JP2015534041A - 合成コラーゲンを用いる抗血小板応答および反応性の試験 - Google Patents

Abstract

本発明は、合成自己組織化ヒトＩ型コラーゲンを用いる血小板凝集試験、個人が抗血小板薬を受けている場合に、個人の血小板の抗血小板薬感受性および残留血小板活性状態を測定する方法、ならびにこれらのアッセイおよび方法において有用であるキットを提供する。

Description

本出願は、２０１２年８月９日出願の米国特許仮出願第６１／６８１，４８５号；２０１３年７月５日出願のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ１３／４９４１８、および２０１３年８月５日出願のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ１３／５３６１２の優先権を主張するものであり、これらのすべては、その全内容が本明細書に組み込まれる。

心臓病学の分野では、血小板応答および反応性の効果的な評価法が従来から第一に求められている。心臓発作、脳卒中、ならびに関連する心血管および血栓性疾患の公衆衛生上の広がりおよび負荷についてはよく知られている。整形外科などのその他の医療の分野においても、患者の予後の改善のために抗血小板療法の使用を次第に取り入れつつあるが、必要である研究による支援および指導を持っていない。医学界は、心血管、脳卒中、およびその他の特定のリスクを低減するためのプライマリケアとしてアスピリンの使用をかなり以前から推奨してきた。アスピリンの新しい配合、他の薬物とのアスピリンの組み合わせ、および「スーパー」アスピリンが現在開発中であり、これらは、多くの専門分野にわたるアスピリンの使用を拡大するであろう。アスピリン（サリチレート系化合物）の経口摂取または暴露により、ＣＯＸ１経路が阻害され、およびＣＯＸ２酵素プロセスが修飾され、そしてこれによって、血小板凝集に必要であるこれに続くすべてのイベントが排除される。アスピリンの経口摂取または暴露は、血小板凝集を阻害することができることから、多くの心臓発作、脳卒中、およびその他の血栓性または出血性の病状の原因であり得る望ましくない血小板凝集を予防するための治療法とされてきた。多くの個人においてアスピリン療法が有益であるにも関わらず、一部の個人にとって、アスピリン療法は、残留血小板反応性が高く、従って患者のリスクが軽減されないことから、その効果が充分ではない。従って、医師は、多くの場合、望ましくない血小板凝集を阻害するための治療を必要とする患者に対して、抗血小板薬を処方する。

すべての患者が、抗血小板薬に対して同じ様に応答するわけではなく、従って、血小板凝集に対する抗血小板薬の応答および反応性を評価し、管理するための信頼のおけるツールが求められている。現在のところ、抗血小板薬療法に対する患者の応答の測定、または患者の残留血小板反応性の特定のための効果的な方法は存在しない。従って、患者が抗血小板薬療法を受けている場合に、血小板凝集に対する抗血小板薬の応答および反応性を評価、管理するための、ならびに治療レジメンの患者コンプライアンスをチェックするための信頼のおけるツールの必要性が満たされていない。従って、アゴニストとして動物由来のコラーゲンを用いず、抗血小板薬に対する血小板応答を測定することができる血小板活性試験が依然として求められている。本発明は、このような必要性を満たすものである。

抗血小板薬は、心血管、神経血管、およびその他の疾患における主たるアテローム血栓性合併症の低減に寄与するものであると広く考えられているが、予後は、予測可能なものではない。経皮的冠動脈インターベンションおよび急性冠動脈症候群の治療において、二重抗血小板療法は、最適な用量およびタイミングで実施される場合、血栓性合併症のリスクを大きく低減し、良好な予後に寄与してきた。しかし、重要な臨床上の問題は、主要有害臨床イベント（major adverse clinical events：「ＭＡＣＥ」）の発生数の増加および患者の予後の混乱しがちな相違に関連する。この現象の下地となっているメカニズムを理解することは、患者のケアの改善、長期（維持）療法、および一定の（良好な）予後にとって重要である。しかし、抗血小板療法に対する応答性についての分かりやすく信頼のおける予測モデルで、現時点において利用可能であるものはない。血小板機能試験を用いて抗血小板療法の有効性を特徴付ける試みが行われてきたが、現時点での情報に基づくと
、それを日常的に用いることは、特にコスト、複雑性、および費用対効果がまだ確立されていないことから、推奨されておらず、ならびに実験室での方法の間での相関、標準化、および一致が欠落しているということが、文献に詳細に記載されている。Tobias Geislera et al., Circulation 2010; 122: 1049-1052。加えて、血小板に対するアスピリンの阻害効果は、長期または慢性療法を受けている患者において、時間と共に低下する。Violi,
F. et al., J Am Cardio, Vol. 43, No. 6, 2004。

従って、動物由来コラーゲンをアゴニストとして用いない定量的な機能性血小板活性試験が依然として求められている。患者がアスピリンおよび抗血小板薬の二重療法を受けている場合の抗血小板薬に対する血小板応答を測定することができる試験、さらには二重療法レジメンでの患者コンプライアンスをモニタリングするための試験も依然として求められている。また、残留血小板活性（患者が二重抗血小板薬療法を受けている間であっても残っている血小板活性のこと）を測定することのできる試験も求められている。本発明はこのような必要性を満たすものである。

従来から、アスピリンおよびその他の抗血小板薬療法に対する患者の応答は、血小板凝集試験を用いて血小板活性を試験することによって評価される。血小板凝集試験の「至適標準」である光透過型凝集測定法（ＬＴＡ）は、血小板の応答もしくは凝集に対する阻害の度合いまたは程度の尺度としての血小板凝集をもたらすためのアゴニストとして、生物源からのコラーゲンを用いている。しかし、生物学的物質を用いる場合、複数の課題、ならびに感染性疾患の伝染のリスクが存在する。「天然」であれ、加工品であれ、発酵、細胞培養、もしくは類似のプロセスによる製造品であれ、または組換え品であれ、生物由来品はすべて、以下の欠点を共通して有する：感染性疾患の伝染リスクを有すること；ロット間の変動（活性物質の比率、性能、化学的特性、溶解性、安定性、水分含有量、およびプロセス汚染物に関して）；製品が作られた場所に依存する生物学的プロファイルの相違；加工に起因する相違；および採取源である動物または培養物に影響を及ぼす環境上、地理上、および食餌上の相違。

２９のコラーゲンの型が（現在のところ）識別されている。線維性コラーゲンには、Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、およびＸＩ型、最近明らかになったＸＸＩＶおよびＸＸＶＩＩ型が含まれる（Esposito, JY et al, The fibrillar Collagen Family. Int J Mol Sci. 2010; 11(2):407-426）。通常、血小板凝集においては、Ｉ型線維性コラーゲンが好ましいが、ＩＶ及びＩＩＩ型の使用も報告されている。利用可能である２９種類のコラーゲンはすべて、生物源からのものである（仔ウシ皮、酸抽出、分別仔ウシ皮、ウシ腱、ウシ鼻中隔、ウマ腱、ロバ大動脈、ウサギ大動脈、ラット皮、ラット尾、マウス胸骨、カンガルー尾、組換え体（ニコタニア）、ヒト胎盤、およびヒト肺）。単一のコラーゲン品標準、または標準コラーゲン品は存在しない。コラーゲンの採取源、その製剤、およびその濃縮が、各々、コラーゲンに対する血小板応答の変動性に、相加的に寄与する。この変動性のために、コラーゲン感受性抗血小板剤の精密な治療的制御に、生物学的コラーゲンを用いることはできない。

抗血小板薬は、心血管、神経血管、およびその他の疾患における主たるアテローム血栓性合併症の低減に寄与するものであると広く考えられている。経皮的冠動脈インターベンションおよび急性冠動脈症候群の治療において、抗血小板療法は、最適な用量およびタイミングで実施される場合、血栓性合併症のリスクを大きく低減し、良好な予後に寄与してきた。しかし、重要な臨床上の問題は、抗血小板治療に対する患者の応答の変動、主要有害臨床イベント（「ＭＡＣＥ」）の発生数、および困惑させる患者の予後の相違に関連する。この現象の下地となっているメカニズムを理解することは、患者のケアの改善、長期（維持）療法、および一定の（良好な）予後にとって重要である。しかし、抗血小板療法に対する応答性についての分かりやすく信頼のおける予測モデルで、現時点において利用
可能であるものはない。血小板機能試験を用いて抗血小板療法の有効性を特徴付ける試みが行われてきたが、現時点での情報に基づくと、それを日常的に用いることは、特にコスト、複雑性、および費用対効果がまだ確立されていないことから、推奨されておらず、ならびに実験室での方法の間での相関、標準化、および一致が欠落しているということが、文献に詳細に記載されている。Tobias Geislera et al., Circulation 2010; 122: 1049-1052。加えて、血小板に対するアスピリンの阻害効果は、長期または慢性療法を受けている患者において、時間と共に低下する。Violi, F. et al., J Am Cardio, Vol. 43, No. 6, 2004。

従って、動物由来コラーゲンをアゴニストとして用いない定量的な機能性血小板活性試験が依然として求められている。抗血小板薬に対する血小板応答を測定することができる試験、さらには患者コンプライアンスをモニタリングするための試験も依然として求められている。また、残留血小板活性（患者が抗血小板薬療法を受けている間であっても残っている血小板活性のこと）を測定することのできる試験も求められている。本発明はこのような必要性を満たすものである。

本発明は、個人が抗血小板薬療法を受けている場合に、個人のドナーの抗血小板薬感受性状態を特定するための、合成コラーゲンを用いることを含む試験を提供する。代表的な試験は、例えば、光透過型凝集アッセイ（ＬＴＡＡ）およびフローサイトメトリーを用いる、血小板凝集試験の使用を含む。本発明の試験は、アゴニストとして合成コラーゲンを用いる。インピーダンス凝集および関連する技術を含むその他の試験も考慮される。

本発明の試験および方法は、個人が抗血小板薬を経口摂取した後に個人の血小板が凝集する能力を試験することができる。これらの実施形態において、用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、好ましくは、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

別の実施形態では、本発明は、個人の抗血小板薬感受性状態（高感受性、平均感受性、または非レスポンダーもしくは低感受性であり得る）を特定するための方法を提供する。

本発明はまた、抗血小板療法レジメンでの患者コンプライアンスを試験する方法も提供する。

本発明はまた、患者にとっての抗血小板薬の効果を予測する手助けとなる試験も提供する。

本発明の特定の実施形態は、生物学的コラーゲンを用いる類似のアッセイよりも少なくとも１０００倍少ない量の合成コラーゲンを用いる。

特定の実施形態では、合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有し、ヒトＩ型コラーゲンを模倣する合成コラーゲンである。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含み：

式中、Ｘは、Ｈｙｐを表し；ｎは、２０から５０００の整数を表し；および
ここで、ポリペプチドは、１００００から５０００００の範囲の分子量を有する。特定の実施形態では、ｎ＝２０〜２５０である。

本発明はまた、光透過型アッセイにおいて血小板凝集を試験するためのキットも提供し、合成コラーゲンのバイアル；ならびに本発明の抗血小板薬療法試験（ＡＰＭＴＴ）およびアッセイにおける合成コラーゲンの使用に関する使用説明を含む。

特定の実施形態では（本明細書で述べる方法およびキットを含む）、合成コラーゲンは、ポリプロピレンホモマー容器中にて提供および／または保存される。特定の実施形態では、キャップは、バイアル／チューブと同じ材料である。特定の実施形態では、容器は、追加の内部シール、またはその中に成型された二次シールを持つキャップを有する。特定の実施形態では、容器は、上述のすべての特徴を含有する。

