JP2014501118A - 生物学的製剤の個別生成および体細胞を再プログラム化するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、生物学的生成物で治療される動物において、減少した抗原性レベルを有するポリペプチドタンパク質生成物および核酸生成物を生成するための方法を提供する。体細胞が動物から単離され、多能性幹細胞に形質転換され、目的の核酸（複数可）を遺伝子導入され、所望の核酸生成物の高レベルの生成元（ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）として知られる体細胞に分化される。本発明は、集団を治療するための一般細胞系、民族を治療するための人種特異的細胞系、または個人を治療するための患者特異的細胞系を誘導するために使用され得る。加えて、本発明は、細胞が奇形腫形成をもたらすことなく動物を治療的に処置するために使用され得るように、誘発した多能性幹細胞をその起始体細胞に分化させる方法を提供する。
【選択図】図１

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１１年１月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４２９，４０９号、２０１１年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／４３１，３７６号に対して優先権を主張する。前述の全出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

現在、多くの疾患を治療するために使用される多くの組み換えポリペプチドおよびタンパク質が存在する。これらの組み換えポリペプチドおよびタンパク質は全て、ヒト以外またはヒトのいずれかの一次連続２倍体細胞系を使用して商業的に製造される。例えば、一部は大腸菌等の細菌を使用して製造され、一方、他は酵母または動物由来の様々な卵巣細胞系を使用して製造される。特にグリコシル化パターンおよび他のタンパク質修飾が生物学的製剤の生物学的受容体結合親和性、生物学的活性、生体分布、もしくは薬物動態、またはレシピエント免疫認識に関して重要であるとき、細菌は一部のポリペプチドおよびタンパク質の製造に使用することができない。グリコシル化が重要な変数であるとき、現在、生物学的製剤の製造において最も一般的に使用される細胞系のうちの１つは、チャイニーズハムスターの卵巣細胞である。

残念ながら、長期間の、または慢性療法における組み換えポリペプチドまたはタンパク質の使用の必要性は、患者の生成物に対する中和抗体の発現をもたらし得、薬物に対して患者の反応を弱め得る、または反応を無くし得る。いくつかの場合において、患者は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病等の疾患を日常的に治療するために使用されるＥｎｂｒｅｌ（エタネルセプトとしても知られる）、Ｒｅｍｉｃａｉｄｅ（インフリキシマブとしても知られる）、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ、およびＨｕｍｉｒａ（Ｄ２Ｅ７としても知られる）等の様々な抗ＴＮＦ生物学的製剤等の、同類の別の薬物に切り替えることができる。しかしながら、一般に、１つの特定の抗ＴＮＦ生物学的製剤に対する中和抗体の生成は、患者が別の抗ＴＮＦ生物学的生成物に対する中和抗体を最終的に生成する素因となる。場合によっては、患者にとって代替治療がなく、そのため、この中和抗体の形成は、患者に治療選択肢を与えない。適切な治療選択肢があるときでも、同類の他の薬物に対する中和抗体を発現させる素因は、最終的に、これらの患者が治療選択肢を与えられない可能性を意味する。

ヒト抗体により中和され得る他の生物学的生成物は、ナタリズマブまたは多発性硬化症の新たな療法であるタイサブリ、および核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）に対する完全ヒトモノクローナル抗体であるデノスマブ（骨粗鬆症および化学療法による骨折の治療に承認されており、ＨＲＴおよびホルモン避妊薬によって生じる乳癌を治療するために使用される可能性がある）を含む。アバタセプト（Ａｂａｔｅｃｅｐｔ）は、抗ＴＮＦ療法に難治性となった関節リウマチ患者における使用に承認されているＣＴＬＡ−４融合タンパク質である。その使用は新しいためアバタセプトに誘発された中和抗体についての証拠がないが、ヒト抗体の中和抗体反応を誘発する可能性もある。

抗体および融合タンパク質系薬物以外の他のポリペプチドおよびタンパク質は、長期治療による免疫応答を引き起こすことも示されてきた。例えば、組み換えヒトエリスロポエチンは、その有効性を減少させ、稀な無形成症候群をもたらす可能性がある中和抗体形成を引き起こす。また、血友病の凝固因子療法に対する抗体の生成は、患者の２５〜３０％という高率にもなる。これは、凝固因子に関する一般的な問題である。癌およびＢ型肝炎の組み換えインターフェロンα２ａ療法も、治療に対する中和抗体の生成によって妨げられる。低身長の子供に関する長期成長ホルモン療法に対する不応性も問題がある。いくつかのインスリン生成物に対する中和抗体形成の報告がある。

中和抗体を引き起こす可能性がある他の生物学的薬物は、全血、血清、血漿プール、または他の一次生物学的供給源、例えばヒトアルブミン、ヒトα１−プロテイナーゼ阻害剤、ヒト抗血友病因子／フォンビルブランド因子複合体、ＢａｂｙＢｉｇ ボツリヌス症の静脈注射用免疫グロブリン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、静脈注射用免疫グロブリン、皮下注射用免疫グロブリン、タンパク質Ｃ濃縮物、静脈注射用Ｒｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン、トロンビン、フォンビルブランド因子／凝固ＶＩＩＩ因子複合体を含む。

組み換えポリペプチドおよびタンパク質は、生物学的治療の時間枠、反復療法の間隔、生物学的製剤のアミノ酸組成物、ならびにグリコシル化、メチル化、ニトロシル化、シアル化、リン酸化、硫酸化、プレニル化、セレン化（ｓｅｌｅｎａｔｉｏｎ）、ユビキチン化、ビタミン依存修飾、タンパク質結合会合、アシル化、糖化、３次元構成、および超らせん等の生物学的製剤に対する修飾を含む、複数の特徴に基づく免疫応答および中和抗体生成を引き起こす。よって、生物学的生成物で治療される動物において、減少した抗原性レベルを有するポリペプチドタンパク質生成物を生成する方法の必要性が存在する。

本明細書に引用される全ての参照文献の教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の詳細な説明

［発明を実施するための形態］
本発明は、合成により生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）または内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を遺伝子導入または形質転換することにより、ポリペプチドまたはタンパク質、核酸、ウイルス、およびワクチン等の生物学的製剤を生成するための方法を提供することによりこの必要性を満たす。これらの細胞は、治療される種に由来し、所望の生物学的製剤を発現し、遺伝子導入された、または形質転換されたｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣによる生物学的生成物の発現を誘発するベクターを遺伝子導入される。

本発明は、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を生成するための方法をさらに提供し、成体細胞からｓｐＰＳＣを生成する、または動物のｅＰＳＣを単離することと、ポリペプチドもしくはタンパク質が前述の幹細胞によって発現する条件下で、前述のｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣを、前述のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸で遺伝子導入する、または形質転換することとを含む。

本発明の代替的な実施形態では、組み換えポリペプチドまたはタンパク質を投与される個人と同じ民族の細胞から、ｓｐＰＳＣは生成され、またはｅＰＳＣは単離される。異なる民族は、異なるグリコシル化パターン、および集団ごとに異なる多型を有し得る。民族は、同じ血液型または組織型を有する集団である。よって、本発明によると、組み換えポリペプチドおよびタンパク質は、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣがポリペプチドもしくはタンパク質を投与される個人と同じ民族から単離された細胞から生成されるｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣから生成される。個人は、個人が属する民族に属する細胞から、ｓｐＰＳＣが製造される、またはｅＰＳＣが単離されるｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣから生成される組み換えポリペプチドもしくはタンパク質を投与される。

本発明は、ポリペプチドもしくはタンパク質を個々の動物に投与する方法をさらに提供し、前述の動物の前述の細胞から誘発した多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等のｓｐＰＳＣを生成する、またはｅＰＳＣを単離することと、ポリペプチドもしくはタンパク質が前述の多能性幹細胞によって発現する条件下で、前述のｓｐＰＳＣもしくはｅＰＳＣを、前述のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸で遺伝子導入する、または形質転換することと、前述のポリペプチドもしくはタンパク質を前述の誘発した多能性幹細胞から単離することと、前述の単離したポリペプチドもしくはタンパク質を前述の個人に投与することとを含む。

本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質治療薬を個別生成するための方法を提供し、それによってｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣを商業的に実現可能かつ有用なものにする。本発明は、長期もしくは慢性使用のためのポリペプチドまたはタンパク質において一般的に生じる中和抗体形成の問題を克服するために、患者特異的ポリペプチドまたはタンパク質を製造するための患者特異的ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣの作製方法に関する。患者は、あらゆる動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトであり得る。本発明は、所望の核酸またはウイルスが生成される条件下で、ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣをベクターで遺伝子導入する、または形質転換することからなる、核酸もしくはウイルスを生成するための方法も提供する。

さらに、本発明は、治療的使用のための密接に一致する翻訳後修飾された生物学的製剤を生成するために、患者特異的、および器官または細胞型特異的細胞系を誘導するための方法を提供する。患者特異的幹細胞は、ＳＣＮＴ、誘発した再プログラム化、単為生殖、またはＡＮＴ−ＯＡＲ再プログラム化法を使用して誘導されるか、またはターゲット患者から単離され得る。よって、誘導または単離された多能性幹細胞は、目的の治療薬を発現させるために、標準的な分子バイオテクノロジー手順を使用して、例えば挿入またはエピソーム発現ベクターまたは相同組み換え法を使用して遺伝的に修飾され得る。遺伝的に修飾された細胞系は、培養物中で増殖され、生成された生物学的製剤の貯蔵寿命に基づき計画されるであろう周期的な生物学的製剤の生成作業のために保存される（実施例２）。別の方法としては、誘導された患者特異的幹細胞は、培養物中で、通常最高レベルの所望の治療用タンパク質を発現する細胞型に分化され、次いで生物学的製剤の製造のために使用され得る。分化は、それぞれの生成作業に関して実行されるか、または大規模で行われ、分化された患者特異的細胞系は、生成された治療薬の貯蔵寿命に基づき、後続の生成作業のために保存される（実施例３）。

