JP2015027304A - 炎症性疾患を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】フラクタルカイン（ＦＫＮ）は、炎症誘発性サイトカインによって内皮細胞の表面上で誘導され、炎症性腸疾患に対する有望な治療ターゲットである。炎症性腸疾患に対する治療薬として、ＦＫＮ抗体及び抗体のＦＫＮ結合断片の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３，Ｌ１，Ｌ２及びＬ３を含むＦＫＮに結合するヒト化抗体又はキメラ抗体及びそのＦＫＮ結合断片。ヒト化抗体及びそのＦＫＮ結合断片を含む炎症性腸疾患に対する医薬組成物並びに治療方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、フラクタルカインに結合する抗体に関連する組成物および方法を特徴とする。

フラクタルカイン（ＦＫＮ）は、活性化された内皮細胞の表面に発現し、ＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する膜貫通型ケモカインである。膜結合型ＦＫＮの膜結合型ＣＸ３ＣＲ１への結合は、セレクチンまたはインテグリンの介在なしに、強力な細胞間接着を媒介する。膜結合型ＦＫＮからシェディングされた分泌型ＦＫＮもまたＣＸ３ＣＲ１に結合し、インテグリンの活性化および細胞走化性を誘導する。

ＦＫＮの発現は、炎症誘発性サイトカインによって内皮細胞の表面上で誘導される。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および糖尿病を含む炎症性および自己免疫疾患を含む、多数の疾患を有する患者において、ＦＫＮの発現上昇ならびにＣＸ３ＣＲ１^＋細胞傷害性エフェクターリンパ球およびマクロファージの蓄積が報告されている。Umehara et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:34-40 (2004)には、アテローム性動脈硬化症および血管傷害におけるＦＫＮの役割について記載されている。Nishimura et al., Ann. NY Acad. Sci. 1173:350-356 (2009)では、ＦＫＮについて、ＵＣおよびＣＤのような炎症性腸疾患に対する有望な治療ターゲットとして考察されている。

抗体および抗体のＦＫＮ結合断片は、それらの持つ特異性から、望ましい治療薬である。抗体およびＦＫＮ結合断片は、特定の細胞または組織を標的とすることにより、非特異的な標的指向化による潜在的な副作用を最小にするために用いられ得る。本明細書に記載するものを含む炎症性疾患の処置に有用な治療用抗体を同定し、かつ特徴付けることが必要とされている。

第１の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および
（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
から選択される６個のＣＤＲを含む、抗ＦＫＮ抗体またはそのＦＫＮ結合断片を特徴とする。

抗体は完全な抗体であってよい。一例では、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を含んでよく、かつヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３８、配列番号４４、または配列番号４５のアミノ酸配列を含んでよい。

一例では、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、抗フラクタルカイン抗体またはそのＦＫＮ結合断片である。

抗体はまた、キメラ抗体であってもよい。一例では、キメラ抗体の重鎖の可変領域は配列番号２６のアミノ酸配列を含み、キメラ抗体の軽鎖の可変領域は配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

抗体のＦＫＮ結合断片もまた意図される。ＦＫＮ結合断片は、ＦＫＮに対する結合特異性を保持するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖ断片であってよい。

特定の例によれば、抗体またはそのＦＫＮ結合断片がヒトの定常領域を含む場合、該定常領域はＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ２アイソタイプ）である。別の例では、抗体またはＦＫＮ結合断片は、ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を変異のないＦｃ領域と比較して減少させるような当該変異Ｆｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域はアミノ酸残基Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｃ１３１、またはＣ２１９の１以上において変異を受ける。

望ましくは、抗体またはＦＫＮ結合断片は、ＦＫＮの、その受容体であるＣＸ３ＣＲ１への結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％まで、もしくはそれ以上実質的に減少または阻害するか、または本明細書に記載するような走化性アッセイにおいて、中和されたｈＦＫＮを実質的に阻害する。

本発明はまた、本発明の抗体またはＦＫＮ結合断片、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も特徴とする。特定の実施形態によれば、組成物は、以下に記載するような１以上のさらなる治療薬を含む。

上記の抗体またはＦＫＮ結合断片をコードする核酸もまた意図される。一実施形態によれば、核酸は、抗体またはそのＦＫＮ結合断片の重鎖の全部もしくは一部をコードする。別の実施形態によれば、核酸は、抗体またはそのＦＫＮ結合断片の軽鎖の全部もしくは一部をコードする。核酸は、ベクター（例えば発現ベクター）内にあってよい。

本発明はまた、本発明の１以上のベクターを含む宿主細胞も特徴とする。一例では、宿主細胞は２つのベクターを含み、第１のベクターは本明細書に記載する抗体またはＦＫＮ結合断片の重鎖をコードする核酸を含み、第２のベクターは本明細書に記載する抗体またはＦＫＮ結合断片の軽鎖をコードする核酸を含む。宿主細胞における重鎖および軽鎖の発現によって、抗体またはＦＫＮ結合断片が産生される。一実施形態によれば、宿主細胞は原核生物のものである。別の実施形態によれば、宿主細胞は真核生物のものである。抗体およびＦＫＮ結合断片産生のために有用な、代表的な哺乳類細胞はＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞である。

本発明はまた、抗ＦＫＮ抗体またはそのＦＫＮ結合断片を作製するための方法も特徴とする。該方法は、（ａ）本発明のベクターを適切な宿主細胞内で発現させること、および（ｂ）抗体を回収することを含む。抗体またはＦＫＮ結合断片は、宿主細胞によって培養液中に分泌されてよい。一例では、抗体またはそのＦＫＮ結合断片は、少なくとも９５％またはそれ以上の純度で、非抗体性の物質を除去して精製される。

本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより、炎症性疾患を処置する方法もまた意図される。代表的な炎症性疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、および潰瘍性大腸炎である。これらの疾患に対し、方法は、１以上の追加の治療薬を投与することを含んでよい。代表的な治療薬は、アヘン剤、５−アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、グルココルチコイド、メトトレキサート、シクロスポリン、およびメトロニダゾールである。その他の適切な治療薬を以下に記す。

本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る炎症性疾患には、自己免疫性肝胆道疾患（例えば、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、または原発性硬化性胆管炎）も含まれる。これらの疾患に対し、方法は、６−メルカプトプリン、ウルソデオキシコール酸、アザチオプリン、グルココルチコイド、サイアザイド系利尿薬、抗アルドステロン性利尿薬、シクロスポリン、アルブミン、またはスピロノラクトンを投与することをさらに含んでよい。

本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより、関節リウマチ（ＲＡ）もまた処置され得る。ＲＡの処置において、方法は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキサート、レフルノミド、ブシラミン、５−アミノサリチル酸、グルココルチコイド、ヒドロキシクロロキン、ビタミンＤ、カルシウム、またはアレンドロネートを投与することをさらに含んでよい。

全身性エリテマトーデス（例えば中枢神経系のループスまたはループス腎炎）もまた、本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を、単独もしくは１以上の追加の治療薬と併用して投与することにより処置され得る。代表的な追加の治療薬は、グルココルチコイド、シクロホスファミド、メトトレキサート、シクロスポリン、およびタクロリムスである。

多発性硬化症および視神経脊髄炎もまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。処置は、グルココルチコイド、インターフェロン−β、またはCopaxone（登録商標）のような追加の治療薬を１以上投与することをさらに含んでよい。

脱髄性多発神経根症（例えば、ギラン・バレー症候群または慢性炎症性脱髄性多発神経根症）もまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。再び、併用療法もまた意図され、処置は、グルココルチコイドまたは静注用免疫グロブリンのような追加の治療薬を１以上投与することをさらに含んでよい。

有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を単独もしくは追加の治療薬と併用して投与することは、神経因性疼痛の処置にもまた有効であり得る。神経因性疼痛の処置のための代表的な追加の薬剤は、ラモトリギン、トピラマート、オクスカルバゼピン、レベチラセタム、フェンタニル、トラマドール、カプサイシン、クロニジン、ＮＳＡＩＤ、アミトリプチリン、プレガバリン、リドカイン、デュロキセチン、およびカルバマゼピンである。

アルツハイマー病もまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。方法は、タクリン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、リバスチグミン酒石酸塩、ガランタミン臭化水素酸塩、メマンチン塩酸塩、パロキセチン、リスペリドン、クエチアピン、またはペロスピロンのような追加の治療薬を１以上投与することをさらに含んでよい。

癌に付随する内臓痛もまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を単独で、もしくはモルヒネ、ＮＳＡＩＤ、フェンタニル、リドカイン、ペンタゾシン、またはクロニジンのような追加の治療薬の１以上と併用して投与することにより処置され得る。

アテローム性動脈硬化症もまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。方法は、プロスタサイクリン、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジン、リマプロスト、プロスタグランジンＥ１、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ベザフィブラート、リドカイン、メキシレチン、利尿薬、ジギタリス、ドーパミン、β−アドレナリン受容体作用薬、硝酸イソソルビド、ニトログリセリン、ナトリウム利尿ペプチド、ワルファリン、ヘパリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、またはプロカインアミドのような追加の治療薬を１以上投与することをさらに含んでよい。

脈管障害（例えば加齢による黄斑変性症、ベーチェット病、原田病、およびサルコイドーシスに由来するぶどう膜炎）もまた、本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。方法は、グルココルチコイド、シクロホスファミド、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ＮＳＡＩＤ、コルヒチン、クロラムブシル、サリドマイド、およびベルテポルフィンから選択される追加の治療薬の１以上を投与することをさらに含んでよい。

腎症（例えばループス腎炎、糸球体腎炎、または糖尿病性腎症）もまた、本発明に従って有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を投与することにより処置され得る。グルココルチコイド類、スルホニル尿素、シクロホスファミド、グリニド類、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、利尿薬、インスリン、ビグアナイド、α−グルコシダーゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、チアゾリジンジオン、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、またはβ−アドレナリン受容体阻害剤が処置方法に含まれてよい。アドレナリン受容体阻害剤が処置方法に含まれてよい。

本発明はまた、本明細書に記載するいずれかの炎症性疾患の処置における、本発明に従った抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片の使用にも関する。

本発明はまた、本明細書に記載するいずれかの炎症性疾患を処置するための薬剤の調製における、本発明に従った抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片の使用にも関する。

本発明はまた、有効量の抗ＦＫＮ抗体またはＦＫＮ結合断片を、このような処置の必要性に応じて被験者に投与し、これによって炎症部位への白血球の動員が阻害されることによる、被験者の炎症部位への白血球の動員を阻害する方法も特徴とする。

Ｅｘ ｖｉｖｏの計画もまた、治療上の応用のために用いることができる。Ｅｘ ｖｉｖｏの計画は、被験者から得た細胞に、抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトまたは形質導入することに関与する。トランスフェクトまたは形質導入された細胞は、次に被験者へ戻される。細胞は、造血性細胞（例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋肉細胞を含むがこれらに限定されない、広範な型のいずれであってもよい。

本発明の目的のため、次の略語および用語を以下のように定義する。

「抗体」（本明細書では「免疫グロブリン」と互換的に用いられる）の語は、望ましい生物活性（例えばＦＫＮに結合し、ＦＫＮとＣＸ３ＣＲ１間の相互作用を調節する能力）を示す、完全なモノクローナルおよびポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ならびに抗体断片を含む。「完全な抗体」は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に結合するが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的な間隔で鎖間にジスルフィド結合も有する。各重鎖は一端に可変領域（ＶＨ）を有し、それに続いて幾つかの定常領域を有する。各軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の一端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と並び、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並ぶ。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変領域の間の接触面を形成すると考えられている。

