルキル基のどの位置に配置されてもよい。最高で２個のヘテロ原子が連続してもよい。
用語「アリール」とは、それ自体で、または別の用語の一部として、別段指摘しない限り、親芳香族環系の単一の炭素原子から１個の水素原子が除去されて導かれる、６〜２０個、好ましくは６〜１４個の炭素原子の、一価の置換または非置換炭素環式芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基としては、限定はしないが、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから導かれるラジカルが挙げられる。アリール基は、次の基：Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２、および−ＣＮの１つまたは複数、好ましくは１〜５つで置換されている場合があり、各Ｒ’は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および非置換アリールから独立に選択される。用語「ヘテロシクリル」とは、それ自体で、または別の用語の一部として、別段指摘しない限り、１〜１０個、好ましくは３〜８個の炭素原子（環員とも呼ばれる）と、Ｎ、Ｏ、Ｐ、またはＳから独立に選択される１個〜４個のヘテロ原子環員とを有し、親環系の環原子から１個の水素原子が除去されて導かれる、一価の置換または非置換芳香族または非芳香族単環式、二環式、または三環式環系を指す。ヘテロシクリル中の１個または複数のＮ、Ｃ、またはＳ原子は、酸化されている場合がある。ヘテロ原子を含む環は、芳香族でも、芳香族でなくてもよい。別段指摘しない限り、ヘテロシクリルは、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子においてその側基に結合している。Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルの代表例としては、限定はしないが、テトラヒドロフラニル、オキセタニル、ピラニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、ベンゾチアゾリル、インドリル、ベンゾピラゾリル、ピロリル、チオフェニル（チオフェン）、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、１，２，３，４−テトラヒドロ（ｔｅｔｒｓｈｙｈｒｏ）−キノリニルなどの部分を含めたキノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、テトラゾリル、エポキシド、オキセタン、および（置換または非置換の）ＢＯＤＩＰＹが挙げられる。Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルは、限定はしないが、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、−ＯＲ’、アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２および−ＣＮを含めた７個までの基で置換されている場合があり、各Ｒ’は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、およびアリールから独立に選択される。一部の実施形態では、置換ヘテロシクリルは、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、および−ＳＲ’の１つまたは複数を含む場合もある。
用語「カルボシクリル」とは、それ自体で、または別の用語の一部として、別段指摘しない限り、親環系の環原子から１個の水素原子が除去されて導かれる、一価の置換または非置換飽和または不飽和非芳香族単環式または二環式３、４、５、６、７、または８員炭素環を指す。代表的なカルボシクリルとしては、限定はしないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、１，４−シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、１，３−シクロヘプタジエニル、１，３，５−シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクタジエニル、ビシクロ（１．１．１．）ペンタン、およびビシクロ（２．２．２．）オクタンが挙げられる。カルボシクリル基は、非置換でも、または、限定はしないが、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ヘテロアルキル、−ＯＲ’、アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２および−ＣＮを含めた７個までの基で置換されていてもよく、各Ｒ’は、上で示したとおりである。
用語「アルケニル」とは、別段指摘しない限り、少なくとも１つの二重結合と、好ましくは２〜１０個の炭素原子とを含んでいる、直鎖または分枝鎖不飽和炭化水素を指す。アルケニル基の例としては、限定はしないが、エチレン、プロピレン、１−ブチレン、２−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、１−ペンテン、２−ペンテン、イソペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、イソヘキセン、１−ヘプテン、２−ヘプテン、３−ヘプテン、１−オクテン、２−オクテン、３−オクテン、４−オクテン、１−ノネン、２−ノネン、３−ノネン、４−ノネン、１−デセン、２−デセン、３−デセン、４−デセンおよび５−デセンが挙げられる。アルケニル基は、非置換でも、置換されていてもよい。
用語「アルコキシ」とは、アルキル−Ｏ−基を指し、アルキルは、本明細書で定義するとおりである。例示的なアルコキシ基としては、限定はしないが、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、およびｔ−ブトキシが挙げられる。アルコキシ基は、非置換でも、置換されていてもよい。
用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの三重結合と、好ましくは２〜１０個の炭素原子とを含んでいる、直鎖または分枝鎖不飽和炭化水素を指す。アルキニル基の例としては、限定はしないが、アセチレン、プロピン、１−ブチン、２−ブチン、イソブチン、ｓｅｃ−ブチン、１−ペンチン、２−ペンチン、イソペンチン、１−ヘキシン、２−ヘキシン、３−ヘキシン、イソヘキシン、１−ヘプチン、２−ヘプチン、３−ヘプチン、１−オクチン、２−オクチン、３−オクチン、４−オクチン、１−ノニン、２−ノニン、３−ノニン、４−ノニン、１−デシン、２−デシン、３−デシン、４−デシンおよび５−デシンが挙げられる。アルキニル基は、非置換でも、置換されていてもよい。
用語「ヘテロアリール」とは、酸素、硫黄、および窒素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子と、通常は１〜９個の炭素原子とを含んでいる、単環式および二環式の５〜１０員芳香族基を指す。単環式ヘテロアリールラジカルの例としては、限定はしないが、オキサジニル、チアジニル、ジアジニル、トリアジニル、チアジアゾイル、テトラジニル、イミダゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、フラニル、フラザニル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピリミジニル、Ｎ−ピリジル、２−ピリジル、３−ピリジルおよび４−ピリジルが挙げられる。二環式ヘテロアリールラジカルの例としては、限定はしないが、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、キノリニル、キナゾリニル、プリニル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソインドリル、およびインダゾリルが挙げられる。ヘテロアリール基は、非置換でも、置換されていてもよい。
用語「カルボキシル」とは、カルボキシル（Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）官能基の酸素原子を介して親構造に結合している基、通常は、本明細書で定義するとおりのアルキル基を指す。カルボキシル基の例としては、アセトキシ、プロピオノキシ、プロピルカルボキシル、およびイソペンチルカルボキシルが挙げられる。
たとえば「置換アルキル」などの化学部分に関連して、「置換」とは、別段指定しない限り、１個または複数の水素原子が、それぞれ独立に、置換基と交換されている部分を意味する。典型的な置換基としては、限定はしないが、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−ＳＯ３ −、−ＳＯ３Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−ＰＯ３ ２−、ＰＯ３Ｈ２、−ＡｓＯ２Ｈ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２ −、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２、または−Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ２が挙げられ、各Ｘは、独立に、ハロゲン：−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり、各Ｒは、独立に、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、保護基、またはプロドラッグ部分である。
また、それを必要とする対象において、がんを治療し、腫瘍の成長もしくは進行を抑制し、がん細胞もしくは腫瘍の転移を抑制し、または腫瘍退縮を誘発する方法であって、対象に、本明細書に記載にとおりのＡＤＣを含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。
一般技術および定義
本明細書で別段定義しない限り、本発明に関連して使用する科学技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段規定されない限り、単数形の用語は、複数性を包含するものとし、複数形の用語は、単数形を包含するものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される術語、およびその技術は、当技術分野でよく知られ、一般に使用されるものである。
本発明の方法および技術は、別段指摘しない限り、一般に、当技術分野でよく知られている従来の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用および論述されている全般的およびより詳細な種々の参考文献に記載のとおりに実施される。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、当技術分野で一般になされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに実施される。本明細書に記載の、分子生物学、生化学、免疫学、分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品および製薬化学と関連して使用される術語、ならびにその検査手順および技術は、当技術分野でよく知られ、一般に使用されるものである。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形語は、記載された完全体または完全体の群を包含するが、他のいずれかの完全体または完全体の群を排除しないことを含意すると理解される。
本明細書で使用する用語「含グルタミンタグ」、「グルタミンタグ」、「含Ｑタグ」、「Ｑタグ」、または「トランスグルタミナーゼタグ」とは、１つまたは複数のＧｌｎ残基を含んでいるポリペプチドもしくはタンパク質を指し、または単一のグルタミンもしくはグルタミン残基を指す場合もある。
本明細書で使用するとき、用語「部位特異性」、「部位特異的にコンジュゲートした」、または「部位特異的に架橋した」とは、含アミン部分が、特定の部位において（たとえば、表１に示す種々の位置において）、含グルタミンタグ、内在グルタミン、および／または抗体工学もしくは改変トランスグルタミナーゼによって反応性にした内在グルタミンを介して、抗体に特異的にコンジュゲートまたは架橋することを指す。部位特異性は、限定はしないが、質量分析（たとえば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、タンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）、および飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ））、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、部位特異的突然変異誘発、蛍光標識、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＸ線結晶学を始めとする、種々の技術によって測定することができる。
用語「負荷」または「薬物負荷」または「ペイロード負荷」とは、ＡＤＣ分子中の抗体あたりのペイロード（「ペイロード」は、本明細書では「薬物」と互換的に使用する）の平均数を表す、または指す。薬物負荷は、抗体あたりｌ〜２０の薬物の範囲でよい。この用語は、時に、ＤＡＲまたは薬物対抗体比と呼ばれる。本発明のＡＤＣの薬物抗体比（ＤＡＲ）は、約１〜約６０である。一部の実施形態では、ＤＡＲは、少なくとも約、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９および６０のいずれかである。抗体あたりの薬物の平均数、またはＤＡＲ値は、ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けることができる。定量的なＤＡＲ値も求めることができる。一部の例では、特定のＤＡＲ値を有する均質なＡＤＣの分離、精製、および特性決定を、逆相ＨＰＬＣや電気泳動などの手段によって実現することができる。ＤＡＲは、抗体上の結合部位の数によって限定されることもある。たとえば、本発明でのように結合がグルタミンである場合において、抗体は、それを介してリンカー単位を結合することのできる適切なグルタミン残基を１つまたはいくつかしかもたない場合もある。通常、コンジュゲーション反応の際、最大理論値より少ない薬物部分しか、抗体とコンジュゲートしない。
本明細書で使用するとき、用語「反応性にした内在グルタミン（Ｑ）」とは、抗体工学（たとえば、酵素的脱グリコシル化および／もしくはアミノ酸修飾）または改変トランスグルタミナーゼによって、トランスグルタミナーゼの存在下で含アミン部分に接触可能になり、暴露され、または反応性になっている内在グルタミンを指す。
本明細書で使用するとき、用語「生体適合ポリマー」とは、レシピエントにおいて望ましくないいかなる局所または全身作用も惹起することなく、レシピエント（たとえば、ヒト）における治療または医療処置に適するポリマー（たとえば、繰返しのモノマー単位または構造単位）を指す。生体適合ポリマー（合成、組換え、または自然）は、水溶性または水不溶性ポリマーでよい。生体適合ポリマーはまた、線状または分枝状のポリマーでよい。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合しうる、免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するとき、文脈から別段示されない限り、この用語は、インタクトのポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの）その断片、サメおよびラクダ科動物抗体を始めとする単鎖（ＳｃＦｖ）および単ドメイン抗体）、抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体（たとえば、ＣＯＶＸ−ＢＯＤＹ（商標））、多重特異性抗体（たとえば、所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体）、および本明細書に記載のとおりの抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む、任意の他の変更された立体配置の免疫グロブリン分子も包含するものである。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り振ることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分ける場合もある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、よく知られている。一態様では、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、サル、またはウサギ免疫グロブリンである。
本明細書で使用する用語「含Ｆａｂポリペプチド」とは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、または「（Ｆａｂ’）２断片」を含むポリペプチドを指す。含Ｆａｂポリペプチドは、（一般に、ポリペプチドのＦａｂ部分のカルボキシル末端にある）野生型ヒンジ配列の一部または全部を含んでもよい。含Ｆａｂポリペプチドは、適切な任意の免疫グロブリンから、たとえば、種々のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得られ、または導かれるものでよい。含Ｆａｂポリペプチドは、１種または複数のポリペプチドが含Ｆａｂポリペプチドに連結している含Ｆａｂ融合ポリペプチドでもよい。Ｆａｂ融合では、免疫グロブリンのＦａｂポリペプチドが、一般に任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子でよい融合パートナーと組み合わさる。事実上任意のタンパク質または低分子をＦａｂポリペプチドに連結させて、含Ｆａｂ融合ポリペプチドを生成してもよい。含Ｆａｂ融合パートナーとしては、限定はしないが、受容体、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のいくつかのタンパク質もしくはタンパク質ドメインの標的結合領域を挙げることができる。
「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１および可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはない。
「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含んだ、１本の重鎖の一部分と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域も含んでおり、その結果、２本の重鎖の２つのＦａｂ’断片間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子となる。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の定常領域の一部分を含んだ２本の重鎖とを含んでいる結果、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖間のジスルフィド結合によってまとめられている２つのＦａｂ’断片から構成される。
本明細書で使用する「抗体断片」は、インタクトの抗体の一部分だけを含み、その部分は、インタクトの抗体の中に存在するとき、通常その部分と関連付けられる機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持することが好ましい。
「多重特異性抗体」とは、２種以上の抗原またはエピトープを標的とするものである。「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、または「二機能性」抗体とは、異なる２つの抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、多重特異性抗体の一種であり、限定はしないが、ハイブリドーマの融合、Ｆａｂ’断片の連結、または抗体ヒンジおよびＣＨ３ドメインにおける突然変異を始めとする様々な方法によってによって生成することができる。たとえば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）；およびＳｔｒｏｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０（３）：２０４〜２１９（２０１２）を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在しうる異なる２種のエピトープに結合する。
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体からなる、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、軽微な量で存在することのある起こりうる自然発生突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一抗原に向けられている。さらに、各モノクローナル抗体は、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を通常は含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の決定基に向けられている。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるモノクローナル抗体には、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種由来であるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、鎖の残部が、別の種由来であるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびに、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片を含めることができる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。
「ヒト化」した形態の非ヒト（たとえば、マウス）抗体とは、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最低限含んでいるキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類などの非ヒト種の高度可変領域（ドナー抗体）からの残基と交換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基と交換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含んでもよい。こうした修飾は、抗体性能をさらに正確にするためになされる。一般に、ヒト化抗体は、高度可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの高度可変ループに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。これ以上の細目については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。その中で引用されている次の総説および参考文献も参照されたい。ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）。
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書で開示するとおりのヒト抗体作製技術のいずれかを使用して作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、詳細には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
本明細書で使用する、「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、およびこれらの変形語は、たとえば、Ｊａｎｅｗａｙら、ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、ニューヨーク州）（第４版、１９９９）；Ｂｌｏｏｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７）、６：４０７〜４１５；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）、２０９：１９３〜２０２で例示されている、当技術分野で知られた意味を包含する。
本明細書で使用する用語「含Ｆｃポリペプチド」とは、免疫グロブリン重鎖のカルボキシル末端ポリペプチド配列を含むポリペプチド（たとえば、抗体またはイムノアドヘシン）を指す。含Ｆｃポリペプチドは、未変性または変異Ｆｃ領域（すなわち、配列）を含む場合がある。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によりＣＨ４ドメインを含む。含Ｆｃポリペプチドは、（一般に、含Ｆｃポリペプチドのアミノ末端にある）野生型ヒンジ配列の一部または全部を含んでもよい。含Ｆｃポリペプチドは、二量体でもよい。含Ｆｃポリペプチドは、適切な任意の免疫グロブリンから、たとえば、種々のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプの少なくとも１つから、またはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭから得られ、または導かれるものでよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、様々になるかもしれないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、たとえば、Ｇｌｕ２１６位のアミノ酸残基から、またはＡｌａ２３１から、そのカルボキシル末端に及ぶと定義されるのが普通である。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのとおりのＥＵインデックスの番号付けである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国国立保健研究所Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、メリーランド州ベセズダ、１９９１。
含Ｆｃポリペプチドは、１種または複数のポリペプチドが含Ｆｃポリペプチドに連結している含Ｆｃ融合ポリペプチドでもよい。Ｆｃ融合では、免疫グロブリンのＦｃポリペプチドが、一般に任意のタンパク質、ポリペプチド、または低分子でよい融合パートナーと組み合わさる。事実上任意のタンパク質または低分子をＦｃ領域に連結させて、含Ｆｃ融合ポリペプチドを生成してもよい。含Ｆｃ融合パートナーとしては、限定はしないが、受容体、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、または他のいくつかのタンパク質もしくはタンパク質ドメインの標的結合領域を挙げることができる。
本明細書で使用するとき、用語「イムノアドヘシン」とは、非相同タンパク質（「アドヘシン」、たとえば、受容体、リガンド、または酵素）の「結合ドメイン」が、免疫グロブリン定常ドメイン（すなわち、Ｆｃドメイン）のエフェクター構成要素と組み合わさっている、抗体様または免疫グロブリン様分子を意味する。イムノアドヘシンは、構造上は、抗体の抗原認識および抗原結合部位（抗原合体部位）以外である（すなわち、「非相同」である）、所望の結合特異性を有するアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合物を含む。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから取得することができる。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では、好ましくは比較的短い、任意の長さ（たとえば、１０〜１００アミノ酸）のアミノ酸の鎖を指すのに互換的に使用される。鎖は、線状でも分枝でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、かつ／または非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、自然に、または介入によって修飾されているアミノ酸鎖；たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾も包含する。（たとえば、非天然アミノ酸などを含めた）アミノ酸の１種または複数の類似体を含んでいるポリペプチド、ならびに当技術分野で知られている他の変更形態も、定義の範囲内に含まれる。ポリペプチドは、単鎖としてまたは連合した鎖として存在する場合があることは理解される。
本明細書で使用するとき、用語「野生型アミノ酸」、「野生型ＩｇＧ」、または「野生型ｍＡｂ」とは、ある特定の集団（たとえば、ヒト、マウス、ラット、細胞など）内で自然発生するアミノ酸または核酸の配列を指す。
本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲーション効率」または「架橋効率」とは、本明細書に記載のとおりのＡＤＣの実験による測定量を、最大予測ＡＤＣ量で割った比である。コンジュゲーション効率または架橋効率は、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの、当業者によく知られている種々の技術によって測定することができる。コンジュゲーション効率は、室温や３７℃などの異なる温度で測定する場合もある。