加えて、グリコシル化パターンおよび他の翻訳後修飾は、組織および細胞型によって異なることが知られているため、患者特異的幹細胞系は、器官もしくは生物学的製剤を内因的に発現する細胞型の中から単離された成体もしくは体細胞から調製され得る。例として、次いで、ＳＣＮＴ、ＰＧＡ、ＡＮＴ−ＯＡＲ、または再プログラム化技法が生物学的製剤の生成のための多能性細胞系を誘導するために適用され得る。よって、誘導または単離された多能性幹細胞は、目的の治療薬を発現させるために、標準的な分子バイオテクノロジー手順を使用して遺伝的に修飾され得る。遺伝的に修飾された細胞系は、培養物中で増殖され、生成された生物学的製剤の貯蔵寿命に基づき計画されるであろう周期的な生物学的製剤の生成作業のために保存される（実施例４を参照）。再プログラム化細胞（ｉＰＳ細胞）の「記憶」特性をさらにうまく利用して、患者および組織もしくは細胞型特異的ｉＰＳ細胞は、内因性翻訳後修飾を可能にする細胞系をより完全に作製するために、その起始細胞型に分化し戻るように誘発され得る。ｉＰＳ細胞は、元の単離された細胞型に再分化する前に、または元の細胞型に再分化した後に目的の治療薬を発現するように遺伝的に修飾され得る（実施例５を参照）。

例えば、成長ホルモンは、通常、下垂体前葉内のソマトトロピン細胞によって最も高度に生成され、胎盤（栄養膜）内の細胞ならびに舌および外陰または肛門皮膚で高度に発現する。Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓによると、第ＶＩＩＩ因子タンパク質発現は、腎臓内の尿細管細胞で高く、多組織および細胞型により適度に発現する。抗体は、典型的に、脾臓および他のリンパ器官の胚中心で成熟するＢ細胞によって生成される。高レベルの抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する抗体の治療薬の生成は、製造細胞系に存在するＩｇＧ１亜型抗体の２等分位置にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）を置くことができるＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）のレベルにより決定される（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．１４５８２−１４５８７，１９９８およびＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：８４−９７（２００７）。ＣＨＯ製造細胞系を使用する高ＡＤＣＣ活性を有する抗体の生成は、常に最適ではない（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３，２００３）。本発明は、製造した抗体、融合タンパク質、および細胞の細胞毒性生物学的製剤の最適なＡＤＣＣ活性に関する新規哺乳類細胞系を提供する。

患者特異的細胞系からの発現レベルを最適化するために、高レベルの生物学的製剤の生成と関連することが知られる転写因子が、目的の遺伝子を用いて同時導入される。例えば、高レベルのＰｉｔ−１発現は、細胞型において高プロラクチン発現をもたらし、一方で、成長ホルモンの発現を遮断または防止することができる（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，３：９４６−９５８ １９８９）。

モノクローナル抗体の生成は、中華人民共和国のＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃによって開発されたもの等の系、モルフォジェニクス（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｓ）（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１０３：３５５７−３５６２，２００６）、または他の標準的なバイオテクノロジー法を使用して、遺伝子コドンを最適化することによって強化され得る。

＜合成により生成された多能性幹細胞の生成＞
本発明の個別生物学的製剤を生成するために、あらゆる種類の合成により生成された多能性幹細胞を使用することができる。２つの主なカテゴリーは、誘発または再プログラム化した多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と、核移植（ＳＣＮＴ）、ＡＮＴ−ＯＡＲ、および単為生殖によって生成された幹細胞である。

体細胞核移植（ＳＣＮＴ）は、成体体細胞の核を用いて除核卵を注入し、調製されたレシピエントの子宮内に移植して、完全な核遺伝クローンを得る出生をもたらす技術である。加えて、多能性幹細胞は培養物中でＳＣＮＴ法から誘導された（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１２：１０５−１１３，２０１０およびＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９：２１９３−２２０１，２００９）。

改変核移植卵母細胞補助再プログラム化（ＡＮＴ−ＯＡＲ）は、ＳＣＮＴに類似する技術であるが、ドナー核は、レシピエント卵内に注入される前に遺伝的に改変されるため、ＡＮＴ卵母細胞の分化および完全な生物形成が防止される（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９：２１９３−２２０１，２００９）。

多能性幹細胞を生成するために、帯なし核移植、単為生殖活性化等の技術を使用する単為生殖（ＰＧＡ）も使用され、ＳＣＮＴおよび単為生殖（ＰＧＡ）等のクローン技術も再プログラム化多能性幹細胞を生成するために使用されてきた（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．，１２：１０５−１１３，２０１０およびＮａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２ ２００７）。

これらの多能性幹細胞は、多少の長期不定期間の間培養物中で維持することができ、組み換えタンパク質、ＤＮＡ、およびウイルス等の生物学的製造の供給源となり得る。

＜誘発したまたは再プログラム化したｓｐＰＳＣ＞
誘発した多能性幹細胞は、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、実行可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）等の多くの点で、胚幹（ＥＳ）細胞等の天然の多能性幹細胞に類似する。

一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略される誘発した多能性幹細胞は、特定の遺伝子の「強制的」発現を誘発することにより、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の種類である（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７）。

誘発した多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、特定の幹細胞関連遺伝子を非多能性細胞内に遺伝子導入することにより生成される。誘発した多能性幹細胞は、典型的に、特定の幹細胞関連遺伝子を成体の線維芽細胞等の非多能性細胞内に遺伝子導入することによって誘導される。遺伝子導入は、典型的に、レトロウイルスまたはレトロトランスポゾン等のウイルスベクターを通して達成される。他の遺伝子が誘導の効率を強化することが示唆されているが、遺伝子導入された遺伝子は、主要転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）およびＳｏｘ２を含む。３〜４週間後、少数の遺伝子導入された細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞に類似し始め、典型的に、形態選択、倍加時間を通して、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通して単離される。

胚性幹細胞由来の線維芽細胞および成体の線維芽細胞ならびに他の細胞は、胚性幹細胞との融合により（Ｃｅｌｌ．１２６：６５２−６５５，２００６およびＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ，２：３３１−３４０，２００６）、レトロウイルス遺伝子導入法を使用して４つの遺伝子を付加することにより（Ｃｅｌｌ．１２６：６６３−６７６，２００６）、単一カセットまたは双シストロン性レンチウイルス遺伝子導入法により［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，２７：５４３−５４９，２００９およびＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，２７：１０４２−１０４９，２００９］、および多能性が要求される転写因子の内因性刺激により（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，２７：３０５３−３０６２，２００９）多能性状態に再プログラム化されてきた。多能性の誘発は、ゲノムのメチル化またはポリアデニル化状態を修飾することにより（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，４：ｅ８４１９，２００９）、マイクロＲＮＡ（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．，３４４：１６−２５，２０１０）、要求される転写因子の小分子活性化因子、後成的な再プログラム化により（Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．，２：７９５−８１６，２００７）、タンパク質に基づく再プログラム化により（Ｂｌｏｏｄ １１６：３８６−３９５，２０１０）、培養物中の多能性細胞からの培養上清または細胞抽出物の添加により、多能性遺伝子を再活性化するための化学もしくは放射または他の手段の遺伝的突然変異により、および成長因子もしくはサイトカインまたは内因性多能性状態を誘発する、または維持する細胞シグナル伝達部分の付加により達成することもできる。

細胞を多能性状態に再プログラム化するためのレトロウイルスの使用は、免疫不全の遺伝子療法試験を想起する危険を示す。Ｃｒｅ−ｌｏｘ等の切除術は、良好な再プログラム化後にレトロウイルスを排除するために使用され、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法は、レトロウイルスの必要性を完全に排除する（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５１６−５２１，２００９）。

ヒトｉＰＳＣは、レトロウイルス系を用いた４つの中枢遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを使用して、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することにより生成されてきた。ヒトｉＰＳＣはまた、レンチウイルス系を使用して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、および異なる遺伝子ＬＩＮ２８を使用して生成されてきた。アデノウイルスもマウスの皮膚および肝細胞のＤＮＡ内に４つの必須の遺伝子を移送するために使用され、胚性幹細胞と同一の細胞をもたらした（Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２（５９０３）：９４５−９４９，２００８）。成体細胞のｉＰＳＣへの再プログラム化は、いずれのウイルス遺伝子導入系を全く用いずにプラスミドを介して達成することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４９−９５３，２００８）。ｉＰＳＣは、ｐｉｇｇｙ ｂａｃトランスポゾン系、ミニサークル（ｍｉｎｉ ｃｉｒｃｌｅ）技術、タンパク質刺激または調整培地刺激再プログラム化を使用して生成されてきた。

ｉＰＳ細胞の生成は、誘発に使用された遺伝子に非常に依存する。Ｏｃｔ−３／４およびいくつかのＳｏｘ遺伝子ファミリー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）は、その不在が誘発を不可能にする誘発プロセスに関与する重要な転写調節因子と同定された。しかしながら、誘発の効率を増加させるいくつかのＫｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、およびＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８を含むさらなる遺伝子が同定された。

○ Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（１７）：４６１３−２０，１９９２）：Ｏｃｔ−３／４は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーのうちの１つであり、多能性の維持に重要な役割を果たす。卵割球および胚性幹細胞等のＯｃｔ−３／４^＋細胞におけるＯｃｔ−３／４の不在は、自発的な栄養膜分化をもたらし、よって、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化の可能性をもたらす。Ｏｃｔ−３／４の類縁物であるＯｃｔ１およびＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーの他の様々な遺伝子は、誘発を引き起こすことができず、よって、誘発プロセスに対してＯｃｔ−３／４の排他性を示す。

○ Ｓｏｘファミリー：Ｓｏｘファミリーの遺伝子は、多能性幹細胞でのみ発現するＯｃｔ−３／４とは対照的に、多能性および単能性幹細胞と関連するが（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２２７（２）：２３９−５５，２０００）、Ｏｃｔ−３／４に類似して、多能性の維持と関連する。Ｓｏｘ２（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）は、誘発に使用された最初の遺伝子であったが（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ５（１０）：６４０−６４２，１９９５）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も誘発プロセスにおいて機能することが分かった。Ｓｏｘ１（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）は、Ｓｏｘ２と類似する効率でｉＰＳ細胞を生じ、Ｓｏｘ３遺伝子（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なヒトｃＤＮＡ）、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８も、効率は減少するが、ｉＰＳ細胞を生成する。

○ Ｋｌｆファミリー：Ｋｌｆファミリーの遺伝子のＫｌｆ４は、マウスｉＰＳ細胞の生成因子である。Ｋｌｆ２（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）およびＫｌｆ４（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）は、ｉＰＳ細胞の生成を可能にする因子であり、関連遺伝子のＫｌｆ１（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）およびＫｌｆ５（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）も、効率は減少するが、ｉＰＳ細胞の生成を可能にする。

○ Ｍｙｃファミリー：Ｍｙｃファミリーの遺伝子は、癌に関与する癌原遺伝子である。Ｃ−ｍｙｃ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）は、マウスｉＰＳ細胞の生成に関与する因子である。しかしながら、ｃ−ｍｙｃは、ヒトｉＰＳ細胞の生成に不要であり得る。ｉＰＳ細胞の誘発における「ｍｙｃ」ファミリーの遺伝子の使用は、ｃ−ｍｙｃ誘発したｉＰＳ細胞を移植されたマウスの２５％が致命的な奇形腫を発症したため、臨床療法としてのｉＰＳ細胞の最終的状況に支障をきたす。Ｎ−ｍｙｃ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）およびＬ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃの代わりに、類似する効率で誘発することが確認されている。

○ Ｎａｎｏｇ：（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）胚性幹細胞において、Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ２と共にＮａｎｏｇは、多能性の促進に必要である（Ｃｅｌｌ１１３（５）：６４３−５５，２００３）。

○ ＬＩＮ２８：（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なｃＤＮＡ）ＬＩＮ２８は、分化および増殖と関連する胚性幹細胞および胚性癌細胞で発現するｍＲＮＡ結合タンパク質である（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ２５８（２）：４３２−４２，２００３）。

＜合成により生成された多能性幹細胞の同一性＞
生成したｓｐＰＳＣは、以下の点において、天然に単離された多能性幹細胞（マウスおよびヒトの胚性幹細胞（ＥＳＣ）、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣなど）と非常に類似しており、よって、天然に単離された多能性幹細胞に対するｓｐＰＳＣの同一性、確実性、および多能性を裏付ける。

細胞の生物学的特性：
○ 形態学：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣに類似する。それぞれの細胞は、形状が丸く、大型の核小体、およびわずかな細胞質を有する。ｉＰＳＣのコロニーも、ＥＳＣに類似する。ヒトｉＰＳＣはｈＥＳＣに類似し、縁が鋭利で平らな密集したコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣに類似し、ｈＥＳＣよりあまり平らではなく、より凝集したコロニーを形成する。

○ 成長特性：倍加時間および有糸分裂活性は、幹細胞がその定義の一部として自己再生でなければならないため、ＥＳＣの基礎である。ｉＰＳＣは、有糸分裂的に活性であり、ＥＳＣと等しい速度で活発に自己再生し、増殖し、分裂する。

○ 幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現するのと同じ細胞表面抗原マーカーを発現する。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現し、これにはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、およびＮａｎｏｇが含まれる。マウスｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３またはＳＳＥＡ−４を発現せず、ｍＥＳＣと類似する。

○ 幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、未分化ＥＳＣにおいて発現する遺伝子を発現し、これにはＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、およびｈＴＥＲＴが含まれる。

○ テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、約５０細胞分裂のヘイフリック限界により制限されない細胞分裂を維持するために必要である。ｈＥＳＣは、自己再生および増殖を維持するために高いテロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣも高いテロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体において必要な構成要素であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。

多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣに類似する様式で、完全に分化した組織に分化することができる。

○ 神経分化：ｉＰＳＣは、ニューロン、発現βＩＩＩチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＭＡＰ２に分化することができる。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｈＥＳＣと同様、ｉＰＳＣがドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることを示し得る。幹細胞関連遺伝子は、分化後下方制御される。

○ 心臓分化：ｉＰＳＣは、自発的に拍動し始める心筋細胞に分化することができる。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ、およびＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は、分化後下方制御された。

○ 奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、９週間後に、自発的に奇形腫を形成する。奇形腫は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の３つの胚葉に由来する組織を含む多系列の腫瘍であり、これは、典型的に単一の細胞型のみのものである他の腫瘍と異なる。奇形腫形成は、多能性の画期的な試験である。

○ 胚様体：培養物中のｈＥＳＣは、「胚様体」と呼ばれるボールの様な胚の様な構造を自発的に形成し、これは、有糸分裂的に活性で分化しているｈＥＳＣのコアと、３つ全ての胚葉から完全に分化した細胞の周縁からなる。ｉＰＳＣは、胚様体も形成し、周縁分化細胞を有する。

○ ４倍体相補性：４倍体胚盤胞内に注入されたマウス胎児線維芽細胞からのｉＰＳ細胞（それ自体は胚体外組織のみを形成することができる）は、成功率は低いが、全非キメラ受精マウスを形成することができる。４倍体相補性アッセイは、生物学において、２つの哺乳類胚の細胞を組み合わせて新しい胚を形成する技法である。遺伝的に修飾された生物を構築するため、胚発達における特定の突然変異の因果関係を研究するため、および多能性幹細胞の研究のために使用される。

誘発した多能性幹細胞（ｉＰＳ）は、腸管腸間膜細胞（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．，１２：２３７−２４７，２０１０）、網膜色素上皮細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，２８：１９８１−１９９１，２０１０）、羊膜細胞（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．，８０：１２３−１２９，２０１０）、線維芽細胞（Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．，８：１５５３，２００９）、成体神経細胞（Ｎａｔｕｒｅ．，Ｖｏｌ．４５４，ｐｐ．６４６−６５０，２００８）、歯髄（Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．７７３−７７８，２０１０）、脂肪細胞（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９：５２５−５３６，２０１０）、卵巣（Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．，５６：４８１−４９４，２０１０）、および胚、胎児、および成体供給源からの他の多くの細胞から生成されている。ｉＰＳ細胞は、理論的に、あらゆる細胞型から生成され得るが、身体の全２２０の細胞型は、まだ系統的に検証されていない。最近のいくつかの研究は、ｉＰＳ細胞がその起始細胞型に関する「記憶」を維持することを示した。これは、ｉＰＳ細胞が培養物中で時折自発的に最も容易にその起始細胞型に好んで再分化すると理解される。

＜内因性幹細胞の単離＞
内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を含む幹細胞は、その表面上に発現する特定の抗原を特徴とし、それによって単離され得る。多能性幹細胞は、他の方法の中でも、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）、転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇならびに他のマーカーの発現を特徴とし得る。今まで単離されてきた内因性多能性幹細胞の主な型は、非常に小さい胚様（ＶＳＥＬ）幹細胞である。

ＶＳＥＬは小さく（マウスにおいては直径３〜５ミクロン、ヒトに関しては直径３〜７ミクロン）、核対細胞質比は高い。ＶＳＥＬは、ＳＳＥＡ１、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１および他の多能性幹細胞マーカー、ならびにＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＡＰ、ｃＭｅｔ、ＬＩＦ−Ｒ、およびＣＸＣＲ４に関して陽性である（Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ５３（１）：１０−２０，２００９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ４：８９−９９，２００８）。これらはＣＤ４５に関して陰性である。ＶＳＥＬはＨＳＣより小さく（３〜６ｖｓ．６〜８μｍ）、核／細胞質比がより高い。ＶＳＥＬ核は大きく、開口型クロマチンを含み、多数のミトコンドリアを有する細胞質の細い縁によって囲まれる。したがって、その形態は、原子的なＰＳＣと一致する。

ＰＢにおける循環ＶＳＥＬの絶対数は、例外的に低く（定常状態条件下の１ｍＬの血液中に１〜２細胞）、よって、特別なフローサイトメトリープロトコルがその同定および単離に適用されなければならない。ＶＳＥＬを同定するために使用される表現型マーカーは、ＣＤ４５（マウスおよびヒト）の陰性発現、Ｓｃａ−１（マウス）、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１３３、およびＣＤ３４（マウスおよびヒト）の陽性発現、前駆体幹細胞マーカー（つまり、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＳＥＡ）に関して陽性を含み、胚盤葉上層／生殖系幹細胞のいくつかのマーカー特徴を発現する。