免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要な型が存在し、それらの幾つかは、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_ｌ、およびＩｇＡ_２のようなサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられる。抗体は、抗体とその他のタンパク質またはペプチドの１以上との共有結合性もしくは非共有結合性の会合によって形成される、比較的大きな融合分子の一部であってよい。抗体はまた、抗体に第２の分子（例えば毒素、放射性同位元素、または標識）が結合した免疫結合体の一部であってもよい。

本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」の語は、実質的に均一な抗体、すなわちわずかに存在し得る可能性のある変異を除いては、同一である個々の抗体の集団から得た抗体を指す。

非ヒト抗体の「ヒト化」型は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域（ＦＲ）、および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列（すなわち「インポート」配列）を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはその断片である。幾つかの場合に、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体へのさらなる修飾が、抗体の能力を改良するために為され得る。

「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖それぞれの可変領域内の、３つの超可変配列のうちの１つを意味する。

「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の３つのＣＤＲのいずれの側にも位置するアミノ酸の配列を意味する。ヒト化抗体のＦＲおよびＣＤＲは、親である配列と正確に対応している必要はなく、例えばインポートＣＤＲまたはコンセンサスＦＲは、その部位のＣＤＲまたはＦＲ残基がコンセンサスまたはインポート配列のいずれかに対応しないように、少なくとも１の残基の置換、挿入、もしくは欠失により変異されてよい。しかしながら、このような変異は一般に大規模なものではないであろう。通常、ヒト化抗体の残基の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、親配列の残基に対応し得る。

本明細書で用いられる「約」の語は、量、持続時間などのような測定可能な値に言及する場合、特定の値から±２０％まで、好ましくは±１０％まで、さらに好ましくは±５％まで、さらになお好ましくは±２％までの変動を包含することが意図され、このような変動は開示する方法を実行するために適切である。他に指示のない限り、明細書および請求項において用いられる成分の量、分子量のような性質、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合に「約」の語によって修飾されていることが理解されなければならない。従ってこれに反することが指示されていない限り、以下の明細書および添付の請求項において示される数のパラメータは、本発明によって得られると考えられる望ましい性質に依存して変動し得る近似値である。最低限でも、請求項の範囲に対する均等論の適用を制限しようとすることなく、それぞれの数のパラメータは、報告された有意な桁数に鑑みて、かつ通常の周辺技術を適用することによって、少なくとも解釈されなければならない。

「十分量」または「有効量」は、炎症性疾患のような疾患を、臨床に関連する方法で処置または寛解させるために必要とされる、治療用の抗体またはその医薬組成物の量を意味する。例えば炎症性疾患の治療上の処置に対する本発明の実行のために用いられる、治療用の抗ＦＫＮ抗体、ＦＫＮ結合断片、またはそれらの医薬組成物の十分な量は、投与の方法、年齢、および患者の一般的健康状態によって変動する。

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の、非共有結合性相互作用の強度の総和を指す。結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、放射性標識ＦＫＮ結合アッセイ（ＲＩＡ）、または表面プラズモン共鳴アッセイ（例えばBIACORE（登録商標））を含む、
当該技術分野において公知の方法によって測定することができる。

「キメラの」または「キメラ化」抗体（すなわち免疫グロブリン）は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、残りの鎖（単数または複数）は、別の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびこのような抗体の断片（それらが望ましい生物活性を示す限り）を指す（Morrison et al., Proc. Natl. Acad.. Set U.S.A. 81:6851-6855, 1984）。

「エピトープ」または「抗原性の決定要因」は、直鎖構造または三次元構造いずれかの結果として、抗体に対する結合部位を形成するアミノ酸の配列を意味する。構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の非連続的な部分を含むことができ、エピトープの三次構造の結果として、抗体と相互作用する。対照的に、直鎖エピトープは、その一次構造に基づいて抗体により認識されるエピトープである。一実施形態によれば、Ｆａｂとの最小の接触面を形成するフラクタルカインのエピトープには、例えばＥ６６−Ｑ６９、Ｗ８１−Ｑ８７、Ｈ７０−Ｆ７３、およびＨ８８−Ｄ９０が含まれる。

本明細書では「発現する」および「産生する」は同じ意味で用いられ、遺伝子産物の生合成を指す。これらの語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。これらの語はまた、ＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、さらに全ての天然に起こる転写後および翻訳後修飾もさらに包含する。抗体の発現／産生は、細胞の細胞質内および／または細胞培養の増殖培地のような細胞外環境で起こり得る。

「フラクタルカイン」、「ＦＫＮ」、「ＦＫ」、または「ニューロタクチン」は、配列番号１（図１）により定義されるポリペプチドと相同であり、かつＦＫＮの生物活性（例えばＣＸ３ＣＲ１受容体への結合；Ｔ細胞および単球の化学誘引；または活性化された内皮細胞に対する白血球の接着の促進）を有するポリペプチドを意味する。ＦＫＮポリペプチドの生物活性は、標準的な方法のいずれかを用いて測定されてよい。本明細書で用いられるＦＫＮには、ＦＫＮファミリーメンバーまたはアイソフォームのいずれも含まれる。例えば、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第７，３９０，４９０号、国際公開第２００６／０４６７３９号、および米国特許出願公開第２００６／０２３３７１０号を参照されたい。

「ＦＫＮ結合断片」には、そのＦＫＮ結合領域を含み、ＦＫＮに結合できる、完全な抗体の一部が含まれる。ＦＫＮ結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、もしくはＦｖ断片；二重特異性抗体；トリボディ；テトラボディ；ミニ抗体；アフィボディ分子；ミニボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；または抗体断片から形成された多重特異性抗体であってよい。

「相同」は、比較する配列の長さにわたって、既知の遺伝子またはタンパク質配列に対し、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、もしくはそれを超える相同性を有するいずれの遺伝子またはタンパク質配列も意味する。「相同」タンパク質はまた、比較するタンパク質の生物活性の少なくとも１を有してよい。ポリペプチドについては、比較する配列の長さは一般に、少なくとも１５、２０、２５、３５、またはそれを超えるアミノ酸である。核酸については、比較する配列の長さは一般に、少なくとも５０、６０、７５、１００、１２５、またはそれを超えるヌクレオチドである。「相同性」はまた、抗体を産生するために用いられるエピトープと、抗体が結合するタンパク質もしくはその断片との間の実質的な類似性も指してよい。この場合の相同性は、問題となるタンパク質を特異的に認識できる抗体の産生を誘発するために十分な類似性を指す。

「ヒト抗体」は、抗体が単にヒト由来であることを意味するか、または可変および定常領域配列がヒト配列であるかもしくはヒト抗体の配列であるいずれの抗体であることを意味する。この語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有する（すなわちそれを利用している）が、例えば免疫原性の可能性を減少させること、親和性を増大させること、望ましくないフォールディングの原因となり得るシステインを除去することなどのために変化を加えた抗体を包含する。この語は、ヒト細胞では典型的でないグリコシル化が行われ得るような、非ヒト細胞内で組み換えにより産生された抗体を包含する。

「ハイブリドーマ」は、培養された腫瘍性リンパ球と、刺激されたＢまたはＴリンパ球との間の細胞融合による産物を指し、親細胞の特異的な免疫潜在力を発現する。

本明細書で用いられる「炎症性疾患」は、免疫系が異常に活性化されるいずれの疾病、疾患、または状態も指す。炎症性疾患は例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、筋炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（例えば中枢神経系のループスまたはループス腎炎）、腎炎、糸球体腎炎、自己免疫性肝胆道疾患（例えば自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、または原発性硬化性胆管炎）、移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、喘息、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）、脱髄性多発神経根症（例えばギラン・バレー症候群または慢性炎症性脱髄性多発神経根症）、神経因性疼痛、癌の内臓痛、アテローム性動脈硬化症、加齢による黄斑変性症、糖尿病性腎症、サルコイドーシスに由来するぶどう膜炎、または糖尿病であってよい。

あるいは、疾病、疾患、または状態は、上部または下部の気道の疾病、例えば、リンパ腫性気管気管支炎；慢性気管支炎および嚢胞性線維症のようなアレルギー性過敏症または分泌過多状態；様々な原因による肺線維症（例えば特発性肺線維症）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；サルコイドーシス；アレルギー性および非アレルギー性鼻炎；アレルギー性または非アレルギー性蕁麻疹；免疫調節不全による炎症、組織再構築、血管新生、および新生物により特徴付けられる皮膚関連の疾病；ヒルシュスプルング病、下痢、吸収不良状態、炎症状態などの消化管の疾病；うつ病、不安状態、パーキンソン病、片頭痛およびその他の型の頭部痛、脳卒中、ならびに嘔吐症などの中枢および末梢神経系の疾患；脾臓およびリンパ組織などの免疫系の疾病、自己免疫疾患、またはその他の免疫関連の疾病；肺水腫、高血圧症、子癇前症、２型複合性局所疼痛症候群、および脳卒中のような心血管系の疾病；関節炎のような慢性炎症性疾患；骨関連の疾病；線維筋痛のような慢性疼痛；およびニューロキニン類、タキキニン類、またはその他の関連物質（例えばヘモキニン類）の作用が発病、病態、および病因に関与するその他の疾患である。

炎症性疾患のさらなる例は、尋常性ざ瘡；急性呼吸促迫症候群；アジソン病；アレルギー性眼内炎症性疾患；ＡＮＣＡ関連小血管脈管炎；強直性脊椎炎；自己免疫性溶血性貧血；ベーチェット病；ベル麻痺；水疱性類天疱瘡；脳虚血；肝硬変；コーガン症候群；接触性皮膚炎；クッシング症候群；皮膚筋炎；円板状紅斑性狼瘡；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑；剥脱性皮膚炎；巣状糸球体硬化症；巣状分節性糸球体硬化症；巨細胞性動脈炎；痛風；痛風性関節炎；手湿疹；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病；妊娠性疱疹；多毛症；特発性角膜強膜炎（idiopathic ceratoscleritis）；特発性血小板減少性紫斑病；免疫性血小板減少性紫斑病；炎症性腸疾患または消化器疾患；炎症性皮膚疾患；扁平苔癬；リンパ腫性気管気管支炎；黄斑浮腫；重症筋無力症；非特異性線維化性肺疾患；骨関節炎；膵炎；妊娠性類天疱瘡；尋常性天疱瘡；歯周炎；結節性多発動脈炎；リウマチ性多発筋痛症；陰嚢掻痒症；掻痒症／炎症；乾癬性関節炎；肺ヒストプラスマ症；再発性多発性軟骨炎；酒さ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック症候群；肩腱炎または滑液のう炎；シェーグレン症候群；スチル病；スウィート病；全身性硬化症；高安動脈炎；側頭動脈炎；中毒性表皮壊死症；移植片拒絶および移植片拒絶関連症候群；結核；１型糖尿病；脈管炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）病；およびウェゲナー肉芽腫症である。

「単離された」または「精製された」は、自然の状態から「ヒトの手によって」変化したことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したかもしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」かまたは「精製された」である。例えば、生きている植物または動物において自然に存在するポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは「単離された」かまたは「精製された」ものではないが、その自然な状態において共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いられる語のように「単離された」かまたは「精製された」ものである。

「機能的に連結する」または「機能的に挿入する」は、コード配列の発現のために必要な調節性配列を、コード配列の発現が可能になるように、コード配列に対して適切な位置において核酸分子内に配置することを意味する。例として、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現を制御できる場合に、コード配列に機能的に連結する。コード配列は、プロモーターまたは調節性配列に、センスもしくはアンチセンスの配向によって機能的に連結してよい。「機能的に連結する」の語は、時々、発現ベクターにおけるその他の転写制御エレメント（例えばエンハンサー）の配置に対して適用される。

