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JP2014523750A - 植物におけるｄｈａおよび他のｌｃ−ｐｕｆａの生成 - Google Patents

植物におけるｄｈａおよび他のｌｃ−ｐｕｆａの生成 Download PDF

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JP2014523750A JP2014523008A JP2014523008A JP2014523750A JP 2014523750 A JP2014523750 A JP 2014523750A JP 2014523008 A JP2014523008 A JP 2014523008A JP 2014523008 A JP2014523008 A JP 2014523008A JP 2014523750 A JP2014523750 A JP 2014523750A
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オーウェンズ メルロ，アン
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Abstract

本発明は、宿主生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成を可能にしかつ／または改善する、ＰＵＦＡシンターゼ系および１つまたは複数のアクセサリータンパク質で遺伝子改変された組換え宿主生物を提供する。本発明は、かかる生物を作製および使用する方法ならびにかかる生物から得られた製品にも関する。

Description

本発明は、宿主生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成を可能にしかつ／または改善する、ＰＵＦＡシンターゼ系および１つまたは複数のアクセサリータンパク質で遺伝子改変された組換え宿主生物（例えば植物）に一般に関する。本発明は、かかる生物を作製および使用する方法（例えば、ＰＵＦＡを得るため）ならびにかかる生物から得られた製品（例えば、油および種子）にも関する。
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、栄養学的適用、医薬適用、産業適用および他の目的のために有用であるとみなされている。しかし、天然供給源（例えば魚油）からおよび化学合成からのＰＵＦＡの現在の供給は、長期の商業的要求には不十分である。
植物（例えば、油糧種子作物）から誘導される植物油は、比較的安価であり、魚油に付随する汚染問題を有さない。しかし、商業的に開発された植物および植物油中に見出されるＰＵＦＡには、より飽和したまたはより長い鎖のＰＵＦＡは典型的には含まれず、リノール酸（１８炭素、Δ９位および１２位に２つの二重結合を有する−−１８：２Δ９，１２）およびリノレン酸（１８：３Δ９，１２，１５）などの脂肪酸が典型的に含まれるに過ぎない。
植物によって内因的に生成される脂肪酸の改変による、植物におけるより不飽和のまたはより長い鎖のＰＵＦＡの生成が記載されている。例えば、脂肪酸エロンガーゼおよび／またはデサチュラーゼをコードする種々の個々の遺伝子による植物の遺伝子改変が、顕著なレベルのより長い鎖およびより不飽和のＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含むが、顕著なレベルのより短い鎖のおよび不飽和度が低い混合型のＰＵＦＡもまた含む、葉または種子の生成を生じるとして記載されている（Qiら、Nature Biotech. 22:739 (2004)；ＷＯ０４／０７１４６７；Abbadiら、Plant Cell 16:1 (2004)；NapierおよびSayanova、Proceedings of the Nutrition Society 64:387-393 (2005)；Robertら、Functional Plant Biology 32:473-479 (2005)；米国出願公開番号２００４／０１７２６８２、米国出願番号６１／３４５，５３７、２０１０年５月１７日出願）。
マメ科（Fabaceae）（またはマメ科（Leguminosae））は、マメ科植物（legume）科、エンドウマメ（pea）科、マメ（bean）科または豆類（pulse）科として一般に公知の、経済的に重要な顕花植物の大きな科である。グリキネ属（Glycine）は、マメ科（Fabaceae）中の１つの属であり、例えば、グリキネ・アルビカンス（Glycine albicans）、グリキネ・アフィオノタ（Glycine aphyonota）、グリキネ・アレナリ（Glycine arenari）、グリキネ・アルギレア（Glycine argyrea）、グリキネ・カネセンス（Glycine canescens）、グリキネ・クランデスチネ（Glycine clandestine）、グリキネ・クルヴァタ（Glycine curvata）、グリキネ・キルトロバ（Glycine cyrtoloba）、グリキネ・ファルカテ（Glycine falcate）、グリキネ・グラセイ（Glycine gracei）、グリキネ・ヒルチカウリス（Glycine hirticaulis）、グリキネ・ヒルチカウリス亜種レプトサ（Glycine hirticaulis subsp. leptosa）、グリキネ・ラクトヴィレンス（Glycine lactovirens）、グリキネ・ラティフォリア（Glycine latifolia）、グリキネ・ラトロベアナ（Glycine latrobeana）、グリキネ・ミクロフィラ（Glycine microphylla）、グリキネ・モンティス−ドウグラス（Glycine montis-douglas）、グリキネ・ペラトサ（Glycine peratosa）、グリキネ・ペスカドレンシス（Glycine pescadrensis）、グリキネ・ピンダニカ（Glycine pindanica）、グリキネ・プレニイ（Gycine pullenii）、グリキネ・ルビギノサ（Glycine rubiginosa）、グリキネ・ステノフィタ（Glycine stenophita）、グリキネ・シンデティカ（Glycine syndetika）、グリキネ・タバキナ（Glycine tabacina）、グリキネ・トメンテラ（Glycine tomentella）、ツルマメ（Glycine soja）およびダイズ（Glycine max）が含まれる。マメ科（Fabaceae）には、ラッカセイ、マメ（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））、ソラマメ（Vicia faba）またはエンドウマメ（Pisum sativum）もまた含まれる。
殆どのダイズ油は、ヒトの消費のために生成された植物油の形態である。産業適用におけるダイズ油の使用に関しても、成長中の市場が存在する。
植物、植物種子または植物油中の大量（例えば、商業的な量）のより長い鎖またはより不飽和のＰＵＦＡ、ならびに植物、植物種子または植物油中のかかるＰＵＦＡが富化された大量の脂質（例えば、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびリン脂質（ＰＬ））を効率的かつ効果的に生成するための比較的安価な方法が、当該分野で必要とされている。本明細書中に記載されているように、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼおよび１つまたは複数のアクセサリータンパク質で遺伝子改変された組換え宿主生物を提供することによって、宿主生物（例えば植物）におけるＰＵＦＡ生成を提供および改善するための系は、当該分野におけるアプローチに対する重要な代替法である。
本発明は、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成するＰＵＦＡシンターゼ（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ）をコードする核酸配列；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）補因子をＰＵＦＡシンターゼ系（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ系）ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列を含む、遺伝子改変された植物（例えば、マメ科（Fabaceae）またはグリキネ属（Glycine）の植物、例えばダイズ）、子孫、種子、細胞、組織またはそれらの一部を対象とする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、または配列番号６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、または配列番号７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、または配列番号８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号６、７もしくは８の核酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、配列番号５に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１０の核酸配列に対して８０％〜９９％同一であるか、または配列番号１０の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、種子特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ＰｖＤｌｅｃ２、ＰｖＰｈａｓｅｏｌｉｎ、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰおよびＢｎａＮａｐｉｎＣから選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）および／または（ｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織またはそれらの一部は、（ｉｉｉ）長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＰＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４に対して８０％〜９９％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号９の核酸配列に対して８０％〜９９％同一な核酸配列を含むか、または配列番号９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、種子特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰおよびＢｎａＮａｐｉｎＣから選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列（複数可）は、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードする核酸配列および／または２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコードする核酸配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部は、ｐＤＡＢ７３６１、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６３、ｐＤＡＢ７３６８、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ７３７０、ｐＤＡＢ１００５１８、ｐＤＡＢ１０１４７６、ｐＤＡＢ１０１４７７、ｐＤＡＢ９１６６、ｐＤＡＢ９１６７、ｐＤＡＢ７３７９、ｐＤＡＢ７３８０、ｐＤＡＢ９３２３、ｐＤＡＢ９３３０、ｐＤＡＢ９３３７、ｐＤＡＢ９３３８、ｐＤＡＢ９３４４、ｐＤＡＢ９３９６、ｐＤＡＢ１０１４１２、ｐＤＡＢ７７３３、ｐＤＡＢ７７３４、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ１０９５０７、ｐＤＡＢ１０９５０８、ｐＤＡＢ１０９５０９、ｐＤＡＢ９１５１、ｐＤＡＢ１０８２０７、ｐＤＡＢ１０８２０８、ｐＤＡＢ１０８２０９、ｐＤＡＢ９１５９、ｐＤＡＢ９１４７、ｐＤＡＢ１０８２２４、およびｐＤＡＢ１０８２２５のうち少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６））および／またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％のＤＨＡ、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１０％のＤＨＡ、または総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＥＰＡ、総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡ、または総脂肪酸の重量で０．０５％〜１％のＥＰＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ-６）、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）、または総脂肪酸の重量で０．０１％〜１％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０または１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、または遺伝子改変された植物、子孫、種子、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０または１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）は、油の重量で７０％〜９９％のトリグリセリドを含む。
いくつかの実施形態において、検出可能な量のＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡは、遺伝子改変された植物、子孫、組織、種子またはそれらの一部から得られた穀物および／または食事においても見出される。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）または種子を対象とする。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）を含む食物製品を対象とする。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油（例えば種子油）または種子を含む機能性食物にも関する。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織または一部から得られた油（例えば種子油）または種子を含む医薬製品を対象とする。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から、あるいは本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを含む油を生成する方法を対象とする。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成長させる工程を含む、少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを含む油を生成する方法にも関する。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＬＣ−ＰＵＦＡを生成する方法にも関する。
本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成長させる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法を対象とする。本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、本明細書中に記載される油、本明細書中に記載される種子、本明細書中に記載される食物製品、本明細書中に記載される機能性食物、あるいは本明細書中に記載される医薬製品を個体に提供する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含むサプリメントまたは治療用製品を個体に提供する方法にも関する。いくつかの実施形態において、かかる実施形態中に含まれるＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡである。
本発明は、植物または植物細胞を、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成するＰＵＦＡシンターゼ（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ）をコードする核酸配列；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニル補因子をＰＵＦＡシンターゼ（例えば、藻類ＰＵＦＡシンターゼ）ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列で形質転換する工程を含む、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を生成する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、この方法は、植物または植物細胞を、（ｉｉｉ）長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列で形質転換する工程をさらに含む。
本発明の種々の実施形態は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明、図面および添付の配列の説明から、より完全に理解され得る。
ＰＵＦＡ ＯｒｆＡの９つの反復ドメインのそれぞれをコードする再設計されたＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩでのアラインメント）を示す図である。 ｐＤＡＢ７３６２のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６１のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６５のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３７０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１００５１８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４７６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４７７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３６２で形質転換された２つのダイズ事象から誘導されたＴ１植物由来の単一のＴ２ダイズ種子のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡ含量を示す図である。 Ｔ２ダイズ種子タンパク質抽出物中のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣのウエスタンブロット検出を示す図である。 ｐＤＡＢ９１６６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１６７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３７９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７３８０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３２３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３０のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３３８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３４４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９３９６のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４１２のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７７３３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ７７３４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４９３のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０９５０９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１５１のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０８のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２０９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１５９のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ９１４７のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２２４のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０８２２５のプラスミドマップを示す図である。 ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ１０１４１２またはｐＤＡＢ７３８０で形質転換された個々のトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）事象由来のＴ２種子のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡ含量を示す図である。
用語「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」とは、本明細書中で使用する場合、少なくとも１６炭素、少なくとも１８炭素、少なくとも２０炭素または２２以上の炭素の長さの炭素鎖を有し、少なくとも３以上の二重結合、４以上の二重結合、５以上の二重結合または６以上の二重結合を有し、全ての二重結合がｃｉｓ立体配置である脂肪酸をいう。
用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＬＣ−ＰＵＦＡ」は、本明細書中で使用する場合、３以上の二重結合を含む２０以上の炭素鎖長の脂肪酸、または少なくとも３以上の二重結合、４以上の二重結合、５以上の二重結合もしくは６以上の二重結合を有する、２２以上の炭素の脂肪酸をいう。ω−６系列のＬＣ−ＰＵＦＡには、ジ−ホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）、アドレン酸（ドコサテトラエン酸またはＤＴＡとも呼ばれる）（Ｃ２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）が含まれるがこれらに限定されない。ω−３系列のＬＣ−ＰＵＦＡには、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が含まれるがこれらに限定されない。ＬＣ−ＰＵＦＡには、Ｃ２８：８（ｎ−３）が含まれるがこれに限定されない、２２より多い炭素および４以上の二重結合を有する脂肪酸もまた含まれる。
用語「ＰＵＦＡシンターゼ」とは、本明細書中で使用する場合、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および特に長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を生成する酵素、ならびに複合体中のかかる酵素の任意のドメインをいう。用語ＰＵＦＡシンターゼには、ＰＵＦＡ生成のためのＰＵＦＡ ＰＫＳ系またはＰＫＳ様の系が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの特定のＰＵＦＡシンターゼは、本出願中で定義されるように、「ＳｚＰＵＦＡ」シンターゼまたは「ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ」シンターゼなどのさらなる表記法で本明細書中に表記される。用語「ＰＵＦＡシンターゼ系」には、異種生物において発現される場合にＰＵＦＡシンターゼの機能に影響を与え得る、ＰＵＦＡシンターゼおよび任意のアクセサリー酵素（例えば、ＰＰＴａｓｅまたはＡＣＳ）が含まれる。
用語「ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」および「ＰＰＴａｓｅ」とは、本明細書中で使用する場合、補酵素Ａ（ＣｏＡ）由来の補因子（例えば、４−ホスホパンテテイン）をＰＵＦＡシンターゼ中に存在する１つまたは複数のＡＣＰドメインに転移させることによってＰＵＦＡシンターゼを活性化する酵素をいう。本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼの１つまたは複数のＡＣＰドメインを活性化し得るＰＰＴａｓｅの一例は、本明細書中で「ＮｏＨｅｔＩ」と称される、ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７１２０（以前にはアナベナ属の種（Anabaena sp.）ＰＣＣ ７１２０と呼ばれた）のＨｅｔＩタンパク質である。
用語「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」、「ＡＣｏＡＳ」および「ＡＣＳ」とは、本明細書中で使用する場合、長鎖多価不飽和遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素をいう。いくつかの特定のアシル−ＣｏＡシンテターゼは、本出願中で定義されるように、「ＳｚＡＣＳ−２」などのさらなる表記法で本明細書中に表記される。
用語「植物」には、本明細書中で使用する場合、任意の子孫、細胞、組織、種子、種子油またはそれらの一部が含まれる。
「栄養補助食品」は、生理学的利益を提供するまたは疾患に対する保護を提供する、植物から単離、精製、濃縮または生成された製品を意味し、増強されたレベルのかかる生理学的に活性な構成要素を含むように遺伝子操作された作物から生成された食物と共に、かかる製品を補充された加工食物が含まれる。
「機能性食物」は、（ａ）通常の食餌の一部として消費される従来型食物と見かけ上類似しまたはかかる従来型食物であり得、（ｂ）改変されていない食物中に典型的に存在する構成要素の割合における改変に基づいて、増強された栄養価および／または特定の食餌上の利益を有する食物を意味する。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、単数形の核酸、ならびに複数形の核酸、核酸分子もしくはフラグメント、バリアント、またはそれらの誘導体、または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を包含する意図である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’配列および３’配列ならびにコード配列を含む、全長ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントのヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。これらの用語は、ポリヌクレオチドまたは核酸の、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態もまた包含する。
ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、そのネイティブ環境から取り出された場合に、「単離された」といわれ得る。例えば、ベクター中に含まれるジヒドロキシ−酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする異種ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸のさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドもしくは核酸が含まれる。本発明に従う単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生成されたかかる分子がさらに含まれる。ＤＮＡのポリマーの形態の、単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
用語「遺伝子」とは、特定のタンパク質として発現されることが可能な核酸またはそのフラグメントをいい、任意選択で、コード配列の前（５’非コード配列）および後ろ（３’非コード配列）の調節配列を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「コード領域」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をいう。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、その内側またはその下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が含まれ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」およびそのフラグメントを包含する意図であり、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子をいう。用語「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）をいい、生成物の特定の長さをいうものではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、または２以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）をいうために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語と相互交換可能に使用され得る。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導され得るか、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものである必要はない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含む、任意の様式で生成され得る。
「単離された」ポリペプチドもしくはフラグメント、バリアントまたはそれらの誘導体は、その天然の環境中には存在しないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブまたは天然の環境から取り出され得る。宿主細胞中で発現された組換え生成されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブポリペプチドまたは組換えポリペプチドであるとき、本発明の目的のために単離されたとみなされる。
本明細書中で使用する場合、「ネイティブ」とは、存在する場合にはそれ自身の調節配列を伴って天然に見出される、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態をいう。
本明細書中で使用する場合、「内因性」とは、生物中のまたは生物のゲノム中のその天然の位置にある、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドのネイティブ形態をいう。「内因性ポリヌクレオチド」には、生物のゲノム中のその天然の位置にあるネイティブポリヌクレオチドが含まれる。「内因性遺伝子」には、生物のゲノム中のその天然の位置にあるネイティブ遺伝子が含まれる。「内因性ポリペプチド」には、生物中のその天然の位置にあるネイティブポリペプチドが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「異種」とは、宿主生物において通常は見出されないが、宿主生物中に導入される、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドをいう。「異種ポリヌクレオチド」には、対応するネイティブポリヌクレオチドとは異なる形態の、供給源生物中に再導入される、ネイティブコード領域またはその一部分が含まれる。「異種遺伝子」は、対応するネイティブ遺伝子とは異なる形態の、供給源生物中に再導入される、ネイティブコード領域またはその一部分が含まれる。例えば、異種遺伝子には、ネイティブ宿主中に再導入される非ネイティブ調節領域を含むキメラ遺伝子の一部分であるネイティブコード領域が含まれ得る。「異種ポリペプチド」には、対応するネイティブポリペプチドとは異なる形態の、供給源生物中に再導入されるネイティブポリペプチドが含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「改変」とは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの低減された、実質的に除去されたまたは除去された活性を生じる、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドにおける変化、ならびにポリペプチドの低減された、実質的に除去されたまたは除去された活性を生じる、本明細書中に開示されたポリペプチドにおける変化をいう。かかる変化は、欠失、変異導入（例えば、自然変異誘発、ランダム変異誘発、ミューテーター遺伝子によって引き起こされる変異誘発、またはトランスポゾン変異誘発）、置換、挿入、下方調節、細胞部位の変更、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの状態の変更（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子の除去、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学的改変、共有結合性の改変、ＵＶもしくはＸ線による照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換法および／またはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない、当該分野で周知の方法によって行われ得る。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が改変され得るかを決定する際のガイダンスは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、酵母または細菌などの相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較し、高い相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列中で行われた改変の数を最大化することによって、見出され得る。
用語「誘導体」とは、本明細書中で使用する場合、本発明において開示される配列の改変をいう。かかる改変の例は、油糧種子作物種中の本明細書中に開示されるコード配列の機能を保存する、僅かに変更する、または増加させる、本明細書中に開示されるコード配列の核酸配列に関する１つまたは複数の塩基の置換、挿入および／または欠失である。かかる誘導体は、例えば、配列構造を予測および最適化するためのコンピュータモデリング技術を使用して、当業者によって容易に決定され得る。従って、用語「誘導体」には、それらが本発明のＬＣ−ＰＵＦＡを生成する際に使用される開示された機能性を有することができるように、本明細書中に開示されるコード配列と実質的な配列相同性を有する核酸配列もまた含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「バリアント」とは、例えば変異誘発などの組換えＤＮＡ技術を使用して創出される、アミノ酸の挿入、欠失、変異および置換により、本発明の具体的に引用されたポリペプチドとは異なるポリペプチドをいう。目的の活性を破壊することなくどのアミノ酸残基が置き換え、付加または欠失され得るかを決定する際のガイダンスは、特定のポリペプチドの配列を、相同ポリペプチドの配列と比較し、高い相同性の領域（保存された領域）中で行われたアミノ酸変化の数を最少化することまたはアミノ酸をコンセンサス配列で置き換えることによって、見出され得る。
あるいは、これら同じまたは同様のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドバリアントは、遺伝子コードの「冗長性」を使用することによって合成または選択され得る。種々のコドン置換、例えば、種々の制限部位を生成するサイレント変化が、発現のためのプラスミドまたはウイルスベクター中へのクローニングを最適化するために導入され得る。ポリヌクレオチド配列中の変異は、ポリペプチドの任意の一部の特性を改変するためにポリペプチドに付加されたポリペプチド中、または他のペプチドのドメイン中に反映され得る。
