JP2013511510A - 抗体製剤 - Google Patents

Abstract

抗体、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、および凍結乾燥保護剤／凍結防止剤を含む安定医薬製剤。そのような製剤を調製、貯蔵、および使用するための関連方法も開示されている。
【選択図】なし

Description

本発明は安定な抗体製剤に関する。好ましい安定製剤は、２５〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、１０〜３０ｍＭの緩衝種、１〜１５％のポリオール、０．００１％〜０．０５％の界面活性剤および５〜７．５のｐＨを含む。本発明のさらなる態様は、前述の製剤を調製するプロセスを特徴とする。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫系の細胞において「白血球分化クラスター」または抗原（ＣＤ）と定義されている、細胞表面に発現された生理的に重要な分子の特徴付けを可能にしてきた（Ｓｃｈｏｌｏｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９４） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １５（３）；９８）。個体発生的成長時のリンパ系細胞の分化および成熟における、細胞認識および接着のメカニズムにおける、ならびに免疫応答時の活性化および増殖のメカニズムにおけるＣＤの役割の定義は、そのそれぞれのｍＡｂを診断および免疫療法で使用するために行なわれ、有望な結果をもたらしている（Ｄａｎｔａｌら（１９９１） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７４０）。

バイオテクノロジー開発における近年の進歩により、薬物として使用するのに十分に大量の多種多様な生物活性ポリペプチドが提供されている。しかしながら、ポリペプチドは、変性や可溶性凝集体および不溶性凝集体の形成をはじめとする物理的不安定性、ならびに加水分解、酸化、および脱アミド化などの種々の化学的不安定性の結果として、その強力な生物活性を失うことがある。液体医薬製剤中のポリペプチドの安定性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、繰り返しの凍結融解サイクル、およびプロセッシング時に生じるような機械的剪断力への曝露などの要因によって影響を受けることがある。凝集体形成および生物活性の喪失は、溶液中でのおよび貯蔵バイアル中の液体−空気界面でのポリペプチド分子の物理的撹拌および相互作用の結果として生じることもある。

ＵＳ２００３０１９０３１６号は、グリシン緩衝剤および／またはヒスチジン緩衝剤中に抗体を含む安定化された調製物に関するものであり、塩基性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸誘導体またはそれらの塩を用いてｐＨを調整することを含む、安定化されたタンパク質含有調製物の調製プロセスも提供している。

いくつかの液体医薬組成物は、その中に含まれるポリペプチドの生物活性を安定化するように調剤されているが、液体製剤中でのポリペプチドの分解は、医師にとって問題を起こし続けている。結果として、ポリペプチド成分の安定化を促進し、それにより、その治療的有効性を維持する生理的に適合性のある安定化剤を含む、さらなる医薬組成物が必要とされている。

発明の目的
本発明の主な目的は、抗体、緩衝剤および医薬として許容される賦形剤を含む製剤を得ることである。

本発明の別の目的は、抗体またはその断片、緩衝剤および凍結乾燥保護剤を含む製剤を得ることである。

本発明のまた別の目的は、安定な抗体製剤を得ることである。

発明の提示
したがって、本発明は、抗体、緩衝剤および医薬として許容される賦形剤を含む製剤；抗体またはその断片、緩衝剤および凍結乾燥保護剤を含む製剤；ａ）約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤を含む安定な抗体製剤；ａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤、ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む安定な抗体製剤；ならびにａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤、ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤ならびにｃ）凍結乾燥保護剤および／または凍結防止剤を含む安定な抗体製剤に関する。