図１は、生物学的コラーゲンで行ったＬＴＡＡの結果を示す。 図２は、合成コラーゲンで行ったＬＴＡＡの結果を提供する。この図は、合成コラーゲンの様々な濃度全体にわたって、正常な応答を示す。 図３は、いくつかの個別の抗血小板薬に応答しての、合成コラーゲンで行った種々のＬＴＡＡの結果を提供する（Ａｇｇｒｅｎｏｘ（登録商標）、Ｉｎｔｅｇｒｅｌｉｎ（登録商標）、およびＲｅｏｐｒｏ（登録商標））。 図４は、ＬＴＡＡで生物由来コラーゲンを用いた場合に得られた結果の変動を示す。図４で実施されたＬＴＡＡはすべて、同じ個人の血小板サンプルに対して、同じ凝集測定装置により、同じ試験手順で実施され、コラーゲンは、同じ業者から入手した。従って、これらの試験における変動は、生物学的コラーゲンにおける変動に起因している。 図４は、ＬＴＡＡで生物由来コラーゲンを用いた場合に得られた結果の変動を示す。図４で実施されたＬＴＡＡはすべて、同じ個人の血小板サンプルに対して、同じ凝集測定装置により、同じ試験手順で実施され、コラーゲンは、同じ業者から入手した。従って、これらの試験における変動は、生物学的コラーゲンにおける変動に起因している。 図４は、ＬＴＡＡで生物由来コラーゲンを用いた場合に得られた結果の変動を示す。図４で実施されたＬＴＡＡはすべて、同じ個人の血小板サンプルに対して、同じ凝集測定装置により、同じ試験手順で実施され、コラーゲンは、同じ業者から入手した。従って、これらの試験における変動は、生物学的コラーゲンにおける変動に起因している。 図５は、フローサイトメトリーで評価した、合成コラーゲンを含む種々のコラーゲン試薬によるクエン酸全血中の血小板の活性化を示す（実施例１参照）。 図６は、フローサイトメトリーで評価した、種々のコラーゲン試薬によるクエン酸全血中の血小板の活性化を示す（実施例１参照）。 図７〜８は、種々の抗血小板薬の抗血小板活性を検出するために合成コラーゲンを用いた試験の結果を示す。これらの試験では、血小板凝集の測定にフローサイトメトリーを用いた。実施例１を参照されたい。 図７〜８は、種々の抗血小板薬の抗血小板活性を検出するために合成コラーゲンを用いた試験の結果を示す。これらの試験では、血小板凝集の測定にフローサイトメトリーを用いた。実施例１を参照されたい。 図９は、アゴニスト誘導血小板凝集に対するチカグレロルの効果を示す。 図１０は、アゴニスト誘導血小板凝集に対するシロスタゾールの効果を示す。 図１１は、アゴニスト誘導血小板凝集に対するアブシキシマブの効果を示す。 図１２は、５および２μｇ／ｍＬの生物学的コラーゲンを示す。Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製凝集測定装置の全血モードを用いた全血に対して血小板凝集を測定する試験では（インピーダンス凝集）、５μｇ／ｍＬでは、生物学的コラーゲンは応答を示している。２μｇ／ｍＬでは、応答を示さない。余談であるが、製造元によって「全血モード」と称される場合であっても、ほとんどの場合、全血は、実際には希釈された全血である（通常、１：１もしくはそれ以上の希釈）。 図１３は、合成コラーゲンは、１００ｎｇ／ｍＬから１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈することができ、それでも、Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製凝集測定装置の全血モードを用いた全血に対して血小板凝集を測定する試験において（インピーダンス凝集）、同じ応答が引き出されることを示す。

本発明は、抗血小板薬療法試験（ＡＰＭＴＴ）を提供する。ＡＰＭＴＴ試験は、異なる合成コラーゲン濃度に基づく独特の定量的機能性試験であり、異なる種類の抗血小板薬に対する患者の応答、ならびに抗血小板薬によって阻害された患者血小板の残留血小板反応性を測定するものである。試験結果は、抗血小板薬に対する患者の応答、ならびに医薬への暴露後に残る残留血小板活性についての情報を医師に提供する。

残留血小板活性は、血小板が抗血小板薬療法に暴露された後の血小板の活性（機能性）である。１００％の血小板を阻害する治療用量というものはない（そのことが所望されることもない）。しかし、これらの非阻害血小板の反応性は、個人の完全な血小板応答およびＭＡＣＥリスクを理解する上で重要な因子である。例えば、抗血小板薬療法が、血小板の８０％を阻害することになる場合（８０％の血小板が凝集せずに保持される）、依然として、極めて活性である場合は血栓性リスクを引き起こす可能性を持ち、または別の選択肢として、血小板が活性ではなく凝集しない場合（従って凝血しない）は出血死のリスクを招く可能性を持つ個人の血小板が２０％存在する。

本発明は、抗血小板薬に対する個人の機能性血小板応答を特定するための方法を提供し、ここで、抗血小板薬は、アスピリンを含まない。抗血小板薬は公知であり、これらに限定されないが、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））、アナグレリド、（Ａｇｒｙｌｉｎ（登録商標））、クロピドグレル二硫酸塩（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））、エプチファバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ（登録商標））、チロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ（登録商標））、ジピリダモール／アスピリン（ＡＳＡ）（Ａｇｇｒｅｎｏｘ（登録商標））、シロスタゾール（Ｐｌｅｔａｌ（登録商標））；ジピリダモール（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ（登録商標））、チカグレロル（Ｂｒｉｌｉｎｔａ（登録商標））、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ（登録商標））、アロキシプリン（アセチルサリチル酸アルミニウム）、カルバサラートカルシウム（アセチルサリチル酸カルシウムと尿素との混合物）、クロリクロメン、クロリンジオン、ジタゾール、インドブフェン、ピコタミド、ラマトロバン、テルボグレル、テルトロバン、およびトリフルサル、ならびにカングレロル、エリノグレル、プラスグレルなどのように様々な開発段階にある類似の薬物に分類されるものが挙げられる。多くの場合、抗血小板薬は、その作用モードに基づいて分類される。例えば、以下の表は、代表的な分類を提供する。

本発明の方法は、個人が抗血小板薬を経口摂取した後に該個人の血小板が凝集する能力を試験することができるものであり、または言い換えると、アゴニストの存在下にて抗血小板薬が血小板凝集を阻害する能力を試験することができるものである。この場合、アゴニストは、合成コラーゲンである。本発明では、光透過型凝集測定アッセイ（ＬＴＡＡ）（多血小板血漿（「ＰＲＰ」）を用いる）；フローサイトメトリー（全血を用いる）；および全血インピーダンス凝集測定法の使用が挙げられるがこれらに限定されない複数の血小板凝集測定方法が用いられてよい。

ＬＴＡＡは、アスピリンに応答する患者の血小板凝集の試験に用いられる従来の（至適標準）アッセイである。本発明者らは、合成コラーゲンを用いることで、抗血小板薬に応答する患者の血小板凝集を、ＬＴＡＡを用いて試験することができることを明らかにした
。本アッセイにおいて、血小板を含有するサンプルを透過した光が、測定され、無血小板血漿標準と比較される。血小板は、通常、溶液中に懸濁されており、それによって、ある量の光を遮断することになる。続いて、物質（すなわち、コラーゲンなどのアゴニスト）が血小板に添加されて血小板の凝集が引き起こされ、サンプルを透過する光が再度測定される。血小板が凝集する場合（凝集塊を形成）、それが懸濁している場合よりも多くの光がサンプルを透過する。血小板凝集の前後での光測定の比較から、どの程度の凝集が発生したのかについての情報が試験者に与えられる。

ほとんどの個人において、種々の抗血小板薬は、血小板凝集の様々な度合いの阻害を引き起こす。このような個人は、平均／正常応答を持つとして、または「低治療血小板反応性」であるとして称される場合がある。しかし、個人の中には、抗血小板薬の標準的用量を服用した後であっても、血小板が依然として凝集し、従って、特定の血小板薬は有益ではなく、血栓性リスクが制御されない、低減されない、または医師に明らかとならないことから、それがむしろ有害である個人も存在する。これらの個人は、多くの場合、非応答性と称される。そのような個人では、医師は、医薬用量の変更、別の種類の薬物の試用、または出血リスクが妥当である場合は抗血小板レジメンへの第二の薬物の追加さえも行う可能性がある。さらには、非常に少ない用量の抗血小板薬であっても、場合によっては命に関わる、または死に至るものとなる出血病変に繋がる可能性のある血小板凝集の強い阻害が引き起こされる個人も存在する。このような個人は、高感受性と称され得る。このような個人にとって、特定の抗血小板薬療法は、出血リスクの上昇のために、得られる有益性よりも害の方が多い場合がある。従って、患者／個人を特定の抗血小板薬に対するその応答について試験して、患者の血小板凝集および残留血小板反応性に対する抗血小板薬の持つ効果を見極め、抗血小板薬療法が望ましくない血小板凝集の予防に有用であるかどうか、または出血、他の薬物療法による干渉、もしくはその他の重篤なリスクのために特定の抗血小板薬療法を避けるべきかどうかを判定することができることが非常に望ましい。

加えて、試験を用いて、処方された抗血小板薬の服用における患者コンプライアンスをモニタリングすることもできる。コンプライアンスとは、医薬を服用すること、および抗血小板薬のリスク低減効果を維持するために、適切な時間に医薬を服用することを意味する。非コンプライアンスは、著しく発生していることが複数の研究において識別されており、患者にとって、非常に高いリスクをもたらす。最近のＭｅｄｓｃａｐｅ誌（７月２５日号）の報告によると、全心臓病患者のうちの半数に上る患者が自身の医薬を服用しておらず、従って、効果的なコンプライアンスモニタリングが、未だ満たされていない重要な医学的必要性であることが確認される。

ＬＴＡＡを用いる本発明の実施形態では、アッセイは、アゴニスト（コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリン、リストセチン、アラキドン酸、トロンビン、およびＴＲＡＰなど）の添加後の多血小板血漿（ＰＲＰ）を通る光透過率の変化から（例：血小板凝集のないサンプルと比較して、血小板凝集が発生したサンプルでは、より多くの光が透過する）、複数の光学パラメーターを定量的に測定する。アゴニストは、多血小板血漿に添加されると、血小板の凝集を引き起こす物質である。本発明において、アゴニストは、合成コラーゲンである。ＬＴＡＡにおいて、ＰＲＰは、通常、キュベット中、３７℃で撹拌され、キュベットは、光路と光電セル（またはソリッドステート検出器）との間に配置される。アゴニストが多血小板血漿（ＰＲＰ）に添加されると、血小板が凝集し、光の吸収が減少し、従って、光透過率が増加し、それが光電セルによって検出される。

ＬＴＡＡは、凝集パターンの形態のデータを作成する。ＬＴＡＡは、ｘ／ｙ格子上にプロットされるパラメーターを作成する。ｘ軸は、通常、直線時間軸である（通常は、分の単位）。ｙ軸は、光透過率に基づく対数スケールである。この光透過率は、凝集パーセント（％）に対応する。

ＬＴＡＡパターンまたは曲線が作成されると（一次データ）、傾き（Ｓａ）；最大凝集；最終凝集；曲線下面積（ＡＵＣ）、傾き下面積（ＡＵＳ）などを含む種々の誘導される尺度が算出される。本発明のある実施形態では、ＡＵＣは、他よりも感受性が高いと思われることから、好ましい尺度の態様である。凝集の傾き（Ｓａ）は、反応が進行する速度の尺度である。希釈プロファイル（ＤＵＰ）は、試験混合物中の反応体濃度の増分変化である。コラーゲン試験において、ＤＵＰは、用いられるコラーゲン試薬の濃度に対する変化から成る。分析において、その他の希釈プロファイルが定められ、用いられてよい。希釈プロファイルの傾き（Ｓｄ）は、一般的に、濃度変化の回帰分析である。反応プロファイルの傾き（Ｓｒ）は、一般的に、希釈の変化に対する反応の変化の回帰分析である。回帰分析は、一次、多項式、またはその他のモデルであってよい。曲線下面積（ＡＵＣ）は、反応の開始から反応の終了までの算出されたグラフ上の量である受信者操作曲線であり、凝集および凝集の傾き（Ｓａ）によって定められる。ＡＵＣパラメーターの使用は、（１又は複数の）ＤＡＰＴアッセイの感受性を高める。これは、反応によって作り出される「パワー」と見なされ得る。加えて、ラグフェイズ（ＬＰ）、脱凝集（ＤＡ）；および最終凝集（ＦＡ）も、用いられてよいその他の読み取り／パラメーターである。

本発明は、合成コラーゲンを用いるものであり、それは、生物学的コラーゲンよりも非常に感受性、効力、予測性、および正確性が高く、さらには希釈が可能であり、そのことによって、従って極めて少ない量の合成コラーゲンの使用が可能となる。合成コラーゲンを用いることで、本発明は、患者が抗血小板薬を経口摂取した後に、患者の血小板が凝集に抵抗する度合いを測定することができる。これは、医師が血栓性または出血リスクを正確に評価し、適切な治療法を決断することを可能とする重要な要素である。さらに、合成コラーゲンは、残留血小板反応性を定量的に評価する手段も提供し、これは、予後リスクの重要な指標であり、従って、血小板阻害と称される現在利用可能である定性的で非常に変動しやすいパラメーターよりも有用な情報である。凝集の阻害が、残留血小板反応性と同じではないことを指摘しておくことは重要である。最近まで、「血小板阻害」は、包括的な用語であり、抗血小板薬に暴露された際の血小板の挙動を理解するためのものとして認められる試験パラメーターであった。凝集パーセントまたは凝集阻害パーセントは、単にそれが血小板凝集を報告する方法であるために採用されたものである。従って、阻害は、単に、患者の元の凝集の結果と治療後の結果との間の相違であった。患者の元の凝集結果が８２％であり、治療後の凝集結果が２３％であった場合、阻害パーセントは、５９％として報告された。この場合、残りの４１％の血小板は阻害されなかったと仮定された。目標は、６０から８０％までの間の阻害パーセントを得ることであり、それは患者が凝血も出血も起こさないことを意味するからである（理想的な予後）。しかし、この単純過ぎる構成または理解は、すべての状況を物語るものではなく、従って、残留血小板反応性（すなわち、経口摂取された医薬に対して応答しなかった血小板の反応性）を理解する手助けには全くならないことから、役に立たないことがここで明らかとなった。単に、阻害パーセントと残留血小板反応性との間の測定可能または予測可能である直接の関係性は存在しないということである。