アミノ酸の「置換」は、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置き換え、即ち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得るか、あるいは異なる構造的および／または化学的特性を有するアミノ酸による１つのアミノ酸の置き換え、即ち、非保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親媒性の性質における類似性に基づいて、行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性または両親媒性の性質における差異を選択することによって、行われ得る。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的または機能的に許容される場合、バリエーションの範囲内であり得る。許容されるバリエーションは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に行い、得られた組換えバリアントを活性についてアッセイすることによって、実験的に決定され得る。
用語「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、その全体がネイティブ遺伝子から誘導され得るか、または天然に見出される異なるプロモーターから誘導された異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントを含みさえし得る。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境的もしくは生理学的状態に応答して、遺伝子の発現を指向し得ることが、当業者に理解される。殆どの時間で殆どの細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、「構成的プロモーター」と一般に呼ばれる。殆どの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
用語「作動可能に連結される」とは、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメント上での核酸配列の関連性をいう。例えば、プロモーターは、コード配列（例えば、このコード配列は、プロモーターの転写制御下にある）の発現に影響を与えることが可能である場合、このコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。
用語「発現」とは、本明細書中で使用する場合、本発明の核酸フラグメントから誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積をいう。発現とは、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳もまたいい得る。
用語「過剰発現」とは、本明細書中で使用する場合、同じまたは関連する遺伝子の内因性の発現よりも高い発現をいう。異種遺伝子は、その発現が匹敵する内因性遺伝子の発現よりも高い場合、過剰発現されている。
本明細書中で使用する場合、用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な遺伝を生じる、宿主生物中への核酸またはフラグメントの移入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書中で使用する場合、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有する、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の、染色体外エレメントをいう。かかるエレメントは、自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の、任意の供給源から誘導された一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのものであり得、ここで、多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーターフラグメントおよび選択された遺伝子産物に関するＤＮＡ配列を細胞中に導入することが可能な独自の構成へと、連結または組換えされている。
本明細書中で使用する場合、用語「コドン縮重性」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列のバリエーションを許容する遺伝子コードの性質をいう。当業者は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を熟知している。従って、宿主細胞における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用の頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように、遺伝子を設計することが望ましい。
用語「コドン最適化された」とは、種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域をいう場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するような、遺伝子または核酸分子のコード領域中のコドンの変更をいう。かかる最適化は、少なくとも１つの、１つより多くの、または顕著な数のコドンを、その生物の遺伝子中でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることを含む。
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列中の逸脱は、その遺伝子をコードする配列におけるバリエーションを許容する。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは４種の特定の塩基に制限されるので、ヌクレオチドの６４の可能な組合せが存在し、そのうち６１がアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終了させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」は、表１のように、本明細書中に再現される。結果として、多数のアミノ酸が、１つより多いコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４種のトリプレットによりコードされ、セリンおよびアルギニンは６種のトリプレットによりコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンは、たった１種のトリプレットによりコードされる。この縮重は、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、ＤＮＡ塩基組成が広範囲にわたって変動することを許容する。
多数の生物が、成長中のペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするように、特定のコドンの使用についてバイアスを示す。コドン選択またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用における差異は、遺伝子コードの縮重によって提供され、多数の生物において充分に報告されている。コドンバイアスは、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性にとりわけ依存すると考えられている、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多い。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づく所与の生物における最適な遺伝子発現のために適合させることができる。
広範な種々の動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考慮すると、コドン使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドン使用表は容易に入手可能であり、多数の方法で適合され得る。Nakamuraら、Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照のこと。この表または類似の表を利用することによって、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列に対してこの頻度を適用でき、ポリペプチドをコードするが所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化されたコード領域の核酸フラグメントを生成できる。本発明は、本明細書中にさらに記載されるように、本発明のＯｒｆＡ、ＯｒｆＢ、キメラＯｒｆＣ、ＰＰＴａｓｅおよび／または他のアクセサリータンパク質のコドン最適化された形態に関する。
用語「パーセント同一性」は、当該分野で公知のように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」は、場合によってはかかる配列の文字列間の一致によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関係性の程度もまた意味する。「同一性」および「類似性」は、１）Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.編) Oxford University: NY (1988)；２）Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W. 編) Academic: NY (1993)；３）Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編) Humania: NJ (1994)；４）Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編) Academic (1987)；ならびに５）Sequence Analysis Primer (Gribskov, M.およびDevereux, J.編) Stockton: NY (1991)中に開示される方法が含まれるがこれらに限定されない公知の方法によって容易に計算できる。
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラム中に体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）パッケージソフト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸプログラムまたはＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施され得る。配列のマルチプルアラインメントは、アラインメント法ラベル付（labeled）Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖに対応する（HigginsおよびSharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；Higgins, D.G.ら、Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)によって開示される）；およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中に見出される、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法のアラインメント」を含む、いくつかの種々のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔａｌ法のアラインメント」を使用して実施される。マルチプルアラインメントのために、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＴＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸について、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同じプログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「パーセント同一性」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメント」が利用可能であり、アラインメント法ラベル付Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（HigginsおよびSharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)；Higgins, D.G.ら、Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)中に記載される）に対応し；ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージソフト（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中に見出される。マルチプルアラインメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同じプログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「パーセント同一性」を得ることが可能である。
用語「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムをいう。「配列分析ソフトウェア」は、市販であっても独立して開発してもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ｌ．）ＧＣＧパッケージソフトのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Altschulら、J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)）；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込むＦＡＳＴＡプログラム（W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. 編者: Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY）が含まれるが、これらに限定されない。本出願の文脈において、特に規定しない限り、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書中で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化される場合、そのソフトウェアが元々ロードする値またはパラメータの任意のセットを意味する。
本明細書中で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分野で周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2000)；およびSilhavyら、Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)；およびGreene Publishing Assoc. and Wiley-Interscienceにより刊行されたAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology（1987年から現在まで）に記載されている。
本明細書中に開示される組換え宿主の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリーニングを使用して実施され得、遺伝子操作に適した任意の宿主細胞において行われ得る。いくつかの実施形態において、組換え宿主は、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、ならびに作物植物およびその油のために使用される植物を含む消費用植物であり得るが、これらに限定されない。従って、任意の植物種または植物細胞が、以下にさらに記載されるように選択され得る。
本発明の油は、非料理または食餌プロセスおよび組成物においても使用され得る。これらの使用のいくつかは、産業的使用、化粧品使用または医療的使用であり得る。本発明の油は、本発明の油が適する任意の適用においても使用され得る。一般に、本発明の油は、潤滑油、潤滑油添加物、金属加工流体、油圧流体および耐火性油圧流体などの種々の適用において、例えば、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪を置き換えるために使用され得る。本発明の油は、改変油を生成するプロセスにおける材料としても使用され得る。本発明の油を改変するための技術の例には、分留、水素添加、油のオレイン酸またはリノレン酸含量の変更、および当業者に公知の他の改変技術が含まれる。
本発明の油について化粧品使用の例には、化粧品組成物中の皮膚軟化剤としての使用；ワセリン代用品としての使用；石鹸の一部を構成するものとしてのまたは石鹸を生成するプロセスにおける材料としての使用；経口処置溶液の一部を構成するものとしての使用；加齢処置組成物の一部を構成するものとしての使用；および皮膚または毛髪エアロゾル泡状調製物の一部を構成するものとしての使用が含まれる。
さらに、本発明の油は、医療的適用において使用され得る。例えば、本発明の油は、感染に対する保護障壁において使用され得、ω−９脂肪酸が高い油は、移植片生存を増強するために使用され得る（米国特許第６，２１０，７００号）。
上記は、本発明の油が適する非料理使用の非限定的な例であることを理解すべきである。上述のように、本発明の油および改変油は、当業者に公知の全ての適用において、例えば、鉱油、エステル、脂肪酸または動物性脂肪を置き換えるために使用され得る。
ＰＵＦＡシンターゼ
真核生物における長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の合成のための「標準的な」または「古典的な」経路は、中間鎖長の飽和またはモノ不飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を含み、記載されている。ＰＵＦＡシンターゼを介した長鎖ＰＵＦＡの合成のための経路もまた記載されており、これは「標準的な」経路とは非常に異なっている。具体的には、ＰＵＦＡシンターゼは、炭素供給源としてマロニル−ＣｏＡを利用し、任意の顕著な量で中間体を放出することなしに最終ＰＵＦＡを生成する。また、ＰＵＦＡシンターゼを用いて、適切なｃｉｓ二重結合が、酸素を必要としない機構を使用して合成の間に付加される。いくつかの実施形態において、ＮＡＤＰＨが、合成サイクルの間に還元剤として使用される。
本発明は、（内因的にまたは遺伝子操作により）ＰＵＦＡシンターゼを発現するように遺伝子改変された宿主生物（例えば、ダイズなどの植物）に関する。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼを発現するように遺伝子改変された生物は、その生物によって内因的に発現されないＰＵＦＡシンターゼまたは別のタンパク質を用いた生物の改変に関して、「異種」宿主生物として本明細書中で言及され得、この生物は、その生物がそれにより遺伝子改変されるかかる酵素または少なくとも特定のＰＵＦＡシンターゼもしくはその一部分を天然には（遺伝子改変なしに内因的には）発現しない。本発明の遺伝子改変は、ＰＵＦＡシンターゼを内因的に発現する宿主生物におけるＰＵＦＡ生成を改善するために使用され得、この生物は、異なるＰＵＦシンターゼまたはその一部分でさらに改変されることはない。
本発明に従うＰＵＦＡシンターゼは、選択されたサイクルにおけるｔｒａｎｓ−ｃｉｓ異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復性のプロセシングおよび非反復性のプロセシングの両方を実施するために一緒になって作用できるいくつかの多機能タンパク質を含み得る（および単一機能のタンパク質、特に海洋細菌由来のＰＵＦＡシンターゼを含み得る）。これらのタンパク質は、本明細書中でコアＰＵＦＡシンターゼ酵素複合体またはコアＰＵＦＡシンターゼとも呼ばれ得る。これらのタンパク質内に含まれるドメインおよびモチーフの一般的な機能は、当該分野で個々に公知であり、海洋細菌および真核生物由来の種々のＰＵＦＡシンターゼに関して詳細に記載されている（例えば、米国特許第６，１４０，４８６号；米国特許第６，５６６，５８３号；Metzら、Science 293:290-293 (2001)；米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；米国出願公開番号２００５／０１００９９５およびＷＯ２００６／１３５８６６を参照のこと）。これらのドメインは、上述のように、単一のタンパク質（例えば、ドメインおよびタンパク質は同義である）として、または単一のタンパク質中の２つ以上の（複数の）ドメインのうち１つとして見出され得る。海洋細菌およびスラウストキトリウム（Thraustochytrium）のメンバー由来の種々のＰＵＦＡシンターゼのドメイン構造、ならびにかかるＰＵＦＡシンターゼを含む遺伝子およびタンパク質の構造的特徴および機能的特徴は、記載されている（例えば、米国特許第６，１４０，４８６号；米国特許第６，５６６，５８３号；Metzら、Science 293:290-293 (2001)；米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；米国出願公開番号２００５／０１００９９５およびＷＯ２００６／１３５８６６を参照のこと）。
ＰＵＦＡシンターゼ活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの多数の例が当該分野で公知であり、本明細書中に開示される遺伝子改変された宿主において使用され得る。本発明において有用なＰＵＦＡシンターゼタンパク質またはドメインには、細菌および非細菌の両方のＰＵＦＡシンターゼが含まれ得る。非細菌ＰＵＦＡシンターゼは、真核生物などの、細菌ではない生物由来であるかかかる生物から誘導される系である。細菌ＰＵＦＡシンターゼは、例えば、米国出願公開番号２００８／００５０５０５中に記載されている。細菌ＰＵＦＡシンターゼの機能的ドメインと共に非細菌ＰＵＦＡシンターゼの機能的ドメイン、ならびに他のＰＫＳ系（Ｉ型反復性またはモジュラー、ＩＩ型またはＩＩＩ型）またはＦＡＳ系由来のＰＵＦＡシンターゼの機能的ドメインまたはタンパク質を組み込む本発明の遺伝子改変された植物が、生成され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＵＦＡシンターゼは、典型的には３つ、４つまたはそれ以上のタンパク質上に含まれる以下の生物学的に活性なドメインを少なくとも含む：（ａ）少なくとも１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン；（ｂ）複数のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン（複数可）（例えば、少なくとも１つ〜４つ、または少なくとも５つのＡＣＰドメイン、およびいくつかの実施形態においては、最大６つ、７つ、８つ、９つ、１０または１０より多いＡＣＰドメイン）；（ｃ）少なくとも２つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｄ）少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；（ｅ）少なくとも１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン；（ｆ）少なくとも２つのＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；（ｇ）少なくとも１つの鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；および／または（ｈ）少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン。いくつかの実施形態において、本発明に従うＰＵＦＡシンターゼは、デヒドラターゼ（ＤＨ）の保存された活性部位モチーフを含む少なくとも１つの領域もまた含む。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、以下の生物学的に活性なドメインを少なくとも含む：（ａ）少なくとも１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン；（ｂ）少なくとも５つのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；（ｃ）少なくとも２つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｄ）少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；（ｅ）少なくとも１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン；（ｆ）少なくとも２つのＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；（ｇ）少なくとも１つの鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；および（ｈ）少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン。いくつかの実施形態において、本発明に従うＰＵＦＡシンターゼは、ＦａｂＡ様ＤＨドメインの一部ではないデヒドラターゼ（ＤＨ）の保存された活性部位モチーフを含む少なくとも１つの領域またはドメインもまた含む。これらのドメインのそれぞれの構造的特徴および機能的特徴は、米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；米国出願公開番号２００５／０１００９９５；米国出願公開番号２００７／０２４５４３１およびＷＯ２００６／１３５８６６中に詳細に記載されている。
コアシゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼを形成する３つのオープンリーディングフレームが存在しており、これらは例えば米国出願公開番号２００７／０２４５４３１において以前に記載されている。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下のとおりである。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＡ（ＯｒｆＡまたはＰｆａ１）：ＯｒｆＡは、２９１０アミノ酸の配列をコードする８７３０ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＡ内には、１２個のドメインが存在する：（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン；（ｃ）９つのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；および（ｄ）１つのケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン。シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８８８の娘株の両方由来のＯｒｆＡをコードするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１２６（ｐＪＫ１１２６ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＡ」遺伝子を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４８が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３０６（ｐＪＫ３０６ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＡ遺伝子の５’部分を含む大腸菌（E. coli）プラスミドの形態（ｐＪＫ３２０と２．２ｋＢが重複））は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４１が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３２０（ｐＪＫ３２０ ＯｒｆＡゲノムクローンと称する、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＡ遺伝子の３’部分を含む大腸菌（E. coli）プラスミドの形態（ｐＪＫ３０６と２．２ｋＢが重複））は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４４が割り当てられた。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＢ（ＯｒｆＢまたはＰｆａ２）：ＯｒｆＢは、２０５９アミノ酸の配列をコードする６１７７ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＢ内には、４つのドメインが存在する：（ａ）１つのケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つの鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；（ｃ）１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；および（ｄ）１つのエノイルＡＣＰ−レダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８８８の娘株の両方由来のＯｒｆＢをコードするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１２９（ｐＪＫ１１２９ ＯｒｆＢゲノムクローンと称する、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＢ」遺伝子を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４９が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＪＫ３２４（ｐＪＫ３２４ ＯｒｆＢゲノムクローンと称する、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＢ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４３が割り当てられた。
シゾキトリウム（Schizochytrium）オープンリーディングフレームＣ（ＯｒｆＣまたはＰｆａ３）：ＯｒｆＣは、１５０２アミノ酸の配列をコードする４５０６ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。ＯｒｆＣ内には、３つのドメインが存在する：（ａ）２つのＦａｂＡ様−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン；および（ｂ）１つのエノイルＡＣＰ−レダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ ２０８８８およびシゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）、株Ｎ２３０Ｄと称されるＡＴＣＣ ２０８８８の娘株の両方由来のＯｒｆＣをコードするゲノムＤＮＡクローン（プラスミド）が単離され、配列決定されている。
ゲノムクローンｐＪＫ１１３１（ｐＪＫ１１３１ ＯｒｆＣゲノムクローンと称する、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＡＴＣＣ ２０８８８由来の「ＯｒｆＣ」遺伝子を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６５０が割り当てられた。
ゲノムクローンｐＢＲ００２（ｐＢＲ００２ ＯｒｆＣゲノムクローンと称する、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）Ｎ２３０Ｄ由来のＯｒｆＣ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７６４２が割り当てられた。
さらに、以前に記載されたコアスラウストキトリウム（Thraustochytrium）ＰＵＦＡシンターゼを形成する３つのオープンリーディングフレームが存在する。各オープンリーディングフレームのドメイン構造は以下のとおりである。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＡ（ＯｒｆＡ）：ＯｒｆＡは、２８１１アミノ酸の配列をコードする８４３３ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＡ中に存在する：（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つのマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）ドメイン；（ｃ）８つのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン；および（ｄ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン。
ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１２．１（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１２．１ゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＡ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３２が割り当てられた。ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１１（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＡ＿ｐＢＲ８１１ゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＡ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３１が割り当てられた。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＢ（ＯｒｆＢ）：ＯｒｆＢは、１９３５アミノ酸の配列をコードする５８０５ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＢ中に存在する：（ａ）１つのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；（ｂ）１つの鎖長因子（ＣＬＦ）ドメイン；（ｃ）１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン；および（ｄ）１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＢ＿ｐＢＲ８００（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＢ＿ｐＢＲ８００ゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＢ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２７が割り当てられた。
スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３ＢオープンリーディングフレームＣ（ＯｒｆＣ）：ＯｒｆＣは、１４７０アミノ酸の配列をコードする４４１０ヌクレオチドの配列（終止コドンを含まない）である。以下のドメインがＴｈ．２３Ｂ ＯｒｆＣ中に存在する：（ａ）２つのＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）ドメイン、共にＦａｂＡタンパク質（ｔｒａｎｓ−２−デセノイル−ＡＣＰの合成およびこの生成物のｃｉｓ−３−デセノイル−ＡＣＰへの可逆的な異性化を触媒する酵素）に対して相同性を有する；および（ｂ）シゾキトリウム（Schizochytrium）ＯｒｆＢのＥＲドメインに対して高い相同性を有する１つのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。ゲノムクローンＴｈ２３ＢＯｒｆＣ＿ｐＢＲ７０９Ａ（Ｔｈ２３ＢＯｒｆＣ＿ｐＢＲ７０９Ａゲノムクローンと称する、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＣ遺伝子配列を含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２８が割り当てられた。
