JP2014082984A - 新規ｎｔｒｋ２活性化変異の検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異に基づくタンパク質を検出することによる、被験者における癌の存在を検出する方法、被験者における癌を診断する方法、当該変異陽性の癌患者を同定する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。
【解決手段】 被験者における癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
【選択図】なし
【解決手段】 被験者における癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ＮＴＲＫ２における活性化変異の存在を検出することによる、被験者における癌の存在を検出する方法に関する。
神経栄養因子受容体（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ；ＮＴＲＫ）は受容体型チロシンキナーゼの１種であり、ＮＴＲＫのリガンドとしては、ニューロトロフィンが知られている。ＮＴＲＫファミリーには、３つの受容体ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、及びＮＴＲＫ３の存在が知られている。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを有する膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインはリガンド結合部、ロイシンリッチ領域、システインリッチ領域及び２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＮＴＲＫは、ＮＴＲＫとニューロトロフィンの結合によって、細胞表面で起こる二量体化によって活性化される、単量体チロシンキナーゼ受容体である。ニューロトロフィンについては、４種の既知の因子が存在し、それぞれが１つ又は複数のＮＴＲＫと結合する能力を有する。ニューロトロフィンがＮＴＲＫに結合することで受容体チロシンキナーゼが活性化され、下流にシグナル伝達が行われる。ＮＴＲＫの発現部位や時期の差異によって、細胞分化や細胞増殖、生存などの複雑な生体機能を制御している。
ＮＴＲＫファミリーのうち、ヒトのＮＴＲＫ２遺伝子については現在までに５つのスプライシングバリアント（ＮＴＲＫ２遺伝子バリアントａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００６１８０．３）、バリアントｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１００７０９７．１）、バリアントｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１０１８０６４．１）、バリアントｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１０１８０６５．２）、バリアントｅ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１０１８０６６．２））の存在が知られている。バリアントａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはＮＴＲＫ２アイソフォーム１、２、３、４及び５をそれぞれコードする。ＮＴＲＫ２アイソフォーム１は全長８３８アミノ酸、アイソフォーム２は全長４７７アミノ酸、アイソフォーム３は全長８２２アミノ酸、アイソフォーム４は全長５５３アミノ酸、アイソフォーム５は全長５３７アミノ酸からなり、アイソフォーム１とアイソフォーム３は膜貫通ドメイン近傍の領域において異なるものの、細胞外ドメイン及び細胞内のキナーゼドメインにおいては同一のアミノ酸配列を有する。
受容体型チロシンキナーゼのキナーゼドメインは細胞内ドメインに存在し、種々の癌においてチロシンキナーゼドメインにおける点変異がチロシンキナーゼの恒常的な活性化を引き起こし、癌化に関与していることが確認されている。ＮＴＲＫ２については、肺癌や大腸癌、皮膚癌、卵巣癌において１９カ所の点変異が認められることが報告されている（非特許文献１、２、３）。
しかし、これまでに癌化の原因となるＮＴＲＫ２の恒常的活性化の要因となる点変異（活性化変異）は見出されていない。
「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、(米国)、２０１１年、１７巻、ｐ．２６３８−２６４５）」
「プロス ワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）、(米国)、２０１１年、Ｖｏｌｕｍｅ ６、Ｉｓｓｕｅ ２、e１６８７１」
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、(英国)、２０１１年、Ｖｏｌ ４７４、ｐ．６０９−６１５）」
癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異を有するタンパク質を検出することによる、被験者における癌の存在を検出する方法、被験者における癌を診断する方法、当該変異陽性の癌患者を同定する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。
本発明者らは、癌の原因となる受容体型チロシンキナーゼにおける活性化変異を同定すべく創意検討を行った結果、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）のチロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異がＮＴＲＫ２の活性化変異であることを同定した。当該変異は卵巣癌の臨床検体から網羅的に同定された変異の１つ（ＮＴＲＫ２＿Ｒ６９１Ｃ：非特許文献３）であるが、これまでに本変異が活性化変異であることは確認されていない。当該変異は、ＮＴＲＫ２において初めて同定された活性化変異である。本発明者は、この知見から、当該ＮＴＲＫ２遺伝子の活性化変異の存在を検出することによる癌の検出法を構築し、そのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供し、当該活性化変異を検出することにより、ＮＴＲＫ２阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］被験者における癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、［１］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。
［３］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。
［４］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［５］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［６］前記変異がＮＴＲＫ２アイソフォーム１の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異である、［２］に記載の方法。
［７］前記変異が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異である、［６］に記載の方法。
［８］ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］に記載の方法。
［９］配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記変異がＮＴＲＫ２アイソフォーム３の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異である、［２］に記載の方法。
［１１］前記変異が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異である、［１０］に記載の方法。
［１２］ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［１０］に記載の方法。
［１３］配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［１５］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［１６］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記癌が卵巣癌である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１］被験者における癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、［１］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。
［３］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。
［４］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［５］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［６］前記変異がＮＴＲＫ２アイソフォーム１の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異である、［２］に記載の方法。
［７］前記変異が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異である、［６］に記載の方法。