同じ意味で「核酸分子」とも称される「ポリヌクレオチド」は、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドも指す。「ポリヌクレオチド」には、単鎖および二本鎖ＤＮＡ、単鎖および二本鎖領域が混合したＤＮＡ、単鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに単鎖および二本鎖領域が混合したＲＮＡ、単鎖であってよいか、またはさらに典型的には、二本鎖または単鎖および二本鎖領域が混合したＤＮＡおよびＲＮＡを含む複合型分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドの語はまた、１以上の修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性もしくはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾された」塩基には、例えばトリチル化塩基、およびイノシンのような稀な塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡには様々な修飾が為され得る；従って「ポリヌクレオチド」は、自然界に典型的に見出される、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、同様に、ウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡならびにＲＮＡの化学形を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される、比較的短い核酸鎖も包含する。

「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと称される短鎖、および一般にタンパク質と称される比較的長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸も含んでよい。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングのような天然の工程、または当該技術分野において公知の化学的修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾については、基本的な教科書およびさらに詳細な研究書、ならびに多数の研究文献において十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内のどこにでも起こり得る。同じ型の修飾は、所定のポリペプチド内の幾つかの部位において、同じかまたは異なる程度で存在し得ることが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含み得る。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果としての分岐型であってよく、かつ分岐を有するかまたは有さない環状型であってもよい。環状型、分岐型、および分岐環状型のポリペプチドは、天然の翻訳後工程の結果であってよいか、または合成法によって作製されてもよい。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチン形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびアルギニル化のような、転移ＲＮＡにより仲介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993、およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983の、1-12頁のPerspectives and Prospects; Seifter et al., Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646、およびRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照されたい。

「特異的に結合する」は、抗体またはその断片が、抗原（例えばＦＫＮまたはその断片）を認識して結合するが、試料（例えば生体試料）中のその他の分子は実質的に認識せず結合しないことを意味する。「特異的に」は、無作為のタンパク質間で、例えば露出された親水性領域により時々起こり得る、低レベルの非特異的な粘着性と区別することを意図する。これは、抗体が本発明の抗原以外のいずれのタンパク質にも結合し得ないということを意図するものではない。抗体は、関連するエピトープを含むいずれのタンパク質とも交差反応（および「特異的に結合」）し得る。

「被験者」は、いずれの動物、例えば哺乳類（例えばヒト）も意味する。例えば炎症性疾患のために処置を受けている被験者は、医学または獣医学従事者によって、このような状態を有し得る症例として診断されたものである。診断は、いずれの適切な手段によって行われてもよい。当業者は、本発明の被験者が標準的な試験に供され得たか、または、年齢、遺伝的特徴、もしくは家族歴のような１以上の危険因子の存在から、高い危険性にあるものとして試験なしで同定され得たことを理解するであろう。

細胞は、例えばＤＮＡが細胞内へ導入された場合、このＤＮＡのような外来性または異種性の核酸によって「形質転換」または「トランスフェクト」される。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノム内に組み込まれて（例えば共有結合により）よいか、または組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、形質転換するＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム性のエレメントにおいて維持され得る。真核細胞に関して、安定的に形質転換された細胞、すなわち「安定化細胞」では、形質転換するＤＮＡが染色体に組み込まれ、染色体複製を通して娘細胞に受け継がれる。この安定性は、形質転換するＤＮＡを含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する、真核細胞の能力によって示される。「クローン」は、単一細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、in vitroで多世代にわたって安定に増殖できる、初代細胞のクローンである。

「処置する」は、予防および／または治療上の目的で、治療用抗体またはその医薬組成物を投与することを意味する。「疾病または疾患を治療する」、または「治療上の処置」のための使用は、既に疾病を患っている被験者に、被験者の状態を改善するために処置を施すことを指す。被験者は、いずれかの特徴的な症状の同定か、または当業者に公知の診断方法の使用に基づいて、炎症性疾患と診断され得る。「疾病または疾患を予防する」は、まだ病気ではないが、特定の疾病に感受性であるか、そうでなければ発症の危険性がある被験者の予防的処置を指す。被験者は、当該技術分野において公知の診断方法を用いて、炎症性疾患発症の危険があることが判定される。

「ベクター」は、別の核酸断片が、その断片の複製または発現がもたらされるように機能的に挿入され得た、プラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルスのようなレプリコンである。

本明細書および添付の請求項で用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に明らかに他の指示がない限り、複数のものを含む。従って、例えば「１個の細胞（a cell）」への参照は、２個以上の細胞の組み合わせなどを含む。

本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。

図１はヒトＦＫＮのアミノ酸配列を示した図である。 図２は、抗ＦＫＮモノクローナル抗体の結合特性（すなわち中和活性、結合親和性、および種交差反応性）を示す表を示した図である。 図３は、ヒト化抗ＦＫＮ ｍＡｂ配列（提示順に、それぞれ配列番号３６〜３７および４２〜４３）、ｍ３Ａ５−２配列（配列番号２６）、生殖系列Ｉｇ配列（配列番号４０）、およびＡＡＡ６８４２７．１配列（配列番号３４）の、重鎖可変領域のアラインメントを示した図である。 図４は、ヒト化抗ＦＫＮ ｍＡｂ配列（提示順に、それぞれ配列番号３８および４４〜４５）、ｍ３Ａ５−２配列（配列番号２７）、生殖系列Ｉｇ配列（配列番号４１）、およびＡＢＵ９０６０２．１配列（配列番号３５）の、軽鎖可変領域のアラインメントを示した図である。 図５は、３回の独立した走化性アッセイの結果をまとめた表を示した図である。ヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂの中和活性を、走化性アッセイを用いて分析した。Ｈ３およびＨ３−２の、Ｌ２およびＬ４との組み合わせは全て、これらのｍＡｂがキメラｍＡｂと類似の中和活性を示したことから、ヒト化に成功した。しかしながら、絞りこまれた重要残基を用いて作製したＨＫ２は、Ｌ２またはＬ４との組み合わせにおいて、中和活性の低下を示した。 図６Ａおよび６Ｂは、ｍ３Ａ５−２ ｍＡｂおよびキメラｍＡｂの中和活性を示す一連のグラフを示した図である。図６Ａは、走化性アッセイによって決定した、ｍ３Ａ５−２ ｍＡｂの中和活性を示すグラフである。図６Ｂは、走化性アッセイによって決定した、キメラｍＡｂの中和活性を示すグラフである。 図７Ａ〜７Ｄは、走化性アッセイによって決定した、ヒト化抗ｈＦＫＮ抗体の中和活性を示す一連のグラフを示した図である。図７Ａは、Ｈ３Ｌ２−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図７Ｂは、Ｈ３Ｌ４−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図７Ｃは、ＨＫ２Ｌ２−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図７Ｄは、ＨＫ２Ｌ４−ＩｇＧ２の中和活性を示す。 図８Ａ〜８Ｆは、走化性アッセイによって決定した、ヒト化抗ｈＦＫＮ抗体の中和活性を示す一連のグラフを示した図である。図８Ａは、Ｈ３−２Ｌ２−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図８Ｂは、Ｈ３−２Ｌ４−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図８Ｃは、Ｈ３−２Ｌ５−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図８Ｄは、ＨＫ３Ｌ２−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図８Ｅは、ＨＫ３Ｌ４−ＩｇＧ２の中和活性を示す。図８Ｆは、ＨＫ３Ｌ５−ＩｇＧ２の中和活性を示す。 図９は、ｍＡｂのｈＦＫＮおよびカニクイザルＦＫＮに対する結合親和性を測定するために用いた、BIACORE（登録商標）アッセイの結果をまとめた表を示した図である。 図１０Ａ〜１０Ｃは、BIACORE（登録商標）アッセイにより決定した、キメラおよびヒト化抗ｈＦＫＮ抗体（Ｈ３Ｌ２、Ｈ３−２Ｌ２、Ｈ３Ｌ４、Ｈ３−２Ｌ４、およびＨＫ２Ｌ４）の、ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰおよびカニクイザルＦＫＮ−ＳＥＡＰに対する結合親和性を示す一連のグラフを示した図である。図１０Ａは、Ｋａ値（１／Ｍｓ）を示す棒グラフである。図１０Ｂは、Ｋｄ値（１／ｓ）を示す棒グラフである。図１０Ｃは、ＫＤ値（Ｍ）を示す棒グラフである。 図１１は、ＦＫＮケモカインドメイン由来の重複する合成ペプチド（提示順に、それぞれ配列番号１１５〜１３５）のライブラリーを用いた、エピトープマッピングの結果を示した図である。 図１２は、ＥＬＩＳＡを用いたｈＦＫＮのエピトープマッピングの結果を示した図である。 図１３は、BIACORE（登録商標）を用いたｈＦＫＮのエピトープマッピングの結果を示した図である。 図１４は、フラクタルカインのＦａｂ結合部位同定のための、交差飽和実験の結果を示した図である。プロットは、ＦＫＮのＥ６６〜Ｑ６９、Ｗ８１〜Ｑ８７、Ｈ７０〜Ｆ７３、およびＨ８８〜Ｄ９０領域が、Ｆａｂによる最小接触面に含まれることを示す。

発明の詳細な説明
本発明者らは、キメラ抗ＦＫ抗体、ヒト化抗ＦＫＮ抗体、およびそれらのＦＫＮ結合断片を設計し、単離した。本明細書で特徴付けられるヒト化抗ＦＫＮ抗体およびそのＦＫＮ結合断片は、炎症性疾患の処置のために用いられてよい。このような抗体はまた、白血球の炎症部位への動員を阻害するために用いられてもよい。本発明に従って処置することのできる炎症性疾患には、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、筋炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス（例えば中枢神経系のループスまたはループス腎炎）、腎炎、糸球体腎炎、自己免疫性肝胆道疾患（例えば自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、または原発性硬化性胆管炎）、移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、喘息、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）、脱髄性多発神経根症（例えばギラン・バレー症候群または慢性炎症性脱髄性多発神経根症）、神経因性疼痛、癌の内臓痛、アテローム性動脈硬化症、加齢による黄斑変性症、糖尿病性腎症、サルコイドーシスに由来するぶどう膜炎、糖尿病、リンパ腫性気管気管支炎、慢性気管支炎および嚢胞性線維症のようなアレルギー性過敏症または分泌過多状態、様々な原因による肺線維症（例えば特発性肺線維症）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、アレルギー性および非アレルギー性鼻炎、アレルギー性または非アレルギー性蕁麻疹、免疫調節不全による炎症、組織再構築、血管新生、および新生物により特徴付けられる皮膚関連の疾病、ヒルシュスプルング病、下痢、吸収不良状態、炎症状態などの消化管の疾病、うつ病、不安状態、パーキンソン病、片頭痛およびその他の型の頭部痛、脳卒中、ならびに嘔吐症のような、中枢および末梢神経系の疾患、脾臓およびリンパ組織などの免疫系の疾病、自己免疫疾患、またはその他の免疫関連の疾病、肺水腫、高血圧症、子癇前症、２型複合性局所疼痛症候群、および脳卒中のような心血管系の疾病、関節炎のような慢性炎症性疾患、骨関連の疾病、線維筋痛のような慢性疼痛、尋常性ざ瘡、急性呼吸促迫症候群、アジソン病、アレルギー性眼内炎症性疾患、ＡＮＣＡ関連小血管脈管炎、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、ベーチェット病、ベル麻痺、水疱性類天疱瘡、脳虚血、肝硬変、コーガン症候群、接触性皮膚炎、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、剥脱性皮膚炎、巣状糸球体硬化症、巣状分節性糸球体硬化症、巨細胞性動脈炎、痛風、痛風性関節炎、手湿疹、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、多毛症、特発性角膜強膜炎（idiopathic ceratoscleritis）、特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患または消化器疾患、炎症性皮膚疾患、扁平苔癬、リンパ腫性気管気管支炎、黄斑浮腫、重症筋無力症、非特異性線維化性肺疾患、骨関節炎、膵炎、妊娠性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、歯周炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、陰嚢掻痒症、掻痒症／炎症、乾癬性関節炎、肺ヒストプラスマ症、再発性多発性軟骨炎、酒さ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症性ショック症候群、肩腱炎または滑液のう炎、シェーグレン症候群、スチル病、スウィート病、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎、中毒性表皮壊死症、移植片拒絶および移植片拒絶関連症候群、結核、１型糖尿病、脈管炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）病、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。