キメラまたはハイブリッドＰＵＦＡシンターゼ：いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、本明細書中に記載されるドメインのいずれかから選択されるドメインを含み、これらのドメインは、組み合わされて（例えば、混合および調和されて）、本明細書中に記載される最低限の要件を満たす完全なＰＵＦＡシンターゼを形成する。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された生物は、別のＰＵＦＡシンターゼの少なくとも１つのドメインまたは生物学的に活性なそのフラグメントによってさらに改変され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼのドメインのいずれかは、ＰＵＦＡシンターゼ系におけるそのドメインの機能を改変または増強するために（例えば、その系によって生成されるＰＵＦＡ型またはその比率を改変するために）、その天然の構造から改変され得る。キメラＰＵＦＡシンターゼを生成するためにドメインをこのように混合することは、本明細書中で引用される特許および刊行物中に記載されている。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼを含み、ここで、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼ由来のＯｒｆＣは、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のＯｒｆＣで置き換えられている。いくつかの実施形態において、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ由来のかかるキメラＯｒｆＣは、シゾキトリウム（Schizochytrium）のコドン使用のために最適化された核酸配列によってコードされる。かかるキメラＯｒｆＣの非限定的な例として、プラスミドｐＴｈＯｒｆＣ−ｓｙｎＰＳ（ｐＴｈＯｒｆＣ−ｓｙｎＰＳと称する、シゾキトリウム（Schizochytrium）または他の異種宿主における発現のために最適化された「完全縫合（perfect stitch）」合成スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ ＰＵＦＡ ＰＫＳ ＯｒｆＣコドンを含む大腸菌（E. coli）プラスミドベクターの形態）は、２００７年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２２９が割り当てられた（米国出願公開番号２００８／００２２４２２もまた参照のこと）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書中にさらに記載される方法によって生成された以下のコドン最適化された配列が含まれるがこれらに限定されない：配列番号１（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３タンパク質）；配列番号２（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３タンパク質）；配列番号３（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３タンパク質）；配列番号６（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ遺伝子）；配列番号７（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３遺伝子）；および配列番号８（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３遺伝子）、ならびにかかる配列の活性なバリアント、一部分、フラグメントまたは誘導体、ここで、かかる遺伝子がＰＵＦＡシンターゼ活性をコードする、またはかかるポリペプチドもしくはタンパク質がＰＵＦＡシンターゼ活性を有する。本発明は、１つまたは複数のかかる配列を含むあるいは１つまたは複数のかかる配列からなる、単離されたポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを含む。
本発明において使用され得るＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチドのいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例えば、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびポリペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼまたは配列のいずれか１つの誘導体の活性なバリアント、一部分、フラグメントが含まれるがこれらに限定されず、かかる遺伝子がＰＵＦＡシンターゼ活性をコードするまたはかかるポリペプチドがＰＵＦＡシンターゼ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、藻類ＰＵＦＡシンターゼであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号６の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号７の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列は、配列番号８の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、配列番号６、７もしくは８の核酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載される配列番号１、２もしくは３のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せもしくはそのパーセント同一性をコードする。
いくつかの実施形態において、他のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子および／またはポリペプチドの配列は、本明細書中に開示された当該分野で利用可能な配列を使用して、当業者に周知の文献中およびバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、かかる配列は、既知のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列を用いた、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索を介して同定され得る。かかる方法において、同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重みマトリックスのデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメントに基づき得る。
さらに、本明細書中に開示されるまたは当該分野で公知のＰＵＦＡシンターゼ遺伝子またはポリペプチド配列は、天然の他のＰＵＦＡシンターゼホモログを同定するために使用され得る。例えば、本明細書中に開示されるＰＵＦＡシンターゼ核酸フラグメントの各々は、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用され得る。配列依存的プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、当該分野で周知である。配列依存的プロトコルの例には、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Mullisら、米国特許第４，６８３，２０２号；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Tabor, S.ら、Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)）の種々の使用によって例示されるような、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法；ならびに（３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法、が含まれるがこれらに限定されない。
これら全ての方法は、標的タンパク質をコードする既知のまたは同定された配列を使用して、当業者によって容易に実施され得る。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡシンターゼコード配列の周囲のＤＮＡ配列もまた、いくつかの改変手順において有用であり、公に利用可能なデータベースにおいて、当業者により容易に見出され得る。遺伝子変異を創出するための方法は一般的であり、当業者に周知であり、変異を創出する実践に適用され得る。
ホスホパンテチエニル（phosphopantethienyl）トランスフェラーゼ
ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）は、脂肪酸合成、ポリケチド合成および非リボソームペプチド合成において充分に特徴付けられた酵素のファミリーである。特に、ＰＵＦＡシンターゼ酵素中に存在するＡＣＰドメインは、補酵素Ａ由来の補因子（４−ホスホパンテテイン）のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）への付着による活性化を必要とする。この補因子の付着は、ＰＰＴａｓｅによって実行される。宿主生物の内因性ＰＰＴａｓｅｓがＰＵＦＡシンターゼのＡＣＰドメインを活性化できない場合、その機能を実行することが可能なＰＰＴａｓｅを提供することが必要である。多数のＰＰＴａｓｅの配列が公知であり、結晶構造（例えば、Reuterら、EMBO J. 18:6823-31 (1999)）ならびに活性に重要なアミノ酸残基の変異分析（Mofidら、Biochemistry 43:4128-36 (2004)）が決定されている。
本明細書中に記載されるＯｒｆＡ ＡＣＰドメインを基質として認識することが以前に実証されている異種ＰＰＴａｓｅの一例は、ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７１２０（以前にはアナベナ属の種（Anabaena sp.）ＰＣＣ ７１２０と呼ばれた）のＨｅｔ Ｉタンパク質である。Ｈｅｔ Ｉは、その生物の異質細胞中に存在する糖−脂質層の構成要素である長鎖ヒドロキシ−脂肪酸の合成を担うことが公知のノストック（Nostoc）中の遺伝子のクラスター中に存在する（BlackおよびWolk, J. Bacteriol. 176:2282-2292 (1994)；Campbellら、Arch. Microbiol. 167:251-258 (1997)）。Ｈｅｔ Ｉは、このクラスター中に存在するタンパク質Ｈｇｌ ＥのＡＣＰドメインを活性化する可能性が高い。Ｈｇｌ Ｅの２つのＡＣＰドメインは、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＯｒｆＡおよび他のＰＵＦＡシンターゼにおいて見出されるＡＣＰドメインに対して高い程度の配列相同性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼは、少なくとも１つの４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）ドメインを含むとみなされ得るか、またはかかるドメインは、ＰＵＦＡシンターゼに対するアクセサリードメインまたはタンパク質であるとみなされ得る。ＰＰＴａｓｅの構造的特徴および機能的特徴は、例えば、米国出願公開番号２００２／０１９４６４１；米国出願公開番号２００４／０２３５１２７；および米国出願公開番号２００５／０１００９９５中に詳細に記載されている。
ＰＰＴａｓｅ活性を有する遺伝子およびポリペプチドの多数の例が、当該分野で公知であり、使用されている特定のＰＵＦＡシンターゼのＡＣＰドメインを活性化することが可能である場合、本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書中にさらに記載される以下のコドン最適化された配列が含まれ得るがこれらに限定されない：配列番号５（ＮｏＨｅｔＩ ｖ３タンパク質）および配列番号１０（ＮｏＨｅｔＩ ｖ３遺伝子）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＰＴａｓｅ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書中に記載されるＰＰＴａｓｅまたは配列のうちいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するＰＰＴａｓｅ遺伝子またはポリペプチドが含まれるがこれらに限定されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例えば、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＰＰＴａｓｅ遺伝子およびポリペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＰＰＴａｓｅ配列のいずれか１つの活性なバリアント、フラグメント、一部分または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、かかる遺伝子がＰＰＴａｓｅ活性をコードするまたはかかるポリペプチドがＰＰＴａｓｅ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは藻類ＰＰＴａｓｅであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、配列番号５のアミノ酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１０の核酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１０の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載される配列番号５のアミノ酸配列またはその任意のパーセント同一性をコードする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅは、異種宿主におけるＰＰＴａｓｅの生成および／または蓄積のために提供され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＰＴａｓｅをコードする遺伝子および／またはポリペプチドは、別のＰＰＴａｓｅ遺伝子および／もしくはポリペプチド配列を同定するために使用され得る、ならびに／または他の細胞におけるＰＰＴａｓｅホモログを同定するために使用され得る。かかるＰＰＴａｓｅコード配列は、例えば、当業者に周知の文献中および／またはバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、バイオインフォマティクスを使用した別の細胞型におけるＰＰＴａｓｅコード配列の同定は、本明細書中に提供される任意のものなどの、既知のＰＰＴａｓｅコードＤＮＡおよびポリペプチド配列を用いた、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上で開示したとおり）検索を介して、達成され得る。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重みマトリックスのデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメントに基づく。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列を単一の組換え発現ベクター中に含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列を異なる組換え発現ベクター中に含む。
アシル−ＣｏＡシンテターゼ
本発明は、長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のアシル−ＣｏＡへの変換を触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）タンパク質を提供する。ＰＵＦＡシンターゼによるＰＵＦＡの内因性生成体であるシゾキトリウム（Schizochytrium）は、そのＰＵＦＡシンターゼの遊離脂肪酸生成物をアシル−ＣｏＡに変換することが可能な１つまたは複数のＡＣｏＡＳを保有する。従って、シゾキトリウム（Schizochytrium）、ならびにＰＵＦＡシンターゼを内因的に含む他の生物（例えば、他のヤブレツボカビ（Thraustochytrids））またはＰＵＦＡ ＦＦＡをアシル−ＣｏＡに変換できる他の生物（例えば、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）またはクリプテコジニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii））は、異種宿主において発現されるＰＵＦＡシンターゼの生成物の蓄積を許容するまたは増加させるのに有用な酵素をコードする遺伝子の供給源を提示し得る。他のＡＣｏＡＳ配列は、米国出願公開番号２００７／０２４５４３１中に記載されている。
ＡＣｏＡＳ活性を有する遺伝子およびポリペプチドの多数の例が、当該分野で公知であり、本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得る遺伝子およびポリペプチドの例には、本明細書中にさらに記載される以下のコドン最適化された配列が含まれ得るがこれらに限定されない：配列番号４（ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３タンパク質）および配列番号９（ｈＳｚＴｈＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子）。
本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＡＣｏＡＳ遺伝子およびポリペプチドの他の例には、本明細書中に記載されるＡＣｏＡＳまたは配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するＡＣｏＡＳ遺伝子またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択され得る（例えば、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一）。本発明の遺伝子改変された生物において使用され得るＡＣｏＡＳ遺伝子およびポリペプチドのなお他の例には、本明細書中に記載されるＡＣｏＡＳ配列のいずれか１つの活性なバリアント、フラグメント、一部分または誘導体が含まれるがこれらに限定されず、かかる遺伝子がＡＣｏＡＳ活性をコードするまたはかかるポリペプチドがＡＣｏＡＳ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは藻類ＡＣｏＡＳであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、８０％〜１００％同一、８５％〜１００％同一、９０％〜１００％同一、９５％〜１００％同一、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一または９５％〜９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、配列番号４のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列に対して、８０％〜９９％同一、８５％〜９９％同一、９０％〜９９％同一、８０％〜９５％同一または８５％〜９５％同一な核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、この核酸配列は、本明細書中に記載される配列番号４のアミノ酸配列またはその任意のパーセント同一性をコードする。
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳは、異種宿主におけるＡＣｏＡＳの生成および／または蓄積、ならびに内因性宿主におけるＡＣｏＡＳの改善された生成および／または蓄積を提供し得る。
いくつかの実施形態において、ＡＣｏＡＳをコードする遺伝子および／またはポリペプチドは、別のＡＣｏＡＳ遺伝子および／またはポリペプチド配列を同定するために使用され得る、ならびに／あるいは他の細胞におけるＡＣｏＡＳホモログを同定するために使用され得る。かかるＡＣｏＡＳコード配列は、例えば、当業者に周知の文献中および／またはバイオインフォマティクスデータベース中で同定され得る。例えば、バイオインフォマティクスを使用した別の細胞型におけるＡＣｏＡＳコード配列の同定は、本明細書中に提供される任意のものなどの、既知のＡＣｏＡＳコードＤＮＡおよびポリペプチド配列を用いた、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上で開示したとおり）検索を介して、達成され得る。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重みマトリックスのデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法のアラインメントに基づく。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼおよびＡＣｏＡＳ、またはＰＵＦＡシンターゼ、ＰＰＴａｓｅおよびＡＣｏＡＳを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物（例えばダイズ）、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、単一の組換え発現ベクター中に含まれる、（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列は、異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれ、（ｉ）の核酸配列が異なる組換え発現ベクター中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の核酸配列またはそれらの任意の組合せは、１つまたは複数の種子特異的プロモーターの制御下にある。
遺伝子改変された生物の作製方法
顕著に高い収率の１種または複数の所望の多価不飽和脂肪酸を生成するために、植物は、ＰＵＦＡシンターゼを植物中に導入するために遺伝子改変され得る。本発明は、かかる遺伝子改変の有効性を改善または増強するための方法、ならびに特にＰＵＦＡシンターゼの最終生成物、例えばＰＵＦＡの生成および／または蓄積を改善または増強するための方法にも関する。
植物が含まれるがこれに限定されない遺伝子改変された生物における遺伝子発現のための方法は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、発現されるＰＵＦＡシンターゼ遺伝子のコード領域は、以下に記載されるように、標的宿主細胞のためにコドン最適化され得る。植物細胞が含まれるがこれに限定されない組換え宿主細胞における遺伝子の発現は、目的のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターおよび／または転写ターミネーターを必要とし得る。種子特異的プロモーター（例えば、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰもしくはＢｎａＮａｐｉｎＣ）または葉特異的プロモーター（例えば、ユビキチンもしくはＣｓＶＭＶ）が含まれるがこれらに限定されない多数のプロモーターが、遺伝子のためのベクターを構築する際に使用され得る。本発明において使用され得るプロモーターの他の非限定的な例には、ＷＯ１９９２／１８６３４に開示されたアシルキャリアタンパク質プロモーター；Slightomら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1897-1901; 1983)；Sengupta-Gopalanら(Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 3320-3324; 1985)；van der Geestら(Plant Mol. Biol. 33: 553-557; 1997)およびBustosら(EMBO J. 10: 1469-1479; 1991)に開示されたインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）β−ファゼオリンプロモーターおよび短縮バージョンが含まれる。
本発明のいくつかの実施形態において、組換えベクターは、選択された核酸配列を操作するためのおよび宿主細胞中にかかる核酸配列を導入するためのツールとして使用される、操作された（例えば人工的に生成された）核酸分子である。従って、組換えベクターは、例えば宿主細胞中に選択された核酸配列を発現および／または送達することによって組換え細胞を形成するために、選択された核酸配列をクローニング、配列決定および／または他の方法で操作する際に使用するのに適切である。かかるベクターは典型的に、異種核酸配列、即ち、クローニングまたは送達される核酸配列に隣接して天然には見出されない核酸配列を含むが、このベクターは、本発明の核酸分子に隣接して天然に見出されるまたは本発明の核酸分子の発現に有用な調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）もまた含み得る。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかで、原核生物または真核生物のいずれかであり得るが、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外エレメント（例えばプラスミド）として維持され得るか、または組換え生物（例えば、微生物または植物）の染色体中に組み込まれ得る。ベクター全体が、宿主細胞内の適所に留まり得、またはある特定の条件下では、本発明の核酸分子を後に残して、プラスミドＤＮＡが除去され得る。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、ネイティブもしくはプラスミドのプロモーターの制御下、またはいくつかのプロモーターの組合せの制御下にあり得る。単一コピーまたは複数コピーの核酸分子が、染色体中に組み込まれ得る。本発明の組換えベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明の組換え核酸分子において使用される組換えベクターは、発現ベクターである。かかる実施形態において、生成される産物（例えばＰＵＦＡシンターゼ）をコードする核酸配列が、組換え核酸分子を生成するために組換えベクター中に挿入される。生成されるタンパク質をコードする核酸配列が、組換え宿主細胞内の核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクターにおいて、この核酸配列を調節配列に作動可能に連結させる様式で、ベクター中に挿入される。
種々の宿主生物および細胞の形質転換に有用なベクターは、一般的であり、文献中に開示されている。典型的には、ベクターは、選択マーカー、および所望の宿主における自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。さらに、適切なベクターは、挿入されたコード領域の発現を提供するために、それらの間にコード領域ＤＮＡフラグメントが挿入され得る、転写開始制御を有するプロモーター領域および転写終結制御領域を含み得る。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導され得るが、かかる制御領域は、生成宿主として選択された特定の種にとってネイティブではない遺伝子からも誘導され得ることを理解すべきである。
本発明は、異種宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を増加させるために、単独であるいは任意の１つまたは複数の本明細書中に記載される戦略（例えば、以下のうち任意の１つ、２つ、３つまたは４つ：コドン最適化、オルガネラ標的化、（例えば、ＦＡＳの阻害による）マロニルＣｏＡについてのＰＵＦＡシンターゼ競合の増強、および／あるいは１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼまたは関連酵素の発現）と組み合わせて利用される、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼおよび外因性ＰＰＴａｓｅと共に、本明細書中に記載され例示される１つまたは複数のアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＵＦＡシンターゼ酵素、ＰＰＴａｓｅ、および／あるいは任意の１つまたは複数のアクセサリータンパク質および／あるいは標的化された遺伝子改変の発現を、宿主の１つまたは複数のオルガネラに標的化することに関する。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼ系およびＰＰＴａｓｅの発現は、植物の色素体に標的化され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅの発現は、細胞質ゾルに標的化される。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅの発現は、植物の色素体および細胞質ゾルの両方に標的化される。これらの実施形態のいずれかにおいて、他の標的が、色素体または細胞質ゾルに指向され得る。
いくつかの実施形態において、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＤＨＡおよび／または他のＬＣ−ＰＵＦＡ遊離脂肪酸を、アシルトランスフェラーゼによって次に利用され得るアシル−ＣｏＡに変換するために、細胞質ゾルにおいて発現される。
種々の色素体標的化配列が当該分野で公知であり、異種宿主が植物または植物細胞である、色素体を標的化することが望まれる実施形態において使用され得る。
本発明は、異種宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を増加させるために、単独であるいは任意の１つまたは複数の本明細書中に記載される戦略（例えば、以下のうち任意の１つ、２つ、３つまたは４つ：コドン最適化、（例えば、ＦＡＳの阻害による）マロニルＣｏＡについてのＰＵＦＡシンターゼ競合の増強、１つまたは複数のアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現、および／あるいは１つまたは複数のアシルトランスフェラーゼまたは関連酵素の発現）と組み合わせて利用される、本明細書中に記載されるＰＵＦＡシンターゼの発現および外因性ＰＰＴａｓｅと共に、オルガネラ標的化（例えば、植物中の色素体または葉緑体への）の使用を含む。
色素体または葉緑体への遺伝子産物の標的化は、種々のタンパク質のアミノ末端において見出される、インポートの間に切断されて成熟タンパク質を生じるシグナル配列によって制御される（例えば、葉緑体標的化に関して、例えば、Comaiら、J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)を参照のこと）。これらのシグナル配列は、葉緑体中への異種産物のインポートをもたらすために、異種遺伝子産物に融合され得る（van den Broeckら Nature 313:358-363 (1985)）。適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および葉緑体に局在化することが公知の多数の他のタンパク質をコードするｃＤＮＡから単離され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明において使用されるタンパク質の局在化は、細胞内区画に、例えば、色素体または葉緑体に指向される。タンパク質は、そのアミノ末端に葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）を含むことによって、葉緑体に指向され得る。同様に、タンパク質は、そのＮ末端に色素体トランジットペプチドまたはシグナリングペプチドを含むことによって、色素体に指向され得る。
葉緑体インポート機構に前駆体を指向させるアミノ末端葉緑体標的化ペプチドを含むより大きい前駆体タンパク質として合成される、天然に存在する葉緑体標的化タンパク質は、当該分野で周知である。葉緑体標的化ペプチドは、葉緑体オルガネラ内に位置する特定のエンドプロテアーゼによって一般に切断され、これにより、標的化された成熟体が放出され、葉緑体環境中へと、前駆体から酵素を活性化できる。植物細胞の葉緑体または色素体に遺伝子または遺伝子産物を標的化することを指向するのに適したペプチドをコードする配列の例には、ペチュニアＥＰＳＰＳ ＣＴＰ、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）のＥＰＳＰＳ ＣＴＰ２およびイントロン、ならびに当業者に公知の他の配列が含まれる。かかる標的化配列は、それが最も効果的に機能する細胞構造に転移される所望の発現されたタンパク質を提供する、または、所望の表現型機能に必要な細胞プロセスが濃縮される細胞の領域へと所望の発現されたタンパク質を転移させることによる。葉緑体標的化ペプチドの具体的な例は、当該分野で周知であり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットａｔｓ１Ａトランジットペプチド、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＥＰＳＰＳトランジットペプチド、およびトウモロコシ（Zea maize）リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットトランジットペプチドが含まれる。
最適化されたトランジットペプチドは、例えば、van den Broeckら、Nature, 313:358-363 (1985)に記載されている。原核生物および真核生物のシグナル配列は、例えば、Michaelisら、Ann. Rev. Microbiol. 36:425 (1982)に開示されている。本発明において使用され得るトランジットペプチドのさらなる例には、Von Heijneら、Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991)；Mazurら、Plant Physiol. 85:1110 (1987)；Vorstら、Gene 65:59 (1988)に記載されるものなどの葉緑体トランジットペプチドが含まれる。ChenおよびJagendorf (J. Biol. Chem. 268:2363-2367 (1993))は、異種導入遺伝子のインポートのための、葉緑体トランジットペプチドの使用を記載している。使用されるこのペプチドは、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のｒｂｃＳ遺伝子由来のトランジットペプチドである（Poulsenら Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)）。異種タンパク質を葉緑体に局在化させるために本明細書中で機能した１つのＣＴＰは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）アシル−ＡＣＰチオエステラーゼから誘導されたものである。
葉緑体または色素体に遺伝子を局在化させるための代替的手段には、葉緑体または色素体の形質転換が含まれる。本出願において想定される分子を組み込むように葉緑体ＤＮＡだけが変更された組換え植物が、生成され得る。葉緑体において機能するプロモーターは、当該分野で公知である（Hanley- Bowdenら、Trends in Biochemical Sciences 12:67-70 (1987)）。異種ＤＮＡが挿入された葉緑体を含む細胞を得るための方法および組成物は、例えば、Daniellら（米国特許第５，６９３，５０７号）およびMaligaら（米国特許第５，４５１，５１３号）に記載されている。
戦略の組合せ
本発明によれば、１種または複数の標的ＰＵＦＡの生成および蓄積のための異種宿主の生成において、宿主におけるＰＵＦＡの生成および／または蓄積を改善するための、任意の１つまたは複数の（任意の組合せの）本明細書中に記載される戦略が使用され得る。実際、種々の組合せの戦略は、相加的または相乗的であり、１つまたは複数のかかる戦略の非存在下と比較して改善されたＰＵＦＡの生成および／または蓄積を提供することが理解される。実際、実施例は、宿主生物におけるＰＵＦＡの生成のための例示的戦略を提供する。
これらの改変の組合せ、または本明細書中に記載される任意の他の改変もしくは改変の組合せを使用する任意の植物または植物細胞が、本発明により包含される。いくつかの実施形態において、かかる植物は、宿主によるＰＵＦＡ（またはＰＵＦＡシンターゼの他の生物活性生成物）の生成および／または蓄積の改善のための、本明細書中に記載されるアクセサリータンパク質（例えば、ＡＣｏＡＳ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＡＧＡＴまたはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ））を発現するように、さらに遺伝子改変されたものである。さらに、標的ＰＵＦＡを含む種子または油を含む任意の生成物が、かかる細胞または生物から誘導されるので、本明細書中に記載される任意の改変または改変の組合せを使用する任意の宿主細胞または生物が、本発明によって包含される。
いくつかの実施形態において、本発明に従って遺伝子改変される植物（例えば植物宿主細胞）には、双子葉植物および単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、ならびに特に、作物植物および特にその油のために使用される植物を含む消費用植物が含まれるがこれらに限定されない。かかる植物には、例えば、ダイズ、ナタネ、アマニ、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコが含まれ得るがこれらに限定されない。従って、任意の植物種または植物細胞が選択され得る。いくつかの実施形態において、植物は、マメ科（Fabaceae）（マメ科（Leguminosae）、マメ科植物（legume）科、エンドウマメ（pea）科、マメ（bean）科または豆類（pulse）科）の植物である。いくつかの実施形態において、植物はグリキネ（Glycine）属の植物である。いくつかの実施形態において、植物は、グリキネ・アルビカンス（Glycine albicans）、グリキネ・アフィオノタ（Glycine aphyonota）、グリキネ・アレナリ（Glycine arenari）、グリキネ・アルギレア（Glycine argyrea）、グリキネ・カネセンス（Glycine canescens）、グリキネ・クランデスチネ（Glycine clandestine）、グリキネ・クルヴァタ（Glycine curvata）、グリキネ・キルトロバ（Glycine cyrtoloba）、グリキネ・ファルカテ（Glycine falcate）、グリキネ・グラセイ（Glycine gracei）、グリキネ・ヒルチカウリス（Glycine hirticaulis）、グリキネ・ヒルチカウリス亜種レプトサ（Glycine hirticaulis subsp. leptosa）、グリキネ・ラクトヴィレンス（Glycine lactovirens）、グリキネ・ラティフォリア（Glycine latifolia）、グリキネ・ラトロベアナ（Glycine latrobeana）、グリキネ・ミクロフィラ（Glycine microphylla）、グリキネ・モンティス−ドウグラス（Glycine montis-douglas）、グリキネ・ペラトサ（Glycine peratosa）、グリキネ・ペスカドレンシス（Glycine pescadrensis）、グリキネ・ピンダニカ（Glycine pindanica）、グリキネ・プレニイ（Gycine pullenii）、グリキネ・ルビギノサ（Glycine rubiginosa）、グリキネ・ステノフィタ（Glycine stenophita）、グリキネ・シンデティカ（Glycine syndetika）、グリキネ・タバキナ（Glycine tabacina）、グリキネ・トメンテラ（Glycine tomentella）、ツルマメ（Glycine soja）またはダイズ（Glycine max）である。いくつかの実施形態において、植物は、ラッカセイ、マメ（インゲンマメ（Phaseolus vulgaris））、ソラマメ（Vicia faba）またはエンドウマメ（Pisum sativum）である。