用語「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、限定はしないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃ受容体結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、食作用、Ｃ１ｑ結合、および細胞表面受容体（たとえば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下向き調節が挙げられる。たとえば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照されたい。このようなエフェクター機能には、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（たとえば、抗体可変ドメイン）と合わさる必要があり、このような抗体エフェクター機能の値を求めることが当技術分野で知られている種々のアッセイを使用して、これを評価することができる。例示的なエフェクター機能の測定は、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑ結合を通したものである。
本明細書で使用するとき、「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現させる非特異的な細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞によって媒介される反応を指す。目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載のものなどの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを使用して評価することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が挙げられる。別法として、または追加として、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６に記載のものなどの動物モデルで評価してもよい。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、同族抗原と複合体形成した分子（たとえば、抗体）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載のとおりのＣＤＣアッセイを実施することができる。
本明細書で使用するとき、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体のことをいう。好ましいＦｃＲは、未変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲとは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体が、こうした受容体の対立遺伝子バリアントおよび別の可能性としてはスプライスされた形態を含めて、これに含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主としてその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎら、２００５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：２〜４において総説されている。「ＦｃＲ」は、母性ＩｇＧの胎児への移行を担う、新生児受容体であるＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
用語「精製する」およびその文法上の変形語は、ＡＤＣと１種または複数の不純物を含有する混合物から、少なくとも１種の不純物を、完全または部分的のいずれにせよ、除去し、それによって、（すなわち、組成物中の不純物の量（ｐｐｍ）を減少させることにより）組成物中のＡＤＣの純度レベルを向上させることを意味するのに使用する。
本明細書における「約」の付いた値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を包含（および記載）する。たとえば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」という記述を包含する。数字の範囲は、範囲の境界となる数を含む。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物として、限定はしないが、家畜、競技用動物、愛玩動物、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットも挙げられる。
本明細書において、実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言い回しで記載される場合は必ず、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載される、他の点では類似した実施形態も提供されると理解される。
本発明の態様または実施形態を、マーカッシュ群または代案の他のグループ分けの用語で記載する場合において、本発明は、まとめて列挙された群全体、個々には群の各メンバー、および主群の考えうるすべての亜群だけでなく、群メンバーの１つまたは複数が存在しない主群も包含する。本発明は、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明確な除外も想定する。
本出願における残基の呼称は、ＥＵの定常ドメイン番号付けスキームに基づく（Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５（１９６９））。
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。例示的な方法および材料を本明細書に記載するが、本明細書に記載のものと同様または同等な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及するすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。不一致の場合では、定義を含めて、本出願が統制をなす。いくつかの文書が本明細書に引用されているとしても、その引用は、こうした文書のいずれかが、当技術分野で共通の一般知識の一部をなすことを容認する性質ではない。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形語は、記載された完全体または完全体の群を包含するが、他のいずれかの完全体または完全体の群を排除しないことを含意すると理解される。文脈によって別段規定されない限り、単数形の用語は、複数性を包含するものとし、複数形の用語は、単数形を包含するものとする。材料、方法、および例は、実例にすぎず、限定するものでない。
トランスグルタミナーゼは、通常はグルタミン残基のリシン残基でのｐＨ依存的なアミド基転移を触媒するタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼである。本明細書に記載する、本発明で使用するトランスグルタミナーゼは、様々な供給源から取得もしくは生成し、または１つまたは複数の内在グルタミン残基の１つまたは複数のリシン残基もしくは他の含アミン部分でのアミド基転移を触媒するように操作したものでよい。一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、酵素立体構造を変化させ、酵素活性を可能にするのにカルシウムを必要とする、カルシウム依存性トランスグルタミナーゼである。たとえば、トランスグルタミナーゼは、モルモット肝臓から得ることも、民間供給業者（たとえば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）およびＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（カリフォルニア州Ｉｒｖｉｎｅ））を通して取得することもできる。一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、酵素立体構造を変化させ、酵素活性を可能にするのにカルシウムを必要としない、カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼである。一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、微生物ゲノム由来の微生物トランスグルタミナーゼ、たとえば、ストレプトベルティシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（たとえば、ストレプトミセス・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）またはストレプトベルティシリウム・モバレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ））からのトランスグルタミナーゼである。ＡＣＴＩＶＡ（商標）（味の素株式会社、日本）などの、市販品として入手可能なカルシウム非依存性トランスグルタミナーゼは、本発明に適する。一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、哺乳動物タンパク質（たとえば、ヒトトランスグルタミナーゼ）、細菌タンパク質、植物タンパク質、真菌タンパク質（たとえば、卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびアクチノミセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｉｃｅｔｅｓ）トランスグルタミナーゼ）、または原核生物タンパク質である。一部の実施形態では、トランスグルタミナーゼは、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ツロルプシス（Ｔｕｒｏｌｐｓｉｓ）、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来である。
一部の実施形態では、本明細書に記載する、本発明で使用するトランスグルタミナーゼは、抗体中の１つまたは複数の内在グルタミン残基の、１つまたは複数のリシン残基または他の含アミン部分でのアミド基転移を触媒する、改変トランスグルタミナーゼである。たとえば、自然発生トランスグルタミナーゼ中の１つまたは複数の野生型アミノ酸残基を、欠失させ、または別のアミノ酸残基で交換もしくは置換して、改変トランスグルタミナーゼを作製することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する、本発明で使用するトランスグルタミナーゼは、当業者に知られている組換え技術を使用して産生された組換えタンパク質でもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載する、本発明で使用するトランスグルタミナーゼは、精製タンパク質でよい。たとえば、精製トランスグルタミナーゼは、純度が少なくとも約５０％である。本明細書で使用するとき、「純粋」または「精製」タンパク質とは、他のタンパク質夾雑物を含まないタンパク質（たとえば、トランスグルタミナーゼ）を指す。一部の実施形態では、精製トランスグルタミナーゼは、純度が、少なくとも約、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９８％、または９９％のいずれかである。一部の実施形態では、精製トランスグルタミナーゼは、純度が、少なくとも約、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれかである。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、抗体工学によって、または改変トランスグルタミナーゼによってアミド基転移反応に反応性にされた少なくとも１つの内在グルタミンを含む。一部の実施形態では、抗体工学は、抗体脱グリコシル（たとえば、酵素的脱グリコシル）、または抗体上でのアミノ酸欠失、挿入、置換、突然変異、もしくはこれらの任意の組合せを含めたアミノ酸修飾である。たとえば、抗体中の２９７位にある野生型アミノ酸Ａｓｎ（Ｎ）が、アミノ酸Ａｌａ（Ａ）で置換または交換される結果、２９７位では非グリコシル化、２９５位では反応性の内在グルタミン（Ｑ）が生じる。別の例では、抗体におけるアミノ酸修飾は、トランスグルタミナーゼの存在下で、２９７位における非グリコシル化、２９５位における反応性内在Ｑ、ならびにＮ２９７ＱおよびＱ２９５と１つまたは複数の含アミン部分との、これら２つの部位における部位特異的コンジュゲーションを結果として生じる、２９７位におけるＮからＱへのアミノ酸置換である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、限定はしないが、１）軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖両方のカルボキシル末端、２）軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖両方のアミノ末端、および３）Ｓ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９−Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７、および／またはＧ３８５を始めとする、少なくとも１つまたは複数の位置において操作された含グルタミンタグを含み、含グルタミンタグは、抗体に挿入され、または抗体中の１つまたは複数の内在アミノ酸と入れ替わる。
詳細な含グルタミンタグおよびその対応する操作位置の例は、表１に示され、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１２／０５９８８２およびＷＯ２０１５／０１５４４８に記載されている。
Figure 2016050204
Figure 2016050204
一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体は、同じ位置で野生型抗体と比較して、２２２、３４０、または３７０位（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、この修飾は、アミノ酸欠失、挿入、置換、突然変異、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、置換は、野生型アミノ酸を別のもの（たとえば、非野生型アミノ酸）と交換することを含む。一部の実施形態では、他の（たとえば、非野生型）または挿入されたアミノ酸は、Ａｒｇである（たとえば、Ｋ２２２Ｒ、Ｋ３４０Ｒ、またはＫ３７０Ｒ）。一部の実施形態では、挿入は、１つまたは複数のアミノ酸を挿入（たとえば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸を挿入）することを含む。一部の実施形態では、他の（たとえば、非野生型）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである。
したがって、一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒ位におけるアミノ酸置換［含アミン部分は、２９５位にある内在グルタミンおよび２９７位にある置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートされる］、および／またはｂ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にコンジュゲートされる］を含む。一部の実施形態では、薬物抗体比（ＤＡＲ）は、約３〜９である。一部の実施形態では、抗体の軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）である。
一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒ位におけるアミノ酸置換［含アミン部分は、２９５位にある内在グルタミンおよび２９７位にある置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｂ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にコンジュゲートされる］、および／またはｃ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体中のＳ６０〜Ｒ６１、Ｒ１０８、Ｔ１３５、Ｓ１６０、Ｓ１６８、Ｓ１９０〜Ｓ１９２、Ｐ１８９〜Ｓ１９２、Ｇ２００〜Ｓ２０２、Ｋ２２２〜Ｔ２２５、Ｋ２２２〜Ｔ２２３、Ｔ２２３、Ｌ２５１〜Ｓ２５４、Ｍ２５２〜Ｉ２５３、Ｅ２９４〜Ｎ２９７、Ｅ２９３〜Ｎ２９７、Ｎ２９７、およびＧ３８５からなる群から選択される１つまたは複数の位置にある含グルタミンタグに部位特異的にさらにコンジュゲートされる］を含み、含グルタミンタグは、抗体中に挿入され、または抗体中の１つまたは複数の内在アミノ酸と入れ替わる。一部の実施形態では、薬物抗体比は、少なくとも約６である。たとえば、一部の実施形態では、本発明のＡＤＣはまた、ａ）Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒにおけるアミノ酸置換［含アミン部分は、２９５位にある内在グルタミンおよび２９７位にある置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｂ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｃ）１つまたは複数のグルタミンタグ［含アミン部分は、抗体重鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にさらにコンジュゲートされる］を含み、薬物抗体比（ＤＡＲ）は、約６〜９である。一部の実施形態では、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）であり、抗体重鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグは、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）である。
一変形形態において、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒ位におけるアミノ酸置換［含アミン部分は、２９５位にある内在グルタミンおよび２９７における置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｂ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｃ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体重鎖においてＴ１３５アミノ酸位の後に挿入された含グルタミンタグに部位特異的にさらにコンジュゲートされる］を含み、薬物抗体比（ＤＡＲ）は、約６〜９である。一部の実施形態では、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）であり、抗体重鎖においてＴ１３５の後に挿入された含グルタミンタグは、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。
別の変形形態では、本発明のＡＤＣは、ａ）Ｎ２９７ＱおよびＫ２２２Ｒ位におけるアミノ酸置換［含アミン部分は、２９５位にある内在グルタミンおよび２９７位にある置換グルタミンに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｂ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグに部位特異的にコンジュゲートされる］、ｃ）１つまたは複数の含グルタミンタグ［含アミン部分は、抗体重鎖におけるＧ２００〜Ｓ２０２アミノ酸位にある含グルタミンタグに部位特異的にさらにコンジュゲートされる］を含み、薬物抗体比（ＤＡＲ）は、約６〜９である。一部の実施形態では、抗体軽鎖のカルボキシル末端にある含グルタミンタグは、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）であり、抗体重鎖においてＴ１３５の後に挿入された含グルタミンタグは、ＬＬＱＧ（配列番号２）である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣ用の含グルタミンタグは、アミノ酸配列ＸＸＱＸ（配列番号３７）［Ｘは、本明細書に記載のとおりの在来または非在来アミノ酸でよい］を含む。たとえば、一部の実施形態では、Ｘは、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、またはＷ（Ｔｒｐ）である。
一部の実施形態では、含グルタミンタグは、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＡ（配列番号２４）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号３３）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号３４）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号３５）、およびＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、含グルタミンタグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号２４）、ＬＱＧ、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号３３）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号３４）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号３５）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、またはＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）を含む。
一部の実施形態では、含グルタミンタグは、ＬＧＧＱＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＱＧＧＬ（配列番号４２）、ＧＸＧＱＧＧＧ（配列番号４３）、ＧＧＸＱＧＧＧ（配列番号４４）、ＧＧＧＱＸＧＧ（配列番号４５）、およびＧＧＧＱＧＸＧ（配列番号４６）［Ｘは、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、またはＥである］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含まない。例示的な他のタグは、たとえば、ＵＳ２０１３／０２３０５４３およびＵＳ２０１３／０１２２０２０にも記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のとおりのＡＤＣの抗体は、同じ位置で野生型抗体と比較して、カルボキシル末端の最後のアミノ酸位におけるアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、この修飾は、アミノ酸欠失、挿入、置換、突然変異、またはこれらのいずれ任意の組合せである。一部の実施形態では、置換は、野生型アミノ酸を別のもの（たとえば、非野生型アミノ酸）と交換することを含む。一部の実施形態では、挿入は、１つまたは複数のアミノ酸を挿入（たとえば、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸を挿入）することを含む。一部の実施形態では、他の（たとえば、非野生型）または挿入アミノ酸は、Ａｒｇである。一部の実施形態では、他の（たとえば、非野生型）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである。たとえば、一部の実施形態では、抗体（たとえば、抗体の重鎖）のカルボキシル末端の最後のアミノ酸は、欠失している場合があり、ポリペプチドのＣ末端に対して操作された含グルタミンタグは、アミノ酸配列ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）またはＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）を含む。
一部の実施形態では、抗体は、同じ位置で野生型抗体と比較して、アミノ末端の最初のアミノ酸位におけるアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、この修飾は、アミノ酸欠失、挿入、置換、突然変異、またはこれら任意のいずれかの組合せである。一部の実施形態では、置換は、野生型アミノ酸を別のもの（たとえば、非野生型アミノ酸）と交換することを含む。一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸を挿入することを含む。一部の実施形態では、非野生型または挿入アミノ酸は、Ａｒｇである。一部の実施形態では、他の（非野生型または挿入）アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、全長抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧである。一部の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣの（たとえば、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑ結合によって測定される）エフェクター機能は、野生型抗体と比較して、約１、２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれか以下に低下する。一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体は、ＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１以下に低下する。他の実施形態では、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１に低下する。他の実施形態では、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約２分の１未満に低下する。一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体は、ＩｇＧであり、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１分の１以下に低下する。他の実施形態では、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して約１分の１に低下する。一部の実施形態では、ＩｇＧのエフェクター機能は、野生型ＩｇＧと比較して、約１、３分の１、４分の１、または５分の１のいずれか未満に低下する。
抗体にコンジュゲートすることのできる含アミン部分剤の数は、１）抗体に連結／挿入されている含グルタミンタグの数ならびに含グルタミンタグ上のグルタミンの数、および／または２）抗体上の内在グルタミン（すなわち、操作されていない未変性グルタミン、たとえば、可変ドメイン、ＣＤＲなどにあるグルタミン）の数、および／または３）本明細書に記載のとおりの抗体工学または改変トランスグルタミナーゼによって反応性にした内在グルタミンの数に応じて決まる。たとえば、２つの含アミン部分が、２本の軽鎖のカルボキシル末端において抗体に部位特異的にコンジュゲートされる場合もあれば、４つの含アミン部分が、Ｑ２９５およびＮ２９７Ｑ位において抗体に部位特異的にコンジュゲートされる場合もある。一部の実施形態では、含アミン部分は、各コンジュゲーション位置において、同じでも異なってもよい。
細胞傷害性薬剤の例としては、限定はしないが、アントラサイクリン、アウリスタチン（たとえば、ドレスタチン、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＦ−０６３８０１０１、ＰＦ−０６４６３３７７、およびＰＦ−０６４５６７８０）、スプリセオスタチン、ＣＢＩ／ＣＰＩ二量体（米国仮特許出願６１／９３２，１１８に記載のとおりの、ＣＢＩおよびＣＰＩ両方の成分を含む「混合型」二量体を含める）、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン、ヘミアステリン、カンプトテシン、コンブレタスタチン、ドラスタチン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン二量体、およびプラジエノリド、ならびにこれらの立体異性体、同配体、類似体、または誘導体が挙げられる。
アントラサイクリンは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌由来であり、白血病、リンパ腫、乳、子宮、卵巣、および肺がんなどの、広範ながんの治療に使用されている。例示的なアントラサイクリンとしては、限定はしないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわち、アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンが挙げられる。
ドラスタチン、ならびにそのペプチド類似体、および誘導体であるオーリスタチンは、抗がんおよび抗真菌活性を有することが示されている、非常に強力な有糸分裂阻害剤である。たとえば、米国特許第５，６６３，１４９号およびＰｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５、１９９８を参照されたい。例示的なドラスタチンおよびオーリスタチンとしては、限定はしないが、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、および（米国出願第２０１３／０１２９７５３号に記載のものなどの）他の新規なオーリスタチンが挙げられる。一部の実施形態では、オーリスタチンは、次の構造を有する、０１０１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。
