JP2014057601A

JP2014057601A - 分子解析のための装置及び方法

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Publication number: JP2014057601A
Application number: JP2013252968A
Authority: JP
Inventors: Turner Stephen; ターナー，スティーブン; Jonas Korlach; コーラッハ，ヨナス
Original assignee: Pacific Biosciences of California Inc
Current assignee: Pacific Biosciences of California Inc
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2013-12-06
Publication date: 2014-04-03
Anticipated expiration: 2025-09-16
Also published as: US20060062531A1; US20060061754A1; WO2006044078A3; JP2016154560A; EP1790202A4; GB2423819A; GB2423819B; AU2005296200A1; CA2579150C; WO2006044078A2; EP3415641B1; US7302146B2; US20060063264A1; CN101914620B; CA2579150A1; AU2005296200B2; US7476503B2; EP3415641A1; JP2008513782A; EP1790202A2

Abstract

【課題】光閉じ込め4 x 10⁴/mm²超、好ましくは10⁵/mm²超の表面密度を有する光閉じ込めのアレイを提供すること。
【解決手段】本発明は、光閉じ込め、それらの製造法、及び分子を解析し及び/又は化学反応を監視するためにそれらを使用する方法に関する。本発明で具体化される装置及び方法は、ハイ-スループット及び低コスト単一分子分析に特に有用である。
【選択図】なし

Description

関連出願に関する相互参照
本願は、本明細書にその全体が全ての目的のために引用される、係属中である、2004年9月17日に出願された米国実用特許出願10/944,106の部分継続である。本願は、各々、全ての目的のために本明細書に引用される、2005年1月31日、2005年2月9日に出願された米国仮出願番号60/649,009及び60/651,846の優先権も請求する。

発明の背景
照射及びシグナル検出の閉じ込めは、蛍光相関分光法(FCS)の適用から、分子的診断における重要なツールとして長く認識されてきた。FCSは、フルオロフォア-標識分子を含む試料体積の照射、及び当該分子が有効観察体積に拡散したり有効観察体積から出たり時の、当該分子によって生成される蛍光シグナルのバラツキの検出を含む。観察下の体積が少数の蛍光分子のみを含む場合及びバックグランドシグナルが低い場合、蛍光強度のバラツキは、最も良く分析できる。これは、劇的に制限された観察体積と低試料濃度との組み合わせによって達成できる。典型的なFCSの検出体積は、約0.5フェトリットル（又は0.5 x 10^-15リットル)であり、ぴったりとレーザービームに焦点を合わせるための高開口数顕微鏡対物レンズの使用により達成される。この検出体積において、単一分子は、最高約1ナノモーラーの濃度の溶液で観察できる。この濃度範囲は、典型的にマイクロモーラー範囲で又は上記のマイクロモーラー範囲である反応定数を有する、ほとんどの生化学的反応には許容されないほど低い。より低濃度では、これらの反応は、許容される速さで進行しないか、又はほとんどの分析で有用である形式とは定量的に異なった形式で進行する。単一分子をより高い、より関連する濃度で観察するために、観察体積は、典型的には、かなり小体積に限定される必要がある。

近年、ナノファブリケーション技術の進歩は、電子的、光学的、化学的及び/又は機械的要素と結合されるナノスケール装置の製造を可能にした。

しかしながら、より生物的又は診断的に関連する条件下で単一分子反応を観察する能力を提供するために、より迅速、より安価かつより正確性が強い化学的及び生物的分析の相当の要求が依然として存在する。また、より高濃度での単一-分子分析を受けやすい光閉じ込めを提供することによってこれらの目的を助けることができる、小さな、大量生産型のかつ使い捨て装置の要求が存在する。本発明は、これらの要求を満足し、同時に関連する利益を提供する。

発明の要約
本発明の主な局面は、分子を特徴づけ及び/又は化学反応を監視するための光学システム及び方法のデザインである。本発明の装置及び方法は、特に単一-分子分析に適している。

従って、本発明は、光閉じ込め4 x 10⁴/mm²超、好ましくは10⁵/mm²超の表面密度を有する光閉じ込めのアレイを提供する。1つの局面では、アレイの個々の閉じ込めは、1ナノリットル(10 x^-9リットル)未満、1ピコリットル未満、又は1フェトリットル未満、好ましくはゼプトリットルのオーダーでの有効観察体積を提供する。他の局面では、個々の閉じ込めの各々は、1000ゼプトリットル、100ゼプトリットル、80ゼプトリットル、又は50ゼプトリットル未満、又は更に10ゼプトリットル未満である有効観察体積を提供する。

他の局面では、個々の閉じ込めの各々は、１ナノモーラー超、又は100ナノモーラー超又はマイクロモーラーの範囲のオーダーの濃度で存在する個々の分子の分離を許容する有効観察体積を与える。ある好ましい局面では、個々の閉じ込めの各々は、生理的に関連する濃度、例えば約1マイクロモーラー超、又は50マイクロモーラー超又は更に100マイクロモーラー超の濃度、で存在する個々の分子の分離を許容する有効観察体積を与える。アレイは、ゼロ-モード導波路又は他のナノスケールの光学構造体を含んでもよい。光閉じ込めのアレイは、上記の有効観察体積を与えない又は個々の分子の分離を許容しない他のアレイの閉じ込めを更に含んでもよい。例えば、光閉じ込めのアレイは、マイクロタイタープレートと結合されてもよく又は当該プレート内に一体化されてもよく、そこでは、光閉じ込めの各々のアレイは、複数ウェル反応プレート上のいくつかの異なったウェル内に配置されてもよい。光閉じ込めのアレイは、少なくとも約2 x 10⁵の光閉じ込め、又は少なくとも約10⁶、又は少なくとも約10⁷の光閉じ込めを含んでもよい。

別の実施態様では、本発明は、前記の性質を有する複数の光閉じ込めをつくる方法を提供する。当該方法は、(a) 基板を提供し; (b) 閉じ込め4 x 10⁴/mm²超の表面密度を有する光閉じ込めのアレイを形成し、ここで個々の閉じ込めは、以下を含むゼロ-モード導波路を含む：コアを取り囲む外装材、当該外装材はゼロ-モード導波路のコアを介して縦方向にカットオフ波長よりも長い波長の電磁エネルギーの伝達を除くように構築される；並びに、(c) カットオフ周波数未満の周波数の電磁放射線でアレイを照射し、それによって複数の光閉じ込めをつくること、のステップを含む。

別の実施態様では、本発明は、個々の分子の分離を許容する光学観察体積をつくる方法を提供する。当該方法は、コアを取り囲む外装材を含むゼロ-モード導波路を提供する。
当該外装材は、ゼロ-モード導波路のコアを介して縦方向にカットオフ波長未満の波長の電磁気エネルギーの伝達を除くように構成され、その際に、カットオフ波長未満の波長の電磁気的放射でゼロ-モード導波路を照射し、ゼロ-モード導波路は、個々の分子の分離を許容する有効観察体積を与える。ある局面では、有効観察体積は、ナノリットル（(10^-9リットル）未満、1ピコリットル未満、又は1フェトリットル未満、好ましくはゼプトリットルのオーダーである。本発明のゼロ-モード導波路を用いて、典型的には、100ゼプトリットル（100 x 10^-21リットル）未満又は50ゼプトリットル又は更に10ゼプトリットルの有効観察体積を得ることができる。他の局面では、1ナノモーラー超、より一般的には100ナノモーラー超、好ましくはマイクロモーラーの範囲のオーダーの濃度で存在する個々の分子の分離を許容する有効観察体積を与える。好ましい実施態様では、約5マイクロモーラー超、7.5マイクロモーラー超又は更に50マイクロモーラー超の範囲の濃度で存在する個々の分子は、本発明の方法により分離することができる。

本発明はまた、複数の分子間の相互作用を検出する方法を提供する。当該方法は、(a) 複数の分子をゼロ-モード導波路のアレイに極めて接近して置く、ここでアレイ内の個々の導波路は、入射波長でアレイを照射する際に複数の回折オーダーでの検出可能な回折散乱強度を与えるために十分な距離によって分離される；(b) 入射波長でゼロ-モード導波路のアレイを照射し；並びに(c) 複数の回折オーダーでの入射波長の回折散乱強度における変化を検出し、それによって複数の分子間の相互作用を検出すること、を含む。

本発明はまた、入射波長で光閉じ込めのアレイを照射する際に分散する回折を減らす方法を提供する。ここで、当該アレイは、少なくとも第一の光閉じ込め及び第二の光閉じ込めを含み、当該方法は、光閉じ込めのアレイを形成すること、ここで、入射波長による照射の際に、第一の光閉じ込めから所定の角度で得られる回折散乱強度が、第一の光閉じ込めが光閉じ込めの非存在下で同一の入射波長で照射される場合よりも低いような距離で、光閉じ込めが第二の光閉じ込めから分離される、を含む。好ましい局面では、前記の光閉じ込めはゼロ-モード導波路である。

本発明はまた、閉じ込め4 x 10⁴/mm²の基板密度、又は本明細書に記載の他の任意の密度もしくはその等価の値を有する光閉じ込めのアレイを用いて、生物検体を検出する方法を含む。当該方法は、典型的には、検体を含むと予測されるアレイ内の少なくとも1つの光閉じ込めを入射光ビームで照射することを含む。本発明はまた、複数の化学反応を実行するための、閉じ込め4 x 10⁴/mm²の基板密度、又は本明細書に記載の他の任意の密度もしくはその等価の値を有する光閉じ込めのアレイを用いる方法を提供する。当該方法は、標識反応物を含む複数の反応試料をアレイ内の光閉じ込め内に置き、ここで別個に反応試料はアレイ内の異なった閉じ込めに置かれる；化学反応生成物の形成に好適な条件にアレイを供し；並びに光学システムで当該生成物の形成を検出する、ステップを含む。

加えて、本発明は、複数の標的核酸分子をシーケンスする方法を提供する。当該方法は、典型的には、(a) 閉じ込め4 x 10⁴/mm²の基板密度、又は本明細書に記載の他の任意の密度もしくはその等価値を有する光閉じ込めのアレイを提供する、ここで、当該光閉じ込めは、個々の分子の観察を許容する有効観察体積、及び閉じ込めの有効観察体積からのシグナルを検出する光閉じ込めに作動的に結合した光装置を提供する；(b) 複数の標的核酸分子、標的核酸分子に相補的なプライマー、重合酵素、及び複数の新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるべき1種以上のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを、光閉じ込め内で混合する、ここで各鎖は各々の標的核酸分子に相補的である；(c) ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの鋳型-指示重合による新生ヌクレオチド鎖の形成に好適な条件下で、重合反応にステップ(b)の混合物を供し；(d) 入射光ビームで光閉じ込めを照射し；並びに(e) 各々の新生ヌクレオチド鎖内に取り込まれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを同定すること、を含む。

本発明はまた、約0.0001超の充填率を有する固体支持体上に導波路のアレイを含む装であって、当該導波路は、生物試薬を維持するために好適であり、導波路は、当該生物試薬中に存在する個々の分子の観察を許容する有効観察体積を提供する、前記装置を提供し；及び、例えば有効観察体積からのシグナルを検出することにより当該導波路中の個々の分子を検出する光学システムを提供する。1つの局面において、アレイは、約0.001超の充填率を有する。別の局面では、アレイは、約0.01超の充填率を有し、ある例では0.1超、又は約0.001〜約0.1の範囲内の充填率を有する。

本発明はまた、かかる高充填率アレイを用いる様々な方法を提供する。1つの実施態様では、本発明は、生物検体を検出する方法を提供する。当該方法は、(a) 約0.0001超の充填率を有するアレイを提供し、及び(b) 検体を含むと予測されるアレイ内の少なくとも1つの導波路を入射光ビームで照射し、それによって検体を検出すること、によりつくられる、光閉じ込め内の検体を光学的に捕獲することを含む。

別の実施態様では、本発明は、対象の高充填率アレイを用いて、複数の反応試料を含む多数の懸濁学反応を達成する方法を提供する。当該方法は、(a) 対象の高充填率アレイを提供し；(b) 標識反応物を含む複数の反応試料をアレイ内の導波路内に置き、ここで別個の反応試料は、アレイ内の異なった導波路内に置かれる；(c) 化学反応生成物の形成に好適な条件にアレイを供し；並びに(d) 光学システムで当該生成物の形成を検出すること、を含む。検出ステップは、入射光ビームで異なった導波路を照射し、及び反応試料から放射された光シグナルを検出することを含んでもよい。適用可能な化学反応は、タンパク質-タンパク質相互作用、核酸-タンパク質相互作用、及び核酸-核酸相互作用を含んでもよい。特に、本発明は、約0.0001超の充填率を用いて複数の標的核酸分子の配列を決定する方法を提供する。

本発明は更に、高充填率を有するアレイを用いて核酸をシーケンスする方法を提供する。当該方法は、典型的に、(a) 約0.0001、又は0.001、又は0.01、又は更に0.1超の充填率を有する導波路のアレイを提供し；(b) 複数の標的核酸分子、標的核酸分子に相補的なプライマー、重合酵素、及び1種超の、複数の新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるべきヌクレオチド又はヌクレオチド鎖を、導波路内で混合し、各々の鎖は、各々の標的核酸分子に相補的である；(c) ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの鋳型-指示重合による新生ヌクレオチド鎖の形成に好適な条件下で重合反応にステップ(b)の混合物を供し；(d) 入射光ビームで導波路を照射し；並びに(e) 各々の新生ヌクレオチド鎖に取りこまれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを同定すること、を含む。

また、本発明は、重複配列シーケンス法を含む。当該方法は、(a) 標的核酸分子を鋳型-指示重合反応に供し、複数の種類のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの存在下で標的核酸分子に相補的な新生核酸鎖、及び鎖-置換活性を示す重合酵素を提供し；並びに(b) ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの、新生ヌクレオチド鎖への取り込みの時間系列を登録すること、を含む。本実施態様の1つの局面では、標的核酸分子は、環状核酸であり、又は合成された鎖がもとの環状鎖の複数の繰り返しコピーを含むように環状核酸配列から合成される線状もしくは環状鋳型であり、従って本発明のシーケンス法に供される。本実施態様の別の局面では、標的核酸分子は、数回、例えば2回以上、又は3回以上重合酵素によってシーケンスされる。本発明の実施態様の更に別の局面では、重合酵素はDNAポリメラーゼであり、例えば修飾型又は非修飾型Φ29ポリメラーゼである。

本発明は、更に、表面を有する固体支持体であって、当該表面が、支持体に結合した重合酵素アレイを有し、アレイのメンバーが個々にかつ場合により、鎖-置換活性を有する分離重合酵素を含む、前記支持体を含む。

また、ゼロ-モード導波路に固定された第一分子複合体を含むゼロ-モード導波路であって、当該分子複合体は、標的核酸と複合化される重合酵素を含み、重合酵素は標的核酸の鋳型-依存的複製によって標的核酸中にヌクレオチド配列を複数回有する、前記導波路を提供する。

本発明は、更に、入射波長の最小回折散乱強度を示す光閉じ込めのアレイを製造する方法を提供する。当該方法は、基板を提供し、及びアレイ内の個々の閉じ込めが当該波長の半分未満の距離で互いに分離されるように、基板上の光閉じ込めのアレイを形成すること、を含む。

最後に、本発明は、光閉じ込めを製造する方法を含み、当該方法は、コアを取り囲む外装材を含み、(a)フォトレジストの層で被覆した基板を提供し；(b)当該コアの境界を定義するためにフォトレジストの層をパターン化し；(c)フォトレジストの十分量が当該コアを占有したままとなるように、定義された境界を取り囲むフォトレジストの層を除き；(d)残存しているフォトレジスト及び当該基板上に外装材料の層を蒸着し；(e)当該残存フォトレジスト上に蒸着された当該外装材料の少なくとも1部分を除き；並びに(f)ステップ(e)のフォトレジストを除き、当該光閉じ込めの当該外装によって囲まれるコアを形成すること、を含む。1つの局面では、フォトレジストは、ネガ・パターンであり、パターン化ステップは、ポジ・パターンを採用する。別の局面では、フォトレジストは、ポジ・パターンであり、パターン化ステップは、ネガ・パターンを採用する。除去ステップは、エッチング、機械的研磨、イオンミリング、及び溶媒溶解からなる群より選ばれる。外装材の層は、熱蒸発法又は蒸着により蒸着することができる。

図1は、例証的な光閉じ込めアレイの平面図を示す。ここで、ゼロ-モード導波路は四角のフォーマットに配置されている。図2は、例証的な光閉じ込めのアレイの平面図を示す。ここで、ゼロ-モード導波路は非-四角フォーマットに配置されている。図3は、例証的な角及び2種の単位ベクター長を有する2-次元アレイの平面図を示す。図4は、ZMWの例証的な規則的蒸着の平面図を示す。図5は、複数のアレイの内の1アレイを示す。サブアレイ71は、スーパーアレイ72の一部分である。図6は、ネガティブトーン製造のプロセスを説明する。図7は、場合により光システムに連結されたZMWのアレイを説明する。図8は、ポジティブトーンレジスト（左パネル）又はネガティブトーンレジスト（右パネル）によって製造されたZMW構造の走査電子顕微鏡写真を示す。多結晶フィルムの粒状組織は、写真中で斑点として見え、ZMWは濃い円形構造として見える。図9は、予備-形成された複製フォークを用いる、ZMWにおける単一-分子DNA配列パターン認識を示す。図10は、基板105に結合された被覆ZMW101を示す。ZMWは、上面に側壁102、コーティング103を、金属フィルム104を含む。図11は、1つの配置ストラテジー及び光セットアップを示す。図12は、基板93上に多孔質フィルム91からなる代替的な光フィルムを示す。92はフィルム中の孔を示す。図13Aは、配置検出システム及び関連構成部品を示す。図13Bは、配置検出システム及び関連構成部品を示す。図14は、いくつかの具体的な光開裂遮断剤、及び保護基を開裂するために適用される適用可能な波長を示す。図15は、光開裂遮断剤が検出可能な標識（例えば、蛍光標識）に複合化される具体的な可逆伸張ターミネータ−を示す。図16は、対象の光閉じ込めを用いる単一-分子シーケンス反応における、2種の標識されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの取り込みの時間系列に対応する、蛍光バーストの具体的なプロファイルを示す。

発明の詳細な説明
本発明の実施は、特に示さない限り、当該分野の技術内である、集積回路(IC)プロセシング生化学、化学、分子生物、ゲノミクス及び再結合DNAの慣用的な方法を採用することになる。例えば、Stanley Wolf他, SILICON PROCESSING FOR THE VLSI ERA, 第1-4巻 (Lattice Press); Michael Quirk他 SEMICONDUCTOR MANUFACTURING TECHNOLOGY; Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版 (1989); METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)のシリーズ: PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MJ. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor著. (1995)を参照されたい。これらは本明細書に参照として引用されている。

定義:
明細書及びクレームに使用される、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」及び「その（the）」は、文脈が他に明確に特定しない限り、複数形を含む。

「ルミネセンス」とは、物質の温度での発生以外の他の理由により物質からの光の発光を称する。一般的に、原子又は分子は、「励起状態」から低エネルギー状態（通常、基底状態）まで運動するときに、電磁エネルギー(例えば光）の量子を発光する；この過程は一般的に「減衰」と称される。多くの励起の原因が存在する。励起の原因が量子である場合には、ルミネセンス過程は、「エレクトロルミネセンス」と称される。より具体的には、エレクトロルミネセンスは、直接的な注入及びエレクトロンの除去から起こり、電子-ホール対を形成し、次の電子-ホール対の再結合により量子を発光する。化学反応から起こるルミネセンスは、通常、「化学ルミネセンス」と称される。生物体によって産生されるルミネセンスは、通常、「生物ルミネセンス」と称される。光ルミネセンスがスピン許容遷移（例えば、一重項-一重項遷移、三重項-三重項遷移）の結果であるならば、光ルミネセンス過程は、通常「フルオロセンス」と称される。典型的には、励起原因が、かかるスピン許容遷移により急速に緩和するかもしれない短-寿命の励起状態の結果として除かれた後に、フルオロセンス発光は存在しない。光ルミネセンスがスピン禁制遷移（例えば、三重項-一重項遷移）の結果であるならば、光ルミネセンス過程は、通常、「燐光」と称される。典型的には、励起原因が、かかるスピン禁制遷移によってのみ緩和するかもしれない長-寿命励起状態の結果としての除かれた後に、燐光発光は存続する。「発光性標識」又は「発光性シグナル」は、上記の性質の任意の1つを有しているかもしれない。