評価した異なる製剤の試験期間中のｐＨ変動性。 評価した異なる製剤の試験期間中のオスモル濃度（Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）値。 異なる条件でインキュベートした異なる製剤のサンプルのスペクトルおよびλ最大値が違わないことを示す正規化した蛍光グラフ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｇｒａｐｈ）。 サンプルの流体力学半径解析（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｒａｄｉｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）。 ４０℃でインキュベートしたサンプルの電荷変異体分布（Charge ｖａｒｉａｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）。 ４０℃でインキュベートしたサンプルの電荷変異体分布（ヒスチジントレハロースが強調されている）。 リン酸塩ベースの製剤中のより多くの酸性変異体を示すリン酸塩およびヒスチジンベースの製剤のイオン交換クロマトグラフィープロファイルの重ね合わせ。 ４０℃でインキュベートしたサンプルのモノマー％の減少を示す図。 ４０℃でのＳＥＣによる分解物（％ＨＭＷＰ＋％ＬＭＷＰ）の増加を示す図。 試験した４つの製剤中のＬＭＷＰの増加。４つの製剤は全て同じ傾向に従い、これらの値は、ヒスチジントレハロース製剤がその他の製剤と比べて若干少ない断片化を示すことを除けば、極めてよく似ている。 試験した４つの製剤中のＨＭＷＰの増加を示す傾向。ヒスチジン含有製剤は、リン酸塩サンプルと比べて少ない凝集を示す。 異なる製剤中のＴ１ｈサンプルのｐＨ変動性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）。 凍結および融解を繰り返したサンプルのタンパク質濃度。 凍結および融解を繰り返した後のリン酸塩およびヒスチジン中の１ｍｌサンプルのＳＥＣプロファイル。 リン酸塩およびヒスチジン製剤の０．５ｍｌサンプルのＳＥＣプロファイルの比較。 繰り返し凍結および融解に供した両製剤の１ｍｌサンプルのＳＥＣデータ。 繰り返し凍結および融解に供した両製剤の０．５ｍｌサンプルのＳＥＣデータ。 リン酸塩サンプルにおける４０分での凝集体溶出の可能性を示す１ｍｌサンプルのイオン交換クロマトグラフィープロファイルの重ね合わせ。 ４０分でのリン酸塩サンプルにおける凝集体溶出を示すが、ヒスチジンサンプルにおける凝集体溶出は示さない、０．５ｍｌサンプルの重ね合わせ。 リン酸塩およびヒスチジン製剤中で繰り返しの凍結および融解に供した１ｍｌサンプルのＩＥＸデータ。 リン酸塩およびヒスチジン製剤中で繰り返しの凍結および融解に供した０．５ｍｌサンプルのＩＥＸデータ。 凍結状態サンプルのｐＨ変動性。 凍結状態安定性サンプルのタンパク質濃度。 リン酸塩凝集のわずかな増加を示す凍結状態安定性のＳＥＣ重ね合わせ。 凍結状態安定性サンプルのサイズ変異体分布のＳＥＣデータ。 凍結状態安定性サンプルのＩＥＸクロマトグラム重ね合わせ。 リン酸塩およびヒスチジンの凍結状態安定性のＩＥＸデータ。

本発明は、抗体、緩衝剤および医薬として許容される賦形剤を含む製剤に関する。

本発明は、抗体またはその断片、緩衝剤および凍結乾燥保護剤を含む製剤に関する。

本発明の一実施形態では、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、イミダゾール、グリシン、Ｌ−アルギニン、ヒスチジンおよびそれらの組合せから選択される。

本発明の別の実施形態では、緩衝剤は好ましくはヒスチジンである。

本発明の別の実施形態では、凍結乾燥保護剤は、ポリオールまたは糖類から選択される。

本発明のまた別の実施形態では、凍結乾燥保護剤は、ＰＥＧ、グリセロール、スクロース、トレハロースおよびマンニトールのように非還元性の性質である。

本発明のさらに別の実施形態では、製剤は、凍結防止剤をさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態では、凍結防止剤は、好ましくはトレハロースである。

本発明のさらに別の実施形態では、製剤は、界面活性剤をさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０およびポリソルベート８０を含む群から選択される。