Figure 2016050204
一部の実施形態では、オーリスタチンは、次の構造を有する、３３７７（Ｎ，２−ジメチルアラニル−Ｎ−｛（１Ｓ，２Ｒ）−４−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシル−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル｝−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。
Figure 2016050204
他の実施形態では、オーリスタチンは、次の構造を有する、０１３１（２−メチル−Ｌ−プロリ−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。
Figure 2016050204
他の実施形態では、オーリスタチンは、次の構造を有する、０１２１（２−メチル−Ｌ−プロリ−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である。
Figure 2016050204
カンプトテシンは、酵素のトポイソメラーゼＩを阻害する、細胞傷害性キノリンアルカロイドである。カンプトテシンおよびその誘導体の例としては、限定はしないが、トポテカンおよびイリノテカン、ならびにその代謝産物、たとえばＳＮ−３８が挙げられる。
コンブレタスタチンは、腫瘍において血管破壊特性を有する中性フェノールである。例示的なコンブレタスタチンおよびその誘導体としては、限定はしないが、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４）およびオンブラブリン（ｏｍｂｒａｂｕｌｉｎ）が挙げられる。
デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞傷害性効力を有するＤＮＡアルキル化剤である。ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：３６４２〜３６４９（１９９５）を参照されたい。例示的なドラスタチンおよびオーリスタチンとして、限定はしないが、（＋）−ドカルマイシンＡ（（＋）−ｄｏｃａｒｍｙｃｉｎＡ）、（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、および（＋）−ＣＣ−１０６５が挙げられる。
エンジインは、９員および１０員環または共役三重−二重−三重結合の環系の存在を特徴とする、一クラスの抗腫瘍細菌産物である。例示的なエンジインとしては、限定はしないが、カリチアマイシン、エスペラミシン、ウンシアラマイシン（ｕｎｃｉａｌａｍｉｃｉｎ）、ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、およびこれらの誘導体が挙げられる。
ヘミアステリンおよびその類似体（たとえば、ＨＴＩ−２８６）は、チューブリンに結合し、正常な微小管力学を崩壊させ、化学量論量で、微小管を解重合する。
ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合するベンゾキノンアンサマイシン抗生物質であり、抗腫瘍薬物として使用されている。例示的なゲルダナマイシンとしては、限定はしないが、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が挙げられる。
メイタンシンまたはその誘導体であるメイタンシノイドは、チューブリンの重合を阻害して有糸分裂の際の微小管生成を阻害することにより、細胞増殖を抑制する。Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜１００５（１９７５）を参照されたい。例示的なメイタンシンおよびメイタンシノイドとしては、限定はしないが、メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＤＭ１）およびその誘導体、ならびにアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）が挙げられる。
ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）およびインドリノ−ベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）は、二重鎖のＤＮＡに結合する、１つまたは複数のイミン官能基を含んでいる抗腫瘍剤またはその同等物である。ＰＢＤおよびＩＧＮ分子は、天然産物アトラマイシンを主体とし、プリン−グアニン−プリン配列を選んで、配列選択的に、ＤＮＡと相互作用する。例示的なＰＢＤおよびその類似体として、限定はしないが、ＳＪＧ−１３６が挙げられる。
スプリセオスタチンおよびプラジエノライドは、スプライシングを阻害し、スプライセオソームＳＦ３ｂと相互作用する抗腫瘍化合物である。スプリセオスタチンの例としては、限定はしないが、スプリセオスタチンＡ、ＦＲ９０１４６４が挙げられる。プラジエノライドの例としては、限定はしないが、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤ、およびＥ７１０７が挙げられる。
タキサンは、抗チューブリン剤または有糸分裂阻害剤として作用するジテルペンである。例示的なタキサンとしては、限定はしないが、パクリタキセル（たとえば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が挙げられる。
ビンカアルカロイドも、抗チューブリン剤である。例示的なビンカアルカロイドとしては、限定はしないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
一部の実施形態では、薬剤部分は、毒素ポリペプチド（または毒素タンパク質）である。毒素ポリペプチドの例としては、限定はしないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、アリューリ・フォルディー（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、トリコテセン、インヒビターシスチンノット（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ）（ＩＣＫ）ペプチド（たとえば、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ））、およびコノトキシン（たとえば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）が挙げられる。
ＡＤＣをコンジュゲートする方法
抗Ｔｒｏｐ２抗体の本発明のリンカー−ペイロードとのコンジュゲーションは、抗体の量を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．５を含有する緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬに調整することにより実施する。抗体の５〜５０倍または５〜５００倍モル過剰の量のリンカー−ペイロードを添加し、２％（ｗ／ｖ）の細菌トランスグルタミナーゼ（味の素アクティバＴＩ、日本国）を添加して酵素反応を開始し、穏やかに振盪しながら３７℃で１６〜２４時間インキュベートする。ＡＤＣは、０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７（緩衝液Ａ）という緩衝液組成が得られるように反応混合物を調整することにより、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製する。材料をＢｕｔｙｌ ＨＰにかけ、５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、２０ＣＶへの線形勾配で、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７中に溶離させる。ＡＤＣを含有する画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して濃縮し、０．２μフィルターで滅菌濾過する。別法として、ＡＤＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準プロトコールに従いながら使用して精製し、緩衝液をＰＢＳに交換する。ＷＯ２０１２／０５９８８２に記載の方法を含めて、ＡＤＣをコンジュゲートする他の方法が知られている。
本発明の抗体薬物コンジュゲートの使用方法
本発明のＡＤＣは、限定はしないが、治療処置方法および診断処置方法を始めとする、種々の用途において有用である。
一態様において、本発明は、対象におけるがんの治療方法を提供する。したがって、一部の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんの治療方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを含む有効量の組成物（たとえば、医薬組成物）を投与することを含む治療方法が提供される。本明細書で使用するとき、がんは、限定はしないが、固形がん（膀胱、乳、子宮頸部、絨毛癌、結腸、食道、胃、膠芽腫、頭頸部、腎臓、肝臓、肺（たとえば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、および皮膚がんなど）、および液状がん（ｌｉｑｕｉｄ ｃａｎｃｅｒ）（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫など）を包含する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍の成長または進行を抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを含む有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。他の実施形態では、それを必要とする対象において、がん細胞または腫瘍（たとえば、固形または液状腫瘍）の転移を抑制する方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを含む有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。他の実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍退縮を誘発する方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを含む有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。
本明細書に記載のとおりのＡＤＣ中の薬剤部分は、画像処理剤や酵素−基質標識などの検出可能な部分にすることができる。本明細書に記載のとおりのＡＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏ撮像（たとえば、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ）などのｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイに、または染色試薬にも使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、付加的な形の療法で対象を治療するステップをさらに含む。一部の実施形態では、付加的な形の療法は、限定はしないが、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、および／または追加免疫療法を始めとする、付加的な抗がん療法である。
一部の実施形態では、付加的な形の療法は、本明細書に記載のとおりのＡＤＣに加えて、１種または複数の治療剤の投与を含む。その治療剤としては、限定はしないが、第２のＡＤＣ（たとえば、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））やａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））などの従来のＡＤＣ、抗体（たとえば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２５抗体、および／または抗ＣＤ２０抗体）、血管新生阻害剤、細胞傷害性薬剤（たとえば、ドセタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、マイトマイシン、タモキシフェン、またはフルオロウラシル）、および抗炎症剤（たとえば、プレドニゾンおよびプロゲステロン）が挙げられる。
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載のとおりのＡＤＣを薬学的に許容できる賦形剤または担体中に含む医薬組成物を提供する。ＡＤＣは、単独で、または本発明の他の１種または複数のＡＤＣと組み合わせて、もしくは他の１種または複数の薬物と組み合わせて（またはこれらの任意の組合せとして）、投与することができる。たとえば、本発明のＡＤＣは、従来の（すなわち、安定性調節の特色をもたせて設計されていない）ＡＤＣと組み合わせて投与することができる。したがって、本発明の方法および使用は、以下で詳述するとおりの、他の活性薬剤との組合せ（共投与）の実施形態も包含する。
本明細書で使用するとき、用語「共投与」、「共投与された」、または「と組み合わせて」とは、（ｉ）治療を必要とする患者への、本明細書で開示するＡＤＣと治療剤の組合せの同時投与（このとき、こうした構成要素は、前記構成要素を前記患者に対して実質的に同時に放出する単一剤形に一緒に製剤される）、（ｉｉ）治療を必要とする患者への、本明細書で開示するＡＤＣと治療剤のこうした組合せの実質的同時投与（このとき、こうした構成要素は、前記患者によって実質的に同時に服用される別個の剤形に、互いに離れて製剤され、その結果、前記構成要素は、前記患者に対して実質的に同時に放出される）、（ｉｉｉ）治療を必要とする患者への、本明細書で開示するＡＤＣと治療剤のこのような組合せの順次投与（このとき、こうした構成要素は、前記患者によって各投与間にかなりの時間間隔を置いた連続した時期に服用される別個の剤形に、互いから離れて製剤され、その結果、前記構成要素は、前記患者に対して、実質的に異なる時期に放出される）、および（ｉｖ）治療を必要とする患者への、本明細書で開示するＡＤＣと治療剤のこうした組合せの順次投与（このとき、こうした構成要素は、前記構成要素を制御された用量で放出する単一剤形に一緒に製剤され、その結果、これら構成要素は、前記患者に対して、同時および／または異なる時期に、並行して、連続して、および／または一部重複して放出される）を意味し、またはこれらのことを指すものとし、各パートは、同じ経路または異なる経路のどちらによって投与してもよい。
一般に、本明細書で開示するＡＤＣは、製剤として、薬学的に許容できる１種または複数の賦形剤と共同して投与するのに適する。用語「賦形剤」は、本明細書では、本発明の化合物以外の任意の成分を述べるのに使用する。賦形剤の選択は、特定の投与方式、賦形剤が溶解性および安定性に及ぼす影響、剤形の性質などの要因によるところが大きい。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容できる賦形剤」は、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）などを包含する。薬学的に許容できる賦形剤の一部の例は、水、食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せである。一部の実施形態では、限定はしないが、糖、多価アルコール（たとえば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウムを始めとする等張剤を、医薬組成物中に含める。薬の学的に許容できる物質の追加の例として、限定はしないが、抗体の保存性（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）または有効性を高める、湿潤剤、または少量の補助物質、たとえば、湿潤もしくは乳化剤、保存剤、緩衝剤が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、たとえばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載のものなどの既知の技術を使用して、対象に投与されると免疫原性が低下するように脱免疫化される（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）場合がある。
本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者には容易に明らかとなる。このような組成物およびその調製方法は、たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２２版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１２）で見ることができる。医薬組成物は、製造管理および品質管理に関する基準の条件下で製造することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、まとめて、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として、調製、包装、または販売することができる。本明細書で使用するとき、「単位用量」とは、所定の量の活性成分を含む、医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与されることになる活性成分の投薬量、または、たとえば、そのような投薬量の２分の１や３分の１などの、そのような投薬量の好都合な分数に等しい。ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するための、当技術分野で受け入れられているいかなる方法も、本明細書で開示する改変ポリペプチドコンジュゲートに適切に用いることができる。
本発明の医薬組成物は通常、非経口投与に適する。医薬組成物の非経口投与には、対象の組織を物理的に突破し、組織における突破口を介して医薬組成物が投与され、したがって、一般に、血流中、筋肉中、または内臓に直接投与される結果となることを特徴とする、任意の投与経路が含まれる。たとえば、非経口投与としては、限定はしないが、組成物の注射、外科的切開を経た組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を介した組成物の適用などによる医薬組成物の投与が挙げられる。詳細には、非経口投与には、限定はしないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、滑液包内の注射または注入、および腎臓透析注入技術が含まれるものと考える。一部の実施形態では、非経口投与は、静脈内または皮下経路である。
非経口投与に適する医薬組成物の製剤は、通常、滅菌水や等張性滅菌食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性成分を一般に含む。このような製剤は、ボーラス投与または継続的投与に適する形で、調製、包装、または販売することができる。注射用製剤は、アンプルや、保存剤を含有する多用量容器などの、単位剤形で調製、包装、または販売することができる。非経口投与用の製剤には、限定はしないが、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、乳濁液、泥膏などが含まれる。このような製剤は、限定はしないが、懸濁化剤、安定剤、または分散剤を始めとする、１種または複数の追加成分をさらに含んでよい。非経口投与用製剤の一実施形態では、活性成分は、適切なビヒクル（たとえば、発熱物質なしの滅菌水）で再構成してから、再構成された組成物を非経口投与するための、乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。非経口製剤には、塩、炭水化物、（好ましくは３〜９のｐＨにする）緩衝剤などの賦形剤を含有してよい水溶液も含まれるが、非経口製剤は、同じ用途について、非水性滅菌溶液として、または発熱物質なしの滅菌水などの適切なビヒクルと共に使用される乾燥形態として、より適切に製剤することができる。例示的な非経口投与形態としては、滅菌水溶液、たとえば、プロピレングリコールまたはデキストロース水溶液中の溶液または懸濁液が挙げられる。このような剤形は、所望であれば、適切に緩衝剤処理してもよい。非経口投与可能な他の有用な製剤として、活性成分を、微結晶の形で、またはリポソーム調製物中に含むものが挙げられる。非経口投与用の製剤は、即時型および／または変更型の放出がなされるように製剤することもできる。変更型放出製剤には、制御、遅延、持続、パルス、標的化、およびプログラム放出製剤が含まれる。たとえば、一態様において、注射用滅菌溶液は、改変含Ｆｃポリペプチド、たとえば、抗体薬物コンジュゲートまたは二重特異性抗体を、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に必要な量で混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。一般には、基礎分散媒と、上で列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に、活性化合物を混ぜることにより、分散液を調製する。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分と所望の任意の追加成分からなる粉末が得られる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって保つことができる。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることにより実現できる。
投薬計画は、所望の最適な応答が得られるように調整することができる。たとえば、単一のボーラスを投与してもよいし、分割されたいくつかの用量を、時間をかけて投与してもよいし、または治療状況の緊急性に合わせて用量を増減してもよい。非経口組成物を投薬量単位形態で製剤することは、投与しやすく、投薬量が一律になるので、特に有利である。本明細書で使用する、投薬量単位形態とは、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を各単位が含有する、治療を受ける患者／対象への単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す。本発明の投薬量単位形態の仕様は、一般に、（ａ）薬剤部分（たとえば、細胞傷害性薬剤などの低分子）および実現される特定の治療または予防効果の独特な特性、および（ｂ）このような活性化合物を配合して個体の感受性を治療する分野に固有の制約によって必然的に決まり、これらに直接左右される。
したがって、本明細書でなされる開示に基づき、用量および投与計画を、当治療分野でよく知られている方法に従って調整することは、当業者に正当に認識されることになる。すなわち、最大耐用量は、容易に打ち立てることができ、患者に検出可能な治療利益をもたらす有効量も求めることができ、各薬剤を投与して患者に検出可能な治療利益をもたらす時間要件を求めることもできる。したがって、ある特定の用量および投与計画を本明細書で例示するが、そうした例は、本発明を実践する際に患者に提供することのできる用量および投与計画を一切限定しない。
投薬量の値は、緩和しようとする状態のタイプおよび重症度によって様々となる場合があり、単回または複数回の用量を含む場合があることを留意されたい。任意の特定の対象について、詳細な投薬計画は、個々の要求、および組成物の投与を管理監督する者の専門的な判断に従って時間と共に調整すべきであること、ならびに本明細書で示す投薬量範囲は、例示的なものにすぎず、請求項に係る組成物の範囲または実用を限定するものでないことをさらに理解されたい。さらに、本発明の組成物を用いた投薬計画は、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および用いる特定の抗体を含めた様々な要因に基づくものでよい。すなわち、投薬計画は、幅広く変化しうるが、標準の方法を使用して型通りに決めることができる。たとえば、用量は、薬動学的または薬力学的パラメータに基づき調整することができ、パラメータには、毒作用などの臨床作用および／または臨床検査値を含めることができる。したがって、本発明は、当業者によって決められたとおりの患者内での用量漸増を包含する。適切な投薬量および計画の決定は、関連分野でよく知られており、本明細書で開示する教示が一度提供されれば当業者によって実現されると理解される。
ヒト対象への投与について、本明細書で開示するＡＤＣの合計１か月用量は、通常、当然のことながら投与方式に応じて、患者１人あたり約０．０１ｍｇ〜約１２００ｍｇの範囲にある。たとえば、静脈内の１か月用量には、約１〜約１０００ｍｇ／患者が必要となる場合がある。合計１か月用量は、単回または分割用量で投与することができ、医師の裁量で、本明細書で示す典型的範囲の範囲外になることもある。
本明細書で開示するとおりのＡＤＣの治療または予防有効量の、例示的な非限定的な範囲は、約０．０１〜約１０００ｍｇ／患者／月である。ある特定の実施形態では、ＡＤＣは、約１〜約２００または約１〜約１５０ｍｇ／患者／月で投与してよい。一部の実施形態では、患者はヒトである。
キット
本発明はまた、上述の障害の治療において使用するキット（または製造品）を提供する。本発明のキットは、精製されたＡＤＣを含む１つまたは複数の容器と、コンジュゲートを疾患の治療に使用することについての使用説明書とを包含する。たとえば、使用説明書は、がん（たとえば、固形または液状がん）などの疾患を治療するためのＡＤＣの投与についての記載を含む。キットは、その個体が疾患を有するかどうか、および疾患の段階を特定することに基づき、治療に適する個体を選択することについての記載をさらに含んでもよい。
ＡＤＣの使用に関する使用説明書は、一般に、目的の治療に関する投薬量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（たとえば、多用量包装）、または小単位用量でよい。本発明のキットの中に支給される使用説明書は、通常、ラベルまたは包装品挿入物（たとえば、キットに含められた紙シート）上での書面による使用説明書であるが、機械で読み取り可能な使用説明書（たとえば、磁気または光学保存ディスクに収容された使用説明書）も許容される。
本発明のキットは、適切に包装されている。適切な包装としては、限定はしないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（たとえば、シールされたＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。特殊な装置、たとえば、吸入器、経鼻投与装置（たとえば、アトマイザー）、ミニポンプなどの注入装置と組み合わせて使用する包装も企図される。キットは、滅菌された接続口を有することがある（たとえば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルでよい）。容器が、滅菌された接続口を有する場合もある（たとえば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルでよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、より高装入量の本明細書に記載のとおりのＡＤＣである。容器は、薬学的に活性のある第２の薬剤をさらに含んでもよい。
キットは、緩衝材や説明的な情報などの追加構成要素を場合により備えてもよい。通常、キットは、容器と、容器に接触または付随したラベルまたは包装品挿入物とを含む。
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示目的のものにすぎず、またそれを踏まえた種々の変更または変化は、当業者に示唆されるところとなり、本出願の真意および範囲の内に含まれると理解される。
分析に使用したＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ条件：
分析ＨＰＬＣ条件：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）、１５０×３．０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：８．５分かけて０％〜１００％のＢ、次いで１．５分間１００％のＢ；流量：１．５ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：１０μＬ；計器：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ ＨＰＬＣ。
分析ＬＣ−ＭＳ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ；移動相Ａ：０．１％のギ酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．１％のギ酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：０．１分かけて５％のＢ、２．５分かけて５％〜９５％のＢ、０．３５分かけて９５％のＢ；流量：１．２５ｍＬ／分。温度：６０℃；検出：２００〜４５０ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲 １００〜２０００ダルトン；注入体積：５μＬ；計器：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ。
精製に使用した分取ＨＰＬＣ条件：