抗体
抗体またはそのＦＫＮ結合断片を作製および精製するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975); Hongo et al., Hybridoma 14:253-260 (1995); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2nd ed. (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier), 563-681 (1981); Ni, Xiandai Mianyixue, 26:265-268 (2006);米国特許第７，１８９，８２６号；第７，０７８，４９２号；
および第７，１５３，５０７号；Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology 20:927-937 (2005); Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27:185-191 (2005);米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号；米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；および米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号を参照されたい。

キメラ抗体
キメラ抗体およびそれを産生する方法は、当該技術分野において公知であり、確立されている。本明細書で用いられる「キメラ抗体」の語は、非ヒト哺乳類、げっ歯類、または爬虫類の抗体のアミノ酸配列に由来する、少なくとも１の可変領域の少なくともある一部を有するが、抗体またはそのＦＫＮ結合断片の残りの部分はヒト由来である、抗体またはそのＦＫＮ結合断片を意味する。例えば、キメラ抗体は、マウス抗原結合領域と共にヒトＦｃまたはその他のこのような構造領域を含んで構成されてもよい。

ヒト化抗体
本発明は、例えばＦＫＮとＣＸ３ＣＲ１間の相互作用を調節する、ヒト化抗ＦＫＮ抗体およびそのＦＫＮ結合断片を包含する。ヒト化は、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法を用いて行うことができる（Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001) and Tsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)）。ヒト化はまた、当該技術分野において公知の以下の方法（例えばJones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988);およびVerhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)を参照）を用いて、超可変領域配列を、ヒト抗体の対応する配列に対して置換することによっても行うことができる。ヒト化抗体は、典型的には幾つかの超可変領域残基、および場合によっては幾つかのＦＲ残基が、非ヒト抗体の類似した部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。

抗原性を減少させるためには、ヒト化抗体の作製において、軽鎖および重鎖の両方でヒト可変領域の使用を選択することが重要であり得る。「最良適合」法によれば、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対して、げっ歯類抗体の可変領域の配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れられる。例えば、Sims et al., J. Immunol. 151 :2296-2308 (1993)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)を参照されたい。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。幾つかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークが用いられ得る。例えば、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 89:4285-4289 (1992) and Presta et al., J. Immunol. 151 :2623-2632 (1993)を参照されたい。

さらに、抗体は一般に、抗原に対する高い親和性およびその他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化されることが望ましい。この目標を達成するため、一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析工程によって調製される。一般に三次元の免疫グロブリンモデルが利用可能であり、当業者に知られている。選択された候補である免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を模式化し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補である免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補である免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。この方法により、単数または複数の標的抗原（例えばＦＫＮまたはその断片）に対する親和性の増大のような、望ましい抗体の特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択して、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基が直接かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。

ＦＫＮ結合断片
本発明の特定の実施形態によれば、ＦＫＮとＣＸ３ＣＲ１間の相互作用を調節するＦＫＮ結合断片が提供される。このような断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖ断片のような、完全な、ヒト化、および／またはキメラ抗体の機能的な抗原結合断片であってよい（例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1998)を参照）。このような断片は、組み換えにより形質転換した宿主細胞から直接、完全な抗体のタンパク質分解性の消化によって、例えばパパイン消化によって産生される（例えば、国際公開第９４／２９３４８号を参照）。ＦＫＮ結合断片は、以下に記載する様々な工学技術を用いて産生され得る。

Ｆｖ断片の２つの鎖の間の相互作用エネルギーは、Ｆａｂ断片よりも低い。ＶＨおよびＶＬ領域の会合を安定化させるため、Ｆｖ断片はペプチド（例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1998)およびHuston et al., PNAS 85:5879-5883 (1998)を参照）、ジスルフィド結合（例えば、Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362-1367 (1990)を参照）、および「knob in hole」変異（例えば、Zhu et al., Protein Sci. 6:781-788 (1997)を参照）によって結合する。ＳｃＦｖ断片は、当業者に公知の方法によって産生することができる（例えば、Whitlow et al., Methods Enzymol. 2:97-105 (1991)およびHuston
et al., Int. Rev. Immunol. 10:195-217 (1993)を参照）。ＳｃＦｖはＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞内で産生され得るが、真核細胞内でもまた産生され得る。ＳｃＦｖが不利である一点は、多価結合によるアビディティーの増大が不可能な一価の産物であり、ＳｃＦｖ断片の半減期が短いことである。これらの問題を克服するための試みには、付加されたＣ末端システインを含むＳｃＦＶから化学的結合によって（例えば、Adams et al., Cancer Res. 53:4026-4034 (1993)およびMcCartney et al., Protein Eng. 8:301-314 (1995)を参照）、または不対のＣ末端システイン残基を含むＳｃＦｖの自発的な部位特異的二量体化によって（例えば、Kipriyanov et al., Cell. Biophys. 26:187-204 (1995)を参照）産生された、二価の（ＳｃＦｖ’）_２が含まれる。あるいはＳｃＦｖは、「二重特異性抗体」を形成するために、ペプチドリンカーを３ないし１２残基に短くすることによって強制的に多量体を形成させることができる（例えば、Holliger et al., PNAS 90:6444-6448 (1993)を参照）。リンカーを短くすることで、さらに、「トリボディ」を形成するＳｃＦＶ三量体（例えば、Kortt et al., Protein Eng. 10:423-433 (1997)を参照）および「テトラボディ」を形成する四量体（例えば、Le Gall et al., FEBS Letters 453: 164-168 (1999)を参照）がもたらされ得る。二価のＳｃＦＶ分子の構築はまた、「ミニ抗体」（例えば、Pack et al., Biochemistry 31 : 1579-1584 (1992)を参照）および「ミニボディ」（例えば、Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061 (1996)を参照）を形成する、タンパク質二量体化モチーフとの遺伝的融合によっても達成され得る。第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖユニットを連結することで、ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）_２）もまた産生され得る（例えば、Kurucz et al., J. Immunol. 154:4576-4582 (1995)を参照）。二重特異性抗体は、短いリンカーによって別の抗体のＶＬ領域に結合した一抗体由来のＶＨ領域を含む、２本の単鎖の融合産物の非共有結合を通して産生され得る（例えば、Kipriyanov et al., Int. J. Can. 77:763-772 (1998)を参照）。このような二重特異性抗体の安定性は、ジスルフィド結合もしくは「knob in hole」変異の導入によって、または、２つの複合型ＳｃＦｖ断片がペプチドリンカーを介して結合した、単鎖二重特異性抗体（ＳｃＤｂ）の形成によって強化され得る（例えば、Kontermann et al., J. Immunol. Methods 226: 179-188 (1999)を参照）。四価の二重特異性分子は、例えばＳｃＦｖ断片を、ＩｇＧ分子のＣＨ３領域に、またはヒンジ領域を介してＦａｂ断片に融合することによって得られる（例えば、Coloma et al., Nature Biotechnol. 15: 159-163 (1997)を参照）。あるいは、四価の二重特異性分子は、二重特異的な単鎖二重特異性抗体の融合によって入手できる（例えば、Alt et al., FEBS Letters 454:90-94(1999)を参照）。より小さな四価の二重特異性分子は、ヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフを含むリンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（ＤｉＢｉミニ抗体）（例えば、Muller et al., FEBS Letters 432:45-49 (1998)を参照）または４つの抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を、分子内の対形成を阻止する配向において含む単鎖分子（タンデム二重特異性抗体）（例えば、Kipriyanov et al., J. Mol. Biol. 293:41-56 (1999)を参照）のいずれかの二量体化によっても形成することができる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２断片は、Ｆａｂ’断片の化学的結合によって、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化によって作製できる（例えば、Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)およびKostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照）。単離されたＶＨおよびＶＬ領域もまた入手可能である（例えば、参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第６，２４８，５１６号；第６，２９１，１５８号；および第６，１７２，１９７号を参照）。

医薬製剤
本発明の抗体もしくはそのＦＫＮ結合断片を含む治療用製剤は、水性または乾燥製剤の形において、生理的に許容される担体、賦形剤、もしくは安定剤と組み合わせてよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤には、例えば生理食塩水；リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような、塩を形成する対イオン；またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。

本発明の抗体またはそのＦＫＮ結合断片は、マイクロカプセル内、コロイド性薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、またはナノカプセル）内、またはマクロエマルション内に封入されてよい。抗体の投与を必要とするいずれの疾患にも適した放出特性を有する製剤において、抗体の持続放出投与が望まれる場合には、抗体のマイクロカプセル化が意図され得る。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸類（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）のような、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される、注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

in vivo投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。

併用療法
本発明の治療用抗体またはそのＦＫＮ結合断片は、治療法において単独か、またはその他の組成物と併用して用いることができる。例えば本発明の抗体は、別の抗体、抗炎症薬、細胞傷害剤、抗血管新生薬、サイトカイン、増殖抑制薬、または抗ＴＮＦ−α治療薬の１以上と同時投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本発明の抗体の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。

抗ＦＫＮ抗体またはそのＦＫＮ結合断片と併用して投与される治療薬の有効量は、医師の判断によるであろう。投与量決定は、処置される状態への最大の対応が達成されるように算出される。用量は、用いられる治療薬の型、および処置される特定の被験者のような因子にさらに依存し得る。適切な投与量は、追加の治療薬と抗ＦＫＮ抗体またはそのＦＫＮ結合断片との併用作用（相乗作用）のために少なくすることができる。

抗炎症薬
抗炎症性化合物は、本発明の抗体またはＦＫＮ結合断片と併用して投与されてよい。代表的な抗炎症薬には、グルココルチコイドのようなステロイド類、非ステロイド性抗炎症薬（例えばイブプロフェンまたはタクロリムス）、ロフェコキシブ（Vioxx（登録商標））およびセレコキシブ（Celebrex（登録商標））のようなシクロオキシゲナーゼ−２−特異的阻害剤、副腎皮質ステロイド類（例えばプレドニゾンまたはヒドロコルチゾン）、Ｔリンパ球機能を標的とした特異的サイトカイン、フルルビプロフェン、ジクロフェナク、およびケトロラクが含まれる。例えば、参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第７，１１２，５７８号および第７，１９９，１１９号を参照されたい。