ＶＳＥＬの蛍光活性化細胞選別単離のみを利用することにより、１００ｍＬのＵＣＢ中に存在する全ＶＳＥＬの選別は、４作業日内で完了し得る。より効率的で経済的な３工程単離プロトコルは、Ｌｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３ｔｈｏｒｎ ＵＣＢ−ＶＳＥＬの初期数の６０％の回収率を可能にする。プロトコルは、低張塩化アンモニウム溶液中への赤血球の溶解、免疫磁気ビーズによるＣＤ１３３ｔｈｏｒｎ細胞選択、およびサイズマーカービーズ制御を伴うＦＡＣＳによるＬｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３ｔｈｏｒｎ細胞の選別を含む。単離した細胞は、小さい高度に原始的なＬｉｎ−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３ｔｈｏｒｎ細胞のＯｃｔ−４ｔｈｏｒｎおよびＳＳＥＡ−４ｔｈｏｒｎ集団に高度に濃縮される。

ＶＳＥＬを選別する別の方法は、いくつかの表面マーカーの存在および細胞の直径に基づく。簡潔に、初期工程は、有核細胞の画分を得るための赤血球の溶解である。赤血球溶解緩衝液は、フィコール遠心分離の代わりに使用され、これは、後者の手法が非常に小さい細胞の集団を除去する可能性があるためである。続いて、細胞をＳｃａ−１（マウスＶＳＥＬ）またはＣＤ１３３（ヒトＶＳＥＬ）に対する抗体、全血球増殖性抗原（ＣＤ４５）、造血系列マーカー（ｌｉｎ）、およびＣＸＣＲ４で染色し、多重パラメータ生減菌細胞選別システム（ＭｏＦｌｏ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＦＡＣＳＡｒｉａ，Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して選別する。この方法は、約９５％のＶＳＥＬを含む直径２〜１０μｍの事象を含むように、「拡張リンパ球ゲート」を使用する。

内因性幹細胞は、骨髄、全血、さい帯血、脂肪組織、または他の供給源からの単核球画分内に含まれるか、またはそれらは、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＳＳＥＡ１−４、色素排除、もしくは他の特定の幹細胞抗原の選択により精製され得る。幹細胞は、フィコールハイパックまたは他の商業的に利用可能な勾配を使用して密度勾配遠心分離により、全血、骨髄、さい帯血、脂肪組織、嗅粘膜からの組織剥離物、およびさい帯血等の単一細胞懸濁液中に解離され得る他の幹細胞供給源から単離され得る。幹細胞は、そのような手順から得られる単核球の画分から回収され得る。別の方法としては、幹細胞は、密度勾配遠心分離後に他の画分内で発見され得る（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１１［印刷前の電子出版］）。例えば、さい帯血は、ＰＢＳ中に１：１に希釈され、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）上に慎重に重ねられ、室温で３０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離され得る。示されるように得られた層は、幹細胞単離のためにさらに処理され得る。層１は血小板層であり、層２は単核球を含むバフィーコートであり、層３はフィコール層であり、層４はＶＳＥＬも含む赤血球ペレット層である。層１、２、および３が回収され、ＦＢＳを含む、または含まないＤＭＥＭ Ｆ１２等の適切な培地で希釈され、細胞ペレットを得るために再度遠心分離され得る。層４は、ＤＭＥＭ Ｆ１２等の適切な培地で希釈され、標準的な卓上遠心分離器で、室温で１５分間、８００ｒｐｍで遠心分離され得る。幹細胞は、上記に概説するフローサイトメトリー法の種類の後に、主に層２（バフィーコート）および層４（ＲＢＣペレット）から回収され得る。図１は、全血の勾配遠心分離によって得られる典型的な層の図を示す。１は血小板を示す。２はＭＮＣおよび幹細胞を有するバフィーコートを示す。３はフィコールを示す。４はＲＢＣペレットおよび幹細胞を示す。

加えて、グリコシル化パターンおよび他の翻訳後修飾は、組織および細胞型によって異なってもよいため、患者特異的幹細胞系は、器官または生物学的製剤を内因的に発現する細胞型の中から単離された成体もしくは体細胞から調製され得る。Ｒａｊｐｅｒｔ−Ｄｅ Ｍｅｙｔｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｅｓｔｉｓ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４５１：８０５−８１４ （２００７）を参照。Ｐｅｖａｌｏｖａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．“Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｂｒａｔｉｓｌ Ｌｅｋ Ｌｉｓｔｙ，１０７：３４６−３５３（２００６）を参照。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
＜不死化ｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣの生成＞
本発明の好ましい実施形態では、ｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣは、典型的にはポリオーマサルウイルス４０（ＳＶ４０）を使用して、好ましくは大型Ｔ抗原の非ウイルス誘発を通して不死化される。Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９８３）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｒｇｅ Ｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｏｍａ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ “Ｎｏｒｍａｌ” Ｒｏｄｅｎｔ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ”．ＰＮＡＳ ８０：４３５４−４３５８（１９８３）およびＨｏｆｍａｎｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１：４１７−４３５（１９９２）を参照。

＜合成により生成された、好ましくは誘発した多能性幹細胞、より好ましくは単離した内因性多能性幹細胞を使用した実施形態の概要＞
好ましい実施形態において、
１．内因性多能性幹細胞が単離される。

２．ｅＰＳＣが不死化される。

３．不死化したｅＰＳＣは、非ウイルス技術を使用して、目的の遺伝子、ウイルス、または核酸を遺伝子導入される。

４．遺伝子導入した不死化ｅＰＳＣは、次いで、より効率的な様式で核酸生成物を発現することができるように、生殖系細胞、好ましくは卵巣細胞に分化するように誘発される。

５．分化した細胞は、ここで、目的の核酸を含む、前に遺伝子導入したベクターから目的の核酸生成物を発現するように誘導され得る。

別の好ましい実施形態では、
１．体細胞が単離される。

２．体細胞が、誘発した多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に形質転換される。

３．ｉＰＳ細胞が不死化される。

４．不死化したｉＰＳ細胞は、目的の遺伝子、ウイルス、または核酸を含むベクターを遺伝子導入される。

５．遺伝子導入した不死化ｉＰＳ細胞は、次いで、より効率的な様式でタンパク質を発現することができるように、体細胞に再分化するように誘発される。

６．再分化した細胞は、ここで、目的の遺伝子を含む、前に遺伝子導入したベクターから目的のタンパク質を発現するように誘発され得る。

さらにより好ましい実施形態では、
１．内因性多能性幹細胞が単離される。

２．不死化したｅＰＳＣは、非ウイルス技術を使用して、目的の遺伝子、ウイルス、または核酸を遺伝子導入される。

３．遺伝子導入した不死化ｅＰＳＣは、次いで、より効率的な様式で核酸生成物を発現すること発ができるように、生殖系細胞、好ましくは卵巣細胞に分化するように誘発される。

４．分化した細胞は、ここで、目的の核酸を含む、前に遺伝子導入したベクターから目的の核酸生成物を発現するように誘導され得る。

本発明の好ましい実施形態を達成するための方法は、当業者に周知である。

代替えの実施形態では、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣは、不死化される前に目的の核酸を含むベクターを遺伝子導入され得る。Ｄｕ Ｃ． ｅｔ ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｄ Ｆｉｘｅｄ Ｌｅｎｇｔｈ ｓｉＲＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ”，Ｂｉｏｍｅｄ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３４５：９９−１０５（２００６）、２００８年１１月２１日に出願されたＹｏｒｋ Ｚｈｕの米国特許出願第１２／３１３，５５４号を参照。あるいは、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞は、再分化するように誘発され得、次いで、細胞は不死化され得、不死化した再分化細胞は、目的の核酸を含むベクターを遺伝子導入され得る。別の可能性は、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞が再分化されるように誘導され得、再分化した細胞は目的の核酸を遺伝子導入され得、再分化した遺伝子導入した細胞が不死化され得る。

ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞が再分化前に培養物中で、好ましくは自己ヒト血清および幹細胞因子もしくは白血病阻害因子を含む細胞培養培地中で増殖されることが好ましい。

生成されるポリペプチドまたはタンパク質は、いずれのポリペプチドまたはタンパク質であり得る。特に関心があるものは、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、抗体もしくは抗体断片、αインターフェロン、インターフェロンα２Ａおよび２Ｂ（米国特許第４，８１０，６４５号および同第４，８７４，７０２号を参照）、βインターフェロン（米国特許第４，７３８，９３１号を参照）、コンセンサスインターフェロン（米国特許第５，６６１，００９号を参照）、成長ホルモン、抗血友病因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性受容体、可溶性受容体の免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域への融合等の融合タンパク質（米国特許第５，１５５，０２７号を参照）、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦα、インターロイキン２、β−グルコセレブロシダーゼもしくはその類似体、α１−プロテイナーゼ阻害剤、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼβ、ラロニダーゼ、アルグルコシダーゼα、アルグルコシダーゼα、サイロトロピンα、およびチモシンαからなる群から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。

本発明のプロセスにより、あらゆる抗体または抗体断片が生成され得る。特に関心があるものは、ターゲットに結合するそれらの抗体または抗体断片であり、前述のターゲット
は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子、成長因子受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）分子、インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、γインターフェロン、核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）、およびＢｌｙｓからなる群から選択される。