方法Ａ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて５％〜５０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｂ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２０％〜８０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｃ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて５％〜７０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｄ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて１０％〜７０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｅ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて３０％〜８５％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｆ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて１０％〜９０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｇ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて１０％〜９５％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｈ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２５％〜６５％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｉ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ Ｃ１８、２５０×５０ｍｍ、１０ｕｍカラム；移動相Ａ：０．２％のギ酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル；勾配：２５分で３３．０％〜５８％のＢ、次いで、２分で１００％のＢに上昇、５分間保持；流量：８０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２２０ｎｍ。
方法Ｊ：ＤＩＫＭＡ Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ（２）Ｃ１８、２００×２０ｍｍ、５ｕｍカラム；移動相Ａ：０．２２５％のギ酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル；勾配：１１分かけて５３％〜７３％のＢ、次いで、０．５分で１００％のＢに上昇、２分間保持；流量：３５ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２２０ｎｍ。
方法Ｋ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２０％〜９０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｌ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて１０％〜８０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｍ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１５０×２１．２ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％の酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％の酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：８．５分かけて１％〜１００％のＢ、次いで、２分にわたり１００％のＢで保持；流量：２７ｍＬ／分。温度：２５℃；検出：ＤＡＤ ２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲 １５０〜２０００ダルトン；注入体積：５ｍＬまで。計器：３０５ ＲＰ Ｗａｔｅｒｓ ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ＬＣＭＳ。
方法Ｎ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて５０％〜１００％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｏ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１５０×２１．２ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％の酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％の酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：８．５分かけて３５％〜５０％のＢ、次いで、２分にわたり１００％のＢで保持；流量：２７ｍＬ／分。温度：２５℃；検出：ＤＡＤ ２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲 １５０〜２０００ダルトン；注入体積：５ｍＬまで。計器：３０５ ＲＰ Ｗａｔｅｒｓ ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ＬＣＭＳ。
方法Ｐ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２５％〜１００％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｑ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２０％〜１００％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｒ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１５０×２１．２ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％の酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％の酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：８．５分かけて３５％〜５０％のＢ、次いで、２分にわたり１００％のＢで保持；流量：２７ｍＬ／分。温度：２５℃；検出：ＤＡＤ ２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲 １５０〜２０００ダルトン；注入体積：５ｍＬまで。計器：３０５ ＲＰ Ｗａｔｅｒｓ ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ＬＣＭＳ。
方法Ｓ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、５μｍカラム；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分かけて２０％〜９０％のＢ；流量：２０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。計器：Ｇｉｌｓｏｎ２１５。
方法Ｔ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ Ｃ１８、２５０×５０ｍｍ、１０ｕｍカラム；移動相Ａ：０．２％のギ酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル；勾配：３０分で３５．０％〜６５％のＢ、次いで、２分で１００％のＢに上昇、５分間保持；流量：３０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２２０ｎｍ。
方法Ｕ：Ｉｓｃｏ ＭＰＬＣ、ＲｅｄｉＳｅｐ ４３ｇ Ｃ１８カラムＧｏｌｄ；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分で２０〜１００％のＢ；流量：４０ｍｌ／分；温度：制御せず；ＤＡＤ ２１４、２５４ｎｍ。
方法Ｖ：Ｉｓｃｏ ＭＰＬＣ、ＲｅｄｉＳｅｐ ４３ｇ Ｃ１８カラムＧｏｌｄ；移動相Ａ：０．０２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．０２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２０分で１０〜８０％のＢ；流量：４０ｍｌ／分；温度：制御せず；ＤＡＤ ２１４、２５４ｎｍ。
方法Ｗ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍカラム；移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：３０分かけて２４％〜５４％のＢ；流量：３０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。
方法Ｘ：Ｌｕｎａ Ｃ１８ １５０×２５、５μｍカラム；移動相Ａ：０．２％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．２％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：１１分かけて３０％〜５０％のＢ；流量：３５ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。
方法Ｙ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ ２５０×５０ｍｍ、１００×３０ｍｍ、１０μｍカラム；移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２２分かけて３０％〜６０％のＢ；流量：８０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。
方法Ｚ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ ２５０×５０ｍｍ、１０μｍカラム；移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：２１．５分かけて３０％〜６０％のＢ；流量：８０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２１０、２５４ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。
方法ＡＡ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ ２５０×８０、１０μｍカラム；移動相Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸水溶液（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）；勾配：３０分かけて４０％〜７０％のＢ；流量：３０ｍＬ／分。温度：制御せず；検出：ＤＡＤ ２２０ｎｍ；注入体積：５ｍＬまで。
（実施例１）
Ｎ２−ベンゾイル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２）の合成。Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン（１００ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）およびＬ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、１０８ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１１１ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）に続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０１ｕｌ、１４９ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ａ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１２７ｍｇ（６３％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 712.4 [M+H+]; 710.4 [M-H+]；保持時間＝１．３０分。
ステップ２： Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（３）の合成。Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２、１２５ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を、炭酸ｐ−ニトロフェニル（１０７ｍｇ、０．３５２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０１ｕｌ、７３．４ｍｇ、０．７０４ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで濃縮してほぼ乾燥させ、５％〜２０％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、１２９ｍｇ（８３．６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 877.4 [M+H+]; 899.3 [M+Na+]；保持時間＝１．７３分。
ステップ３： Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、２０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（３、２８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（５．８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９ｕｌ、７ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、４．４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｂ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、３０ｍｇ（７５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1481.8 [M+H+]; 1478.8 [M-H+]；保持時間＝１．９１分。
ステップ４： Ｎ２−ベンゾイル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６）の合成。Ｎ２−ベンゾイル−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５、３０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、１０％のトリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液２．５ｍＬを添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２．２５時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｃ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２２ｍｇ（７４％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1381.7 [M+H+]；保持時間＝１．５４分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．００分。
（実施例２）
Ｎ２−（２，２−ジメチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１２）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（８）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（７、７６．７ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（４６．３ｍｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６７．７ｕｌ、５６．４ｍｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、１７．７ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、４５℃で１６時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、５％〜２０％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、９０ｍｇ（６７％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1248.7 [M+H+]；保持時間＝１．８４分。
ステップ２： Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（９）の合成。Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（８、９１ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、２０％のトリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液２ｍＬを添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２．７５時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮して、９１ｍｇ（１００％）の所望の生成物を得、それを精製せずに次のステップでそのまま使用した。LC-MS m/z 1148.7 [M+H+]；保持時間＝１．４３分。
ステップ３： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１０）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン（５０．６ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４１．６ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）に続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５１ｕｌ、３７．６ｍｇ、．２８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（９、９１ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２時間撹拌した後、ジエチルアミン（２ｍｌ、１．４１ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応液を１６時間撹拌し、次いで、トリフルオロ酢酸を添加して酸性化し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｄ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、９９ｍｇ（９２％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1376.8 [M+H+]; 1374.8 [M-H+]；保持時間＝１．４０分。
ステップ４： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（２，２−ジメチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１１）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドトリフルオロ酢酸塩（１０、２１．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）およびピバル酸無水物（５．６ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２６ｕｌ、１９．４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｅ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２１．９ｍｇ（１００％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1460.7 [M+H+]; 1458.5 [M-H+]；保持時間＝１．９３分。
ステップ５： Ｎ２−（２，２−ジメチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１２）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（２，２−ジメチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１１、２１．９ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、０．３３ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｆ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、８ｍｇ（３６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1360.7 [M+H+]；保持時間＝１．４５分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．０１分。
（実施例３）
Ｎ２−（フェニルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１４）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１３）の合成。フェニル酢酸（１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４３．１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）に続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０ｕｌ、１４．５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４５分間撹拌した。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドトリフルオロ酢酸塩（１０、２０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を次いで添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１０ｍｇ（５２％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1495.3 [M+H+]; 1493.1 [M-H+]；保持時間＝１．９３分。
ステップ２： Ｎ２−（フェニルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１４）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１３、１０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、２０％のトリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液１ｍＬを添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１０ｍｇ（１００％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1394.7 [M+H+]；保持時間＝１．５２分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．３９分。
（実施例４）
Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１６）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１５）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドトリフルオロ酢酸塩（１０、２０．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）および１Ｈ−イミダゾール−５−カルボン酸（１５．７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５ｕｌ、１８．３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で５分間撹拌した。Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、５４．３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１３ｍｇ（５９％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1471.6 [M+H+]; 1469.0 [M-H+]；保持時間＝１．７０分。
ステップ２： Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１６）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１５、１３ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、２０％のトリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液２ｍＬを添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１５分間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｄ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、６ｍｇ（５０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1370.7 [M+H+]; 1368.6 [M-H+]；保持時間＝１．３９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．３０分。
（実施例５）
Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１８）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１７）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドトリフルオロ酢酸塩（１０、２０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）および２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）酢酸（３０．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２３ｕｌ、１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で５分間撹拌した。Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、５０．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温でさらに１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１３．６ｍｇ（６５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1485.6 [M+H+]; 1483.5 [M-H+]；保持時間＝１．４４分。
ステップ２： Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１８）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イルアセチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１７、１３．６ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、２０％のトリフルオロ酢酸ジクロロメタン溶液２ｍＬを添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１５分間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｄ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１３ｍｇ（９６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1384.9 [M+H+]; 1382.8 [M-H+]；保持時間＝１．２６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．２１分。