医師は、患者が同じ阻害パーセントを共有していたとしても、種々の治療に対する患者の予後が変動することを見出した。例えば、ＬＴＡにおいて４１パーセント阻害を示す（従って、５９％の凝集を有する）２人の患者は、非常に異なって応答する可能性がある（一方は、望ましくない凝血の問題を依然として有し、他方は、出血の問題を有するという可能性がある）。この観察結果により、阻害パーセントの数値（残留または非阻害血小板の数）が同一であり得るとしても、患者の応答は非常に異なり得るものであるということが次第に認識されてきた。このことから、最近、機能亢進および機能低下、ハイパーおよびハイポレスポンダー、血小板反応性、残留血小板反応性、ならびに高治療血小板反応性、などの用語が使用されるようになってきた。

重要なことは、阻害パーセントが残留血小板反応性と同じものではないということである。血小板応答が、血小板機能に対する攻撃の測定可能な効果、すなわち、特定の薬物が血小板機能経路へどの程度干渉するかということであることは明らかである（血小板および代謝の遺伝的性質、薬物の作用および薬物動態、ならびにその他の因子のすべてが、残留血小板反応性に関与している）。本発明は、残留血小板反応性を測定することができ、それは、２つの事項を組み合わせて、基本的には単一の測定値にまとめたものである。第一のコンポーネントは、主薬物（例：抗血小板薬）に基づく用量応答であり、その薬物および用量に対する特定の患者の個々の応答に基づいて、部分的機能性または非機能性とされた患者の血小板の割合を示すものである。第二のコンポーネントは、残りの血小板の反応性の程度に関する。これらの血小板は、阻害された血小板と同様に、異なる医薬に対して、機能亢進、機能低下、または連続的に続くこれら２つの点の間のどこかであり得る。

１つの態様では、合成コラーゲンは、抗血小板薬に暴露された後の血小板の残留活性を試験する濃度で用いられる。

この態様では、合成コラーゲンの濃度は、約２．０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ、または約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬから約２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度である。濃度は、約８ｎｇ／ｍＬ、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、．．．．４９０、４９５ｎｇ／ｍＬ、および５００ｎｇ／ｍＬを含む値までであってよい。

個人が抗血小板薬を摂取した後に発生する血小板凝集には範囲が存在し、このような範囲を用いて、抗血小板薬に対して高感受性応答、正常／平均応答、または非応答を有するとして個人を特徴付けることができる。特定の抗血小板薬に対する応答は個人によって異なり、従って、本発明は、抗血小板薬に対する応答、ならびに残留血小板反応性を測定する方法を提供する。個人が医薬に対して所望されるような応答を示さない場合、医師は次に、用量の変更、異なる抗血小板薬の処方、または第二の抗血小板薬もしくは低用量アスピリンレジメンの追加さえも行い得る。

本発明はまた、合成コラーゲンの再現性および感受性、ならびにある範囲の濃度にわたって再現可能に希釈されるその能力を利用する実施形態も提供し、従って、合成コラーゲンの複数の希釈を用いて（本明細書にて「希釈プロファイル」と称される）、個人が抗血小板薬に対して感受性であるかどうかを医師が判断することだけでなく、個人の抗血小板薬感受性状態（例：個人が抗血小板薬感受性であるか、非応答性であるか、または高感受性である度合い）をさらに理解することの手助けとなる。希釈プロファイルは、図として表示される場合、独特の形状および変化を有し、これはさらに、ＥＫＧ（心電図）に非常に類似して、迅速な画像評価が可能である。

この情報は、処方された治療レジメンにおける抗血小板薬および／またはアスピリンの適切な用量を、または場合によっては第二もしくは第三の治療薬が必要であるかどうかを、または抗血小板薬の使用を完全に断念して別の選択肢としての治療法を考慮すべきかどうかを医師が判断するために有用であり得る。また、それにより、経時での薬物の効果および患者コンプライアンスを医師がモニタリングすることも可能となる。アスピリンなどの特定の薬物の効果は、慢性的に用いられる場合、経時で低下する。これも、合成コラーゲンを用いる本発明の方法を用いて定期的なモニタリング試験を行うもう１つの理由である。

合成コラーゲンの感受性をさらに利用し、希釈プロファイルの概念をさらに用いることで、本発明はまた、個人が抗血小板薬を経口摂取する前であっても、個人の抗血小板薬感受性を予測することができる実施形態も提供する。抗血小板薬の非レスポンダー（抵抗性）個人は、合成コラーゲンの種々の濃度にわたって実施されるＬＴＡＡに対して独特の応答を有し（本明細書にて「跳ね返り」と称される）、それを用いて、抗血小板薬に対する個人の応答を診断することができる。この、およびその他の実施形態は、本明細書にて以降でより詳細に考察する。

上述のように、ＬＴＡＡは、多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いるものであり、これは、適切に抗凝固剤処置された全血から調製される。個人の血液が回収され、遠心沈殿されてＰＲＰが得られる。血小板は、非常に感受性が高く、ＰＲＰの調製の過程で容易に活性化され得ることから、個人の血液は、通常、特定の凝固剤を含有するチューブ中に回収される。例えば、静脈血液は、３．２％クエン酸ナトリウム中に、１：９の比率（９部の血液に対して１部の抗凝固剤）で採取、回収される。全血サンプルは、回収から４時間以内に処理されるべきであり、血小板を冷却すると、活性化して、誤った試験結果に繋がりかねないことから、血小板凝集試験用の血液サンプルは、室温で保存される必要がある。ＰＲＰは、通常、２０℃、１５０〜２００ｇにて１０〜１５分間の遠心分離によって調製される。ＰＲＰは、注意深く取り出され、キャップ付きプラスチックチューブに投入される。ＰＲＰは、室温で保存されなければならない。

次に、少血小板血漿（ＰＰＰ）を、残りの血漿を２７００ｇで１５分間さらに遠心分離することによって調製することができる。少血小板血漿（ＰＰＰ）は、血小板やその他の細胞物質を含有しておらず、ＬＴＡサンプル分析においてブランクとして用いられることが多い。特定の実施形態では、血小板機能遠心分離機またはＰＤＱ（登録商標）と称される、典型的な４５〜６０分間ではなく、約５分間でＰＲＰおよびＰＰＰを作製することができる特殊な遠心分離機が用いられる。これによって、救急および救命治療の状況または高処理量の臨床状況において、ＬＴＡＡがさらにより実用的となる。迅速なサンプル調製に加えて、合成コラーゲンの特定の濃度の使用を用いることにより、救急時に患者の包括的残留血小板反応性を得ることも可能である。

ＰＲＰに血小板アゴニストを添加することは、通常は、血小板の活性化に繋がり、円盤形状からトゲのある球形状へのその形状の変化が引き起こされ、それは、一過性の光学密度の上昇を伴う。その例外は、形状変化を起こさないエピネフリン、および凝集ではなく血小板膠着を引き起こす、すなわち、フィブリノーゲンの結合が存在しないリストセチンである。アゴニストは、通常、強アゴニストまたは弱アゴニストに分類される。例として、強アゴニスト（例：コラーゲン、トロンビン、ＴＲＡＰ、高濃度ＡＤＰ、およびＵ４６６１９（ＴｘＡ２の類似体））は、血小板凝集、ＴｘＡ２合成、および血小板顆粒分泌を直接誘導する。弱アゴニスト（例：低濃度ＡＤＰおよびエピネフリン）は、分泌を誘導することなく、血小板凝集を誘導する。

一般的に、ＬＴＡは、３７℃で実施される。凝集測定装置の較正は：１）光透過率０％に対応するＰＲＰ含有キュベット；および２）光透過率１００％に対応するＰＰＰ含有の第二キュベットによって行われる。血小板は、通常、活性化され（アゴニストによって−化学的または物理的に）、互いに接触する場合にのみ凝集することから、試験の実施中は、撹拌する必要がある。撹拌を行わない場合、凝集が起こらないか、または少なくとも大きく減少し、誤った試験結果を生み出す。

本発明は、光透過型凝集測定アッセイ（「ＬＴＡＡ」）を含む血小板凝集試験において、生物源から得られるコラーゲンの代わりに、合成コラーゲンをアゴニストとして用いる
。合成コラーゲンの使用により、生物学的コラーゲンの使用と比較した多くの予想外な有益性が提供され、それらは本明細書に記載される。

特定の実施形態では、ＬＴＡＡを用いて血小板凝集を測定する本発明の試験において、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社のＰＡＰ ８Ｅ光透過型凝集測定装置が使用される（米国特許第７，４５３，５５５号参照）。

通常は、血小板自然凝集（spontaneous platelet aggregation：「ＳＰＡ」）についての試験が実施される。ＳＰＡは、健康な個人では稀であるが、機能亢進性血小板を持つ人で見られ、一部の血栓形成促進性状態、フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）の一部のケース、一部の糖尿病患者、一部の脂質障害、および様々なその他の障害についての独立したマーカーとしても認識されている。ＳＰＡの存在は、未希釈のＰＲＰを凝集測定装置中に配置し、１５分間撹拌することによって試験することができる。ＳＰＡの場合、ＰＲＰをＰＰＰまたは生理食塩水で希釈することでこれが破壊され得るものであり、血小板数が＞２００×１０^９／Ｌに維持されている場合は、凝集試験を進めてよい。

一般的に、約２２５μＬのＰＲＰが、凝集測定用試験キュベットに添加され、３７℃に加温される。次に、２５μＬのアゴニストが添加され、応答が記録される。記録される典型的な読み取りまたは応答としては、一次凝集（「ＰＡ」）（通常は凝集量を示す値を提供する）、一次傾き（「ＰＳ」）（通常は凝集速度に関連する値を提供する）、および曲線下面積（「ＡＵＣ」）（一般的にはＰＡとＰＳとの組み合わせに関連する値を提供する）、ラグフェイズ、脱凝集、および最終凝集が挙げられる。本技術分野で用いられる凝集測定装置は、通常、これらの読み取りの一部またはすべてを、凝集のグラフ画像と共に提供する。各凝集測定装置またはシステムは、これらの値を少し異なった形で算出し、システムソフトウェアに埋め込まれた固有の式を用いる場合がある。

例えば、最大凝集％は、ベースライン［凝集０％‐多血小板血漿］と少血小板血漿［凝集１００％］との間の長さ［Ｙ］を測定し、この数値を最大凝集［Ｘ］で除することによって算出され得る。従って、Ｙ＝１００ｍｍおよびＸ＝８９ｍｍの場合は、最大凝集パーセント＝Ｘ／Ｙ＝８９％である。

複数の血小板凝集アッセイを用いる本発明の実施形態では、同じ種類の凝集アッセイが用いられることが好ましい。例えば、第一の試験が、多血小板血漿およびＬＴＡＡで血小板凝集を測定する場合、これに続く各試験も、同じＬＴＡＡを用いて血小板凝集を測定することが好ましい。同様に、第一の試験が、全血およびフローサイトメトリーを用いて血小板凝集を測定する場合、これに続く各試験も、フローサイトメトリーを用いて血小板凝集を測定することが好ましい。

Ａ１．個人の抗血小板薬に対する血小板感受性に関する試験（医薬前および後の読み取りを用いる）
本発明の１つの実施形態は、抗血小板薬に対する個人の血小板感受性を特定することができるアッセイを提供する。これは、ＬＴＡＡまたはフローサイトメトリーの使用などの１つ以上の血小板凝集アッセイを実施して凝集を測定することを含み、ここで、第一の多血小板または全血サンプルが個人から採取され、合成コラーゲンと混合されて、第一の処理サンプルが形成される。この実施形態および本出願中に記載されるその他の実施形態で用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約
１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、合成コラーゲンの量は、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約２ｎｇ／ｍＬである。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

第一の処理サンプルでは、個人は、約２４時間、好ましくは７２〜９６時間にわたって抗血小板薬を経口摂取していない。この趣旨は、個人が、血小板凝集試験に影響を与える抗血小板薬を自身の系内にまったく有していないことを確実にすることである。このサンプルが、血小板凝集について測定され、経口摂取抗血小板薬の非存在下における個人のベースラインレベルを特定するための第一の読み取りが得られる。

