DE102007016699A1

DE102007016699A1 - Biochip für die Fluoreszenzanalyse von einzelnen Transportern

Info

Publication number: DE102007016699A1
Application number: DE102007016699A
Authority: DE
Inventors: Stefan Hummel; Matthias Pirsch
Original assignee: SYNENTEC GmbH
Current assignee: SYNENTEC GmbH
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2008-10-09
Also published as: WO2008122267A2; WO2008122267A3; EP2142911A2; JP5370864B2; JP2010523987A; US20100092341A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Biochip (1) zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen Transport-Systemen (50). Um die Eigenschaften von Transportermolekülen (50) mit hoher Messgenauigkeit und hohem Durchsatz zu messen, wird ein Biochip (1) zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen Transport-Systemen (50) vorgeschlagen, der im Wesentlichen aus einem transparten Träger (10) sowie mehreren nach oben geöffneten Vertiefungen (30) besteht, wobei die Vertiefungen (30) derart ausgebildet sind, dass bei einer Messung ihre Öffnungen (31) durch eine Membran bedeckt und so geschlossene Messkammern (30) gebildet werden und der Transport von Substratmolekülen (50) über die Membran in die Vertiefungen (30) nachgewiesen wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Biochip zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen Transport-Systemen.
Biologische Membranen trennen Zellen vom äußeren Medium und die einzelnen Zellkompartimente der Zellen voneinander ab. Transport-Systeme wie Transportproteine und Kanäle steuern selektiv den Stoffdurchlass durch diese Membranen. Funktionsstörungen dieser Transporter und Kanäle sind für zahlreiche verbreitete Krankheiten verantwortlich. Unter den 100 am meisten verkauften Arzneimitteln in den USA im Jahre 2004 waren die Membrantransporter die am häufigsten vorkommende Targetgruppe. Es sind mindestens 1.302 Transporter-Pharmaka, sowohl eingeführte als auch noch in der Entwicklung sich befindende Arzneimittel, in den Portfolios von 326 Firmen weltweit vorhanden. Insgesamt werden zurzeit mehr als 100 Transporter-Targets bei den Pharmafirmen erforscht, was zeigt, welche immense wirtschaftliche Bedeutung diese haben.
Für die Entwicklung solcher Wirkstoffe werden Messmethoden benötigt, mit denen Eigenschaften wie die Transportraten von spezifischen Substraten durch das Transporter-Target und der Einfluss von Wirkstoffkandidaten evaluiert werden kann. Hierbei werden insbesondere Methoden benötigt, die einzelne Targetmoleküle sogar automatisiert im Hochdurchsatz charakterisieren können.
Für die Analyse von Transportraten von Ionen und geladenen Teilchen können elektrische Messungen eingesetzt werden. Dieses Verfahren findet bereits eine Anwendung im Hochdurchsatz in der biotechnologischen und pharmazeutischen Forschung. Es ist jedoch auf geladene Transportsubstrate beschränkt und wird daher in der Regel für die Gruppe der Ionenkanäle eingesetzt. Der Transport von ungeladenen Molekülen wie Aminosäuren, Peptiden, Zuckerverbindungen und Fettsäuren, aber auch biologischen Makromolekülen wie RNA, DNA und Proteinen kann nur indirekt mit elektrischen Verfahren gemessen werden.
Die Fluoreszenzanalyse kann dagegen den Transport dieser Moleküle sichtbar machen. Erste Vorarbeiten dazu wurden von einer akademischen Gruppe für den Transport von Biomolekülen durch den Kernporenkomplex in Kernhüllen aus Xenopus Laevis durchgeführt. Dieses Verfahren wurde dort als Optische Einzeltransporter-Aufnahme (OSTR) bezeichnet. Es wurde auch für die Messung des Transports von Calcium-Ionen durch die α-Hämolysin-Pore angewendet, welche direkt in vorgefertigte, künstliche Lipidmembranen insertiert wurde und sich dabei aus einer denaturierten Struktur in eine funktionale Form rückfaltet.