（実施例６）
Ｎ２−（３−メチルブタノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（１９）の調製
Figure 2016050204
 ３−メチルブタン酸（１０．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を０．４ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３５ｕｌ、２６．１ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、７７．６ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）で処理し、混合物を室温で５分間撹拌した。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドトリフルオロ酢酸塩（１０、３０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を０．４ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮してほぼ乾燥させ、次いで、２ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸で処理した。室温でさらに３０分間撹拌した後、反応液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｈ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１３ｍｇ（４４％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1360.8 [M+H+]; 1358.4[M-H+]；保持時間＝１．４９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．９８分。
（実施例７）
Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２５）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２０）の合成。Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、６．５ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）およびＮ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン（８．０３ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）を２００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３２ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、７．８ｇ、２０．５６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで濃縮し、５％〜１７％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカクロマトグラフィーによって精製して、４．００ｇ（２８．２％）の所望の生成物を白色の固体として得た。
ステップ２： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２１）の合成。Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２０、４．８ｇ、５．７８ｍｍｏｌ）を９６ｍＬの４Ｍ塩酸水溶液に混ぜた混合物を、室温で１２時間撹拌した。飽和Ｋ２ＣＯ３水溶液をゆっくりと添加して、反応混合物をｐＨ７．５に調整し、次いで、得られる懸濁液を濾過した。固体を収集し、真空乾燥させて、４．００ｇ（９４．９％）の所望の生成物を黄色の固体として得た。
ステップ３： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２２）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２１、５００ｍｇ、０．６８５ｍｍｏｌ）および１−［（２−メチルプロパノイル）オキシ］ピロリジン−２，５−ジオン（１９０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２１ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌した後、混合物を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｉ）によって精製して、１００ｍｇ（１８．２％）の所望の生成物を白色の固体として得た。
ステップ４： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２３）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２２、１００ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（４２ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｊ）によって精製して、１１０ｍｇ（９１．７％）の所望の生成物を白色の固体として得た。C５０H６０N８O１２についてのHRMS m/z: 987.4036 (M+Na)+。1H NMR (400 MHz,
DMSO): δ 10.12 (s, 1H), 8.30 (m, 2H), 8.18 (m, 1H),
7.88 (m, 3H), 7.64 (m, 6H), 7.27 (m, 6H), 6.00 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.23 (s,
2H), 4.21 (m, 6H), 2.95 (m, 5H), 1.99 (m, 1H), 1.24 (m, 12H), 0.99 (d, 6H),
0.85 (d, 6H);
ステップ４： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２４）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、２７．５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）およびＮ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２３、３６．７ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（１３．７ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２３ｕｌ、１６．７ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、５．２ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｋ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、３０ｍｇ（６０％）の所望の生成物を得た。
ステップ５： Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２５）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（２−メチルプロパノイル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２４、３０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液を、１ｍＬのジエチルアミンで処理した。溶液を室温で５時間撹拌し、次いで濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｋ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、６．０ｍｇ（２１％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1346.9 [M+H+]；保持時間＝１．４７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８７分。
実施例８〜１８および４９〜７１についての手順：部位特異的抗Ｔｒｏｐ２ＡＤＣのコンジュゲーション、精製
抗Ｔｒｏｐ２抗体の、実施例１から７のリンカー−ペイロード（ＬＰ）とのコンジュゲーションについては、示された量の抗体を、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〜８．５を含有する緩衝液中５ｍｇ／ｍＬになるように調整した。示された量のＬＰを、抗体の５〜５０倍モル過剰で添加し、２％（ｗ／ｖ）の細菌トランスグルタミナーゼ（味の素アクティバＴＩ、日本国）を添加して酵素反応を開始し、穏やかに振盪しながら３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。ＡＤＣは、０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７（緩衝液Ａ）という緩衝液組成が得られるように反応混合物を調整することにより、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｂｕｔｙｌ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。材料をＢｕｔｙｌ ＨＰにかけ、５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、２０ＣＶの線形勾配で、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７中に溶離させた。ＡＤＣを含有する画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して濃縮し、０．２μフィルターで滅菌濾過した。別法として、ＡＤＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準プロトコールに従いながら使用して精製し、緩衝液をＰＢＳに交換した。
次のＡＤＣ（表２から７において示すとおり、種々の位置において、Ｔｒｏｐ２抗体上の種々のタグ上で結合している）は、上述の技術を使用して作製した（括弧でくくられた部分は、グルタミン残基を示し、波線は、抗Ｔｒｏｐ２抗体の残部への結合点を示す）。
（比較例８）
Ｃ６ｖｃＭＭＡＤ：
Figure 2016050204
（比較例９）
ＡｃＬｙｓ−ｖｃＭＭＡＤ：
Figure 2016050204
（比較例１０）
Ｃ６ｖｃ０１０１：
Figure 2016050204
（比較例１１）
ＡｃＬｙｓ−ｖｃ０１０１：
Figure 2016050204
（実施例１２）
Figure 2016050204
（実施例１３）
Figure 2016050204
（実施例１４）
Figure 2016050204
（実施例１５）
Figure 2016050204
（実施例１６）
Figure 2016050204
（実施例１７）
Figure 2016050204
（実施例１８）
Figure 2016050204
（実施例１９）
ｉｎ ｖｉｖｏ安定性アッセイ−マウス
ＡＤＣを９ｍｇ／ｋｇで単回投与した後、１〜１０日の範囲にわたる時点で、マウスから血漿試料を取得した。試料を等体積の１×ＰＢＳで希釈し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔビーズ、または標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＴｒｏｐ２抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。薬物抗体比は、ＨＩＣ法および質量分析を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ被作用の前後に評価した。
（実施例２０）
ｉｎ ｖｉｖｏ安定性アッセイ−ラット
ＡＤＣを９ｍｇ／ｋｇで単回投与した後、１〜１０日の範囲にわたる時点で、ラットから血漿試料を取得した。試料を等体積の１×ＰＢＳで希釈し、標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＴｒｏｐ２抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。薬物抗体比は、ＨＩＣ法および質量分析を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ被作用の前後に評価した。
（実施例２１Ａ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイ−マウス血漿
１００〜２００ｕｇのＡＤＣを、１×ＰＢＳで補充して最終ＡＤＣ濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬとした（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎより提供された）マウス血漿中でインキュベートした。３〜７日間のインキュベートに続いて、試料を等体積の１×ＰＢＳで希釈し、標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＴｒｏｐ２抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。薬物抗体比は、ＨＩＣ法および質量分析を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ被作用の前後に評価した。
（実施例２１Ｂ）
リンカー切断を担うマウス血漿酵素の特定
そのマウス血漿酵素を分類するために、種々のプロテアーゼ阻害剤の存在下、抗Ｔｒｏｐ２Ｌ１１Ｂ Ｃ６ ｖｃ０１０１コンジュゲートを基質として使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイを実施した。結果から、そのマウス血漿酵素は、おそらく、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ）および１００ｕＭのＢＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ）によって阻害されたセリンヒドロラーゼであることが示された。酵素を特定するために、本発明者らは、一連のステップを使用してＢａｌｂ／ｃマウス血清を分別することにより、抗Ｔｒｏｐ２Ｌ１１Ｂ Ｃ６ ｖｃ０１０１リンカー加水分解活性を強化した。最初に、市販品として入手可能なＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に続いて、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｂａｌｂ／ｃ血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）からＩｇＧおよびアルブミンを枯渇させた。次いで、枯渇させた血清を、硫酸アンモニウムを用いた連続沈殿にかけた。次いで、リンカーヒドロラーゼ活性の最も高い画分を、塩化ナトリウムを用いたステップ勾配溶離を使用する陽イオン交換ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。その後、活性の最も高いＳＰ画分を、塩化ナトリウムを用いたステップ勾配溶離を使用して、陰イオン交換ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。次いで、ヒドロラーゼ活性の最も高い画分を合わせ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ分けした。プールされた、活性の最も高いＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００画分のプロテオミクス分析によって、アミド結合を加水分解することができ、ＰｅｆａｂｌｏｃおよびＢＮＰＰによって阻害されうる、カルボキシルエステラーゼ１Ｃが明らかになった。マウスカルボキシルエステラーゼ１Ｃが、リンカー切断を担う血漿酵素であることが正確な同定であるかを検証するために、組換えタンパク質をＥｘｐｉ ２９３細胞中で発現させ、標準プロトコールに従いながらＨＩＳタグを使用して精製した。精製されたタンパク質は、ＶＣを主体とするリンカーを有するいくつものコンジュゲートを、マウス血漿について示されたのと同じ相対活量で切断することが確認された。
（実施例２２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイ−ラット血漿
１００〜２００ｕｇのＡＤＣを、１×ＰＢＳで補充して最終ＡＤＣ濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬとした（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎより提供された）ラット血漿中でインキュベートした。３〜７日間のインキュベートに続いて、試料を等体積の１×ＰＢＳで希釈し、標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＴｒｏｐ２抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。薬物抗体比は、ＨＩＣ法および質量分析を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ被作用の前後に評価した。
（実施例２３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイ−カニクイザル血漿
１００〜２００ｕｇのＡＤＣを、１×ＰＢＳで補充して最終ＡＤＣ濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬとした（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎより提供された）カニクイザル血漿中でインキュベートした。３〜７日間のインキュベートに続いて、試料を等体積の１×ＰＢＳで希釈し、標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＴｒｏｐ２抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。薬物抗体比は、ＨＩＣ法および質量分析を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ被作用の前後に評価した。
（実施例２４）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
図１（ＡからＩ）に示すとおり、アミノカプロイル（Ｃ６）ｖｃ Ａｕｒ０１０１細胞傷害性ペイロードと、様々な部位においてコンジュゲートされたキメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性研究を、標的を発現させるＢｘＰＣ３細胞で実施した。未処理化合物（実線）と、マウス血漿中で４．５日処理した後に単離されたその代謝産物（破線）とを、比較試験して、細胞傷害性の変化を明らかにした。ＢｘＰｃ３は、標的発現レベルの高い（Ｔｒｏｐ−２＋＋＋）がん細胞系である。細胞は、処理前に、壁面が白色の透明底プレートにウェルあたり２０００細胞で、２４時間播いておいた。細胞を、４倍段階希釈した抗体薬物コンジュゲートで三通りに処理した。処理してから９６時間後に、細胞生存度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）によって測定した。相対的な細胞生存度を未処理対照に対する百分率として求めた。
また、図１（ＪからＯ）に示すとおり、３種のリンカーペイロード（実施例２、３および５のリンカーペイロード）の１種と、ＬＣＱ０４またはＬ１１Ｂ部位においてコンジュゲートされたキメラ抗Ｔｒｏｐ２抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性研究も、標的を発現させるＢｘＰＣ３細胞で実施した。未処理化合物（実線）と、マウス血漿中で４．５日処理した後に単離されたその代謝産物（破線）とを、比較試験して、細胞傷害性の変化を明らかにした。ＢｘＰｃ３は、標的発現レベルの高い（Ｔｒｏｐ−２＋＋＋）がん細胞系である。細胞は、処理前に、壁面が白色の透明底プレートにウェルあたり２０００細胞で、２４時間播いておいた。細胞を、４倍段階希釈した抗体薬物コンジュゲートで三通りに処理した。処理してから９６時間後に、細胞生存度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）によって測定した。相対的な細胞生存度を未処理対照に対する百分率として求めた。
（実施例２５）
Ｎ２−（ヒドロキシアセチル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３０）の調製
Figure 2016050204
ステップ１： Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２６）の合成。Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２０、９９８ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（７４８ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ））を７ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび７ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４５２ｕＬ ０．３２８ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。残渣を酢酸エチルおよびジエチルエーテルで希釈し、得られるスラリーを３０分間撹拌した。固体を濾過によって単離し、エーテルで数回洗浄して、風乾した後、所望の生成物を黄色の固体（１３１９ｍｇ）として得、これをそれ以上精製せずにそのままで使用した。LC-MS m/z 995.5 [M+H+]；保持時間＝１．０２分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．１８１分。
ステップ２： Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２７）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、３７１ｍｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）およびＮ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（２６、８０２ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（２１６ｕＬ、２００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３２６ｕＬ、２４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、１７．７ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、５０℃で９０分間、次いで室温で１６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相クロマトグラフィー（方法Ｕ）によって精製して、凍結乾燥後に、３３９ｍｇ（４２％、２ステップ）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1599.9 [M+H+]；保持時間＝１．０９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．１６３分。
ステップ３： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８）の合成。Ｎ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２７、４３９ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた懸濁液に、１ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２０分間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、４１０ｍｇ（９６％）を得た。LC-MS m/z 1499.8 [M+H+]；保持時間＝０．８６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．７７８分。
ステップ４： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（ヒドロキシアセチル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２９）の合成。ヒドロキシ酢酸（１４．７ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）を０．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ、７．９９ｍｇ、０．０４１７ｍｍｏｌ）、エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート（オキシマ、２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（４０ｕＬ、３７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた黄色の溶液を２０分間撹拌し、次いで、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１時間撹拌し、次いで濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｆ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、凍結乾燥後に、１２．２ｍｇ（２４％）を得た。LC-MS m/z 1557.8 [M+H+]；保持時間＝０．９８分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．３７１分。
ステップ５： Ｎ２−（ヒドロキシアセチル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３０）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（ヒドロキシアセチル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２９、１２．２ｍｇ、０．００７８４ｍｍｏｌ）を０．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、ピペリジン（０．１ｍＬ、９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｅ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、８ｍｇ（７０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1334.8 [M+H+]；保持時間＝０．７６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７８８分。
（実施例２６）
Ｎ２−（メチルカルバモイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３３）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキサミド（３１）の合成。１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．７６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）とメチルアミン塩酸塩（６６１ｍｇ、９．７ｍｍｏｌ）の混合物を、１．８ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび５．５ｍＬのアセトニトリルに溶解させた。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で３．２５時間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、０％〜１０％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、６９６ｍｇ（５７％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 126.0 [M+H+]；保持時間＝０．１７分。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.22 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 2.83 (d, J=4.3 Hz, 3H).