＜幹細胞の分化の誘発＞
目的のタンパク質の生成を最適化するために、遺伝子導入されたｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞は、体細胞に分化するように誘発されるべきである。

代替えの実施形態では、ｅＰＳＣまたはｓｐＰＳＣ細胞の集団が増殖され得、分化が誘発され得、次いで、分化した細胞が、目的の核酸を遺伝子導入され得る。幹細胞は、細胞生物学および細胞分化の分野の者に公知である他の方法の中でも、様々な成長因子を培養物に添加することにより（Ｂｌｏｏｄ．，８５：２４１４−２４２１，１９９５）、培養培地中の栄養素を変更することにより、酸素分圧（ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：９４，２０１０）もしくは温度等の培養条件を操作することにより、または幹細胞を様々な細胞外マトリックス上で培養することにより、培養物中で体細胞型に分化するように誘発され得る。例えば、レチノイン酸、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アスコルビン酸、およびβ−グリセロリン酸塩は、骨芽細胞の生成をもたらし、インドメタシン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、インスリン、およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）は、脂肪細胞の生成をもたらし、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ビタミンＤ３、ＴＮＦ−β、およびレチノイン酸は、筋細胞の生成をもたらす（ＣＡＲＤＩＡＣ−ＤＥＲＩＶＥＤ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ．（国際公開第１９９９／０４９０１５号）１９９８年３月）。生殖細胞は、単層培養、胚様体（ＥＢ）の形成、ＢＭＰ４生成細胞との共凝集、および精巣もしくは卵巣細胞調整培地の使用、または組み換えヒト骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いたＥＢ形成を使用して、多能性幹細胞から生成されている（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９；４（４）：ｅ５３３８）。生殖細胞マーカー遺伝子は、ＺＮＦドメインを伴う１を含むＰＲドメイン（ＰＲＤＭ１、ＢＬＩＭＰ１としても知られる）、１４を含むＰＲドメイン（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、ＤＰＰＡ３、ＩＦＩＴＭ３、ＧＤＦ３、ｃ−ＫＩＴ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＮＡＮＯＳ１−３、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＰＩＷＩファミリー遺伝子（ＰＩＷＩＬ１およびＰＩＷＩＬ２、それぞれ、ヒトにおいてＨＩＷＩおよびＨＩＬＩとしても知られる）、Ｍｕｔ−Ｌ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１（ＭＬＨ１）、シナプトネマ複合タンパク質１（ＳＣＰ１）、およびＳＣＰ３を含む。得られた生殖細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および他の現在使用されている製造細胞系の使用に類似して、目的の遺伝子またはタンパク質生成物を発現するように遺伝的に修飾され得る。様々な段階の幹細胞から様々な体細胞系を得るための分化戦略は、幹細胞生物学の分野の者に周知である。

患者特異的細胞系からの発現レベルを最適化するために、高レベルの生物学的製剤の生成と関連することが知られる転写因子が、目的の遺伝子を用いて同時導入される。例えば、高レベルのＰｉｔ−１発現は、細胞型において高プロラクチン発現をもたらし、一方で、成長ホルモンの発現を遮断または防止することができる（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，３：９４６−９５８ １９８９）。

モノクローナル抗体の生成は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃによって開発されたもの等の系、モルフォジェニクス（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｓ）、または他の標準的なバイオテクノロジー法を使用して、遺伝子コドンを最適化することにより強化され得る。

本発明によると、組み換えポリペプチドおよびタンパク質は、ｅＰＳＣおよびｓｐＰＳＣにおいて生成され、ｓｐＰＳＣおよびｅＰＳＣは、動物の特定の種のいくつかの血統または民族が特定の血統または民族により生成されたポリペプチドまたはタンパク質において異なるグリコシル化パターンを有するという事実により、特定の血統または民族の細胞から生成または単離される。本発明によると、民族は、そのメンバーが共通の遺伝形質により相互に認め合う、多くの場合、祖先または同族結婚（特定の集団内での結婚の習慣、例えばアシュケナージ系ユダヤ人）からなる人の集団である。一般に、高度に生物学的に自己永続的な集団である。ポリペプチドおよびタンパク質における異なるグリコシル化パターンを有し得る民族の例は、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｄａｖｉｄ（１９９８），Ｅｔｈｎｉｃ Ｇｒｏｕｐｓ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：Ａ Ｒｅａｄｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐに示されている。

＜幹細胞療法のための方法およびシステム＞
本発明は、奇形腫を形成することなく、幹細胞療法を促進するための方法も含む。本発明は、本明細書において、より大きな治療利益のために、上記に定義される合成により生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）と呼ばれる、観察された「記憶」または再プログラム化体細胞をどのように有利に利用するかを教示する。再プログラム化の前に起始細胞型に再分化する選好を付与するｓｐＰＳＣの記憶は、再生医療においてｓｐＰＳＣの安全かつ治療的有用性を強化するための手段を提供する。

一般的な工程
本発明は、
１．目的の体細胞、特に再生したい体細胞の単離、
２．体細胞の、合成により生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）、特に上述のように誘発した多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への体細胞の形質転換、
３．ｓｐＰＳＣが体細胞の固有の後成的記憶を維持する、ｓｐＰＳＣの集団の増殖、
４．培養物中のｓｐＰＳＣの、元の体細胞型を有する再分化した体細胞への再分化、および
５．細胞型が望まれる身体の領域内への再分化した体細胞の投与または送達、を伴う。

最近のいくつかの研究は、ｓｐＰＳＣ細胞がその起始細胞型の「記憶」を維持することを示した（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：１９８１−１９９１，２０１０）、（Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：２８５−９０，２０１０）、（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２８，：８４８−８５５，２０１０）、および（Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．，１６：８８０−８８５，２０１０）。これは、ｓｐＰＳＣが培養物中で時折自発的に最も容易に起始細胞型に好んで再分化すると理解される。科学者および臨床科学者は、決然と、臨床療法、薬剤開発、疾患モデル、または毒性スクリーニング（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：５１６−５２１，２００９）に有用である可能性がある多能性幹細胞の生成に重点を置き、多能性幹細胞の記憶態様が安全なヒト療法を提供する治療利点を見逃した。実際、再プログラム化多能性幹細胞の「記憶」態様に関するデータを公開した科学者は、このｓｐＰＳＣ細胞の特性が療法に生じる限界に重点を置き、これらの細胞の治療的有用性を提供するためのこの特性の重要性を見逃した。

ｓｐＰＳＣの記憶態様は、複数の起源の体細胞から観察されている。例えば、一次胎児網膜上皮細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、およびＮａｎｏｇのレンチウイルス発現を使用して、ｉＰＳＣに再プログラム化され（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：１９８１−１９９１，２０１０）、多能性に関する標準的な試験に合格し、それらは、奇形腫を形成し、多能性幹細胞マーカーを発現した。成長培地からの塩基性ＦＧＦの除去後、網膜ｓｐＰＳＣ系の一部が、自発的に網膜上皮細胞系列に再分化し戻った。ヒト胎児肺線維芽細胞からのｓｐＰＳＣ、ヒト包皮線維芽細胞、またはヒトＥＳＣ細胞からの５〜１６％の網膜上皮細胞と比較して、自発的にヒトの胎児網膜上皮ｓｐＰＳＣ細胞から分化する約６０％の細胞は、網膜上皮細胞である。しかしながら、ヒト胎児網膜上皮細胞からのｓｐＰＳＣ細胞の３つのうちの１つは、網膜上皮細胞に分化することが全くできなかった。Ｋｉｍら（Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１３）：２８５−９０，２０１０）は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＭｙｃのレトロウイルス導入を使用して、加齢マウスからの骨髄前駆体細胞および真皮線維芽細胞を再プログラム化した。それらの得られた全ての幹細胞系は、ヒトサンプルに典型的に適用される基準に基づく多能性を示した。それらの再プログラム化多能性幹細胞の後の分化は、造血源が線維芽細胞源より容易に造血系列に再分化し、同様に、線維芽細胞源が造血源より容易に間葉系列に再分化したことを示した。著者は、その起始体細胞系列に好んで分化するこの傾向が、造血系列への分化、続いて再度の多能性の再プログラム化、次いでさらなる分化により一部克服され得ることも示した。例えば、神経前駆体細胞に由来する再プログラム化細胞は、造血系列に分化した後、多能性に再プログラム化され、造血コロニーの形成が、神経細胞に分化され、再プログラム化された後、造血細胞に分化された神経前駆体より高いことを示した。

ヒト胎児神経前駆体細胞の非ウイルス性再プログラム化を使用して、再プログラム化した細胞がその起始細胞型に好んで再分化する同様の知見がなされている（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．，４：ｅ７０７６−ｅ７０８８，２００９）。得られた再プログラム化した細胞は、いくつかの多能性のマーカー（３つ全ての生殖層に関するマーカー）を発現し、胚様体を培養物中でおよび奇形腫を形成することができたが、著者は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析を用いて、再プログラム化した神経前駆体細胞が神経幹細胞遺伝子の発現を一部維持したことを示した。Ｐｏｌｏら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２８，：８４８−８５５，２０１０）は、マウス尾端部由来線維芽細胞、脾臓Ｂ細胞、骨髄顆粒球、および骨格筋前駆体から多能性再プログラム化細胞を誘導した。自己分化研究は、脾臓Ｂ細胞および骨髄顆粒球再プログラム化ｓｐＰＳＣ細胞が線維芽細胞または骨格筋由来ｓｐＰＳＣ細胞より効率的に造血前駆体を生じることを示した。興味深いことに、これらの様々なｓｐＰＳＣ細胞の連続継代は、継代１６までに遺伝子およびメチル化の相違の抑止をもたらし、細胞は、次いで、より初期の継代４での結果とは対照的に、分化の効率が等しいことも示した。興味深いことに、この差次的な分化の可能性の現象は、再プログラム化した体細胞に限定されず、異なる遺伝標識を有し、特定の細胞系列に自発的に好んで分化することが分かった胚性幹細胞系においても観察されている（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：３１３−３１５，２００８）（Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｕｐｄａｔｅ．，１３：１０３−１２０，２００７）（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．，３０７：４４６−４５９，２００７）（ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０：４４，２００９）。