In den Veröffentlichungen wurden dazu Polycarbonatfilter oder Polycarbonatstrukturen eingesetzt, deren Vertiefungen für die Fluoreszenzmessung von Transportraten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie genutzt wurden. Dies bedingt schlechte optische Eigenschaften, u. a. auf Grund von Divergenzen in den Brechungsindices von Polycarbonat und Messpuffer. Weitergehende Experimente, die über die Grundlagenforschung hin zu einer biotechnologischen oder pharmazeutischen Anwendung des Verfahrens im Hochdurchsatz führen oder hierfür geeignete Chips verwenden, sind nicht publiziert worden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung vorzuschlagen, durch die die Eigenschaften von Transportermolekülen mit hoher Messgenauigkeit und hohem Durchsatz gemessen werden können.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Biochip zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen Transport-Systemen vorgeschlagen wird, der im Wesentlichen aus einem transparentem Träger sowie mehreren nach oben geöffneten Vertiefungen besteht, wobei die Vertiefungen derart ausgebildet sind, dass bei einer Messung ihre Öffnungen durch eine Membran bedeckt und so geschlossene Messkammern gebildet werden und der Transport von Substratmolekülen über die Membran in die Vertiefungen nachgewiesen wird. Dazu wird die Membran über die Vertiefungen im Biochip aufgespannt, so dass diese verschlossen sind. Über der Membran zugegebene und mit Fluoreszenzverfahren detektierbare Transportsubstrate gelangen somit nur mittels der in der Membran enthaltenen Transportproteine oder Kanäle in die Messräume des Biochips. Durch Fluoreszenzmessungen können diese Substrate in den Vertiefungen nachgewiesen und quantifiziert werden. Eine Auswertung ergibt Parameter wie die Transportrate, die Rückschlüsse auf das Transportprotein/den Kanal oder z. B. einen Einfluss eines Wirkstoffkandidaten erlauben. Sowohl das Verfahren als auch die Auswertung kann automatisiert und im Hochdurchsatz eingesetzt werden. Für die biotechnologische und pharmazeutische Anwendung dieses Verfahrens ist es notwendig, mittels Standardverfahren hergestellte Proteo-Liposomen, also künstliche, hohle Membranvesikel, die in die Membran insertierte Transportproteine enthalten, einzusetzen. Diese können entweder direkt an die aktivierte Oberfläche des Biochips gekoppelt werden oder durch Fusion mit einer vorgeformten Lipidmembran aufgebracht werden. Dabei wird der Vesikel zu einer den Transporter enthaltenden Membran umgeformt, die die aus den Vertiefungen gebildeten Messkammern im Biochip verschließt und somit eine Fluoreszenzmessung zur Charakterisierung der Transporter und Bestimmung der Transportraten ermöglicht.
Mit Vorteil besteht der Träger aus einem Material mit hohem Brechungsindex, wie Glas oder Silizium. Hierdurch werden optische Artefakte vermindert und die Fluoreszenzdetektion in den Vertiefungen mit Abmessungen im Nanometerbereich möglich. Ist der Brechungsindex höher als der Brechungsindex der verwendeten Messlösung, kann durch Einstrahlen des Anregungslichtes unter einem Winkel eine Totalreflektion und somit ein evaneszentes Feld an der Phasengrenze von Material und Messlösung erzeugt und für die Fluoreszenzdetektion genutzt werden.
Die Vertiefungen können durch eine oder mehrere mit der Oberseite des Trägers verbundene Schichten gebildet werden, welche durchgehende Öffnungen aufweisen. Hierdurch kann unterschiedliches Material für den Träger und Messkammern verwendet werden, was weitere vorteilhafte Eigenschaften ermöglicht.
Mit Vorteil besteht, ebenso wie der Träger, die genannte verbundene Schicht aus einem Material mit hohem Brechungsindex, vorzugsweise Glas oder Silizium, um optische Artefakte zu vermindern und eine Fluoreszenzdetektion in den Vertiefungen mit Abmessungen im Nanometerbereich zu ermöglichen.
Wenn die die Vertiefungen bildende Schicht aus Metall besteht, sind die so gebildeten Messkammern an ihren Wandseiten lichtundurchlässig. Bei Abmessungen der Vertiefungen im Nanometerbereich kann das eingestrahlte Licht nicht mehr vollständig in die Vertiefungen eindringen, wodurch in den Vertiefungen ein evaneszentes Feld entsteht, welches für die Fluoreszenzdetektion der Transportsubstrate in den Vertiefungen genutzt werden kann.
Ein besonders geeignetes Metall ist Gold, da es chemisch inert ist, sicher mit dem Trägermaterial verbunden werden kann und außerdem geeignete Lichtreflektionseigenschaften hat.