本発明のさらに別の実施形態では、製剤は、増量剤をさらに含む。

本発明のさらに別の実施形態では、増量剤は、グリシンおよびマンニトールを含む群から選択される。

本発明は、ａ）約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤を含む安定な抗体製剤に関する。

本発明は、ａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤；ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む安定な抗体製剤に関する。

本発明は、ａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤；ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤；ならびにｃ）凍結乾燥保護剤および／または凍結防止剤を含む安定な抗体製剤に関する。

本発明の一実施形態では、製剤は、凍結乾燥ケーキまたは粉末である。

本発明の一実施形態では、製剤は、注射用滅菌水または注射用静菌水中でさらに再構成される。

本発明の主な目的は、抗体、緩衝種、ポリオールおよび界面活性剤を含む安定な液体医薬組成物を提供することである。

有利なことに、本発明による組成物の製剤は、貯蔵中に安定である組成物になることが見出された。貯蔵中に安定であるとは、免疫グロブリンが実質的に凝集も分解もせず、許容可能なレベルのインビトロおよびインビボ活性を維持することを意味すると解釈される。

本発明の別の態様は、抗体製剤を調製する方法に関する。

本発明は、治療的活性成分としての抗体を含む液体医薬組成物およびその調製において有用な方法に関する。本発明の目的のために、医薬組成物または製剤に関する「液体」という用語は、「水性」という用語を含むことが意図される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、天然の（ネイティブの）、合成された、および組換えの抗体およびタンパク質、ならびに本明細書の別の場所で適格性が保証されているその生物活性変異体を包含する。「治療的活性成分」により、医薬組成物を対象に投与したとき、その対象内の疾患または状態の治療、予防、または診断に関して所望の治療応答をもたらすように、抗体が組成物に特に組み込まれていることが意図される。

より具体的には、本発明の組成物は、その治療的活性成分が、通常は液体医薬製剤中での貯蔵中に凝集体形成を示す抗体を含む安定化された液体医薬組成物である。「凝集体形成」により、溶けたままであり得るオリゴマー、または溶液から沈殿する目に見える巨大な凝集体の形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用が意図される。「貯蔵中」により、一旦調製された液体医薬組成物または製剤が、すぐには対象に投与されないことが意図される。どちらかと言えば、調製後、それは、貯蔵のために、液体形態、凍結状態、もしくは後に液体形態へと再構成するための乾燥形態のいずれか、または対象への投与に好適な他の形態で包装される。液体医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼし、医薬組成物の治療効力を失わせることもある。さらに、凝集体形成は、ポリペプチド含有医薬組成物を、注入システムを用いて投与するときに、チューブ、メンブレン、またはポンプの閉塞などの他の問題を引き起こす可能性がある。

本発明の安定化された液体医薬組成物は、一定量の緩衝種をさらに含む。これらの緩衝種としては、主に、リン酸塩またはヒスチジンが挙げられる。製剤の緩衝種は、ｐＨを維持することが意図される。リン酸塩製剤のｐＨを７に設定し、ヒスチジン製剤のｐＨを６に設定したが、それは、これらのｐＨがこれらの緩衝種の緩衝範囲にあるからである。

本発明の組成物に添加される界面活性剤の安定化量は、抗体含有組成物における凝集体形成または濁りを阻害するのに十分な量である。そのような凝集体形成は、例えば、長期貯蔵、機械的撹拌、凍結および融解によって起こることがある。凝集または濁りの顕著な阻害が観察され、濁り／凝集体形成は、界面活性剤を含む抗体含有組成物では、界面活性剤を含まない同等の製剤よりも少なくとも１０％少なく、好ましくは少なくとも５０％少なく、より好ましくは少なくとも７０％少なく、最も好ましくは少なくとも９０％少ない。３２０ｎｍでの吸光度についてバイアルおよび抗体含有組成物の目視検査をモニタリングして、溶液中のタンパク質分子を維持するポリソルベート８０の能力を決定すべきである。主に、溶液中での分子の散乱の結果として生じる３２０ｎｍでの吸光度は、ポリソルベート８０を欠くサンプルでは、はるかに顕著であった。