用語「電磁放射線」とは、例えば、周波数の昇順（又はあるいは波長の降順）での、赤外放射線、可視光、紫外（UV）光、X-線及びガンマ線を含む、エネルギーの電磁波を称する。

本明細書で用いる「有効観察体積」は、典型的には、所与の適用のために採用される検出手段によって観察され得る体積を称する。例えば、蛍光型検出の例では、励起放射線に曝露される体積、及び/又は発光放射線が隣接の光学ユニット/検出器により集められる体積である。例として、ある適用のために用いられるゼロ-モード導波路の例では、有効観察体積は、励起放射線の導波路コアへの伝達により決定され、特に、導波路コアに入る励起放射線のもとの強度の少なくとも1 %及び好ましくは少なくとも10 %である光に曝露される体積である。かかる強度及び体積は、励起放射線の波長及び導波路コアの大きさを含む、問題となっている適用の特定の条件から容易に計算できる (例えば、全ての目的のためにその全体が本明細書に参照として引用される、米国特許第6,917,726号明細書を参照）。

「プライマー」は、一般的に、遊離の3' OH基を有する短いポリヌクレオチドであり、これは、標的核酸とハイブリダイズし、その後に標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することにより対象の試料中に潜在的に存在する標的核酸（又は鋳型）に結合する。

用語「作動的に連結された」又は「作動的に結合された」は、本明細書では交換的に使用される。それらは、記載された成分が、意図した形式でそれらを機能させる関係にある並列を称する。

用語「ヌクレオチド」は、一般的に、塩基、糖及び1以上のアニオン性基、好ましくはリン酸を含む分子を称する。当該分子は、1、2、3、4、5又はそれ以上のリン酸基及び/又は他の基、例えば硫酸塩を有することがある。当該語は、また、天然ヌクレオチドに構造的に類似し、ヌクレオチドのように実質的に機能することができるヌクレオチドアナログ、例えばDNA又はRNA内で生じ、及び/又は重合酵素によりヌクレオチド鎖を合成する際に塩基-相補取り込みが可能である1以上の塩基と相補的な塩基を示すアナログ、を包含する。

「ヌクレオチドの種類」は、検出されるべき共通の特徴を共有する一群のヌクレオチドを称する。例えば、ヌクレオチド種は、DNAについてはA、T、C及びG、RNAについてはA、U、C及びGの4つのカテゴリーに分類される。実施態様によっては、反応に用いられるヌクレオチドの各々の種類は、残りのものと区別され得る唯一の標識で標識されることになる。

用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの「ヌクレオチド」のポリマー形態を称する。

用語「光閉じ込め」は、閉じ込め内の意図した反応の反応物が、光手段により閉じ込められかつ分離される面積を称する。

「ポリヌクレオチドプローブ」は、ハイブリダイゼーション反応において、対応する標的ポリヌクレオチドを検出又は同定するために使用されるポリヌクレオチドを称する。

ポリヌクレオチドに適用される用語「ハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーション反応においてヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する、ポリヌクレオチドの能力を称する。水素結合は、ワトソン-クリック型塩基対、Hoogstein結合又は任意の他の配列特異的な様式により起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する2つの鎖、多重鎖複合体を形成する3以上の鎖、又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より広いプロセス、例えばPCR反応の開始又はリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂、においてステップを構成してもよい。

ハイブリダイゼーションは、異なった「緊縮」条件下で実行されうる。関連する条件は、温度、イオン強度、インキュベーションの時間、反応混合物中の追加の溶質、例えばホルムアミドの存在、及び洗浄方法を含む。高緊縮条件は、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するためのハイブリダイズ要素間のより高い最小の相補性を必要とする条件であり、例えばより高い温度及びより低いナトリウムイオン濃度である。一般的に、低緊縮ハイブリダイゼーション反応は、10 x SSCで約40℃、又は等価のイオン強度/温度の溶液で実行される。中程度のハイブリダイゼーションは、典型的に、6 x SSCで約50℃で実行され、高緊縮ハイブリダイゼーション反応は、一般的に、1 x SSCで約60℃で行われる。

ハイブリダイゼーションが2つの単一鎖ポリヌクレオチド間の逆行性配置で起こるとき、反応は、「アニーリング」と称され、これらのポリヌクレオチドは「相補的」であると記載される。ハイブリダイゼーションが、第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドの鎖の内の1つで起こりうる場合には、二重-鎖ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオドに対して「相補的」又は「相同的」であり得る。「相補性」又は「相同性」（1つのポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に許容される塩基対法則に従い、互いに水素結合を形成すると予測される、反対鎖における塩基の割合の点から定量可能である。

本発明の光閉じ込め構造
本発明の1つの局面は、分子を特徴付け及び/又は化学反応を監視するための光装置及び方法のデザインである。本発明の光装置は、生理学的に関連する条件下で膨大な数の単一-分子分析の多重化を可能にする。

1つの実施態様では、本発明は、閉じ込め4 x 10⁴/mm²超、好ましくは10⁵超の表面密度を有する光閉じ込めの高密度アレイであって、アレイ内の個々の閉じ込めが、ゼプトリットルのオーダーで有効観察体積を提供する、前記アレイを提供する。アレイは、少なくとも約2 x 10⁵、少なくとも約10⁶又は少なくとも約10⁷の光閉じ込めを含めばよい。好ましくは、アレイ内の個々の閉じ込めは、約1000ゼプトリットル未満、より好ましくは約900ゼプトリットル未満、より好ましくは約80ゼプトリットル未満、更により好ましくは約10ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する。必要であれば、1ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供することができる。好ましい局面では、個々の閉じ込めは、生理的に関連する濃度で存在する個々の分子の分離を許容する有効観察体積を与える。ほとんどの生化学反応のための生理的に関連する濃度は、マイクロ-モーラーからミリモーラーの範囲である。酵素のほとんどはその範囲にミカエリス定数を有するからである。従って、好ましい光閉じ込めのアレイは、約1マイクロモーラー（μM）超、又はより好ましくは50μM超、又は更に100μM超の濃度で存在する個々の分子を検出するための有効観察体積を有する。

生理的に関連する条件下での単一-分子分析のために必要とされる観察体積を得るために、アレイは、ゼロ-モード導波路又は代替的にナノスケール光構造物を含んでもよい。
かかる代替的な構造物は、特に限定されないが、反射率媒体を有する多孔質フィルム及び屈折率整合固体を用いる閉じ込めを含む。

本明細書で用いる「ゼロ-モード導波路」は、大部分の入射光が減じられる光ガイドを称し、入射光の好ましくは80 %超、より好ましくは90 %超、更により好ましくは99 %超が減じられる。かかる高レベルの減少のため、電磁放射線の伝達モードがほとんどガイド中に存在しない。従って、単一分子がマイクロモーラーの範囲ほど高い濃度で存在するときでさえ、かかるガイドの入口での入射電磁放射線の急速な減衰は、単一分子を検出するために効果的な極端に小さな観察体積を提供する。

本発明のゼロ-モード導波路は、典型的には、コアを取り囲む外装材（すなわち、部分的又は完全に）であって、当該外装材が、ゼロ-モード導波路のコアを介して縦方向にカットオフ波長よりも高い波長の電磁エネルギーの伝達を除くように構成される、前記外装材を含む。外装材は、典型的には、電磁線の電気的及び電磁気的領域の顕著な浸透を妨げる材料から作られる。外装材を製造するための好適な材料は、特に限定されないが、合金、金属、及び半導体材料及びこれらの任意の組み合わせを含む。合金は、金属性を有する多数の物質のうちのいずれかを含むが、少なくとも1つが金属である2以上の元素を含む。
合金は、金属性又は非金属性である各々の元素の含有量又は量が変化してもよい。好ましい合金は、一般的に、純粋な元素性材料を越える望ましい材料の特徴を改善する。材料の混合物の使用によって改善することができる特徴は、耐化学性、熱伝導率、電気的伝導率、反射率、粒径、熱膨張率、脆性、温度許容度、伝導率を含み、及び/又は外装の粒径を減少させる。

一般的に、本発明に好適な合金は、1成分が0.0001 %程度の低い割合で存在する混合物を含んでもよい。他の例では、1化合物よりも多い大きな割合を有する合金が望ましいだろう。ZMWの1実施態様は、ZMW構造の外装としてアルミニウムを使用する。いかに合金がZMW構造に有利であり得るかの1例として、どのように合金がZMWに影響を与えるかの点で、異なったアルミニウム合金を考慮するのが有益である。冶金の分野では、多数の材料がアルミニウムで合金化される。アルミニウムと合金されるために好適な材料の非限定的な例は、アンチモン、ヒ素、ベリリウム、ビスマス、ホウ素、カドミウム、カルシウム、炭素、セリウム、クロム、コバルト、銅、ガリウム、水素、インジウム、鉄、鉛、リチウム、マグネシウム、マンガン、水銀、モリブデン、ニッケル、ニオブ、リン、ケイ素、亜鉛及びその他である。いかに他の元素の導入がZMWの実施に有利に影響を与えるかの例として、ホウ素のアルミニウムへの導入が、アルミニウムの伝導率を増加することが知られている。金属フィルムの伝導率の増加は、透過の深さを減らすことにより当該実施を改善し、それによって観察体積を減らす。好ましい実施態様は、0.0001 %超のドーパントであるアルミニウム合金を含む。より好ましい実施態様は、0.005 %超のドーパントであるアルミニウム合金を含む。更に好ましい実施態様は、0.01 %超のドーパントであるアルミニウム合金を含む。

対照的に、材料の中には、ZMW構造の実施を減らすと予測されるものがあり、これらの例では、測定を行い、ある不純物を削除することが望ましいだろう。例えば、ある適用においては、装置の毒性が問題である場合には、鉛又はヒ素の量を減らすことが望ましい。
装置の好ましい実施態様は、1%未満のヒ素である金属フィルムを含む。装置のより好ましい実施態様は、0.1 %未満のヒ素である金属フィルムを含む。更により好ましい実施態様は、0.001 %未満のヒ素である金属フィルムを含む。更により好ましい実施態様は、0.00001 %未満のヒ素である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、1 %未満の鉛である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、0.1 %未満の鉛である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、0.01 %未満の鉛である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、0.001 %未満の鉛である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、0.00001 %未満の鉛である金属フィルムを含む。別の好ましい実施態様は、0.01 %未満の鉛である金属フィルムを含む。光閉じ込めの実施が特に重要な他の適用においては、伝導率を減少させる傾向にある不純物は、閉じ込めを悪化させ、望ましくないだろう。例えば、冶金の分野では、バナジウムは、アルミニウムの伝導率を減少させることが知られている。好ましい実施態様は、0.1 %未満のバナジウムである金属フィルムを含む。更により好ましい実施態様は、0.01 %未満のバナジウムである金属フィルムを含む。更により好ましい実施態様は、0.001 %未満のバナジウムである金属フィルムを含む。

外装材を製造するために好適な半導体材料は、一般的に不透明であり、ケイ素、珪酸酸塩、窒化珪素、ガリウム燐、ガリウムヒ素又はそれらの任意の組み合わせを含む。

対象のゼロ-モード導波路の外装材は、表面品質を改善するための材料で被覆することができる。例えば、コーティングは、外装材料の耐久性を向上させる。加えて、コアに含まれる反応物が外装材料と相互作用するか又は接着する傾向にある場合には、コーティングは、特に望ましい。様々な好適なコーティング材料は、当該分野で入手可能である。材料の中には、表面に共有結合的に接着するものもあるし、非-共有結合的相互作用を介して表面に結合するものもある。コーティング材料の非-限定的な例は、酸化アルミニウムフィルム、シラナイズ化試薬、例えばジメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン、又はトリメチルクロロシラン、ポリマレイミド、及びシリコナイジング試薬、例えば酸化ケイ素、Aquasil（商標）及びSurfasil（商標）を含む。被覆ZMW (101)の例を図10に示す。ZMW (101)は、基板105に結合される。ZMWは側壁102、コーティング103を上表面に含み、金属フィルム104を含む。

ある実施態様では、2以上の材料の不均一な組み合わせである金属組成物から閉じ込めを構築するのは有利であるかもしれない。例えば、ある適用に関して、2層以上を含む組成物であって、各層が異なった組成物又は層内で変化する組成物を有する、前記組成物を提供するのは有利であるかもしれない。これは、特に限定されないが、光閉じ込めの性質、装置の構造的強度及び動作、装置の表面化学の特徴等を含む、閉じ込めの実施のいくつかの局面に対する有利な効果を有することができる。1つの実施態様では、閉じ込めは、基板への第二層の接着を向上させるために層の内の1つが役立つ、2層を含む。別の実施態様では、均一組成物の層から得られる異なった光学的実行を提供するために、外装フィルムの組成物は、閉じ込めと比べてアキシアル位の機能として変化する。この実施態様の具体的な例では、閉じ込めの性質が、表面に近い形状でより均一であり、そして基板から離れたより長い距離をより迅速に先細りにするように、フィルムは、基板表面に近いより大きな値の表皮厚さを有する組成物を含み、そして、基板表面から更に離れたより小さな値の表皮厚さを有する組成物を含む。別の実施態様では、閉じ込めの外装を含む2種の層の厚さは、特定の光条件、例えば建設的干渉又は相殺的干渉、が装置の基板で達成されように選択される。

外装材により取り囲まれる内部空洞（すなわちコア）は、ガイド内の電磁放射線の伝達モードが効果的に防げる限り、慣用的なサイズ、形状又は体積を採用することができる。
コアは、典型的には、カットオフ波長（λ_c）未満の外側寸法を有する。径d及び完全導体のクラッドを有する環状ガイドに関して、λ_cは約1.7 x dである。コアの断面積は、環状、楕円形、長円形、円錐状、長方形、三角形、多面体又は任意の他の形状でよい。様々な形状が、ある適用のための具体的な適合性を有することができる。例えば、長い断面積は、機械的耐性又は剛性を有する分子、例えばDNAに増大した接近を提供するために有用であり得る。長い溝から様々な外観の長方形の割合までの範囲の断面は、放射線の軸方向の減衰において過度に妥協することなく、構造の検出域への難分解性分子の接近可能性を顕著に増大させるだろう。均一な断面積が好ましいが、その断面積は、必要ならばガイドの所与の深さが変動してもよい。好ましい平均断面積は、100 nm²〜10,000 nm²の範囲である。

好ましい実施態様では、コアは非-円筒型である。この実施態様の1つの局面では、非-円筒型コアは、上面に開口部を、及び外装材により全体が取り囲まれる底面に支持体を含む。当該開口部は、外側寸法が支持体より狭い。この構造は、反応物の拡散を著しく制限し、よって観察体積の平均残留時間を増やす。かかる構造は、特に有用である。化学反応の結合速度定数（比）を測定するために有用である。別の局面では、コアは、支持体よりも外側寸法が広い開口部を含む。ゼロ-モード導波路の開放端が光実行理由に必要とされる支持体程度に小さい場合には、かかる構造は、立体的又はエントロピーによる障害をかけて構造内に入る大きな分子への接近をより容易にする。例は、小さな開口部への導入とは反対のエントロピー力を受けやすい、長鎖の高分子電解質、例えばDNA分子の接近可能性を含む。

本発明で具体化されるゼロ-モード導波路は、比較的高い充填率、典型的には0.0001超、好ましくは0.001超、より好ましくは0.01超、及び更により好ましくは0.1を有する。本明細書で用いる、パターンの「充填率」とは、パターンの表面によって占有される面積に対する、パターンによって占有される総面積（表面及び裏面を含む）の割合を称する。用語「充填率」及び「充填比」は、交換的に使用される。ゼロ-モード導波路の文脈で、表面は、ゼロ-モード導波路のコアによって占有される面積であると考えられ、裏面は、ゼロ-モード導波路間の面積である（例えば、あるデザインにおいて外装材を形成するアルミニウム）。高充填率を有するゼロ-モード導波路は、均一なアッセイを達成するために特に有用である。充填率は、アレイ内のゼロ-モード導波路の全ての総面積を合計して、そして、ゼロ-モード導波路及びそれらの間の隙間を含む総合的に得られる面積により割って計算することができる。例えば、ゼロ-モード導波路が50 nmの径を有する場合には、このゼロ-モード導波路の面積は、7,850平方ナノメートルの4分の1、すなわち1962.5 nm²である。これらのゼロ-モード導波路が100 nmにより分離されている平方アレイ内にある場合には、総取得面積は、各ゼロ-モード導波路について10,000平方ナノメートルである。従って、アレイは、78 %の4分の1すなわち19.6 %の充填率を有し、0 01 %のオーダーの充填率を有するゼロ-モード導波路よりも、ほぼ4オーダー高い表面結合アッセイにおけるシグナル強度を提供することになる。

バイオアッセイ、例えばELISA又は他の分子結合バイオアッセイにおいて、1つの限界は、「均一に」又は溶液が混合物に添加されるが何も除かれないモードにおいて作動することができない能力である。これは、かなり多数のウェルに材料を添加しかつ材料を除く条件は、単に材料を添加する条件よりも著しくより複雑であるため、高度な多重化アッセイを困難にする。ELISAアッセイの例では、材料の除去が必須である。これは、アッセイの最後に溶液中に遊離の状態で存在する蛍光（又は他の）マーカーが、反応表面に結合されたマーカーを検出する能力を邪魔することになるからである。ある放射性同位体からの短い範囲の放射活性発光を利用する、これを解消する技術が考え出されているが、これらの技術は、作業員の安全性及び廃棄物処理に関連した固有の困難性を有する。表面へのアッセイの感受性を制限する他の方法、例えば内部全反射閉じ込め（TIR）及び共焦点検出、も考え出されている。ゼロ-モード導波路光構造は、これらの技術のいずれよりもより簡単かつより安価の光学システム構造を可能にし、そして、表面に対する感受性の閉じ込めの見込みから、非常に優れている。

充填率はバイオアッセイには重要である。なぜなら、有効プローブ面積は、検出域においてゼロ-モード導波路の底の表面積に限定されるからである。かかるアッセイにおいてシグナル検出可能量は、獲得できる領域に直接比例することになり、よって、ゼロ-モード導波路によって占有される獲得可能な表面のより高い比は、かかるアッセイの測定のシグナル強度を増加させることになる。高充填率構造は、一般的に、任意の表面感受性適用において有用であり、ELISAアッセイに限定されない。

カットオフ波長は、使用される照明構成下で導波路に沿って、導波路が電磁気エネルギーを本質的に伝達することができない波長を越える波長である。コアの構造、外装材料の性質、及び入射電磁線の波長を考慮すると、当業者は、マックスウェルの式を解くことによりカットオフ波長を容易に導き出すことができる（例えば、John D. Jackson, CLASSICAL ELECTRODYNAMICS, 第2版, John Willey and Sons参照)。入射波長の選択は、対象のアレイが採用されることになる特定の適用に依存するだろう。ある局面では、入射波長は約10 nm〜約1 mmの範囲から選択することができる。蛍光シグナルを検出するためには、入射光は、典型的に、約380 nm〜約800 nmの範囲から選択される。偏光（線状的又は好ましくは環状的に分極した）又は非偏光入射光は、一般的に、所望の観察体積をつくるために、アレイを照射するために採用される。

別の実施態様では、本発明は、外部放射閉じ込め（ERC）と称される代替的な光閉じ込めを提供する。慣用的な内部全反射閉じ込め（IRC）と対照的に、低インデックス媒体は電磁線担体であり、高インデックス（及び不透明）媒体は、反射器である。そのようなわけで、反射インデックスの役割は、IRC状態に比べて逆である。ERCは、一般的に、不透明相において検体（すなわち、研究での分子）を提供するいくつかの手段を必要とする。

IRCは、高インデックス反射と低インデックス反射との間のインターフェース上の、電磁線入射の反射に依存する。光が（当該分野で公知の）内部全反射の境界角度を越える入射であるとき、入射電磁線の全てが反射され、低インデックス相には全く伝達されない。
消えていく放射線の細い領域は、低インデックス側のインターフェースに最も近接して確立される。この放射線は、典型的には、入射角及び2相の反射インデックスに依拠して、約100 nm〜約200 nmの範囲の減衰長を有する飛躍的に減少する領域である。低インデックス相が検体を含む溶液である場合には、消えていく放射線は、高度の表面感受性を溶液中の検体を試験するために使用することができる。