［８］ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］に記載の方法。
［９］配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記変異がＮＴＲＫ２アイソフォーム３の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異である、［２］に記載の方法。
［１１］前記変異が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異である、［１０］に記載の方法。
［１２］ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［１０］に記載の方法。
［１３］配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［１５］下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［１６］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記癌が卵巣癌である、［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［１８］〜［２２］に関する。
［１８］被験者における癌を診断する方法であって、前記［１］〜［１５］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［１９］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１８］に記載の方法。
［２０］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］前記癌が卵巣癌である、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２２］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が卵巣癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２１］に記載の方法。
［１８］被験者における癌を診断する方法であって、前記［１］〜［１５］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［１９］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１８］に記載の方法。
［２０］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］前記癌が卵巣癌である、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２２］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が卵巣癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２１］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［２３］〜［２６］に関する。
［２３］ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［１］〜［１５］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［２４］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２３］に記載の方法。
［２５］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［２３］又は［２４］に記載の方法。
［２６］前記癌が卵巣癌である、［２３］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２３］ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［１］〜［１５］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［２４］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２３］に記載の方法。
［２５］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［２３］又は［２４］に記載の方法。
［２６］前記癌が卵巣癌である、［２３］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［２７］〜［２９］に関する。
［２７］被験者における癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［２８］以下の（１）及び（２）からなる群より選択される、［２７］に記載のプライマーセット。
（１）配列番号１の塩基番号１から２０７０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２０７２から２５１７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から２０２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０２４から２４６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［２９］前記癌が卵巣癌である、［２７］又は［２８］に記載のプライマーセット。
［２７］被験者における癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［２８］以下の（１）及び（２）からなる群より選択される、［２７］に記載のプライマーセット。
（１）配列番号１の塩基番号１から２０７０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２０７２から２５１７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から２０２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０２４から２４６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［２９］前記癌が卵巣癌である、［２７］又は［２８］に記載のプライマーセット。
また、本発明は、以下の［３０］〜［３１］に関する。
［３０］被験者における癌の存在を検出するためのプローブであって、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［３１］前記癌が卵巣癌である、［３０］に記載のプローブ。
［３０］被験者における癌の存在を検出するためのプローブであって、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［３１］前記癌が卵巣癌である、［３０］に記載のプローブ。
また、本発明は、以下の［３２］〜［３３］に関する。
［３２］被験者における癌の存在を検出するための検出用キットであって、前記［２７］又は［２８］に記載のプライマーセット或いは前記［３０］に記載のプローブの少なくとも１つを含む、検出用キット。
［３３］前記癌が卵巣癌である、［３２］に記載の検出用キット。
［３２］被験者における癌の存在を検出するための検出用キットであって、前記［２７］又は［２８］に記載のプライマーセット或いは前記［３０］に記載のプローブの少なくとも１つを含む、検出用キット。
［３３］前記癌が卵巣癌である、［３２］に記載の検出用キット。
また、本発明は、以下の［３４］〜［４１］に関する。
［３４］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［２７］又は［２８］に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
［３５］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３４］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［３６］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３４］又は［３５］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［３７］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［３０］に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
［３８］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３７］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［３９］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３７］又は［３８］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［４０］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［３４］〜［３９］のいずれかに記載の方法。
［４１］前記癌が卵巣癌である、［３４］〜［４０］のいずれかに記載の方法。
［３４］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［２７］又は［２８］に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