Die Metallschicht wird mit dem Träger mittels eines Haftvermittlers fest verbunden.
Es hat sich herausgestellt, dass als Haftvermittler ein Metall, insbesondere Chrom oder Titan, sehr gut geeignet ist.
Eine Verbesserung der Messgenauigkeit lässt sich dadurch erreichen, dass die Metallschicht das Anregungslicht reflektiert und so die Substratmoleküle mehrfach angeregt werden.
Mit Vorteil wird die Öffnung der Vertiefung zum Teil von der darüber angeordneten Metallschicht abgedeckt, indem die Öffnung in der Metallschicht so gewählt ist, dass sie kleiner ist als die Vertiefungsöffnung. Hierdurch wird das Anregungslicht von den Substratmolekülen abgeschirmt, die sich nicht in der Messkammer befinden und so die Messgenauigkeit verbessert.
Es hat sich herausgestellt, das sowohl unter fertigungstechnischen als auch messtechnischen Gesichtspunkten besonders günstige Verhältnisse vorliegen, wenn die Öffnung in der teilweise abdeckenden Metallschicht einen Durchmesser von etwa 60 nm und die Öffnung der Vertiefung einen Durchmesser von etwa 200 nm hat.
Sofern die Schicht aus Silizium besteht, ist die Fluoreszenzdetektion der Transportsubstrate in den Vertiefungen der Schicht möglich.
Besteht die dem transparenten Träger aufliegende Schicht aus einem Fluoropolymer, wie Teflon oder Cytop, dann erlaubt dies die Detektion der Fluoreszenz in den Messkammern, z. B. mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie.
Die gleichzeitige Fluoreszenzanalyse von mehreren Transportmolekülen wird dadurch ermöglicht, dass die Vertiefungen als Gruppen oder als Arrays angeordnet sind. Dabei sind vorzugsweise jeweils vier Vertiefungen gruppiert und diese Vertiefungsgruppen wiederum zu einem Array gruppiert, welches aus sechzehn Vertiefungsgruppen besteht.
Eine weitere Verbesserung lässt sich dadurch erzielen, dass sich der Durchmesser der Vertiefungen von unten zur Oberseite hin kontinuierlich verringert, so dass die Vertiefungen annähernd eine Kegelform aufweisen. Die zum Träger hin größeren Durchmesser der Kammern ermöglichen dann eine konfokale Detektion der Fluoreszenz in den so gebildeten Messräumen mit höherer Genauigkeit.
Die Kopplung, das heißt Fixierung, der Vesikel an den Biochip kann so erfolgen, dass dessen Oberfläche Linkermoleküle und/oder Lipidderivate aufweist, an die geeignete Bestandteile des Vesikels, kovalent oder nichtkovalent, binden.
Die Membran weist als Transportermolekül ein oder mehrere Proteine, insbesondere Poren-, Kanal- oder Carrierproteine, auf, deren Transport-Aktivität über die Vesikelmembran nachgewiesen wird.
Eine weitere Anwendung des Biochips ist die Charakterisierung von Produktionszelllinien für rekombinante Proteine und Antikörper. Hierzu werden Zellen oder Zellbestandteile für die Produktion von rekombinanten Proteinen oder Antikörpern gemessen. Dabei werden die Zellen auf den Biochips angezogen, so dass sie mit ihrer Membran die Vertiefungen des Chips verschließen. Bei Sekretion der hergestellten Proteine in die Messräume wird über ein Reportersystem ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dieses Fluoreszenzsignal gibt Aufschluss über die erzeugte Menge an rekombinantem Protein oder Antikörper und erlaubt somit das Auffinden von viel produzierenden Zellen, die für die biotechnologische Herstellung dieser Proteine und Antikörper eingesetzt werden können.
Die bei der Messung verwendeten Membranen können biologische oder künstliche Lipidmembranen sein. Sofern biologische Membranen verwendet werden, ergeben sich besonders natürliche Messbedingungen.
Vorzugsweise erfolgt die Messung mit einer Vesikelmembran, die darin rekonstituierte Transportermoleküle enthält. Dies erlaubt schnelle, reproduzierbare Messungen. Durch die Einbettung in die Vesikelmembran nimmt das Transporterprotein außerdem wieder seine funktionelle Konformation ein.
Die Messung eines einzelnen Moleküls ist dann möglich, wenn die über eine Vertiefung gespannte Membran gerade ein Transportermolekül enthält.