ERCにおいて、伝達電磁線の担体は、透明な低インデックスフィルムであり、検体-保持媒体は高-インデックス金属不透明フィルムである。この例では、ほとんどの放射線は、入射角には無関係に反射され、非-反射光は、金属の表皮厚さに従って急激に減衰される。典型的には、金属相内の検体を運ぶ手段が提供される。これらの手段は、金属層内に構築されたナノキャピラリー管の形態をとることができる。十分に小さいときには、かかる管の存在は、2つの媒体中のエネルギーの分配にはほとんど影響を与えないが、生物分子を運ぶのに十分に大きいことがあり得る。十分に小さいためには、金属フィルム中の欠陥が照射波長と比べて小さくなければならない。可視光の波長と対象の生物分子の典型的なサイズとの比が大きいために、これは達成可能である。可視光が典型的に400 nm〜750 nmの波長である場合には、対象の生物分子は一般的に1〜30 nm径の近傍にある。インターフェース上の放射線の減衰は、照射を検体の非常に小さな領域に限定するために使用することができる。高インデックス基板上の（水に）適合したインデックス中の小ホールは、TIR文脈中の回折限定光学により可能であるものを越えて軸方向閉じ込めを提供することができた。これは、原則的に、100ゼプトリットル閉じ込めを提供した。この方法では、検体溶液に整合した固体材料インデックスが基板表面に適用され、次いでナノスケールのホールが開けられる、内部全反射閉じ込めの種類が使用される。TIRモードで使用するときには、これらの構造は、TIRのみで得られるものを越える、追加の閉じ込めを提供することになる。

他の代替的な閉じ込めは、インデックス整合個体である。例として、かかる光閉じ込めは、高インデックス透明基板、例えばサファイア、スピンコート200 nmのPMMA（ポリメチルメタクリレート）レジスト樹脂で製造することができる。電子ビームリソグラフィーへの曝露は、適用されるパターンに従い、溶解性の単離スポットを与えることになる。現像後、装置は、PMMA層にナノ-スケールの穴を有し、TIR構成装置にいつでも使用できる。軸方向閉じ込めは、検体を含む溶液とほとんど同一の反射インデックスを有するので、軸方向閉じ込めは、PMMA層により影響を受けないが、溶液は、穴は位置している場所を除く表面の近くに物理的に接近しないようにされ、穴の径によって与えられる外側閉じ込め度を提供する。

光閉じ込めは、単一-分子レベルでの反応物間の相互作用を検出及び/又は監視することができる光学システムを提供することができる。かかる光閉じ込めは、入射波長を先ず生成しそして閉じ込め内に含まれる反応物に入射波長を伝達し、次いで、反応物からの光シグナルを回収しそして分析することにより、これらの機能を達成する。かかるシステムは、典型的には、閉じ込めのアレイからのシグナルをアレイ-型検出器の異なった位置に方向付けて、同時に複数の異なった閉じ込めの各々由来の複数の異なった光シグナルを検出する、光トラム（tram）を採用する。特に、光列（optical trains）は、典型的には、光通信又はウェッジプリズムを含み、同時に、アレイ型検出器、例えばCCD、上の異なった位置に、アレイ内の各閉じ込めと異なったスペクトル特性を有するシグナルを導き及び分離する。各閉じ込めからのシグナルを、検出器上の異なった位置に別個に方向付け、加えて、各閉じ込め由来の成分シグナルを、別個の位置に分離することにより、同時に、複数の閉じ込め及び各閉じ込め由来の複数のシグナルを監視することができる。

本発明に適用可能な光システムは、少なくとも1つの元素、すなわち励起源及び量子検出器を含む。励起源は、光閉じ込めに含まれる反応物を場合により励起するために使用される入射光を生成し、そして伝達する。意図した適用によっては、入射光源は、レーザー、半導体レーザー、発光ダイオード（LED）、紫外線電球及び/又は白光灯でよい。必要ならば、2以上の光源を同時に使用することができる。複数の光源の使用は、異なった励起スペクトルを有する複数の異なった試薬化合物を採用する適用において特に望ましく、次いで、2以上の蛍光シグナルの検出を可能にして、2以上の分子又は2以上の種類の分子を同時に追跡することができる。幅広い量子検出器が当該分野で利用可能である。代表的な検出器は、特に限定されないが、光学式読み取り装置、高-量子効率検出システム、フォトダイオード（例えば、アバランシェ型フォトダイオード(APD))、カメラ、電荷結合素子（CCD）、電子-多重化電荷-結合素子（EMCCD）、及び任意の先の検出器を備えた共焦点顕微鏡を含む。必要ならば、光閉じ込めの対象アレイは、光閉じ込め、及び励起光源、量子検出器又は以下の光透過要素の適正な空間配置を促進する様々な配置補助装置又はキー（keys）を含む。

対象の光システムは、機能が多様化し得る光透過要素を含んでもよい。第一に、それは、入射波長を、反応物を含む光閉じ込めに集める及び/又は方向付ける。第二に、それは、光閉じ込め内の反応物から量子検出器に放出される光シグナルを伝達し及び/又は方向付ける。第三に、それは、入射波長又は反応物由来の放出波長の光学的性質を選択し及び/又は改変することができる。かかる要素の例は、回折格子、アレイ導波路格子（AWG)、光ファイバ、光スイッチ、ミラー、(ミクロレンズ及びナノレンズを含む）レンズ、コリメータである。他の例は、光減衰器、偏光フィルタ（例えばダイクロイック・フィルター）、波長フィルタ（低-通過、帯域-通過、又は高-通過）、及び遅延線を含む。いくつかの実施態様では、光透過要素は、アレイ光閉じ込めを有する光通内の平面導波路でもよい。例えば、平面導波路は、ゼロ-モード導波路のアレイに作動的に結合されて、波エネルギーの喪失を最小限にするように、入射波長をゼロ-モード導波路の各々のコアに直接に送ることができる。平面チャンネルは、アレイ基板の支持体に位置する取り外し可能なユニットとして含まれるか、又はアレイの欠くことができない部分として基板に結合することができる。

本発明の使用に好適な光透過要素は、1つの位置から、許容又は禁制のいずれかの状態にある別の位置まで光を送る様々な光装置を包含する。かかる光透過装置の非-限定的な例は、光ファイバ、回折格子、アレイ導波路格子（AWG)、光スイッチ、ミラー（ダイクロイックミラー）、（マイクロレンズ及びナノレンズを含む）レンズ、コリメータ、フィルタ、プリズム、及び適正な反射インデックス及び幾何学的構成により光の透過を案内する任意の他の装置を含む。

好ましい実施態様では、本発明の光閉じ込めは、量子検出器に作動的に結合される。例えば、アレイ光閉じ込めは、各々のかつ別個の量子検出器に作動的に結合される。閉じ込め及び各々の検出器は、空間的に配置することができ（例えば、1：1マッピング）、導波路からの光学シグナルの効率的な回収を可能にする。特に好ましい構成装置は、ゼロ-モード導波路のアレイを含み、個々の導波路の各々は、それぞれのマイクロレンズ又はナノレンズに作動的に結合され、好ましくは、シグナル回収効率を最適化するように空間的に配置される。代替的に、対物レンズ、スペクトルフィルタセット又は異なった波長のシグナルを分離するためのプリズム、及び画像レンズの組み合わせは、光学列で使用して、各閉じ込めからの光シグナルをアレイ検出器、例えばCCD、に方向付け、同時に、各閉じ込め内で生じる異なった反応事象に対応する、各異なった閉じ込めからのシグナルを複数の構成シグナル要素、例えば異なった波長スペクトル、に分離することができる。

ZMWのアレイが場合により光システムに連結さる、具体的な光学的構成装置を図7に示す。このシステムは、ZMWアレイフィルム（81）、それによって光が透過するガラスカバースリップ（82）を含み、更に、ガラス製のレンズとは異なった反射インデックスを有する材料からできた一体型レンズ（83）セットに焦点を当てる。特に、84は、ZMW構造を示し、85は、一体型レンズ例えば埋め込み型マイクロレンズによってZMW上に焦点が当てられる光線を示す。

図11は、1つの配置ストラテジー及び光学システムを示す。当該システムは、光センサー131、光を集めるための光学レンズ132、基板135に結合された金属フィルム134を有するZMW 133、及び入射光ビーム137に位置合わせされる対物レンズ136を含む。図13は、具体的な配置検出装置及び関連構成部品を示す。例証的システム13Aは、光閉じ込め、例えば基板114に結合された金属フィルム113を有するゼロ-モード導波路111、を含む。ゼロ-モード導波路111は、典型的には、シグナル発生分子112を含み、場合により、対物レンズ115、ビームスプリッター/二色性キューブ117、場合により（無限遠補正システムで用いられる）テレンレンズ120及び光センサー（例えば、4象限光検出器.）を含む関連構成部品に結合される。116は、システムにより伝達する光線を示す。118は、入射照射光線を示す。119は、検出器122に従って動く戻り光線（return rays）を示す。図13Bは、4象限フォトダイオードの正面図を示す。この図の中央には、4象限光検出器の中心に、調整不良のビームを示す。4象限によって生成する4つの電圧は、調整不良のビーム及び光閉じ込め例えばZMW 111の程度及び方向を決定するために処理することができる。

対象アレイは、多数のレーンが、例えば通常少なくとも2、より一般的には10超、及びより一般的には100超存在する、基板表面上の光閉じ込めの1列又は多数の列を含んでもよい。光閉じ込めの対象アレイは、基板のx-軸又はy-軸を水平に又は対角線上に長く並べることができる。個々の閉じ込めは、基板表面上の任意のフォーマットに又は当該表面を越えて、例えばグリッドを形成するように又は環状、楕円形、長円形、円錐形、長方形、三角形もしくは多面体パターンを形成するように縦横に、配列することができる。隣接光閉じ込め間の最も近い-隣接距離を最少とするために、六角形アレイが好ましい。

光閉じ込めのアレイは、分析の容易さのために、ハイスループット又は他の利点、例えばマイクロタイタープレート等を提供する構造に取り込むことができる。かかる構成は、「アレイ（複数）のアレイ」とも称される。例えば、対象アレイは、別のアレイ、例えばマイクロタイター又はマルチ-ウェルプレートであって、プレートの各マイクロウェルが光閉じ込めの対象アレイを含む、アレイに取り込むことができる。典型的には、かかるマルチ-ウェルプイレートは、複数の反応容器又はウェル、例えば48ウェル、96ウェル、384ウェル又は1536ウェルフォーマットを含む。かかる例では、ウェルは、典型的には、各々18 mm、9 mm、4.5 mm又は2.25 mm中心に置かれる。

アレイの例証的アレイを、サブアレイ71がスーパーアレイ72の一部である、図5に示す。アレイは、格子に配置することもできる。例えば、図4は、ZMWの例証的な規則性の平面図を示す。この構造においては、パラメータd1、d2及び角度53によって定義される格子が存在する。各格子点でのZMWに加えて、ユニットセルの各要素について1つの角度及び1つの距離を有する角度及び距離の一覧によって定義される、配置内にある多数のZMWを含む複合ユニットセルが存在する。特に、52は第一格子距離を示し、53は格子角を示し、54は第二格子距離を示し、55はユニットセル第一距離を示し、及び56はユニットセル第一角を示す。この図は、2つの成分のユニットセルを有するアレイを示すが、このユニットセルは、任意の多数の要素を有することができる。

上記のように、対象アレイは、多数の光閉じ込めを含む。実施態様によっては、アレイは、少なくとも約20 x 10⁴の明確な光閉じ込め、好ましくは少なくとも約20 x 10⁶の明確な光閉じ込め、より好ましくは少なくとも約20 x 10⁸の明確な光閉じ込めを有する。ある実施態様では、固体表面上のスポット密度は、少なくとも光閉じ込め約4 x 10⁴ /mm²、通常、少なくとも約8 x 10⁴、少なくとも約1.2 x 10⁵又は少なくとも約4 x 10⁶ 閉じ込め/mm²であるが、4 x 10¹² 閉じ込め/mm²を越えず、通常、約4 x 10¹⁰ 閉じ込め/mm²を越えない。アレイの全体的なサイズは、一般的に、厚さが数ナノメートルから数ミリメートルの範囲であり、幅又は長さが数ミリメートルから50センチメートルの範囲である。好ましいアレイは、厚さが約数百ミクロンの全体的サイズを有し、所望の光閉じ込め数に依拠して任意の幅又は長さを有してもよい。

図1に示す1例では、光閉じ込めのアレイ、例えばゼロ-モード導波路は、四角型に配置される。アレイは、隣接導波路から、距離「d」（22は、内部ゼロ-モード導波路空間を示す）離れた、代表的なゼロ-モード導波路21を含む。図2に示す別の例では、光閉じ込めのアレイ、例えばゼロ-モード導波路は、非-四角型に配置される。アレイは、隣接導波路から、距離「d」（32は、内部ゼロ-モード導波路空間を示す）離れた、代表的なゼロ-モード導波路31を含む。33は、任意の3つの隣接ZMW間に形成される角度（例えば60度）を示す。図3は、別の例証的2-次元アレイの正面を示す。隣接光閉じ込めは、ユニットベクター角43により、1つの次元では、距離「d1」離れ、もう1つの次元では、距離「d2」離れる。

個々の閉じ込め間の空間は、対象アレイが採用される特定の適用を支持するように調整することができる。例えば、意図した適用が、光閉じ込めからの入射波長の低レベルの回折散乱を伴って又は伴わずに、アレイの暗-域照射を必要とする場合には、個々の閉じ込めは、典型的には入射波長に比べて互いに接近して置かれる。

従って、1つの局面では、本発明は、少なくとも第一及び少なくとも第二のゼロ-モード導波路を含むゼロ-モード導波路のアレイを提供する。ここで、当該第一のゼロ-モード導波路は、入射波長で照射する際に、所与の角度で第一のゼロ-モード導波路から観察される回折散乱強度が、第一のゼロ-モード導波路が第二のゼロ-モード導波路の非存在下に同一の入射波長で照射される場合よりも低いような距離で、第二のゼロ-モード導波路と分離される。アレイが、その最も近い近接物からのゼロ-モード導波路の分離が入射波長の半分の波長未満である、規則的空間格子内に間隔を空けたゼロ-モード導波路を含む場合には、回折散乱は、減少させるか又は著しく少なくすることができる。このレジュメでは、構造は、ゼロ-オーダー格子として働く。かかる格子は、それ自体、非常に効果的に散乱することになる非常に多数の元素を有するにもかかわらず、入射光を散乱させることができる。表面散乱が対物レンズにより集められることになる励起放射線の原因になり、その結果、バックグラウンドノイズを増加させる場合には、この配置は、暗域照射のような照射方法に特に望ましい。照射用の有用な波長は、250 nmから最高8ミクロンの範囲であり、これは、4000 nm未満の空間を有するゼロ-モード導波路のアレイはこの方法での適用になお有用である、ことを意味している。2000 nm未満の空間はより好ましいが、1000 nm未満の空間は、この点でなおより好ましい。照射が非対称的に適用されるか又は回収円錐角が90度未満に設定される場合には、波長の半分よりも大きい空間を有する配置は、同一の利点を有することができる。減少した回折散乱の利点に加え、個々の閉じ込めの間の狭い空間は、照射領域を減少させ、電力需要を低下させる。

入射波長に対して非常に離れた間隔で置かれた光閉じ込めを有するアレイも、所望の性質を有する。角-依存的散乱は、ある適用には不利であるバックグランドシグナルを生じるが、光閉じ込めのサイズ及び形状を特徴付けるために特に適する手段を提供する。特に非標識分子を含む、分子相互作用の全体的な大量測定をも容易に可能にする。かかる適用に適したアレイは、一般的に、2以上の入射光の波長、通常、入射波長の1.5倍超、しかし、通常入射光の150倍を超えない、により分離される個々の閉じ込めを含む。

キット：
本発明はまた、本発明の光閉じ込めアレイを含むキットを包含する。本発明によって具体化されるキットは、分子を特徴付け及び/又は単一-分子レベルでの化学反応を監視することができるキットを含む。各キットは、通常、かかる特徴を与え及び/又は可能な手段を監視する装置及び試薬を含む。キットの意図した使用によって、キットの内容物及び包装は異なることになる。キットがDNAシーケンスのためである場合には、キットは、典型的に、以下を含む：(a) 個々の分子の分離又は個々の分子、例えば約1マイクロモーラー超の濃度で存在する分子、の反応を可能にする、光閉じ込めのアレイ、好ましくは本発明のゼロ-モード導波；及び (b) ポリメラーゼ、水溶性緩衝液、塩、プライマー、及びヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを典型的に含むシーケンス試薬。必要であれば、公知の配列の「対照」核酸は、反応の精度又は進行を監視するために含まれる。

試薬は、固体形態、固定形態、及び/又は在庫保存に適した、及び後に試験が終了したときに反応媒体と交換又は反応媒体中への添加に適した液体緩衝剤中に溶解/懸濁形態で供給することができる。好適な個々の包装が一般的に提供される。キットは、場合により、この方法に有用な追加の成分を提供する。これらの追加の成分は、特に限定されないが、緩衝剤、捕捉試薬、現像試薬、標識、反応表面、対照試料、教示、及び翻訳情報を含む。本発明のキットを用いる診断又は予知方法は、臨床的研究室、実験的研究室、熟練者、又は個人によって実施することができる。

光閉じ込めの製造：
本発明のアレイは、本発明によって提供されるナノファブリケーション技術、並びに集積回路（IC）及び微小電気機械システム（MEMS）の分野で公知の技術を用いて製造することができる。ファブリケーションプロセスは、典型的には、アレイ基板を選択し、次いで光閉じ込め及び他の関連する部品を構築し一体化するために、好適なIC処理法及び/又はMEMSミクロ機械加工技術を用いて、進行する。

アレイ基板：
実施態様によっては、光閉じ込めのアレイは、硬い基板上に存在する。例えば反射インデックス媒体を有する多孔質フィルムに関する他の実施態様では、柔軟性材料を採用できる。一般的に、硬い支持体は、容易に曲がらない。本発明に関する硬い支持体でない固体材料の例は、膜、柔らかな金属又はプラスチックフィルム等を含む。従って、対象アレイの硬質基板は、アッセイが採用されるそのアッセイ条件下、特にハイスループット操作条件下で、物理的支持体及び構造をその上又はその中に存在する光閉じ込めに提供するには十分である。

その上にアレイの対象パターンが配置される基板は、アレイの意図した使用により、単一から複合体までの範囲の様々な構造をとることができる。従って、基板は、スライド全体又はプレートの構造、例えば長方形又は円盤状構造を有することができた。標準的なマイクロタイタープレート及び顕微鏡用スライドで見出されるように、長方形全体構造が好ましい。一般的に、硬い基板の厚さは、少なくとも約0.01 mmであろう、そして1 cm以上の大きさでよいが、通常、約5 cmを越えない。硬い基板の長さ及び幅は、その上又はその中に製造されることになる光閉じ込めのアレイのサイズによって変動するだろう。

対象アレイの基板は、様々な材料から製造することができる。基板が製造される材料は、好ましくは可視光及び/又はUV光を通す。好適な材料は、ガラス、半導体（例えば、ケイ酸塩、シリコン、ケイ酸塩（複数）、窒化珪素、二酸化珪素、石英、石英ガラス及びガリウムヒ素）、プラスチック、及び他の有機ポリマー材料を含む。好ましい局面では、ガラス、石英及び石英ガラスのようなシリカ系基板は、基礎になる透過性基板材料として用いられる。

対象アレイの基板は、光閉じ込めのパターンが存在する少なくとも1つの表面を含み、その表面は、平滑でも又は実質的に平面でもよく、又は凹凸、例えば窪み又は隆起を有していてもよい。表面は、所望の方法で表面の性質を調整するのに役立つ1以上の異なった化合物層で修飾することができる。対象の修飾層は以下を含む：無機及び有機層例えば金属、金属酸化物、ポリマー、小有機分子、機能性部分例えばアビジン/ビオチン等。コーティング材料を適用する方法の選択は、使用するコーティング材料の種類に依拠するだろう。一般的に、コーティングは、ゼロ-モード導波路に材料を直接適用し、次いで、過剰の非結合コーティング材料を表面から洗浄することにより実行される。代替的に又は追加的に、コーティング材料は、他の慣用的技術、例えば化学熱蒸着（CVD）、スパッタリング、スピンコーティング、in situ合成等を用いて蒸着することができる。あるコーティング材料は、加熱、放射及び/又は化学反応により表面に架橋することができる。好ましい局面では、好適なコーティング材料は、共有結合的に又はイオン性もしくは疎水性/親水性相互作用のいずれかにより、基板表面に結合される。シリカ系基板の例では、例えばシラン化学は、コーティング材料の表面、例えばカップリング基、特異的結合部分等、への共有結合的な結合に特に適している。かかる化学は、当業者に周知であり、過度な実験をすることなく実施することができる。