本明細書で使用される「界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」は、親水性領域と疎水性領域を有する任意の界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を包含すると定義され、これには、非イオン性、カチオン性、アニオン性および両性界面活性剤が含まれる。好適な界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０もしくは「ＴＷＥＥＮ」８０としても知られる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０もしくは「ＴＷＥＥＮ」２０としても知られる）、またはＮ−ラウリルサルコシン（ｌａｕｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、本明細書に記載の製剤に好ましい。そのような非イオン性界面活性剤は、以下の界面活性剤、例えば、ポリオキサマーまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０）から選択することができる。ポリソルベート８０は、本発明の組成物に好ましい。界面活性剤は、０．０１重量％〜０．５重量％の濃度で存在することができる。

免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは各々、定常領域と可変領域を含む。ほとんどの種では、重鎖可変領域（すなわち、ＶＨドメイン）と軽鎖可変領域（すなわち、ＶＬドメイン）が組み合わさって、「相補性決定領域」またはＣＤＲという、特定のエピトープの抗原結合部位に特に寄与する免疫グロブリン分子の部分から構成された抗原結合ドメインを形成する。通常、重鎖と軽鎖は各々３つのＣＤＲを有しており、これらが組み合わさって、免疫グロブリンの抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン分子の「抗原結合ドメイン」は、必ずしもそうではないが、通常、ジスルフィド結合で結合している、１つの重鎖の可変ドメインの少なくとも一部と１つの軽鎖の可変ドメインの少なくとも一部からなる。Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能に必須である。エフェクター機能としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を開始すること、貪食細胞および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始すること、ならびにトランスサイトーシスにより抗体を細胞障壁の向こうに移動させること挙げられる。さらに、Ｆｃ領域は、ＩｇＧクラスの抗体の血清半減期を維持するのに極めて重要である（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５））。

さらなる態様では、本発明は、改変された抗体またはＦａｂ、Ｆｃもしくはそれらの部分から選択される機能断片を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能断片を、医薬として許容される希釈剤または担体とともに含む医薬組成物を提供する。

組成物は、１以上の緩衝種、１以上のポリオール、および１以上の界面活性剤を含むことができる。

組成物は、医薬として許容される担体を含む。医薬として許容される担体としては、食塩水、滅菌水、リン酸塩緩衝食塩水などが挙げられるが、これらに限定されない。患者への送達に好適な他の緩衝剤、分散剤、および無毒な不活性物質を本発明の組成物に含めることができる。組成物は、投与に好適な溶液であってもよく、通常、滅菌性で、かつ望ましくない粒子状物質を含まない。

本発明との関連で用いられる緩衝剤は、好ましくは、リン酸塩またはヒスチジンである。最も好ましくは、本発明の製剤で用いられる緩衝剤は、酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジンおよびリン酸塩に限定されない。これらは、そのままでまたは組み合わせて用いることができる。

製剤の溶液のｐＨは、５〜７．５の範囲とすることが望ましく、溶液のｐＨは、必要に応じて、最終的なｐＨを所望のレベルに調整して、５．５〜６の範囲とすることが好ましい。

本発明との関連で用いられるポリオールは、抗体の安定化剤、張性修飾剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）および凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）などの、いくつかの役割を果たす還元糖であり、これも、製剤に含められる。最も好ましくは、本発明の製剤で用いられるポリオールは、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。

当業者に周知の他の医薬として許容される賦形剤もまた、本組成物の一部を形成することができる。これには、例えば、様々な増量剤が含まれ、ここで、増量剤は、グリシンまたはマンニトールから選択される。