特定の実施形態では、初期血小板凝集アッセイが、自然凝集について確認し、血小板が固有の機能亢進を有するかどうかについて試験するために実施されてよい。合成コラーゲンの代わりに生理食塩水がＬＴＡＡに添加され、なんらかの凝集が発生するかどうかが調べられる。

続いて、個人に抗血小板薬が投与され、抗血小板薬を代謝させるのに充分な時間（例：少なくとも約２時間から約１６時間）が経過した後、第二の多血小板血漿サンプルまたは全血サンプルが個人から採取される。第二の多血小板血漿サンプルまたは全血サンプルに対して、これを合成コラーゲンで処理して第二の処理サンプルを形成することにより、血小板凝集アッセイが実施される。サンプルの測定が行われ、第二の読み取りが得られる。

プロセス全体を通して同じ種類の血小板凝集アッセイが用いられることが好ましい。例えば、ＬＴＡＡが第一の処理サンプルに用いられる場合、好ましくは、第二の処理サンプルにもＬＴＡＡが用いられる。

経口摂取抗血小板薬なしでの血小板凝集のベースラインレベルの読み取りが、第二の処理サンプルの読み取り（抗血小板薬経口摂取後に得られる）と比較され、この比較の結果から、個人の抗血小板薬応答状態が特定される。例えば、個人が、ベースラインサンプルと比較して、抗血小板薬経口摂取後に（第二のサンプルにおいて）血小板凝集の著しい低下を示す場合、個人は、正常または平均抗血小板薬感受性を持つとして特徴付けられ得る。個人が、抗血小板薬服用後において血小板凝集にほとんど違いを示さない場合（すなわち、個人が抗血小板薬を経口摂取した後も、血小板は依然として凝集を起こした）、個人は、抗血小板薬に対して非応答性であるとして特徴付けられ得る。個人が、抗血小板薬の経口摂取後に、血小板凝集のほとんど完全な欠如を示した場合、個人は、抗血小板薬に対して高感受性であるとして特徴付けられ得るものであり、これはそれ自体、患者にとって非常に高リスクの状態である（出血リスク）。

血小板凝集の測定にＬＴＡＡを用いる場合、ＬＴＡＡからの読み取りは、好ましくは、曲線下面積、傾き、一次凝集、ラグフェイズ（ＬＰ）、脱凝集（ＤＡ）、最終凝集（ＦＡ）、またはこれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、好ましい読み取りは、曲線下面積である。

例えば、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社のＰＡＰ ８Ｅ凝集測定装置を用いる場合、および抗血小板薬高感受性個人に対して、５０ｎｇ／ｍＬの合成コラーゲン「試験内」濃度を用いる場合、ＰＡに対するベースラインは、５０％から１００％の範囲である。ＰＳに対するベースラインは、２５から６０の範囲である。ＡＵＣに対するベースラインは、３００から８００の範囲である。抗血小板薬後、ＡＵＣは、１００から４００の範囲となる。ＰＳおよ
びＰＡは、それぞれのベースラインと比較して異なる。これらの値は、患者が服用している実際の抗血小板薬に応じて異なる。抗血小板薬感受性および抗血小板薬非レスポンダーは、ベースラインとの相違を示し；感受性個人は、より少ない凝集を示す。特定の実施形態では、このデータを、医師にとって有用である利用可能な形態へと組み合わせ、分類するアルゴリズムが用いられ得る。

別の実施形態では、ベースライン読み取りの取得は行われない。この状況では、必須ではないが、個人が抗血小板薬療法を開始する前にこの個人に対して実施された過去の試験をベースライン読み取りとして用いることが望ましい場合がある。ベースラインが取得されない状況では、アッセイは、１つ以上の血小板凝集アッセイを実施することを含み、ここで、第一の多血小板サンプルまたは全血サンプルが個人から採取され、これが合成コラーゲンと混合されて処理サンプルが形成される。サンプルの測定が行われ、個人の血小板凝集レベルを特定するための読み取りが得られる。特定の実施形態では、自然凝集の確認のために、初期血小板凝集アッセイが実施されてよい。この処理サンプルの結果を用いて、個人の抗血小板薬応答状態が特定される。例えば、個人が、血小板凝集の著しい低下を示す場合、個人は、正常または平均抗血小板薬感受性を持つとして特徴付けられ得る。個人が、抗血小板薬服用後において血小板凝集の阻害をほとんど示さない場合（すなわち、個人が抗血小板薬を経口摂取した後も、血小板は依然として凝集を起こした）、個人は、抗血小板薬に対して非応答性であるとして特徴付けられ得る（血栓性または凝血リスク）。個人が、抗血小板薬の経口摂取後に、血小板凝集のほとんど完全な欠如を示した場合、個人は、抗血小板薬に対して高感受性であるとして特徴付けられ得る（出血リスク）。いずれも命に関わるものである。

血小板凝集がＬＴＡＡを用いる場合、読み取りは、曲線下面積、傾き、一次凝集、ラグフェイズ（ＬＰ）、脱凝集（ＤＡ）、最終凝集（ＦＡ）、またはこれらの組み合わせであり得る。ＮＡＲＸ数学分析またはその他の計算モデルで得られるものなどの追加の分析方法が用いられてよい。個人を高感受性、非レスポンダー、または正常として分類するためのカットオフ値を特定するために、代表する数のアッセイを異なる患者グループに対して実施することにより、別々の各医薬における種々の異なる読み取り（すなわち、ＰＡ、ＰＳ、またはＡＵＣ）に対する基準値および／または確立されたカットオフ値が得られ得る。従って、本発明のアッセイにおいて、個人の血小板感受性状態の特定は、その個人自身のベースラインまたは過去のＬＴＡＡの結果に対しての比較を含んでよく、および／または確立された値に対する比較を含んでよい。さらに、本発明で用いられる希釈プロファイルも、ＥＫＧ（心電図）の読み取りに類似する方法で、視覚的に分析されてよい。

Ａ２．個人の抗血小板薬に対する血小板感受性に関する試験（医薬後読み取り−ベースラインなし）
ベースライン（抗血小板薬前ベースライン）を取得することが実行可能ではない場合、または抗血小板薬療法を受けてきたか、もしくは自身の抗血小板薬の服用を順守してきたかどうかを患者から判断することができない場合のような救急の臨床状況などの特定の状況では、個人の血小板感受性を調べる試験を持つことが望ましい場合がある。例えば、患者が抗血小板薬を受けていることが疑われ得るが、患者の状況のためにその事実を確認可能ではない場合があり、本発明の実施形態を用いて、出血のリスクが関与する可能性のある他の医療手順へ進む前に、血小板活性についての試験が行われ得る。

この実施形態および本出願中に記載されるその他の実施形態で用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約
５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、合成コラーゲンの量は、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約２ｎｇ／ｍＬである。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

特定の実施形態では、初期血小板凝集アッセイが、自然凝集について確認し、血小板が固有の機能亢進を有するかどうかについて試験するために実施されてよい。合成コラーゲンの代わりに生理食塩水がＬＴＡＡに添加され、なんらかの凝集が発生するかどうかが調べられる。

特定の実施形態では、好ましくは、多血小板サンプルが患者から採取され、合成コラーゲンで処理される。次に、このサンプルが分析されて、読み取りが得られる。この読み取りが分析されて、患者の血小板反応性状態および血液凝固性合併症または出血性合併症の潜在的リスクが特定され得る。この分析は、過去に正常、ハイパーレスポンダー、または非レスポンダーとして特徴付けられた読み取りに対する比較を含み得る。例えば、正常／健康血小板凝集応答（例：合成コラーゲンの存在下にて、健全な量の血小板凝集阻害が存在する）；非レスポンダー、従って凝血リスク（完全な、または急速で長時間持続する凝集応答−例：血小板凝集の阻害が、ほとんど、またはまったく起こらない）、または高感受性レスポンダー、従って出血リスク（正常応答と比較して、合成コラーゲンの存在下での血小板凝集が少ない）。

血小板凝集（または血小板凝集の阻害）の測定にＬＴＡＡを用いる場合、ＬＴＡＡからの読み取りは、好ましくは、曲線下面積、傾き、一次凝集、ラグフェイズ（ＬＰ）、脱凝集（ＤＡ）、最終凝集（ＦＡ）、またはこれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、好ましい読み取りは、曲線下面積である。

例えば、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社のＰＡＰ ８Ｅ凝集測定装置を用いる場合、および抗血小板薬高感受性個人に対して、５０ｎｇ／ｍＬの合成コラーゲン「試験内」濃度を用いる場合、ＰＡに対するベースラインは、５０％から１００％の範囲である。ＰＳに対するベースラインは、２５から６０の範囲である。ＡＵＣに対するベースラインは、３００から８００の範囲である。抗血小板薬後、ＡＵＣは、１００から４００の範囲となる。ＰＳおよびＰＡは、それぞれのベースラインと比較して異なる。これらの値は、患者が服用している実際の抗血小板薬に応じて異なる。抗血小板薬感受性および抗血小板薬非レスポンダーは、ベースラインとの相違を示し；感受性個人は、より少ない凝集を示す。特定の実施形態では、このデータを、医師にとって有用である利用可能な形態へと組み合わせ、分類するアルゴリズムが用いられてよい。

Ｂ．個人の抗血小板薬に対する血小板感受性に関する希釈プロファイルを用いた試験
Ｂ１．抗血小板薬の経口摂取前および後の希釈プロファイル
別の実施形態では、個人のＰＲＰまたは全血サンプルに対して実施されたＬＴＡＡなどの複数の異なる血小板凝集アッセイ全体にわたって、合成コラーゲンの希釈プロファイルが用いられる。本発明のこの実施形態では、３つ以上の反応（抗血小板薬経口摂取前のベースライン試験だけでなく、抗血小板薬経口摂取後の試験も）が実施される。一連の血小板凝集アッセイは、複数の異なる量の合成コラーゲンを用いて実施される。これは、本明細書にて、「希釈プロファイル血小板凝集アッセイ」または「希釈プロファイルＬＴＡＡ」または「希釈プロファイル」と称される。本実施形態では、複数の異なるＰＲＰまたは全血サンプルが、抗血小板薬経口摂取前（ベースライン希釈プロファイルを得るために）
、および抗血小板薬経口摂取後（抗血小板薬後希釈プロファイルを得るために）に、個人から採取される。各個人の抗血小板薬前血小板サンプルは、異なる量の合成コラーゲンと混合され（２ｎｇ／ｍＬから５００ｎｇ／ｍＬの範囲）、各サンプルに対して血小板凝集アッセイが実施されて、濃度範囲全体にわたるベースライン希釈プロファイルが得られる。次に、個人に抗血小板薬が投与され、確実に抗血小板薬が代謝されるように充分な時間を経過させる。続いて、複数のＰＲＰまたは全血サンプルが、抗血小板薬経口摂取後の個人から採取され、異なる量の合成コラーゲンと混合される。各サンプルに対して血小板凝集試験が実施されて、抗血小板薬後希釈プロファイルが得られる。抗血小板薬前ベースライン血小板凝集アッセイで用いられたものと同じ合成コラーゲン濃度が、抗血小板薬後血小板凝集アッセイで用いられることが好ましい。結果が分析され、抗血小板薬前および抗血小板薬後アッセイの間での血小板凝集の変化、ならびに希釈プロファイルにおける合成コラーゲンの異なる量全体にわたって発生する変化が調べられ、個人の抗血小板薬感受性応答（個人が、抗血小板薬高感受性、平均抗血小板薬感受性、または抗血小板薬非応答性であるかどうか、およびその中での感受性の度合い）が特定される。特定の実施形態では、抗血小板薬前ＬＴＡＡおよび抗血小板薬後ＬＴＡＡの間でのＰＡ、ＰＳ、ＡＵＣ、ＬＰ、ＤＡ、ＦＡ、またはこれらの組み合わせの変化、ならびに合成コラーゲンの異なる量全体にわたるＰＡ、ＰＳ、もしくはＡＵＣ、またはこれらの組み合わせの変化が調べられ（多くの場合、データまたは情報を分類してデータの報告を行うアルゴリズムが用いられる）、個人の抗血小板薬感受性応答（個人が、抗血小板薬高感受性、平均抗血小板薬感受性、または抗血小板薬非応答性であるかどうか、およびその中での感受性の度合い）が特定される。特定の実施形態では、結果は、システムソフトウェア中に埋め込まれた凝集測定装置所有のアルゴリズムを用いて特徴付けられ、これよって、分析は、診断医が試験結果を理解することがより容易であり、従って適切な臨床的判断を下すことがより容易であるものとなる。

この実施形態および本出願中に記載されるその他の実施形態で用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、合成コラーゲンの量は、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約２．０ｎｇ／ｍＬである。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