ファブリケーションプロセス：
対象アレイ基板の製造は、以下に記載の方法、又はIC-処理及び/又はMEMSミクロ機械加工の他の標準的技術に従って実行することができる。当該分野で公知の標準的技術は、特に限定されないが、電子-ビームリソグラフィー、フォトリソグラフィー、化学的蒸着又は物理的蒸着、乾式又は湿式エッチング、イオン注入、プラズマエッチング、結合及び電気メッキを含む。別の製造方法は、参考としてその全体が引用される、米国特許出願公開第2003/0174992号に記載されている。

好ましい実施態様では、本発明は、負のトーンファブリケーションプロセスを提供する。これは、変化する大きさの光閉じ込めを与え得る慣用的な正のトーンファブリケーションプロセスよりもより、より均一かつ一貫した大きさを有する光閉じ込めの生成を提供する。2つのファブリケーションプロセスの比較を、以下の表1に示す。

ネガティブトーンプロセスでは、ネガティブレジストは、基板に適用される。ある薬剤の適用により不溶性が付与される場合に、レジストはネガティブである。ここで、フォトレジスト又はe-ビームレジストの場合には、薬剤は、それぞれ光エネルギー又は電子ビームエネルギーである。代替的に、ポジティブトーンレジストは、ネガティブパターンで使用することができる。ネガティブトーンパターンは、薬剤が光閉じ込め領域にのみ制限されるポジティブトーン画像と対比して、光閉じ込め、例えばゼロ-モード導波路の位置を除く全ての領域における薬剤の適用によって特徴付けられる。いずれか1つの例では、レジストの現像後に、レジストは、光閉じ込めが残ることが意図される領域にのみ残存する。多くの例では、これらの残存しているレジスト形体のアンダーカット側壁プロファイルを達成するための手段を使用することが有用である。当該分野では、例えば電子ビームリソグラフィーにおいて、アンダーカット側壁を得る多くの技術が存在する。例えば、ネガティブトーンレジストを使用するときには、1つの方法は、表面に電子ビームレジストの層を連続的に適用することである。上層のフィルムは、電子ビームにより送達されるエネルギーに対してより高い感受性を有する。ビームは散乱する傾向を有するため、上層のフィルムのより大きな面積は、低層よりも不溶性になるだろう。その結果、希望どおり、上層下では、オーバーハングが生じる。

現像、及び当該分野で公知の好適な洗浄工程、例えばプラズマ洗浄工程の後、光閉じ込めを含む金属フィルムは、金属蒸発、分子ビームエピタキシー及びその他を含む数種類の方法の1つによって適用することができる。レジストプロファイルが上記のようにアンダーカットされる場合には、レジストによって占有され続ける領域に蒸着される金属は、装置表面に残存するよりもむしろ、レジスト表面上に残るだろう。次いで、レジスト層は、超音波処理又は他の機械的攪拌、反応性プラズマエッチング、蒸発又はその他を用いる又は用いずに、溶媒による溶解を含む数種類の技術のいずれかによって除去される。レジスト形体上に残る金属は、レジストが除かれる（「リフトオフ」）ときに除去されるが、基板上に直接残るレジストは、光閉じ込めの壁を形成するように残存する。

このプロセスの利点は、光閉じ込めの大きさがレジスト形体の大きさにより決定され、そして、金属フィルム、特にこれらの装置用の所望の金属であるアルミニウムに高い可変性を有する、反応性イオンエッチングパターン転送機構の忠実性に依拠しない、ことである。ポジティブトーンプロセスは、レジスト形体サイズにおいては固有の変化及びパターン転送に起因する変化を受けるが、ネガティブトーンプロセスは、第一の可変を受けやすいが、第二の変化は受けない。金属薄フィルム技術は、側面の変化がほとんどなく、そのため全体的厳密性に優れる。この方法も、問題となっている金属に適したエッチングの利用可能性に依拠せず、このプロセスを、ポジティブトーンプロセスよりも金属のより広い選択に適用することができる。

図6は、ゼロ-モード導波路を製造するネガティブトーンプロセスの例を示す図面である。このプロセスにおいて、基板11は、先ず、ネガティブレジスト12の層により被覆される。場合により、基板は、第二レジスト層13で被覆することができる。ポジティブトーンプロセスで用いられる同一パターン電子ビームリソグラフィー手段へのレジストの曝露は、先に観察された反対のパターンを生じる。すなわち、残存レジストの小ピラー及びピラー15間の隙間からなる周期的アレイの1つである。最終的なゼロ-モード導波路構造は、薄金属層、例えばアルミニウム層17でこのパターンを被覆し、次いで底にあるネガティブレジストピラー18を溶解すことによりつくられる。このプロセスは、アルミニウム層の厚さ、結晶構造又は金属フィルムの形態に依拠しないので、かなり一貫性のある構造体を製造し、基準の形体サイズよりもより微細なコントロールができる。図8は、ポジティブトーンレジスト（左パネル）又はネガティブトーンレジスト（右パネル）によって構築されるZMW構造の走査電子顕微鏡写真を示す。多結晶フィルムの粒状組織は、画像では斑点として見ることができ、ZMWは濃い円形構造として見ることができる。

異なったネガティブトーンプロセスは、ナノキャスティングと称される。ナノキャスティングのステップは、二-層レジストの使用を避けられることを除いて同様である。プロセスは、先ず、基板表面上の蒸着を含む（この例では、単一-層レジストが使用される）。電子ビーム曝露及び現像は、曝露パターン中の各ドットについて円筒形形体をとる。このプロセスに関しては、金属蒸着技術を、材料をレジスト構造の上面に適用するのだけでなく、レジスト形体の側壁上に適用させることが望ましい。立体的レジスト形体の外面のネガティブレプリカが、光閉じ込め壁を形成する金属フィルムの内面内で再構築される点で、このプロセスは、本質的に立体的である。この例では、アンダーカットレジストプロファイル及びこれを製造するために使用される様々な方法は、ネガティブプロセスにおいては、蒸着されたフィルムとレジスト形体の側面との接触を避けるために特別に使用されるものであるため、必ずしも必要ではない。ナノキャスティング法では、蒸着されたフィルムは、レジスト形体の外面を忠実に再構築する。従って、アンダーカット形状は、非-円筒形閉じ込めが望ましい場合に使用されるにすぎない。

ナノキャスティングの実施において、上記のナノキャスティング「マスター（レジスト形体）」から金属を除くために典型的には注意が必要である。レジスト形体は、場合によっては、全体的に埋め込まれ、除去できない場合があるためである。しかしながら、これは、多数の方法により改善することができる。

蒸着技術が蒸着における高度の異方性（例えば金属蒸発）を有する場合には、側壁は、場合によっては円筒形のピラーでもよい、レジスト形体の上面近傍では非常に薄くなるだろう。この弱点は、直接的な機械的崩壊を受けることがあり、レジスト形体上の金属を除去し、それによってZMW配置を可能にする。等方性エッチングは、溶液相又はプラズマのいずれかで、この弱点が分離するまでフィルムを更に薄くするために使用することができる。金属蒸着ステップが程度の異方性（例えば、スパッタリング又は電気メッキ）を有する場合には、レジスト材料は、化学的な機械的研磨又はイオン・エッチングにより曝露することができる。

レジスト形体上の金属キャップの除去と同時に又はこれに続いて、レジスト材料は、溶媒溶解又は反応性イオン・エッチングにより除去される。好適なパターンが適用され、他のパラメータが正確に選択されることを条件に、これは製造ステップを完結させる。

対象光閉じ込め及び他の装置の使用：
光閉じ込め及び関連する光システムを含む対象装置は、分子を分析し及び化学反応をリアルタイムで監視するための効率的な手段を提供する。対象装置及び検出/監視法は、診断的及び研究的適用のための生化学的及び生物的反応の分析を含む様々な環境で使用することができる。特に好ましい局面では、本発明は、研究的適用のための核酸配列の解明において適用され、特に予防医薬の部分として個々のヒトゲノムをシーケンスすること、遺伝子型-表現型の関連のための迅速な仮定的試験、多-細胞生物の発達における全ての段階でのin vitro及びin situ遺伝子-発現プロファイリング、個々のクローン用の包括的な突然変異群を決定すること、及び様々な疾患又は疾患ステージでのプロファイリングに適用される。他の適用は、酵素反応速度論を測定し、標的分子と標的分子の候補モジュレーターとの間の特異的関係を特定することを含む。更なる適用は、細胞アクセプター多様性をプロファイルし、公知及び新規の病原を特定し、農業的、環境的及び治療的目標に向かって多様性を追及することを含む。

ある実施態様では、対象装置及び方法は、ハイ-スループットの単一-分子分析を可能にする。単一-分子分析は、生物的事象を研究する慣用的な方法を越えるいくつかの説得力のある利点を提供する。第一に、分析は、その性質が、通常の一組の測定技術によって記録される統計的に平均化された情報では秘密にされているような個々の分子に関する情報を提供する。加えて、分析は多重化することができるので、ハイ-スループット実行を助長し、より少量の試薬（複数）を必要とし、光システムの高処理能力、例えば極端に速いデータ収集のための現代のアバランシェ型フォトダイオードを利用する。更に、単一-分子カウントは、照射及び光収集変動に対してある程度の免疫を生じるので、単一-分子分析は、バルク蛍光又は光-散乱技術よりも材料の量を測定する点でより正確性を提供することができる。そういうわけで、単一-分子分析は、遺伝子型特定、遺伝子発現プロファイリング、DNAシーケンス、ヌクレオチド多型検出、病原検出、タンパク質発現プロファイリング、及び沢物スクリーニングにおける効率及び正確性を大いに改善する。

単一-分子配列決：
様々な形態の光閉じ込め及び関連する光システムを含む対象装置は、多重化単一-分子シーケンスに特に適している。従って、本発明は、多数の標的核酸を同時にシーケンスする方法を提供する。当該方法は、一般的に、(a) 本発明の光閉じ込めのアレイを提供し；(b) 多数の標的核酸分子、標的核酸分子に相補的なプライマー、重合化酵素、及び多数の新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるべき1種以上のヌクレオド又はヌクレオチドアナログ、ここで各鎖は各々の標的核及び分子に相補的である、を閉じ込め内で混合し；(c) 当該混合物を、鋳型-指示重合による新生ヌクレオチド鎖の形成に好適な条件下で重合反応に供し；(d) 入射光ビームで導波路を照射し；並びに (e) 各新生的ヌクレオチド鎖に取り込まれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを特定すること、を含む。

対象のシーケンス法は、二重-鎖又は単一-鎖、線状又は環状核酸（例えば、環状DNA）、単一鎖DNAヘアピン、DNA/RNAハイブリッド、ポリメラーゼの結合のための認識部位を有するRNA、又はRNAヘアピンを含む、任意の核酸分子の中の核酸分子を決定するために使用することができる。本発明の方法は、複合核酸構造、例えば5'又は3'非-翻訳配列、タンデムリピート、エキソン又はイントロン、染色体断片、全染色体又はゲノム、をシーケンスするために好適である。

1つの局面では、重合反応の間の塩基付加の時間的順序は、核酸の単一分子で特定される。プライマーの鋳型-指示型伸張又は重合が光閉じ込め内で起こっている間に、かかる特定ステップは起こる。好ましい実施態様では、単一-分子シーケンスは、各塩基付加の事象の後に、任意の反応物又は副生成物（例えば、ヌクレオチドから開裂されたフルオロフォア）を転写し、分離し又は洗浄して除くことを要しない均一アッセイで実行される。
均一アッセイのある局面では、単一-分子のシーケンスは、次の塩基配列を読む前に混合物に反応物を添加しないで実行される。閉じ込め上の大体積の試薬からの反応物の拡散が取り込みの検出を邪魔であろうから、このアッセイでは、ヌクレオチドの段階的付加又は副生成物の除去は、必要でない。ポリメラーゼが好適なヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを新生DNA鎖に頻繁に取り込むので、配列情報は連続して生じる。かかる単一分子シーケンスの詳細な議論に関しては、例えば、全ての目的のためにその全体が参照として本明細書に引用される公開された米国特許出願第2003/0044781号、及びMJ. Levene, J. Korlach, S.W. Turner, M Foquet, H.G Craighead, W W. Webb, SCIENCE 299: 682-686, January 2003 Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrationsを参照されたい。単一分子は別個に観察されるので、同期化によるロスはない。この方法はまた、生物試料から直接的に採取された標的核酸分子の使用を可能にする。これは、シーケンスを行う前に、標的核酸のクローニング、サブクローニング又は増幅の必要性を最小限にする。

好ましい実施態様では、ポリメラーゼ酵素は、光閉じ込め内の有効観察体積内で提供される。次いで、体積を観察し、そして、妨害、例えば脱保護等なく、増幅していく鎖に連続して取り込まれることができる標識ヌクレオチドアナログを用いながら、相補鎖の鋳型依存的合成は行われる。好ましい局面では、非-導入リン酸基又はその誘導体、例えば、取り込みの際にアナログから開裂されるヌクレオチドポリリン酸のベータ、ガンマ、デルタリン酸等上に標識を有するヌクレオチドアナログは、かかる方法で使用される。かかるヌクレオチドアナログは、増幅していく核酸鎖に連続的に取り込まれ、そしてかかる標識が合成鎖と会合して残った場合に生じる合成の際のシグナルノイズを増加しないように、取り込みプロセスにおいて除去される標識群を有するという利点を提供する。加えて、取り込み事象は、（非-取り込みアナログの観察体積への無作為拡散と比べて）観察体積内の標識アナログの長期の存在を提供するので、取り込み内の関連するシグナルは容易に同定可能である。特に好ましい局面では、単一分子核酸シーケンス適用に関しては、対象の特定の配列断片のタンデムリピートの重複又は反復な読み/合成を提供する鋳型核酸が使用される。特に、本発明のシステムは、典型的には、ポリメラーゼ酵素による鋳型依存的合成において起こる得るエラーの修正するために、多数の方法で重複を提供する。例えば、本発明の方法は、単一分子に焦点を当てるので、ポリメラーゼによるミス-取り込みがデータ分析のために修正されることを確実にするために、重複プロセスが採用される。

第一の局面では、かかる重複は、例えばマルチ-ウェルプレートの単一ウェルにおいて、対象の所与の配列に適用される、多数の異なった閉じ込めのアレイを利用することにより供給される。この重複に加えて、本発明はまた、単一閉じ込め内で複数回、所与の配列断片（又はそのコピー）の反復シーケンスを提供する。第一の好ましい局面では、ポリメラーゼは環状鋳型の周囲を複数回プロセスし（かかる鋳型の配列の解明を可能にする）ので、かかる反復シーケンスは、環状鋳型フォーマットにおいて対象の配列断片を提供することによって達成することができる。核酸断片の環状化方法は、当業者には公知であり、本発明に従って鋳型配列に容易に適用される。

別の局面では、対象の配列断片を有する鋳型-依存的環状鋳型を用いることにより、同様な結果が達成される。特に、かかる合成生成物は、典型的には、単一線状鎖に環状鋳型の複数コピーを含み、更に、対象の配列断片の反復シーケンスを提供する。更に、重複は、この線状の複数-コピー鋳型を環状化し、複数回、複数コピーを反復してシーケンスすることにより、追加的に達成される。

別の局面では、同様な結果は、単一-分子増幅ストラテジー、それらのいくつかは当業者に公知であるが、で生じるアンプリコンのコンカトメリゼーション（concatmerization）を実行することにより得られる。これらのストラテジーは、単一分子レベルまでの希釈、又は増幅中に2-相エマルション中の小ミセル内の分子の単離を採用することができる。
次いで、結合された（concatmerized）鎖は、単一鋳型としてシーケンスされ、重複情報はこの態様で単一分子から生じる。

更に別の局面では、同様な結果は、二重鎖鋳型に沿って複数の位置にニック及び/又はギャップを有する長い二重鎖鋳型を用いて得られる。次いで、当該分子は、鎖に沿っていくつかの位置で単一分子シーケンスを開始する原因になり得る。各位置は独立に鎖を配列する閉じ込めを含む。いくつかの閉じ込めは同一鎖上で作用するので結果的に、単一分子からの重複情報を提供する同一鋳型が複数回配列される。

具体的な実験構成：
本発明のシーケンス法を実施する際に、対象の標的核酸（複数）、標的核酸に相補的なプライマー、重合酵素及び1種以上のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含む反応混合物は、光閉じ込めのアレイに適用される。好ましくは、各光閉じ込めは、配列される1つの標的核酸分子のみを受ける。これは、シーケンスプロセスに必要とされる反応物の残りを含む大体積の溶液中の少量の標的核酸を希釈することによって達成することができる。代替的には、開口部が側面積において基板よりも狭い非-円筒形の導波路は、複数の標的核酸の挿入を限定する原因となり得る。

標的核酸又はポリメラーゼの光閉じ込めへの固定
標的核酸は、多数の方法により光閉じ込めの内面に固定することができる。例えば、標的核酸は、(1) プライマー又は (2) 単一-鎖標的核酸又は (3) 二重-鎖もしくは部分的二重-鎖標的核酸分子を結合することにより、光閉じ込め上に固定することができる。従って、(1) 標的核酸分子が、結合されたオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされるか、(2) オリゴヌクレオチドプライマーが、固定された標的核酸分子にハイブリダイズされて、増幅された標的核酸分子複合体を形成するか、又は (3) （例えば、補助的タンパク質、例えばプライマーゼとの相互作用により）ポリメラーゼの認識部位が二重-鎖又は部分的に二重-鎖の標的核酸上につくられる、かのいずれかである。増幅された標的核酸分子複合体上の核酸重合酵素は、標的核酸分子に沿って動くために好適な、及び重合部位でオリゴヌクレオチドプライマーを伸張するために好適な位置で提供される。

好ましい局面では、先に記載のように、重合酵素は、閉じ込めの有効観察体積内の対象光閉じ込めの表面に、標的核酸分子複合体が重合酵素に対して移動するために好適な位置で、先ず結合される。

当業者は、リンカー部分を介して共有結合的にもしくは非共有結合的に、又は核酸及び酵素を固定化部分に繋ぐかにより、核酸及び酵素を光閉じ込め上に固定する多くの方法が存在することを理解することになる。これらの方法は、固相合成及びマイクロ-アレイの分野で周知である（Beier他, Nucleic Acids Res 27 1970-1-977 (1999)）。核酸又はポリメラーゼのいずれかを固体支持体に結合させるための結合部分の非-限定的例は、ストレプトアビジン又はアビジン/ビオチン結合、カルバメート結合、エステル結合、アミド、チオールエステル、(N)-官能基化チオウレア、官能基化マレイミド、アミノ、ジスルフィド、ヒドラゾン結合、及びその他を含む。標的核酸又はポリメラーゼに特異的に結合する抗体も、結合部分として採用することができる。加えて、シリル部分は、当該分野で公知の方法を用いて、核酸を基板例えばガラスに直接結合させることができる。

必要な場合には、ポリメラーゼは、それに対する特異的抗体が商業的に入手可能である、1以上のエピトープ、例えばMyc、（インフルエンザウイルス血球凝集素由来の）HA、ポリ-ヒスタジン、及び/又はFLAG、を含むように修飾することができる。加えて、ポリメラーゼは、異種ドメイン、例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース-結合タンパク質（MBP）、特異的結合ペプチド領域（例えば、米国特許第5,723,584号明細書、同第5,874,239号明細書及び同第5,932,433号明細書)、又は免疫グロブリンのFc部分を含むように修飾することができる。これらのドメインに対する各々の結合剤、すなわち、グルタチオン、マルトース及び免疫グロブリンのFc部分に対する抗体は、入手可能であり、本発明の光閉じ込めの表面を被覆するために使用することができる。

ポリメラーゼもしくは核酸が固定するポリメラーゼもしくは核酸のいずれかの結合部分又は薬剤は、当該分野で周知の慣用的な化学的技術により支持体に適用することができる。一般的に、これらの方法は、支持体の標準的な化学的表面修飾、結合部分又は薬剤を含む異なった媒体中で異なった温度レベルでの支持体のインキュベーション、及び可能な次の洗浄及び清浄のステップを含むことができる。

反応混合物：標識ヌクレオチド、ポリメラーゼ及びプライマー：
単一-分子シーケンス法に従って利用した様々なヌクレオチドの種類は、検出可能な標識で複合化される。量子検出器が対象の光閉じ込め内のそれらの存在を検出し、識別することができるからである。好ましい標識は、発光標識、特に蛍光又は発色体標識である。

ヌクレオチド内の検出可能な標識として用いられる様々な官能基は、当該分野で開発されている。表1は、かかる官能基の多数の例を挙げる。別の例は、米国特許第6,399,335号明細書、公開米国特許出願第2003/0124576号、及びThe Handbook-'A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版' (2005) (Invitrogen, Inc.,/Molecular Probesから入手可能)に記載されている。これらは、全て本明細書に参照として引用されている。