幹細胞は、その表面上に発現する特定の抗原を特徴とし、それにより単離され得る。多能性幹細胞は、他の方法の中でも、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）、転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇならびに他のマーカーの発現を特徴とし得る。胚性幹細胞由来線維芽細胞および成体の線維芽細胞ならびに他の細胞は、胚性幹細胞との融合により（Ｃｅｌｌ １２６：６５２−６５５，２００６およびＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ，２：３３１−３４０，２００６）、レトロウイルス遺伝子導入法を使用した４つの遺伝子の付加により（Ｃｅｌｌ１２６：６６３−６７６，２００６）、単一カセットまたは双シストロン性レンチウイルス遺伝子導入法により（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ２７：５４３−５４９，２００９およびＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ２７：１０４２−１０４９，２００９）、および多能性が要求される転写因子の内因性刺激により（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ２７：３０５３−３０６２，２００９）多能性状態に再プログラム化されてきた。多能性の誘発は、ゲノムのメチル化またはポリアデニル化状態を修飾することにより（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ４：ｅ８４１９，２００９）、マイクロＲＮＡ（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．３４４：１６−２５，２０１０）、要求される転写因子の小分子活性化因子、後成的な再プログラム化により（Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２：７９５−８１６，２００７）、タンパク質に基づく再プログラム化により（Ｂｌｏｏｄ１１６：３８６−３９５，２０１０）、培養物中の多能性細胞からの培養上清または細胞抽出物の添加により、多能性遺伝子を再活性化するための、化学もしくは放射線または他の手段の遺伝子突然変異により、あるいは成長因子もしくはサイトカインまたは内因性多能性状態を誘発する、または維持する細胞シグナル伝達部分の付加によっても達成され得る。細胞を多能性状態に再プログラム化するためのレトロウイルスの使用は、免疫不全の遺伝子治療試験を想起する危険を示す。Ｃｒｅ−ｌｏｘまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法等の切除術は、良好な再プログラム化後にレトロウイルスを排除するために使用されてきた（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５１６−５２１，２００９）。ＳＣＮＴおよび単為生殖（ＰＧＡ）等のクローン法（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．１２：１０５−１１３，２０１０）も、再プログラム化した多能性幹細胞を生成するために使用されてきた（Ｎａｔｕｒｅ４５０：４９７−５０２，２００７）。

主に、これらの幹細胞がヒトの再生医療の療法に適切であることを願って、多能性幹細胞の様々な供給源を発見するために大量の資源（経済、知識、および労力）が注ぎ込まれてきた。残念なことに、成体ＶＳＥＬを除き（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ４：８９−９９，２００８）、今までに単離された全ての多能性幹細胞は、奇形腫形成、腫瘍形成、およびさらには腫瘍特性の問題のため阻まれる。したがって、過去１５年ほどにわたって行われてきた経済、知識、および労力の投資を生かすために、多能性幹細胞のある程度の有用性が必要とされる。

幹細胞は、細胞生物学および細胞分化の分野の者に公知である他の方法の中でも、様々な成長因子を培地に添加することにより（Ｂｌｏｏｄ８５：２４１４−２４２１，１９９５）、培養培地中の栄養素を変更することにより、酸素分圧（ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：９４，２０１０）もしくは温度等の培養条件を操作することにより、または幹細胞を様々な細胞外マトリックス上で培養することにより、培養物中で体細胞型に分化するように誘発され得る。例えば、レチノイン酸、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アスコルビン酸、およびβ−グリセロリン酸塩は、骨芽細胞の生成をもたらし、インドメタシン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、インスリン、およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）は、脂肪細胞の生成をもたらし、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ビタミンＤ３、ＴＮＦ−β、およびレチノイン酸は筋細胞の生成をもたらす（国際公開第１９９９／０４９０１５号）１９９８年３月）。様々な段階の幹細胞から様々な体細胞系を得るための分化戦略は、幹細胞生物学の分野の者に周知である。

幹細胞療法は、多くのヒト疾患の治療のために検証され、改良されている。ＮＩＨウェブサイトｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖに含まれる臨床試験の情報は、３０００を超える幹細胞の検証を列挙している。評価中の疾患は、血液悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、癌、大理石骨病、再生不良性貧血、および血球減少症、鎌状赤血球疾患およびサラセミア、角膜縁幹細胞欠損、乳癌、急性心筋梗塞、冠動脈疾患、末梢血管病、心不全、１型真性糖尿病、２型真性糖尿病、脳卒中、脊髄損傷、神経芽細胞腫、多発性硬化症、全身性硬化症、紅斑性狼瘡、慢性創傷治癒、火傷、骨折治癒、軟骨修復、ＣＮＳ腫瘍、変形性関節炎、腎不全、パーキンソン病、骨髄腫、糖尿病性足病変、肝臓および胆汁性肝硬変、拡張型心筋症、貧血、網膜色素変性症、クローン病、糖尿病性神経障害、肥満細胞症、卵巣癌、癲癇、重症筋無力症、自己免疫疾患、肉芽腫性疾患、骨壊死、肝不全、ＰＭＤ疾患、リポジストロフィー、脱髄性疾患、軟骨欠損、網膜症、ループス腎炎、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、肉腫、筋炎、高血糖、黄斑変性症、潰瘍性大腸炎、筋変性等を含む。

幹細胞は、当業者に公知の様々なマーカーを使用して単離され得る。例えば、一般的な幹細胞マーカーのリストは、ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｆｏ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ／ａｐｐｅｎｄｉｘｅ．ａｓｐ＃ｅｉｉで見つけることができる。神経幹細胞はＣＤ１３３を使用して、間葉幹細胞および前駆体細胞は骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）を使用して、造血幹細胞はＣＤ３４により、間葉幹細胞はＣＤ３４＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−マーカーの組み合わせにより、造血幹細胞および間葉幹細胞はｃｋｉｔ、Ｓｔｒｏ１、またはＴｈｙ１により、神経前駆体および膵臓前駆体はネスチンにより、外胚葉、神経前駆体および膵臓前駆体はビメンチンにより、ならびに他のマーカーにより単離され得る。

本発明は、再生医療に関して、体細胞を安全に再プログラム化し、再分化するための方法をさらに提供する。有用な体細胞は、完全に分化した体細胞、前駆体細胞、またはより原始的な幹細胞を含み得る。再生療法を必要とする器官により、より原始的な幹細胞が器官穿刺、生検、剥離、または外科的アクセスにより、大体は利用可能であり得る。より原始的な幹細胞の使用は、これらの幹細胞へのアクセスが可能である場合、好ましい。あまり好ましくないが、完全に分化した体細胞より好ましいのは、前駆体細胞の使用である。

治療のターゲットとされる特定の器官からの体細胞の単離、これらの体細胞の再プログラム化、ｓｐＰＳＣの固有の「記憶」が維持されると仮定する培養物中での短期間の増殖、続いて培養物中での起始細胞型への分化、その後の治療への適用は、多能性幹細胞法が腫瘍または奇形腫形成の危険を減少させながら患者を治療するために使用されることを可能にする。

再プログラム化体細胞は、継代１から１２の間で、最も好ましくは継代４で使用され得る。再プログラム化体細胞は、標準的な細胞生物学および分化法により、所望の再生のために、細胞型に分化され得る。得られた治療用細胞は、静脈内、動脈内、筋肉内、またはＮＯＧＡＳｔａｒまたはＭｙｏＳｔａｒ注入カテーテルもしくは他の承認されたカテーテル注入装置等のカテーテルを含み得る標準的な注入法を使用する他の注入法により投与され得る。別の方法としては、治療用細胞は、低侵襲性またはより侵襲性の外科手術法によりターゲット組織に施されてもよい。治療用細胞は、０〜１５％、より好ましくは５％の自己ヒト血清アルブミンを含む緩衝組成物において投与され得る。中枢神経系の疾患の治療において、治療用細胞は、好ましくは自己脳脊髄液を使用して緩衝される。治療用細胞はまた、コラーゲン、フィブリノーゲン、または他の細胞外マトリックスもしくは細胞外マトリックスの組み合わせ等の足場の使用を通して、または細胞を適所に保ち、再生修復を必要とする器官との接触を保持するために、アルギニン酸塩等を使用して作製された縫合糸または他の標準的な方法を使用することにより施されてもよい。

好ましくは、最低５００個の治療用細胞が投与され、一般的には、細胞療法は１５００万〜５憶個の細胞を利用する。より好ましくは、１５００万〜１憶個の細胞が最適効果のために投与される。