一実施形態では、製剤の糖成分（スクロースおよびトレハロース）は、多面的な目的を有する：糖は、抗体の安定化剤として働き、抗体を分解から保護する；糖は、（凍結と乾燥の両方を伴う）凍結乾燥プロセスにおいて抗体を保護する凍結防止剤／凍結乾燥保護剤である；糖は張性修飾剤でもあり、その濃度を調整して、製品を等張にすることができる。等張製品は、注射部位での痛みを顕著に軽減することができるので、張性は、本製品のような皮下投与される製品では重要である。スクロースとトレハロースは両方とも非還元糖類であり、タンパク質を安定化するのに広く用いられているので、これらを評価用に選択した。糖の濃度は、皮下投与用の等張溶液を提供するように選択した。

本発明の別の実施形態では、製剤スクリーニング試験の結果は、２〜８℃で、凍結／融解に供したとき、製剤間で、ＨＭＷＰまたはＬＭＷＰにそれほど大きな違いが見られなかったことを示している。しかしながら、４０℃でインキュベートしたとき、抗体の物理的安定性は、特に凝集に関して、リン酸塩ベースの製剤と比べて、ヒスチジン含有緩衝剤で改善される（図１１）。ヒスチジントレハロース製剤のＴ１ｈサンプルは、一貫して、最も高いパーセンテージのモノマーを示し、結果として、試験した４つの全製剤のうち最も低い分解物パーセンテージを示した。

本発明のまた別の実施形態では、電荷変異体分布は、２〜８℃での、または凍結／融解下での抗体のインキュベーションによって変化しなかった。しかしながら、４０℃での抗体のインキュベーションによって、各製剤により与えられる安定化の程度に違いが生じた。ヒスチジンベースの製剤は、この場合もやはり、リン酸塩製剤と比べて、酸性変異体を蓄積するのが遅かった。ヒスチジン製剤の中で、ヒスチジントレハロースは、ヒスチジンスクロースと比べて、一貫して少ない酸性変異体を示し、したがって、高い主要ピーク％を示した（図５：４０℃でインキュベートしたサンプルにおける電荷変異体分布。図２８：４０℃でインキュベートしたサンプルにおける電荷変異体分布）。抗体の効力／生物活性は、どの製剤および／または条件でも変化しておらず、標準と同程度である。異なる製剤を識別するのに十分な活性／効力アッセイがまだ開発されていないために、このような結論に至ったのかも知れない。これは、ヒスチジンベースの製剤がリン酸塩製剤よりも良好に抗体を分解から保護することができるという事実に照らすと、考慮すべき重要な側面である可能性がある。

本発明の別の実施形態では、蛍光分光法およびＤＳＣでアッセイしたときの抗体の構造安定性は、試験した製剤のいずれにおいてもそれほど変化していなかった。蛍光実験では、（抗体の３Ｄ構造の変化を示すことができる）λ最大値に変化は見られない（図３）。同様に、Ｔ０サンプルと４０℃サンプルとで見られる融解温度には大きな違いが見られず、これは、抗体の異なるドメインが依然として、試験の開始とほぼ同じように折り畳まれずにいることを示している。

本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、実例として与えられるに過ぎないことを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、かつその精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行ない、それを様々な用途および条件に適合させることができる。

本発明は、以下の実施例によってより良好に理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、これらの実施例が、以下に示す特許請求の範囲で定義される本発明の単なる例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。

本発明を以下の実施例および図によって詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を表す。

実験例
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
精製抗体を接線流濾過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔａｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）またはＵＦ／ＤＦを用いて所要の高濃度まで濃縮し、その後、緩衝剤を製剤緩衝剤に交換する。

精製抗体を接線流濾過（ＴＦＦ）またはＵＦ／ＤＦを用いて２０〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、その後、緩衝剤を製剤緩衝剤に交換する。次に、このサンプルを凍結乾燥に供し、凍結乾燥したら、所要の最終薬物製品濃度に達するように、ケーキを適量のＷＦＩ中で再構築する。