Der Nachweis des durch die Transportermoleküle transportierten Substrates wird dadurch ermöglicht, dass die Substratmoleküle fluoreszieren, vorzugsweise indem sie an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind.
Die fluoreszierenden Substratmoleküle werden von dem Transportermolekül über die Membran in die Vertiefungen des Biochips transportiert. Dort werden sie mittels einer geeigneten Fluoreszenzdetektionsvorrichtung nachgewiesen.
Eine besonders genaue Messung erfolgt dadurch, dass die Detektionsvorrichtung die Fluoreszenz in einer konfokalen Ebene innerhalb der Vertiefung misst.
Eine weitere Verbesserung der Genauigkeit wird dadurch erzielt, dass der Durchmesser der Vertiefungen unter Berücksichtigung der Wellenlänge des Anregungslichtes so gewählt ist, dass ein evaneszentes Feld erzeugt wird, welches zur Fluoreszenzdetektion verwendet wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein evaneszentes Feld erzeugt, indem das Anregungslicht unter einem totalreflektierenden Winkel eingestrahlt und so zur Fluoreszenzdetektion verwendet wird.
Eine Steigerung der Messgeschwindigkeit wird erreicht, wenn die Messung automatisiert ist.
Eine weitere Verbesserung ergibt sich dadurch, dass auch die Auswertung der Messdaten automatisiert ist.
Der Biochip ist zweckmäßigerweise als Bestandteil in einer Messvorrichtung integriert, der die Automatisierung von Messreihen erlaubt.
Die Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
Funktionsmäßig gleiche Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen.
Die Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
1 einen Vertikalschnitt des erfindungsgemäßen Biochips;
2 einen Vertikalschnitt wie in 1 mit einem Vesikel;
3 einen Vertikalschnitt wie in 2 mit aufliegender biologischer Zelle;
4 eine Draufsicht auf ein Array des Biochips;
5a eine Detailansicht des Biochips mit einer Vertiefung im Vertikalschnitt;
5b eine Detailansicht des Biochips mit einer konusförmigen Vertiefung des Biochips im Vertikalschnitt und
6 eine Detailansicht einer bevorzugten Ausführungsform des Biochips mit einer Vertiefung im Vertikalschnitt.
1 zeigt einen Vertikalschnitt durch den erfindungsgemäßen Biochip.
Der Biochip 1 besteht aus einem Träger 30, der für das Anregungslicht beziehungsweise das Fluoreszenzlicht transparent ist. An seiner Oberseite weist der Chip Vertiefungen 30 auf, die als Messkammern zum Nachweis eines Substrates 60 dienen. In einer Ausführungsform besteht der Biochip 1 einteilig aus demselben Material. In einer anderen Ausführungsform besteht der Biochip 1 aus einem Verbund unterschiedlicher Materialien, beispielsweise aus dem optisch durchlässigen Träger 10 und einer darauf aufliegenden und mit dem Träger 30 verbundenen Schicht 20 aus Metall oder Silizium. Die Schicht 20 enthält durchgehende Öffnungen 31, durch die zusammen mit dem Träger 30 eine nach oben geöffnete Messkammer gebildet wird.
Auf die Oberfläche des Biochips 1 wird zur Messung eine Membran 40 aufgebracht, so dass die Messräume 30 verschlossen werden. Die Membran 40 kann aus künstlichen Proteo-Liposomen 5 hergestellt werden, welche als Transport-System Transport-Proteine oder Poren-Proteine enthalten. Andererseits kann die Membran 40 auch die Zellmembran von Produktionszelllinien für rekombinante Proteine oder Antikörper sein.
Die Membran 40 enthält Transport-Systeme 50, wie Transport-Proteine oder Poren-Proteine. Exemplarisch können hierbei Transporter der ABC-Transportergruppe genannt werden, die für viele Krankheiten relevant sind, wie z. B. der Adrenoleukodystrophie ABCD1-Transporter mit Fettsäuren als Substrat oder z. B. der Glutamat-Transporter mit dem Substrat Glutamat, dessen Stoffwechsel bei psychischen Erkrankungen gestört ist.