「植物の一部」には、本明細書中で使用する場合、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植体などが含まれるがこれらに限定されない、植物の任意の一部が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された植物は、所望の結果（例えば、増加したもしくは改変されたＰＵＦＡシンターゼならびに／またはＰＵＦＡシンターゼを使用した所望の生成物の生成および／もしくは蓄積）が達成されるように、その正常（例えば、野生型または天然に存在する）形態から改変（例えば、変異または変化）されたゲノムを有する。いくつかの実施形態において、植物の遺伝子改変は、古典的な株発生および／または分子遺伝学的技術を使用して達成され得る。所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子が植物のゲノム中に組み込まれたトランスジェニック植物を生成するための方法が、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、本発明に従って遺伝子改変される植物は、ヒトを含む動物による消費に適した植物である。
特に望ましい形質、例えば、疾患抵抗性、植物形質転換の容易さ、油の含量またはプロファイルなどのために最適化された、これらの植物由来の植物系統が、生成、選択または同定され得る。いくつかの実施形態において、植物系統は、植物育種を介して、またはマーカー補助された育種および耕作などの方法を介して、選択され得る。いくつかの実施形態において、植物細胞培養物が使用され得、例えば、植物細胞培養物は、分化した植物へと成長せず、通常の農作業を使用して栽培されないが、その代わりに、液体培地中で成長させ維持される。
いくつかの実施形態において、植物は油糧種子植物であり得、ここで、この油糧種子および／または油糧種子中の油は、ＰＵＦＡシンターゼにより生成されるＰＵＦＡを含む。いくつかの実施形態において、かかる油は、検出可能な量の、ＰＵＦＡシンターゼの生成物である少なくとも１種の標的または一次ＰＵＦＡを含み得る。いくつかの実施形態において、かかる油は、標的ＰＵＦＡ生成物でも一次ＰＵＦＡ生成物でもなく、野生型植物における内因性ＦＡＳ系によって天然に生成されない中間体または副生成物を、実質的に含まないことが可能である（例えば、野生型植物は、ＦＡＳ系を介して、ある種のより短いまたは中間長の鎖のＰＵＦＡ、例えば１８炭素のＰＵＦＡを生成するが、ＰＵＦＡシンターゼを用いた遺伝子改変の結果として、植物中で生成された新たなまたはさらなる脂肪酸が存在する）。
遺伝子改変された植物の生成に関して、植物の遺伝子操作のための方法は、当該分野で周知である。例えば、双子葉植物および単子葉植物のための生物学的および物理的な形質転換プロトコルを含む、植物形質転換のための多数の方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyukiら、Nature Biotech 17:282-286 (1999)；Mikiら、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R.およびThompson, J. E. 編, CRC Press, Inc., Boca Raton, 67-88頁 (1993)）。さらに、例えばGruberら、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R.およびThompson, J. E.編, CRC Press, Inc., Boca Raton, 89-119頁(1993)において、植物細胞または組織の形質転換のためのベクターおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法、ならびに植物の再分化が、利用可能である。
本発明は、配列番号６〜１０から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子、ならびに本明細書中に記載されるかかる配列の改変または変異を含む単離された核酸分子に関する。本発明は、配列番号１〜５から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、ならびに改変または変異または本明細書中に記載されるかかる配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６１を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６２を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６５を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７０を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１００５１８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４７６を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６６を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３８０を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３２３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３０を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３４４を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３９６を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４１２を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３４を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４９３を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５１を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０８を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５９を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１４７を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２４を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２５を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６１を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６２を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６５を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３６９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７０を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１００５１８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４７６を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６６を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１６７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３７９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７３８０を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３２３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３０を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３３８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３４４を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９３９６を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４１２を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ７７３４を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。
本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０１４９３を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０９５０９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５１を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０８を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２０９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１５９を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ９１４７を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２４を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。本発明は、組換え発現ベクターｐＤＡＢ１０８２２５を含むダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸分子（例えば、組換え核酸分子）が細胞中に挿入され得る任意の方法をいうために使用される。用語「形質転換」は、藻類、細菌および酵母などの微生物細胞中または植物細胞中への核酸分子の導入をいうためにかかる用語が使用される場合、用語「トランスフェクション」と相互交換可能に使用され得る。微生物および植物の系において、用語「形質転換」は、微生物または植物による外因性核酸の獲得に起因した遺伝性の変化を記述するために使用され、用語「トランスフェクション」と本質的に同義である。いくつかの実施形態において、トランスフェクション技術には、形質転換、パーティクルボンバードメント、拡散、能動輸送、槽超音波処理（bath sonication）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染およびプロトプラスト融合が含まれるがこれらに限定されない。
植物中に発現ベクターを導入するために広く利用される方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然の形質転換系に基づいている。Horschら、Science 227:1229 (1985)。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが公知の、植物病原性の土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミドおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換を担う遺伝子を保有する。Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)。アグロバクテリウム（Agrobacterium）ベクター系、およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の遺伝子移入のための方法の説明もまた、利用可能である。例えば、Gruberら、前出、Mikiら、前出、Moloneyら、Plant Cell Reports 8:238 (1989)および米国特許第４，９４０，８３８号および同第５，４６４，７６３号。
植物形質転換の別の公知の方法は、微粒子（microprojectile）媒介性の形質転換であり、この方法では、ＤＮＡは、微粒子の表面上に担持される。この方法において、発現ベクターは、植物の細胞壁および細胞膜を貫通するのに充分な速度まで微粒子を加速する遺伝子銃（biolistic）デバイスを用いて、植物組織中に導入される。Sanfordら、Part. Sci. Technol. 5:27 (1987)、Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988)、Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990)、Kleinら、Biotechnology 10:268 (1992)。
植物へのＤＮＡの物理的送達のためのなお別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Zhangら、Bio/Technology 9:996 (1991)。また、リポソームまたはスフェロプラスト融合が、植物中に発現ベクターを導入するために使用されてきた。Deshayesら、EMBO J., 4:2731 (1985)、Christouら、Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)。ＣａＣｌ２沈澱、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを使用したプロトプラスト中へのＤＮＡの直接的取り込みもまた、報告されている。Hainら、Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)およびDraperら、Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに細胞全体および組織全体のエレクトロポレーションもまた記載されている。Donnら、Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, 53頁(1990)；D'Halluinら、Plant Cell 4:1495-1505 (1992)およびSpencerら、Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)。さらに、炭化ケイ素（silicone carbide）ウィスカー（Kaeplerら、1990, Plant Cell Reports）および例えば花浸漬（flower dipping）方法論を使用する植物形質転換（CloughおよびBent, Plant J. 16:735-743 (1998)）もまた、使用され得る。正確な植物形質転換方法論は、形質転換のために選択される植物種および選択される植物細胞型（例えば、実生由来の細胞型、例えば、胚軸（hypocotyl）および子葉または胚性組織）にいくらか依存して変動し得る。
植物細胞中への遺伝子構築物の導入後に、植物細胞を成長させ得、苗条および根などの分化する組織の出現に際して、成熟植物が生成され得る。いくつかの実施形態において、複数の植物が生成され得る。植物を再分化させるための方法論は当業者に告知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, VasilおよびThorpe編Kluwer Academic Publishers、ならびにPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall編Humana Press)中に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物は、発酵培地中で培養され得るか、または土壌などの適切な培地中で成長させ得る。いくつかの実施形態において、高等植物に適した成長培地には、土壌、砂、根の成長を支持する任意の他の粒子状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）または水耕栽培、ならびに高等植物の成長を最適化する適切な光、水および栄養サプリメントが含まれるがこれらに限定されない、植物用の任意の成長培地が含まれ得る。
組換えＤＮＡ技術の使用は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、これらの核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得ることが、当業者に理解される。さらに、プロモーター配列は、ネイティブのプロモーターと比較して、発現のレベルを改善するように遺伝子操作され得る。核酸分子の発現を制御するのに有用な組換え技術には、１つまたは複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用に対応するための核酸分子の改変、および転写物を不安定化する配列の欠失、が含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、植物には、医薬品、香味料、栄養補助剤、機能性食物成分もしくは化粧品として活性な薬剤として使用される化合物を生成することが公知の植物、またはこれらの化合物／薬剤を生成するように遺伝子操作された植物が含まれ得る。
本発明のこれらの実施形態は全て、遺伝子改変された生物ならびに本明細書中に記載されるような生物を生成および使用する方法のいずれかの考察に適用される。
遺伝子改変された生物由来の生成物
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された生物は、ＥＰＡ（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）、ＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３）、ＡＲＡ（Ｃ２０：４，ｎ−６）、ＧＬＡ（Ｃ１８：３，ｎ−６）、ＡＬＡ（Ｃ１８：３，ｎ−３）および／またはＳＤＡ（Ｃ１８：４，ｎ−３））が含まれるがこれらに限定されない１種または複数の多価不飽和脂肪酸を生成し、いくつかの実施形態において、ＥＰＡ（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）、ＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３）もしくはＤＴＡ（Ｃ２２：４，ｎ−６）またはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない１種または複数のより長い鎖のＰＵＦＡを生成する。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物は、ＥＰＡ（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ＤＨＡ（Ｃ２２：６，ｎ−３）および／もしくはＤＰＡ（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３）またはこれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない１種または複数の多価不飽和脂肪酸を生成する。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物は、高いオレイック（oleic）背景を有さない。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された生物は、本明細書中に記載される、ＰＵＦＡシンターゼおよびＰＰＴａｓｅを組換え発現するように遺伝子改変された植物である。いくつかの実施形態において、かかる植物は、宿主によるＰＵＦＡ（またはＰＵＦＡシンターゼの他の生物活性生成物）の生成および／または蓄積の改善のための、本明細書中に記載されるアクセサリータンパク質（例えば、ＡＣｏＡＳ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＡＧＡＴまたはＡＣＣａｓｅ）を発現するように、さらに遺伝子改変されたものである。
本発明のいくつかの実施形態は、所望の鎖長および所望の数の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸の生成、ならびに拡張して、これらのＰＵＦＡを含む本明細書中に記載される遺伝子改変された植物から得られた（例えば、かかる植物の油または種子から得られた）油糧種子および油を含む。本発明によって生成され得るＰＵＦＡの例には、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＡＲＡ（エイコサテトラエン酸またはアラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６））、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６またはｎ−３））およびＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））ならびにそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない。本発明は、ＰＵＦＡを生成するＰＵＦＡシンターゼの使用を介した遺伝子改変された植物の開発によって、１種または複数の所望の（標的または一次）ＰＵＦＡが富化した商業的に有益な脂質の生成を可能にする。
いくつかの実施形態において、特定の生物から誘導された所与のＰＵＦＡシンターゼは、特定の生物由来のＰＵＦＡシンターゼの選択が特定された標的または一次ＰＵＦＡの生成を生じるように、特定のＰＵＦＡ（複数可）を生成する。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡの比率は、特定のＰＵＦＡシンターゼの選択、およびそれが発現される特定の条件にその系が如何に応答するかに依存して、異なり得る。例えば、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂ（ＡＴＣＣ番号２０８９２）由来のＰＵＦＡシンターゼの使用は、標的または一次ＰＵＦＡとしてＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）の生成もまた生じ得る；しかし、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）２３Ｂの場合、ＤＨＡ対ＤＰＡ（ｎ−６）の比率は、１０：１（および８：１から４０：１までの範囲であり得る）であるが、シゾキトリウム（Schizochytrium）では、この比率は典型的には２．５：１である。いくつかの実施形態において、所与のＰＵＦＡシンターゼは、異なるＰＵＦＡシンターゼ由来のタンパク質およびドメインを混ぜることによって改変され得るか、あるいは標的ＰＵＦＡ生成物および／または比率を変化させるために、所与のＵＦＡシンターゼのドメインまたはタンパク質が改変され得る。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを生成する酵素系の「中間体生成物」または「副生成物」に対する言及は、その系の標的または一次ＰＵＦＡ（複数可）の生成の結果として酵素系によって生成されるが、一次または標的ＰＵＦＡ（複数可）ではない任意の生成物、および特に脂肪酸生成物をいう。いくつかの実施形態において、中間体および副生成物には、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとして使用される親植物によって天然に生成されるが、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとして使用される親植物によって生成されるレベルと比較して遺伝子改変の結果としてより高いレベルで生成されるので本明細書中では中間体または副生成物として分類される、非標的脂肪酸が含まれ得る。いくつかの実施形態において、１つの酵素系の一次または標的ＰＵＦＡは、一次または標的生成物が異なるＰＵＦＡである異なる酵素系の中間体であり得る。例えば、ＥＰＡを生成するための標準的な経路を使用した場合、ＧＬＡ、ＤＧＬＡおよびＳＤＡなどの脂肪酸は、顕著な量で中間体生成物として生成される（例えば、米国出願公開番号２００４／０１７２６８２）。同様に、また米国出願公開番号２００４／０１７２６８２によって示されるように、ＤＨＡを生成するための標準的な経路を使用した場合、上述の脂肪酸に加えて、ＥＴＡおよびＥＰＡ（即ち、上記第１の例における標的ＰＵＦＡ）は、顕著な量で生成され得、標的ＰＵＦＡ自体よりも、総脂肪酸生成物に対して、顕著により多い量で存在し得る。
いくつかの実施形態において、１種または複数の所望の多価不飽和脂肪酸を顕著に高い収率で生成するために、植物は、植物中にＰＵＦＡシンターゼ系を導入するために遺伝子改変され得る。植物は、ＰＵＦＡシンターゼを内因的に含むことが知られておらず、従って、本発明は、独自の脂肪酸生成能を有する植物を生成する機会を提示する。本発明は、同じ植物において、それらの任意の組合せを含めたＥＰＡ、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ３またはｎ６）、ＡＲＡ、ＧＬＡ、ＳＤＡなどが含まれるがこれらに限定されない、１種または複数のＰＵＦＡを生成するように遺伝子操作された植物を提供する。本発明は、種々の比率および形態で多数の「デザイナー油」のうち任意の１つを創出する能力を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される特定の海洋生物由来のＰＵＦＡシンターゼの使用は、ＰＵＦＡ生成の範囲を拡張でき、殆どの作物植物を成長させるのに使用される温度範囲内でかかるＰＵＦＡを首尾よく生成できる。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを合成するための系の中間体または副生成物を「実質的に含まない」、あるいは実質的な量で存在する中間体または副生成物を有さないとは、ＰＵＦＡ（例えば、野生型植物または示された遺伝子改変のレシピエントとして使用される親植物によって生成されない）を生成するための酵素系の導入または存在の結果として、遺伝子改変された植物（ならびに／または植物の一部および／もしくは種子油画分）において生成される任意の中間体または副生成物の脂肪酸（非標的ＰＵＦＡ）が、総脂肪酸の重量で１０％未満、総脂肪酸の重量で９％未満、総脂肪酸の重量で８％未満、総脂肪酸の重量で７％未満、総脂肪酸の重量で６％未満、総脂肪酸の重量で５％未満、総脂肪酸の重量で４％未満、総脂肪酸の重量で３％未満、総脂肪酸の重量で２％未満、総脂肪酸の重量で１％未満、総脂肪酸の重量で０.５％未満の量で存在し得ることを意味する。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ ｎ−６））またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、少なくとも１０％、少なくとも１０．５％、少なくとも１１％、少なくとも１１．５％、少なくとも１２％、少なくとも１２．５％、少なくとも１３％、少なくとも１３．５％、少なくとも１４％、少なくとも１４．５％、または少なくとも１５％のＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％、０．０５％〜１０％および１％〜５％のＤＨＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、または少なくとも１０％のＥＰＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％、０．０５％〜５％および０.１％〜５％のＥＰＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、または少なくとも１０％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％、０．０１％〜５％、０．０１％〜１％、０．０１％〜０．０５％、０．０５％〜５％および０.１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）で選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも１：１、少なくとも１：１.５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、少なくとも１：１０、少なくとも１：１１、少なくとも１：１２、少なくとも１：１３、少なくとも１：１４、少なくとも１：１５、少なくとも１：１６、少なくとも１：１７、少なくとも１：１８、少なくとも１：１９、少なくとも１：２０、少なくとも１：２１、少なくとも１：２１、少なくとも１：２２、少なくとも１：２３、少なくとも１：２４、少なくとも１：２５、少なくとも１：２６、少なくとも１：２７、少なくとも１：２８、少なくとも１：２９、または少なくとも１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０、１：１〜１：２５、１：１〜１：２０、１：１〜１：１５、１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１〜１：３および１：１〜１：２の比率のＥＰＡ：ＤＨＡで選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、あるいは本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた油または種子は、総脂肪酸の重量で少なくとも１：１、少なくとも１：１．５、少なくとも１：２、少なくとも１：２．５、少なくとも１：３、少なくとも１：３．５、少なくとも１：４、少なくとも１：４．５、少なくとも１：５、少なくとも１：５．５、少なくとも１：６、少なくとも１：６．５、少なくとも１：７、少なくとも１：７．５、少なくとも１：８、少なくとも１：８．５、少なくとも１：９、または少なくとも１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ-６）：ＤＨＡを含む。有用な範囲は、これらの値のいずれかの間、例えば、総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０、１：１〜１：５、１：１〜１：３および１：１〜１：２の比率のＤＰＡ（ｎ-６）：ＤＨＡ、で選択され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部あるいは種子から得られた油は、油の重量で少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％のトリグリセリドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部あるいは種子から得られた油は、油の重量で７０％〜９９％のトリグリセリド、油の重量で７５％〜９９％のトリグリセリド、油の重量で８０％〜９９％のトリグリセリド、油の重量で８５％〜９９％のトリグリセリド、または油の重量で９０％〜９９％のトリグリセリドを含む。トリグリセリドの精製および分析のための方法は、記載されている（例えば、Ruiz-Gutierrez VおよびBarron LJ, J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 671:133-168, 1995）。
いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡシンターゼ系の標的生成物が、長鎖ＰＵＦＡ、例えばＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６またはｎ−３）またはＥＰＡである場合、かかるＰＵＦＡシンターゼ系を用いて遺伝子改変された植物の総脂質中に実質的な量で存在しない中間体生成物および副生成物には、以下が含まれ得るがこれらに限定されない：γ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３，ｎ−６）；ステアリドン酸（ＳＴＡまたはＳＤＡ；１８：４，ｎ−３）；ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡまたはＨＧＬＡ；２０：３，ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ，Ｃ２０：４，ｎ−６）；エイコサトリエン酸（ＥＴＡ；２０：３，ｎ−９）および種々の他の中間体または副生成物、例えば２０：０；２０：１（Δ５）；２０：１（Δ１１）；２０：２（Δ８，１１）；２０：２（Δ１１，１４）；２０：３（Δ５，１１，１４）；２０：３（Δ１１，１４，１７）；ミード酸（２０：３；Δ５，８，１１）；または２０：４（Δ５，１，１４，１７）。
本発明に従う植物の遺伝子改変は、植物による１種または複数のＰＵＦＡの精製を生じ得る。いくつかの実施形態において、植物によって生成されるＰＵＦＡプロファイルおよびＰＵＦＡの比率は、ＰＵＦＡシンターゼがそこから誘導された生物によって生成されるＰＵＦＡプロファイルおよびＰＵＦＡの比率と必ずしも同じである必要はない。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、ＰＵＦＡシンターゼの活性を介してＰＵＦＡを生成するように操作され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から化合物を抽出する精製プロセスを介して回収され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を収集することによって回収され得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡは、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部由来（例えば、油糧種子由来）の油、あるいは植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部由来の種子を収集することによって回収され得る。いくつかの実施形態において、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部はまた、その天然状態で消費され得るか、または消費用の製品へとさらに加工され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変された植物、子孫，細胞、組織またはそれらの一部は、１種または複数の多価不飽和脂肪酸を生成し得る。いくつかの実施形態において、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部は、少なくとも１種のＰＵＦＡ（標的ＰＵＦＡ）を、（例えば、油糧種子植物である場合にはその成熟種子中に、または油糧種子植物の種子の油中に）生成し得、ここで、ＰＵＦＡを蓄積する植物または植物の一部（例えば、植物が油糧種子植物である場合には成熟種子、または油糧種子植物の種子の油）中の総脂肪酸プロファイルは、検出可能な量のこのＰＵＦＡ（単数または複数）を含む。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡは、少なくとも２０炭素のＰＵＦＡであり、少なくとも３つの二重結合、少なくとも４つの二重結合または少なくとも５つの二重結合を含む。いくつかの実施形態において、標的ＰＵＦＡは、その植物によって天然には生成されないＰＵＦＡであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＵＦＡを蓄積する植物または植物の一部（植物の種子油を含む）中の総脂肪酸プロファイルは、総脂肪酸の重量で少なくとも０．１％の標的ＰＵＦＡ（複数可）、総脂肪酸の重量で少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％の、７５％より多くの少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（標的ＰＵＦＡ（単数または複数））、または０．１％から７５％までの任意の百分率、または０．１％の増分で７５％より高い％（最大１００％または１００％）の標的ＰＵＦＡ（複数可）を含む。