Ｂ２．抗血小板薬の経口摂取後のみの希釈プロファイル（ベースラインは希釈プロファイルが関与せず）
他の実施形態では、抗血小板薬前ベースラインは、１つの合成コラーゲンの濃度（５０ｎｇ／ｍＬなどであるがこれに限定されない）を用いて個人の抗血小板薬前血小板サンプルに対して実施された１つの血小板凝集アッセイによって確立され、一方抗血小板薬後希釈プロファイルの作製には、異なる抗血小板薬後血小板凝集アッセイにおいて、合成コラーゲンの複数の異なる濃度が依然として用いられる（２．０ｎｇ／ｍＬ；８ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ；３２ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、および／または５００ｎｇ／ｍＬなどであるがこれらに限定されない）。この場合、結果が分析され、異なる量の合成コラーゲンでの血小板凝集の変化が調べられ、互いに対して、ならびにベースライン（抗血小板薬前）に対して比較されて、ドナーの抗血小板薬感受性応答（抗血小板薬高感受性、正常／平均抗血小板薬感受性、また
は抗血小板薬非応答性であるかどうか、およびその中での感受性の度合い）が特定される。血小板凝集アッセイがＬＴＡＡである場合、血小板凝集試験結果の評価および比較のための読み取りとして、ＰＡ、ＰＳ、ＡＵＣ、ＬＰ、ＤＡ、ＦＡ、またはこれらの組み合わせが用いられる。

他の実施形態では、抗血小板薬前ベースラインまたは抗血小板薬後希釈プロファイルは取得されない。これは、抗血小板薬前ベースラインを取得することが実行可能ではない場合、または抗血小板薬療法を受けてきたかどうかを患者から判断することができない場合のような救急の臨床状況において有用であり得る。本実施形態では、複数の異なる多血小板血漿サンプルまたは全血サンプルが個人から採取され、各々が独立して、異なる濃度の合成コラーゲンと混合されて、希釈プロファイルアッセイのための複数の異なる処理サンプルが得られる。血小板凝集アッセイが、これらのサンプルの各々について実施され、合成コラーゲンの異なる濃度範囲全体にわたる希釈プロファイルが得られる。データが取得され、評価される。例えば、血小板凝集アッセイがＬＴＡＡである場合、ＡＵＣ、ＰＡ、ＰＳ、ＬＰ、ＤＡ、ＦＡ、またはこれらの組み合わせが得られ、合成コラーゲンの異なる範囲全体にわたって分析される。特定の実施形態では、結果は、システムソフトウェア中に埋め込まれた凝集測定装置所有のアルゴリズムを用いて分析される。

発明者らは、本実施形態を用いて、個人の血小板抗血小板薬応答を予測することができることを明らかにした。平均または「正常」抗血小板薬感受性を有する個人の場合、傾き、凝集パーセント、および／またはＡＵＣを希釈プロファイル全体にわたって調べると、傾き、凝集パーセント、および／またはＡＵＣは、用いられた合成コラーゲンの量の減少に沿った、それに対応しての減少を示している。従って、例えば、合成コラーゲンの種々の希釈の任意の範囲内では、濃度が低下するに従って、傾き、凝集パーセント、およびＡＵＣも減少する。合成コラーゲンの濃度とほぼ平行して進行するか、またはほぼ直接の相関を有して、傾き、凝集パーセント、およびＡＵＣがほぼ直線的に減少していると思われる。他方、抗血小板薬非レスポンダーである個人の場合、合成コラーゲンの減少に対応して直線的に減少する傾き、凝集パーセント、および／またはＡＵＣを有する代わりに、希釈プロファイルに沿って、傾きの増加、予想外の一時的な凝集パーセントの増加、および／またはＡＵＣの一時的な増加が見られる地点が、（合成コラーゲンの濃度が減少することから）減少するべきところで存在する。そして、希釈プロファイルが継続して減少するに従って、傾きおよびＡＵＣは、それがあるべきところへ（合成コラーゲンの希釈に基づいて）、および一時的な増加を見せる前にあったところへ、「跳ね返って戻り」、そして減少を続ける。跳ね返りが発生する地点は、合成コラーゲンの異なる濃度であり、医薬の種類および用量、ならびに患者の代謝および血小板受容体の遺伝的特徴に依存する。

抗血小板薬高感受性の個人は、参照範囲と称される場合もある期待される／正常な結果と比較して、ＰＡ、ＰＳ、およびＡＵＣの増加を示す。

希釈プロファイルの概念を用いる本発明の特定の実施形態では、一連の７、６、または５つの異なる濃度が希釈プロファイルの作製に用いられ、他の実施形態では、４つの異なる濃度が用いられ、さらに他の実施形態では、３または２つの異なる濃度が用いられる。用いる異なる濃度が多過ぎると、試験が煩雑で時間の掛かるものとなりかねず、一方用いる濃度が少な過ぎると、得られるデータの量が少なくなり、感受性分析が制限される。患者の薬物療法の個別化には、多くの異なる濃度を用いることが有用である可能性が高く、一方患者の迅速な、もしくは救急のスクリーニング、または心臓カテーテルもしくは直視下心臓手術などの手技の直前の場合は、１もしくは２つだけの異なる血小板凝集アッセイが実施されることになる可能性が高い。試験キットは、現場での希釈誤差を排除するために、および試験の実施をさらに簡便化するために、希釈剤を予め充填したバイアルを有していてよい。

用いられる合成コラーゲンの範囲は、希釈プロファイルであり、好ましくは、「抗血小板薬感受性範囲」内であり、これは、平均抗血小板薬感受性個人において、測定される血小板活性／凝集が、合成コラーゲン濃度の量の減少に対応して低下する（例：ＡＵＣおよび／または傾きがコラーゲンの濃度と共に減少する）濃度範囲として本明細書で定義される。

特定の実施形態において、異なる合成コラーゲン希釈量は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から選択される複数の異なる合成コラーゲン量を含む。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

例えば、特定の実施形態では、以下の通りの７つの異なる合成コラーゲン量が、最終「試験内」濃度として存在する：５００ｎｇ／ｍＬ；３２５ｎｇ／ｍＬ；２５０ｎｇ／ｍＬ；１５０ｎｇ／ｍＬ；１００ｎｇ／ｍＬ；７５ｎｇ／ｍＬ；および５０ｎｇ／ｍＬ。他の実施形態では、８ｎｇ／ｍＬから２５０ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる合成コラーゲン量（２、３、４、５、６、または７つの異なる希釈）が存在する。希釈プロファイル濃度のために選択される希釈量において、約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬより選択されるいかなる数値が用いられてもよい。例えば、１つの７希釈プロファイルでは、選択される量は、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、および１７５ｎｇ／ｍＬである。別の限定されない例では、選択される７希釈プロファイルは、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、および３００ｎｇ／ｍＬである。別の限定されない例としては、選択される７希釈プロファイルは、５０、１００、１５０、２２５、３００、３５０、および５００ｎｇ／ｍＬである。この趣旨は、２５から５００までのいかなる数値が選択されてもよいということであり、好ましくは、プロファイル中の異なる濃度は、その範囲全体にわたって広がっている。２、３、４、５、または６つの異なる希釈が用いられる場合も同じである。本明細書にて範囲が列挙される場合、用いられてよいすべての考えられる希釈を列挙することが煩雑過ぎることから、それは、その範囲の最初と最後の数値を含むその範囲内に含まれるすべての数値を含むことを意味する。

Ｃ．患者コンプライアンスの試験
本発明の別の実施形態では、合成コラーゲンによる上記で考察したアッセイを用いて、処方された用量の抗血小板薬の服用における患者コンプライアンス、ならびに残留血小板活性を試験／モニタリングする方法が提供される。非コンプライアンスとしては、医薬を服用しないこと、適切な用量を服用しないこと、または有効投与（時間）ウィンドウに従わないことが挙げられる。最近の研究から、患者の非コンプライアンスが、医療における大きな問題であることが示された。以前は薬物耐性と見なされていたものが、そうではなく、抗血小板薬に対する血小板阻害応答を評価するために複数の標準化されていない実験室試験を用いることによって複雑化された非コンプライアンスの顕在化であり得ると現在では考えられている。

従って、コンプライアンスを評価するために、患者は、週１回、月２回、月１回、３か月に１回など定期的に試験され、その結果が互いに対して比較されてよい。凝集の結果が
試験ごとに大きく変動する場合、患者はさらに試験されて、抗血小板耐性（抗血小板薬に対する耐性）が発達したかどうかが特定されてよく、または患者は、医薬の処方された用量の服用および投与スケジュールの順守における自身のコンプライアンスについて質問されてもよい。凝集試験は、試験ごとの変動性を示す場合があり、この変動性は、患者が処方された定期的な投与レジメンに従っていなかったことの指標として用いることが可能である（用量を毎日は服用していないか、または一日の異なる時間に用量を服用している）。患者が、アスピリンおよび抗血小板薬による二重療法、または場合によっては、異なる抗血小板薬によるレジメンを受けるべきであるかどうかを判断するために、さらなる試験が実施されてよい。

方法は、患者からＰＲＰまたは全血サンプルを採取すること、および上述のアッセイにおいて、合成コラーゲンの存在下での血小板凝集について試験することを含む。血小板凝集アッセイの結果は、その患者について得られた以前の結果に対して比較される。結果が過去の結果と類似する場合、患者が治療法を順守してきたものと判断され得る。結果が異なるか、または大きく変動する場合、コンプライアンス、または医薬に対する耐性の発達が問題であり得る。例えば、以前の結果が、患者が特定のレベルの血小板凝集を有することを示し、その後の試験が、血小板凝集の増加を示した場合、それは、患者が抗血小板薬を服用してこなかったか、または耐性を発達させたということであり得る。

過去の試験との比較が有効となるように、経時でのコンプライアンス試験には、同じレベルの合成コラーゲンが用いられることが好ましい。加えて、同じ理由で、血小板凝集を測定する同じ方法（例：ＬＴＡＡ）および同じ読み取り（例：曲線下面積）が比較される。経時での患者の試験結果の間には、僅かな変動が存在する可能性があるが、試験間の著しい相違は、非コンプライアンスまたは抵抗性の有望な指標として見なされるべきである（すなわち、試験が、過去の試験よりも著しく多い血小板凝集を示した）。場合によっては、患者は、自身の自由意志でアスピリンの服用を開始した可能性があり、試験結果が過去の試験と比較して少ない血小板凝集を示した場合、患者は、アスピリンについての質問を受け、出血リスクが存在するか、または増加する可能性があると医師が考えた場合、そのような一連の行動を止めるように忠告を受け得る。

この実施形態および本出願中に記載されるその他の実施形態で用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、合成コラーゲンの量は、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも２ｎｇ／ｍＬである。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

Ｄ．抗血小板薬の効果の予測
さらに、本発明はまた、血小板活性に対する抗血小板薬の影響を試験することができ、従って特定のまたは個別の患者に対する抗血小板薬の効果を医師が予測する補助とすることができるアッセイも提供する。実施例２を参照されたい。従って、医師が患者に抗血小板薬を開始することを考慮していた場合、患者のＰＲＰまたは全血サンプルが採取され、抗血小板薬で処理されてよい。合成コラーゲンの添加後、血小板凝集が調べられる。血小板凝集のレベルが許容されるものであると判断される場合、医師は、その医薬を処方して
よい。または、血小板凝集のレベルが許容されないものであった場合、医師は、異なる抗血小板薬または医薬の組み合わせを試験し、処方してよい。特定の実施形態では、医師は、凝集の結果を、同じ抗血小板薬が処方され、有益であると判断された過去の患者の結果に対して比較して、この抗血小板薬がこの特定の患者にとって有益であるかどうかを予測する補助としてよい。

これらの実施形態では、用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、アゴニスト（合成コラーゲン）の存在下で血小板が凝集する能力を試験するものである。この実施形態および本出願中に記載されるその他の実施形態で用いられる合成コラーゲンの最終試験内濃度は、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；８ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約１５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約２０ｎｇ／ｍＬから；約２５ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬから約３００ｎｇ／ｍＬ；４０ｎｇ／ｍＬから約４００ｎｇ／ｍＬ；約５０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約８０ｎｇ／ｍＬ；約８ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、合成コラーゲンの量は、少なくとも約８ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも２．０ｎｇ／ｍＬである。これらの値および範囲は、好ましくは、血小板凝集試験が光透過型アッセイである場合に用いられ、サンプルは、試験されるＰＲＰサンプルである。しかし、それらは、他の分析器に用いられてもよく、フローサイトメーター、およびインピーダンス凝集測定装置、またはこれらと同等のものが挙げられる。