その他の薬剤
投与されてよいその他の治療薬には、例えばアミノサリチル酸類（例えば５−アミノサリチル酸）、スルファサラジン（例えばアザルフィジン）、メサラミン（例えばAsacol（登録商標）またはPentasa（登録商標））、アザチオプリン（例えばImuran（登録商標））、６−メルカプトプリン（例えばPurinethol（登録商標））、シクロスポリン、メトトレキサート、インフリキシマブ（例えばRemicade（登録商標））、インターフェロン（例えばインターフェロン−β）、グラチラマー酢酸塩（例えばCopaxone（登録商標））、ナタリズマブ（Tysabri（登録商標））、抗インテグリンα４、ウルソデオキシコール酸、
タクリン塩酸塩、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤、リドカイン、スルホニル尿素、シクロホスファミド、静注用免疫グロブリン、アミトリプチリン、アヘン剤（例えばモルヒネ）、ジフェノキシラート、アトロピン、ビタミンＤ、カルシウム、ラモトリギン、クエチアピン、プロスタグランジンＥ１、ニトログリセリン、ペガプタニブ、ラニビズマブ、硝酸イソソルビド、ペロスピロン、トピラマート、オクスカルバゼピン、ドーパミン、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、レベチラセタム、フェンタニル、トラマドール、ジギタリス、カプサイシン、ナトリウム利尿ペプチド、クロニジン、−ドロネート（例えばアレンドロネート）、ベザフィブラート、メキシレチン、グリニド類（例えばナテグリニドまたはレパグリニド）、ドネペジル塩酸塩、レフルノミド、プレガバリン、リバスチグミン酒石酸塩、フェンタニル、プロスタサイクリン、プロカインアミド、コルヒチン、α−グルコシダーゼ阻害剤、利尿薬（例えばサイアザイド系利尿薬、または抗アルドステロン性利尿薬）、タクロリムス、メマンチン塩酸塩、ペンタゾシン、クロピドグレル、組織プラスミノーゲン活性化因子、サリドマイド、アンジオテンシン受容体遮断薬、チアゾリジンジオン、メトロニダゾール、スピロノラクトン、デュロキセチン、パロキセチン、クロニジン、チクロピジン、ヘパリン、カルシウムチャネル遮断薬、インスリン、アルブミン、ブシラミン、カルバマゼピン、リスペリドン、リマプロスト、ワルファリン、ベルテポルフィン、ガバペンチン、ガランタミン臭化水素酸塩、アスピリン、ウロキナーゼ、クロラムブシル、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ビグアナイド、β−アドレナリン受容体阻害剤または作用薬、ヒドロキシクロロキン、およびミトキサントロンが含まれる。

本明細書に記載する疾患（例えば炎症性疾患）の処置は、その他の治療法の施行をさらに含んでよい。例えば血漿分離交換法（例えば血漿交換療法）が、例えばギラン・バレー症候群、脱髄性多発神経根症（例えば慢性炎症性脱髄性多発神経根症）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ベーチェット病、または多発性硬化症を処置するために用いられてよい。

投与量および投与
炎症性疾患の緩和または処置は、一般に、疾患に付随する１以上の症状または合併症を減少させることを含む。炎症性疾患の場合、治療用抗体、ＦＫＮ結合断片、またはその医薬組成物の治療上有効な量は、以下のうちの１、または組み合わせにより達成され得る：炎症の縮小；腹痛または痙攣の減少；腹部膨満感の減少；下痢の減少または排除；消化管の潰瘍の縮小；熱の低下；悪心の減少または軽減；倦怠感の減少；体重減少の最少化；関節痛の軽減；腫脹の縮小；掻痒感または皮膚発疹の軽減；黄疸の排除；および／または炎症性疾患に付随する１以上の症状の軽減。投与される抗体の「治療上有効な量」は、炎症性疾患を予防、寛解、または治療するために必要な最小量である。

本明細書に記載する抗体、ＦＫＮ結合断片、および医薬組成物は、急速投与または一定期間にわたる連続的な点滴による静脈内投与、局所、経口、皮下、気管支内注入により、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣、経直腸、関節内、動脈内、病巣内、非経口、脳における脳室内、または眼内のような、公知の方法に従って被験者へ投与される。処置が広範な副作用または毒性を伴う場合には、局所投与が特に望まれ得る。

経口で使用される製剤は、咀嚼錠、もしくは有効成分が不活性の固形希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分が水性もしくは油性の溶媒と混合された軟ゼラチンカプセルとしても提供され得る。

Ｅｘ ｖｉｖｏの計画もまた、治療上の応用のために用いることができる。Ｅｘ ｖｉｖｏの計画は、被験者から得た細胞に、抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトまたは形質導入することに関与する。トランスフェクトまたは形質導入された細胞は、次に被験者へ戻される。細胞は、造血性細胞（例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋肉細胞を含むがこれらに限定されない、広範な型のいずれであってもよい。

本発明の組成物の投与量およびタイミングは、被験者の総合的な健康状態および炎症性疾患の症状の重症度を含む、様々な臨床的因子に依存する。処置は、１日ないし４年、１日ないし３年、１日ないし２年、１日ないし１年、１ないし１００日、１ないし６０日、１ないし２０日、１ないし１０日の範囲の期間、、または炎症性疾患もしくは炎症性疾患の症状が、処置されるかもしくは緩和されるまで継続され得る。本発明の組成物は、１日４回、１日３回、１日２回、毎日、週１回、月２回、月１回、２か月に１回、３か月に１回、または年１回投与されてよい。投与量は状態の重症度によって変動し、定常状態の血中濃度が約１ｎｇ／ｍＬないし１０μｇ／ｍＬ、または１ないし５００ｎｇ／ｍＬの範囲となるように設定される。投与される抗体の量は、典型的には、被験者の体重あたり約０．００１ないし約３０ｍｇ／ｋｇの範囲である（例えば被験者の体重あたり０．０１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ）。

以下の実施例により本発明を例証するが、これは本発明を限定することを意図したものではない。

［実施例１］マウス抗ヒトフラクタルカイン（ｈＦＫＮ）モノクローナル抗体の調製
マウス抗ｈＦＫＮモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以前に記載されたように作製した（例えば、参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第７，３９０，４９０号を参照）。中和ｍＡｂクローン１Ｆ３−１、３Ａ５−２、１Ｆ３、１Ｇ１、２Ｂ２、３Ｄ５、３Ｈ７、６Ｄ１、７Ｆ６、および５Ｈ７−６を得た。

［実施例２］ヒト化の候補となるｍＡｂの選択
中和活性測定のための走化性アッセイ、ｈＦＫＮに対する結合親和性測定のためのBIACORE（登録商標）アッセイ、およびカニクイザルＦＫＮに対する種交差反応性測定のための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、クローン１Ｆ３−１、３Ａ５−２、および５Ｈ７−６を分析した。中和活性、結合親和性、およびカニクイザルＦＫＮに対する種交差反応性を図２に要約する。クローン３Ａ５−２は、ｈＦＫＮに対して最も高い中和活性および最も高い結合親和性を示した。クローン３Ａ５−２は、カニクイザルＦＫＮとｈＦＫＮに対して同等の反応性を示した。従って、クローン３Ａ５−２をヒト化の候補として選択した。

走化性アッセイは以下のように行った。細胞をトランスウェル培養プレート（MultiScreen-MIC Plate、５．０μｍ、Millipore、カタログ番号ＭＡＭＩＣ ５Ｓ１０）の上部のウェルに入れ、下部のウェルにリガンドを入れた。最初に、組み換えヒトＦＫＮ（R&D Systems、カタログ番号３６２−ＣＸ／ＣＦ）（最終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）（図１）を、様々な濃度の（０から１０μｇ／ｍｌ）精製した抗体と共に、室温でプレインキュベートした。組成物は、以下の成分を含んだ：１０ｘケモカイン溶液、１５μｌ／ウェル；１０ｘ精製ｍＡｂ、１５μｌ／ウェル；および１ｘ走化性緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．５％ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０μΜ ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen））、１２０μｌ／ウェル。３０分後、ＣＸ３ＣＲ１をトランスフェクトしたＢ３００．１９細胞（２ｘ１０^５細胞／７５μｌ）を上部のウェルに入れ、５％−ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション後、下部ウェルの溶液を１５０μｌ回収し、５０μｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳによって固定した後、３０μｌのサンプルから、FACSCantoIIセルアナライザーによって遊走細胞をカウントした。

BIACORE（登録商標）アッセイは以下のように行った。組み換えプロテイン−Ａ／Ｇ（Pierce Chemical）を、アミンカップリング試薬（GE Healthcare）によって予め活性化したBIACORE（登録商標）センサーチップ（ＣＭ５）に固定化した。精製したｍＡｂを、０．２μｇ／ｍｌの濃度でセンサーチップ内に加えた。可溶性抗原（分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に結合させた可溶性ＦＫＮまたはコントロールＳＥＡＰタンパク質）を、様々な濃度（０から２００ｎＭ）でセンサーチップ内に加えた。添加した抗原と、センサーチップ上に捕捉されたｍＡｂとの結合を連続的にモニターし、抗原の相対的な結合応答をBIACORE（登録商標）Ａ１００システム（GE Healthcare）を用いて測定した。

ＥＬＩＳＡは以下のように行った。ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories、カタログ番号７１１−００５−１５２）を、９６ウェルプレート（Nunc、カタログ番号４４２４０２）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（大日本製薬）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルに１０ｎＭのウサギポリクローナル抗ＰＬＡＰ抗体（Biomeda）を加えた（５０μｌ／ウェル）。室温にて１時間インキュベートし、上記のように３回洗浄した後、ウェルにｈＦＫＮ−ＳＥＡＰまたはカニクイザルＦＫＮ−ＳＥＡＰを含む培養上清を加え（最終濃度１ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルに精製した抗ｈＦＫＮ ｍＡｂを様々な濃度（０から１０μｇ／ｍｌ）で加えた。１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories、カタログ番号７１５−０３６−１５１）を０．１６μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、１５〜３０分インキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Arvo, PerkinElmer）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

可溶性ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰは以下のように調製した。ｈＦＫＮの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、５’−ＳａｌＩ−ｈＦＫＮプライマー（CGCGTCGACGCCACCATGGCTCCGATATCTCTGTC；配列番号２）および３’−ＮｏｔＩ−ｈＦＫＮプライマー（GCGGGCGGCCGCCCTCCGGGTGGCAGCCTGGG；配列番号３）によって増幅し、ＳＥＡＰ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｄＳａｌＩ ＳＥＡＰベクターへサブクローニングした。ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰの発現ベクターを、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ（ＨＥＫ２９３Ｅ）細胞（Invitrogen）へトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は、トランスフェクションの前日に、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）中にまいた。トランスフェクションの日に、培地をOPTI-MEM II無血清培地（Invitrogen）に交換した。TransIT LT1（タカラバイオ）を製造元の指示に従って用いて、発現ベクターをトランスフェクトした。３日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）後、培養上清を回収した。ＳＥＡＰタンパク質の濃度を、Great EscAPe SEAP Chemiluminescence Kit 2.0（Clontech）を用いて測定した。

可溶性カニクイザルＦＫＮ−ＳＥＡＰは以下のように調製した。カニクイザルＦＫＮの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、５’−ＸｈｏＩ−カニクイザルＦＫＮプライマー（GCGCTCGAGGCCACCATGGCTCCGATATCTCTGTCGTGG；配列番号４）および３’−ＮｏｔＩ−カニクイザルＦＫＮプライマー（CGCGGCGGCCGCGGTGGCAGCCTGGGAGTCAGGGAC；配列番号５）によって増幅し、ＳＥＡＰ ｃＤＮＡを含むｐＥＮＴＲ１Ａ（Invitrogen）へサブクローニングした。カニクイザルＦＫＮおよびＳＥＡＰをコードする断片を、GATEWAYシステム（Invitrogen）を用いて、カセットＢを含むｐｃＤＮＡ３．１へ移入した。カニクイザルＦＫＮ−ＳＥＡＰを含む培養上清を上記のように調製した。