ステップ２： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（メチルカルバモイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３２）の合成。Ｎ−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−カルボキサミド（４０．１ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ）およびＮ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに混ぜた混合物に、トリエチルアミン（４４．７ｕＬ、３２．５ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１．５時間撹拌し、次いでジメチルスルホキシドで希釈し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製して、凍結乾燥後に、８．８ｍｇ（１８％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1556.8 [M+H+]；保持時間＝０．９９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．５２１分。
ステップ３： Ｎ２−（メチルカルバモイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３３）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−（メチルカルバモイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３２、８．８ｍｇ、０．００５７ｍｍｏｌ）を０．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、ピペリジン（０．１ｍＬ、９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１．５時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｅ、次いでＭ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、４．６ｍｇ（５８％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1333.7 [M+H+]；保持時間＝０．７６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８２５分。
（実施例２７）
Ｎ−メチルグリシル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３４）の合成
Figure 2016050204
 ２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ−メチルグリシネート（１１．９ｍｇ、０．０４１６ｍｍｏｌ）を０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７ｕＬ、１３ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ １６７０．７ １［Ｍ＋Ｈ＋］；保持時間＝１．０３分）。混合物を、強い窒素流下で濃縮し、残渣をメタノールに再び溶解させ、ＳＣＸカラム（２カラム体積のメタノールで予め洗浄したもの）に通した。カートリッジをカラム体積のメタノールで洗浄し、生成物を終夜カラムに残しておいた。カラムを７Ｍのアンモニアメタノール溶液でフラッシュし、濃縮した後、残渣を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、４．２ｍｇ（８％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1347.51 [M+H+]；保持時間＝０．６８分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４８６分。
（実施例２８）
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３５）の調製
Figure 2016050204
 Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（４．５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ、７９．９ｍｇ、０．４１７ｍｍｏｌ）、エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート（オキシマ、１０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（１０ｕＬ、９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした保存溶液０．１ｍＬを添加した。得られた黄色の溶液を１５分間撹拌し、次いで、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４０分間撹拌し、Ｎ−メチルモルホリン（５０ｕＬ、４５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）をさらに加えた。混合物を１６時間撹拌し、濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５．４ｍｇ（１１％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1361.8 [M+H+]；保持時間＝０．７１分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４８１分。
（実施例２９）
グリシル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３７）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３６）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、６５．０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ））を０．６５０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシネート（６８．４ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２３．１ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ、３０．８ｕＬ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｎ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２２．３ｍｇ（２９％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1777.2 [M+H+]；保持時間＝１．１０分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．５４４分。
ステップ２： グリシル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３７）の合成。Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］グリシル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３６、２０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を０．６ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、ピペリジン（０．３ｍＬ、２７０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ、次いでＭ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１４．４ｍｇ（９０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1333.8 [M+H+]；保持時間＝０．７０分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８２５分。
（実施例３０）
Ｎ２−［（３−メチルオキセタン−３−イル）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３９）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−［（３−メチルオキセタン−３−イル）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３８）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、３−メチルオキセタン−３−カルボン酸（２２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、６５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３５ｕＬ、２６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を氷水浴中でさらに４０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｐ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、３７．４ｍｇ（５５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1597.8 [M+H+]；保持時間＝１．００分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．５６７分。
ステップ２： Ｎ２−［（３−メチルオキセタン−３−イル）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３９）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ２−［（３−メチルオキセタン−３−イル）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（３８、２７．４ｍｇ、０．０１７２ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウムの水溶液（４１１ｕＬ、４１．１ｍｇ、０．０３４３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、９．３ｍｇ（３６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1374.4 [M+H+]、保持時間＝０．７７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８４１分。
（実施例３１）
２−メチルアラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４１）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４０）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニン（１７．５ｍｇ、０．０５３８ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、２５．９ｍｇ、０．０６８１ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５ｕＬ、１９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、氷水浴中でさらに４０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｑ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５６ｍｇ（１００％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1806.9 [M+H+]；保持時間＝１．１２分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．８１７分。
ステップ２： ２−メチルアラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４０）の合成。Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４０、５６ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウムの水溶液（１００ｕＬ、１０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、７．６ｍｇ（１５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1384.2 [M+Na+]；保持時間＝０．７１分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４６７分。
（実施例３２）
Ｎ２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４３）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−（メトキシカルボニル）−２−メチルアラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４２）の合成。Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、３０．０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ））を０．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよび０．２ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、メチルクロロホルメート（２９ｕＬ、３５．２ｍｇ、０．３７２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２時間撹拌した。２時間後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０．０ｕＬ、７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をさらに１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳによって、反応が不完全であることが依然として示されたので、メチルクロロホルメート（６０ｕＬ、７３ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０ｕＬ、７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を添加した。室温でもう４時間撹拌した後、混合物を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｑ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、６．４ｍｇ（２２％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1557.9 [M+H+]；保持時間＝１．０５分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．７０９分。
ステップ２： Ｎ２−（メトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４３）の合成。Ｎ−（メトキシカルボニル）−２−メチルアラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４２、６．４ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、ジエチルアミン（０．３ｍＬ、２００ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２．６ｍｇ（４４％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1334.8 [M+H+]；保持時間＝０．８３分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．９０８分。
（実施例３３）
Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４４）の調製
Figure 2016050204
 Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、２０．０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ））を０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、ピペリジン（０．１ｍＬ、９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ、次いでＲ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、７．６ｍｇ（４４％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1276.7 [M+H+]；保持時間＝０．７０分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．５１６分。
（実施例３４）
Ｌ−アラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４６）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−アラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４５）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、８．７ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−アラニネート（（８．８１ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０．０ｕＬ、７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｓ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５．３ｍｇ（５５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1791.7 [M+H+]；保持時間＝１．１１分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．６５５分。
ステップ２： Ｌ−アラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４６）の合成。Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−アラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４５、５．３ｍｇ、０．００３０ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウムの水溶液（２１０ｕＬ、２０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、３．４ｍｇ（７３％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1347.7 [M+H]+；保持時間＝０．６９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４８７分。
（実施例３５）
Ｄ−アラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４８）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−アラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４７）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−アラニネート（１５．７ｍｇ、０．０５４８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２．０ｕＬ、１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｓ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２０．０ｍｇ（４０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1791.7 [M+H+]；保持時間＝１．０８分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．０２４分。
ステップ２： Ｄ−アラニル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４８）の合成。Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−アラニル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（４７、２０．０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶かした溶液に、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、次いで濃縮した。残渣を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解させ、氷水浴で冷却した。これに、水酸化リチウムの水溶液（５０．３ｕＬ、５．３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、８．９ｍｇ（４７％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1347.9 [M+H]+；保持時間＝０．７７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４２９分。
（実施例３６）
Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５０）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： ｔｅｒｔ−ブチル（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ）−１−アミノ−６−（｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝カルバモイル）−１５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−１２−（４−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブチル）−１，８，１１，１４−テトラオキソ−９−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１７−オエート（４９）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、５０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、（２Ｓ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−４−オキソブタン酸（２０．９ｍｇ、０．０７２２ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、２８．０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２．０ｕＬ、１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、１時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｑ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、４１ｍｇ（７０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1771.2 [M+H+]；保持時間＝１．１６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．５９１分。
ステップ２： Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５０）の合成。ｔｅｒｔ−ブチル（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ）−１−アミノ−６−（｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝カルバモイル）−１５−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−１２−（４−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ブチル）−１，８，１１，１４−テトラオキソ−９−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１７−オアート（４９、４１．０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を１ｍＬのアセトニトリルに溶かした溶液に、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物を室温で２５分間撹拌し（LC-MS m/z 1671.0 [M+H]+；保持時間＝０．９３分）、次いで濃縮した。残渣を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解させ、氷水浴で冷却した。これに、水酸化リチウムの水溶液（５０．３ｕＬ、５．３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｑ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１．１ｍｇ（３％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1392.1 [M+H]+；保持時間＝０．８０分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．３０９分。
（実施例３７）
Ｎ−アセチルグリシル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５２）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ−アセチルグリシル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５１）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（２８、３０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を０．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，５−ジオキソピロリジン−１−イルＮ−アセチルグリシネート（１３．７ｍｇ、０．０６４０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２ｕＬ、１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で１６時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｑ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１７．４ｍｇ（６０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1598.9 [M+H+]；保持時間＝１．０４分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．３２６分。
ステップ２： Ｎ−アセチルグリシル−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５２）の合成。Ｎ−アセチルグリシル−Ｎ６−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５１、１７．４ｍｇ、０．０１０９ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウムの水溶液（１００ｕＬ、１０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。次いで、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｂ）によって溶液を直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、９．４ｍｇ（５８％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1398.1 [M+Na+]；保持時間＝０．８４分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７１５分。
（実施例３８）
Ｌ−セリル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５７）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（５３）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン（１０９０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、８８２ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を添加した。４０分後、Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、８００ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１１４ｍｌ、８１７ｍｇ、６．３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２時間撹拌した。次いで、反応液をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１５０ｍＬ）中に注ぎ、１５分間撹拌し、次いで濾過した。得られた固体をジクロロメタン：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル：メタノール（１０：１０：２）混合物で洗浄して、粗生成物（１．３ｇ）を灰色の固体として得た。この固体を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｔ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５７０ｍｇ（３３％）の所望の生成物を得た。分析ＨＰＬＣ保持時間＝４．５５分。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 9.97 (br. s., 1H), 8.14 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J=7.5 Hz,
2H), 7.73 (br. s., 3H), 7.54 (d, J=8.5 Hz, 3H), 7.42 (t, J=7.3 Hz, 2H), 7.33
(t, J=7.3 Hz, 2H), 7.23 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.78 (br. s., 1H), 5.98 (br. s.,
1H), 5.43 (br. s., 2H), 5.11 (br. s., 1H), 4.45 - 4.34 (m, 3H), 4.34 - 4.15 (m,
4H), 4.02 (br. s., 1H), 3.02 (d, J=5.5 Hz, 1H), 2.89 (br. s., 3H), 1.98 (d,
J=6.5 Hz, 1H), 1.61 (br. s., 3H), 1.52 (br. s., 1H), 1.42-1.30 (m, 13H), 1.24
(br. s., 2H), 0.83 (d, J=12.0 Hz, 3H), 0.85 (d, J=11.5 Hz, 3H).
ステップ２： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（５４）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（５３、５７０ｍｇ、０．６８７ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（４１８ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５７ｕＬ、１７８ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で６時間撹拌した。次いで、反応液をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１５０ｍＬ）中に注ぎ、１５分間撹拌し、次いで濾過した。得られた固体をジクロロメタン（２０ｍＬ）に２０分間分散させ、次いで濾過して、４００ｍｇ（５８％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 996.0 [M+H+]；保持時間＝４．８２９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４３分。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.14 (s, 1H), 8.36 - 8.29 (m, 2H), 8.18 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.90
(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.66 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.62 - 7.50
(m, 2H), 7.42 (d, J=7.0 Hz, 3H), 7.38 - 7.11 (m, 3H), 6.78 (br. s., 1H), 6.00
(br. s., 1H), 5.44 (br. s., 2H), 5.26 (s, 2H), 4.39 (br. s., 1H), 4.35 - 4.16
(m, 4H), 4.04 (br. s., 1H), 3.05 (d, J=7.0 Hz, 1H), 2.90 (br. s., 3H), 2.74 (s,
1H), 2.34 (br. s., 1H), 2.10 (s, 1H), 1.99 (d, J=6.0 Hz, 1H), 1.68 (br. s., 1H),
1.62 (br. s., 2H), 1.53 (br. s., 2H), 1.38 (s, 11H), 1.42 - 1.20 (m, 1H), 1.42
- 1.20 (m, 1H), 0.85 (d, J=12.5 Hz, 3H), 0.86 (d, J=12.5 Hz, 3H).
ステップ３： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５５）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、４４０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）およびＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（５４、６５８．０ｍｇ、０．６６１ｍｍｏｌ）を１．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（１３７ｕＬ、１３０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２０７．０ｕＬ、１６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、９２．１ｍｇ、０．６７７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、５０℃で２．５時間、次いで室温で１６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相クロマトグラフィー（方法Ｕ）によって精製して、凍結乾燥後に、６３０ｍｇ（６７％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1600.6 [M+H+]；保持時間＝１．０７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝８．２１３分。
ステップ４： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５５、６３０ｍｇ、０．３９４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウム（２９．４ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬの水に溶かした溶液を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌し、その後、水酸化リチウム（４０．４ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を添加した。合計３時間後、溶液を氷冷水浴で冷却し、次いで酢酸（０．２ｍＬ）で失活させ、逆相ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、３５０ｍｇ（６０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1377.6 [M+H+]；保持時間＝０．７７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．１８１分。
ステップ５： Ｌ−セリル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５７）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（６．８８ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｌ７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで、強い窒素流下で濃縮して、粗生成物を得た（LC-MS m/z 1565.6 [M+H+]；保持時間＝０．９６分）。黄色の残渣を１．２ｍＬのメタノールに溶解させ、３カラム体積のメタノールで予備溶離した２本のＳＣＸカートリッジに等しくかけた。カラムを３カラム体積のメタノールで洗浄した（ＬＣ−ＭＳによれば、洗液中に生成物の痕跡はない）。生成物は、終夜カラムに静置しておいた。２カラム体積の１Ｎトリエチルアミンメタノール溶液で、所望の生成物を溶離させた。減圧下で濃縮した後、次いで残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、８．３ｍｇ（１６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1364.5 [M+H+]；保持時間＝０．６８分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４６４分。
（実施例３９）
Ｄ−セリル−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５８）の調製
Figure 2016050204
 氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−セリン（６．８８ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｌ７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで、強い窒素流下で濃縮して、粗生成物（LC-MS m/z 1565.6 [M+H+]；保持時間＝０．９６分）を得た。黄色の残渣を１．２ｍＬのメタノールに溶解させ、３カラム体積のメタノールで予備溶離した２本のＳＣＸカートリッジに等しくかけた。カラムを３カラム体積のメタノールで洗浄した（ＬＣ−ＭＳによれば、洗液中に生成物の痕跡はない）。生成物は、終夜カラムに静置しておいた。２カラム体積の１Ｎトリエチルアミンメタノール溶液で、所望の生成物を溶離させた。減圧下で濃縮した後、次いで残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、１０．４ｍｇ（１９％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1364.5 [M+H+]；保持時間＝０．６７分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．４２４分。
（実施例４０）
Ｎ２−［（２Ｓ）−２−ヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５９）の調製
Figure 2016050204
 氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中の（２Ｓ）−２−ヒドロキシプロパン酸（３．０２ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｌ７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで強い窒素流下で濃縮して、粗生成物（LC-MS m/z 1449.5 [M+H+]；保持時間＝０．９１分）を得た。黄色の残渣を１．２ｍＬのメタノールに溶解させ、３カラム体積のメタノールで予備溶離した２本のＳＣＸカートリッジに等しくかけた。カラムを３カラム体積のメタノールで洗浄した（ＬＣ−ＭＳによれば、洗液中に生成物の痕跡はない）。生成物は、終夜カラムに静置しておいた。２カラム体積の１Ｎトリエチルアミンメタノール溶液で、所望の生成物を溶離させた。減圧下で濃縮した後、次いで残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、１２．９ｍｇ（２６％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1349.4 [M+H+]；保持時間＝０．７４分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８１３分。
（実施例４１）
Ｎ２−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６０）の調製
Figure 2016050204
 氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中の（２Ｒ）−２−ヒドロキシプロパン酸（３．０１ｍｇ、０．０３３４ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｌ７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで、強い窒素流下で濃縮して、粗生成物を得た（LC-MS m/z 1449.4 [M+H+]；保持時間＝０．９０分）。次いで、残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、２９．６ｍｇ（６０％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1349.4 [M+H+]；保持時間＝０．７５分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７４０分。
（実施例４２）
Ｎ２−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６２）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６１）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中の（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパン酸ｙ（４．０２ｍｇ、０．０３７９ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｌ７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで、強い窒素流下で濃縮した。次いで、黄色の残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｕ）によって精製して、凍結乾燥後に、１０．８ｍｇ（２２％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1465.5 [M+H+]；保持時間＝０．８９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．６０７分。
ステップ２： Ｎ２−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６２）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロパノイル］−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６１、１０．８ｍｇ、０．００７４ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた懸濁液に、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２０分間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、３．６ｍｇ（３３％）を得た。LC-MS m/z 1365.4 [M+H+]；保持時間＝０．７４分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７４９分。
（実施例４３）
Ｎ２−（３−ヒドロキシプロパノイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６４）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（３−ヒドロキシプロパノイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６３）の合成。氷水浴中で、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（５６、５０．０ｍｇ、０．０３３５ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中の３−ヒドロキシプロパン酸（４．０１ｍｇ、０．０４４５ｍｍｏｌ）、０．１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１５．３ｍｇ、０．０４０２ｍｍｏｌ ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７．９ｕＬ、１３．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で４５分間撹拌し、次いで、強い窒素流下で濃縮した。次いで、黄色の残渣を逆相クロマトグラフィー（方法Ｕ）によって精製して、凍結乾燥後に、１３．９ｍｇ（２９％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1449.6 [M+H+]；保持時間＝０．９１分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝６．７２１分。
ステップ２： Ｎ２−（３−ヒドロキシプロパノイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６４）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（３−ヒドロキシプロパノイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（６３、１３．９ｍｇ、０．００９６ｍｍｏｌ）を１ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた懸濁液に、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で２０分間撹拌した。次いで、反応液を濃縮し、逆相クロマトグラフィー（方法Ｖ）によって精製して、凍結乾燥後に、４．１ｍｇ（２９％）を得た。LC-MS m/z 1349.4 [M+H+]；保持時間＝０．７５分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７５８分。
（実施例４４）
Ｎ２−（メチルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（７０）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： メチルＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシネート（６５）の合成。メチルＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシネート（２．０ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：水（１：１、２０ｍＬ）に溶かした氷冷溶液に、炭酸カリウム（４．６ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）を添加した後、塩化メシル（０．６２ｍＬ、８．０８ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで混合物を濾過した。濾液を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残渣を、０％〜２％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、２．０ｇ（８７％）の所望の生成物を無色の油状物として得た。1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 5.23 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.62 (br.
s., 1H), 4.10 (dt, J=5.0, 8.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.16 - 3.04 (m, 2H), 2.95
(s, 3H), 1.88 - 1.78 (m, 2H), 1.77 - 1.64 (m, 1H), 1.59 - 1.47 (m, 3H), 1.45
(s, 9H).
ステップ２： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシン（６６）の合成。メチルＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシネート（６５、２．０ｇ、５．９０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：水：メタノール（１：１：１、３０ｍＬ）に溶かした、撹拌した溶液に、水酸化リチウム一水和物（４９６ｍｇ、１１．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮した。残存する水性層を酢酸エチルで２回抽出した。水性相を１Ｎ塩酸水溶液でｐＨ３に酸性化し、次いで、イソプロピルアルコール：酢酸エチル（１：５）で２回抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮して、１．３ｇ（６８％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 323.1 [M-H+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 6.40 (br. s., 1H), 5.81 - 5.66 (m, 1H), 4.79 (br. s., 1H), 3.23 -
3.06 (m, 2H), 2.99 (s, 3H), 1.96 - 1.71 (m, 2H), 1.55 - 1.39 (m, 13H).
ステップ３： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］オルニチンアミド（６７）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシン（６６、１．０ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）およびＬ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、１．２８ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした氷冷溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６００ｕＬ、４３８ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６４９ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（４５９ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温に温め、１６時間撹拌した。次いで、混合物を１５０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに滴下添加した。固体を逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５８０ｍｇ（２８％）の所望の生成物を白色の固体として得た。
ステップ４： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］オルニチンアミド（６８）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］オルニチンアミド（６７、５８０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（７７０ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした、撹拌した溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４５１ｕｌ、３３０ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を１５０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに滴下添加した。固体を逆相ＨＰＬＣ（方法ＸＸＸ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２００ｍｇ（２８％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 851.4 [M+H+]。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.16
(s, 1H), 8.32 (d, J=9.5 Hz, 2H), 8.26 (d, J=6.5 Hz, 1H), 7.95 (t, J=7.4 Hz,
1H), 7.65 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J=5.9 Hz, 2H), 7.45 (d, J=9.0 Hz, 1H),
7.42 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.79 (t, J=5.5 Hz, 1H), 6.00 (t, J=5.8 Hz, 1H), 5.45
(s, 2H), 4.40 (d, J=5.0 Hz, 1H), 4.33 - 4.06 (m, 1H), 3.84 (d, J=4.5 Hz, 1H),
3.30 (br. s., 1H), 3.09 - 2.99 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.93 - 2.86 (m,
2H), 2.83 (s, 3H), 2.01 (d, J=6.5 Hz, 1H), 1.59 (br. s., 3H), 1.47 (d, J=13.1
Hz, 2H), 1.38 (s, 13H), 0.89 (d, J=7.0 Hz, 3H), 0.85 (d, J=7.0 Hz, 3H).