これらの官能基又は当該分野で公知の他の好適な官能基を用いて、本発明のシーケンス法に好適なフルオロフォアの多様性が生じ得る。それらは、特に限定されないが、4-アセトアミド-4'-イソチオシアネートスチルベン-2,2'ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-3,5 ジスルホン酸塩 (Lucifer Yellow VS)、N-(4-アニリノ-1-ナフチル)マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン (AMC, クマリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルコールアリン（trifluoromethylcouluarin） (クマリン151); シアノシン; 4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール (DAPI); 5',5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン (ブロモピロガロールレッド); 7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオチアネートフェニル)-4-メチルクマリン; ジエチレントリアミンペンタアセテート; 4,4'-ジイソチオチアネートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸; 4,4'-ジイソチオチアネートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸; 5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド (DNS,ダンシルクロリド); 4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸 (DABCYL); 4-dジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオチアネート (DABITC); エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート; エリスロシン及び誘導体、例えばエリトロシンB及びエリトロシンシソチオシアネート; エチジウム; フルオロセイン及び誘導体、例えば5-カルボキシフルオレセイン (FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン (DTAF)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン (JOE)、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート (FITC)、及びQFITC (XRITC); フルオレサミン; IR144; IR1446; マラカイトグリーンイソチオシアネート; 4-メチルウンベリフェロン; オルトクレゾールフタレイン; ニトロチロシン; パラロサニリン; フェノールレッド; B-フィコエリトリン; o-フタルジアルデヒデド; ピレン及び誘導体、例えばピレン、酪酸ピレン及びスクシンイミジル 1-酪酸ピレン; リアクティブレッド 4 (Cibacron .RTM. ブリリアントレッド 3B-A); ローダミン及び誘導体、例えば6-カルボキシ-X-ローダミン (ROX)、6-カルボキシローダミン (R6G)、リサミンローダミンB塩化スルホニル、ローダミン (Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンX イソチアシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101及びスルホローダミン101の塩化スルホニル誘導体 (テキサスレッド); N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン (TAMRA); テトラメチルローダミン; テトラメチルローダミンイソチアシアネート (TRITC); リボフラビン; ロソール酸及びテルビウムキレート誘導体を含む。対象のシーケンス法に適用可能な別のフルオロフォアは、米国特許第5,866,366号明細書及びWO 01/16375に開示されている。これらはいずれも、本明細書に参照とし引用されている。

標識は、塩基上で、リボースユニット上で又はその組み合わせ上でリン酸骨格に結合することができる。好ましい標識は、シーケンス反応においてヌクレオチドの連続付加を実質的に妨げない標識である。かかる標識は、アルファ-リン酸、ベータ-リン酸、末端リン酸、又はテトラ、ペンタ又はヘキサリン酸ヌクレオチドにおけるデルタリン酸もしくはより末端のリン酸、あるいはヌクレオチドの塩基ユニットに結合される標識を含む。

標識末端リン酸（例えば、dNTPで見られるようなガンマリン酸）を含むヌクレオチドは、シーケンスプロセスにおいて標識をのぞくように求められる別の手段が存在しないため、特に好ましい。核酸重合のプロセスにおいて、ヌクレオチドの結合開裂がアルファ-リン酸とベータ-リン酸との間に起こり、ベータ-リン酸及び末端リン酸（例えば、dNTPで見られるようなガンマリン酸）を重合部位から離す原因となる。そういうわけで、ヌクレオチドが取り込まれるやいなや、末端リン酸に結合した標識は、新生鎖から分離される。一般的に、末端-リン酸-結合ヌクレオチドは、3以上のリン酸、典型的には約3〜約6のリン酸、好ましくは約3〜約5のリン酸を含むことができる。表1は、標識された末端リン酸を有するヌクレオチドの多数の例を挙げる。多くの他の末端-リン酸-結合ヌクレオチドが開発され、本明細書にその全体が参照として引用されている米国特許出願第2003/0124576号に詳述されている。

修飾されたリン酸骨格を含むヌクレオチドも使用することができる。例えば、修飾成分は、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルマセタール、ホルホロジチオネート、ホスホチオネート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、又はそのアナログでよい。

ある実施態様では、本発明で使用されるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは、可逆的保護基を含む可逆的伸張ターミネータである。ある実施態様では、可逆的伸張タームネータ上の保護基は、検出可能な標識に結合される。他の実施態様では、保護基及び検出可能標識は、ヌクレオチドの異なった位置にある。更に他の実施態様では、保護基も標識である。

例証的な可逆的伸張ターミネータは、3'末端に標識リボースユニットを含む。リボースユニット上の各標識は、典型的には、次のヌクレオチド付加事象が重合反応中に起こり得る前に除去しなければならない可逆的保護基として働く。好ましい3'-リボース標識は、好適な波長で光ビームに曝露した際に脱保護され得る、光-除去官能基を含む。

別の例では、可逆的保護基は、ヌクレオチドのリボース単位の2'又は4'位置にある。更に別の実施態様では、可逆的保護基は、塩基（アデニン、チミン、シトシン、グアニン又はウラシル）に連結又は複合化される。可逆的保護基の非-限定例及び特に光開裂保護基は、図14及び15、並びに本明細書に全体が参照として引用される同時係属出願第60/649,009号に記載の分子を含むが、これらに限定されない。

光開裂保護基を開裂するために用いられる波長は、保護基の選択に依拠することになる。波長は、約320 nm〜約800 nmの範囲でよい。ある実施態様では、保護基を開裂するための波長は、標識を検出するために使用される波長とほぼ同一である。他の実施態様では、保護基を開裂するための波長は、標識を検出するために使用される波長とは異なる。

ある実施態様では、非標識ヌクレオチドが実質的にない標識ヌクレオチドの混合物を使用するのが有利である。かかる組成物及びシーケンスのためのその使用は、本明細書に引用される同時係属の出願第60/651,846号に詳述されている。すなわち、組成物は、標識及び非標識ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含む混合物を、非標識もしくは不正確に標識されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを特異的に修飾する薬剤で処理して、ハイブリダイゼーション又はシーケンスアッセイで使用される能力を低減させることにより、調製される。好ましくは、使用される薬剤は、非標識もしくは不正確に標識されたヌクレオチドアナログを特異的に修飾して、ヌクレオチドアナログを、ハイブリダイゼーション又はシーケンスアッセイで使用できるようにする。例えば、ヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション又は鋳型-指示型シーケンスアッセイにおいて、これ以上ワトソンクリック型塩基対に一般的に必要とされる構造を含まないように、修飾することができる。
ある実施態様では、例えば、ヌクレオチドの塩基ユニットが修飾される。ある実施態様では、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログのリン酸基、好ましくは末端リン酸基、は、鋳型-指示重合反応の間に、より低度で新生核酸鎖に取り込まれる分子を与えるように修飾される。より好ましい実施態様では、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの末端リン酸基は、鋳型-指示重合反応の間に、新生核酸鎖に実質的に取り込まれ得ない分子を与えるように修飾される。

薬剤は、1以上の酵素を含むことができる。当該分野で公知の様々な酵素は、特異的なワトソンクリック型塩基対を妨害するために、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、例えば、糖、塩基又はリン酸の構造を開裂するか又は変更することにより修飾するために好適である。具体的な薬剤は、特に限定されないが、グアニン又はアデニンP-リボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、AMPヌクレオシダーゼ、プリン用のヌクレオシドデオキシリボシルランスフェラーゼ、及びオロチン酸P-リボシルトランスフェラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、チミジン又はウリジンヌクレオシダーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオチドホスホリラーゼデオキシリボシルトランスフェラーゼを含む。

ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの末端リン酸基を修飾するために利用できる酵素は、広い群のホスファターゼを含む。かかる酵素の例は、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)からガンマ及びベータリン酸を除くことができる、Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)である。当該酵素は、非標識dNTPを鋳型-指示型シーケンス反応においてポリメラーゼ酵素によって一般的に利用され得るヌクレオシド一リン酸dNMPに特異的に変換することができる。このホスファターゼは、標識されていないヌクレオオチド、例えば末端リン酸、を選択的に修飾する、ことが明らかになっている。従って、末端リン酸-標識及び非標識ヌクレオドの混合物において、SAPは、非標識ヌクレオチドに対して選択的に作用し、高比率の標識ヌクレオチドを、シーケンス反応での取り込みのために利用させるだろう。

使用できる他の好適なホスファターゼは、ウシ腸内アルカリホスファターゼ及び/又は他の哺乳動物のホスファターゼであるクラスタシィアン、及び他の動物由来のホスファターゼを含むが、これらに限定されない。本発明を実施するために有用であるホスファターゼの例は、米国特許20040203097号明細書、同第20040157306号明細書、同第US 20040132155号明細書; 及び同第US 20040110180号明細書に見出される。

任意の他の天然又もしくは合成ホスファターゼ、又は組換えDNA技術によって製造されるホスファターゼはが、（標識ヌクレオチドと比べて）非標識ヌクレオチド又はアナログを重合酵素によって実質的に利用され得る分子に特異的に又は選択的に変換する限り、これらのホスファターゼも使用できる。関連する酵素の活性を増加し拡張して上記の所望の性質を与えるために、直接的分子進化も使用できる。コンピュータ上での及びin situでの様々な突然変異誘発技術も当該分野で利用できる。かかる酵素を生じるための突然変異誘発又はスクリーニングアッセイの例は、非標識ヌクレオチドを有するシステムでの重合破棄の第一試験、及び標識ヌクレオチドの存在下での重合活性の保持の第二選別チェック、を含むことができる。これらの選別はいずれも、高度に多重化したパラレルアッセイの状況で実行することができる。いくつかの有益な特異性を示す酵素は、ある方法により保持し、突然変異を誘発し、再-選別することができる。このような方法は、特異性及び実行性の点で何オーダーもの大幅な改善をつくることが明らかになった。

非標識ヌクレオチド群を選択的又は優先的に修飾することができる酵素も採用できる。
例えば、クレアチンキナーゼ酵素は、アデノシド三リン酸からの1つのリン酸の除去に特異的であり、他の塩基には作用しないだろう。1種以上の非標識ヌクレオチドに選択的又は優先的に作用する他の酵素も使用できる。

上記のヌクレオチド修飾酵素ヌクレオチド又は、ヌクレオチドアナログを予備-処理するために使用できるか、又はハイブリダイゼーション及び/又はシーケンス反応混合物において、例えば他のハイブリダイゼーション又はシーケンス試薬と共に、使用できる。

ヌクレオチドの修飾が起こる反応条件は、修飾酵素の選択によって変化するだろう。1つの局面では、当該条件は以下のパラメータ内で設定することができる：pHは4.0〜12.0、より好ましくはpH 6.0〜10.0、より好ましくは7.0〜9.0、より好ましくは8未満、より好ましくは7〜8、最も好ましくはpH 7.5〜8.5、好ましくは緩衝剤により調整される。緩衝剤は、好ましくはpH 7.5〜pH 8.5のTris-系である。他の緩衝剤も、有機緩衝剤例えばMOPS、HEPES、TRICINE等、又は無機緩衝剤例えばリン酸もしくは酢酸塩特に限定されず、使用できる。緩衝剤又は他の薬剤は、溶液のpHを調整するために添加することができ、それにより酵素の安定性を増加させることができる。必要であるならば、還元剤、例えばジチオトレイトール（DTT）又は2-メルカプトエタノールに限定されないが、酵素の安定性に逆に作用するかもしれない酵素酸化を抑えるために添加することができる。様々な緩衝剤及びpH条件を含む特異的な反応条件の選択は、当業者の技術の範囲内であり、よって本明細書では更に詳述しない。

予備-処理の完了時に、酵素は、少なくとも約65℃に、好ましくは約65℃〜約80℃に反応温度を上昇させることによって熱-不活性化することができる。代替的に、酵素は、反応混合物から、例えば、酵素の大きさよりも小さい分子量分画を有するフィルタ（例えばMillipore）による遠心分離により、除くことができる。

処置後、混合物は、一般的に、非標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチドアナログの約30 %未満、好ましくは約20 %未満、より好ましくは約10 %未満、より好ましくは約5 %未満、より好ましくは約1 %未満、より好ましくは約0.5 %未満、又はより好ましくは約0.1 %未満、及び更により好ましくは約0.01 %未満を含む。この非標識ヌクレオチド又は非標識ヌクレオチドアナログの過剰な混合物は、単一-分子配列反応において標識ヌクレオチドの高分解能検出に特に有用である。

重要なことに、前記の処理の結果は、核酸の合成のプロセス、好ましくは実質的にヌクレオチドのみを用いて鋳型配列を解明するためのプロセス、例えば、天然のヌクレオチドの、ヌクレオドアナログ、特に標識アナログによる実質的に完全な置換、である。実質的にヌクレオチドアナログのみ、特に標識アナログの存在下でのかかる鋳型依存的合成は、これはシーケンス操作における実質的に完全な置換とも称されるが、単一ヌクレオチドが、残りの2つの天然ヌクレオチド中の標識された連鎖終了ヌクレオチドで置換されるか、又はポリメラーゼ鋳型複合体が、かかるアナログが取り込まれるか否かを決定するために一度に1つのアナログのみにより問いただされる、上記のシーケンス法とは相当に異なる。

対象のシーケンス法に好適な別の種類のヌクレオチドは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による検出を可能にする。FRETにおいて、励起したフルオロフォア（ドナー）は、距離-依存的な方法で、その励起状態エネルギーを、光吸収分子（アクセプター）に移動する。エネルギーが移動することができる距離の限界は、標識分子と全体との関係をすぐそばで識別させる。この種類のヌクレオチドは、塩基、リボース又は好ましくはリン酸骨格に結合された（例えば、末端リン酸に結合された）ドナー・フルオロフォア、及び塩基、リボース又はドナーが結合されていないリン酸骨格に結合されたアクセプター・フルオロフォアを含むことができる。好ましい実施態様では、ドナー・フルオロフォアは、末端リン酸に結合され、アクセプター・フルオロフォアは、塩基又はヌクレオチドのリボースユニットに連結される。この種のヌクレオチドの新生鎖への取り込みの際に、これ以上クエンチされないポリリン酸の放出により起こり得る蛍光シグナルが検出できる。重合事象中、相補的ヌクレオチドの取り込みの際に放出される蛍光ポリリン酸のオーダーを決定することにより、標的核酸の塩基配列を推論することができる。この種のヌクレオチドの別の例は、本明細書に参照として引用される米国特許第20030194740号明細書に開示されている。

別の実施態様では、ドナー・フルオロフォアは、ヌクレオチド中に存在することができ、アクセプターはポリメラーゼ中、又はその逆で、存在する。必要ならば、ポリメラーゼ中のフルオロフォアは、緑色蛍光タンパク質（GFP）、又は野生型緑色蛍光タンパク質に比べて異なった発光及び/又は吸収スペクトルを有する突然変異体によって提供することができる。例えば、399 nmで励起し、511 nmで発光するGFP突然変異体H9-40 (Tsien他, Ann. Rev. Biochem. 67: 509 (1998))は、BODIPY、フルオレセイン、ローダミングリーン及びオレゴングリーンと共に使用するための、ドナー・フルオロフォアとして役立つかもしれない。加えて、テトラメチルローダミン、リサミン（登録商標）、テキサスレッド及びナフトフルオレセインは、当該GFP突然変異体と共にアクセプター・フルオロフォアとして使用できる。

蛍光エネルギー移動できる他の代表的なドナー及びアクセプターは、特に限定されないが、4-アセトアミド-4'-イソチオシアネートスチルベン-2,2'ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）；4-アミノ-N-[3-(ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-3,5 ジスルホン酸塩；N-(4-アニリノ-1-ナフチル)マレイミド；アントラニルアミド；BODIPY；ブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体：クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン (AMC, クマリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルコールアリン（trifluoromethylcouluarin） (クマリン151); シアニン色素; シアノシン；4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール (DAPI); 5',5”-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン (ブロモピロガロールレッド); 7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオチアネートフェニル)-4-メチルクマリン; ジエチレントリアミンペンタアセテート; 4,4'-ジイソチオチアネー
トジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸; 4,4'-ジイソチオチアネートジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸; 5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド (DNS,ダンシルクロリド); 4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸 (DABCYL); 4-dジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオチアネート (DABITC); エオシン及び誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート;、エリスロシン及び誘導体：エリトロシンB、エリトロシン、イソチオシアネート; エチジウム; フルオロセイン及び誘導体：5-カルボキシフルオレセイン (FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン (DTAF)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン (JOE)、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、QFITC (XRITC); フルオレサミン; IR144; IR1446; マラカイトグリーンイソチオシアネート; 4-メチルウンベリフェロン; オルトクレゾールフタレイン; ニトロチロシン; パラロサニリン; フェノールレッド; B-フィコエリトリン; o-フタルジアルデヒデド; ピレン及び誘導体：ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル 1-酪酸ピレン; 酪酸エステル量子ドット；リアクティブレッド 4 (Cibacron. TM. ブリリアントレッド 3B-A)ローダミン及び誘導体：6-カルボキシ-X-ローダミン (ROX)、6-カルボキシローダミン (R6G)、リサミンローダミンB塩化スルホニルローダミン (Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンX イソチアシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101の塩化スルホニル誘導体 (Texas Red); N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン (TAMRA); テトラメチルローダミン; テトラメチルローダミンイソチアシアネート (TRITC); リボフラビン; ロソール酸；テルビウムキレート誘導体；Cy 3; Cy 5; Cy 5.5; Cy 7; IRD 700; IRD 800; La Jolla Blue; フタロシアニン; 及びナフタロシアニンを含む。

代替的な構造では、ドナーが、実質的に均一な励起スペクトルを提供するが、各種のアナログ、例えばA、T、G又はCとは異なる発光スペクトルを提供するアクセプターにエネルギーを供与する場合には、ドナー及びアクセプター・フルオロフォアは、各ヌクレオチドアナログ上に存在してもよい。かかる構造は、多数の異なった発光プロファイルのための単一励起源を利用する能力を提供し、利用されるシステムのためのエネルギーインプット要件を減らす。

加えて、フルオレセイン及びローダミン色素を含むキサンチン色素ドナー及びアクセプター対として使用できる。これらの色素の多くは、末端リン酸又はヌクレオチドの塩基に結合するための部位として利用され得るフェニル部分上の修飾置換基を含む。必要ならば、広い範囲の蛍光波長をクエンチすることができるクエンチャーとして作用するアクセプターが使用できる。かかるクエンチャーの代表的な例は、4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ-o)-安息香酸 (DABCYL)、ジニトロフェニル (DNP)及びトリニトロフェニル (TNP)を含む。

本発明に好適な重合酵素は、合理的な合成忠実性を有する鋳型-指示重合を触媒することができる任意の核酸ポリメラーゼでよい。ポリメラーゼは、野生型又は改変型の、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ又は熱分解性ポリメラーゼでよい。好適な熱安定性ポリメラーゼの非-限定的例は、サーマス・アクアチカス（Thermits aquaticus）、サーマス・アクアチカス（Thermus caldophilus）、サーモ・フィリフォーミス（Thermus filiformis）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）、バチルス・ステアロサーモファス（Bacillus stearothermophus）、サーマス・サーモフィリス（Thermus thermophilus）、パイロコッカス・ボイセイ（Pyrococcus woesei）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、及びサーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来のポリメラーゼを含む。有用な熱分解性ポリメラーゼは、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼを含む。

核酸分子の配列を決定するために使用され得る重合酵素の別の例は、大腸菌T7、T3、SP6 RNAポリメラーゼ、並びにAMV、M-MLV及びHIV逆転写酵素を含む。ポリメラーゼは、増幅された単一-鎖核酸の増幅標的核酸配列、複製のオリジン、二重-鎖核酸中のニック又はギャップ、単一-鎖核酸中の二次的構造、補助的タンパク質によってつくられる結合部位、又は増幅単一-鎖核酸に結合することができる。

1つの好ましい実施態様では、重合酵素は、異例の又は修飾型ヌクレオチド、例えばフルオロフォアに連結されたヌクレオチドを取り込むための野生型酵素に比較して、高い効率を示す。組換えDNA技術は、野生型酵素を修飾するために使用することができる。かかる技術は、典型的に、発現ベクター又は発現ベクターのライブラリーの構築、発現が起こるような条件下での形質転換された宿主細胞の培養を含む。非慣用的な又は修飾型ヌクレチドを取り込むことができるポリメラーゼの選択は、任意の慣用的シーケンス法及び本明細書で開示されるシーケンス法を用いて実行することができる。