［３５］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３４］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［３６］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３４］又は［３５］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。
［３７］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［３０］に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
［３８］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３７］に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［３９］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３７］又は［３８］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。
［４０］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［３４］〜［３９］のいずれかに記載の方法。
［４１］前記癌が卵巣癌である、［３４］〜［４０］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［４２］〜［４６］に関する。
［４２］被験者における癌を診断する方法であって、前記［３４］〜［３９］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４３］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４２］に記載の方法。
［４４］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４２］又は［４３］に記載の方法。
［４５］前記癌が卵巣癌である、［４２］又は［４３］に記載の方法。
［４６］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が卵巣癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４５］に記載の方法。
［４２］被験者における癌を診断する方法であって、前記［３４］〜［３９］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４３］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４２］に記載の方法。
［４４］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４２］又は［４３］に記載の方法。
［４５］前記癌が卵巣癌である、［４２］又は［４３］に記載の方法。
［４６］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が卵巣癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４５］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［４７］〜［５０］に関する。
［４７］ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［３４］〜［３９］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４８］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４７］に記載の方法。
［４９］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［４７］又は［４８］に記載の方法。
［５０］前記癌が卵巣癌である、［４７］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
［４７］ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［３４］〜［３９］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４８］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４７］に記載の方法。
［４９］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［４７］又は［４８］に記載の方法。
［５０］前記癌が卵巣癌である、［４７］〜［４９］のいずれかに記載の方法。
また、本発明は、以下の［５１］〜［５３］に関する。
［５１］試験物質が、ＮＴＲＫ２チロシンキナーゼドメインにおける１３８番目のアルギニンからシステインへの変異を有するＮＴＲＫ２変異体ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害するか否かを評価する工程を包含する、癌治療剤のスクリーニング方法。
［５２］前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害する物質を選択する工程を包含する、［５１］に記載の方法。
［５３］前記癌が卵巣癌である、［５１］又は［５２］に記載の方法。
［５１］試験物質が、ＮＴＲＫ２チロシンキナーゼドメインにおける１３８番目のアルギニンからシステインへの変異を有するＮＴＲＫ２変異体ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害するか否かを評価する工程を包含する、癌治療剤のスクリーニング方法。
［５２］前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害する物質を選択する工程を包含する、［５１］に記載の方法。
［５３］前記癌が卵巣癌である、［５１］又は［５２］に記載の方法。
また、本発明は、以下の［５４］に関する。
［５４］ＮＴＲＫ２阻害剤を患者に投与する工程を包含する癌の治療方法であって、該患者が前記［２３］〜［２６］及び［４７］〜［５０］のいずれかに記載の方法によって同定された患者である方法。
［５４］ＮＴＲＫ２阻害剤を患者に投与する工程を包含する癌の治療方法であって、該患者が前記［２３］〜［２６］及び［４７］〜［５０］のいずれかに記載の方法によって同定された患者である方法。
本発明の方法は、被験者における癌（特には卵巣癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の方法によれば、癌患者（特には卵巣癌患者）に対してＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であるか否かを鑑別することができる。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。
《本発明の検出方法》
本発明の方法の１つは、被験者における癌の存在を検出する方法であり、該方法は、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）のチロシンキナーゼドメインにおける１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を含む。
本発明の方法の１つは、被験者における癌の存在を検出する方法であり、該方法は、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）のチロシンキナーゼドメインにおける１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を含む。
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好適には生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
現在まで、ＮＴＲＫ２には５つのアイソフォーム、アイソフォーム１、２、３、４及び５が存在することが知られている。ＮＴＲＫ２アイソフォーム１は全長８３８アミノ酸からなるＮＴＲＫ２であり、例えば、野生型のＮＴＲＫ２アイソフォーム１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＮＴＲＫ２アイソフォーム３は全長８２２アミノ酸からなるＮＴＲＫ２であり、例えば、野生型のＮＴＲＫ２アイソフォーム３は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＮＴＲＫ２のアイソフォーム１及び３は、その細胞内領域において共通のチロシンキナーゼドメインを有する。本明細書中で使用される場合、ＮＴＲＫ２のチロシンキナーゼドメインとは、ＮＴＲＫ２アイソフォーム１のアミノ酸第５５４〜８２３位、アイソフォーム３のアミノ酸第５３８〜８０７位にそれぞれ対応する、２７０アミノ酸からなる領域を意味する。野生型のＮＴＲＫ２アイソフォーム１及び３のチロシンキナーゼドメインは、どちらも同じく配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。