ステップ５： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｄ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（６９）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、５２．０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）およびＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］オルニチンアミド（６８、６０．６ｍｇ、０．０７１０ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（３１ｕＬ、２８．３ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６ｕＬ、３４．１ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で１６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｓ）によって精製して、凍結乾燥後に、７０ｍｇ（６９％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1455.09 [M+H+], 1453.77 [M-H+]；保持時間＝１．８０分。
ステップ６： Ｎ２−（メチルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（７０）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（メチルスルホニル）−Ｄ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（６９、３０ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を０．８ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、０．２ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で３０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｂ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、凍結乾燥後に、１５ｍｇ（４８％）を得た。LC-MS m/z 1355.4 [M+H+], 1353.3 [M-H+]；保持時間＝１．４２分。
（実施例４５）
Ｎ２−（フェニルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（７５）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシン（７１）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン（３．０ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：水（１：１、１００ｍＬ）に溶かした氷冷溶液に、炭酸カリウム（８．４ｇ、６１．０ｍｍｏｌ）を添加した後、塩化ベンゼンスルホニル（１．８６ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで混合物を濾過した。濾液を酢酸エチル：イソプロピルアルコール１０：１で３回抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残渣に、１００ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加し、混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過によって収集し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、５３８ｍｇ（１１％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 408.9 [M+Na+]。1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.76
(d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.50 (m, 3H), 3.61 - 3.53 (m, 1H), 2.82 - 2.73 (m,
2H), 1.61 - 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.28 - 1.06 (m, 4H).
ステップ２： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］オルニチンアミド（７２）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシン（７１、１．２ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）およびＬ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、（１．３０ｇ、３．４１ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした氷冷溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６００ｕＬ、４３８ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６５０ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（４６０ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温に温め、１６時間撹拌した。混合物を１５０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに滴下添加した。固体を濾過によって単離し、次いで逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、８５０ｍｇ（３７％）の所望の生成物を白色の固体として得た。
ステップ３： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］オルニチンアミド（７３）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］オルニチンアミド（７２、８５０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（８５３ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした、撹拌した溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５０１ｕｌ、３６５ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を１５０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに滴下添加した。固体を逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、４５０ｍｇ（４３％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 935.1 [M+Na+]；1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.11
(s, 1H), 8.35 - 8.27 (m, 2H), 8.10 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.94 (d, J=8.5 Hz, 1H),
7.83 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.60 -
7.48 (m, 5H), 7.40 (t, J=5.8 Hz, 2H), 6.70 (s, J=5.6, 5.6 Hz, 1H), 6.01 - 5.93
(m, 1H), 5.43 (s, 2H), 4.36 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.01 (t, J=7.5 Hz, 1H), 3.78 (d,
J=5.0 Hz, 1H), 3.01 (d, J=6.0 Hz, 1H), 2.97 - 2.88 (m, 1H), 2.76 (q, J=6.5 Hz,
2H), 1.86 (d, J=6.5 Hz, 1H), 1.44 (d, J=5.5 Hz, 4H), 1.41 - 1.40 (m, 1H), 1.36
(s, 9H), 1.31 - 1.13 (m, 3H), 1.05 (br. s., 1H), 0.75 (d, J=7.0 Hz, 3H), 0.73
(d, J=7.0 Hz, 3H).
ステップ４： Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（７４）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、５２．０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）およびＮ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）−Ｌ−リシル−Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］オルニチンアミド（７３、６０．４ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（３１ｕＬ、２８．３ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６ｕＬ、３４．１ｍｇ、０．２６４ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で１６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｓ）によって精製して、凍結乾燥後に、８５ｍｇ（８５％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1518.4 [M+H+], 1516.3 [M-H+]；保持時間＝１．９３分。
ステップ５： Ｎ２−（フェニルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（７５）の合成。Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ２−（フェニルスルホニル）リシル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（７５、８２ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を０．８ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、０．２ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加した。混合物をＬＣ−ＭＳによってモニターし、室温で３０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｂ）によって直接精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、凍結乾燥後に、３５ｍｇ（４２％）を得た。LC-MS m/z 1416.87 [M+H+]；保持時間＝１．３５分。
（実施例４６）
Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｄ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（８３）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： メチルＮ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリネート（７８）の合成。９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（２−ヒドロキシエチル）カルバメート（１０００ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）およびメチル（２Ｓ）−１−アセチルアジリジン−２−カルボキシレート（ＵＳ２０１１００２１４８２、７５８ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた−３０℃の懸濁液に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（５３２ｕＬ、６０１ｍｇ、４．２４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物をその温度で２時間撹拌し、次いで室温まで温めた。さらに１時間後、反応液に、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液を添加し、ジクロロメタン（８０ｍＬ）で希釈した。有機相を分離し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｗ）によって精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で有機溶媒を除去した。残存する水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残渣を１回ジクロロメタン（５０ｍＬ）との同時蒸発にかけて、表題化合物１６０ｍｇ（１１％）を淡黄色のゴム質として得た。MS m/z 448.9 [M+Na+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 7.78 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.42 (t, J=7.5
Hz, 2H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 6.66 (br. s., 1H), 5.07 (br. s., 1H), 4.89 - 4.72
(m, 1H), 4.45 (d, J=6.5 Hz, 2H), 4.23 (d, J=6.5 Hz, 1H), 3.88 (d, J=6.5 Hz,
1H), 3.72 (br. s., 4H), 3.54 (br. s., 2H), 3.36 (br. s., 2H), 2.09 (s, 3H).
ステップ２： Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリン（７９）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリネート（７８、１６０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）をイソプロパノール：水（７：３、１０ｍＬ）に溶かした溶液に、塩化カルシウム（８３３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物が透明になったら、水酸化ナトリウム（１８ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、混合物を３Ｍ塩酸水溶液でｐＨ約１〜２に酸性化し、水（１０ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で抽出し、有機物質を単離し、減圧下で濃縮して、イソプロパノールの大部分を除去した。水性相を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して、１０７ｍｇ（９６％）の所望の化合物を青色の固体として得たが、これをそれ以上精製せずに次のステップでそのまま使用する。MS m/z 434.8 [M+Na+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 8.48 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.56 (d, J=7.5
Hz, 2H), 7.47 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 7.15 (t, J=6.1 Hz, 1H), 5.03
(d, J=9.0 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=6.8, 10.8 Hz, 1H), 4.41 (dd, J=7.0, 10.5 Hz,
2H), 4.30 - 4.23 (m, 1H), 4.32 - 4.21 (m, 1H), 4.21 - 4.09 (m, 1H), 3.57 (t,
J=8.3 Hz, 3H), 3.53 - 3.45 (m, 2H), 3.40 (br. s., 1H), 3.31 (d, J=9.0 Hz, 1H),
2.00 (s, 3H).
ステップ３： Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８０）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリン（７９、１０５ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）およびＬ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、９６．６ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７アザベンゾトリアゾール１イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１０６ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ）に続いて、Ｎ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（９８．７ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）を添加した。黄色の透明な混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（６０ｍＬ）で希釈し、３０分間撹拌した。固体を濾過によって単離し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｘ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、８４ｍｇ（４３％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 774.2 [M+H+]。
ステップ４： Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８１）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８０、２００ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（８５３ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした、撹拌した溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００．８ｕｌ、７３．５ｍｇ、０．５６９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、さらに炭酸ｐ−ニトロフェニル（７８．６ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）を添加した。もう１時間後、混合物を１００ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに滴下添加した。固体を濾過によって単離し、いくらかのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄して、風乾後に、１８０ｍｇ（７４％）の所望の生成物を黄色の固体として得た。MS m/z 939.2 [M+H+] 961.1 [M+Na+]。
ステップ５： Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｄ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（８２）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、６０．０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８１、１２１ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（３７．４ｕＬ、３４．６ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４２．２ｕＬ、３１．３ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（１１．０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製して、凍結乾燥後に、６２ｍｇ（５０％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1543.3 [M+H+]；保持時間＝２．２５分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．４３５分。
ステップ６： Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｄ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（８３）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）−Ｄ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（８２、４２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウム（３．２６ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）の水溶液を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｌ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２９ｍｇ（７４％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1321.2 [M+H+]；保持時間＝１．３０分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８０４分。
（実施例４７）
Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（９０）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： メチルＮ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリネート（８５）の合成。９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］カルバメート（８４、７．５５ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）およびメチル（２Ｓ）−１−アセチルアジリジン−２−カルボキシレート（７５８ｍｇ、５．２９ｍｍｏｌ）を１３０ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（３．９４ｍＬ、４．４６ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。１時間後、反応液に、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液を添加した。有機相を分離し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｙ）によって精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で有機溶媒を除去した。残存する水性混合物をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮して、表題化合物３．８ｇ（２６％）を無色の油状物として得た。MS m/z 493.0 [M+Na+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.62 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.44 - 7.37 (m,
2H), 7.35 - 7.29 (m, 2H), 6.69 (d, J=6.5 Hz, 1H), 5.49 (br. s., 1H), 4.78 (d,
J=8.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J=6.5 Hz, 2H), 4.25 (d, J=7.0 Hz, 1H), 3.95 (d, J=10.0
Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.66 - 3.50 (m, 6H), 3.41 (br. s., 2H), 2.04 (s, 3H).
ステップ２： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリン（８６）の合成。メチルＮ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリネート（８５、３２００ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を９０ｍＬのイソプロパノールおよび４０ｍＬの水に溶かした溶液に、塩化カルシウム（１５．１ｇ、１３６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物が透明になったなら、水酸化ナトリウム（３２６ｍｇ、８．１６ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、次いで、混合物を３Ｍ塩酸水溶液でｐＨ約１〜２に酸性化し、水（３００ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出し、有機物質を単離し、減圧下で濃縮して、３０００ｍｇ（９７％）の所望の化合物を白色の固体として得、これをそれ以上精製せずに次のステップでそのまま使用した。MS m/z 456.9 [M+H+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.53 (m, 2H), 7.44 - 7.38 (m, 2H),
7.36 - 7.30 (m, 2H), 6.65 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.77 (br. s., 1H), 4.51 (br. s.,
1H), 4.43 (d, J=6.5 Hz, 1H), 4.26 (d, J=6.0 Hz, 1H), 3.95 (br. s., 1H), 3.76
(br. s., 1H), 3.70 - 3.57 (m, 3H), 3.54 (d, J=7.5 Hz, 2H), 3.41 (d, J=13.1 Hz,
2H), 3.29 (br. s., 1H), 2.05 (br. s., 3H).
ステップ３： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８７）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリン（８６、３０００ｍｇ、６．５７ｍｍｏｌ）を４５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、Ｏ−（７アザベンゾトリアゾール１イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、３０００ｍｇ、７．８９ｍｍｏｌ）を添加した。２０分後、Ｌ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、２４９０ｍｇ、６．５７ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５５０ｍｇ、１９．７ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（５００ｍＬ）と石油エーテル（２００ｍＬ）の混合物中に注ぎ、２０分間撹拌した。固体を濾過によって単離し、次いで、１％〜２０％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、３１００ｍｇ（５８％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 818.1[M+H+]。
ステップ４： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８８）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８７、５００ｍｇ、０．６１１ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（２７９ｍｇ、０．９１７ｍｍｏｌ）を６ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした、撹拌した氷冷溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１６．７ｕｌ、１５８ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で５時間撹拌し、次いでさらに炭酸ｐ−ニトロフェニル（１００ｍｇ、０．５３８ｍｍｏｌ）を添加した。もう１２時間後、混合物を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（６０ｍＬ）と石油エーテル（２０ｍＬ）の混合物中に注ぎ、１５分間撹拌した。固体を濾過によって単離し、次いで、１％〜１０％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、３００ｍｇ（５０％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 983.5 [M+H+]。
ステップ５： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（８９）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、６０．０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（８８、７５．４ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（３７．４ｕＬ、３４．６ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４２．２ｕＬ、３１．３ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（ＨＯＡｔ、１１．０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で１６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製して、凍結乾燥後に、７６ｍｇ（５８％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1587.3 [M+H+]；保持時間＝２．２６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．４５９分。
ステップ６： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（９０）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（８９、４０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウム（３．０２ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）の水溶液を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、溶液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｄ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、２７ｍｇ（７２％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1365.2 [M+H+]；保持時間＝１．２６分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．７６８分。
（実施例４８）
Ｎ２−（３−ヒドロキシプロパノイル）−Ｌ−リシルバリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（９７）の調製
Figure 2016050204
 ステップ１： メチルＮ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリネート（９２）の合成。９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（１７−ヒドロキシ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカ−１−イル）カルバメート（９１、７６００ｍｇ、１５．０９ｍｍｏｌ）およびメチル（２Ｓ）−１−アセチルアジリジン−２−カルボキシレート（４３２０ｍｇ、３０．２ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬのジクロロメタンに溶かした溶液に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（２．８４ｍＬ、３２１０ｍｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を滴下添加した。２．５時間後、反応液を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残渣を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｚ）によって精製した。適切な画分を合わせ、減圧下で有機溶媒を除去した。残存する水性混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して、表題化合物５ｇ（５１％）を油状物として得た。MS m/z 647.1 [M+H+]；1H NMR (400MHz, クロロホルム-d) δ = 7.76 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J=7.5
Hz, 2H), 7.31 (t, J=7.4 Hz, 2H), 6.72 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.47 (br. s., 1H),
4.73 (td, J=3.5, 8.0 Hz, 1H), 4.41 (d, J=7.0 Hz, 2H), 4.26 - 4.19 (m, 1H), 3.94
(dd, J=3.5, 10.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.70 (dd, J=3.5, 10.0 Hz, 1H), 3.67 -
3.56 (m, 22H), 3.40 (q, J=5.2 Hz, 2H), 2.07 (s, 3H).