別の好ましい実施態様では、シーケンスは、高度の能力、すなわち、安定な核酸/酵素複合体を維持することにより核酸の長いストレッチを合成する能力、を示すポリメラーゼで実行することができる。有能なポリメラーゼは、典型的に、約11キロベース超の新生鎖を合成することができる。補助的酵素（例えば、ヘリカーゼ/プライマーゼ）の助けにより、有能なポリメラーゼによっては、50キロベース超さえも合成できる。例えば、ヘリカーゼ/プライマーゼと複合化されたT7 DNAポリメラーゼは、数種類の100キロベースのヌクレオチドを合成することができ、同時に標的核酸との安定複合体を維持する (Kelman他, "Processivity of DNA Polymerases: Two Mechanisms, One Goal" Structure 6: 121-125 (1998))。

別の好ましい実施態様では、シーケンスは、環状複製を回転することができる、すなわち、限定されないがプラスミドバクテリオファージDNAを含む環状DNA鋳型を複製することができる、ポリメラーゼにより実行される。好ましい環状ポリメラーゼの回転は、鎖-置換活性を示し、好ましくは5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が低いか又は5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を本質的に有さない。鎖置換は、環状DNA鋳型のタンデムコピーの合成をもたらし、これは、同一のDNA鋳型を2回以上、再-シーケンスすることができる。同一のDNA鋳型の再-シーケンスは、ポリメラーゼによって作られるエラーを検出するための機会を大幅に増加させる。なぜなら、同一のエラーは、ポリメラーゼによりほとんど繰り返されることはなく、同一のエラーは、確実に、ポリメラーゼ連鎖反応において飛躍的には増幅されないだろう。

本発明に好適な回転環状ポリメラーゼの非-限定的例は、特に限定されないが、T5 DNAポリメラーゼ (Chatterjee他, Gene 97: 13-19 (1991))、及びT4 DNAポリメラーゼホロ酵素 (Kaboord and Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995))、ファージM2 DNAポリメラーゼ (Matsumoto他, Gene 84:247 (1989))、ファージPRD1 DNAポリメラーゼ (Jung他, Proc. Natl. Aced. Sci. USA 84: 8287 (1987)、及びZhu and Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219: 267-276 (1994))、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片 (Jacobsen他, Eur. J. Biochem. 45: 623-627 (1974))を含む。

回転環状ポリメラーゼの好ましい種類は、複製を開始する方法として増幅するタンパク質を利用する。この種類の具体的なポリメラーゼは、修飾型及び非修飾型DNAポリメラーゼであり、ファージΦ29、PRD1、Cp-1、Cp-5、Cp-7、Φ15、Φ1、Φ21、Φ25、BS 32 L17、PZE、PZA、Nf、M2Y (又はM2)、PR4、PR5、PR722、B103、SF5、GA-1、及びポド・ウイルスファミリーの関連するメンバーから選択されるか又は得られる。具体的には、野生型バクテリオファージΦ29ゲノムは、19,285の塩基対の線状二重-鎖DNA（dsDNA）からなり、5'末端に共有結合的に連結する末端タンパク質（TP）を有する。複製を開始するために、ヒストン様ウイルスタンパク質は、おそらく両DNA末端のダブルへリックスの巻き戻しの原因となる複製のオリジンを有する核タンパク質複合体を形成する（Serrano他, The EMBO Journal 16(9): 2519-2527 (1997))。DNAポリメラーゼは、TPによって提供されるヒドロキシ基への第一dAMPの付加を触媒する。このタンパク質-増幅事象は、鋳型への第二3'ヌクレオチドとは反対に起こり、開始生成物（TP-dAMP）は、DNA内の1つの位置を後退させて、末端ヌクレオチドを取り戻す。開始後、同一のDNAポリメラーゼは、DNA鎖の1つを複製し、同時に他を置換する。Φ29 DNAポリメラーゼの高能力及び鎖置換能は、ヘリカーゼ又は補助的因子の不存在下で、Φ29 TP-含有ゲノム（TP-DNA）の完全な複製を可能にする（Serrano他，The EMBO Journal 16(9)：2519-2527 (1997) により参照)。

低5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する修飾Φ29 DNAポリメラーゼも、記載されている（米国特許第5,198,543号明細書及び同第5,001,050号明細書、これらはいずれも本明細書に引用される)。合成される新生鎖を過剰に分解する場合には、これらのポリメラーゼは、5'→3'エキソヌクレアーゼとしてのシークエンスに特に望ましい。

様々な補助的タンパク質の使用により、鎖置換は増加することができる。それらは、ヘリカーゼ（Siegel他, J Biol Chem 267：13629-13635 (1992))、単純ヘルペスウイルスタンパク質 ICP8 (Skahter and Lehman, Proc. Natl, Acad Sci USA 91(22) 10665-10669 (1994))、単一-鎖DNA結合タンパク質 (Rigler and Romano, J. Biol. Chem 270：8910-8919 (1995))、アデノウイルスDNA-結合タンパク質 (Zyderveld and van der Vhet, J. Virology 68(2) 1158-1164 (1994))、及びBMRF1ポリメラーゼ補助的サブユニット (Tsurumi他, J. Virology 67(12).7648-7653 (1993)) に限定されない。

好ましい実施態様では、シーケンス反応は、光閉じ込めに固定される、鎖-置換重合酵素と環状標的DNAとの単一複合体を含む。標識ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ及びプライマーを混合するときに、鎖-置換重合酵素は、新生鎖の合成を方向付け、様々な種類の標識ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの、新生鎖への取り込みの時間系列が登録される。必要ならば、鎖-置換ポリメラーゼは、標的DNAの複数のタンデムリピートを合成させ、従って、同一の環状DNA標的を複数回、再-シーケンスさせる。標的DNA分子の少なくとも2つのタンデムリピート、より好ましくは少なくとも約3〜約10又は約3〜約100タンデムリピート、好ましくは約100万リピートにすぎないに取り込まれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの時間系列を登録することが好ましい。この複数の重複配列シーケンスは、等温条件下及び/又は周囲温度で起こり得る。

対象の方法を用いて、シーケンスは、少なくとも1塩基/秒、好ましくは少なくとも10塩基/秒、より好ましくは少なくとも100塩基/秒の速度で実行することができる。ポリメラーゼは、in vivoで1,000塩基/秒、in vitroで750塩基/秒を重合することができる（例えば、Kelman他, "Processivity of DNA Polymerases: Two Mechanisms, One Goal," Structure 6: 121-125 (1998); Carter他, "The Role of Exonuclease and Beta Protein of Phage Lambda in Genetic Recombination. II. Substrate Specificity and the Mode of Action of Lambda Exonuclease，"J. Biol. Chem. 246: 2502-2512 (1971); Tabor他, "Escherichia coli Thioredoxin Confers Processivity on the DNA Polymerase Activity of the Gene 5 Protein of Bacteriophage T7，"J. Biol. Chem. 262: 16212-16223 (1987); 及び、Koval他, "Toroidal Structure of Lambda-Exonuclease" Science 277: 1824-1827 (1997)（これらは本明細書に参照として引用される）を参照)。

反応条件：
本発明のシーケンス方法は、鋳型-指示重合が重合酵素を用いて起こり得るような条件下で行われる。1つの局面では、重合酵素の基質、すなわちシーケンス反応に存在する様々な種類のヌクレオチドは、生理学的に関連する濃度に調整される。例えば、シーケンス反応に用いられるヌクレオチドは、ほぼ重合酵素のミカエリス定数の濃度で存在する。かかる濃度は、典型的には、約1マイクロモーラー〜約50マイクロモーラー又は約100マイクロモーラーの範囲である。

シーケンス方法は、採用される4未満の標識を用いて達成することもできる。3つの標識を用いて、(1) 4番目の塩基が他の標識のシグナル間で一定の暗期遅延として検出される場合、又は(2) 明らかに、両核酸鎖のシーケンスにより、核酸鎖のシーケンスから配列を推論することができる。この場合には、各塩基対から陽性蛍光シグナルを得られからである。2つの標識を利用する別の可能なスキームは、1つのフルオロフォアで標識した4塩基及び別のフルオロフォアで標識した他の3塩基を有することである。この場合には、他の3塩基は、配列を与えないが、特定の塩基間で生じる多数の塩基が他のフルオロフォアにより特定されるに過ぎない。異なったシーケンス反応で異なった塩基によるフルオロフォアの当該特定を繰り返すことにより、連続的なシーケンス操作から配列全体が推論され得る。2つの標識のみを利用するこのスキームを拡張して、シーケンス操作当たり、2標識塩基のみを利用して完全配列を得ることさえもできる。

シーケンス方法は、周囲温度で等温条件下で、又はサーマルサイクリング条件下で実行できる。緩衝剤、pH等の選択は、当業者の技術の範囲内であり、よってここでは詳述しない。

検出：
対象のシーケンス法は、光閉じ込め内に閉じ込められた個々の分子の画像を必要とする。ポリメラーゼ及び/又はヌクレオチドは、特定の種類のヌクレオチドが新生鎖に取り込まれるときに、識別可能な光シグナルを発光するフルオロフォアで標識される。ヌクレオチドが光閉じ込め内で新生鎖に連続的に付加されるので、識別可能なシグナルの配列が検出される。好ましい実施態様では、かかる検出は、各ヌクレオチド付加事象の後に、反応物もしくは副生成物（例えば、ヌクレオチドから開裂されるフルオロフォア）の移動、分離又は洗浄の必要なく実行される。この好ましい実施態様の1つの局面では、配列検出は、取り込まれるべき次の塩基配列ヌクレオチドを読む前に、混合物に反応物を加えることなく実行される。

対象の光閉じ込めに閉じ込められた個々の分子の画像化は、光システムの助けを借りて実行される。かかるシステムは、典型的には、少なくとも2つの要素、すなわち励起源及び量子検出器、を含む。これらの要素の多数の例は上記のとおりである。

好ましい実施態様では、励起源はレーザーであり、好ましくは偏光レーザーである。レーザー光の選択は、異なった種類のヌクレオチド及び/又はポリメラーゼに結合されたフルオロフォアに依拠することになる。ほとんどのフルオロフォアセント化合物に関して、必要な励起光は、約300 nm〜約700 nmの範囲内にある。タンパク質性フルオロフォア、例えば緑色-蛍光タンパク質及びその突然変異体に関しては、励起波長は、約488 nm〜約404 nmの範囲でよい。当業者は、規定の実験により所与のフルオロフォアを励起するための好適な励起波長を知り又は確認することができるだろう（例えば、参照として先に引用された、The Handbook-'A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 第10版' (2005) (Invitrogen, Inc /Molecular Probesから入手可能) 参照)。

励起源の選択における別の考慮は、蛍光の1-量子励起と蛍光の多光子励起との選択である。検出に結び付けられる多光子励起は、多光子顕微鏡（「MPM」）としても知られ、高い感度を提供し、空間分解能MPMは、薄いラスタ-走査平面内の蛍光を励起するために偏光非線状励起を使用するレーザー-走査顕微鏡の形態である。MPMにおいては、慣用的なレーザー-走査共焦点顕微鏡に見られるように、レーザーに焦点が当てられ、試料をラスタ-走査する。レーザーが後ろに延び、試料の前方にくるので、画像は、検出器シグナルをデジタル処理することによりつくられる蛍光強度測定のマトリックスからなる。2-量子励起の可能性は極度に小さく、焦点合わせは焦点の部分的強度を増加させる。2-量子励起蛍光は、通常、MPM中の一次的シグナル源であるが、3-量子又はそれ以上の量子励起蛍光及び第二又は第三-高調波発生も画像化に使用できる。例えば、Webb他. Nature Biotechnology (2003) 21：(11) 1251-1409における多光子顕微鏡の考察を参照。好ましいMPM構成は、MPMレーザー走査顕微鏡、及び約700〜1,000 nmの波長で操作するフェト秒モード-にロックされたチタンサファイアレーザーを備えた、第二-高調波画像を含む。かかる構成は、慣用的な画像多光子顕微鏡のほとんどで、約100量子超/ピクセルを捕らえることができる。

区別可能なシグナルの配列は、要素、例えば光学式読み取り装置、高効率量子検出システム、光電管、ゲート感応性FET、ナノ-チューブFET、フォトダイオード（例えば、アバランシェ型フォトダイオード (APD))、カメラ、電荷結合素子 (CCD)、電子-多重化電荷-結合素子電子 (EMCCD)、補力電荷結合素子 (ICCD)及び共焦点顕微鏡を含む他の光システムによって検出することもできる。

好ましい組み合わせは、広域CCD又はICCD、及びデジタル画像処理能を有する補力ビデオ画像顕微鏡、並びに蛍光褪色回復 (FPR)、及び共焦点多光子能及び連続データ獲得及び制御に連結した蛍光補正分光法 (FCS)を含む。かかる構成は、準弾性光散乱、レーザーDIC干渉分光法、補正分光装置、光学式力顕微鏡の成分、及び時間相関単一光子計数法システム（TCSPC）を更に含んでもよい。

これらの光システムは、光伝達要素、例えば回折格子、アレイ型導波路回折格子（AWG）、光ファイバ、光スイッチ、ミラー、レンズ（マイクロレンズ及びナノレンズを含む）、コリメータを含んでもよい。他の例は、光減衰器、偏光フィルタ（例えば、ダイクロイック・フィルター）、波長フィルタ（低域-通過、バンド-通過、又は高域-通過）、ウエーブ-プレート及び遅延線を含む。ある実施態様では、光伝達要素は、アレイ型光閉じ込めを有する光通信内において平面導波路でよい。

これらの及び当該分野で公知の他の光構成部品は、様々な方法で組み合わせ及び組み立てて、次の反応から発光された区別可能なシグナルの検出を達成することができる。同時かつ独立の核酸シーケンスが起こる場合には、好ましい装置は、多数の光閉じ込めを有するアレイを用いて、並行データ収集を可能にする。1つの局面では、好ましいシステムは、10⁴超の光閉じ込め、2 x 10⁴超の光閉じ込め、又は10⁵超の光閉じ込め、又は2 x 10⁵超の光閉じ込め、又は好ましくは10⁶超の光閉じ込め、又は好ましくは2 x 10⁶超の光閉じ込め、及び更により好ましくは10⁷超又は2 x 10⁷超の光閉じ込め、からシグナルを収集し、処理することができる。別の実施態様では、好ましい構成は、約10塩基/秒、より好ましくは約100塩基/秒、及び更により好ましくは1,000塩基/秒の速度で、同時かつ独立の核酸のシーケンスをリアルタイムで監視することができる。そういうわけで、迅速型シーケンス反応に連結された大規模並行処理は、100,000塩基超/秒の全体シーケンス処理を提供することができる。全体処理は、少なくとも1メガ塩基/秒、好ましくは10メガ塩基以上/秒までスケールアップすることができる。更に、例えば2以上の異なった反応体積中で、複数の異なった配列断片からかかるデータを得ることにより、例えば、ゲノムDNAの連続断片由来の、独立配列を得ることができ、ゲノムシーケンスに直接適用可能な高率のスループットを可能にする。

他の単一-分子適用：
対象の光閉じ込め及び光閉じ込めのアレイは、単一分子解析が望まれる多くの他の化学的及び生物的適用において有用性を見出す。一般的に、対象の光閉じ込めは、酵素、核酸、抗体、抗原等を含む、表面に結合することができ、基質を標識することができる任意の試薬を含む任意の単一分子解析に適用可能である。かかる適用は、生物分子、例えばタンパク質、糖タンパク質、核酸及び脂質：並びに無機化学物質、又はそれらの任意の組み合わせ、を含む識別可能な相互作用を含む。この相互作用は、核酸分子間、核酸とタンパク質間、及びタンパク質と小分子間でよい。

生物分子を含む相互作用の異常は、癌、血管性疾患、神経系及び内分泌疾患の多数の形体を含む、様々な疾患を説明することが長く認識されている。例えばシグナル複合体の構成的活性化及び時期尚早の不活性化の形態での異常相互作用は、現在では、疾患性細胞の異常行動を招くことが知られている。癌の例では、2つのシグナル伝達分子、例えば成長因子受容体とその対応するリガンド、間の異常相互作用は、細胞プロセスの不全をまねく。これは、終局的には、成長不全、足場阻害の欠如、ゲノム不安定性及び/又は細胞転移性をもたらす。

生物的又は化学的分子間の特異的相互作用は、典型的に、探索されることになる標的分子、及び当該標的と特異的に相互作用することができると予測されるプローブを含む。対象の方法を実施するにおいて、特に、対象の方法、標的及びプローブは、光閉じ込め内に置かれる。標的-プローブ複合体は、タンパク質-タンパク質複合体、糖タンパク質-タンパク質複合体（例えば、受容体とリガンドとの複合体）、タンパク質-脂質複合体、及び無機小分子又は有機小分子の複合体でもよい。

好ましくは、各光閉じ込めは、探索される1つの標的のみを含む。これは、閉じ込めのアレイ上の蒸着が一次的分布を生じ、又は大多数の閉じ込めがそこに蒸着される単一標的分子を有することになるように、大容量の溶液中で少量の標的を希釈して達成することができる。代替的に、非-円筒形導波路であって、導波路コアの開口部が塩基よりも側面積が狭い導波路は、多数の標的タンパク質の参入を制限するために用いることができ、同時に多数のより小プローブの参入を許容する。

標的又はプローブは、上記の項で記載したポリメラーゼを固定し、蒸着するために適用可能な方法により、光閉じ込めの内面上に固定することができる。かかる方法は、様々な結合部分によって達成される共有的及び非共有的結合の使用を包含する。結合部分の選択は、標的及び/又はプローブの性質に依拠することになる。例えば、結合部分は、タンパク質標的又はプローブに合成的に連結することができるか、又は組換え法により融合モチーフ又はタグとして作られる。標的タンパク質又はタンパク質性プローブを固定する好ましい方法は、ストレプトアビジン又はアビジン/ビオチン結合対、及び上記の他の結合部分又は薬剤の使用を含む。

反応条件は、研究下にある特定の相互作用に依拠することになる。反応温度、反応時間、緩衝剤の強度、及び標的濃度又はプローブ濃度を変えてもよい。例えば、標的タンパク質に対する結合親和性を測定するために、プローブの濃度を変更してもよい。標的-プローブ複合体の熱安定性を決定するために、反応温度を変えることができる。標的-プローブ複合体の安定性は、pH又は緩衝剤の塩濃度を変えることにより、決定することもできる。必要ならば、相互作用は、生理的に関連する温度及び緩衝剤条件下で試験することができる。生理的に関連する温度は、おおよそ室温から約37℃の範囲である。生理的な緩衝剤は、約6.5〜約7.8、好ましくは約7.0〜約7.5の範囲の中性pHでの生理的塩濃度を含む。所与の標的及びプローブ間のin vitroの特定の相互作用を識別するための反応条件を調整することは、当業者の技術の範囲内であり、よってここでは詳述しない。

標的及び/又はプローブは、一般的に、量子検出器がそれらの相互作用の単一指標を検出することができるように、検出可能な標識で標識される。好適な標識は、「単一-分子シーケンス」の項で開示された標識の全てを包含する。好ましい標識は、発光性標識、特に蛍光又は発色体標識である。

1つの実施態様では、シグナルが、好適なクエンチャーと複合化された対応するプローブとの相互作用の際にクエンチされる、フルオロフォアで標識される。様々な好適なフルオロフォア-クエンチャー対は、上記の項に開示されているので、ここでは詳述しない。
この実施態様の変更形式は、2つの分子が互いに結合する時に識別可能なシグナルを発光するドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで、標的及びプローブを標識する（又はその逆）ことである。適用可能なドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアの範囲も、上に記載されている。当業者は、生物分子及び/又は化学化合物の特異的な相互作用の指標である識別可能なシグナルを生じるための、検出可能な標識及びその組み合わせの多様性を理解するだろう。

特異的な相互作用の識別可能なシグナル指標の検出は、本明細書に記載の光システムの助けを借りて実行される。単一-分子シーケンスに適用可能な任意のシステムは、他の生物分子及び/又は化学化合物間の相互作用を検出するために同等に好適である。同時及び独立の標的-プローブ相互作用が起こる場合には、好ましいシステムは、多数の光閉じ込めを有するアレイを用いる並行データ収集を可能にする。1つの局面では、好ましいシステムは、10⁴超の光閉じ込め、2 x 10⁴超の光閉じ込め、又は10⁵超の光閉じ込め、又は2 x 10⁵超の光閉じ込め、又は好ましくは10⁶超の光閉じ込め、又は好ましくは2 x 10⁶超の光閉じ込め、及び更により好ましくは10⁷超又は2 x 10⁷超の光閉じ込め、からシグナルを収集し、処理することができる。