本明細書中で使用する場合、ＰＵＦＡの百分率量に対する言及は、特に示さない限り、抽出された総脂肪酸の重量百分率である。いくつかの実施形態において、総脂肪酸は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）調製物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって決定されるが、総脂肪酸の決定はこの方法に限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明の植物（および／または子孫、細胞、組織またはそれらの一部あるいは種子油画分）中の総脂肪酸は、植物によって生成された総脂肪酸の重量で１０％未満、植物によって生成された総脂肪酸の重量で９％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で８％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で７％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で６％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で５％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で４％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で３％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で２％未満、植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成された総脂肪酸の重量で１％未満の、γ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３，ｎ−６）；ステアリドン酸（ＳＴＡまたはＳＤＡ；１８：４，ｎ−３）；ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡまたはＨＧＬＡ；２０：３，ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４，ｎ−６）；エイコサトリエン酸（ＥＴＡ；２０：３，ｎ−９）および種々の他の脂肪酸、例えば２０：０；２０：１（Δ５）；２０：１（Δ１１）；２０：２（Δ８，１１）；２０：２（Δ１１，１４）；２０：３（Δ５，１１，１４）；２０：３（Δ１１，１４，１７）；ミード酸（２０：３；Δ５，８，１１）；または２０：４（Δ５，１，１４，１７）から選択される脂肪酸を、含み得る。
本発明は、本明細書中に記載される植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部によって生成される任意の種子、ならびに本発明の植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部または種子によって生成される任意の油を含む。本発明はまた、本明細書中に記載される植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、種子または油を使用して生成される任意の製品もまた含む。
本発明の遺伝子改変された生物に関する使用および生成物
本発明は、上に詳細に記載される本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部（例えばダイズ）を成長させるまたは栽培することによって、ＰＵＦＡを生成する方法を含む。いくつかの実施形態において、かかる方法は、例えば、本明細書中に以前に記載したような本発明に従う遺伝子改変を有する植物を、土壌などの適切な環境中で成長させることを含む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から、または本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法を含む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成長させる工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法を含む。本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法を含む。本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を成長させる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法を含む。
本発明は、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部、本発明の油、本発明の種子、本発明の食物製品、本発明の機能性食物、あるいは本発明の医薬製品をそれを必要とする個体に提供する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含むサプリメントまたは治療用製品を、それを必要とする個体に提供する方法を含む。本発明は、植物または植物細胞を、（ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成する藻類ＰＵＦＡシンターゼ系をコードする核酸配列；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニル補因子を藻類ＰＵＦＡシンターゼ系ＡＣＰドメインに転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸配列で形質転換する工程を含む、本発明の遺伝子改変された植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を生成する方法もまた含む。いくつかの実施形態において、この方法は、植物または植物細胞を、（ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡへの長鎖ＰＵＦＡ遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の変換を触媒するアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列で形質転換する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法のＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＤＰＡ（ｎ−６）および／またはＥＰＡである。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、ダイズ油である。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲を含む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＥＰＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ−６）、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡ、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲を含む。いくつかの実施形態において、本発明のかかる方法によって生成される油は、総脂肪酸の重量で１：１または１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡ、総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡ、または本明細書中にさらに記載されるその任意の量もしくは範囲をさらに含む。
本発明はさらに、本明細書中に記載される任意の生物またはそれらの一部（例えば、植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部（例えば油糧種子）、あるいはその調製物もしくは画分）、ならびに本明細書中に記載される生物によって生成される任意の油を、さらに含む。本発明はまた、本明細書中に記載される生物、その一部または油を使用して生成される任意の製品もまた含む。
本発明は、生物、その一部、あるいは本発明に従うおよび本明細書中に記載される遺伝子改変された生物（例えば、本明細書中に記載されるように遺伝子改変された植物、子孫、細胞、種子、組織またはそれらの一部）によって生成される油を製品に添加する工程を含む、少なくとも１種の脂肪酸を含む製品を改変する方法に関する。本方法によって生成される、本明細書中に記載される任意の生物、その一部または生物由来の油を一般に含む任意の製品もまた、本発明によって包含される。
いくつかの実施形態において、この製品は、食物食餌サプリメント、医薬製剤、ヒト化動物ミルク、調製粉乳、栄養補助食品および機能性食物から選択される。適切な医薬製剤には、抗炎症製剤、化学療法剤、活性な賦形剤、骨粗鬆症薬物、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）薬物、神経変性疾患の処置用の薬物、変性性肝臓疾患の処置用の薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、この製品は、慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、癌、悪液質、心臓再狭窄、神経変性障害、肝臓の変性性障害、血液脂質障害、骨粗鬆症、変形性関節症、自己免疫疾患、妊娠高血圧腎症、早産、加齢性黄斑変性症、肺障害およびペルオキシソーム病から選択される状態を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、この製品は、食物製品または機能性食物製品である。適切な食物製品には、高級製パン商品（fine bakery ware）、パンおよびロール、朝食用シリアル、プロセスチーズおよび非プロセスチーズ、調味料（ケチャップ、マヨネーズなど）、乳製品（ミルク、ヨーグルト）、プディングおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果実ベースの飲料、チューインガム、硬い菓子類（hard confectionery）、冷凍乳製品、加工食肉製品、ナッツおよびナッツベースのスプレッド、パスタ、加工家禽製品、グレイビーおよびソース、ポテトチップスおよび他のチップス（chipsまたはcrisps）、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミックス、ダイズベースの製品（例えば、豆乳、飲料、クリーム、粉状ミルク）、植物油ベースのスプレッド、ならびに野菜ベースの飲料が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態において、この製品は、動物のための餌もしくは食事組成物、または餌もしくは食事組成物用の添加物である。用語「動物」には、ヒトおよび非ヒトが含まれる。動物の非限定的な例は、非反芻動物（例えば、ブタ、家禽または魚）および反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジおよびウマ）である。用語餌または餌組成物とは、動物による摂取に適したまたは動物による摂取を意図した、任意の化合物、調製物、混合物または組成物を意味する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物、子孫、組織またはそれらの一部から得られる油、および別の油を含む油ブレンドを対象とする。いくつかの実施形態において、この別の油は、種子油、植物油、魚油、微生物油またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子改変された植物、子孫、組織またはそれらの一部から得られる油は、油中のＬＣ−ＰＵＦＡを改変するため、例えば、エステルを形成するためおよび／または医薬目的でＬＣ−ＰＵＦＡを精製するために、さらに加工され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡまたは本明細書中にさらに記載されるその任意の範囲を含むダイズ油を対象とする。いくつかの実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡをさらに含む。いくつかの実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ−６）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ダイズ油は、総脂肪酸の重量で３．５％より高いα−リノレン酸、または本明細書中にさらに記載されるその任意の範囲の脂肪酸プロファイルを有する。本発明のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるダイズ油を含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態において、ダイズ油を含む組成物は、１種または複数種の油を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、ダイズではない供給源由来のＰＵＦＡ（例えばＤＨＡ）を含まない。
本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴は、限定を意図しない以下の実施例を検討すれば、当業者に明らかとなる。
［実施例］
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩのコドン最適化
シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＦ３７８３２７、ＧＩ：１５８５１８６８８）由来のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＦ３７８３２８、ＧＩ：１５８５１８６９０）由来のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８およびスラウストキトリウム（Thraustochytrium）由来のＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（米国出願公開番号２００８／００２２４２２）（「ハイブリッドＯｒｆＣ」とも記載される）、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ＿２０８８８由来のアシル−ＣｏＡシンテターゼ（米国出願公開番号２００７／０２４５４３１）、ならびにノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７１２０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｐ３７６９５、ＧＩ：２０１４１３６７）由来の４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩをコードするＤＮＡ配列の分析により、最適な植物発現にとって有害であり得る非最適なコドン組成を含むいくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質をコードする遺伝子（複数可）の設計を、性質がより「植物様」であるＤＮＡ配列を生成するために最適化したが、このとき、配列改変は、翻訳を妨害せず、非最適なコドン組成を介したｍＲＮＡの不安定化を生み出すこともない。
遺伝子コードの冗長性／縮重（例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多いコドンによって特定される）によってもたらされる可塑性に起因して、異なる生物または生物のクラスにおけるゲノムの進化が、同義のコドンの差示的な使用を生じている。この「コドンバイアス」は、タンパク質コード領域の平均塩基組成中に反映される。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含量を有するゲノムを有する生物は、同義のコドンの３番目の位置においてＡまたはＴを有するコドンをより多く利用するが、より高いＧ＋Ｃ含量を有するものは、３番目の位置においてＧまたはＣを有するコドンをより多く利用する。さらに、ｍＲＮＡ内の「マイナー」コドンの存在は、特に、マイナーコドンに対応するチャージｔＲＮＡの相対的な豊富さが低い場合には、ｍＲＮＡの絶対的翻訳速度を低下させ得ると考えられる。この論法の拡張は、個々のマイナーコドンによる翻訳速度の減少が、複数のマイナーコドンにとって少なくとも付加的となるというものである。従って、高い相対含量のマイナーコドンを有するｍＲＮＡは、対応して低い翻訳速度を有する。この速度は、対応して低いレベルのコードされるタンパク質によって反映される。
双子葉植物（例えば、タバコ、ダイズ、ワタまたはキャノーラ）における発現のために、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質をコードする遺伝子を操作する際に、キャノーラのコドン使用を、公に利用可能なデータベースから評価した（表１）。
アミノ酸に対する残りのコドン選択の分布のバランスをとるために、各コドンについての加重平均表示を、式：Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋など）×％Ｃ１×１００を使用して計算し（表１）、式中、Ｃ１は問題のコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３などは、表１の残りの同義のコドンの、キャノーラについての％値の平均（関連するコドンについての平均％値は、列ＣおよびＧからとる）を示す。各コドンについての加重平均％値は、表１の列ＤおよびＨに与えられる。
植物発現のためのコード領域を設計する際に、植物によって好まれる一次（「第１選択の」）コドンを決定し、複数の選択が存在する場合には好ましいコドンの第２選択、第３選択、第４選択などを決定した。次いで、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの本質的に同じアミノ酸配列をコードするが、アミノ酸配列内の各位置においてアミノ酸を特定するために、植物（第１に好ましい、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましい、など）コドンの置換によって元のＤＮＡ配列（ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩをコードする）とは異なっている、新しいＤＮＡ配列を設計した。
次いで、この新しい配列を、配列中の改変によって創出された制限酵素部位について分析した。次いで、第１、第２、第３または第４選択の好ましいコドンによってコドンを置き換えることによって、同定された部位を改変した。次いでこの配列をさらに分析し、ＴＡまたはＧＣダブレットの頻度を低減するために改変した。
これらの配列の分析により、新たなＤＮＡ配列が、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質のアミノ酸配列を本質的にコードするが、キャノーラ遺伝子において見出される頻繁に使用されるコドンのバランスのとれたコドン分布を使用する双子葉植物における最適な発現のためにそれぞれ設計されたものであることが明らかになった。特に、新たなＤＮＡ配列は、タンパク質のアミノ酸配列内の各位置において適切なアミノ酸を特定するために、植物（第１に好ましい、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましい）コドンの置換によって、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩをコードする元のＤＮＡ配列とは異なっていた。
植物に最適化されたＤＮＡ配列の設計を、表１、列ＤおよびＨから構築したキャノーラコドンバイアス表を使用して、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（配列番号１）、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ（配列番号２）、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（配列番号３）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ（配列番号４）および４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ（配列番号５）のタンパク質配列の逆翻訳によって開始した。アシル−ＣｏＡシンテターゼ（配列番号４）のタンパク質配列を、元の配列から変更した；このとき、２番目のアミノ酸アラニンをタンパク質から除去した。次いで、制限酵素認識部位を除去または付加するため、高度に安定な鎖内二次構造を除去するため、および植物中の操作された遺伝子のクローニング操作または発現にとって有害であり得る他の配列を除去するために、コドン変化（全体的な加重平均コドン表示を保持したまま）を補償することによって、最初の配列を改変した。次いで、このＤＮＡ配列を、改変によって創出された可能性がある制限酵素認識部位について再分析した。第１、第２、第３または第４選択の好ましいコドンによって適切なコドンを置き換えることによって、同定された部位をさらに改変した。目的の遺伝子の転写または翻訳に影響を与え得る配列中の他の部位には、エキソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナルまたはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルが含まれる。改変された配列をさらに分析し、さらに改変して、ＴＡまたはＣＧダブレットの頻度を低減し、ＴＧまたはＣＴダブレットの頻度を増加させた。これらのダブレットに加えて、［Ｇ＋Ｃ］または［Ａ＋Ｔ］の約６より多く連続する残基を有する配列ブロックが、配列の転写または翻訳に影響を与え得る。従って、第１または第２選択などのコドンを他の好ましい選択されたコドンで置き換えることによって、これらの配列ブロックもまた改変した。コドン組成自体とは異なる設計基準（例えば、制限酵素認識部位の付加または欠失）を適応させることが必要な場合にのみ使用される、稀に使用されるコドンは、遺伝子設計においてかなりの程度まで含まれない。
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡによってコードされるタンパク質は、１７から２９アミノ酸までのサイズ範囲の反復する「プロリン−アラニン」ドメインを１０個含む。プロリン−アラニン反復間には、８７アミノ酸を含む９つのより長い反復配列ドメインが散在した。これらの反復のアミノ酸配列は、４つの位置でのみ変動し、バリアント位置のそれぞれにおいて２つのコドン選択だけが存在した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗコンピュータプログラムを使用して９つの反復のアミノ酸配列を分析したところ、１００％の相同性値および９５．４％の同一性値が得られた。ＤＮＡレベルで、９つの反復をコードする配列は、１００％相同、８９．７％同一であり、各反復をコードする２６１塩基中の２７の位置でのみ変動する（２７の変化のうち２３が「サイレントな」差異であり、同じアミノ酸についての同義のコドンが相互交換される）。
標準的な遺伝子設計プロセスは、このサイズの複数の反復のために新たなコドンバイアスのかかったＤＮＡ配列の開発を容易に適応させることはできないが、これは、高度に関連するＤＮＡ配列が生じるのを回避するために、コドン選択が他の８つの反復中の同じ位置で行われた、個々の反復中の全てのコドン選択のバランスを継続的にとる必要があるからである。８７残基の反復のそれぞれについて、同じアミノ酸配列をコードする４．５×１０４３より多くの可能なＤＮＡ配列が存在した（配列中の各アミノ酸についての同義のコドンの数の積として計算される）。従って、同一にコードするＤＮＡ配列を生成するために利用可能な非常に大きい計算空間（computing space）が存在した。以下のプロトコルは、各個々の反復についての（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）複数配列設計を生成し、その後、全ての配列バージョンをバルクで比較して、反復をコードする高度に多様な配列を示すセットを同定するために使用される方法を記載している：
工程１：別個の配列として各反復されたアミノ酸ドメインをコードするネイティブＤＮＡ配列を抽出する。
工程２：遺伝子設計プログラム（例えば、ＯＰＴＧＥＮＥ（商標）、Ｏｃｉｍｕｍ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｈｙｄｅｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）中に、個々の反復されたＤＮＡ配列を別個の配列としてインポートする。工程３〜５は、各配列に対して個別に実施される。
工程３：標準的な遺伝子コードを使用してＤＮＡ配列を翻訳する。
工程４：標準的な遺伝子コードおよび適切なコドンバイアス表を使用して、翻訳されたタンパク質の配列を逆翻訳する。この例において、５３０のセイヨウアブラナ（Brassica napus）タンパク質コード領域から集められたバイアスがかかったコドン表を使用し、各生成された配列は、「ｎａｐ」（「ｎａｐｕｓ」の代わり）＋バージョン番号でコード名化した。従って、反復１についての、第１の逆翻訳されたコドンバイアスがかかった配列は、「ｒｐｔ１ ｎａｐ１」と命名した。この例示において、このプロセスを１０回実施して、反復１のタンパク質配列をコードする１０のＤＮＡ配列バージョンを生成した。
工程５：１０の配列バージョンを、対応する数のテキストファイルにエクスポートする。
工程６：他の反復した配列ドメインのそれぞれについて工程３〜５を反復する。この例示において、合計９０の「ｎａｐ」配列バージョンを生成した（各反復されたエレメントについて１０）。
工程７：９０の配列ファイルをＣｌｕｓｔａｌ ＷプログラムＭｅｇａ ３．１（Ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅにおいてアクセスされる）中にインポートし、９０全ての配列をインプットとして使用してマルチプル配列アラインメントを実施する。これらの配列はタンパク質コード領域のセグメントであるので、ギャップを許容せずにアラインメントを実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント後、近隣結合ツリーを組み上げて可視化し、タンパク質中の９つの反復したドメインのそれぞれについて１０のコドン最適化された配列のうち１つを、視覚により選別する。各選択された配列バージョンを、最も深く枝分かれしたツリーの区画から選択する。
工程８：各反復されたドメインについて選択された配列を、各特定の反復について適切な位置において、タンパク質全体をコードするコドン最適化されたＤＮＡ配列中に組み込む。
工程９：個別に設計された多様な反復エレメントを含む、コドン最適化された配列全体の最終的な分析を実施して、望ましくないモチーフ、制限酵素認識部位などの非存在を保証する。
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡコード配列のコドン最適化と共にこの方法を使用することは、反復される配列の不安定性を回避するために充分に多様化された反復されたプロリン−アラニン配列の選択を生じる。これらの配列を、近接結合ツリーの最も深い枝（即ち、この配列セット中の互いに最も遠く関連するもの）から選択した。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｓｓｅｒｍａｎグローバルアラインメントを、全てのペアワイズの組合せについて実施したところ、７６〜７７％の起こりうる中央値で、相同性の範囲は７４〜８１％であった（表２）。
９つの反復されたドメインについての選択された９つの新たに設計されたコード領域のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が、図１に示される。全体として、これらの配列は、１００％相同および８９．７％同一な元の配列と比較して、９３．１％相同、６１．７％同一である。より大きい配列の分岐は、１０より多い配列反復（iteration）を使用し、（視覚的に配列を選択する代わりに）コンピュータプログラムまたは数学的アルゴリズムを使用してこれらの配列から選択することによって、達成され得る。それにもかかわらず、例示された配列は高度に分岐しており、安定なポリヌクレオチドフラグメントを生成した。
新たに設計されたキャノーラに最適化されたＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩのＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０で列挙する。これらのコドン最適化された配列は、明細書全体にわたりバージョン３（ｖ３）と特定されるが、コドン最適化されていない配列は、明細書全体にわたりバージョン２（ｖ２）という。
得られたＤＮＡ配列は、より高い程度のコドン多様性、望ましい塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または産物ｍＲＮＡの翻訳を妨害し得る配列を欠く。表３、表４、表５、表６および表７は、表１、列ＤおよびＨから計算されるように、元の遺伝子、植物に最適化されたバージョンおよび植物に最適化された配列についての推奨されるコドン組成において見出されるＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質のコード領域のコドン組成の比較を示す。
コード領域配列のコドン最適化が完了した後、この最適化されたコード領域配列にさらなるヌクレオチド配列を付加した。クローニングを容易にするための制限部位、Ｋｏｚａｋ配列およびさらなる終止コドンを、植物に最適化されたコード配列に付加した。さらに、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小鎖１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿２０２３６９．２）由来の葉緑体標的化配列を含む、第２シリーズのＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩコード配列を設計した。この配列、配列番号２８を、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの上記コード配列に付加した。配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から最初のメチオニンを除去し、葉緑体標的化配列で置き換えた。葉緑体標的化配列を含む配列は、明細書全体にわたりバージョン４（ｖ４）と特定される。
第２の葉緑体トランジットペプチドを、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩのコード配列に付加した。これらのコード配列は、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｘ７３８４９．１）由来の葉緑体標的化配列を含むように設計した。この配列、配列番号２９を、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣおよびホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩの上記コード配列に付加した。配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号１０から最初のメチオニンを除去し、葉緑体標的化配列で置き換えた。葉緑体標的化配列を含む配列は、明細書全体にわたりバージョン５（ｖ５）と特定される。
シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）由来のアシル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子の代替的バージョンを、ネイティブ遺伝子配列を改変して余分なオープンリーディングフレームを除去することによって創出した。このバージョンを「ＳｚＡＣＳ−２ ｖ４」と標識し、配列番号３０として列挙する。得られた遺伝子は「ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３」として上記されるアシル−ＣｏＡシンテターゼ発現遺伝子配列を置き換えるために使用される。
植物に最適化されたＤＮＡ配列が書類上またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで一旦設計されると、実際のＤＮＡ分子を、設計された配列に対して配列が正確に対応するように、実験室において合成することができる。かかる合成ＤＮＡ分子は、クローニングでき、天然またはネイティブの供給源から誘導されたかのように他の方法で正確に操作できる。上記さらなる配列を含む配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０を含むＤＮＡフラグメントの合成は、供給業者（Ｇｅｎｅａｒｔ Ａｇ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が実施した。次いで、合成ＤＮＡを発現ベクター中にクローニングし、実施例２および３に記載したように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）およびダイズ中に形質転換した。
ｐＤＡＢ７３６２のプラスミド構築
ｐＤＡＢ７３６２バイナリープラスミド（図２；配列番号１１）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６２は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ（上記ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ遺伝子を発現する）、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ ＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、短縮型インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）フィトヘマグルチニン−Ｌ遺伝子プロモーター（ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０６３３６）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＡＴ２Ｓ３遺伝子５’非翻訳領域（２Ｓ ５’ＵＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１１８８５０）、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームＡ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）２Ｓアルブミン遺伝子３’非翻訳領域ターミネーター（Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２２０３５）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームＢ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シゾキトリウム（Schizochytrium）およびスラウストキトリウム種（Thraustochytrium sp.）の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームＣ（ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３）、ならびにＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、シゾキトリウム属の種（Schizochytrium sp.）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ノストック属の種（Nostoc sp.）４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ（ＮｏＨｅｔＩ ｖ３）およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６２を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、Ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ（Toroら、PNAS 85(22): 8558-8562; 1988）およびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ；Gardnerら、Science 231:725-727; 1986および国際公開公報ＷＯ２００１／０２５４５９Ａ１）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Cassava vein Mosaic Virus）プロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２；Verdaguerら、Plant Molecular Biology 31:1129- 1139; 1996）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ ｖ５；Wohllebenら、Gene 70:25- 37; 1988）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４；Huangら、J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990）もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．１：発現を駆動するためのＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用するさらなるプラスミドの構築