本発明の方法における検出対象となる変異（「検出対象変異」とも称する）は、ＮＴＲＫ２のチロシンキナーゼドメイン内の変異であり、具体的には、ＮＴＲＫ２のチロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニン（Ｒ）からシステイン（Ｃ）への変異（本明細書中、本変異をＲＣ−ＮＴＲＫ２とも称する）である。本検出対象変異の代表的な例としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異が挙げられる。本検出対象変異は、ＮＴＲＫ２遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における変異に起因し、従って、本発明の方法において遺伝子変異の存在を検出してもよい。このような遺伝子変異の代表的な例としては、配列番号９に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の４１２番目のシトシンからチミンへの変異が挙げられる。
前述の検出対象変異は、ＮＴＲＫ２アイソフォーム１においては６９１番目のアルギニンからシステインへの変異に対応し、ＮＴＲＫ２アイソフォーム３においては６７５番目のアルギニンからシステインへの変異に対応する。また、これらの変異にそれぞれ対応するＮＴＲＫ２遺伝子における変異としては、ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異、ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異が挙げられる。
本発明の方法における検出対象変異のより具体的な例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異が挙げられる。また、これらに対応するＮＴＲＫ２遺伝子における変異の例としては、配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異、配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異が挙げられる。
本発明の方法においては、検出対象変異を有するタンパク質（「変異型タンパク質」とも称する）又は検出対象変異を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（「変異型ポリヌクレオチド」とも称する）のいずれを検出対象としてもよい。変異型タンパク質の例としては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、変異型ポリヌクレオチドの例としては、配列番号５又は配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の検出方法において変異型ポリヌクレオチドの存在を検出する場合、本検出工程は、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異型ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異型ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。
本検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、本検出工程は、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ ＴＭＡ ｓｙｓｔｅｍ）等）を用いて、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域（「検出対象変異領域」とも称する）を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。
前述の核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異型ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ−ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行うと、伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解され、それにより蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質から蛍光が発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異を反映する。
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。
当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
本発明の検出方法においては、被験者から得た試料中の変異型タンパク質の存在を検出してもよく、例えば、変異型タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施できる。このような抗体の作製及び抗体を用いたタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。
本発明の検出方法において、検出対象変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者が癌（特には卵巣癌）に罹患している可能性が高いと判定できる。
本発明の方法における検出工程は、被験者における癌（特には卵巣癌）の診断方法にも使用することができる。本発明の診断方法は、当該検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者が癌（特には卵巣癌）に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。また、当該検出工程は、ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者（卵巣癌などの癌患者）を同定する方法にも使用することができる。本発明の同定方法は、当該検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者がＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程を含んでもよい。
《本発明のプライマーセット、プローブ、検出用キット》
本発明のプライマーセットは、被験者における癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
本発明のプライマーセットは、被験者における癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。
本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下（１）及び（２）から選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から２０７０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２０７２から２５１７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から２０２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０２４から２４６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（１）配列番号１の塩基番号１から２０７０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号２０７２から２５１７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から２０２２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２０２４から２４６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
より好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号９に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の４１２番目の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含み、具体的な態様としては、以下に示すプライマーセットが挙げられる：
配列番号９の塩基番号１から４１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号９の塩基番号４１３から８１０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
配列番号９の塩基番号１から４１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号９の塩基番号４１３から８１０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
本発明のプライマーセットは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、本発明のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含んでもよい。
本発明のプローブは、被験者における癌の存在を検出するためのプローブであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域にハイブリダイズすることができるように設計したプローブである。本発明のプローブは、変異型ポリヌクレオチド又はその相補鎖中の検出対象変異領域にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
好ましくは、本発明のプローブは、配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異を含む領域にハイブリダイズするように設計される。