特異的タンパク質-タンパク質相互作用の存在を検出する点で、前記方法の適用は特に重要である。かかる適用は、一般的に、光閉じ込め内に置かれたタンパク質性プローブ及び標的タンパク質を採用する。この実施態様の1つの局面では、特異的タンパク質-タンパク質相互作用は、細胞表面受容体と対応するリガンドとの間である。細胞表面受容体は、細胞血漿膜上に固定された又は細胞血漿膜中に挿入された分子である。それらは、血漿膜の構成成分としてばかりでなく、様々な生物機能を支配する調節要素としても働く、タンパク質、糖タンパク質、多糖及び脂質の大ファミリーを構成する。別の局面では、特異的タンパク質-タンパク質相互作用は、細胞表面受容体及び免疫リポソーム又は免疫毒を含む。更に別の局面では、特異的タンパク質-タンパク質相互作用は、細胞質タンパク質、核タンパク質、シャペロンタンパク質、又は他の細胞内膜構造に固定されたタンパク質を含んでもよい。更に別の局面では、特異的タンパク質-タンパク質相互作用は、標的タンパク質（例えば抗原）と当該抗原に特定的な抗体との間である。

抗原と抗体との特異的相互作用は、免疫アッセイの文脈で考察した。当該分野では、様々な免疫アッセイが存在するが、そのうちのいずれも単一-分子検出ができない。例えば、慣用的なラジオイムノアッセイは、イムノブロット上で、抗原群と放射活性的に標識された抗体群との間の相互作用を検出する。ELISA (酵素固定化免疫測定）と称される別の慣用的な免疫アッセイは、抗原-特異的抗体、及び特異的抗体に結合する酵素-結合型一般抗体を利用する。抗原と抗体との特異的相互作用は、基質を結合酵素に添加する際に見ることができる。かかるアッセイは、検出される全ての相互作用の測定群を提供するイムノブロット上で再度、実行される。

対象に光閉じ込めは、単一−分子イムノアッセイを行うための効果的な手段を提供する。慣用的イムノアッセイとは異なり、抗原と抗体との特異的相互作用は、単一-分子レベルで解決され得る。本発明で具体化された光閉じ込めの全ては、単一-分子イムノアッセイを行うために適用可能であり、特に所望のシステムは、比較的高充填率を有する光閉じ込めのアッセイを含む。例えば、好ましいシステムは、0.0001超、より好ましくは約0.001超、より好ましくは約0.01超、及び更により好ましくは0.1超の充填率を有する導波路のアレイを含む。

対象のイムノアッセイを実行する際に、抗体は、放射活性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素タグ、例えばジゴキシゲニン、β-ガラクトシターゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシターゼ、アビジン/ビオチン複合体、及び本明細書に開示された検出可能な任意の標識から選択される好適な標識で標識される。

対象のイムノアッセイは、生物学的存在を特徴付け、抗体治療法を選別し、及び標的抗原の構造的配置を決定するために実行することができる。例えば、生物学的存在に特異的である又は生物学的存在によって産生される副生成物に特異的である抗体を含むイムノアッセイは、抗体-複合体（antibody-entity complex）を形成することにより、生物学的存在を同定するためにきまって使用されている。イムノアッセイは、治療可能性の標的抗原の生物活性を活性化又はダウン-レギュレートすることができる抗体を選別するために採用することもできる。イムノアッセイは、異なった構造で折り畳まれた標的タンパク質を識別することができる抗-イデオタイプ抗体を用いて、構造的配置を決定するためにも有用である。

前記の単一-分子解析の別の重要な適用は、酵素的ターンオーバーサイクル、動的挙動、折り畳み及び非折り畳み中間体、及び結合親和性を決定することを含んでもよい、酵素反応速度論を試験することである。研究下にある酵素は、光閉じ込め内に固定されてもよく、又は対象の光閉じ込め内に閉じ込められた溶液中に存在してもよい。

本発明によって具体化された光閉じ込めの全ては、酵素反応速度論を試験するために採用することができる。特異的な光閉じ込めの選択は、研究下にある特異的な特徴に依拠することになる。例えば、光閉じ込めの基部よりも狭い上面に開口部を有する非-円筒形コアを含む光閉じ込めは、酵素反応の結合速度定数（率）を測定するために好ましい。この構造は、反応物及び基質の拡散を著しく制限し、観察体積における平均滞留時間を増加させる。一方、基部よりも側面積が広い開口部を有するコアを含む光閉じ込めは、当該構造に入る立体的又はエントロピー的障害をかけることになり、よって、大分子の酵素又は酵素複合体の接近可能性を測定するために有用である。

測定群における対象の光閉じ込めの使用：
本発明の光閉じ込めは単一-分子解析を行う点で有用で特に有用であるが、対象の閉じ込めは、大量の測定群のハイスループット実行にも適している。従って、本発明は、多数の分子の間の相互作用を検出する方法であって、以下のステップ：ゼロ-モード導波路のアレイに非常に接近して多数の分子を置き、ここで、当該アレイ内個々の導波路は、光ビームの入射波長で当該アレイを照射した時に、多数の回折オーダーで散乱する検出可能な回折強度を与えるために十分な距離により分離される；入射波長でゼロ-モード導波路のアレイを照射し；及び、当該複数の回折オーダーで入射波長の回折散乱の強度における変化を検出し、それによって当該複数の分子間の相互作用を検出すること、を含む方法を提供する。

この方法に採用されるアレイは、典型的に、入射波長に対して非常に離れた隙間を介して光閉じ込めを含む。入射光（例えば、入射光の波長の半分）に対して非常に離れた個々の光閉じ込めのかかる隙間は、スペクトル反射の角度から離れた所与の角度での入射光の回折散乱に対して大きな効果を与える。この実施態様の1つの局面では、アレイは、入射光の1超の波長、通常、入射光の1.5倍超であるが、通常、入射光の150倍を越えない波長により分離される個々の光閉じ込めを含む。

入射光に対して非常に離れた隙間を介して光閉じ込めを有するアレイも、所望の性質を有する。角度-依存的散乱は、ある適用には不利であり得るバックグラウンドシグナルを生じることがあるが、光閉じ込めの大きさ及び形状を特徴付けるために特に好適な手段を提供する。それは、特に非標識分子を含む分子相互作用の集合大量測定を容易に可能にする。かかる適用に適したアレイは、一般的に、入射光の1超の波長、通常、入射光の1.5倍超であるが、通常、入射光の150倍を越えない波長により分離される個々の光閉じ込めを含む。

集合大量測定は、典型的に、本明細書に記載の光システムの助けを借りて実行される。
単一-分子シーケンスに適用可能な任意の構成は、この解析に等しく適する。

本発明の光閉じ込めの製造及びシーケンスにおける使用の更なる例は、以下の「実施例」の項で説明する。実施例は、当業者への指針として提供されるものであり、何ら限定するものではない。

実施例 1
以下は、ゼロ-モード導波路の例証的製造方法を提供する。本明細書に記載のパラメータは、例にすぎず、任意の方法において限定するものではない。

1. 基板: 基板は二回研磨した。60/40スクラッチ/ディグ表面品質、熔融シリコンウェハを100ミリメートル(+/-0.2mm)径、175マイクロメートル(+/-25マイクロメートル)厚、及び25マイクロメートル未満の全体的な厚変化にカットした。
2. 洗浄: 5部の脱イオン水、1部の(30% v/v 過酸化水素水)、1部の(30% v/v 水酸化アンモニア水)の混合物をホットプレート上で75℃まで加熱した。テフロン（登録商標）ホルダー又は他の化学抵抗性ホルダーを用いて混合物中にウェハを15分間浸漬した。
3. 濯ぎ: ウェハを含むホルダーをRCAクリーン浴から取り出し、脱イオン水浴に浸漬した。ウェハを2分間、この第二浴に放置した。ウェハを含むホルダーを当該浴から取り出し、脱イオン水でスプレイし、濯ぎプロセスを完了した。
4. 乾燥: 1分間の最終の濯ぎステップにおいて、ウェハを乾燥し、同時に、乾燥したきれいな窒素流を用いてホルダー内に維持した。
5. 酸素プラズマ: 次いで、ウェハをGlenn 1000pプラズマ・アッシャー中に置き、140 mTorrの圧、40kHz周波数での400ワットの前進的力で、プラズマエッチングモードで使用した（ウェハは、粉末状シェルフ上で、かつ別の粉末状シェルフの下に置いた）。プラズマを10分間維持した。分子状酸素の18 sccm流を使用した。
6. 蒸気操作（Vapor Priming）: イールドエンジニアリングシステム（Yield Engineering Systems）蒸気操作オーブンにおいて酸素プラズマの後、ウェハを3分以内に装着した。ウェハは、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）接着促進剤の層で被覆した。
7. 電子ビームレジストコーティング: NEB-31電子ビームレジスト（Sumitomo Chemical America)を用いるマニュアルスピナーユニット内で蒸気操作を行った後、ウェハを15分以内に被覆した。約3 mlをウェハ上に施行し、次いで60秒間、4500 rpmで回転した。初期加速及び減速は、3秒に設定した。
8. レジスト焼結: ウェハを115℃の温度で2分間、CEEホットプレート上で焼結した。プレートは、ウェハとホットプレート表面との良好な熱接触を可能にする真空構造に備えた。
9. 金蒸発: レジストで被覆された面上にある、10 nmの金層をウェハ上で熱蒸発させた。蒸発前に、2 10e-06 Torr未満の圧力に到達する必要がある。蒸発は約2.5オングストローム/秒の速度で行い、Inficonコントローラを用いて監視した。
10. 電子ビーム曝露: ゼロ-モード導波路からなるパターンは、高分解能の電子ビームリソグラフィー手段、例えばLeica VB6-HR装置を用いて、ウェハ上に曝露した。ゼロ-モード導波路は単一エクセル（exel）要素としてパターン化した。見掛1ナノアンペアの電流及び1の可変分解ユニットにおいて、５ナノメートルのエクセル設定に関して、10000マイクロクーロン/平方センチメートル〜300000マイクロクーロン/平方センチメートルの範囲でよい。
11. 後曝露焼結: 次いで、ウェハを、真空構造に同様に備えた、ホットプレート上で95℃で2分間、後曝露焼結に供した。
12. 金エッチング: 電子ビーム装置から除いた後、10ナノメートルの金層を、金腐食液TFAを用いて室温で、10秒間で除いた（GE 8148, Transene Corporation)。ウェハは、ステップ2で用いたものと同様のテフロン（登録商標）ホルダーに維持した。
13. 濯ぎ: ウェハを含むホルダーを金腐食液浴から取り出し、脱イオン水の浴に浸漬した。ウェハをこの第二浴中で、2分間以内、穏やかに手攪拌しながら放置した。ウェハを含むホルダーを当該浴槽から取り出し、脱イオン水でスプレイし、濯ぎプロセスを終了した。代替的に、ウェハを含むホルダーを、別の脱イオン水を含む新しい容器に入れた。
14. 乾燥: 1分間の最終の濯ぎステップにおいて、ウェハを乾燥し、同時に、乾燥したきれいな窒素流を用いて、ホルダー内に維持した。
15. 後曝露焼結: 次いで、ウェハを、真空構造に同様に備えた、ホットプレート上で95℃で2分間、後曝露焼結に供した。
16．現像：化学抵抗性のホルダー内のウェハを、現像剤MF-321 (Shipley Chemicals, Rohm-Haas）に室温で30秒間浸漬した。
17．濯ぎ：ウェハを含むホルダーを現像剤の腐食液浴から取り出し、脱イオン水の浴に浸漬した。ウェハをこの第二浴中で、2分間以内、穏やかに手攪拌しながら放置した。ウェハを含むホルダーを当該浴槽から取り出し、脱イオン水でスプレイし、濯ぎプロセスを終了した。
18．乾燥：1分間の最終の濯ぎステップにおいて、ウェハを乾燥し、同時に、乾燥したきれいな窒素流を用いて、ホルダー内に維持した。
19．表面ディスカミング処理：ウェハをアッシャリングモードでのGlenn 1000pプラズマ・アッシャー運転に装填した（ウェハは、粉末状プレートの下のベースプレート上にある）。140 mTorr圧の圧力及び40 kHzでの100ワット前進的力で、酸素プラズマをディスカミング処理する表面に30秒間供した。分子状酸素の18 scm流を使用した。
20．アルミニウム蒸発：ウェハを、表面ディスカミングプロセスの5分以内に、金属蒸発器内に装填した。100 nmの熱で蒸発したアルミニウム層は、ウェハ上に蒸着された。25オングストローム/秒の速度で2 x 10-6 Torr未満の圧力で蒸発させ、Inficonコントローラにより監視した。
21．アルミニウム厚測定： P-10 Profilometer (Tencor)で、アルミニウム厚を測定した。
22．ゼロ-モード導波路デキャスティング：ゼロ-モード導波路は、1165 Stripper (Shipley Chemicals, Rohm-Haas) 浴又はAZ-300T Stripper (Shipley Chemicals, Rohm-Haas) 浴中で、テフロン（登録商標）ホルダー又は他の化学的抵抗性ホルダーにそれらを浸漬することにより、包含されるアルミニウムフィルムからデキャストした。当該浴槽は、超音波装置にStripper及びウェハホルダーを維持する容器を浸漬することにより、超音波に供した。ウェハを30分間又は約45分間超、デキャスティング浴に放置し、追加的に穏やかに攪拌した。
23．濯ぎ：剥離浴を、超音波から取り出した。ウェハを剥離剤（stripper）浴から取り出し、脱イオン水の浴槽に漬けた。ウェハをこの第二浴に2分間、穏やかに手攪拌しながら放置し、ウェハを当該浴から取り出し、脱イオン水でスプレイし、濯ぎプロセスを完了した。
24 乾燥：1分間の最終の濯ぎステップにおいて、ウェハを乾燥し、同時に、乾燥したきれいな窒素流を用いてホルダー内に維持した。
25．フォトレジストコーティング：ウェハを、1500 rpmの速度で、Shipley 1827フォトレジストスパンで被覆した。約5mlのレジストを散布した。加速及び減速を5秒に設定した。
26．レジスト焼結：115℃の温度で15分間、ウェハをCEEホットプレート上で焼結した。
プレートは、ウェハとホットプレート表面との間に良好な熱接触を可能にする真空構造を備えた。
27．ダイシング：ウェハを、樹脂/ダイアモンド刃 (ADT 00777-1030-010-QIP 600) により、K&S-7100ダイシングソー（dicing saw） (Kuhcke & Soffa) を用いて切断した。ダイシング前に、ウェハを低-タック接着テープ上に置いた。
28．ダイ除去：ダイを接着テープから手でとり、保存した。
29．レジスト除去：ダイを最初にアセトン浴に1分間浸漬し、次いで2-プロパノー浴に2分間、穏やかに手攪拌しながら浸漬することにより、1827フォトレジスト層を除いた。
30．ダイ乾燥：乾燥したきれいな空気を用いて2-プロパノール浴を取り出した後、ダイを乾燥した。
31．プラズマ洗浄：ウェハをDrytek 100プラズマエッチャーに装填し、140 mTorrの圧力で酸素状プラズマ、85 sccm酸素の分子状酸素流、及び13 Mhzでの500ワット前進的力のRF力に1分間供した。代替的に、Harrick Plasma Cleaner PDC-32Gを、2 Torrの圧力及び10.5ワットで、乾燥したきれいな空気プラズマに5分間供した。

実施例 2
単一DNAポリメラーゼ分子によるDNA鎖の酵素合成のリアルタイムでのモニタリング
この実験は、光システム及び以下に詳述する反応混合物を用いて、行うことができる。
しかしながら、任意の特定の光システム及びパラメータについての文献、緩衝剤、試薬。
濃度、pH、温度等は、限定されるものではない。それらは、本発明の方法を実行する1例として提供するために含まれる。

単一DNAポリメラーゼ分子によるDNA鎖の酵素的合成は、蛍光標識ヌクレオチドを用いてリアルタイムで追跡記録した。個々のPhi29^N62DDNAポリメラーゼ酵素（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) は、希釈酵素溶液を用いて、非-特異的結合によりゼロ-モード導波路（ZMW）内で固定した。固定後、ZMW構造体を洗浄し、非結合酵素を除き、次いで反応試薬を含む溶液に曝露した。DNA鋳型において、2つのグアニン塩基を特徴的な非対称空間で含む、70-bp予備-増幅した環状DNA配列を用いた（図9A）。鎖-置換重合酵素、例えばPhi29 DNAポリメラーゼは、環状鋳型の周囲に連続的に巻き付き、長鎖のかつ高反復性の相補性DNA鎖を形成した。

R110-dCTP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)は、フルオロフォアがγ-リン酸へのリンカーによってヌクレオチドに結合する蛍光-タグ付きヌクレオチドアナログとして使用した。より一般的に使用される塩基-標識ヌクレオチドアナログと対照的に、結合されたヌクレオチドが増幅するDNA鎖に組み込まれ、次いで、標識が遊離して、DNAポリメラーゼを取り囲む有効観察体積から拡散するので、ガンマ-リン酸-結合アナログは、DNAポリメラーゼの酵素活性により開裂される。フルオロフォアの効率的な除去は、連続的に、低バックグラウンドレベルを保証し、DNAポリメラーゼ活性による著しい干渉を避ける。これらのガンマ-リン酸-結合フルオロフォアの特徴は、この適用には好ましい。なぜなら、この特徴は、4つの塩基全てをフルオロフォア-タグ付きアナログで置換することを可能にするだろうからである。ヌクレオチドの結合、及びミスマッチ事象由来の核酸への核酸の次の取り込みは、区別される。これらの2つのプロセスの速度定数は顕著に異なり、ヌクレオチド取り込みは、ゼロ遅延時間事象を妨害するいくつかの連続的なステップを含むからである。

全ての他のヌクレオチドは、標識なしで供給される。我々は、重合アッセイの前の、アルカリリン酸を用いる酵素精製による非標識dNTPの取り込みに起因してエラーが導入されないことを確実にするために、ヌクレオチドアナログ調製における残存している少量の天然dNTP量を除く非常に効率的な方法を確立した。

これらの条件下でのPhi29^N62D DNAポリメラーゼの速度及び能力を研究するために、反応混合物中で、溶液中でかつガラス表面に固定された酵素を用いてdCTPを完全に置換するR110-dCTPを用いて、取り込み特徴を測定した。このアナログを効率的に利用した酵素は、小さな予備形成された複製フォーク（図9A）及び大きな環状DNA例えばM13 DNAを用いて、回転サイクル合成プロトコールにおいて連続的に、何千の塩基対長の相補的DNAを合成する、ことが見出された。2つのみ、すなわち非対称的に間隔を空けられたR110-dCTPは、この鋳型に取り込まれることになった。同様な実験は、DNAポリメラーゼが、この触媒的活性を喪失することなく、ZMWの底に固定され得る、ことを証明した。

蛍光標識dCTPヌクレオチドの取り込みを、個々のZMW中に発光された蛍光バーストを記録することにより、回転-サークルDNA合成の間、追跡記録した。数分間続いた蛍光の明確な破裂として、多くの導波路で、DNAポリメラーゼ活性を観察した。蛍光時間足跡は、特徴的な2つの破裂パターンを示し（図9B）、各破裂は、R110-dCTPアナログのDNA鎖への取り込み事象及び次のフルオロフォアの開裂事象に対応する。完全時間足跡から得られた破裂間隔のヒストグラムにおいて、DNAアナログに対応する2つのピークは、短鎖（14塩基、約1秒）及び長鎖（54塩基、約4秒）のDNA鋳型断片の間に観察でき、約10塩基対/秒の条件下で、大量溶液中で測定された全体的な平均速度と一致した。

10μMのフルオロフォア濃度でのこの単一-分子活性が容易に観察されたことは、特筆すべきである。従来の方法でつくられる励起体積では、フルオロフォアの数は、非常に高すぎて、DNAポリメラーゼの個々の酵素的ターンオーバーの観察ができない。従って、これらの実験は、(a) ZMWにおけるDNAポリメラーゼの固定はその酵素活性に影響を与えない；(b) 蛍光ガンマ-リン酸-結合ヌクレオチドアナログは、DNAポリメラーゼの活性を阻害しない；及び (c) ZMWは、生理的試薬濃度で単一-分子DNAポリメラーゼ活性を検出するために十分な程度の閉じ込めを提供する、ことを検証することにより、ZMW-系単一-分子DNAシーケンス法の有効性を確認した。より一般的には、これらの結果は、特に、表面に結合することができ及び基質が蛍光的に標識され得る酵素を含み、ZMWが酵素反応速度論の単一-分子解析を可能にすることを証明する。