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の発現を駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用するさらなる構築物を設計し、構築した。これらの構築物に対する種々の変更が、発現レベルを増加するために行われている。これらの変化には、コドン最適化されていない遺伝子配列の使用、葉緑体トランジットペプチドの組込み、およびアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵの除去が含まれる。
新たに構築されたプラスミドを使用して、ダイズ植物を安定に形質転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。これらの代替的構築物の使用は、より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られたＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
実施例２．２：ｐＤＡＢ７３６１の構築
ｐＤＡＢ７３６１は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２を含むように構築されたバイナリープラスミドであり、残りの遺伝子配列はコドン最適化されている（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３）。ｐＤＡＢ７３６１プラスミド（図３；配列番号３１）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６１は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６１を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３ ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．３：ＤＡＢ７３６３の構築
ｐＤＡＢ７３６３は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）をその全てが含む、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＮｏＨｅｔＩ ｖ４を含むように構築されたバイナリープラスミドである。さらに、このプラスミドは、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＡＣＳ−２ ｖ３を含む。ｐＤＡＢ７３６３プラスミド（図４；配列番号３２）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３４０、ｐＤＡＢ７３４１、ｐＤＡＢ７３４２、ｐＤＡＢ７３４４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６３を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．４：ｐＤＡＢ７３６５の構築
ｐＤＡＢ７３６５は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＳｚＡＣＳ-２ ｖ２およびＮｏＨｅｔＩ ｖ２を含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ７３６５プラスミド（図５；配列番号３３）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６５は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３５６、ｐＤＡＢ７３５７、ｐＤＡＢ７３６０およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６５を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．５：ｐＤＡＢ７３６８の構築
ｐＤＡＢ７３６８は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２およびＮｏＨｅｔＩ ｖ２を含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はＳｚＡＣＳ−２コード配列を含まない。ｐＤＡＢ７３６８プラスミド（図６；配列番号３４）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３５５、ｐＤＡＢ７３５６、ｐＤＡＢ７３５７、ｐＤＡＢ７３５９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６８を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．６：ｐＤＡＢ７３６９の構築
ｐＤＡＢ７３６９は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はＳｚＡＣＳ−２コード配列ＰＴＵを含まない。ｐＤＡＢ７３６９プラスミド（図７；配列番号３５）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３６９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３６９を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．７：ｐＤＡＢ７３７０の構築
ｐＤＡＢ７３７０は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）を含む、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＮｏＨｅｔＩ ｖ４を含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はＳｚＡＣＳ−２コード配列ＰＴＵを含まない。ｐＤＡＢ７３７０プラスミド（図８；配列番号３６）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７３７０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３４０、ｐＤＡＢ７３４１、ｐＤＡＢ７３４２、ｐＤＡＢ７３４３およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３７０を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．８：ｐＤＡＢ１００５１８の構築
ｐＤＡＢ１００５１８は、コード配列のアミノ末端に融合されたアシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ由来の葉緑体トランジットペプチド（チオエステラーゼトランジットペプチドと標識される）を含む、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ５、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ５およびＮｏＨｅｔＩ ｖ５を含むように構築されたバイナリープラスミドである。さらに、このプラスミドは、葉緑体トランジットペプチドを保有しないＳｚＡＣＳ−２ ｖ３コード配列ＰＴＵを含む。ｐＤＡＢ１００５１８プラスミド（図９；配列番号３７）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１００５１８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ５およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ５およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ５およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１００５１７、ｐＤＡＢ１００５１４、ｐＤＡＢ１００５１１、ｐＤＡＢ１００５１５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１００５１８を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ５、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ５、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ５、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ５である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．９：ｐＤＡＢ１０１４７６の構築
ｐＤＡＢ１０１４７６は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。このＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子配列は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンである。ｐＤＡＢ１０１４７６プラスミド（図１０；配列番号３８）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４７６は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１４７１およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４７６を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例２．１０：ｐＤＡＢ１０１４７７の構築
ｐＤＡＢ１０１４７７は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３を含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ１０１４７７プラスミド（図１１；配列番号３９）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４７７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ４遺伝子およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１４７２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４７７を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ４、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
ダイズ形質転換
ダイズ子葉節外植体のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を介して、トランスジェニックダイズ（Glycine max）を生成した。ｐＤＡＢ７３６２として上記されるバイナリーベクターを保有する無害化したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡ２５５２（米国出願番号６１／３６８，９６５、２０１０年７月２９日出願）を使用して、形質転換を開始した。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を、Zengら（Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の改変１／２子葉節手順を使用して実施した。簡潔に述べると、ダイズ種子（栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋ）を、基本培地上で発芽させ、子葉節を単離して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を感染させた。苗条開始、苗条伸長および発根培地に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の除去のために、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネート選択を使用して、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。選択された苗条を、根の発生のために発根培地に移し、次いで、小植物の順化のために土壌ミックスに移した。
選択された小植物の頂小葉を、グルホシネートを用いて局所的に処理して（葉彩色技術）、推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して順化させ、次いでグルホシネートで葉を彩色して、耐性を再確認した。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を使用して、ＰＡＴ、ならびにＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の存在を確認した。Ｔ０植物を温室中で自家受精させ、Ｔ１種子を生成した。
第２のダイズ形質転換法を使用して、さらなるトランスジェニックダイズ植物を生成した。ｐＤＡＢ７３６２として上記されるバイナリーベクターを保有する無害化したアグロバクテリウム（Agrobacterium）株ＤＡ２５５２（米国仮特許出願番号６１／３６８，９６５）を使用して、形質転換を開始した。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を、Pazら、（Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T.およびWang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）の改変半種子手順を使用して実施した。簡潔に述べると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで一晩滅菌し、無菌Ｈ２Ｏに２０時間浸し、その後アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の植物形質転換を行った。種子を臍に沿った縦方向切断によって半分に切断して種子を分離し、種皮を除去した。胚軸（embryonic axis）を切り出し、任意の軸方向の苗条/芽を子葉節から除去した。得られた半種子外植体にアグロバクテリウム（Agrobacterium）を感染させた。苗条開始、苗条伸長および発根培地に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の除去のために、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補充した。グルホシネート選択を使用して、形質転換されていない苗条の成長を阻害した。選択された苗条を、根の発生のために発根培地に移し、次いで、小植物の順化のために土壌ミックスに移した。
選択された小植物の頂小葉を、グルホシネートを用いて局所的に処理して（葉彩色技術）、推定形質転換体についてスクリーニングした。スクリーニングされた小植物を温室に移して順化させ、次いでグルホシネートで葉を彩色して、耐性を再確認した。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を使用して、ＰＡＴ、ならびにＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ導入遺伝子の存在を確認した。７つの事象を、ｐＤＡＢ７３６２由来の導入遺伝子を含むと同定した。これらのＴ０植物をさらなる分析に進め、温室中で自家受精させて、Ｔ１種子を得た。
ダイズ事象の分子分析
選択されたｐＤＡＢ７３６２ダイズ事象の導入遺伝子コピー数を、比較定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用して定量した。葉組織サンプルを成熟ダイズ植物の上部および下部の葉から採取し、これらのサンプルを合わせて、ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６ ＤＮＡ Ｐｌａｎｔ ＫｉｔおよびＢｉｏＳｐｒｉｎｔ ９６磁気粒子自動化プラットフォーム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して単離した。抽出されたゲノムＤＮＡを、定量リアルタイムＰＣＲ反応（ｑＰＣＲ）においてテンプレートとして使用するために、ｄｄＨ２０で１：５希釈した。
Ｒｏｃｈｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ｗｗｗ．ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｏｂｅｌｉｂｒａｒｙ．ｃｏｍ）を使用することによって、ｐＤＡＢ７３６２ダイズ植物中のＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＰＡＴ ｖ５導入遺伝子を検出するためにｑＰＣＲアッセイを設計した。アッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブを表８に記載する。標的遺伝子の存在を、フルオレセイン−アミダイト（ＦＡＭ）標識したＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて検出した。これらのアッセイを、シアニン−５（Ｃｙ−５）蛍光色素で標識されたダイズ内部参照ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１（表８中でＧＭＳ１１６と言及される）を用いて二重の反応で実施した。
リアルタイムＰＣＲ反応を、標準的なプロトコルを使用してＬＣ４８０ＩＩリアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で実施した。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＰＡＴ ｖ５、ＦＡＭ標識されたアッセイについてのデータを、５３３ｎｍの発光フィルターおよび４８３ｎｍの励起シグナルを使用して収集した。ＧＭＳ１１６ Ｃｙ５標識された参照アッセイについてのデータを、６６０ｎｍのフィルターおよび６１８ｎｍの励起シグナルを使用して収集した。クロッシングポイント値（Ｃｐ値）および標的対参照比を、ＬＣ４８０ＩＩソフトウェアの「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」分析ワークフローを使用して自動的に計算した。各サンプルについての標的対参照比を、標準的な「ΔΔＣｔ」法を使用して計算した。サンプルの標的−参照比を、ダイズ内部参照ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９の標的−参照比を用いて標準化することによって、概算コピー数を決定した。
ＰＡＴ ｖ５選択マーカーおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）導入遺伝子（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３）の概算コピー数を、７つのｐＤＡＢ７３６２事象由来のＴ１植物において決定した。２つの事象７３６２［７１０］−７１００６および７３６２［７１０］−７１０１０由来の植物は、ＰＡＴ ｖ５選択マーカーまたはＤＨＡ遺伝子標的配列のいずれも含まなかった。残りの事象；７３６２［７１０］−７０９０３、７３６２［７１０］−７１００５、７３６２［７１０］−７１００８および７３６２［７１０］−７１００９由来の植物は、１〜１０の範囲のコピー数でＰＡＴ ｖ５選択マーカーおよび５つのＤＨＡ導入遺伝子を含んでいた。事象７３６２［７０８］−７０８０１は、単一の分離した遺伝子座を示す、０、１または２コピーのＰＡＴ ｖ５遺伝子を有するＴ１植物を生成し、事象７３６２［７１０］−７１００５は、２つの連鎖していない遺伝子座の分離を示唆する０と４との間のコピー数のＰＡＴ ｖ５を有するＴ１植物を生成した。
トランスジェニックダイズ植物のＴ１子葉の脂質分析
限定量のＴ１種子の破壊的分析を回避するために、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）分析を、Ｔ１植物の発芽後緑色子葉に対して実施した。ＦＡＭＥの精製および分析のための方法が記載されている（例えば、Nightingale, ZDら、(1999) Purification of fatty acid methyl esters by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 732(2):495-500；およびW.W Christieによる「Gas chromatography and lipids: a practical guide」, 1989, The Oily Press）。Ｔ１子葉中の油プロファイルの特徴付けは、乾燥Ｔ１種子中の油プロファイルを示す（Wilson, RF およびKwanyuen, P., (1986) Triacylglycerol synthesis and metabolism in germinating soybean cotyledons, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 877(2):231-237）。
実施例５．１：トランスジェニックキャノーラの分析を介したＴ１子葉中のＤＨＡの発芽後検出の検証
発芽後緑色子葉中の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の検証および検出を、ＤＨＡ産生キャノーラ種子を用いて実施して、Ｔ１子葉中の油プロファイルの特徴付けが成熟Ｔ１種子内の油プロファイルの存在を示すかどうかを評価した。バイナリープラスミドｐＤＡＢ７３６２を保有するトランスジェニックキャノーラ種子を、水で飽和させたペーパータオル上で室温で発芽させ、３日後に収集し、この時点で、組織を凍結乾燥させた。この組織を直接メチル基転移したが、ヘキサンでの事前抽出はしなかった。ＬＣ−ＰＵＦＡ含量（重量での％ＦＡＭＥ）を計算し、成熟種子と比較した。３０のキャノーラの現れた子葉からの平均ＤＨＡ含量は０．７１％（総ＬＣ−ＰＵＦＡ＝０．９７％）であり、油含量は５３．０％であった。発芽前の４８の成熟キャノーラ種子の平均ＤＨＡ含量は０．４９％（総ＬＣ−ＰＵＦＡ＝０．７３％）であり、油含量は４４．３％であった。この研究により、ＬＣ−ＰＵＦＡが、発芽した緑色子葉において発芽後に検出され得ること、発芽した緑色子葉におけるＬＣ−ＰＵＦＡの検出が、ＬＣ−ＰＵＦＡが種子中に存在することを示すことが実証されている。
実施例５．２：Ｔ１ダイズ子葉におけるＤＨＡの発芽後検出
ＦＡＭＥ分析を、定植の３〜５日後にサンプリングしたダイズ実生当たり１つの切り取った緑色子葉に対して実施した。植物材料を凍結乾燥させ、鋼鉄のボールおよびボールミルを使用してホモジナイズし、ヘキサンで３回脱脂した。プールしたヘキサン画分を蒸発させ、乾燥残渣を計量し、ヘプタン中で再構成した。既知量の油残渣を、代用品トリヘプタデカノイン（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）の存在下でメタノール中０．２５Ｍの新たに調製したナトリウムメトキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてメチル基転移させた。この反応を、穏やかな加熱下（４０℃）で一定に震盪しながら実施し、得られたＦＡＭＥをヘプタンで抽出した。反応の完了を、反応したヘプタデカン酸メチルエステル代用品の回収によって確認した。ＦＡＭＥ抽出物を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＳＧＥ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）の１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ ＢＰＸ ７０キャピラリーカラムを使用したＧＣ−ＦＩＤによって分析した。各ＦＡＭＥピークをその保持時間によって同定し、Ｍａｔｒｅｙａ ＬＬＣ（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、ＰＡ）のナタネ油参照ミックスの注入によって定量した。較正標準は、Ｎｕ−ＣｈｅｋのＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）メチルエステルの個々に添加された標準を含んでいた。データ分析を、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ４ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。２つの事象由来のＴ１子葉は、ＤＨＡを含んでいた；ｐＤＡＢ７３６２［７０８］−７０８０１．００１およびｐＤＡＢ７３６２［７１０］−７１００５．００１（表９）。
事象ｐＤＡＢ７３６２［７０８］−７０８０１．００１由来の４０の種子を発芽させ、切り取った緑色子葉中のＬＣ−ＰＵＦＡの存在についてスクリーニングした。４０の種子のうち６つに由来する子葉が、０．７８％〜１．５８％の範囲（平均１．１２％）でＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた。ＤＨＡ含量は０．４８％〜０．９３％の範囲（平均０．６８％）であり、ＤＰＡ（ｎ−６）含量は０．３％〜０．６５％の範囲（平均０．４４％）であった。
事象ｐＤＡＢ７３６２［７１０］−７１００５．００１由来の３９の種子を発芽させ、切り取った緑色子葉中のＬＣ−ＰＵＦＡの存在についてスクリーニングした。３９の種子のうち３７に由来する子葉が、０．７０％〜１１．９８％の範囲（平均３．９１％）でＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた。総ＬＣ−ＰＵＦＡのうち、ＤＨＡ含量は０．３６％〜８．００％の範囲（平均２．２４％）であり、ＤＰＡ（ｎ−６）含量は０．３４％〜３．９８％の範囲（平均１．６８％）であった。
ＬＣ−ＰＵＦＡの同定を、Ｐｅｇａｓｕｓ ＩＩＩ ＧＣ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｌｅｃｏ、Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ、ＭＩ）を使用して、陰性対照と比較して標準ＰＵＦＡメチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ、ＭＮ）の特異的フラグメント化を評価することによって確認した。
トランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ２種子の脂質分析
２つの事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［７１０］−７１００５．００１由来のＴ１植物を、温室中で成熟するまで成長させた。Ｔ１子葉中に高いレベルのＬＣ−ＰＵＦＡ、および１または２コピーのＰＡＴ ｖ５、およびＤＨＡ生成のための付随する５つの遺伝子を含む植物を選択した。これらの植物を自家受精させ、得られたＴ２種子を成熟の時点で収集した。単一の種子をＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤで分析して、このＴ２ダイズ種子中のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量を決定した。植物当たり１２個の成熟種子全体を、圧力によって種子を粉砕し、鋼鉄のボールおよびボールミルを使用してホモジナイズすることによって、個々に分析した。組織をヘキサンで３回脱脂し、プールしたヘキサン画分を乾燥するまで蒸発させ、残渣を計量し、上の実施例で記載したようにＦＡＭＥ分析を実施するために、ヘプタン中に再構成した。
単一コピーのＰＡＴ ｖ５を保有する事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１のＴ１植物（図１２中で７３６２［７０８］−７０８０１．Ｓｘ．０２１と記載される）由来の単一のＴ２種子は、０％〜０．７３％のＤＨＡ（０％〜１．１９％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含んでいた。単一コピーのＰＡＴ ｖ５を保有する事象７３６２［７１０］−７１００５．００１の２つのＴ１植物（図１２中で７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．００６および７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０．３５と記載される）由来の単一のＴ２種子は、０％〜２．０８％のＤＨＡ（０％〜３．５６％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含んでいた。２コピーのＰＡＴ ｖ５を含有する事象７３６２［７１０］−７１００５．００１由来の７つのＴ１植物（図１２中で７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１０、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１２、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１３、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１６、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０１８、７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０２５および７３６２［７１０］−７１００５ Ｓｘ．０３１と記載される）由来の単一のＴ２種子は、０％〜２．８４％のＤＨＡ（０％〜４．７７％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含んでいた。最も高いＤＨＡ生成系統（７３６２［７１０］−７１００５．Ｓｘ．０２５）由来のＴ２種子の平均ＤＨＡ含量は、１．８３％（３．１１％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）であった。個々のＴ１植物由来の各Ｔ２種子のＤＨＡ含量は図１２に示される。
ＤＨＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡを含むこれらのＴ２種子中の総ＬＣ−ＰＵＦＡ含量の６０％を構成していた。２つの新規ＬＣ−ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）だけが、Ｔ２ダイズ種子において検出された。ダイズ種子中に見出されると予測される脂肪酸は正常レベルで検出されたが、総Ｃ１８脂肪酸は、ＬＣ−ＰＵＦＡの存在に起因して、比例してより低かった。ＤＨＡおよびＤＰＡ（ｎ−６）以外の他の異なる脂肪酸は、これらのトランスジェニックダイズ種子においては検出されなかった。トランスジェニック種子の油含量（個々のＦＡＭＥの質量の合計を、種子質量によって除算する）およびトランスジェニックＴ１系統によって生成される種子の数は、同じ条件下で同時に温室中で成長させた非トランスジェニックＷｉｌｌｉａｍｓ８２対照栽培品種のものと有意には異ならなかった。
ダイズ事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［７１０］−７１００５．００１由来の個々のＴ２種子の完全ＦＡＭＥプロファイルを表１０に示す。
実施例６．１：２つのトランスジェニックダイズ事象由来の成熟Ｔ３種子の脂質分析
２つのＴ２ダイズ植物事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１および７３６２［７１０］−７１００５．００１を、温室中で成熟するまで成長させた。各事象の複数の植物を温室中で成長させ、スクリーニングして、Ｔ２子葉中で高レベルのＬＣ−ＰＵＦＡを生成し、導入遺伝子の単一のホモ接合性挿入物を含む個々の植物を同定した。同定された植物を自家受精させ、得られたＴ３種子を、種子が成熟に達した時点で収集した。単一の成熟Ｔ３種子をＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤで分析して、このＴ３ダイズ種子中のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡ含量を決定した（図１２ａ）。植物当たり１２個の成熟種子全体を、圧力によって種子を粉砕し、粉砕された種子材料を鋼鉄のボールおよびボールミルを使用してホモジナイズすることによって、個々に分析した。組織をヘキサンで３回脱脂し、プールしたヘキサン画分を乾燥するまで蒸発させ、残渣を計量し、上の実施例で記載したようにＦＡＭＥ分析を実施するために、ヘプタン中に再構成した。ＤＨＡレベルをＴ３種子から決定し、以前にアッセイしたＴ２のＤＨＡレベルと比較した（表１１）。
表１１に示すように、ダイズ種子中のＤＨＡの相対的百分率は、ダイズの後続の世代において、一定のままであるか、または増加していた（Ｔ２およびＴ３から）。事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１（この系統は、分子的に特徴付けられ、ＰＡＴの単一のヘミ接合性コピーを保有することが見出されたものである）のＴ２植物の自家受精から生成された単一のＴ３種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜０．９３％のＤＨＡ（０％〜１．３７％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含むことを決定した。比較として、事象７３６２［７０８］−７０８０１．００１から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜０．７３％のＤＨＡを含むことを決定した。Ｔ２植物事象７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−３５（この系統は、分子的に特徴付けられ、ＰＡＴの単一のヘミ接合性コピーを保有することが見出されたものである）の自家受精由来の単一のＴ３種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜３．１０％のＤＨＡ（０％〜５．４５％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含むことを決定した。比較として、事象７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−３５から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０％〜２．８４％のＤＨＡを含むことを決定した。さらに、事象７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１３、７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１８および７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−２５（各事象は、ＰＡＴの単一のホモ接合性コピーを含むと決定されたものである）から生成された単一のＴ３種子は、０．７９％〜４．２４％のＤＨＡ（１．２６％〜６．５％の総ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含んでいた。比較として、事象７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１３、７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−１８および７３６２［７１０］−７１００５．００１−１−２５から生成されたＴ２種子をＦＡＭＥ分析でアッセイし、種子が、０．７９％〜２．８４％のＤＨＡを含むことを決定した。これらのトランスジェニック事象を対照植物と比較したところ、植物当たりの収量（種子の数）および総油含量（％）が、トランスジェニック系統と同様の条件において、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２対照と類似していることが見出された。
試験した全ての系統について、Ｔ２世代およびＴ３世代についてダイズ種子において生成および測定されたＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡの百分率は、Ｔ２世代からＴ３世代まで、レベルにおいて一貫していたまたは増加していた。これらの結果は、この形質が遺伝すること、およびこの形質のさらなる世代への伝達が、減少したＤＨＡ生成を生じないことを示している。
トランスジェニックダイズ種子におけるＰＵＦＡシンターゼタンパク質のウエスタンブロット検出
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３遺伝子によりコードされる）、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ（ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３遺伝子によりコードされる）、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ（ｈＴｈＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３遺伝子によりコードされる）およびＨｅｔＩ（ノストック属の種（Nostoc sp.）ＰＣＣ ７１２０、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｐ３７６９５、ＧＩ：２０１４１３６７由来）を、ウエスタンブロット分析によって成熟トランスジェニック種子サンプルにおいて検出した。残余のダイズＴ２種子ケイクサンプルを、ＦＡＭＥ分析のためのヘキサン抽出後に保持した。粉末化種子ケイクを、単一の４．５ｍｍステンレス鋼ボールを有するチューブ中に配置し、抽出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）を添加した。サンプルチューブを、３０分間穏やかに揺らし、３，０００ｒｃｆで１５分間遠心分離し、上清を分析に使用した。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量を、６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。サンプルを、１．２５ｍｇ／ｍｌの総可溶性タンパク質に対して標準化し、１レーン当たり１６．２５μｇの総可溶性タンパク質の標準化されたロードのために、５０ｍＭ ＤＴＴを含むＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で調製した。サンプルを、３％〜８％のＴｒｉｓ−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において電気泳動し、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣの検出のためにニトロセルロースメンブレンに移した。サンプルを、４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において電気泳動し、ＨｅｔＩの検出のためにニトロセルロースメンブレンに移した。