例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、多発性硬化症、麻痺、および中枢神経系（ＣＮＳ）の他の疾患等の神経疾患の細胞療法においては、好ましくは、公開（Ｊ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｍｅｄ．２９：１９１−２０３，２００６）されるように、剛性内視鏡を使用して、嗅粘膜を単離する。神経幹細胞および前駆体細胞もしくは嗅神経鞘細胞は、再生医療の分野の当業者に周知の方法により嗅粘膜から単離される。別の方法としては、神経冠幹細胞は、ヒトの毛嚢から単離され得る（Ｆｏｌｉａ Ｂｉｏｌ．５６：１４９−１５７，２０１０）。最も好ましくは、神経幹細胞は、特定の因子の付加により再プログラム化され、４継代に増殖および継代され、特定の因子の付加により特定の中枢神経系細胞型に再分化され、次いで再生療法のために患者に投与される。

本発明は、再生医療に関して、体細胞を安全に再プログラム化し、再分化するための方法を提供する。有用な体細胞は、完全に分化した体細胞、前駆体細胞、またはより原始的な幹細胞を含み得る。再生療法を必要とする器官により、より原始的な幹細胞が器官穿刺、生検、剥離、または外科的アクセスにより、大体は利用可能であり得る。より原始的な幹細胞の使用は、これらの幹細胞へのアクセスが可能である場合、好ましい。あまり好ましくないが、完全に分化した体細胞より好ましいのは、前駆体細胞の使用である。

脊髄損傷の修復において、嗅粘膜が剛性内視鏡により除去され、神経幹細胞が１９９２年にＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓにより最初に説明された神経球アッセイを使用して単離され（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１７０７−１７１０，１９９２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が神経球成長を刺激するために嗅粘膜の培養物中で数日生存する細胞に添加され、神経幹細胞は、７〜１０日以内の培養で回復可能である。得られた神経幹細胞は、５〜７日の間、ハイグロマイシン選択を伴うＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの送達のためのエピソームベクターの付加により再プログラム化される。細胞は、自己脳脊髄液または特定の因子を使用して、継代され、遺伝子挿入のない（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）コロニーを得るために継代４まで増殖された後、嗅神経鞘細胞および幹様神経前駆体細胞に分化される。標準的な正中切開および後方正中脊髄切開術を使用して、損傷した脊髄を手術中露出させ、許容できる瘢痕組織を除去し、治療用細胞を自己脳脊髄液に懸濁し、生理活性足場上に播種し、損傷した脊髄に直接適用する。

＜実施例１＞
組み換えタンパク質生成のための合成により生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝子修飾
患者からのＳＣＮＴもしくはＰＧＡもしくはＡＮＴ−ＯＡＲもしくはｉＰＳＣ等の合成により生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）は、生物学的製剤の生成を誘発するための遺伝子修飾に使用される。ＳＣＮＴ由来幹細胞は、患者の細胞の核を調製した除核卵母細胞内に移植することにより調製される。ＡＮＴ−ＯＡＲ由来細胞は、修飾した核を、除核し、調製した卵母細胞内に移植する前に患者の核ＤＮＡを遺伝的に修飾することにより調製される。ｉＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝子修飾、多能性転写因子の活性化因子、後成的修飾、または上述の当該技術分野に公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた合成により生成された患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の生成における後の遺伝的修飾のために、マスターセルバンク（ｍａｓｔｅｒ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）およびワーキングバンク（ｗｏｒｋｉｎｇ ｂａｎｋ）として「保存される」。

生殖細胞は、単層培養、胚様体（ＥＢ）の形成、ＢＭＰ４生成細胞との共凝集、精巣もしくは卵巣細胞調整培地の使用、または組み換えヒト骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いたＥＢ形成を使用して、多能性幹細胞から生成される。生殖細胞は、ＺＮＦドメインを伴う１を含むＰＲドメイン（ＰＲＤＭ１、ＢＬＩＭＰ１としても知られる）、１４を含むＰＲドメイン（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、ＤＰＰＡ３、ＩＦＩＴＭ３、ＧＤＦ３、ｃ−ＫＩＴ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）、ＮＡＮＯＳ１−３、ＤＡＺＬ、ＶＡＳＡ、ＰＩＷＩファミリー遺伝子（ＰＩＷＩＬ１およびＰＩＷＩＬ２、それぞれ、ヒトにおいてＨＩＷＩおよびＨＩＬＩとしても知られる）、Ｍｕｔ−Ｌ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１（ＭＬＨ１）、シナプトネマ複合タンパク質１（ＳＣＰ１）、およびＳＣＰ３を含み得るマーカー遺伝子の発現により同定される。得られた生殖細胞は、組み換え第ＶＩＩＩ因子の製造に一般的に使用される方法により、第ＶＩＩＩ因子等の目的の遺伝子を遺伝子導入される。

＜実施例２＞
組み換えインスリン生成のための合成により生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝子修飾
患者からのＳＣＮＴもしくはＰＧＡもしくはＡＮＴ−ＯＡＲもしくはｉＰＳＣ由来幹細胞等の合成により生成された多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）は、生物学的製剤の生成を誘発するための遺伝子修飾に使用される。ＳＣＮＴ由来幹細胞は、患者の細胞の核を調製した除核卵母細胞内に移植することにより調製される。ＡＮＴ−ＯＡＲ由来細胞は、修飾した核を、除核し、調製した卵母細胞内に移植する前に患者の核ＤＮＡを遺伝的に修飾することにより調製される。ｉＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝子修飾、多能性転写因子の活性化因子、後成的修飾、または上述の当該技術分野に公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた合成により生成された患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の生成における後の遺伝的修飾のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「保存される」。

患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現は、出芽酵母におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法［Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ”．２１，Ｍａｙ ２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７：１８２４５−１８２４８（Ｍａｙ ２００２）、Ｚｈａｎｇ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ ｃｏｍｐｌｅｘ”．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５３：１１８７−１１９８（Ｊｕｎｅ ２００１）、およびＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，“Ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ”．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７２：１２９７８−１２９８３（Ｍａｙ １９９７）］またはＥ． Ｃｏｌｉ ［Ｓｏｎ ＹＪ．，ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ”．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：９８３−９８９（Ｍａｙ ２００８）］により行われた後、標準的な方法により処理され、精製される。患者特異的細胞系を発現するインスリン前駆体は、後のインスリン生成のためにマスターセルバンクおよびワーキングセルバンクとして「保存される」。

＜実施例３＞
合成により生成された患者特異的多能性幹細胞の遺伝的修飾を使用したインスリン生成のためのβ細胞の生成
インスリンを生成するために、患者からの体細胞をｓｐＰＳＣを生成するための遺伝的修飾に使用し、これらは生物学的製剤の生成を誘発するために使用される。ｓｐＰＳＣ由来幹細胞は、遺伝的修飾、多能性転写因子の活性化因子、後成的修飾、または当該技術分野に公知の他の方法を使用して、患者の細胞を再プログラム化することにより調製される。得られた患者特異的幹細胞系は、生物学的製剤の生成における後の遺伝的修飾のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「保存される」。あるいは、内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）は、上述の技法により単離されて、保存され得る。

患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現は、上述のように、出願酵母または大腸菌におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法により行われる。適切なインスリン遺伝子構築物を遺伝子導入した後、細胞は、［Ｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ．Ａｌ．“Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ａｎｄ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ”．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，２３：６５６−６６２（２００５）またはＴａｔｅｉｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ．Ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｌｉｋｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８３：３１６０１−３１６０７（２００８）］ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｔａ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔ／Ｃｅｌｌ＿Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｓｔｅｍ＿Ｃｅｌｌｓ／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿Ｓｔｅｍ＿Ｃｅｌｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｏｎｌｉｎｅ．［オンライン］［２０１０年１２月１９日に引用。］に見出される標準的なプロトコルに従い、β細胞系列に分化される。

次いで、標準的な方法により、得られた発現した生物学的製剤の生成物を処理し、精製する。幹細胞系を発現する得られた患者特異的インスリン前駆体は、生物学的製剤の生成における後の遺伝的修飾のために、マスターセルバンクおよびワーキングバンクとして「保存される」。

別の方法としては、得られた患者特異的幹細胞は、Ｂｅｔａ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ同上のＳｈｉ ｅｔ．Ａｌ．同上またはＴａｔｅｉｓｈｉ ｅｔ．Ａｌ．同上に見出される標準的なプロトコルに従い、β細胞系列に分化される。一旦分化されると、患者特異的幹細胞におけるインスリン前駆体の発現は、上述の出芽酵母または大腸菌におけるインスリンの製造に一般的に使用される方法により行われる。次いで、標準的な方法により、得られた発現した生物学的生成物を処理し、精製する。

＜実施例４＞
再プログラム化および遺伝子導入して生物抗体治療薬を生成するための成体（体細胞）抗体生成細胞の単離
抗体生成Ｂ細胞は、患者特異的製造細胞系を生成し、治療用抗体生物学的製剤を生成する目的のために末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血細胞源から単離される。Ｂ細胞は、ＣＤ１９発現に基づき利用可能なキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して単離される。最高レベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を生成する細胞を選択するために、限界希釈法または細胞選別法が利用され得る。簡単な増殖の後、高Ｉｇ生成クローナル細胞は、標準的な再プログラム化法を使用して、多能性または前駆体状態に再プログラム化される。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な分子生物学技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物を形質導入される。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能であるか、抗体治療薬の事項の組成物の所有者により内密に維持されるかどうかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。所望の精製された抗体生成物を得るための方法は、イオン交換クロマトグラフィーを含む。