試験で用いられる医薬の濃度は、医薬および合成コラーゲン濃度に依存する。合成コラーゲン誘導血小板凝集は、機能性試験であることから、個別化抗血小板療法を処方する前に遺伝子および代謝試験のデータが入手可能である必要はない。用いられる医薬の濃度は、患者に投与される用量、および血漿中に得られる所望されるレベルに依存し得る。本発明の方法で用いる最良濃度を特定するためには、当業者であれば、実施例２に従い、健康なドナーを集め、抗血小板薬および合成コラーゲンの様々な範囲を試験し、血漿中レベルをガイドとして用いて、抗血小板薬および合成コラーゲンの最良範囲（健康なドナーの集団全体にわたって最も感受性が高く、最も信頼性が高い）を特定することが可能である。

種々の実施形態に関して上記から分かるように、実施されることになる試験、または評価のための医師による要求に応じて、様々な量の合成コラーゲンが用いられてよいことは明らかである。用いられる合成コラーゲンの量は、生物源コラーゲンによってＬＴＡＡを実施する場合に一般的に用いられる量の約１００倍少ない。例えば、通常、仔ウシ皮由来生物学的コラーゲンを用いるＬＴＡＡは、一般的には、０．１９ｍｇ／ｍＬ（ミリグラム／ｍＬ）のコラーゲン（「試験内」濃度として）を用い；ウマ腱由来コラーゲンを用いるＬＴＡＡは、一般的に、ＬＴＡＡ試験において２．０μｇ／ｍＬ（マイクログラム／ｍＬ）のコラーゲンを用い（「試験内」濃度として）、一方、一般的に、本発明の方法は、各ＬＴＡＡ試験において、約５００ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬ（ナノグラム／ｍＬ）の合成コラーゲンを用いる（「試験内」濃度として）。

フローサイトメトリーを用いて血小板凝集を試験する場合、生物学的コラーゲンの通常の濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬの範囲であり、２０μｇ／ｍＬが最も一般的である。しかし、合成コラーゲンを用いると、用いられる量は、これより非常に少なく、約２．０ｎｇ／ｍＬから約６４０ｎｇ／ｍＬの範囲である。

特定の実施形態では、凝集アッセイが、凝集の測定にフローサイトメトリーを用いる場合、試験内コラーゲンとして用いられる合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬの範囲である。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、４ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬ；６ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／ｍＬ；８ｎｇ／ｍＬから６４ｎｇ／
ｍＬ；２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ；４ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ；６ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ；８ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの範囲；および２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでの範囲のいずれかのサブセットまたは個々の数値である。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３２ｎｇ／ｍＬ、および／または６４ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、試験内合成コラーゲンの量は、２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでの範囲内のいずれかの数値であり、これらに限定されないが、２ｎｇ／ｍＬ、３、４、５、６、７、８．．．９５、９６、９７、９８、９９、または１００ｎｇ／ｍＬなどである。

上記に含まれる範囲が存在するが、本発明は、最初と最後の終点の列挙によって、その最初と最後だけを意味することには限定されず、最初と最後の終点、ならびにその終点間の濃度のすべてを明白に含む。本明細書にて、列挙した範囲内に含まれるすべての濃度をリストにすることが煩雑過ぎるというだけのことである。発明者らは、２つ以上の濃度、および２つ以上の範囲、さらには列挙した範囲内の２つ以上の濃度を用いることを考慮した。

そのような低濃度のコラーゲン、ならびにコラーゲンの希釈プロファイルを用いることができることは、合成コラーゲンによってのみ可能である。発明者らは、生物学的コラーゲンを同様の低濃度まで希釈することを試みたが、合成コラーゲンによる本発明のＬＴＡＡで用いられる濃度に匹敵するレベルまで生物学的コラーゲンを希釈することは物理的に不可能であった。生物学的コラーゲンは、不溶性、粘稠、不均質な物質であり、三重らせんに巻かれた長い繊維状構造タンパク質を有する。このような物理的特性により、合成コラーゲンの場合に１００倍分近付く濃度であっても、生物学的コラーゲンをそれに匹敵する低濃度まで希釈することができないか、または予測可能もしくは有用な形でのそのようないかなる希釈をも実施することができなかった。さらに、０．１９ｍｇ／ｍＬ（ミリグラム／ｍＬ）よりも少し低い濃度にて（「試験内」濃度として）仔ウシ皮由来コラーゲンを用いた場合も；２．０μｇ／ｍＬ（マイクログラム／ｍＬ）よりも少し低い濃度にてウマ腱由来コラーゲンを用いた場合も、ＬＴＡＡは機能しなかった（凝集が発生しなかった）。

全血に対して実施された試験において、生物学的コラーゲンを希釈した場合、有用ないかなる結果も得られないが、合成コラーゲンは、１００ｎｇ／ｍＬから１２．５ｎｇ／ｍＬまで希釈され、それでも同じ応答を得ることが可能であることが示された。図１２および１３を参照されたい。

上記に含まれる範囲が存在するが、本発明は、最初と最後の終点の列挙によって、その最初と最後だけを意味することには限定されず、最初と最後の終点、ならびにその終点間の濃度のすべてを明白に含む。本明細書にて、列挙した範囲内に含まれるすべての濃度をリストにすることが煩雑過ぎるというだけのことである。発明者らは、２つ以上の濃度、および２つ以上の範囲、さらには列挙した範囲内の２つ以上の濃度を用いることを考慮した。

好ましい実施形態では、ＬＴＡＡは、希釈プロファイルを用いる。ＬＴＡＡの結果（プロファイルデータ）は、何らかの公知の期待されるプロファイルと比較される。用いられる比較の１つの種類は、「累積報告」（ＣＲ）である。ＣＲは、経時での患者の試験結果を連続して表すものであり、経時での患者の応答の変化を識別するのに特に有用である。従って、比較の目的で用いられる期待される結果は、患者自身の（１又は複数の）過去の試験結果である。他の実施形態では、「期待されるプロファイル」または「正常プロファイル」が、患者のプロファイルと比較される。各薬物および恐らくは各人種グループにつ
いての「期待されるプロファイル」または「正常プロファイル」が開発され、比較の基準として用いられる可能性が高い。

合成コラーゲン
特定の実施形態では、合成コラーゲンは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／５２０，５０８号に記載されている。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有する合成コラーゲンであり、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。特定の実施形態では、合成コラーゲンは、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含み：

式中、Ｘは、Ｈｙｐを表し；ｎは、２０から５０００の整数を表し；およびここで、ポリペプチドは、１００００から５００００００００の範囲の分子量を有する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の構造を有する合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有し、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。本発明のすべてのアッセイで用いられる合成コラーゲンは、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有することが好ましく、それによって、合成コラーゲンはヒトＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。

特定の実施形態では、用いられる合成コラーゲンは、米国特許第７，２６２，２７５号に記載されている。合成コラーゲン分子は、米国特許第７，２６２，２７５号に記載されている方法によって作製された（例えば、実施例６および実施例７を参照）。この分子の分子量は、同特許の実施例セクションに記載の方法により、１００００００超であると測定された。

特定の実施形態では、合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐ＭＡＬｓ（ゲル浸透クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱）に基づく以下の値を有する；平均分子量（Ｍ_ｎ）１．３×１０^４；Ｍ_ｗ（重量平均分子量）＝１．６×１０^４；サイズ平均分子量（Ｍ_ｚ）２．０×１０^４。他の実施形態では、合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐ＭＡＬｓ（ゲル浸透クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱）に基づく以下の値を有する；平均分子量（Ｍ_ｎ）２．８×１０^４；Ｍ_ｗ（重量平均分子量）＝４．１×１０^４；サイズ平均分子量（Ｍ_ｚ）６．１×１０^４。

合成コラーゲンは、ＧＰＣ‐Ｍａｌｓによって測定することができる。本発明で試験される合成コラーゲン分子は、東ソー製のＨＬＣ‐８１２０ＧＰＣデバイスを用い、以下の条件で測定した。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ α‐Ｍ（内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ）×２（東ソー製）
密度検出器：示差屈折率計（ＲＩ検出器）、極性＝（＋）
ＭＡＬＳ：ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ（ウィアットテクノロジー（Wyatt Technology）製）
ＭＡＬＳレーザー波：６５８ｎｍ
溶出液：ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３‐ヘキサフルオロ‐２‐プロパノール）セントラル硝子製 ＋ ５ｍＭ ＣＦ_３ＣＯＯＮａ（１級、和光純薬製）
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＲＩ検出器温度：４０℃
ＭＡＬＳ温度：室温
サンプル密度：２ｍｇ／ｍＬ
サンプル量：１００μＬ
サンプルの前処理：サンプルの秤量後、任意の量の溶出液を添加することでこれを溶解し、室温で一晩静置した。サンプルを緩やかに混合し、次に０．５μｍのＰＴＦＥカートリッジフィルターでろ過した。

特定の実施形態では、ｎは、２０から２５０の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から２００の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から１５０の整数である。特定の実施形態では、ｎは、３０から１００の整数である。特定の実施形態では、ｎは、２０から２５００；２０から２０００；２０から１５００；２０から１０００；２０から５００；または２０から２５０；３０から２５００；３０から２０００；３０から１５００；３０から１０００；３０から５００；または３０から２５０の整数である。上記で考察した合成コラーゲン分子は、三重らせんに自己組織化してフィブリルを形成する能力を有することが好ましく、それによって、合成コラーゲンはＩ型コラーゲンを模倣することが可能となる。

合成コラーゲン選択の際に考慮される２つの因子は、溶解性および取扱いの容易さである。分子量が小さすぎると、合成コラーゲンは、低い溶解度特性を有し得る。分子量が大きすぎると、合成コラーゲンは、良好な取扱い特性を持たない可能性がある（粘稠過ぎる、および分散性が悪い可能性がある）。従って、式（Ｉ）［−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）_ｎ］の好ましい合成コラーゲンは、良好な溶解性および良好な取扱い特性の両方を有する。

以下の合成コラーゲン分子について試験を行った：ｎ＝２４（Ｍｎ＝６３００）；ｎ＝２８（Ｍｗ＝７５００）；ｎ＝４９（Ｍｎ＝１３０００）；ｎ＝６０（Ｍｗ＝１６０００）；ｎ＝７５（Ｍｚ＝２００００）；ｎ＝１０５（Ｍｎ＝２８０００）；ｎ＝１５３（Ｍｗ＝４１０００）；ｎ＝２２９（Ｍｚ＝６１０００）。種々の合成分子を試験すると、４９〜７５のｎ値を有する分子が、望ましい溶解性と取扱い特性との最良の組み合わせを示した。

本発明の特定の実施形態では、合成コラーゲンは、すべて１つの長さであってよく（例えば、すべての合成分子においてｎ＝４９、特定の実施形態では、合成コラーゲンは、多くの異なる長さの混合物であってよい（例えば、これに限定されないが、合成コラーゲンは、４９〜７５のｎを有する分子の混合物である）。

キット
本発明は、光透過型アッセイで血小板凝集を試験するのに有用である、合成コラーゲンを含むキットも提供する。合成コラーゲンは、上述の通りであり、多くの異なる濃度であってよい。加えて、キットは、１つ以上の希釈剤、ならびにコントロールを含んでもよい。

合成コラーゲンは、「試験内」濃度として用いられるよりも高い濃度でバイアル中に供給されてよい。特定の実施形態では、バイアル中の合成コラーゲンは、好ましくは、所望される最終「試験内」濃度の量の１０倍超である。

特定の実施形態では、合成コラーゲンは、合成コラーゲンの希釈を作り出す必要性を回避するために、本発明の方法で用いられることが考慮される濃度でキット中に供給される。言い換えると、合成コラーゲンは、それが本発明の方法で直接用いられることになる濃度であるように提供される。

他の実施形態では、バイアルは、より高い濃度の量を含有してよく、キットに含まれる説明書きが、合成コラーゲンの所望される最終「試験内」濃度を達成するようにアッセイで用いられる所望される濃度に関する使用説明を提供する。

他の実施形態では、キットは、合成コラーゲンの少なくとも１つの単回使用バイアルおよび／または少なくとも１つの多数回使用バイアルを含有する。単回使用バイアルの場合バイアルは、１回のＬＴＡＡに必要とされる合成コラーゲンの量のみを含有する。多数回使用バイアルの場合、合成コラーゲンは、所望される試験内濃度で供給されてよいが、バイアルは、２回以上のＬＴＡＡに必要とされる体積を超える量を含有する。

本発明のキットは、本明細書で述べる方法を用いる光透過型アッセイで合成コラーゲンを用いるための使用説明を含有することが好ましい。

他の実施形態では、本発明のキットは、同じ濃度の合成コラーゲンのバイアルを２つ以上含有し、または他の実施形態では、キットは、異なる濃度のバイアルを２つ以上含有する。異なる濃度のバイアルを２つ以上有するキットは、本発明の希釈プロファイルＬＴＡＡで有用である。例えば、本発明の１つのキットは、ある範囲の異なる濃度の合成コラーゲンを有する７、６、５、４、または３つのバイアルを含有してよい。各バイアルは、特定の実施形態では、所望される最終「試験内」濃度の合成コラーゲンを提供し、単回使用または多数回使用バイアルとして供給されてよい。