［実施例３］クローン３Ａ５−２マウス抗ｈＦＫＮ ｍＡｂの、重鎖および軽鎖の可変領域のｃＤＮＡクローニング
クローン３Ａ５−２の、重鎖および軽鎖のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。
クローン３Ａ５−２のハイブリドーマから、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡ合成用キット（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成し、重鎖に対して５’−Ｍｍ−ＨＣ−Ｌｅａｄｅｒ１プライマー（GGGATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT；配列番号６）、５’−Ｍｍ−ＨＣ−Ｌｅａｄｅｒ２プライマー（GGGATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT；配列番号７）または５’−Ｍｍ−ＨＣ−Ｌｅａｄｅｒ３プライマー（GGGATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT；配列番号８）および３’−Ｍｍ−ＩｇＧ２ａ−ＣＨ３−Ｒプライマー（TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTC；配列番号９）、ならびに軽鎖に対して５’−Ｍｍ−ＬＣ−Ｌｅａｄｅｒ１プライマー（GGGATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT；配列番号１０）または５’−Ｍｍ−ＬＣ−Ｌｅａｄｅｒ２プライマー（GGGATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG；配列番号１１）または５’−Ｍｍ−ＬＣ−Ｌｅａｄｅｒ３プライマー（GGGATGRAGTCACAKACYCAGGTCTTYRTA；配列番号１２）または５’−Ｍｍ−ＬＣ−Ｌｅａｄｅｒ４プライマー（GGGATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGR；配列番号１３）または５’−Ｍｍ−ＬＣ−Ｌｅａｄｅｒ５プライマー（GGGATGAAGTTGGCTGTTAGGCTGTTG；配列番号１４）および３’−Ｍｍ−Ｃｋａｐｐａ−Ｒプライマー（CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC；配列番号１５）をそれぞれ用いて増幅した。増幅したｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen）へサブクローニングした。ABI3130XLを用いて配列を解析した。完全長の重鎖および５’端の配列を欠失したＬ鎖を得た。Ｌ鎖の５’端の配列を増幅して正確なリーダー配列を同定するため、５’−ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（５’−ＲＡＣＥ）を行った。ｃＤＮＡ合成用キット（タカラバイオ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、５’アダプター（ａｄ２９Ｓ；ACATCACTCCGT（配列番号１６）およびａｓ２９ＡＳ；ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT（配列番号１７）をアニールした）を加えた。第１ＰＣＲに対して５’−ＰＣＲ１プライマー（GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG；配列番号１８）を、および第２ＰＣＲに対して５’−ＰＣＲ４プライマー（AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG；配列番号１９）を、およびＨ鎖の第１ＰＣＲに対して３’ＨＣ ＲＡＣＥプライマー＿１（GTACGGAGTACTCCAAAAATGTTG；配列番号２０）を、またはＨ鎖の第２ＰＣＲに対して３’ＨＣ ＲＡＣＥプライマー＿２（TCTTCAGGCTGCAGGCTGATGATC；配列番号２１）を、Ｌ鎖の第１ＰＣＲに対して３’ＬＣ ＲＡＣＥプライマー＿３（AAATCTTCAGGCTGCAGGCTGTTG；配列番号２２）を、またはＬ鎖の第２ＰＣＲに対して３’ＬＣ ＲＡＣＥプライマー＿４（CTGTTGATCTTGAGAGAATATTGTG；配列番号２３）をそれぞれ用いてｃＤＮＡを増幅した。上記のように、増幅したｃＤＮＡをサブクローニングして配列決定した。同定した可変領域の配列を以下に示す。

重鎖（Ｈ）可変領域のヌクレオチド配列：
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAACTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAGATGGTAGTCCTAAGTTCAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACTGCAGACAAGTCCTCAAACACAGCCTACATGTTGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAAGACTCTGCGATCTATTTCTGTGCAACTGGGCCCACTGATGGCGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA（配列番号２４）

軽鎖（Ｌ）可変領域のヌクレオチド配列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGCGGGAATATTCACAATTTTTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGTTCCTGGTCTATAATGAAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGATTTATTTCTGTCAACAGTTTTGGAGTACTCCGTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA（配列番号２５）

重鎖（Ｈ）可変領域のアミノ酸配列：
QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGKTTLTADKSSNTAYMLLSSLTSEDSAIYFCATGPTDGDYFDYWGQGTTLTVSS（配列番号２６）

軽鎖（Ｌ）可変領域のアミノ酸配列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNFLAWYQQKQGKSPQFLVYNEKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGIYFCQQFWSTPYTFGGGTKLEIK（配列番号２７）

［実施例４］クローン３Ａ５−２からのヒト化抗ＦＫＮ ｍＡｂの設計
マウス抗ｈＦＫＮ ｍＡｂであるクローン３Ａ５−２を、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法によってヒト化した（Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001)およびTsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)）。ＣＤＲのアミノ酸配列を以下に示す。
ＣＤＲ−Ｈ１：NYYIH（配列番号２８）
ＣＤＲ−Ｈ２：WIYPGDGSPKFNERFKG（配列番号２９）
ＣＤＲ−Ｈ３：GPTDGDYFDY（配列番号３０）
ＣＤＲ−Ｌ１：RASGNIHNFLA（配列番号３１）
ＣＤＲ−Ｌ２：NEKTLAD（配列番号３２）
ＣＤＲ−Ｌ３：QQFWSTPYT（配列番号３３）

ヒトアクセプターフレームワークは、ヒト可変領域区分の中から選択した。同定した３Ａ５−２のＣＤＲを、選択したヒトアクセプターフレームワーク内に移植した。設計したヒト化配列を以下に示す。

Ｈ鎖（Ｈ３と命名；配列番号３６）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVKQAPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGRTTLTADKSTNTAYMLLSSLRSDDTAVYFCATGPTDGDYFDYWGQGTTVTVSS

Ｈ鎖（Ｈ３−２と命名；配列番号３７）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVKQAPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGRTTLTADKSTNTAYMLLSSLRSEDTAVYFCATGPTDGDYFDYWGQGTTVTVSS

Ｌ鎖（Ｌ２と命名；配列番号３８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNFLAWYQQKPGKAPKFLVYNEKTLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYFCQQFWSTPYTFGGGTKVEIK

Ｈ鎖（Ｈ４と命名；配列番号３９）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGRTTLTRDKSTNTAYMELSSLRSDDTAVYFCATGPTDGDYFDYWGQGTTVTVSS

Ｈ鎖の生殖系列配列（配列番号４０）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTXXXXXWVRQAPGQGLEWMGXXXXXXXXXXXXXXXXXRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARXXXXXXXXXXWGQGTTVTVSS

Ｌ鎖の生殖系列配列（配列番号４１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCXXXXXXXXXXXWYQQKPGKAPKLLIYXXXXXXXGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCXXXXXXXXXFGGGTKVEIK

Ｈ鎖（ＨＫ２と命名；配列番号４２）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGRTTMTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGPTDGDYFDYWGQGTTVTVSS

Ｈ鎖（ＨＫ３と命名；配列番号４３）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGSPKFNERFKGRTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGPTDGDYFDYWGQGTTVTVSS

Ｌ鎖（Ｌ４と命名；配列番号４４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNFLAWYQQKPGKAPKLLIYNEKTLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQFWSTPYTFGGGTKVEIK

Ｌ鎖（Ｌ５と命名；配列番号４５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNFLAWYQQKPGKAPKLLIYNEKTLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYFCQQFWSTPYTFGGGTKVEIK

全てのヒト化配列を整列させた（図３および４）。

［実施例５］ヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂ発現ベクターの構築
ヒト化ｍＡｂを発現させるリーダー配列を選択するため、ＡＡＡ６８４２７．１およびＡＢＵ９０６０２．１との類似性に基づいて生殖細胞系のセグメントを探索した。ＶＨ１−１−１８およびＶＫＩ−Ｏ１２のセグメントが、それぞれＡＡＡ６８４２７．１およびＡＢＵ９０６０２．１に最も類似していた。これらのリーダー配列を、ヒト化ｍＡｂの発現に用いた。これらのリーダー配列を以下に示す。

Ｈ鎖アミノ酸配列（配列番号４６）
MDWTWSILFLVAAPTGAHS

Ｈ鎖ヌクレオチド配列
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGCCCACTCC（Ｈ３およびＨ３−２に対する；配列番号４７）
ATGGACTGGACATGGTCCATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTCCAACTGGCGCACACTCT（ＨＫ２およびＨＫ３に対する；配列番号４８）

Ｌ鎖アミノ酸配列（配列番号４９）
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC

Ｌ鎖ヌクレオチド配列（配列番号５０）
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT

設計したヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂの可変領域に上記のリーダー配列を加えたものを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって作製した。

Ｈ３重鎖に対する
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−１プライマー（配列番号５１）：
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−２Ｒプライマー（配列番号５２）：
CCAGACTGCACCAGCTGCACCTGGGAGTGGGCACCTGTTGGTGCTGCCAC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−３プライマー（配列番号５３）：
GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGT
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−４Ｒプライマー（配列番号５４）：
GTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAGACCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTCTT
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−５プライマー（配列番号５５）：
TGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTACTATATACACTGGGTGAA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−６Ｒプライマー（配列番号５６）：
ATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGGGCCTGCTTCACCCAGTGTATATAGTA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−７プライマー（配列番号５７）：
GGACAAGGGCTTGAGTGGATAGGATGGATTTATCCTGGAGATGGTAGTCC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−８Ｒプライマー（配列番号５８）：
GTCCTGCCCTTGAACCTCTCATTGAACTTAGGACTACCATCTCCAGGATA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−９プライマー（配列番号５９）：
GAGAGGTTCAAGGGCAGGACCACCCTGACCGCAGACAAGTCCACGAACAC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−１０Ｒプライマー（配列番号６０）：
GATCTCAGGCTGCTCAGCAACATGTAGGCTGTGTTCGTGGACTTGTCTGC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−１１プライマー（配列番号６１）：
TTGCTGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ３−１２Ｒプライマー（配列番号６２）：
TAGTCAAAGTAGTCGCCATCAGTGGGCCCTGTCGCACAGAAATACACGGC
ｈ３Ａ５−２ ＶＨ３−１３プライマー（配列番号６３）：
GATGGCGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
ｈ３Ａ５−２＿Ｒプライマー（配列番号６４）：
GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACGGTGACCGTGGTCCC

Ｌ２軽鎖に対する
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−１プライマー（配列番号６５）：
GCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGAT
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−２Ｒプライマー（配列番号６６）：
TCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTCACATCTGGCACCTCGGAGCCAG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−３プライマー（配列番号６７）：
CCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGAGCAAGCGGGAATATTCACAATTTTTT
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−４Ｒプライマー（配列番号６８）：
GAACTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGTTGATACCATGCTAAAAAATTGTGAATATTCCCGCTTGCTCGG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−５プライマー（配列番号６９）：
CAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGGTCTATAATGAAAAAACCTTAGCAGATGG GGTCCCATCAAGGTTCAG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−６Ｒプライマー（配列番号７０）：
GTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTATATTGTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−７プライマー（配列番号７１）：
CACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCGACCTACTTCTGTCAACAGTTTTGGAGTACTCCGTAT
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ２−８Ｒプライマー（配列番号７２）：
TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAACGTATACGGAGTACTCCAAAACTGTTGACAGAA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ−Ｒ（配列番号７３）：
GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC

作製したＨ３およびＬ２を、Ｈ３に対して５’−Ｅｃｏ−Ｓａｌ−ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ＿Ｆプライマー（GCGAATTCGTCGACGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTG；配列番号７４）および３’−ＮｈｅＩ−ｈ３Ａ５−２＿ＶＨ＿Ｒ（CGCGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCGTGGTCCC；配列番号７５）、ならびにＬ２に対して５’−ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ＿ＳａｌＩ−ｋｏｚａｃ＿Ｆプライマー（GCGGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCC；配列番号７６）および３’−ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ−Ｒプライマー（GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC；配列番号７７）をそれぞれ用いたＰＣＲによって増幅した。

Ｈ４はGenscript USA Inc.によって作製された。Ｈ４の配列を以下に示す。
Ｈ４（配列番号７８）：
GAATTCGTCGACGCCACCATGGACTGGACATGGTCCATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTCCAACTGGCGCACACTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGTGGCGCTGAGGTGAAGAAACCCGGAGCATCAGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCCAGCGGATACACCTTCACCAACTACTATATTCATTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGGGAC
GGTTCCCCTAAGTTCAACGAAAGGTTTAAAGGCCGGACCACACTGACCAGGGATAAGTCAACCAATACAGCTTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGCTCTGACGATACAGCAGTGTATTTCTGTGCCACTGGGCCAACCGACGGCGACTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGAACTACCGTGACCGTGTCTAGTGCTAGC

ＨＫ２の可変領域は、以下のプライマーによるＰＣＲを用いた点突然変異導入によって、Ｈ４から作製した。
３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿ｓａｌ２４Ｆプライマー（配列番号７９）：
CGCGTCGACGCCACCATGGACTGGACATGGTCCATCCTG
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿２８０Ｆプライマー（配列番号８０）：
ATGACCGCCGATACCTCAACCTCCACAGCTTACATGGAA
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿３００Ｒプライマー（配列番号８１）：
GGTTGAGGTATCGGCGGTCATTGTGGTCCG
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿３４０Ｆプライマー（配列番号８２）：
GAGGATACAGCAGTGTATTTCTGTGCCCGGGGGCCAACC
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿３７０Ｒプライマー（配列番号８３）：
GGCACAGAAATACACTGCTGTATCCTCAGAGCGCAG
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿Ｎｈｅ２４Ｒ（配列番号８４）：
CGCGCTAGCACTAGACACGGTCACGGTAGTTCC

ＨＫ３の可変領域は、以下に示すプライマーによるＰＣＲを用いた点突然変異導入によって、ＨＫ２から作製した。
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿ｓａｌ２４Ｆプライマー（配列番号８５）：
CGCGTCGACGCCACCATGGACTGGACATGGTCCATCCTG
ＨＫＧ３＿Ｒプライマー（配列番号８６）：
TTGACTTATCGGCGGTCAGTGTGGTCCGGCCTTTAAACCTTTC
ＨＫＧ３＿Ｆプライマー（配列番号８７）：
ACACTGACCGCCGATAAGTCAACCTCCACAGCTTACATGGAA
ｈ３Ａ５−２＿ＨＫＧ２＿Ｎｈｅ２４Ｒプライマー（配列番号８８）：
CGCGCTAGCACTAGACACGGTCACGGTAGTTCC

Ｌ４の可変領域は、以下に示すプライマーによるＰＣＲを用いた点突然変異導入によって、Ｌ２から作製した。
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿ｓａｌ２４Ｆプライマー（配列番号８９）：
CGCGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿２００Ｒプライマー（配列番号９０）：
CAGCAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGTTTCTG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿１９０Ｆプライマー（配列番号９１）：
GGGAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCTATAATGAAAAA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿２６０Ｒプライマー（配列番号９２）：
TGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGA
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿２５０Ｆプライマー（配列番号９３）：
AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTATACTCTCACC
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿ＢｓｉＷ２４Ｒプライマー（配列番号９４）：
CGCCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC

Ｌ５の可変領域は、以下に示すプライマーによるＰＣＲを用いた点突然変異導入によって、Ｌ４から作製した。
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿ｓａｌ２４Ｆプライマー（配列番号９５）：
CGCGTCGACGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAG
ＶＬ５＿Ｒプライマー（配列番号９６）：
GGTGAGAGTATACTGTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAAC
ＶＬ５＿Ｆプライマー（配列番号９７）：
GGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGTCTG
ｈ３Ａ５−２＿ＶＬ４＿ＢｓｉＷ２４Ｒ（配列番号９８）：
cgcCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC

ＩｇＧ２およびＩｇκの定常領域を、ＩｇＧ２に対して５’−ＮｈｅＩ−ＩｇＧ２＿Ｆプライマー（CGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC；配列番号９９）および３’−ＥｃｏＲＶ−ＩｇＧ２＿Ｒプライマー（CGCGATATCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG；配列番号１００）、ならびにＩｇκに対して５’−ＢｓｉＷＩ−Ｉｇｋ＿Ｆプライマー（CGCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC；配列番号１０１）および３’−ＥｃｏＲＶ−Ｉｇｋ＿Ｒプライマー（CGCGATATCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT；配列番号１０２）をそれぞれ用いて増幅した。増幅した定常領域を、ＮｏｔＩが欠失したｐＥＮＴＲ１Ａ ｄＮｏｔＩへサブクローニングした。

作製した可変領域を、重鎖に対してＳａｌＩ−ＮｈｅＩ部位、または軽鎖に対してＳａｌＩ−ＢｓｉＷＩ部位をそれぞれ用いて、ｐＥＮＴＲ１Ａ−ＩｇＧ２またはｐＥＮＴＲ１Ａ−Ｉｇκへサブクローニングした。Ｌ２の場合、Ｉｇκの定常領域は５’−ｈＩＧＫ＿Ｆプライマー（CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC；配列番号１０３）および３’−ｈＩＧＫ＿ＮｏｔＩ−Ｒプライマー（CGCGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT；配列番号１０４）を用いて増幅した。増幅したＩｇκ定常領域および作製したＬ２をＰＣＲによって組み合わせ、ｐＥＮＴＲ１Ａへサブクローニングした。サブクローニングした可変領域および定常領域を、GATEWAYシステム（Invitrogen）を用い、重鎖および軽鎖それぞれについてpEE6.4またはpEE12.4（Lonza）へ移入した。

Ｈ３−２は、GeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemを用いた点突然変異導入により、ｐＥＮＴＲ１Ａ−Ｈ３−ＩｇＧ２から５’−ｈ３Ａ５−２＿Ｈ３−２＿３００Ｆプライマー（TTGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCC；配列番号１０５）および３’−ｈ３Ａ５−２＿Ｈ３−２＿３２０Ｒプライマー（AGATCTCAGGCTGCTCAGCAACATGTAGGC；配列番号１０６）によって作製した。GeneTailorによる部位特異的変異誘発は、製造元の指示に従って行った。変異導入した可変領域および定常領域を、上記のようにpEE6.4へ移入した。

［実施例６］ヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂの調製
ヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂの重鎖および軽鎖の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの日に、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）にまいた。５時間インキュベートした後、重鎖および軽鎖発現ベクターの混合を、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を製造元の指示に従って用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日、培地を２９３無血清培地（ＳＦＭ）ＩＩ（Invitrogen）と交換した。３７℃にて５日間インキュベートした後、培養上清を回収した。BIACORE（登録商標）アッセイには、回収した培養上清を直接使用
した。走化性アッセイには、上清を組み換えプロテインＡセファロースカラム（Pharmacia）を用いて精製した。

［実施例７］マウス−ヒトキメラ３Ａ５−２ｍＡｂの調製
マウス３Ａ５−２の重鎖の可変領域は、５’−ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ−３Ａ５−２ＶＨプライマー（GCGGAATTCGTCGACGCCACCATGCGATGGAGCTGGATC；配列番号１０７）および３’−ＩｇＧ重複３Ａ５−２ＶＨプライマー（GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC；配列番号１０８）によって増幅した。ヒトＩｇＧ２定常領域は、５’−ｈＩｇＧ２プライマー（GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTG；配列番号１０９）および３’−ＮｏｔＩ−ｈＩｇＧ２（CGCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG；配列番号１１０）によって増幅した。増幅した３Ａ５−２ＶＨおよびヒトＩｇＧ２定常領域をＰＣＲによって組み合わせ、細胞選択のためのブラストサイジン耐性遺伝子を有するｐＣＸ−ＩＲＥＳ−ｂｓｒへサブクローニングした。マウス３Ａ５−２の軽鎖の可変領域は、５’−３Ａ＿ＶＬ−ＳａｌＩ−ｋｏｚａｃ＿Ｆプライマー（GCGGTCGACGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAG；配列番号１１１）および３’−３Ａ−ＩｇＧ１，２＿ＶＨ−Ｒプライマー（GACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT；配列番号１１２）によって増幅した。ヒトＩｇκ定常領域は、５’−ｈＩＧＫ＿Ｆプライマー（CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC；配列番号１１３）および３’−ｈＩＧＫ ＮｏｔＩ−Ｒ（CGCGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT；配列番号１１４）によって増幅した。増幅した３Ａ５−２ＶＨおよびヒトＩｇＧ２定常領域をＰＣＲによって組み合わせ、細胞選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子を有する、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏへサブクローニングした。

レトロウイルスパッケージングのために、キメラ軽鎖の発現ベクターをpE-EcoおよびpGp（タカラバイオ）と共にＨＥＫ２９３Ｅ細胞へトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は、トランスフェクションの前日に、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ（Invitrogen）中にまいた。トランスフェクションの日に、ベクターをTranIT LT1（タカラバイオ）によってトランスフェクトした。３日間インキュベートした後、レトロウイルスを含む培養上清を回収して、Ｂ３００．１９細胞へ加えた。８時間インキュベートした後、培養上清を除いて１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）を加えた。２日間培養した後、感染細胞を選択するためピューロマイシンを加えた。選択した細胞は、次に、軽鎖について記載したものと似た方法によって作製したキメラ重鎖を有する、別の組み換えレトロウイルスに感染させた。ブラストサイジンを用いて選択後、二重選択された細胞を、Integra CELLine（Integra Bioscience）内で、８ｍＭ Glutamax、５５μΜ ２−メルカプトエタノール、１ｘコレステロール（Invitrogen）を含むSF-O培地（三光純薬）によって培養した。培養上清を、走化性アッセイおよびBIACORE（登録商標）アッセイのために、組み換えプロテインＡセファロースカラム（Pharmacia）を用いて精製した。

［実施例８］ヒト化ｈＦＫＮ ｍＡｂの分析
中和活性を測定するための走化性アッセイならびにｈＦＫＮおよびカニクイザルＦＫＮに対する結合親和性を測定するためのBIACORE（登録商標）アッセイを用いて、ヒト化抗ｈＦＫＮ ｍＡｂを分析した。３回の独立した走化性アッセイの代表的なデータおよび結果を図５にまとめ、かつ図６Ａ〜Ｂ、７Ａ〜Ｄ、および８Ａ〜Ｆに示す。重鎖であるＨ３およびＨ３−２と、軽鎖であるＬ２およびＬ４との組み合わせは全て、これらのｍＡｂがキメラｍＡｂと類似の中和活性を示したことから、ヒト化に成功した。しかしながら、絞りこまれた重要残基を用いて作製したＨＫ２は、Ｌ２またはＬ４との組み合わせにおいて、中和活性の低下を示した。BIACORE（登録商標）アッセイの結果を、図９および１０Ａ〜Ｃにまとめる。重鎖であるＨ３およびＨ３−２と、軽鎖であるＬ２およびＬ４との組み合わせは全て、キメラｍＡｂに比較して類似のレベルの親和性を示した。一方で、ＨＫ２Ｌ４は他よりも低い親和性を示した。これらの結果により、３Ａ５−２は、特に重鎖の場合に、通常の重要残基の同定を用いる一般的な方法によってはヒト化に成功しなかったことが示唆される。