本発明のプローブは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、被験者から得た試料中の核酸に本発明のプローブをハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。
前記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマー及びプローブは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
本発明のプライマーセット及びプローブは、例えば、化学合成法によって当業者に容易に製造することができ、また、検出方法に応じて、蛍光標識等で標識化してもよい。
本発明の検出用キットは、被験者における癌の存在を検出するためのキットであり、好ましくは、本発明のプライマーセット又は本発明のプローブの少なくとも１つを含む。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、前述の本発明の方法において使用することもできる。例えば、本発明の検出方法は、本発明のプライマーセットを用いて検出対象変異領域を増幅する工程を含んでもよく、本発明のプローブを検出対象変異領域にハイブリダイズさせる工程を含んでよい。
《本発明のスクリーニング方法》
本発明はまた、前記ＮＴＲＫ２変異体を使用する癌（例えば卵巣癌）治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、前記ＮＴＲＫ２変異体を使用する癌（例えば卵巣癌）治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
例えば、本発明のスクリーニング方法は、前記ＮＴＲＫ２変異体（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）に試験物質を接触させ、その活性が阻害されるか否かを分析するか、又は前記ＮＴＲＫ２変異体を発現する細胞に試験物質を接触させ、その活性又は発現が阻害されるか否かを分析することによって実施することができる。本発明のスクリーニング方法はさらに、当該ＮＴＲＫ２変異体ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害する物質を選択する工程を包含してもよい。前記ＮＴＲＫ２変異体の活性（即ち自己リン酸化活性）が阻害されたか否かは、試験物質を接触させたＮＴＲＫ２変異体のチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定でき、これは、当該分野で公知のアッセイ方法を用いて実施可能である。また、ＮＴＲＫ２変異体の発現が阻害されたか否かは、試験物質を接触させたＮＴＲＫ２変異体を発現する細胞におけるｍＲＮＡ又は蛋白質の発現を抑制するか否かにより分析することにより判定でき、これは、定量的ＰＣＲ法やＥＬＩＳＡ法などの当該分野で公知の方法を用いて実施可能である。あるいは、前記ＮＴＲＫ２変異体を発現する細胞をヌードマウスに接種し、該マウスに試験物質を投与した場合の、腫瘍増殖に対する阻害作用を確認してもよい。
《本発明の治療方法》
本発明の治療方法は、ＮＴＲＫ２変異体陽性の癌患者にＮＴＲＫ２阻害剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法である。本発明の治療方法において、前述の方法を用いて、ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象と同定された患者を治療することができる。
本発明の治療方法は、ＮＴＲＫ２変異体陽性の癌患者にＮＴＲＫ２阻害剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法である。本発明の治療方法において、前述の方法を用いて、ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象と同定された患者を治療することができる。
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
［実施例１］ 野生型及び変異体ＮＴＲＫ２のクローニング
ＲＣ−ＮＴＲＫ２変異を含むＮＴＲＫ２変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、野生型ＮＴＲＫ２（アイソフォーム３）をクローニングした。配列番号１１（制限酵素サイトとして、ＢａｍＨＩを含む）及び配列番号１２（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）のプライマーにて、全長ＮＴＲＫ２（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ，Ｗｈｏｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から得た）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３と命名）。
ＲＣ−ＮＴＲＫ２変異を含むＮＴＲＫ２変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、野生型ＮＴＲＫ２（アイソフォーム３）をクローニングした。配列番号１１（制限酵素サイトとして、ＢａｍＨＩを含む）及び配列番号１２（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）のプライマーにて、全長ＮＴＲＫ２（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ，Ｗｈｏｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から得た）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３と命名）。
次に、ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を鋳型に、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社）にて、ＲＣ変異（Ｒ６７５Ｃ）を導入した（Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３と命名）。作製したＮＴＲＫ２変異体（Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２）の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。
［実施例２］ ＲＣ−ＮＴＲＫ２が活性化変異体であることの確認
上記ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３をそれぞれ１００ｎｇ、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。翌日、ＳＤＳサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。抗リン酸化ＮＴＲＫ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）及び抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）にて検出した結果、ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３に比べてＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を導入したＨＥＫ２９３細胞では、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進及びＥＲＫ１／２のリン酸化亢進が認められた。また、下記で樹立したＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３においても野生型ＮＴＲＫ２と比べ、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進が認められた。以上よりＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２が活性化変異であることが示された。
上記ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３をそれぞれ１００ｎｇ、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。翌日、ＳＤＳサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。抗リン酸化ＮＴＲＫ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）及び抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）にて検出した結果、ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３に比べてＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を導入したＨＥＫ２９３細胞では、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進及びＥＲＫ１／２のリン酸化亢進が認められた。また、下記で樹立したＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３においても野生型ＮＴＲＫ２と比べ、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進が認められた。以上よりＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２が活性化変異であることが示された。