ブロットを、ブロッキング緩衝液中でインキュベートし、次いで、異なるＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣおよびＨｅｔＩポリペプチドに対する抗体でプロ−ビングした。シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ（ＳｚＰＵＦＳ−Ａ）のＡ２領域に対するウサギ抗Ａ２−Ａ、シゾキトリウム（Schizochytrium）ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ（ＳｚＰＵＦＳ−Ｂ）のＢ３領域に対するウサギ抗Ｂ３−Ａ、および全長ＨｅｔＩポリペプチドに対するウサギ抗ＨｅｔＩを使用した。領域Ｂ３は、ＯｒｆＢのエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインを含む。ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ中にも相同なＥＲドメインが存在するので、この抗血清は、ウエスタンブロット上のＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣの両方を認識する。抗ウサギ蛍光標識二次抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＡＦ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））を検出のために使用した。ブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ蛍光画像機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＮＪ）で可視化した。
事象７３６２［７０８］−７０８０１および７３６２［７１０］−７１００５由来の成熟Ｔ２種子由来のタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットにより、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣおよびＨｅｔＩ特異的抗血清でプロ−ビングした場合に、適切なサイズにおけるバンドが示された（図１３）。ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢおよびＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣのバンドは、クマシーブルーによる直接的染色によっても見ることができる。
代替的プロモーターを使用した、藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートの発現
ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩタンパク質をコードする遺伝子（複数可）を発現するためのさらなる転写調節エレメントの使用は、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量をさらに増加させ得る。トリアシルグリセロールの生合成および堆積の間に、ならびに延長された期間にわたり、発生において初期に発現する転写調節エレメントの同定および使用は、種子発生の初期段階（例えば、１５〜２５ＤＡＰにおける）においてＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ生合成遺伝子の転写を促進し、従ってＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡの生成の期間を延長させることによって、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡのレベルを増加させ得る。かかる転写調節領域の例には、レスケレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）ＫＣＳ（ＬｆＫＣＳ３）プロモーター（米国特許第７，２５３，３３７号）およびＦＡＥ１プロモーター（米国特許第６，７８４，３４２号）およびブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）アシルキャリアタンパク質（ＢｏＡＣＰ）プロモーター（国際公開公報ＷＯ１９９２／１８６３４）が含まれるがこれらに限定されない。さらに、他の種子特異的プロモーター、例えば、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）由来のファゼオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）が、ダイズ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡのレベルを増加させるために、種子発生の間に延長した期間にわたり異種遺伝子の発現を確実に駆動するために使用され得る。最後に、強い構成的プロモーター、例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２）は、発生の全ての段階を通じて異種遺伝子の発現を駆動し、それによってダイズ種子および他の植物組織内のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡのレベルを増加させるために使用され得る。
これらのプロモーターは、プラスミドｐＤＡＢ７３６２において以前に記載されたＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼキメラＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ発現カセットの発現を駆動するために、単独でまたは組み合わせて使用される。プラスミド内の転写調節領域を置き換えるための方法は、当該分野で周知である。このように、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２を含むポリヌクレオチドフラグメントをｐＤＡＢ７３６２（またはｐＤＡＢ７３６２を構築するために使用した上述のプラスミド）から除去し、新たなプロモーター領域で置き換える。新たに構築されたプラスミドを使用して、ダイズ植物を安定に形質転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。得られたＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を、本明細書中に記載される方法を使用して脂質プロファイル（ＦＡＭＥ）を分析することによって決定し、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％のＤＨＡ、総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ−６）、または総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＥＰＡを生成するダイズ植物を同定する。
種子発生において初期に発現するプロモーターの使用
実施例８．１：ｐＤＡＢ９１６６の構築
ｐＤＡＢ９１６６プラスミド（図１４；配列番号４０）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１６６は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１６１、ｐＤＡＢ９１６２、ｐＤＡＢ９１６３、ｐＤＡＢ１０１４８４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１６６を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．２：ｐＤＡＢ９１６７の構築
ｐＤＡＢ９１６７プラスミド（図１５；配列番号４１）は、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１６７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ ５’ＵＴＲ ｖ１、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＬｆＫＣＳ３プロモーターｖ１、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーターｖ１、ＢｏＡＣＰ ５’ＵＴＲ ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１６１、ｐＤＡＢ９１６５、ｐＤＡＢ９１６３、ｐＤＡＢ１０１４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１６７を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
ファゼオリンプロモーターを含むプラスミド
実施例８．３：ｐＤＡＢ７３７９の構築
ｐＤＡＢ７３７９は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＡＣＳ−２遺伝子配列はこの構築物中には含まれない。ｐＤＡＢ７３７９プラスミド（図１６；配列番号４２）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ７３７９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７１、ｐＤＡＢ７３７２、ｐＤＡＢ７３７３、ｐＤＡＢ７３７４およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３７９を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．４：ｐＤＡＢ７３８０の構築
ｐＤＡＢ７３８０は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＡＣＳ−２遺伝子配列はこの構築物中には含まれない。この構築物において使用されるファゼオリンプロモーターのバージョンを、Bustosら、1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載されるように本質的に改変したが、このとき、プロモーターの５’部分を短縮させ、ファゼオリンの５’非翻訳領域をインタクトなままにした。ｐＤＡＢ７３８０プラスミド（図１７；配列番号４３）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ７３８０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３７７、ｐＤＡＢ７３７８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７３８０を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．５：ｐＤＡＢ９３２３の構築
ｐＤＡＢ９３２３は、ネイティブのコドン最適化されていないバージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ９３２３プラスミド（図１８；配列番号４４）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３２３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ２遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３０７、ｐＤＡＢ９３１１、ｐＤＡＢ９３１５、ｐＤＡＢ９３２２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３２３を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ２、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ２、ＮｏＨｅｔＩ ｖ２である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．６：ｐＤＡＢ９３３０の構築
ｐＤＡＢ９３３０は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ９３３０プラスミド（図１９；配列番号４５）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３３０は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ９３２５、ｐＤＡＢ９３２６、ｐＤＡＢ９３２９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３０を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．７：ｐＤＡＢ９３３７の構築
ｐＤＡＢ９３３７は、ファゼオリンプロモーターによって駆動される、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩ発現を含むように構築されたバイナリープラスミドである。ｐＤＡＢ９３３７プラスミド（図２０；配列番号４６）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３３７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ９３２５、ｐＤＡＢ９３２６、ｐＤＡＢ９３２８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３７を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．８：ｐＤＡＢ９３３８の構築
ｐＤＡＢ９３３８は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡの発現を駆動するためにファゼオリンプロモーターを使用し、他の導入遺伝子を駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用する。ｐＤＡＢ９３３８プラスミド（図２１；配列番号４７）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ９３３８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３８を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．９：ｐＤＡＢ９３４４の構築
ｐＤＡＢ９３４４は、コード配列のアミノ末端に融合されたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小鎖１Ａ（ＳＳＵ−ＴＰ ｖ１と標識される）をその全てが含む、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣおよびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡの発現を駆動するためにファゼオリンプロモーターを使用し、他の導入遺伝子を駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用する。
ｐＤＡＢ９３４４プラスミド（図２２；配列番号４８）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３４４は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３４３、ｐＤＡＢ９３４２、ｐＤＡＢ９３４０、ｐＤＡＢ９３３１およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３４４を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ４、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ４、ＮｏＨｅｔＩ ｖ４である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、６つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．１０：ｐＤＡＢ９３９６の構築
ｐＤＡＢ９３９６は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡおよびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢの発現を駆動するためにファゼオリンプロモーターを使用する。他の導入遺伝子；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅｔＩを駆動するためにＰｖＤｌｅｃ２プロモーターを使用する。
ｐＤＡＢ９３９６プラスミド（図２３；配列番号４９）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９３９６は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３９およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９３３８を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例８．１１：ｐＤＡＢ１０１４１２の構築
ｐＤＡＢ１０１４１２は、コドン最適化された再構築バージョンのＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ、ＳｚＡＣＳ−２およびＮｏＨｅｔＩを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物において使用されるファゼオリンプロモーターのバージョンを、Bustosら、1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載されるように本質的に改変したが、このとき、プロモーターの５’部分を短縮させ、ファゼオリンの５’非翻訳領域をインタクトなままにした。短縮型ファゼオリンプロモーター配列は、本出願を通じてバージョン４（ｖ４）、バージョン５（ｖ５）およびバージョン６（ｖ６）と特定される。ｐＤＡＢ１０１４１２プラスミド（図２４；配列番号５０）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。
ｐＤＡＢ１０１４１２は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＡＣＳ−２ ｖ３遺伝子およびＡｔｕＯＲＦ２３ ５’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３７７、ｐＤＡＢ７３９８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４１２を形成した。具体的には、上記５つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＡＣＳ-２ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて６つのＰＴＵの組込みについて試験した。
種子発生において初期に発現するプロモーターを用いたダイズ形質転換
これらのプラスミドを使用して、上記のプロトコルを使用してダイズ植物を安定に形質転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。代替的構築物の使用は、より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られたＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
代替的構築物設計を使用した藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートの発現
調節エレメントの重複を低減させるためにプロモーター多様性を導入する
遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックダイズ事象の後代世代において観察されている現象である。Waterhouseら、2001 (Nature 411:834-842)、VaucheretおよびFagard, 2001 (Trends in Genetics 17(l):29-35、ならびにOkamotoおよびHirochika, 2001 (Trends in Plant Sci. 6 (11): 527-534)などのいくつかの総説論文が、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）および転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を考察している。植物において、遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックポリヌクレオチド配列の重複（縦列反復導入遺伝子配列、逆方向反復導入遺伝子配列、または染色体中への複数の挿入）によって、または標的遺伝子配列に対して相同な配列が感染性植物ウイルス、もしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴ−ＤＮＡのいずれかによって保有される場合に、誘発され得る。
さらに、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列の重複は、構築物の不安定性の誘発因子として作用し得る。高いレベルの配列類似性を共有する複数の導入遺伝子配列は、互いに折り返すことができる。再編成は相同組換えを介して生じ得、このときＤＮＡの介在配列が切り出される。結果として、反復された導入遺伝子ポリヌクレオチド配列間に位置するＤＮＡのフラグメントが切り出される。
プラスミドベクターを設計する際の１つの戦略は、各導入遺伝子の高レベルの発現を維持する複数の独自の種子特異的プロモーターを組み込むことによって、構築物にプロモーター多様性を導入することである。プラスミドベクターにプロモーター配列多様性を導入することは、遺伝子サイレンシングを低減させ、プラスミド安定性を改善することができる。複数の種子特異的プロモーターには、ＰｖＤｌｅｃ２、ファゼオリンおよびＮａｐｉｎが含まれる（米国特許第５，６０８，１５２号）。これらのプロモーターは、例えば組織特異性、発現のレベル、発現の持続時間などのプロモーター活性において、比較的匹敵する。
実施例９．１：ｐＤＡＢ７７３３の構築
ｐＤＡＢ７７３３プラスミド（図２５；配列番号５１）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７７３３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３７５、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３７８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７７３３を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．２：ｐＤＡＢ７７３４の構築
ｐＤＡＢ７７３４バイナリープラスミド（図２６；配列番号５２）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ７７３４は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７７３２、ｐＤＡＢ７３３８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ７７３４を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．３：ｐＤＡＢ１０１４９３の構築
ｐＤＡＢ１０１４９３バイナリープラスミド（図２７；配列番号５３）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０１４９３は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３７６、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３７８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０１４９３を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．４：ｐＤＡＢ１０９５０７の構築
ｐＤＡＢ１０９５０７プラスミド（図２８；配列番号５４）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーター／５’ＵＴＲ ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０７を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．５：ｐＤＡＢ１０９５０８の構築
ｐＤＡＢ１０９５０８プラスミド（図２９；配列番号５５）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＢｎａＮａｐｉｎＣプロモーターｖ１、ＢｎａＮａｐｉｎＣ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＢｎａＮａｐｉｎＣ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９３２４、ｐＤＡＢ７７３１、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０８を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．６：ｐＤＡＢ１０９５０９の構築
ｐＤＡＢ１０９５０９プラスミド（図３０；配列番号５６）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０９５０９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＢｏＡＣＰプロモーター／５’ＵＴＲ ｖ１、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯｒｆ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ１０１４８５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０９５０９を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
長い遺伝子配列のフラグメント化を低減するための、バイナリー構築物ＰＴＵの順序の再編成
ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵを、バイナリー構築物の３’末端に配置して、ＰＴＵカセットの順序が単離されたトランスジェニック事象においてフラグメント化および再編成を低減させ得るかどうかを試験した。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡは、９つの縦列アシルキャリアタンパク質反復を含む大きいオープンリーディングフレーム（約８，７００塩基対）である。完成した構築物の第１シリーズにおいて、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵを、植物染色体中に最初に組み込まれるように位置付けた。分子サイズが減少するので、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵには、残りのＰＵＦＡ合成関連遺伝子ＰＴＵを後に続けた。ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡコード領域の分子分析により、いくつかのトランスジェニックキャノーラおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）事象がフラグメント化された挿入物を含むことが示された。ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵの順序が、以下の立体配置；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ＰＴＵ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ＰＴＵ、ＮｏＨｅｔＩ ＰＴＵ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵおよびＰＡＴ ＰＴＵへと変化した、代替的構築物設計が記載される。単離されたトランスジェニック事象におけるフラグメント化および再編成を低減させるために、バイナリー構築物上のＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ＰＴＵの位置を変化させることを完了させる。
実施例９．７：ｐＤＡＢ９１５１の構築
ｐＤＡＢ９１５１プラスミド（図３１；配列番号５７）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１５１は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。最後のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１４８、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ９１４９、ｐＤＡＢ９１５０およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１５１を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
構築物多様性を導入するためにバイナリー構築物ＰＴＵの転写方向を変化させる
代替的構築物設計は、ＰＵＦＡシンターゼＰＴＵの順序および遺伝子発現カセットの転写方向を変化させることを含む。完成した構築物の第１シリーズにおいて、各遺伝子発現カセットを同じ方向で位置付けた（「ヘッドトゥーテール」、このとき、１つの遺伝子発現カセットのプロモーターは、第２の遺伝子発現カセットの３’ＵＴＲに隣接して位置する）。以下の構築物は、遺伝子発現カセットが異なる方向で位置付けられる、代替的プロモーターを利用する戦略を記載している。これらの例において、両方の遺伝子発現カセットのプロモーターが互いに隣接して操作されるように、遺伝子発現カセットは、第２の遺伝子発現カセットに対してｔｒａｎｓに位置する。この立体配置は、「ヘッドトゥーヘッド」立体配置と記載される。両方の遺伝子発現カセットの３’ＵＴＲが互いに隣接して操作されるように、１つの遺伝子発現カセットが第２の遺伝子発現カセットに対してｔｒａｎｓに位置する例において、他の立体配置が記載される。この立体配置は「テールトゥーテール」立体配置と記載される。かかる設計の潜在的なリードスルーを軽減するために、二方向Ｏｒｆ２３／２４ターミネーターが、これら２つのＰＴＵ間に配置されている。これらの立体配置は、導入遺伝子の発現を増加させることにより、ＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ脂肪酸のより高い濃度および含量を生じるために、提唱される。
実施例９．８：ｐＤＡＢ１０８２０７の構築
ｐＤＡＢ１０８２０７プラスミド（図３２；配列番号５８）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）ならびにＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ１０１４８９、ｐＤＡＢ１０８２０５、ｐＤＡＢ１０８２０６およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０７を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、テールトゥーテール方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．９：ｐＤＡＢ１０８２０８の構築
ｐＤＡＢ１０８２０８プラスミド（図３３；配列番号５９）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）ならびにＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０１４９０、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０８を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１０：ｐＤＡＢ１０８２０９の構築
ｐＤＡＢ１０８２０９プラスミド（図３４；配列番号６０）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲおよびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）ならびにランダムＤＮＡスペーサーを含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０８２０４、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０９を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
転写干渉を最小化するために、３’ＵＴＲを倍化し、スペーサーＤＮＡを含める。
複数の遺伝子が一続きでスタックすることによって、下流の遺伝子の発現低減が生じる場合に、転写干渉が生じ得る。この現象は、次のプロモーター−転写単位への３’ＵＴＲおよびターミネーターの転写リードスルーから生じる。転写干渉および転写干渉を最小化するための２つの戦略からなる代替的構築物設計を記載する。第１の戦略は、次の遺伝子発現カセットへのリードスルーを制限するために、個々のＤＨＡ遺伝子発現カセット間にスタックされた２つのターミネーター／３’ＵＴＲの使用を配備する。第２の戦略は、遺伝子発現カセット間に約１０００塩基対のスペーサーＤＮＡを挿入することによって、転写干渉を最小化する。
実施例９．１１：ｐＤＡＢ１０８２０７の構築
ｐＤＡＢ１０８２０７プラスミド（図３２；配列番号５８）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ６、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ ｖ１およびＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）を含む。
プラスミドｐＤＡＢ７３３４、ｐＤＡＢ１０１４８９、ｐＤＡＢ１０８２０５、ｐＤＡＢ１０８２０６およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０７を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを２つのＰＴＵ間に配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢをヘッドトゥーテール方向で配置し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを２つのＰＴＵ間に配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１２：ｐＤＡＢ１０８２０８の構築
ｐＤＡＢ１０８２０８プラスミド（図３３；配列番号５９）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０８は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシル−ＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０１４９０、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０８を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し、ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲを、２つのＰＴＵ間に配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１３：ｐＤＡＢ１０８２０９の構築