Auf der Unterseite der Membran werden ein oder mehrere mit Fluoreszenzverfahren detektierbare Transport-Substrate 60 zugegeben. Dies wird beispielsweise dadurch ermöglicht, indem das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff kovalent markiert ist. Der Transport 70 der Transportsubstrate durch die in der Membran 40 enthaltenen Transport-Systeme 50 in die Vertiefungen 30 des Biochips ist spezifisch für das enthaltene Transport-System 50 und kann durch Fluoreszenzmessungen in den Messräumen 30 quantifiziert werden. Dies ermöglicht Rückschlüsse auf für das Transport-System 50 spezifische Parameter wie Transportraten und Durchlässigkeit und somit die Evaluation von Wirkstoffkandidaten oder die Produktionsraten von Produktionszelllinien.
Der Biochip kann aus einem Fluoropolymer 20 wie Teflon oder Cytop bestehen, welches die Messräume 30 enthält und auf einen lichtdurchlässigen Träger 10 aufgebracht wird. Dies erlaubt die Detektion der Fluoreszenz in den Messräumen z. B. mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie.
Der Biochip kann aber auch aus einer Metallschicht 20 bestehen, in die die Löcher 30 eingebracht werden, und die auf einem lichtdurchlässigen Träger 10 aufgebracht werden. Unterschreitet der Durchmesser der Löcher 30 eine bestimmte Größe im Nanometer-Bereich, so kann das eingestrahlte Licht nicht mehr vollständig in die Messräume eindringen, stattdessen bildet sich ein evaneszentes Feld am Übergang von Träger und mit Messlösung gefülltem Messraum aus. Die Vertiefungen stellen dann „Zero Mode Waveguides" dar und erlauben so die Detektion der Fluoreszenz in den gebildeten Messräumen.
Eine weitere Möglichkeit, den Biochip herzustellen besteht darin, kegelförmige Löcher 30 anisotrop in Silizium 20 zu ätzen und dieses dann auf einen durchlässigen Träger 10 z. B. aus Pyrex aufzubringen. Der zum Träger 10 hin größere Durchmesser der Löcher erlaubt dann eine konfokale Detektion der Fluoreszenz in diesen Vertiefungen.
Außerdem kann der Biochip durch Erzeugen von Vertiefungen 30 in ein Material mit einem hohen Brechungsindex, wie z. B. Glas 10 + 20, Brechungsindex 1,53 hergestellt werden. Dieser Brechungsindex ist deutlich höher als der der in den Messräumen 30 befindlichen Messlösung mit einem Brechungsindex von 1,33. Wird das Anregungslicht schräg von unten eingestrahlt, so wird ab einem bestimmten Winkel am Übergang vom Träger zur Messlösung bei Totalreflektion des Lichtes ein evaneszentes Feld erzeugt, welches zur Detektion der Fluoreszenz in den Messkammern 30 genutzt werden kann.
2 zeigt einen Vertikalschnitt wie in 1 mit einem Vesikel (5). In der Vesikelmembran sind porenbildende Proteine (50) rekonstituiert.
3 zeigt einen Vertikalschnitt wie in 2 mit einer aufliegenden biologischen Zelle 15. Dies kann eine vollständige Zelle 15 sein oder auch nur ein Teil davon. Die Zelle erstreckt sich über mehrere Vertiefungen 30 und bedeckt diese. Hierdurch ist eine Messung unter natürlichen biologischen Bedingungen möglich.
4 zeigt eine Draufsicht auf ein Array 36 des Biochips 1. Dieses wird dadurch gebildet, dass jeweils vier in der Draufsicht quadratische Vertiefungen 30 dicht beieinander angeordnet sind und so eine Gruppe 35 bilden. Die Gruppe 35 hat dabei eine Länge c bzw. Breite d von jeweils etwa 100 μm. Jeweils sechzehn Vertiefungsgruppen 35 bzw. vierundsechzig Vertiefungen 30 sind zu einem Array 36 angeordnet, welches eine Länge a bzw. Breite b von jeweils etwa 500 μm aufweist.
5a zeigt eine Detailansicht einer Ausführungsform des Biochips 1 mit einer Vertiefung 30 im Vertikalschnitt. Hierbei ist auf einen Träger 10 aus Glas, geeignet sind BK7 von Schott oder Pyrex, mittels eines Haftvermittlers aus Chrom oder Titan (nicht gezeigt) eine Metallschicht 20 aus Gold aufgebracht. Die bevorzugten Maße des Glasträgers sind 20 × 20 × 0,17 mm. Die Metallschicht 20 hat eine Dicke von 0,5 bis 5 μm. Die Metallschicht 20 ist mit einer durchgehenden Schichtöffnung 31 versehen, die einen Durchmesser von 60 bis 120 nm hat. Bevorzugt sind Durchmessern von ca. 60 nm, 80 nm, 100 nm und 120 nm. Der Pitch beträgt vorzugsweise 1 μm. Die Messkammer 30 wird bei dieser Ausführungsform also ausschließlich durch die Öffnung 31 im Metall 20 gebildet, während der Glasträger 10 selbst keine Vertiefung aufweist.