［実施例３］ 野生型及び変異体ＮＴＲＫ２のレトロウイルス発現ベクターの作製及び安定発現細胞株の樹立
ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化したレトロウイルス発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）。同様の手法にて、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３からレトロウイルス発現ベクター（Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）を構築した。
ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化したレトロウイルス発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）。同様の手法にて、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３からレトロウイルス発現ベクター（Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）を構築した。
上記ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏをそれぞれ９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｅ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レトロウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）及びＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社）１．５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに１週間培養を続け、野生型ＮＴＲＫ２及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２をそれぞれ安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（それぞれ、ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。
［実施例４］ ＲＣ−ＮＴＲＫ２の足場非依存的増殖亢進作用の検討
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、親株ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３をそれぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）、３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。足場非依存性増殖アッセイを行った結果、Ｄａｙ３及びＤａｙ７においてＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３は親株ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に比べて足場非依存性増殖能の亢進が確認された。以上から、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなり、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２は癌の原因遺伝子であることが示された。
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、親株ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３をそれぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）、３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。足場非依存性増殖アッセイを行った結果、Ｄａｙ３及びＤａｙ７においてＲ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３は親株ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＴＲＫ２／ＮＩＨ３Ｔ３細胞に比べて足場非依存性増殖能の亢進が確認された。以上から、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなり、Ｒ６７５Ｃ−ＮＴＲＫ２は癌の原因遺伝子であることが示された。
［実施例５］ 野生型及び変異体ＮＴＲＫ２ｖ１のクローニング
ＲＣ−ＮＴＲＫ２変異を含むＮＴＲＫ２変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、野生型ＮＴＲＫ２（アイソフォーム１）（ＮＴＲＫ２ｖ１とも称する）をクローニングした。配列番号１１（制限酵素サイトとして、ＢａｍＨＩを含む）及び配列番号１５のプライマーを用いて、ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）により末端をリン酸化した（核酸断片１と命名）。また、配列番号１６及び配列番号１２（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）を用いてＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（前述）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った後、本ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（前述）により末端をリン酸化した（核酸断片２と命名）。核酸断片１と核酸断片２をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３と命名）。
ＲＣ−ＮＴＲＫ２変異を含むＮＴＲＫ２変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、野生型ＮＴＲＫ２（アイソフォーム１）（ＮＴＲＫ２ｖ１とも称する）をクローニングした。配列番号１１（制限酵素サイトとして、ＢａｍＨＩを含む）及び配列番号１５のプライマーを用いて、ＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）により末端をリン酸化した（核酸断片１と命名）。また、配列番号１６及び配列番号１２（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）を用いてＮＴＲＫ２／ｐｃＤＮＡ３を鋳型にＤＮＡポリメラーゼ（前述）を用いてＰＣＲ（９８℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２分を１８サイクル）を行った後、本ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（前述）により末端をリン酸化した（核酸断片２と命名）。核酸断片１と核酸断片２をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３と命名）。
次に、ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３を鋳型に、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社）にて、ＲＣ変異（Ｒ６９１Ｃ）を導入した（Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３と命名）。作製したＮＴＲＫ２変異体（Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１）の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示す。
［実施例６］ 野生型及び変異体ＮＴＲＫ２ｖ１のレトロウイルス発現ベクターの作製及び安定発現細胞株の樹立
ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化したレトロウイルス発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）。同様の手法にて、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３からレトロウイルス発現ベクター（Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）を構築した。
ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ消化したレトロウイルス発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）。同様の手法にて、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐｃＤＮＡ３からレトロウイルス発現ベクター（Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏと命名）を構築した。