大量の製剤原料を凍結乾燥させ、その後、所要の濃度まで製剤緩衝剤中に溶解する。

抗体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー技術を用いて、必要な高濃度にまで濃縮される。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースは優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼすモノマーの減少速度に違いを示したが、このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図に見られる。

ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｍＡｂをリン酸塩／ＮａＣｌ製剤およびヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

本発明は安定な抗体製剤に関する。好ましい安定製剤は、２５〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、１０〜３０ｍＭの緩衝種、１〜１５％のポリオール、０．００１％〜０．０５％の界面活性剤および５〜７．５のｐＨを含む。本発明のさらなる態様は、前述の製剤を調製するプロセスを特徴とする。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫系の細胞において「白血球分化クラスター」または抗原（ＣＤ）と定義されている、細胞表面に発現された生理的に重要な分子の特徴付けを可能にしてきた（Ｓｃｈｏｌｏｓｓｍａｎ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９４） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １５（３）；９８）。個体発生的成長時のリンパ系細胞の分化および成熟における、細胞認識および接着のメカニズムにおける、ならびに免疫応答時の活性化および増殖のメカニズムにおけるＣＤの役割の定義は、そのそれぞれのｍＡｂを診断および免疫療法で使用するために行なわれ、有望な結果をもたらしている（Ｄａｎｔａｌら（１９９１） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７４０）。

バイオテクノロジー開発における近年の進歩により、薬物として使用するのに十分に大量の多種多様な生物活性ポリペプチドが提供されている。しかしながら、ポリペプチドは、変性や可溶性凝集体および不溶性凝集体の形成をはじめとする物理的不安定性、ならびに加水分解、酸化、および脱アミド化などの種々の化学的不安定性の結果として、その強力な生物活性を失うことがある。液体医薬製剤中のポリペプチドの安定性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、繰り返しの凍結融解サイクル、およびプロセッシング時に生じるような機械的剪断力への曝露などの要因によって影響を受けることがある。凝集体形成および生物活性の喪失は、溶液中でのおよび貯蔵バイアル中の液体−空気界面でのポリペプチド分子の物理的撹拌および相互作用の結果として生じることもある。

ＵＳ２００３０１９０３１６号は、グリシン緩衝剤および／またはヒスチジン緩衝剤中に抗体を含む安定化された調製物に関するものであり、塩基性アミノ酸もしくは塩基性アミノ酸誘導体またはそれらの塩を用いてｐＨを調整することを含む、安定化されたタンパク質含有調製物の調製プロセスも提供している。

いくつかの液体医薬組成物は、その中に含まれるポリペプチドの生物活性を安定化するように調剤されているが、液体製剤中でのポリペプチドの分解は、医師にとって問題を起こし続けている。結果として、ポリペプチド成分の安定化を促進し、それにより、その治療的有効性を維持する生理的に適合性のある安定化剤を含む、さらなる医薬組成物が必要とされている。

発明の目的
本発明の主な目的は、抗体、緩衝剤および医薬として許容される賦形剤を含む製剤を得ることである。

本発明の別の目的は、抗体またはその断片、緩衝剤および凍結乾燥保護剤を含む製剤を得ることである。

本発明のまた別の目的は、安定な抗体製剤を得ることである。

発明の提示
したがって、本発明は、Ｔ１ｈ抗体、ヒスチジン緩衝剤、トレハロース糖、および医薬として許容される賦形剤を含み、ＨＭＷＰを約２０％減少させるヒスチジン−トレハロース製剤；ａ）約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体、およびｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤；ａ）約５０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤、およびｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤；ならびにａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤、ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤、およびｄ）凍結乾燥保護剤または凍結防止剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