5b zeigt eine ähnliche Ausführungsform wie in 5a, allerdings weist die Metallschicht 20 eine konus-, bzw. kegelförmige Vertiefung 30 auf. Die Öffnung 31 hat an ihrer Oberseite ebenfalls einen Durchmesser von 60 bis 120 nm, erweitert sich aber nach unten hin. Hierdurch erhöht sich die Messgenauigkeit, weil die Messkammer 30 mehr Substrat 60 (nicht gezeigt) enthält und so das Signal/Rauschverhältnis verbessert wird.
6 zeigt eine Detailansicht einer bevorzugten Ausführungsform des Biochips 1 mit einer Vertiefung 30 im Vertikalschnitt. Wie in den in 5a und 5b dargestellten Ausführungsformen ist auf einen Träger 10 aus Glas eine Metallschicht 20 mittels eines (nicht dargestellten) Haftvermittlers aufgebracht. Die Metallschicht 20 weist ebenfalls eine durchgehende Öffnung 21 auf.
Im Unterschied zu den oben gezeigten Ausführungsformen wird die Messkammer aber im Wesentlichen durch eine Vertiefung 30 innerhalb des Glasträgers 10 gebildet. Die Vertiefung hat eine Länge e von etwa 450 nm und einen Öffnungsdurchmesser 31 von etwa 200 nm. Die Dicke f der Metallschicht 20 beträgt vorzugsweise etwa 50 nm, der Durchmesser der Schichtöffnung 21 etwa 60 nm. Da die Vertiefungsöffnung 31 im Glasträger 10 also wesentlich größer ist als die Öffnung 21 in der oberen Metallschicht 20, wird sie größtenteils von dieser abgedeckt.
Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht zum einen darin, dass der im Glasträger 10 durch die Vertiefung 30 gebildete Messraum eine größere Ausdehnung in vertikaler Richtung hat. Hierdurch sind die über die Membran transportierten Substratmoleküle 50 (nicht gezeigt) im Mittel weiter von der Membran und damit von den nicht transportierten Substratmolekülen 50 entfernt. Idealerweise sollen nur die unterhalb der Lipidmembran (nicht gezeigt) befindlichen Substratmoleküle 50 zur Fluoreszenz angeregt werden, was durch den größeren räumlichen Abstand erleichtert wird. Dadurch erhöht sich das Signal/Rauschverhältnis.
Das Signal/Rauschverhältnis wird weiter durch das erfindungsgemäße Merkmal verbessert, dass die obere Vertiefungsöffnung 31 zum Teil durch die Metallschicht 20 abgedeckt wird. Das Anregungslicht wird so effektiv von den nicht transportierten Substratmolekülen 50 (nicht dargestellt) oberhalb der Membran abgeschirmt.
Ein weiterer und überraschender Vorteil besteht darin, dass die Metallschicht 20 das Anregungslicht reflektiert. Um dieses zu verdeutlichen, zeigt die 6 eine schematische Darstellung der Strahlen 80 des Anregungslichts. Ein paralleles Lichtbündel 80 wird schrägwinklig in die Unterseite des Glasträgers 10 eingestrahlt. Der Strahlengang ist dabei wie bei einem handelsüblichen TIRF-Mikroskop angeordnet. Die Strahlen 80 werden von der Metallschicht 20 reflektiert und durchstrahlen mehrfach das Messvolumen 30 mit der Probe 60 (nicht gezeigt).
Hierdurch wird die Signalanregung um ein Vielfaches verstärkt, was die Messgenauigkeit weiter erheblich verbessert.
Die sich neben dem Anregungslicht ausbildende evaneszente Welle ist in der 6 nicht gezeigt. Durch den Schrägeinfall und die Dicke der Metallschicht 20 reicht der Durchmesser für eine „Zero Mode"-Anregung nicht aus, was jedoch zur Signalunterdrückung erwünscht ist.