上記ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏをそれぞれ９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｅ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レトロウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）及びＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社）１．５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに１週間培養を続け、野生型ＮＴＲＫ２ｖ１及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１をそれぞれ安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（それぞれ、ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。
［実施例７］ Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１の足場非依存的増殖亢進作用の検討
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３をそれぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。また、比較コントロールとしてｐＭＸｓ−ｐｕｒｏベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３を同様に播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）、３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。足場非依存性増殖アッセイを行った結果、Ｄａｙ３及びＤａｙ７においてＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３は比較コントロールであるＮＩＨ３Ｔ３及びＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３に比べて足場非依存性増殖能の亢進が確認された。以上から、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなり、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１は癌の原因遺伝子であることが示された。
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３をそれぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。また、比較コントロールとしてｐＭＸｓ−ｐｕｒｏベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３を同様に播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）、３日後（Ｄａｙ３）、７日後（Ｄａｙ７）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。足場非依存性増殖アッセイを行った結果、Ｄａｙ３及びＤａｙ７においてＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３は比較コントロールであるＮＩＨ３Ｔ３及びＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３に比べて足場非依存性増殖能の亢進が確認された。以上から、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなり、Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１は癌の原因遺伝子であることが示された。
［実施例８］ Ｒ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１が活性化変異体であることの確認
上記で樹立したＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３を１ウェル当たり１×１０6個となるように６ウェルプレートに１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。また、コントロールとしてｐＭＸｓ−ｐｕｒｏベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３を同様に播種した。翌日、細胞をＳＤＳサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。ＮＴＲＫ２の活性化の指標となる抗リン酸化ＮＴＲＫ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）にて検出した結果、ＮＴＲＫ２ｖ１に比べてＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１では、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進が認められた。以上よりＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１が活性化変異であることが示された。
上記で樹立したＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３及びＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１／ＮＩＨ３Ｔ３を１ウェル当たり１×１０6個となるように６ウェルプレートに１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。また、コントロールとしてｐＭＸｓ−ｐｕｒｏベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３を同様に播種した。翌日、細胞をＳＤＳサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。ＮＴＲＫ２の活性化の指標となる抗リン酸化ＮＴＲＫ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｌｙ社）にて検出した結果、ＮＴＲＫ２ｖ１に比べてＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１では、ＮＴＲＫ２の自己リン酸化の亢進が認められた。以上よりＲ６９１Ｃ−ＮＴＲＫ２ｖ１が活性化変異であることが示された。
本発明の方法は、被験者における癌（特には卵巣癌）の検出及び診断、並びにＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者の同定に有用である。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。本発明のスクリーニング方法は、癌治療剤のスクリーニングに有用である。本発明の治療方法は、前記ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者における癌の治療に有用である。
Claims (11)
- 被験者における癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、神経栄養因子受容体２（ＮＴＲＫ２）チロシンキナーゼドメインの１３８番目のアルギニンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
- 前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。 - 前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６９１番目のアルギニンからシステインへの変異；又は
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＮＴＲＫ２の６７５番目のアルギニンからシステインへの変異。 - 下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）ＮＴＲＫ２アイソフォーム１遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）ＮＴＲＫ２アイソフォーム３遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。 - 下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。 - 下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目の塩基を含む領域。 - 下記（１）乃至（２）に記載のＮＴＲＫ２遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０７１番目のシトシンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＮＴＲＫ２遺伝子の２０２３番目のシトシンからチミンへの変異。 - 前記被験者から試料を得る工程を包含する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が卵巣癌である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 被験者における癌を診断する方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
- ＮＴＲＫ２阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、請求項１〜７のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
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