ｐＤＡＢ１０８２０９プラスミド（図３４；配列番号６０）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２０９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのアシルＣｏＡシンテターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ５、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ＰｖＰｈａｓ ３’ＵＴＲ、ＰｖＰｈａｓ ３’ＭＡＲ ｖ２（プラスミドマップ上にアノテートされていない）およびランダムＤＮＡスペーサーを含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２００、ｐＤＡＢ１０８２０４、ｐＤＡＢ１０８２０１、ｐＤＡＢ１０８２０２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２０９を形成した。具体的には、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３をヘッドトゥーヘッド方向で配置し；ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３をテールトゥーテール方向で配置し、１０００塩基対のスペーサーを２つのＰＴＵ間に配置し；ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢを、ヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
転写リードスルーを制限するための代替的３’ＵＴＲ−ターミネーターの使用
アグロバクテリウム（Agrobacterium）ＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ−ターミネーターは、上記構築物の多くにおいて転写を終結させるために第一に使用される。ＺｍＬｉｐａｓｅ ３’ＵＴＲ−ターミネーターは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において転写リードスルーを終結させる際により有効であることが最近示された。このように、１つのバージョンの構築物は、この３’ＵＴＲが上流遺伝子の転写リードスルーを低減することによって転写干渉を低減できるかどうかを試験するために、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターと組み合わせてＺｍＬｉｐａｓｅ ３’ＵＴＲ−ターミネーターを利用する。
実施例９．１４：ｐＤＡＢ９１５９の構築
ｐＤＡＢ９１５９プラスミド（図３５；配列番号６１）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１５９は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ３、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１５２、ｐＤＡＢ９１５３、ｐＤＡＢ９１５４、ｐＤＡＢ９１５５およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１５９を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１５：ｐＤＡＢ９１４７の構築
ｐＤＡＢ９１４７プラスミド（図３６；配列番号６２）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ９１４７は、３つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、Ａｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１およびＺｍＬｉｐ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第３のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ９１４６、ｐＤＡＢ７３３５、ｐＤＡＢ７３３６、ｐＤＡＢ７３３８およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ９１４７を形成した。具体的には、上記４つのＰＴＵを、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーテールの方向で配置した。遺伝子の順序は：ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて５つのＰＴＵの組込みについて試験した。
２つの別個のＴ−ＤＮＡ上でのＤＨＡ遺伝子の送達
代替的構築物設計は、２つの別個のバイナリーベクターを構築することからなり、第１のベクターは１つのＴ−ＤＮＡ上にＰＵＦＡシンターゼ遺伝子のサブセットを含み、第２のバイナリーベクターは、第２のＴ−ＤＮＡ上に残りのＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を含む。これらのバイナリーベクターは、性的に交雑される植物を形質転換するために個々に使用され、それによって全てのＰＵＦＡシンターゼ遺伝子発現構築物を含む後代を生じる。トランスジェニック植物を生成するための代替的方法は、ダイズ組織中に両方のバイナリーベクターを同時形質転換し、両方のＴ鎖を含む単一の植物を選択またはスクリーニングすることである。
実施例９．１６：ｐＤＡＢ１０８２２４の構築
ｐＤＡＢ１０８２２４プラスミド（図３７；配列番号６３）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２２４は、１つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵ、１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＰｖＰｈａｓ ５’ＵＴＲ、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２１６、ｐＤＡＢ１０８２２１およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２２４を形成した。具体的には、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３およびＮｏＨｅｔＩ ｖ３を、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＡ ｖ３、ＮｏＨｅｔＩ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて３つのＰＴＵの組込みについて試験した。
実施例９．１７：ｐＤＡＢ１０８２２５の構築
ｐＤＡＢ１０８２２５プラスミド（図３８；配列番号６４）を、マルチサイトＧａｔｅｗａｙ Ｌ−Ｒ組換え反応を使用して構築した。ｐＤＡＢ１０８２２５は、２つのＰＵＦＡシンターゼＰＴＵおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵを含む。具体的には、第１のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＤｌｅｃ２プロモーターｖ２、２Ｓ ５’ＵＴＲ、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔ２Ｓ ＳＳＰターミネーターｖ１を含む。第２のＰＵＦＡシンターゼＰＴＵは、ＰｖＰｈａｓプロモーターｖ４、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１を含む。
プラスミドｐＤＡＢ１０８２１７、ｐＤＡＢ１０８２２２およびｐＤＡＢ７３３３を組換えて、ｐＤＡＢ１０８２２５を形成した。具体的には、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３およびｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３を、植物形質転換バイナリーｐＤＡＢ７３３３のＴ鎖ＤＮＡボーダー領域内にヘッドトゥーヘッド方向で配置する。遺伝子の順序は、ＳｚＰＵＦＡ ＯｒｆＢ ｖ３、ｈＳｚＴｈＰＵＦＡ ＯｒｆＣ ｖ３である。ｐＤＡＢ７３３３は、ＯｖｅｒｄｒｉｖｅおよびＴ鎖ボーダー配列（Ｔ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ ＡおよびＴ−ＤＮＡ Ｂｏｒｄｅｒ Ｂ）などの他の調節エレメントに加えて、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼＰＴＵ：ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、ＰＡＴ ｖ５、ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ４もまた含む。次いで、５つのＰＴＵを含む組換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定を用いて３つのＰＴＵの組込みについて試験した。
代替的設計を含む構築物によるダイズ形質転換
これらのプラスミドを使用して、上記プロトコルを使用してダイズ植物を安定に形質転換する。トランスジェニックダイズ植物を単離し、分子的に特徴付ける。代替的構築物の使用は、より多い量のＤＨＡおよびＬＣ−ＰＵＦＡを含むダイズ植物を生じる。得られたＬＣ−ＰＵＦＡ蓄積を決定し、０．０１％〜１５％のＤＨＡまたは０．０１％〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡを生成するダイズ植物を同定する。
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換ならびにＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡの引き続く生成のために使用される代替的構築物設計
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物を、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ１０１４１２またはｐＤＡＢ７３８０バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株で形質転換した。CloughおよびBent (1998)に記載される花浸漬（floral dipping）形質転換プロトコルを形質転換に使用した。CloughおよびBent、「Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia」、Plant J., 16:735-743, 1998。形質転換されたシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を得、導入遺伝子の存在の分子的確認を完了した。トランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）事象由来のＴ１植物を、温室中で成熟するまで成長させた。これらの植物を自家受精させ、得られたＴ２種子を成熟の時点で収集した。Ｔ２種子（１０ｍｇ）をＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤで分析して、Ｔ２シロイヌナズナ属（Arabidopsis）種子中のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量を決定した。組織を、上述の実施例に記載されたＦＡＭＥ ＧＣ−ＦＩＤ法で分析した。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物のＴ１植物由来のＴ２種子は、０％〜０．９５％のＤＨＡおよび０％〜１．５０％の総ＬＣ−ＰＵＦＡを含んでいた。個々のＴ１植物由来のＴ２種子のＬＣ−ＰＵＦＡおよびＤＨＡ含量は図３９に示される。
ダイズ内での藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子スイートとのＤＧＡＴ２またはＡＣＣａｓｅの同時発現
ダイズ植物内の油含量を、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）または２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコードし発現するキメラＤＮＡ分子の形質転換によってさらに改変する。これらの遺伝子を、ＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２発現カセットを含むダイズ植物をＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を含むダイズ植物と交配すること；あるいはＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２およびＰＵＦＡシンターゼ遺伝子を含む遺伝子スタックでダイズ植物を形質転換することのいずれかによって、上記藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子と同時発現させる。ＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２コード配列の発現に必要な調節エレメントには、上記のものが含まれ得る。当該分野で公知のさらなる調節エレメント発現配列もまた使用され得る。ＡＣＣａｓｅおよびＤＧＡＴ２発現カセットを、上記形質転換プロトコルを使用してダイズ中に形質転換する。形質転換は、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ発現カセットと組み合わせたＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２発現カセットの分子スタックとして；あるいは選択マーカーに連結され、次いでＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＡ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＢ、ＰＵＦＡシンターゼＯｒｆＣ、アシル−ＣｏＡシンテターゼおよび４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＨｅｔＩ発現カセットを含むダイズ植物と引き続いて交雑される独立したＡＣＣａｓｅまたはＤＧＡＴ２発現カセットとして、行い得る。陽性形質転換体を単離し、分子的に特徴付ける。形質転換されていない対照ダイズ植物と比較して、植物、植物の種子または植物油濃縮物におけるＬＣ−ＰＵＦＡの増加した蓄積を含むダイズ植物を同定する。かかる増加は、１．２倍から２０倍までの範囲の増加であり得る。
細胞質におけるＡＣＣａｓｅの過剰発現は、より高いレベルのマロニル−ＣｏＡを生成し得る。増加したレベルの細胞質マロニル−ＣｏＡを含むダイズ植物または種子は、藻類ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子が存在し発現される場合、より高いレベルの長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を引き続いて生成し得る。ダイズ植物内で発現されるＤＧＡＴ２遺伝子は、トリアシルグリセロール中に顕著な量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を優先的に取り込むことが可能であり得る。ＬＣ−ＰＵＦＡに対する基質選択性を有するＤＧＡＴ２遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ２００９／０８５１６９ Ａ２を参照のこと）は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）中へのこれらの脂肪酸の取り込みを増加させ得る。かかるＤＧＡＴ遺伝子は、ＴＡＧ中へのＬＣ−ＰＵＦＡ、特にＤＨＡの取り込みを指向させるため、ならびに植物および他の生物におけるＴＡＧの生成を増加させるために有用である。
ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子の発現のための代替的構築物設計で形質転換されたシロイヌナズナ属（Arabidopsis）種子におけるＤＨＡの生成
種々の植物発現エレメントの制御下にＰＵＦＡシンターゼ遺伝子およびＨｅｔＩ（およびある場合にはＳｚＡＣＳ−２）をコードするプラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）で形質転換されたシロイヌナズナ属（Arabidopsis）Ｔ１事象を、CloughおよびBent (Plant J., 1998 16(6):735-43)に本質的に記載される花浸漬（floral dip）法を使用して生成した。得られたＴ１種子を収集し、播種した。形質転換されたＴ１植物を、ホスフィノトリシンを噴霧することによって選択して、選択マーカーとして機能的ＰＡＴ遺伝子を含む植物について選択した。生存Ｔ１植物由来の葉組織をサンプリングし、ＰＡＴ遺伝子に特異的な定量ＰＣＲ反応によって分析して、単一コピーの選択マーカー（および関連する導入遺伝子）を含む植物を同定した。これらの植物を成熟するまで成長させ、Ｔ２種子を収集し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含量について（抽出可能な総ＦＡＭＥの％として）分析した。ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子をコードする種々の構築物を用いて生成された事象由来のデータのまとめを表１２に示す。
これらのデータは、ある特定の構築物立体配置とプロモーターとの組合せが、Ｔ２種子においてより高い割合のＬＣ−ＰＵＦＡ含有事象を生成することを示している（ｐＤＡＢ１０９５０７について全ての単一コピー事象の７７％がＤＨＡを生成し、ｐＤＡＢ１０８２０７について全ての単一コピー事象の８６％がＤＨＡを生成した）。またある特定の構築物は、＞１％のＬＣ−ＰＵＦＡ含量を生成する事象をより高い割合で生成する（ｐＤＡＢ１０９５０７について全ての単一コピー事象の３３％、およびｐＤＡＢ１０８２０７について全ての単一コピー事象の３４％）。種々の事象由来のＴ２種子の最大ＬＣ−ＰＵＦＡ含量は、異なる構築物について０．２４％〜２．０３％までの範囲であった。同様に、ある特定の構築物は、より高いレベルのω−３ ＬＣ−ＰＵＦＡを生成する。生成した全ての構築物および事象にわたり、最大ＤＨＡ含量は０．１７％〜１．４５％までの範囲であり、最大ＥＰＡ含量は０％〜０．２６％までの範囲であった。これらのデータは、プロモーター立体配置が変化した構築物設計の変更により、ｐＤＡＢ７３６２で形質転換されたトランスジェニック植物と比較して増加したＬＣ−ＰＵＦＡを示すトランスジェニック植物が生じたことを示している。このように、構築物設計が変更されたこれらの構築物は、作物の形質転換に望ましい。
高ＬＣ−ＰＵＦＡ生成事象由来のＴ２種子を定植し、成長する植物由来の葉組織を、定量ＰＣＲを使用してサンプリングして、ＰＡＴ遺伝子および他の導入遺伝子をアッセイした。２コピーの導入遺伝子を含む植物（即ち、ホモ接合体）を同定し、成熟するまで成長させた。得られたＴ３種子を収集し、ＬＣ−ＰＵＦＡ含量について分析した。反復したプロモーター／３’ＵＴＲ発現エレメントを含む、ｐＤＡＢ７３６２およびｐＤＡＢ１０９５０９などのいくつかの構築物は、引き続くＴ３種子世代において安定性の乏しいＬＣ−ＰＵＦＡ形質を示した。しかし、異なる構築物立体配置および／または多様化された発現エレメント（例えば、ｐＤＡＢ１０８２０７、１０９５０８および７７３４）で形質転換されたいくつかの事象は、表１３に示すように、Ｔ３種子世代において顕著に改善された安定性のＬＣ−ＰＵＦＡ形質を生じた。これらのデータは、ある特定の構築物が引き続く世代においてＤＨＡ形質の安定性を維持し得ること、およびかかる構築物が作物の形質転換に好ましいことを示している。
本発明の上述の記載は、例示および説明を目的として提示されている。さらに、この記載は、本発明を本明細書中に開示される形態に限定する意図ではない。
本明細書中に記載される種々の態様、実施形態および選択肢の全ては、任意のおよび全てのバリエーションで組み合わされ得る。
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み込まれると示されるのと同程度まで、参照により本明細書中に組み込まれる。

Claims (73)

  1. （ｉ）少なくとも１種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成するＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸分子；および
    （ｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む核酸分子
    を含む、遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  2. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  3. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  4. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８０％同一な核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  5. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６の核酸配列を含む、請求項４に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  6. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  7. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  8. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも８０％同一な核酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  9. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号７の核酸配列を含む、請求項８に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  10. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  11. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  12. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも８０％同一な核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  13. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号８の核酸配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  14. ＰＵＦＡシンターゼが、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  15. ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列が、配列番号６〜８の核酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  16. ＰＰＴａｓｅが、配列番号５に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  17. ＰＰＴａｓｅが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  18. ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列が、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  19. ＰＰＴａｓｅをコードする核酸配列が、配列番号１０の核酸配列を含む、請求項１８に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  20. （ｉ）および（ｉｉ）の核酸配列が、単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  21. （ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、種子特異的プロモーターまたは葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  22. （ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列が、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  23. （ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列を含む核酸分子
    をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  24. ＡＣｏＡＳが、配列番号４に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  25. ＡＣｏＡＳが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  26. ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列が、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８０％同一な核酸配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  27. ＡＣｏＡＳをコードする核酸配列が、配列番号９の核酸配列を含む、請求項２６に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  28. （ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の核酸配列が、単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  29. （ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列が、種子特異的プロモーターまたは葉特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  30. （ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列が、ＰｖＤｌｅｃ２、ＬｆＫＣＳ３、ＦＡＥ１、ＢｏＡＣＰ、ＢｎａＮａｐｉｎＣ、ユビキチンまたはＣｓＶＭＶプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  31. アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）をコードする核酸配列または２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  32. ｐＤＡＢ７３６１、ｐＤＡＢ７３６２、ｐＤＡＢ７３６３、ｐＤＡＢ７３６８、ｐＤＡＢ７３６９、ｐＤＡＢ７３７０、ｐＤＡＢ１００５１８、ｐＤＡＢ１０１４７６、ｐＤＡＢ１０１４７７、ｐＤＡＢ９１６６、ｐＤＡＢ９１６７、ｐＤＡＢ７３７９、ｐＤＡＢ７３８０、ｐＤＡＢ９３２３、ｐＤＡＢ９３３０、ｐＤＡＢ９３３７、ｐＤＡＢ９３３８、ｐＤＡＢ９３４４、ｐＤＡＢ９３９６、ｐＤＡＢ１０１４１２、ｐＤＡＢ７７３３、ｐＤＡＢ７７３４、ｐＤＡＢ１０１４９３、ｐＤＡＢ１０９５０７、ｐＤＡＢ１０９５０８、ｐＤＡＢ１０９５０９、ｐＤＡＢ９１５１、ｐＤＡＢ１０８２０７、ｐＤＡＢ１０８２０８、ｐＤＡＢ１０８２０９、ｐＤＡＢ９１５９、ｐＤＡＢ９１４７、ｐＤＡＢ１０８２２４、およびｐＤＡＢ１０８２２５のうち少なくとも１つを含む、遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  33. 検出可能な量のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６，ｎ−３））、ＤＰＡ（ｎ−６）（ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６））またはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３））を含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  34. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１５％のＤＨＡを含む、請求項３３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  35. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１０％のＤＨＡを含む、請求項３４に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  36. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＤＨＡを含む、請求項３５に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  37. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＥＰＡを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  38. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡを含む、請求項３７に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  39. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１％のＥＰＡを含む、請求項３８に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  40. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１０％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  41. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項４０に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  42. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜１％のＤＰＡ（ｎ-６）を含む、請求項１から３４および３９から４７のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  43. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  44. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項４３に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  45. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  46. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項４５に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部。
  47. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部から得られた油。
  48. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部から得られた種子。
  49. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた種子を含む食物製品。
  50. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた種子を含む機能性食物。
  51. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部から得られた油、または請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部から得られた種子を含む医薬製品。
  52. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部から、または請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織もしくはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法。
  53. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を成長させる工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含む油を生成する方法。
  54. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部の種子から油を回収する工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法。
  55. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を成長させる工程を含む、種子油中の少なくとも１種のＰＵＦＡを生成する方法。
  56. 請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子もしくはそれらの一部、請求項４７に記載の油、請求項４８に記載の種子、請求項４９に記載の食物製品、請求項５０に記載の機能性食物、または請求項５１に記載の医薬製品を個体に提供する工程を含む、少なくとも１種のＰＵＦＡを含むサプリメントまたは治療用製品を個体に提供する方法。
  57. ＰＵＦＡがＤＨＡである、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. ＰＵＦＡがＥＰＡである、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. ＰＵＦＡがＤＰＡ（ｎ-６）である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  60. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉ）藻類ＰＵＦＡシンターゼをコードする配列を含む核酸分子；および（ｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む核酸分子で形質転換する工程を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織またはそれらの一部を生成する方法。
  61. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする配列を含む核酸分子で形質転換する工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜１５％のＤＨＡを含むダイズ油。
  63. 総脂肪酸の重量で０．０５％〜５％のＥＰＡをさらに含む、請求項６２に記載のダイズ油。
  64. 総脂肪酸の重量で０．０１％〜５％のＤＰＡ（ｎ-６）をさらに含む、請求項６２または６３に記載のダイズ油。
  65. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３０の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含むダイズ油。
  66. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＥＰＡ：ＤＨＡを含む、請求項６５に記載のダイズ油。
  67. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：１０の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含むダイズ油。
  68. 総脂肪酸の重量で１：１〜１：３の比率のＤＰＡ（ｎ−６）：ＤＨＡを含む、請求項６７に記載のダイズ油。
  69. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油を含む組成物。
  70. ダイズ植物または植物細胞を、（ｉ）ＰＵＦＡシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸分子；（ｉｉ）アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣｏＡＳ）をコードする核酸配列を含む核酸分子；および（ｉｉｉ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする配列を含む核酸分子を含む発現カセットで形質転換する工程を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたダイズ植物、子孫、細胞、組織、種子またはそれらの一部を生成する方法。
  71. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油、ならびに別の油を含む油ブレンド。
  72. 別の油が、植物油、魚油、微生物油またはそれらの混合物である、請求項７１に記載の油ブレンド。
  73. 請求項４７および５８から６８のいずれか一項に記載の油を含む餌または食事組成物。
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