本発明は、合成コラーゲンを用いて作製された希釈プロファイルと共に（特定の実施形態において）、血小板凝集能力を測定すること、ならびにそれに続くデータ分析および利用可能である報告に基づいている。合成コラーゲンを用いて１つ以上の抗血小板療法レジメンに対する血小板の応答ならびにその他の尺度を測定するためのその他の方法も有用であることが期待され、ここで、現時点では、これらの方法の臨床的価値は限定的であると報告されている。例えば、全血およびポイントオブケア血小板機能分析器、方法、ならびに技術であり、インピーダンスおよび多電極インピーダンス凝集測定、高せん断応力コーンプレート式フローサイトメトリー、ならびに血小板機能または阻害のその他のポイントオブケア技術およびアッセイなどである。

生物学的または合成コラーゲンの保存に用いられるバイアルの性質が、コラーゲンをある度合いで活性化することによってコラーゲンに影響を与え得ることが見出された。合成コラーゲンを保存するために用いられる容器は、コラーゲンを活性化せず、合成コラーゲンがバイアルから取り出されて試験系へ導入された際に、合成コラーゲンの活性化および接着の度合いがその試験系だけに起因することが確保されることが好ましい。言い換えると、コラーゲンと容器との相互作用による意図しない活性化によって引き起こされるアーチファクトは、凝集アッセイ中に導入されない。汎用ポリプロピレンバイアルまたは容器中に保存された合成コラーゲンを含むコラーゲンは、未知の度合いで活性化され、その後容器に接着し、従って試験系に加えることができない。容器および／またはキャップに接着したために試験系に用いることができないコラーゲンの量は未知であり、安定性データに基づいて、不定である。発明者らは、ホモポリマー容器中で作製され、保存された合成コラーゲンを用いることで、試験結果の高い度合いの変動性が排除されることを見出した。従って、合成コラーゲンは、ホモポリマー容器中で作製され、保存されることが好ましい。

ポリプロピレンとして示されるほとんどの容器は、単一のプラスチックではなく、製造プロセスの過程で種々の添加剤を含めることによってその性能が修飾され得るプラスチックのファミリーである。従って、製造プロセス自体によって、異なる様々なポリプロピレンが作製され得る。さらに、添加剤の性質の大部分は、購入者／一般には未知であるか、
または開示されておらず、それは、この情報が、製造業者にとって所有財産であると見なされているからである。加えて、離型剤により、評価することのできない別の変動要素が追加される。

最良の長期的安定性を有し、合成コラーゲンとの相互作用を起こさない容器が、以下の特性を有することが見出された：ａ）化学構造は、繰り返される特定の同一のモノマーに基づいている（ホモポリマー − 同一のモノマーユニットから成るポリプロピレンポリマー）；ｂ）キャップは、チューブと同じ材料から作製される；およびｃ）キャップは、シリコーンＯリングまたはワッシャーなどの追加の内部シールを有するか、またはキャップの中に成型された二次シールを有する。代表的なバイアルとしては、シムポート社（Ｔ３１０シリーズ）；レークチャールズマニュファクチャリング社（５４Ａシリーズ）；およびＢＤ社（Ｆａｌｃｏｎチューブ ３５２０９６シリーズ）から入手されるクライオバイアルおよびキャップが挙げられる。

加えて、本発明者らは、合成コラーゲンが、精製水の代わりに生理学的食塩水（保存剤としてのチメロサールあり、またはなし）で希釈された場合に、より良好な安定性が達成されることを見出した。従って、本発明のキットは、合成コラーゲンの希釈用として、生理食塩水のバイアルを含有してよい。

実施例１：フローサイトメトリーを用いた合成コラーゲンの評価
物質：
１． コラーゲン 可溶性 仔ウシ皮由来；Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製
２． 合成コラーゲン（図５〜８にて、コラーゲンＳと称する）
３． コラーゲン − Ｉ型 ウマ由来；Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製
４． ＲｅｏＰｒｏ − ２．５、５、１０μｇ／ｍＬ 最終濃度
５． Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ − １、２、５μｇ／ｍＬ 最終濃度
６． Ａｇｇｒａｓｔａｔ − １、２、５μｇ／ｍＬ 最終濃度

方法：フローサイトメトリー
Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製仔ウシ皮由来コラーゲンのバイアルを、０．５ｍＬの水で再構成して、１．９ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。合成コラーゲンのバイアルを、１ｍＬの合成コラーゲン用希釈液で再構成して、０．０００５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲンを生理食塩水で希釈して、１００μｇ／ｍＬの溶液を作製した。２％のパラホルムアルデヒドストック溶液を、カルシウム非含有タイロード緩衝液で希釈して、１％のパラホルムアルデヒド溶液を作製した。１ｍＬの１％パラホルムアルデヒドを入れたチューブ一式を作製した。３０μＬのコラーゲン試薬および３０μＬの抗血小板薬を入れた第二のチューブ一式を作製し、３７℃の加熱ブロックに設置した。健康な個人から全血をクエン酸ナトリウム中へ採取した。２４０μＬのクエン酸血を、１５〜２０秒の間隔でチューブに添加し、緩やかに混合した。３分間のインキュベーション時間の後、５０μＬの活性化血を、対応するパラホルムアルデヒド含有チューブへ移した。４℃で３０分間インキュベートした後、サンプルを、１６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を除去した。細胞ペレットを、７５０μＬのタイロード緩衝液中に再懸濁した。ＣＤ６１ＦＩＴＣおよびＣＤ６２ＰＥ（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））の各１０μＬを、一式の清浄なチューブに添加した。１００μＬの再懸濁した細胞を、これらの抗体チューブに添加した。室温、暗所での３０分間のインキュベーション時間の後、７００μＬのタイロード緩衝液を各チューブに添加し、サンプルをフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ‐ＸＬ、ベックマン‐コールター（Beckman-Coulter））で分析した。血小板活性化を、Ｐ‐セレクチンを発現する血小板のパーセントおよび凝集した血小板のパーセントについて評価した。

結果：
血小板活性化を誘導する種々のコラーゲン試薬の能力を、全血フローサイトメトリーを用いて評価した。血小板活性化は、２つのパラメーター：Ｐ‐セレクチンの発現および血小板凝集物の形成について評価した。本アッセイにおいて、血小板凝集物は、非凝集血小板集団よりもサイズが大きい（前方角度光散乱（forward angle light scatter））ＣＤ６１（＋）イベントとして定義される。すべてのコラーゲン試薬は、血小板表面上でＰ‐セレクチンの発現を誘導することができたが（図５）、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製コラーゲンは、その他の試薬と比較して効果が非常に低かった。類似の傾向が、全血中の血小板凝集物の形成でも観察された（図６）。

活性化の前にＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤を全血に添加しても、コラーゲン誘導Ｐ‐セレクチン発現にほとんど影響はなかったが、血小板凝集物の形成は阻止された（図７および８）。

実施例２：正常ヒト多血小板血漿中におけるチカグレロル、シロスタゾール、およびアブシキシマブの抗血小板活性を検出するための合成コラーゲンの使用の評価

物質：抗血小板薬
チカグレロル（Ｂｒｉｌｉｎｔａ（登録商標）、アストラゼネカ，ロンドン，英国；ロットＡＬ０１５３，有効期限２０１４年２月）を、ロヨラ大学医療センター入院患者向け調剤部（Loyola University Health System inpatient pharmacy）より、９０ｍｇ錠剤として入手した。錠剤を乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、続いて１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に溶解した。このストック溶液を脱イオン水で希釈し、０．５、０．１、および０．０５ｍｇ／ｍＬの作業溶液を作製した。

シロスタゾール（Ｐｌｅｔａｌ（登録商標）、大塚製薬（Otsuka Laboratories），徳島，日本；ロット０Ｂ９１Ｍ）を、粉末として入手した。シロスタゾールをＤＭＳＯ中に溶解して５ｍＭのストック溶液とした。このストック溶液を脱イオン水で希釈し、２５０、１２５、および５０μＭの作業溶液を作製した。

アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、イーライ−リリー（Eli-Lilly），インディアナポリス，インディアナ州；ロット１２Ｄ０９ＡＡ、有効期限２０１５年５月）を、２ｍｇ／ｍＬの溶液として入手し、これを生理学的食塩水で希釈して、１２．５、２５、および５０μｇ／ｍＬの作業溶液を作製した。

物質：血小板アゴニスト
ＡＤＰを、Ｂｉｏ／Ｄａｔａコーポレーション，ホルシャム，ペンシルベニア州より入手した。各バイアルを１ｍＬの脱イオン水で再構成し、１００μＭの作業溶液を作製した。凝集キュベット中のＡＤＰの最終濃度は、１０μＭであった。

アラキドン酸を、Ｂｉｏ／Ｄａｔａコーポレーション，ホルシャム，ペンシルベニア州より入手した。各バイアルを０．５ｍＬの脱イオン水で再構成し、５ｍｇ／ｍＬの作業溶液を作製した。凝集キュベット中のアラキドン酸の最終濃度は、５００μｇ／ｍＬであった。

コラーゲンを、Ｂｉｏ／Ｄａｔａコーポレーション，ホルシャム，ペンシルベニア州より入手した。各バイアルを０．５ｍＬの脱イオン水で再構成し、１．９ｍｇ／ｍＬの作業溶液を作製した。凝集キュベット中のＢｉｏ／Ｄａｔａ社製コラーゲンの最終濃度は、１９０μｇ／ｍＬであった。

コラーゲンを、Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇコーポレーション，ハバータウン，ペンシルベニア州より、１ｍｇ／ｍＬ溶液として入手した。生理学的食塩水で希釈することにより、１００μｇ／ｍＬの作業溶液を作製した。凝集キュベット中のＣｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲンの最終濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。

合成コラーゲンは、ＪＮＣコーポレーション，横浜，日本より、８０、１６０、３２０、および６４０ｎｇ／ｍＬの作業濃度で提供を受けた。凝集キュベット中の合成コラーゲンの最終濃度は、６４、３２、１６、および８ｎｇ／ｍＬであった。

方法：血液採取
健康なヒト提供者からの全血の採取については、ロヨラ大学シカゴ校保健学部施設内治験審査委員会（Institutional Review Board of the Health Sciences Division of Loyola University Chicago）による認可を受けた。全血は、肘前静脈からダブルシリンジ技術を用いて採取し、１部の３．２％クエン酸ナトリウム（１部のクエン酸塩に対して９部の血液）を添加することで抗凝固剤処置を行った。クエン酸血に、室温、８０ｘ ｇにて、１５分間の遠心分離を行い、多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。ＰＲＰの上澄を回収し、キャップ付きチューブ中、室温で保存した。残りのクエン酸血に、１１００ｘ ｇにて１５分間、再度遠心分離を行い、少血小板血漿（ＰＰＰ）を調製した。ＰＲＰの血小板数は、ＩＣＨＯＲ ＩＩ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ヘレナラボラトリーズ（Helena Laboratories），ボーモント，テキサス州、を用いて特定した。ＰＲＰの血小板数は、同一源ＰＰＰ（homologous PPP）を添加することによって、２５００００〜３０００００／μＬに調節した。

この実験では、６人の血液ドナーを用いた。プロトコルの「非アスピリン化（non-aspirinized）」の部分用に、それぞれ別の日に採取を行った。プロトコルの「非アスピリン化」部分については、凝集応答が他の５人のドナーと大きく異なっていたため、１人のドナー（ＣＳ）を最終分析から除外した。

方法：血小板凝集
血小板凝集は、ＰＡＰ ８Ｅ血小板凝集測定装置（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製）を用いて測定した。各ウェルを、ＰＰＰを用いてブランク調整した（blanked）。２５μＬの生理食塩水または抗血小板薬、および２００μＬのＰＲＰを、マグネティックスターラーチップを入れたキュベットへ添加し、３分間インキュベートして、サンプルを３７℃に平衡化した。２５μＬのアゴニストを各キュベットに添加し、安定状態が得られるまで凝集プロファイルをモニタリングした。結果を、最大凝集レベルについての表にした。ある反応条件下では、可逆的な凝集が見られた。これは、チカグレロルまたはシロスタゾールの存在下、ＡＤＰおよびアラキドン酸誘導凝集で最もよく見られた。最終凝集レベルについても表にした。