ステップ２： Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリン（９３）の合成。メチルＮ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリネート（９２、４２００ｍｇ、６．４９ｍｍｏｌ）をイソプロパノール：水（７：３、１７０ｍＬ）に溶かした溶液に、塩化カルシウム（１４．４ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物が透明になったなら、水酸化ナトリウム（３１２ｍｇ、７．７９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、混合物を３Ｍ塩酸水溶液でｐＨ約１〜２に酸性化し、水（１００ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、有機物質を単離し、減圧下で濃縮して、イソプロパノールの大部分を除去した。水性相を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、０％〜１５％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、３．４ｇ（８３％）の所望の化合物を黄色の油状物として得た。MS m/z 633.1 [M+H+]。
ステップ３： Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（９４）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリン（９３、１．２０ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）およびＬ−バリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（１、７２０ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした氷冷溶液に、Ｏ−（７アザベンゾトリアゾール１イル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（７９４ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）に続いて、Ｎ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（７３６ｍｇ、５．６９ｍｍｏｌ）を添加した。黄色の透明な混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で希釈し、水（６０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。次いで、残渣を、０％〜１５％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、１．５ｇ（８０％）の所望の生成物を無色のガラスとして得た。MS m/z 994.8 [M+H+]。
ステップ４： Ｎ−アセチル−Ｏ−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（９５）の合成。氷冷浴中で、Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリルバリル−Ｎ５−カルバモイル−Ｎ−［４−（ヒドロキシメチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（９４、１．５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）および炭酸ｐ−ニトロフェニル（９１８ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした、撹拌した溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４０２ｕｌ、２９３ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、次いでさらに炭酸ｐ−ニトロフェニル（９１８ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ）を添加した。もう３時間後、混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、水（４０ｍＬ）で洗浄した。水性相を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮し、次いで、０％〜１５％のメタノールジクロロメタン溶液の勾配溶離を使用するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、次いで逆相ＨＰＬＣ（方法ＡＡ）によって精製して、凍結乾燥後に、９４４ｍｇ（５４％）の所望の生成物を白色の固体として得た。MS m/z 1159.8[M+H+]。
ステップ５： Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（９６）の合成。２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（４、５５．０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチル−Ｏ−［２−（２−アミノエトキシ）エチル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（９５、８５．８ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶かした溶液に、２，６−ルチジン（３４．３ｕＬ、３１．７ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌ） Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３８．７ｕＬ、２８．７ｍｇ、０．２２２ｍｍｏｌ）、および３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オール（１０．１ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で６時間撹拌した。次いで、反応液を逆相ＨＰＬＣ（方法Ｇ）によって精製して、凍結乾燥後に、９０ｍｇ（６９％）の所望の生成物を白色の固体として得た。LC-MS m/z 1764.4 [M+H+]；保持時間＝１．９９分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝７．４７６分。
ステップ６： Ｎ−アセチル−Ｏ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカ−１−イル）−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド・トリフルオロ酢酸塩（９７）の合成。Ｎ−アセチル−Ｏ−［１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサ−４−アザヘニコサン−２１−イル］−Ｌ−セリル−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）−１１−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−１２−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−５，５，１０−トリメチル−３，６，９−トリオキソ−８−（プロパン−２−イル）−２，１３−ジオキサ−４，７，１０−トリアザテトラデカ−１−イル］フェニル｝−Ｎ５−カルバモイルオルニチンアミド（９６、４６ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、水酸化リチウム（３．１ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）の水溶液を添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。次いで、溶液を濃縮し、逆相ＨＰＬＣ（方法Ｄ、次いで方法Ｈ）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、１５ｍｇ（３５％）の所望の生成物を得た。LC-MS m/z 1542.2 [M+H+]；保持時間＝１．４１分。分析ＨＰＬＣ保持時間＝５．８３６分。
次の追加のＡＤＣ（表２から７において示すとおり、種々の位置において、Ｔｒｏｐ２抗体上の種々のタグ上で結合している）は、上述のコンジュゲーション技術を使用して作製した（括弧でくくられた部分は、グルタミン残基を示し、破線は、抗Ｔｒｏｐ２抗体の残部への結合点を示す）。
（実施例４９）
Figure 2016050204
（実施例５０）
Figure 2016050204
（実施例５１）
Figure 2016050204
（実施例５２）
Figure 2016050204
（実施例５３）
Figure 2016050204
（実施例５４）
Figure 2016050204
（実施例５５）
Figure 2016050204
（実施例５６）
Figure 2016050204
（実施例５７）
Figure 2016050204
（実施例５８）
Figure 2016050204
（実施例５９）
Figure 2016050204
（実施例６０）
Figure 2016050204
（実施例６１）
Figure 2016050204
（実施例６２）
Figure 2016050204
（実施例６３）
Figure 2016050204
（実施例６４）
Figure 2016050204
（実施例６５）
Figure 2016050204
（実施例６６）
Figure 2016050204
（実施例６７）
Figure 2016050204
（実施例６８）
Figure 2016050204
（実施例６９）
Figure 2016050204
（実施例７０）
Figure 2016050204
（実施例７１）
Figure 2016050204
（実施例７２）
マウスカルボキシルエステラーゼ１Ｃが血漿においてＶＣ−ＰＡＢＣリンカー切断を担う酵素であることの確認
マウスノックアウト系統Ｃ５６／ＢＬ６ Ｃｅｓ１Ｃ−／−、ヘテロ接合系統Ｃ５６／ＢＬ６ Ｃｅｓ１Ｃ＋／−、および野生型系統Ｃ５６／ＢＬ６ Ｃｅｓ１Ｃ＋／＋からの血漿試料を使用して、抗Ｔｒｏｐ２ Ｌ１１Ｂ−Ｃ６−ＶＣ−ＰＡＢＣ−Ａｕｒ０１０１コンジュゲートの安定性を試験した。５６ｕｇのＡＤＣを、１×ＰＢＳで補充して最終ＡＤＣ濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬとした３５％の血漿中でインキュベートした。１８時間インキュベートした後、標準プロトコールを使用してＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させたＭ１Ｓ１抗原を使用して、ＡＤＣを単離した。ＨＩＣ分析を使用して、インキュベート前後にＤＡＲ値を評価した。コンジュゲート安定性（％）は、インキュベート後に残るＤＡＲの％として算出する。図３を参照されたい。
生物学的データ
実施例８から１８で概略を述べた手順において生成された安定性データを、表２から７に要約する。
Figure 2016050204
 マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲート安定性。９ｍｇ／ｋｇで投薬された動物から精製されたコンジュゲートについてのＤＡＲ値を、ｉｎ ｖｉｖｏ被作用より前のＤＡＲ値と比較した。上記安定性値は、（括弧内に示す）所与の被作用期間後に残るＤＡＲの％として示す。
Figure 2016050204
 ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲート安定性。９ｍｇ／ｋｇで投薬された動物から精製されたコンジュゲートについてのＤＡＲ値を、ｉｎ ｖｉｖｏ被作用より前のＤＡＲ値と比較した。上記安定性値は、（括弧内に示す）所与の被作用期間後に残るＤＡＲの％として示す。
Figure 2016050204
Figure 2016050204
Figure 2016050204
 マウス血漿におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲート安定性。血漿インキュベート後に精製されたコンジュゲートについてのＤＡＲ値を、血漿処理より前のＤＡＲ値と比較した。上記安定性値は、（括弧内に示す）所与のインキュベート期間後に残るＤＡＲの％として示す。
Figure 2016050204
 ラット血漿におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲート安定性。血漿インキュベート後に精製されたコンジュゲートについてのＤＡＲ値を、血漿処理より前のＤＡＲ値と比較した。上記安定性値は、（括弧内に示す）所与のインキュベート期間後に残るＤＡＲの％として示す。
Figure 2016050204
 イヌ血漿におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのコンジュゲート安定性。血漿インキュベート後に精製されたコンジュゲートについてのＤＡＲ値を、血漿処理より前のＤＡＲ値と比較した。上記安定性値は、（括弧内に示す）所与のインキュベート期間後に残るＤＡＲの％として示す。
Figure 2016050204
Figure 2016050204
Figure 2016050204
Figure 2016050204
Figure 2016050204
開示する教示について、種々の用途、方法、および組成物に関して述べてきたが、本明細書における教示および以下の請求項に係る発明から離れることなく、種々の変更および改良がなされる場合があることは理解されよう。前述の実施例は、開示する教示をより十分に例示するために設けており、本明細書で示す教示の範囲を限定するものでない。本教示は、こうした例示的な実施形態に関して述べられているが、当業者なら、こうした例示的な実施形態のいくつもの変形形態および改良形態が、必要以上の実験なしで実現可能であることを難なく理解されよう。このような変形形態および改良形態はすべて、本教示の範囲内にある。
特許、特許出願、論文、教本などを含めた、本明細書で引用するすべての参考文献、およびその中で引用されている参考文献は、既存にならない程度に、その全体が参照により援用される。限定はしないが、定義された用語、用語の用法、記載の技術などを含めて、援用される文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なるまたは矛盾する場合では、本出願が統制をなす。
前述の解説および実施例では、本発明のある特定の詳細な実施形態を詳述し、発明者らが企図する最良の形態について記載している。しかし、前述の事項が本文中でどんなに詳細に見えることがあろうと、本発明は、色々に実施されてよく、また、添付の特許請求の範囲およびその任意の同等物に従って解釈すべきであることは正しく認識される。

Claims (29)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2016050204
     または薬学的に許容できるその塩もしくは溶媒和物
    ［式中、
    Ｍは、安定性調節基であり、
    Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
    Ｑは、Ｐ中に存在する、グルタミン残基であり、
    各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
    各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
    各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
    各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
    各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
    ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
    Ｄは、細胞傷害性薬剤である］。
  2. 式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2016050204
     または薬学的に許容できるその塩もしくは溶媒和物
    ［式中、
    Ｍは、安定性調節基であり、
    Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
    Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
    各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
    各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
    各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
    各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
    各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
    ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
    Ｄは、細胞傷害性薬剤である］。
  3. 式（ＩＩＩ）の化合物：
    Figure 2016050204
     または薬学的に許容できるその塩もしくは溶媒和物
    ［式中、
    Ｍは、安定性調節基であり、
    各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
    各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
    各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
    各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
    各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
    ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
    Ｄは、細胞傷害性薬剤である］。
  4. Ｍが−Ｍ１−Ｍ２であり、Ｍ１は、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１−Ｓ（Ｏ）２−、または不在であり、Ｍ２は、置換メチル、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキル、−Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロアルキル、−Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、カルボキシ、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、および−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリルからなる群から選択され、Ｍ２は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＮＯ２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル、カルボキシ、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４アリール）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール）、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル）、−Ｓ（Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル）、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１−Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−ＯＨ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基でさらに置換されていてもよく、但し、Ｍ１が−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、−（Ｃ（Ｒ１）２）ｒ−Ｅｑ−（Ｃ（Ｒ１）２）ｓ−が直鎖Ｃ４アルキルであるとき、Ｍ２は、非置換メチルではない、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
  5. Ｍが−Ｍ１−Ｍ２であり、Ｍ１は、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１−Ｓ（Ｏ）２−、または不在であり、Ｍ２は、−Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、および−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリルからなる群から選択され、Ｍ２は、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、および−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基でさらに置換されていてもよい、請求項４に記載の化合物。
  6. Ｍ２が、
    Figure 2016050204
     からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
  7. 細胞傷害性薬剤Ｄが、アントラサイクリン、アウリスタチン、スプリセオスタチン、ＣＢＩ／ＣＰＩ二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、ツブリシン、ヘミアステリン、カンプトテシン、コンブレタスタチン、ドラスタチン、インドリノ−ベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン二量体、およびプラジエノリド、ならびにこれらの立体異性体、同配体、類似体、または誘導体からなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の化合物。
  8. 細胞傷害性薬剤Ｄが、ドレスタチン、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＰＦ−０６３８０１０１、ＰＦ−０６４６３３７７、およびＰＦ−０６４５６７８０からなる群から選択されるアウリスタチンである、請求項１から７のいずれかに記載の化合物。
  9. Ｐが、Ｑ、ＬＱＧ、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号２０）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号２１）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号２２）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号２３）、ＬＬＱＧＡ（配列番号２４）、ＬＬＱＧＰＧＫ（配列番号２５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号２６）、ＬＬＱＧＰ（配列番号２７）、ＬＬＱＰ（配列番号２８）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号２９）、ＬＬＱＡＰＧＫ（配列番号３０）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号３１）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号３２）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号３３）、ＬＬＱＧＰＰ（配列番号３４）、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号３５）、ＬＬＱＬＱＧ（配列番号３６）、およびＸＸＱＸ（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１または２に記載の化合物。
  10. 以下のもの：
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
     からなる群から選択される化合物または薬学的に許容できるその塩もしくは溶媒和物。
  11. 以下のもの：
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
    Figure 2016050204
     ［化合物の括弧でくくられた部分は、ペプチド配列内のグルタミン残基を表す］からなる群から選択される化合物または薬学的に許容できるその塩もしくは溶媒和物。
  12. 前記調節基Ｍをもたない対応する化合物と比較して、安定性が５〜５０％低下している、請求項１または２に記載の化合物。
  13. 前記調節基Ｍをもたない対応する化合物と比較して、安定性が５〜５０％増大している、請求項１または２に記載の化合物。
  14. Ｘ−Ｙが、Ｇｌｙ、β−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−Ｎｉｔｒｏ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ａｌａ、およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
  15. Ｐが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および抗体断片からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
  16. 前記抗体が、トラスツズマブ、トラスツズマブ変異体、オレゴボマブ、エドレコロマブ、セツキシマブ、ビトロネクチン受容体（αｖβ３）に対するヒト化モノクローナル抗体、アレムツズマブ、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、１３１Ｉ Ｌｙｍ−１、抗ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体、抗ｃｄ３３抗体、抗ｃｄ２２抗体、ラベツズマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、イピリムマブ、およびゲムツズマブから選択される、請求項１５に記載の化合物。
  17. 各Ｑが、独立に、前記ペプチド配列Ｐに内在するグルタミンの残基、または前記ペプチド配列Ｐ上にある改変タグ配列に設けられたグルタミンの残基である、請求項１または２に記載の化合物。
  18. １つまたは複数のＱが、前記ペプチド配列Ｐに内在するグルタミンの残基である、請求項１または２に記載の化合物。
  19. １つまたは複数のＱが、前記ペプチド配列Ｐ上にある改変タグ配列に設けられたグルタミンの残基である、請求項１または２に記載の化合物。
  20. １つまたは複数のタグが、単一のアミノ酸グルタミンである、請求項１９に記載の化合物。
  21. Ｚが、ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジル−カルバモイル）、ＰＡＢ−ＯＨ（ｐ−アミノカルバモイルオキシ）、
    Figure 2016050204
     からなる群から選択され、
    Ｔは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
  22. ＺがＺ１−Ｚ２であり、Ｚ１は、ｐ−アミノベンジル−カルバモイル（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルオキシ、ｏ−アミノベンジル−カルバモイル、ｏ−アミノベンジルオキシ、−ＮＨ−Ｕ−Ｃ（Ｒ１）２ＯＣＯ−、および−ＮＨ−Ｕ−Ｃ（Ｒ１）２Ｏ−からなる群から選択され、Ｚ２は、不在であるか、または−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−ＯＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−Ｎ（Ｒ１）２ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ１〜Ｃ６−アルキレン）−ＳＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−シクロアルキレン）−ＯＣＯ−、−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−シクロアルキレン）−Ｎ（Ｒ１）２ＣＯ−、および−Ｎ（Ｒ１）２−（Ｃ３〜Ｃ９−アルキレン）−ＳＣＯ−からなる群から選択され、Ｕは、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、−Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、−ＮＯ２、−Ｃ６〜Ｃ１４アリール、−Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール、−Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、−Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル、カルボキシ、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４アリール）、−Ｓ（Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリール）、−Ｓ（Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル）、−Ｓ（Ｃ３〜Ｃ１０カルボシクリル）、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−ＮＲ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−ＯＨ、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）２−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｓ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択される５つまでの追加の置換基で置換されていてもよいＣ５〜Ｃ２０芳香族またはヘテロ芳香族環である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物。
  23. 式（ＩＩ）の抗体薬物コンジュゲート：
    Figure 2016050204
     ［式中、
    Ｍは、安定性調節基であり、
    Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
    Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
    各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
    各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
    各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
    各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
    各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
    ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
    Ｄは、細胞傷害性薬剤である］の安定性を調節する方法であって、
    前記化合物の細胞外での安定性を調節しうる調節基Ｍを選択するステップと、
    前記調節基Ｍを前記コンジュゲートに組み込むステップと、
    前記コンジュゲートを患者に投与するステップと
    を含む方法。
  24. 前記安定性がｉｎ ｖｉｖｏ安定性である、請求項２３に記載の方法。
  25. 標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率を増大させる、請求項２４に記載の方法。
  26. 標的細胞内で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤の比率を低下させる、請求項２４に記載の方法。
  27. 標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率を増大させる、請求項２４に記載の方法。
  28. 標的細胞の外側で放出される細胞傷害性薬剤と比較した標的細胞の内側で放出される細胞傷害性薬剤の比率を低下させる、請求項２４に記載の方法。
  29. 式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2016050204
     ［式中、
    Ｍは、安定性調節基であり、
    Ｐは、１つまたは複数のグルタミン残基を含むペプチド配列であり、
    Ｑは、Ｐ中に存在する、前記グルタミン残基の１つであり、
    各Ｅは、−Ｃ（Ｒ１）２−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−（ｒが少なくとも２である場合）、および−Ｃ（Ｒ１）２−Ｃ（Ｒ１）２−Ｏ−（ｓが少なくとも１である場合）からなる群から独立に選択され、
    各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分枝アルキル、Ｃ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルケニル、およびＣ２〜Ｃ６直鎖または分枝アルキニルからなる群から独立に選択され、
    各Ｘは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｘは、同じまたは異なり、
    各Ｙは、独立に、アミノ酸であり、各アミノ酸Ｙは、同じまたは異なり、
    各Ｚは、独立に、スペーサー要素であり、各スペーサー要素は、同じまたは異なり、
    ｍは、０〜５であり、ｎは、１〜５であり、ｐは、０〜２であり、ｑは、０〜１０であり、ｒは、０〜２であり、ｓは、０〜２であり、ｑ＋ｒ＋ｓ＝２またはそれ以上であり、
    Ｄは、細胞傷害性薬剤である］を合成する方法であって、
    ある量の、構造
    Figure 2016050204
     の第１の化合物を用意するステップと、
    ある量の、グルタミンが組み込まれているペプチド配列を含む第２の化合物を用意するステップと、
    前記ある量の第１の化合物と第２の化合物をトランスグルタミナーゼの存在下で反応させるステップと
    を含む方法。
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