＜実施例５＞
体細胞抗体生成細胞への再分化を伴う再プログラム化および遺伝子導入して生物学的抗体治療薬を生成するための成体（体細胞）抗体生成細胞の単離
抗体生成Ｂ細胞は、患者特異的製造細胞系を生成し、治療用抗体生物学的製剤を生成する目的のために、末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血細胞源から単離される。最高レベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を生成する細胞を選択するために、限界希釈法または細胞選別法が利用され得る。簡単な増殖の後、高Ｉｇ生成クローナル細胞は、標準的な再プログラム化法を使用して、多能性または前駆体状態に再プログラム化される。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物を形質導入される。遺伝子修飾後、多能性患者特異的細胞系は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（ＴＬＲ）の存在下での培養［Ｈａｙａｓｈｉ Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．“ＴＬＲ４ ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ： ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ”．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８４：４６６２−４６７２（２０１０）、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野に公知の他のＢ細胞成熟因子［Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ”．１０，Ｍａｙ ２００９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．５９８２−５９９３（２００９）、Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ”．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３９：９２−１０２（２００６）により成熟抗体生成Ｂ細胞に分化される。

治療用抗体の力価および親和性は、Ｌｉ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｖｉａ ａ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されるように、形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能であるか、抗体治療薬の事項の組成物の所有者により内密に維持されるかどうかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。

別の方法としては、多能性患者特異的幹細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．同上を参照）の存在下での培養、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野に公知の他のＢ細胞成熟因子により成熟抗体生成Ｂ細胞に分化される（Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．同上，およびＴｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．同上を参照）。治療用抗体の力価および親和性は、記載される形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．同上を参照）。

得られた患者特異的抗体生成細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物を形質導入される。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能であるか、抗体治療薬の事項の組成物の所有者により内密に維持されるかどうかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。

＜実施例６＞
高活性ＡＤＣＣ抗体生成のための患者特異的細胞系の生成
免疫グロブリンのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）翻訳後修飾は抗体依存細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）において重要であり、フコシル化されないＧｌｃＮａｃ残基はＦｃγ受容体に対して最高の親和性を有する。Ｍｏｒｉ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，５５：１０９−１１４（２００７）。

したがって、高レベルのＡＤＣＣを有する抗体治療薬が所望されるとき、適切なレベルでＧｌｃＮａｃを伝達し、ＧｌｃＮａｃをフコシル化しない患者特異的細胞系が望ましい。癌細胞は、高レベルのＧＭＤを発現することが知られており、したがって、癌幹細胞および多能性細胞は、類似する遺伝標識を有するため、多能性細胞も、翻訳後ＧｌｃＮａｃ結合に関与する酵素である高レベルのＧＭＤを発現することが推測され得る。正常な組織では、結腸および膵臓が最高レベルのＧＭＤを発現する。抗体をフコシル化する酵素に関与するＦＵＴ８の欠損は、リツキシマブまたはハーセプチン等の、有効性に関してＡＤＣＣ活性に依存する治療用抗体生成のための患者特異的幹細胞系において望ましいであろう。例えば、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞において生成されたモノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞を使用して生成された同じモノクローナル抗体よりＡＤＣＣ活性が５０倍高い。脂肪由来幹細胞および生殖細胞系ならびにＢ細胞リンパ腫は、平均レベルより高いＦＵＴ８を発現し、一方、造血性幹細胞（ＨＳＣ）、未成熟Ｂ細胞、正常な骨格筋は、平均より低いＦＵＴ８を発現する。

造血性幹細胞は、幹細胞動員剤による前処置を伴ってまたは伴わずに、標準的な方法により骨髄穿刺液から、または全血アフェレーシス法により単離される。単離したＨＳＣは、続いて前述のように多能性に再プログラム化される。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物を形質導入される。遺伝子導入後、多能性患者特異的細胞系は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、ｔｏｌｌ様受容体活性化（ＴＬＲ）の存在下での培養（Ｈａｙａｓｈｉ Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，同上を参照）、またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化，およびノッチ受容体リガンドファミリー活性化等の当該技術分野に公知の他のＢ細胞成熟因子により成熟抗体生成Ｂ細胞に分化される（Ｐａｌａｎｉｃｈａｍｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．同上，およびＴｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．同上を参照）。治療用抗体の力価および親和性は、記載される形態形成法等の方法を使用することにより改善され得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．同上を参照）。得られた発現抗体治療薬は、公的に入手可能であるか、抗体治療薬の事項の組成物の所有者により内密に維持されるかどうかに関わらず、現状技術のバイオテクノロジー法により処理され、精製される。

別の方法としては、抗体生成Ｂ細胞は、患者特異的製造細胞系を生成し、治療用抗体生物学的製剤を生成する目的のために、末梢血、骨髄、および他の容易に利用可能な造血細胞源から単離される。最高レベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を生成する細胞を選択するために、限界希釈法または細胞選別法が利用され得る。簡単な増殖の後、高Ｉｇ生成クローナル細胞は、標準的な再プログラム化法を使用して、多能性または前駆体状態に再プログラム化される。得られた患者特異的幹細胞は、標準的な技法および方法を使用して、所望の抗体遺伝子構築物を形質導入される。遺伝子修飾後、多能性患者特異的細胞系は、フコースが低い、またはそれを欠損する治療用抗体の生成ために、ＨＳＣ、未成熟Ｂ細胞、または骨格筋細胞に分化される。

本発明の好ましい実施形態が図示され、説明されてきたが、上述のように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができる。したがって、本発明の範囲は、好ましい実施形態の開示によって限定されない。代わりに、本発明は、続く特許請求の範囲を全面的に参照することにより決定されるべきである。

全血の勾配遠心分離から得られた層を示す。

本発明の好ましい実施形態が図示され、説明されてきたが、上述のように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができる。したがって、本発明の範囲は、好ましい実施形態の開示によって限定されない。代わりに、本発明は、続く特許請求の範囲を全面的に参照することにより決定されるべきである。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
組み換えポリペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、合成により生成した多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）または内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を、前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記幹細胞によって発現する条件下で、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸で遺伝子導入することを含み、前記ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣが動物の細胞から生成される、または単離される、方法。
［２］
前記ポリペプチドまたはタンパク質は、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、抗体もしくは抗体断片、αインターフェロン、インターフェロンα−２Ａおよび２Ｂ、βインターフェロン、成長ホルモン、抗血友病因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性受容体、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦα、インターロイキン２、β−グルコセレブロシダーゼもしくはその類似体、α１−プロテイナーゼ阻害剤、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼβ、ラロニダーゼ、グルコシダーゼα、サイロトロピンα、ならびにチモシンαからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］
前記抗体または抗体断片は、ターゲットに結合し、前記ターゲットは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、成長因子受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）分子、インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、γインターフェロン、核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）、およびＢｌｙｓからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［４］
前記可溶性受容体は、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、およびＢｌｙｓからなる群から選択されるターゲットに結合される、［１］に記載の方法。
［５］
前記遺伝子導入したｓｐＰＳＣの不死化をさらに含む、［１］に記載の方法。
［７］
前記遺伝子導入し、不死化したｓｐＰＳＣの分化を誘発することをさらに含む、［５］に記載の方法。
［８］
前記遺伝子導入したｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣの分化を誘発することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［９］
前記遺伝子導入し、分化した細胞を不死化することをさらに含む、［７］に記載の方法。
［１０］
前記ｓｐＰＳＣは、誘発された多能性幹細胞、体細胞核移植により生成された多能性幹細胞（ＳＣＮＴ多能性幹細胞）、改変核移植卵母細胞補助再プログラム化により生成された多能性幹細胞（ＡＮＴ−ＯＡＲ多能性幹細胞）、および単為生殖により生成された多能性幹細胞（ＰＧＡ多能性）からなる群から選択される、［１］に記載の方法。

Claims (9)

1. 組み換えポリペプチドまたはタンパク質を生成するための方法であって、合成により生成した多能性幹細胞（ｓｐＰＳＣ）または内因性多能性幹細胞（ｅＰＳＣ）を、前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記幹細胞によって発現する条件下で、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸で遺伝子導入することを含み、前記ｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣが動物の細胞から生成される、または単離される、方法。
2. 前記ポリペプチドまたはタンパク質は、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンビン、抗体もしくは抗体断片、αインターフェロン、インターフェロンα−２Ａおよび２Ｂ、βインターフェロン、成長ホルモン、抗血友病因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、可溶性受容体、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＧＦα、インターロイキン２、β−グルコセレブロシダーゼもしくはその類似体、α１−プロテイナーゼ阻害剤、フィブリン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼβ、ラロニダーゼ、グルコシダーゼα、サイロトロピンα、ならびにチモシンαからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体または抗体断片は、ターゲットに結合し、前記ターゲットは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、成長因子受容体、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）分子、インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、γインターフェロン、核因子カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）、およびＢｌｙｓからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記可溶性受容体は、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、およびＢｌｙｓからなる群から選択されるターゲットに結合される、請求項１に記載の方法。
5. 前記遺伝子導入したｓｐＰＳＣの不死化をさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記遺伝子導入し、不死化したｓｐＰＳＣの分化を誘発することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記遺伝子導入したｓｐＰＳＣまたはｅＰＳＣの分化を誘発することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記遺伝子導入し、分化した細胞を不死化することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ｓｐＰＳＣは、誘発された多能性幹細胞、体細胞核移植により生成された多能性幹細胞（ＳＣＮＴ多能性幹細胞）、改変核移植卵母細胞補助再プログラム化により生成された多能性幹細胞（ＡＮＴ−ＯＡＲ多能性幹細胞）、および単為生殖により生成された多能性幹細胞（ＰＧＡ多能性）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

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