結果：
チカグレロル
非アスピリン化血漿において、ＡＤＰ誘導凝集は強く阻害された（図９）。アラキドン酸誘導凝集も、同様の度合いで阻害された。Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製コラーゲン、Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲン、または６４ｎｇ／ｍＬ合成コラーゲンのいずれも、チカグレロルによって大きく影響を受けることはなかった。チカグレロル（登録商標）の抗血小板効果は、３２ｎｇ／ｍＬおよびそれより低い濃度の合成コラーゲンによって凝集が誘導された場合に識別することができた。チカグレロル検出に対する感受性は、合成コラーゲン濃度の低下に伴って高まるように思われた。

シロスタゾール
非アスピリン化血漿において、シロスタゾールの最も著しい効果は、アラキドン酸誘導凝集に対するものであり（図１０）、ここでは、≧１２．５μＭの濃度にて、約２０％の凝集レベルが観察された（シロスタゾールの非存在下での９５％に対して）。ＡＤＰ誘導凝集への影響は、最小限であった（２５μＭにて約３０％阻害）。２５μＭまでの濃度のシロスタゾールは、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製コラーゲン、Ｃｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲン、または６４ｎｇ／ｍＬ濃度の合成コラーゲンによって誘導される凝集は阻害しなかった。これより低い濃度の合成コラーゲンでは、より高濃度のシロスタゾールによる抗血小板効果を観察することができた。

アブシキシマブ
非アスピリン化血漿において、アブシキシマブは、試験した濃度範囲全体にわたって（１．２５〜５μｇ／ｍＬ）、アゴニスト誘導凝集の濃度依存的阻害を示した（図１１）。アラキドン酸および合成コラーゲン（８および１６ｎｇ／ｍＬ）は、アブシキシマブの存在の検出に対して最も感受性が高かった。Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製およびＣｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲン誘導凝集の阻害は、５μｇ／ｍＬの濃度でのみ見られた。

考察：
ＡＤＰ、アラキドン酸、およびコラーゲンは、血小板機能の研究に一般的に用いられるアゴニストである。チカグレロルは、ＡＤＰおよびアラキドン酸によって誘導される凝集を阻害したが、コラーゲン誘導凝集に対しては、ほとんど効果を示さなかった。シロスタゾールは、アラキドン酸誘導凝集を強く阻害したが、ＡＤＰ誘導凝集に対しては、より弱く、濃度依存的である阻害を示した。コラーゲン誘導凝集は、シロスタゾールによる影響を受けなかった。アブシキシマブは、ＡＤＰ、アラキドン酸、およびコラーゲンによって誘導される凝集を阻害したが、ＡＤＰおよびアラキドン酸の方がより感受性が高かった。

合成コラーゲン試薬は、８から６４ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で試験した。６４ｎｇ／ｍＬの濃度の合成コラーゲンによって誘導される凝集は、チカグレロルまたはシロスタゾールによる凝集応答に対する効果が最小限であったという点で、Ｂｉｏ／Ｄａｔａ社製およびＣｈｒｏｎｏ Ｌｏｇ社製コラーゲン試薬のそれと同等であった。コラーゲンまたは６４ｎｇ／ｍＬの合成コラーゲンによって誘導される凝集は、同等の度合いでアブシキシマブによって阻害された。合成コラーゲンのより低い濃度では、チカグレロル、シロスタゾール、およびアブシキシマブの抗血小板効果は、容易に明らかであった。

Claims (17)

1. 個人の抗血小板薬感受性状態を、前記個人が抗血小板薬療法を受けている場合に特定するための血小板凝集試験であって、アッセイは、前記血小板凝集試験において、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で合成コラーゲンを用いることを含む、血小板凝集試験。
2. 前記試験が、光透過型凝集測定アッセイを含む、請求項１に記載の凝集試験。
3. 個人の抗血小板薬感受性状態を、前記個人が抗血小板薬を受けている場合に特定するための方法であって：
   ａ）第一の処理サンプルを形成するために、前記個人から採取された第一の多血小板サンプルまたは全血サンプルを、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬの量の合成コラーゲンと混合する工程であって、前記個人は、少なくとも約２４時間にわたって前記抗血小板薬を経口摂取していない工程；
   ｂ）第一の読み取りを取得するために、前記第一の処理サンプルの血小板凝集を測定する工程であって、前記第一の読み取りは、抗血小板薬の経口摂取なしでの前記個人のベースラインレベルを特定するものである工程；
   ｃ）第二の処理サンプルを形成するために、前記個人が前記抗血小板薬を経口摂取した後に前記個人から採取された第二の多血小板サンプルまたは全血サンプルを、少なくとも約２ｎｇ／ｍＬの量の合成コラーゲンと混合する工程；
   ｄ）第二の読み取りを取得するために、前記第二の処理サンプルの血小板凝集を測定する工程；
   ｅ）抗血小板薬の経口摂取なしでの前記ベースラインレベルと前記第二の処理サンプル読み取りとを比較する工程であって、前記比較は、前記個人の抗血小板薬感受性状態を特定するものである工程、
   によって血小板凝集アッセイを実施することを含む、方法。
4. 前記サンプルが、多血小板血漿であり、前記血小板凝集が、光透過型凝集測定アッセイで測定される、請求項３に記載の方法。
5. 前記サンプルが、全血であり、前記血小板凝集が、フローサイトメトリーで測定される、請求項３に記載の方法。
6. 前記読み取りが、曲線下面積、一次凝集、一次傾き、ラグフェイズ、脱凝集、最終凝集、またはこれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
7. 前記個人の抗血小板薬感受性状態をさらに分析するために希釈プロファイル分析を実施することをさらに含み：
   ｆ）複数の異なる処理ベースラインサンプルを得て、ある濃度範囲にわたるベースライン希釈プロファイルを取得するために、前記抗血小板薬の経口摂取前に前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルまたは全血サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立して混合する工程；
   ｇ）ベースライン希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理ベースラインサンプルの血小板凝集を測定する工程；
   ｈ）複数の異なる処理抗血小板薬後サンプルを得て、ある濃度範囲にわたる抗血小板薬後希釈プロファイルを取得するために、前記抗血小板薬の経口摂取後に前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルまたは全血サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立して混合する工程であって；
   工程ｆ）の前記ベースライン希釈プロファイルと工程ｈ）の前記抗血小板薬後希釈プロ
   ファイルに対して、同じ希釈量が用いられる工程；
   ｉ）抗血小板薬後希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理抗血小板薬サンプルの血小板凝集を測定する工程；
   ｊ）前記個人の抗血小板薬感受性のレベルを特定するために、前記抗血小板薬後希釈プロファイル読み取りを前記ベースライン希釈プロファイル読み取りに対して分析する工程；
   を含む、請求項３に記載の方法。
8. ドナーの抗血小板薬感受性状態を、前記個人が抗血小板薬を受けている場合に特定するための方法であって：
   ａ）複数の異なる処理ベースラインサンプルを得て、ある濃度範囲にわたるベースライン希釈プロファイルを取得するために、抗血小板薬の経口摂取前に前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルまたは全血サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量と混合する工程；
   ｂ）ベースライン希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理ベースラインサンプルの血小板凝集を測定する工程；
   ｃ）複数の異なる処理抗血小板薬後サンプルを得て、ある濃度範囲にわたる抗血小板薬後希釈プロファイルを取得するために、抗血小板薬の経口摂取後に前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルまたは全血サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立して混合する工程であって；
   工程ａ）の前記ベースライン希釈プロファイルと工程ｃ）の前記抗血小板薬後プロファイルに対して、同じ希釈量が用いられる工程；
   ｄ）抗血小板薬後希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理抗血小板薬サンプルの血小板凝集を測定する工程；
   ｅ）前記ドナーの抗血小板薬感受性のレベルを特定するために、前記抗血小板薬後希釈プロファイル凝集結果を前記ベースライン希釈プロファイル凝集結果に対して比較する工程；
   によって血小板凝集試験を用いる希釈プロファイル分析を実施することを含む、方法。
9. 前記サンプルが、多血小板血漿であり、前記血小板凝集が、光透過型凝集測定アッセイで測定される、請求項７および８に記載の方法。
10. ドナーの抗血小板薬感受性状態を、前記個人が抗血小板薬を受けている場合に予測するための方法であって：
    ａ）複数の異なるサンプルを得て、ある濃度範囲にわたる希釈プロファイルを取得するために、前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立して混合する工程；
    ｂ）希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なる処理サンプルの光透過率を測定する工程；
    ｃ）前記個人の抗血小板薬感受性状態を予測するために、前記希釈プロファイル読み取りを分析する工程、
    によって光透過型アッセイを用いる希釈プロファイル分析を実施することを含む、方法。
11. 前記複数の異なる合成コラーゲン量が、抗血小板薬感受性領域（ＳＲ）内の３、４、５、６、または７つの異なる合成コラーゲン量を含み；
    前記抗血小板薬感受性領域（ＳＲ）は、平均抗血小板薬感受性を有する平均個人において測定される血小板活性／凝集が、合成コラーゲン濃度の低下と共に減少される合成コラーゲン濃度の範囲である、
    請求項７、８、または１０に記載の方法。
12. 前記異なる合成コラーゲン希釈量が、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内から選択される５から７つの異なる合成コラーゲン量を含む、請求項７、８、または１０に記載の方法。
13. 個人の残留血小板反応性状態を、前記個人が抗血小板薬を受けている場合に特定するための方法であって、：
    ａ）処理サンプルを形成するために、前記個人から採取された多血小板サンプルを、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの範囲の量の合成コラーゲンと混合する工程；
    ｂ）読み取りを取得するために、前記処理サンプルの光透過率を測定する工程あって、前記読み取りは、曲線下面積、一次凝集、一次傾き、ラグフェイズ、脱凝集、最終凝集、またはこれらの組み合わせであり；前記読み取りは、前記個人の残留血小板活性状態を特定するものである、工程、
    による光透過型アッセイを実施することを含む、方法。
14. 前記個人の残留血小板反応性をさらに分析するために希釈プロファイル分析を実施することをさらに含み：
    ｃ）複数の異なる処理サンプルを得て、ある濃度範囲にわたる希釈プロファイルを取得するために、前記抗血小板薬の経口摂取後に前記個人から採取された複数の異なる多血小板サンプルを、前記濃度範囲にわたる異なる合成コラーゲン希釈量とそれぞれ独立して混合する工程；
    ｄ）希釈プロファイル読み取りを取得するために、前記複数の異なるサンプルの光透過率を測定する工程；
    ｅ）前記個人の残留血小板反応性のレベルを特定するために、前記希釈プロファイル読み取りを分析する工程；
    を含む、請求項１３に記載の方法。
15. ドナーの抗血小板薬療法コンプライアンスを特定するための方法であって：
    ａ）第一の処理サンプルを形成するために、前記ドナーが前記抗血小板薬を経口摂取した後に前記ドナーから採取された第一の多血小板サンプルを、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの量の合成コラーゲンと混合する工程；
    ｂ）第一の読み取りを取得するために、前記第一の処理サンプルの凝集を測定する工程であって、前記第一の読み取りは、抗血小板薬の経口摂取ありでの前記ドナーのベースラインレベルを特定するものである、工程；
    ｃ）第二の処理サンプルを形成するために、前記ドナーが前記抗血小板薬療法レジメンを受けた後に前記ドナーから採取された第二の多血小板サンプルを、約２ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの量の合成コラーゲンと混合する工程；
    ｄ）第二の読み取りを取得するために、前記第二の処理サンプルの血小板凝集を測定する工程；
    ｅ）前記第二の読み取りにおける血小板凝集レベルが前記ベースラインレベルと類似しているかどうかに基づいて、前記ドナーが前記抗血小板薬療法を順守してきたかどうかを確認するために、前記ベースラインレベルと前記第二の処理サンプル読み取りとを比較する工程であって、前記比較は前記ドナーの抗血小板療法コンプライアンスを特定するものである工程、
    によって血小板凝集アッセイを実施することを含む、方法。
16. 患者の血小板の凝集を阻害する抗血小板薬の効果を予測する方法であって：
    Ａ）前記患者から多血小板血漿サンプルまたは全血サンプルを採取する工程；
    Ｂ）工程Ａの前記サンプルに、前記抗血小板薬および合成コラーゲンを添加する工程であって、前記合成コラーゲンは、２．０ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で
    添加される工程；
    Ｃ）前記抗血小板薬が所望されるレベルまで血小板凝集を阻害する能力を有していたかどうかを特定するために、血小板凝集を測定する工程、
    Ｄ）工程Ｃでの前記血小板凝集の測定に基づいて、前記患者に対する前記抗血小板薬の効果を予測する工程、
    を含む血小板凝集アッセイを実施することを含む、方法。
17. 前記合成コラーゲンが、式（Ｉ）で表されるペプチド断片を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
    （式中、Ｘは、Ｈｙｐを表し；およびｎは、２０から２５０の整数を表す。）