1: Biochip
5: Vesikel
10: Träger
15: Biologische Zelle
20: Schicht
21: Schichtöffnung
30: Vertiefung
31: Vertiefungsöffnung
35: Vertiefungsgruppe
36: Array
40: Membran
50: Transportermolekül
60: Substrat
80: Anregungslicht

Claims

Biochip (1) zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen Transport-Systemen (50), bestehend im Wesentlichen aus einem transparentem Träger (10) sowie mehreren nach oben geöffneten Vertiefungen (30), wobei die Vertiefungen (30) derart ausgebildet sind, dass bei einer Messung ihre Öffnungen (31) durch eine Membran (40) bedeckt und so geschlossene Messkammern (30) gebildet werden und der Transport von Substratmolekülen (60) über die Membran (40) in die Vertiefungen (30) nachgewiesen wird.
Biochip (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (10) aus einem Material mit hohem Brechungsindex, wie Glas oder Silizium, besteht, wobei der Brechungsindex vorzugsweise höher als der Brechungsindex der verwendeten Messlösung ist.
Biochip (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (10) mindestens eine mit seiner Oberseite verbundene Schicht (20) aufweist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht (20) oder die Schichten (20) durchgehende Öffnungen (21) aufweisen.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine mit dem Träger (10) verbundene Schicht (20) aus einem Material mit hohem Brechungsindex, vorzugsweise Glas oder Silizium, besteht.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Schichten (20) aus Metall bestehen.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall Gold ist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht (20) mittels eines Haftvermittlers mit dem Träger (10) verbunden ist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Haftvermittler ein Metall, insbesondere Chrom oder Titan, aufweist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht das Anregungslicht (80) reflektiert und so die Substratmoleküle (60) mehrfach angeregt werden.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Öffnung (31) der Vertiefung (30) zum Teil von der darüber angeordneten Metallschicht (20) abgedeckt wird, indem die Öffnung (21) in der Metallschicht so gewählt ist, dass sie kleiner ist als die Vertiefungsöffnung (31).
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Öffnung (21) in der teilweise abdeckenden Metallschicht einen Durchmesser von etwa 60 nm und die Öffnung (31) der Vertiefung (30) einen Durchmesser von etwa 200 nm hat.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht (20) aus Silizium besteht.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht (20) aus einem Fluoropolymer, insbesondere Teflon oder Cytop, besteht.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass, vorzugsweise jeweils vier, Vertiefungen (30) gruppiert und insbesondere diese Vertiefungsgruppen (35) wiederum zu einem Array (36) gruppiert sind.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Array (36) aus sechzehn Vertiefungsgruppen (35) besteht.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Durchmesser der Vertiefungen (30) von unten zur Oberseite hin kontinuierlich verringert, so dass die Vertiefungen (30) annähernd eine Kegelform aufweisen.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass seine Oberfläche Linkermoleküle und/oder Lipidderivate zur Kopplung der Membran (40) an den Chip (1) aufweist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (40) als Transportermolekül (50) ein oder mehrere Proteine, insbesondere Poren-, Kanal- oder Carrierproteine, aufweist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (40) Zellen oder Zellbestandteile für die Produktion von rekombinanten Proteinen oder Antikörpern aufweist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (40) eine biologische oder künstliche Lipidmembran ist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (40) eine Vesikelmembran mit darin rekonstituierten Transportermolekülen ist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die über eine Vertiefung (30) gespannte Membran gerade ein Transportermolekül enthält.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratmoleküle (60) fluoreszieren, vorzugsweise indem sie an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierenden Substratmoleküle (60) von dem Transportermolekül (50) über die Membran in die Vertiefungen (30) des Biochips (1) transportiert und sie dort mittels einer geeigneten Fluoreszenzdetektionsvorrichtung nachgewiesen werden.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsvorrichtung die Fluoreszenz in einer konfokalen Ebene innerhalb der Vertiefung misst.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Vertiefungen (30) unter Berücksichtigung der Wellenlänge des Anregungslichtes so gewählt ist, dass ein evaneszentes Feld erzeugt wird, welches zur Fluoreszenzdetektion verwendet wird.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht unter einem totalreflektierenden Winkel eingestrahlt und so ein evaneszentes Feld erzeugt wird, welches zur Fluoreszenzdetektion verwendet wird.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung automatisiert ist.
Biochip (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung der Messdaten automatisiert ist.
Verwendung eines Biochips (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einer Messvorrichtung.