実施例 3
複数の異なった標識ヌクレオチドを用いるリアルタイムシーケンス
2つの異なった標識ヌクレオチドアナログを用いて、上記の実施例2に記載の実験と同様の実験を行った。実験は、光セットアップ又はシステム及び以下に詳述する反応混合物を用いて行った。しかしながら、任意の特定の光セットアップ及びパラメータに関する文献、緩衝剤、濃度、pH、温度等は限定されるものではない。それらは、本発明の方法を実施する1例として提供するために含まれる。

反応試料の調製：約10μlの反応混合物を1つのシーケンス反応で使用した。反応混合物は、一般的に、0.5〜1 mM MnCl₂、0.1〜1 μM DNA鋳型、10 μM dATP、10 μM dGTP、10 μM SAP-処理Alexa 488-dC4P、10 μM SAP-処理Alexa 568-dT4P、及びDNAポリメラーゼを含む。

ゼロ-モード導波路の製造：重合反応の前に、ゼロ-モード導波路は、典型的にプラズマクリナー中で清浄した。ZMWを覆うPDMSガスケットを導波路上に置き、個々の光閉じ込めを覆った。DNAポリメラーゼを除く上記の反応混合物のアリコートを導波路表面に接触することなく適用した。散乱バックグラウンドを測定した。バックグラウンド（すなわち、ZMWからの蛍光バースト）が低く、許容されるものである場合には、DNAポリメラーゼは、ZMWに適用され、その上に固定されるだろう。固定混合物は、典型的には、25 mM Tris-HCL、pH 7.5及び10 mM ベータ-メルカプトエタノールの緩衝剤中に、0.5〜1 mM MnCl₂、0 1〜1 μM鋳型、15 nM DNAポリメラーゼを含む。ポリメラーゼは、約0℃で約15分間、インキュベーションした後に、ZMWの表面に固定した。次いで、固定反応混合物を除き、上記の反応混合物と置換した。

複数の異なった導波路由来のシグナルの同時収集及び検出のための光セットアップを含み、存在するA488及び568のフルオロフォアの各々の分離のための、好適なレーザー、例えばAr/Kr レーザーに備えられた顕微鏡装置を使用した。この装置は、対物レンズ、及び反射された励起光から発光された蛍光を分離するための、一連のダイクロイック/ノッチ-オフフィルタを含む。発光されたシグナルは、楔状フィルタを通過して、各フルオロフォアのシグナル成分を空間的に分離し、そして各シグナルをEMCDカメラ上に画像化した。

ポリメラーゼ活性測定：ZMWを顕微鏡下に置いた。次いで、透照光を適用した後、所望の時間、例えば2分間以上、カメラを用いて重合反応を監視した。データは、ZMWにおける各反応の蛍光バーストを保存しかつ追跡するコンピュータに自動的に送信した。

反復A塩基のブロックに次いでG塩基のブロックか、又は一連の反復A-G塩基を有する環状DNAは、前記の方法に従ってシークエンスした。標識ヌクレオチドの各取り込み事象に対応する蛍光バーストの代表的なプロファイルを図16に示す。これは、リアルタイムの単一-分子シーケンスが1種超の標識ヌクレオチドにより達成される、ことを示す。複数の別個のリピート及び複数の異なった導波路からのパルスデータの統計的解析は、リアルタイムでの標識塩基の取り込みの配列依存的検出を確立した。

説明の目的で詳細に記載してきたが、当業者により公知の又は理解される多数の変更が本発明の範囲内で実行することができる、ことが容易に理解されるだろう。本明細書に明白に援用されていない範囲内で、この開示中に言及した全ての公開された文献及び特許文書は、全ての目的のためにその全体が本明細書に参照として引用される。

Claims

4 x 10⁴ 閉じ込め/mm²超の基板密度を有する光閉じ込めのアレイ、ここで、当該光閉じ込めは、生物試薬を保持するために好適であり、当該光閉じ込めは、当該生物試薬に存在する個々の分子の観察を許容する有効な観察体積を提供する；及び
当該光閉じ込めの有効観察体積からシグナルを検出する、光閉じ込めに作動的に連結された光学システム
を含む、装置。
前記密度が10⁵ 光閉じ込め/mm²超である、請求項１記載の装置。
前記光閉じ込めが生物試薬を保持する、請求項１又は２記載の装置。
前記生物試薬が酵素を含む、請求項３記載の装置。
前記生物試薬が、基質用の酵素のほぼミカエリス定数(Km)の濃度で存在する当該酵素の基質を更に含む、請求項３記載の装置。
前記濃度が、約1マイクロモーラー超である、請求項５記載の装置。
前記濃度が、約50マイクロモーラー超である、請求項５記載の装置。
前記基質が標識される、請求項５記載の装置。
前記個々の分子が、前記生物試薬に含まれる前記酵素と前記基質との反応の生成物である、請求項５記載の装置。
前記個々の分子が、DNA/ポリメラーゼ複合体である、請求項３記載の装置。
前記個々の分子が、核酸、ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる生物分子である、請求項３記載の装置。
前記個々の分子が、有機又は無機化学化合物である、請求項３記載の装置。
少なくとも1つの個々の閉じ込めが、前記アレイ内の少なくとも1つの他の光閉じ込めから約1000 nm未満の距離で離れている、請求項３記載の装置。
前記アレイ内の前記光閉じ込めが、約200 nm〜約1000 nmの距離で互いに離れている、請求項３記載の装置。
前記アレイが、少なくとも約2 x 10⁵の光閉じ込めを含む、請求項３記載の装置。
前記アレイが、少なくとも約10⁷の光閉じ込めを含む、請求項３記載の装置。
前記個々の分子が、検出可能な標識で標識される、請求項３記載の装置。
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識及び放射活性標識からなる群より選ばれる、請求項１７記載の装置。
前記光閉じ込めが多孔質フィルムからなる、請求項３記載の装置。
前記アレイ内の各閉じ込めが、入射光線を送信する光学送信要素に作動的に結合される、請求項３記載の装置。
前記光学システムが光量子検出器を更に含む、請求項３記載の装置。
前記光閉じ込めが、コアを取り囲む外装材を含む導波路であり、当該外装材が、当該コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光の大部分の伝達を防ぐ、請求項３記載の装置。
前記導波路が、前記コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光の90%超の伝達を防ぐ、請求項２２記載の装置。
前記導波路が、前記コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光の99%超の伝達を防ぐ、請求項２２記載の装置。
前記外装材が、シート、及び各穴がコアを形成する当該シートを通って拡がる1以上の穴を含む、請求項２２記載の装置。
前記コアが円筒型の形状である、請求項２２記載の装置。
前記コアが、非-円筒型の形状である、請求項２２記載の装置。
前記導波路が合金を含む、請求項２２記載の装置。
前記合金がアルミニウム合金である、請求項２８記載の装置。
各閉じ込めが、約1000ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項３記載の装置。
各閉じ込めが、約80ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項３記載の装置。
各閉じ込めが、約10ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項３記載の装置。
請求項３記載の光閉じ込めのアレイ及び当該アレイの使用のための教示マニュアルを含むキット。
前記アレイ内の多数の前記光閉じ込めが、それぞれ標的核酸と重合性酵素との単一複合体、及び約1μM〜約50μMの濃度で存在する1種超の標識ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを保持する、請求項３記載の装置。
前記閉じ込めがゼロ-モード導波路である、請求項３４記載の装置。
生物検体の検出方法であって、以下のステップ：
(a) 4 x 10⁴ 光閉じ込め/mm²超の基板上密度を有する光閉じ込めのアレイを提供し、ここで、当該光閉じ込めは、個々の分子の観察を許容する有効観察体積；及び当該光閉じ込めの有効観察体積からシグナルを検出する光閉じ込めに作動的に結合された光学システムを提供し；並びに
入射光ビーム内と共に検体を含むと予測されるアレイ内で、少なくとも1つの光閉じ込めを照射し、それによって当該検体を検出すること
により、形成される光閉じ込め内で当該検体を光学的に捕獲するステップを含む、前記方法。
多数の反応試料を含む複数の化学反応を行う方法であって、以下のステップ：
(a) 請求項１記載の光閉じ込めのアレイを提供し；
(b) 標識反応物を含む多数の反応試料を、当該アレイ内の当該光閉じ込め内に置き、ここで別個の反応試料は当該アレイ内の異なった閉じ込め内に置かれる；
(c) 化学反応の生成物の形成に好適な条件に当該アレイを供し；及び
(d) 光学システムで当該生成物の形成を検出すること
を含む、前記方法。
多数の標的核酸分子のシーケンス法であって、以下のステップ：
(a) 4 x 10⁴ 光閉じ込め/mm²超の基板上密度を有する光閉じ込めアレイを提供し、ここで当該光閉じ込めは、個々の分子の観察を許容する有効観察体積、及び当該光閉じ込めの有効観察体積からのシグナルを検出する光閉じ込めに作動的に連結された光学システムを提供し；
(b) 標的核酸分子、当該標的核酸分子に相補的なプライマー、重合化酵素、及び多数の新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるべき1種超のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを、当該光閉じ込め内で混合し、ここで各鎖は反応性標的核酸分子に相補的である；
(c) ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの鋳型-指示重合による新生ヌクレオチド鎖の形成に好適な条件下で、ステップ(b)の混合物を重合反応に供し；
(d) 入射光ビームで当該光閉じ込めを照射し；並びに
(e) 各新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを同定すること
を含む、前記方法。
生物試薬中に存在する個々の分子を検出するための、請求項１〜３２、３４及び３５のいずれか１項記載の装置の使用。
固体支持体上の導波路のアレイ、当該アレイは、約0.0001超の充填率を有し、当該導波路は、生物試薬を保持するために好適であり、そして、当該導波路は、当該生物試薬中に存在する個々の分子の観察を可能にする有効観察体積を提供する；及び
当該導波路の有効観察体積からのシグナルを検出する、導波路に作動的に連結された光学システム
を含む、装置。
前記アレイが、約0.001超の充填率を有する、請求項４０記載の装置。
前記アレイが、約0.01超の充填率を有する、請求項４０記載の装置。
前記アレイが、約0.1超の充填率を有する、請求項４０記載の装置。
前記アレイが、約0.001〜約0.1の範囲の充填率を有する、請求項４０記載の装置。
前記生物試薬が、酵素、及び基質用の酵素のほぼミカエリス定数(Km)の濃度で存在する当該酵素の基質を含む、請求項４０記載の装置。
前記濃度が、約1マイクロモーラー超である、請求項４５記載の装置。
前記濃度が、約50マイクロモーラー超である、請求項４５記載の装置。
前記濃度が、約100マイクロモーラー超である、請求項４５記載の装置。
前記基質が標識される、請求項４５記載の装置。
前記個々の分子が、前記生物試薬中に含まれる前記酵素と前記基質との反応生成物である、請求項４５記載の装置。
前記個々の分子がDNA/ポリメラーゼ複合体である、請求項４０記載の装置。
前記個々の分子が、核酸、ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる生物分子である、請求項４０記載の装置。
個々の分子が有機又は無機化学化合物である、請求項４０記載の装置。
前記の個々の分子が検出可能な標識で標識される、請求項４０記載の装置。
前記検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識及び放射活性標識からなる群より選ばれる、請求項５４記載の装置。
前記導波路が多孔質フィルムからなる、請求項４０記載の装置。
前記導波路が入射光ビームを伝達する光学伝達要素に作動的に連結される、請求項４０記載の装置。
前記光学伝達要素が、マイクロレンズ、ナノレンズ、アレイ導波路格子、光スイッチ、光ファイバ、光減衰器、偏光フィルタ、位相差板及び遅延線からなる群より選ばれる要素を含む、請求項５７記載の装置。
前記光学システムが、光量子検出器を更に含む、請求項４０記載の装置。
前記光量子検出器が、光学リーダー、高効率光量子検出システム、光ダイオード、カメラ、電荷結合素子、電子-増幅電荷結合素子、及び強化電荷結合素子からなる群より選ばれる、請求項５９記載の装置。
カットオフ波長よりも長い波長を有する入射電磁エネルギーの大部分の伝達を防ぐ、請求項４０記載の装置。
前記アレイの個々の導波路が、コアを取り囲む外装材を含み、前記個々の導波路が、当該コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射電磁エネルギーの90 %超の伝達を防ぐ、請求項６１記載の装置。
前記アレイの個々の導波路が、コアを取り囲む外装材を含み、前記個々の導波路が、当該コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射電磁エネルギーの99 %超の伝達を防ぐ、請求項６１記載の装置。
前記アレイの個々の導波路が、コアを取り囲む外装材を含み、前記個々の導波路が、当該コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射電磁エネルギーの90 %超の伝達を防ぐ、請求項６２記載の装置。
前記外装材がシート、及び各穴が個々の導波路のコアを構成するシートを通って拡張する1以上の穴を含む、請求項６１記載の装置。
前記アレイの個々の導波路が、円筒型であるコアを取り囲む外装材を含む、請求項６１記載の装置。
前記アレイの個々の導波路が、非-円筒型であるコアを取り囲む外装材を含む、請求項６１記載の装置。
前記外装材が合金を含む、請求項６１記載の装置。
個々の導波路が、約1000ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項４０記載の装置。
個々の導波路が、約80ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項４０記載の装置。
個々の導波路が、約10ゼプトリットル未満の有効観察体積を提供する、請求項４０記載の装置。
請求項４０記載の導波路のアレイ、及び当該アレイの使用のための教示マニュアルを含むキット。
生物検体を検出する方法であって、以下のステップ：
(a) 約0.0001超の充填率を有する導波路のアレイを提供し；及び
(b) 当該検体を含むと予側されるアレイ内で少なくとも1つの導波路を入射光ビームで照射し、それによって当該検体を検出すること
によって生成する光閉じ込め内で当該検体を光学的に捕獲することを含む、前記方法。
複数の反応試料を含む多数の化学反応を行う方法であって、以下のステップ：
(a) 約0.0001超の充填率を有する導波路のアレイを提供し；
(b) 標識反応物を含む多数の反応試料を、当該アレイ内の導波路内に置き、別個の反応試料は当該アレイ内の異なった導波路内に置かれる；
(c) 化学反応の生成物の形成に好適な条件に当該アレイを供し；及び
(d) 光学システムで当該生成物の形成を検出すること
を含む、前記方法。
多数の標的核酸分子をシーケンスする方法であって、以下のステップ：
(a) 約0.0001超の充填率を有する導波路のアレイを提供し；
(b) 標的核酸分子、当該標的核酸分子に相補的なプライマー、重合酵素、及び多数の新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるべき1種超のヌクレオチド又はヌクレオドアナログを混合し、ここで各鎖は各々の標的核酸分子に相補的である；
(c) ステップ(b)の混合物を、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの鋳型-指示重合による新生ヌクレオチド鎖の形成に好適な条件下で重合反応に供し；
(d) 入射光ビームで当該導波路を照射し；並びに
(e) 各新生ヌクレオチド鎖に取り込まれるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを同定すること
を含む、前記方法。
生物試薬中に存在する個々の分子を検出するための、請求項１〜３１のいずれか１項記載の装置の使用。
標的核酸分子を鋳型-指示重合反応に供して、多数の種類のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの存在下で当該標的核酸分子に相補的である新生核酸鎖を得；及び
ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの新生ヌクレオチド鎖への取り込みの時間系列を登録すること
を含む、核酸シーケンス法。
前記標的核酸分子が、環状核酸である、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、環状DNAである、請求項７８記載の方法。
前記鋳型-指示重合反応が、前記標的核酸分子内の同一のヌクレオチド配列を、複数回、処理する、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、前記標的核酸分子内に複数回存在するヌクレオチド配列を含む、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、環状核酸の鋳型依存的複製の生成物を含む、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、重合酵素によって1回超シーケンスされる、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、重合酵素によって2回超シーケンスされる、請求項７７記載の方法。
前記ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログが標識を更に含む、請求項７７記載の方法。
前記標識が、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの塩基、糖部分、アルファリン酸、又はベータリン酸の位置で、当該ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに結合される、請求項７７記載の方法。
前記標識が、末端リン酸の位置で、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに結合される、請求項７７記載の方法。
前記標識が、一リン酸、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸及び六リン酸からなる群より選ばれるリン酸部分を含む、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの末端リン酸上にある、請求項７７記載の方法。
前記ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの各種が、前記登録ステップで、互いに識別される異なった標識を有する、請求項７７記載の方法。
前記標識が、蛍光共鳴エネルギー転移ドナー又はアクセプターである、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、支持体に結合される、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子が、支持体に結合されるプライマーにハイブリダイズされる、請求項７７記載の方法。
前記重合酵素が、支持体に結合される、請求項７７記載の方法。
前記登録が、鋳型-指示重合反応が進行している間に行われる、請求項７７記載の方法。
前記登録ステップが、前記多種類のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログにおいて提供されるヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを同定することを含む、請求項７７記載の方法。
前記鋳型-指示重合反応が光閉じ込めで起こる、請求項７７記載の方法。
前記鋳型-指示重合反応が光閉じ込めのアレイで起こる、請求項７７記載の方法。
前記鋳型-指示重合反応がゼロ-モード導波路で起こる、請求項７７記載の方法。
前記標的核酸分子及び重合酵素が、光閉じ込め内に固定された単一複合体を形成する、請求項７７記載の方法。
前記光閉じ込めのアレイが、約0.0001超の充填率を有する、請求項９７記載の方法。
前記光閉じ込めのアレイが、4 x 10⁴ 光閉じ込め/mm²超の基板密度を有する、請求項９７記載の方法。
前記光閉じ込めのアレイが、10⁵ 光閉じ込め/mm²超の基板密度を有する、請求項９７記載の方法。
表面がそれに結合される重合酵素アレイを有し、当該アレイのメンバーが、鎖-置換活性を有する個々にかつ光学的に分離された重合酵素を含む、表面を有する固体支持体。
前記アレイ内の少なくとも1つの個々の重合酵素が、新生鎖が重合酵素による鋳型-指示重合を介して形成され得る標的核酸に会合される、請求項１０３記載の固体支持体。
個々にかつ光学的に分離された重合酵素の各々が、光閉じ込めに別個に閉じ込められる、請求項１０３記載の固体支持体。
前記閉じ込めがゼロ-モード導波路である、請求項１０５記載の固体支持体。
ゼロモード導波路に固定された第一分子複合体を含むゼロモード導波路であって、当該分子複合体が標的核酸と複合化された重合酵素を含み、当該重合酵素が、当該標的核酸の鋳型-依存的複製を介して当該標的核酸内でヌクレオチド配列を複数回処理する、前記導波路。
前記標的核酸が環状核酸を含む、請求項１０７記載のゼロモード導波路。
前記標的核酸が、標的核酸内に複数回存在するヌクレオチド配列を含む、請求項１０７記載のゼロモード導波路。
前記標的核酸が環状核酸を含む、請求項１０８記載のゼロモード導波路。
前記標的核酸配列が線状核酸を含む、請求項１０８記載のゼロモード導波路。
コアを取り囲む外装材を含む光閉じ込めを製造する方法であって、以下のステップ：
(a) フォトレジスト層で被覆された基板を提供し；
(b) 当該コアの境界を特定するために当該フォトレジスト層をパターン化し；
(c) 十分量のフォトレジストが当該コアを占有するように、当該特定された境界を取り囲む当該フォトレジスト層を取り除き；
(d) 残存しているフォトレジスト及び当該基板上に外装材料の層を蒸着し；
(e) 残存フォトレジスト上に蒸着された当該外装材料の少なくとも一部分を取り除き；並びに
(f) ステップ(e)のフォトレジストを取り除いて、当該光閉じ込めの当該外装材によって取り囲まれる当該コアを形成すること
を含む、前記方法。
前記外装材が半導体製である、請求項１１２記載の方法。
前記外装材が合金製である、請求項１１２記載の方法。
前記合金がアルミニウム合金である、請求項１１４記載の方法。
前記アルミニウム合金が0.0001 %超のドーパントを含む、請求項１１５記載の方法。
前記外装材がコーティング材料で被覆される、請求項１１２記載の方法。
前記コアが円筒型である、請求項１１２記載の方法。
前記コアが非-円筒型の形状である、請求項１１２記載の方法。
前記光閉じ込めが、前記コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光の大部分の伝達を防ぐ、請求項１１２記載の方法。
前記光閉じ込めが、前記コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光ビームの90 %超の伝達を防ぐ、請求項１１２記載の方法。
前記光閉じ込めが、前記コアを通過するカットオフ波長よりも長い波長を有する入射光ビームの99 %超の伝達を防ぐ、請求項１１２記載の方法。