走化性アッセイは以下のように行った。細胞をトランスウェル培養プレート（MultiScreen-MIC Plate、５．０μｍ、Millipore、カタログ番号ＭＡＭＩＣ ５Ｓ１０）の上部のウェルに入れ、下部のウェルにリガンドを入れた。最初に、組み換えヒトＦＫＮ（R&D Systems、カタログ番号３６２−ＣＸ／ＣＦ）（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を、様々な濃度の（０から１０μｇ／ｍｌ）精製抗体と共に下部のウェルに加えた。組成物は、以下の成分を含んだ：３ｘケモカイン溶液、５０μｌ／ウェル；１．５ｘ精製ｍＡｂ、１００μｌ／ウェル；ケモカインおよび精製抗体は、１ｘ走化性緩衝液（上記）により希釈した。ＣＸ３ＣＲ１をトランスフェクトしたＢ３００．１９細胞（２ｘ１０^５細胞／７５μｌ）を、様々な濃度の（０から１０μｇ／ｍｌ）精製抗体と共に上部のウェルに加えた。組成物は、以下の成分を含んだ：３ｘ細胞懸濁液、２５μｌ／ウェル；１．５ｘ精製ｍＡｂ溶液、５０μｌ／ウェル；細胞および精製抗体は１ｘ走化性緩衝液により希釈した。走化性アッセイは、５％−ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて４時間行った。インキュベーション後、下部ウェルの１５０μｌを回収し、５０μｌの４％ＰＦＡ／ＰＢＳによって固定した後、３０μｌのサンプルから、FACSCantoIIセルアナライザーによって遊走細胞をカウントした。

BIACORE（登録商標）アッセイは上記のように行った。しかしながらヒト化およびキメラｍＡｂに対しては、センサーチップ上の捕捉抗体として抗ヒトＩｇＧマウスｍＡｂ（GEHealthcare）を用いた。

［実施例９］ＦＫＮケモカインドメイン由来の合成ペプチドを用いたエピトープマッピング
ＦＫＮケモカインドメイン由来の、互いに一部分を重複させた合成ペプチドライブラリーを用いて、エピトープマッピングを行った。Sigma Genosysにより、２１種類の１５残基ペプチドを合成した。ペプチドをＤＭＳＯで１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。これらのペプチド（５０μｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）に４℃にて一晩コートした。ペプチド溶液を除去し、各ウェルに１％ブロックエース（大日本製薬）を含むＰＢＳ溶液を加えて１時間室温でインキュベートした後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（洗浄液）により洗浄した。ウェルにＨ３−２Ｌ４抗体溶液（５０μｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間インキュベートした。抗体溶液を除き、洗浄液で洗浄した。ウェルにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（Zymed；４００ｎｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除き、洗浄液で洗浄した。各ウェルにＴＭＢＺ溶液（Sigma）を加え、室温で１０分インキュベートした。反応を１Ｎ Ｈ_２Ｓ０_４溶液によって停止させ、４５０〜６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１１に示す。Ｈ３−２Ｌ４抗体は、ヒトＦＫＮのＮ末端および中央領域由来のペプチドと反応した。

［実施例１０］アラニンまたはセリン置換変異体の調製
ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰのアラニンまたはセリン置換変異体を、以下のように調製した。ｈＦＫＮの細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰの発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰからＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を用いて単離し、ＳＥＡＰ ｃＤＮＡを含むｐＥＮＴＲ１Ａ＿ｄＳＥＡＰ−（Ｈｉｓ）１０ベクターへサブクローニングした（pENTR1AはInvitrogenから購入した）。アラニンまたはセリン置換変異は、GeneTailor（商標）Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen）を、製造元の指示に従って用いて導入した。変異導入したｈＦＫＮ−ＳＥＡＰのｃＤＮＡ断片を、Gatewayシステム（Invitrogen）を用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）＿カセットＢベクター（カセットＢはInvitrogenから購入した）へ移入した。ｈＦＫＮ−ＳＥＡＰのアラニンまたはセリン置換変異体の発現ベクターを、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ（ＨＥＫ２９３Ｅ）細胞（Invitrogen）へトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は、トランスフェクションの前日に、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）中にまいた。TransIT LT1（タカラバイオ）を製造元の指示に従って用いて、発現ベクターをトランスフェクトした。３日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）後、培養上清を回収した。ＳＥＡＰタンパク質の濃度を、Great EscAPe SEAP Chemiluminescence Kit 2.0（Clontech）を用いて測定した。

［実施例１１］ｈＦＫＮのエピトープマッピングのためのＥＬＩＳＡ
抗ｈＦＫＮポリクローナル抗体（eBioscience）およびＨ３−２Ｌ４をそれぞれ、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）のウェルに一晩４℃にてコートした。それぞれについて抗体溶液を除去し、各ウェルに１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを加えて１時間室温でインキュベートした後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（洗浄液）により洗浄した。アラニンまたはセリン置換変異体を１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで０．１３ｎＭに希釈し、その５０μｌをＥＬＩＳＡプレートに加えて４時間室温にてインキュベートした。変異体を含む溶液を除き、洗浄液で洗浄した。各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Thermo Scientific）を加え、室温で３０分インキュベートした。反応を１Ｎ ＮａＯＨ溶液によって停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１２に示す。Ｒ６８Ａ変異体は、Ｈ３−２Ｌ４との反応性を特異的に失った。Ｈ３−２Ｌ４との反応性を失ったその他の変異体は、ポリクローナル抗体との反応性もまた失った。これらの結果により、Ｒ６８はＨ３−２Ｌ４に対する決定的なエピトープであることが示される。

［実施例１２］BIACORE（登録商標）を用いたｈＦＫＮのエピトープマッピング
抗ヒスチジンタグ抗体（Bethyl）を、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）上に固定化した。アラニンまたはセリン置換変異体を含む溶液をHBS-EP緩衝液（GE Healthcare）で１０倍に希釈してチップ上に載せ、HBS-EPで洗浄した後に抗原結合レベルを測定した。Ｈ３−２Ｌ４および抗ＦＫＮポリクローナル抗体溶液を抗原結合チップに載せ、HBS-EPで洗浄した後に抗体結合レベルを測定した。［抗体結合レベル／抗原結合レベル］を算出し、各変異体について算出した値を野生型の値と比較した。結果を図１３に示す。

［実施例１３］その他の抗体のＲ６８Ａ変異体との反応性
マウス抗ヒトＦＫＮモノクローナル抗体（１Ｆ３、１Ｇ１、２Ｂ２、３Ｄ５、６Ｄ１、７Ｆ６）およびＨ３−２Ｌ４抗体を、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）に一晩４℃にてコートした。抗体溶液を除去した。各ウェルに１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加えて１時間室温でインキュベートした後、ウェルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）によって洗浄した。ウェルに野生型およびＲ６８Ａ変異型のＦＫＮ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ溶液（１、０．５、０．２５、０．１２５ｎＭ）を加え、２時間室温でインキュベートした。抗原溶液を除去し、洗浄液で洗浄した。各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Thermo Scientific）を加え、室温で３０分インキュベートした。反応を１Ｎ ＮａＯＨ溶液によって停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

これらの抗体の中和活性を、上記のような走化性アッセイに基づいて試験した。１０ｎＭのヒトＦＫＮ、および様々な濃度のこれらの抗体を、トランスウェルプレートの下部のウェルに加えた。プレートの上部のウェルに、ＣＸ３ＣＲ１を発現する細胞を加えた。３７℃で４時間インキュベートした後、下部ウェルの培地を回収し、４％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＦＡＣＳアナライザーを用いて細胞数を計数した。中和活性と、Ｒ６８Ａ変異体との反応性の関連について表１に示す。ＣＴＸ活性を強力に中和する抗体は、そのＲ６８Ａ変異体との反応性を失っていた。この結果から、ヒトＦＫＮのＲ６８は、ＦＫＮの機能を効果的に中和できる抗体の重要な認識部位であることが示される。

［実施例１４］ＮＭＲによるｈＦＫＮのエピトープマッピング
Ｈ３−２Ｌ４抗体からのＦａｂの精製
１００ｍｇの精製したＨ３−２Ｌ４抗体の溶液（２０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析緩衝液で抗体濃度を１５ｍｇ／ｍｌに調整し、３０ｍＭのシステインを加えた。抗体溶液に０．２ｍｇのパパイン（Sigma）を加え、３７℃にて１４時間インキュベートした。溶液にヨードアセトアミドを加えて酵素反応を停止させた。パパイン消化した抗体溶液を、ＰＢＳ溶液に対して一晩室温で透析した。溶液をProSep vA（Millipore）カラムに通し、フロースルー画分を回収した。フロースルー画分を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を固定化したカラムに通し、フロースルーを回収した。フロースルー画分を濃縮し、Superose 12 10/300 GL（GE Healthcare）に通して、Ｆａｂ断片を含む画分を回収した。これらの画分の純度をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、Ｆａｂが濃縮された画分を集めた。

フラクタルカインにおけるＦａｂ結合部位の同定
フラクタルカインにおけるＦａｂの結合部位を同定するため、安定同位体標識した（^２Ｈ、^１５Ｎおよび^２Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ）フラクタルカインを調製し（Mizoue, L et al., Biochemistry, 38: 1402-1414 (1999)）、^１５Ｎ−異核種単一量子コヒーレンス法（ＨＳＱＣ）に基づくＮＭＲ実験を実行した。２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）および８０％Ｄ_２Ｏ（交差飽和実験）または５％Ｄ_２０（その他の実験）中でＮＭＲサンプルを調製した。全てのＮＭＲ実験は、低温プローブを備えた７００ＭＨｚ Bruker Avance分光計において、４５℃の温度下で行った。

非標識Ｆａｂの添加によってフラクタルカインのスペクトルが変化したことから、標識フラクタルカインとＦａｂの間の相互作用が示唆される。Ｆａｂと複合体形成したフラクタルカインの、主鎖^１５Ｎおよび^１Ｈ_Νの連鎖帰属は、３Ｄ ＨＮＣＡスペクトルから完成させた。

交差飽和実験は、タンパク質−タンパク質相互作用の結合接触面を決定するための、最も正確なＮＭＲ法の一つである（Takahashi, H et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 7: 220-223 (2000)）。実験の結果、Ｆａｂへの選択的照射によって幾つかの残基由来シグナルの強度が減少した（図１４）。これらの残基は、２つの別々の近接した領域に位置した。一領域はＥ６６〜Ｑ６９からなり、もう一つの領域はＷ８１〜Ｑ８７からなる。さらに、これらの残基の化学シフトがＦａｂの添加によって大きく影響されたことにより、交差飽和実験のデータが支持される（図１４）。これらの結果から、本発明者らは、これらの領域がＦａｂの接触面に含まれると結論付けた。

その他の実施形態
前述の説明から、本明細書に記載する発明を様々な使用法および条件において用いるため、これに変更および改変が為され得ることは明らかである。このような実施形態もまた、以下の請求項の範囲内である。

本明細書で言及される全ての出版物は、それぞれの独立した出版物または特許出願が参照により取り込まれることを明確かつ個別に指示されたものとして同範囲まで参照により本明細書に取り込まれる。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載の発明。