評価した異なる製剤の試験期間中のｐＨ変動性。 評価した異なる製剤の試験期間中のオスモル濃度（Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）値。 異なる条件でインキュベートした異なる製剤のサンプルのスペクトルおよびλ最大値が違わないことを示す正規化した蛍光グラフ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｇｒａｐｈ）。 サンプルの流体力学半径解析（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｒａｄｉｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）。 ４０℃でインキュベートしたサンプルの電荷変異体分布（Charge ｖａｒｉａｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）。 ４０℃でインキュベートしたサンプルの電荷変異体分布（ヒスチジントレハロースが強調されている）。 リン酸塩ベースの製剤中のより多くの酸性変異体を示すリン酸塩およびヒスチジンベースの製剤のイオン交換クロマトグラフィープロファイルの重ね合わせ。 ４０℃でインキュベートしたサンプルのモノマー％の減少を示す図。 ４０℃でのＳＥＣによる分解物（％ＨＭＷＰ＋％ＬＭＷＰ）の増加を示す図。 試験した４つの製剤中のＬＭＷＰの増加。４つの製剤は全て同じ傾向に従い、これらの値は、ヒスチジントレハロース製剤がその他の製剤と比べて若干少ない断片化を示すことを除けば、極めてよく似ている。 試験した４つの製剤中のＨＭＷＰの増加を示す傾向。ヒスチジン含有製剤は、リン酸塩サンプルと比べて少ない凝集を示す。 異なる製剤中のＴ１ｈサンプルのｐＨ変動性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）。 凍結および融解を繰り返したサンプルのタンパク質濃度。 凍結および融解を繰り返した後のリン酸塩およびヒスチジン中の１ｍｌサンプルのＳＥＣプロファイル。 リン酸塩およびヒスチジン製剤の０．５ｍｌサンプルのＳＥＣプロファイルの比較。 繰り返し凍結および融解に供した両製剤の１ｍｌサンプルのＳＥＣデータ。 繰り返し凍結および融解に供した両製剤の０．５ｍｌサンプルのＳＥＣデータ。 リン酸塩サンプルにおける４０分での凝集体溶出の可能性を示す１ｍｌサンプルのイオン交換クロマトグラフィープロファイルの重ね合わせ。 ４０分でのリン酸塩サンプルにおける凝集体溶出を示すが、ヒスチジンサンプルにおける凝集体溶出は示さない、０．５ｍｌサンプルの重ね合わせ。 リン酸塩およびヒスチジン製剤中で繰り返しの凍結および融解に供した１ｍｌサンプルのＩＥＸデータ。 リン酸塩およびヒスチジン製剤中で繰り返しの凍結および融解に供した０．５ｍｌサンプルのＩＥＸデータ。 凍結状態サンプルのｐＨ変動性。 凍結状態安定性サンプルのタンパク質濃度。 リン酸塩凝集のわずかな増加を示す凍結状態安定性のＳＥＣ重ね合わせ。 凍結状態安定性サンプルのサイズ変異体分布のＳＥＣデータ。 凍結状態安定性サンプルのＩＥＸクロマトグラム重ね合わせ。 リン酸塩およびヒスチジンの凍結状態安定性のＩＥＸデータ。

本発明は、Ｔ１ｈ抗体、ヒスチジン緩衝剤、トレハロース糖、および医薬として許容される賦形剤を含み、ＨＭＷＰを約２０％減少させるヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

本発明は、また、医薬として許容される賦形剤が、凍結防止剤、凍結乾燥防止剤、界面活性剤、増量剤またはこれらの組合せから選択される、ヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

本発明の一実施形態では、ＨＭＷＰを約９０％増大させるリン酸塩−ショ糖製剤、ＨＭＷＰを約９０％増大させるリン酸塩−トレハロース製剤、およびＨＭＷＰを約１１％減少させるヒスチジン−ショ糖製剤と比べて、ヒスチジン−トレハロース製剤はＨＭＷＰを約２０％減少させる。

本発明のさらに別の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０およびポリソルベート８０を含む群から選択される。

本発明のさらに別の実施形態では、増量剤は、グリシンおよびマンニトールを含む群から選択される。

本発明は、さらにａ）約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体；およびｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

本発明は、さらにａ）約５０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体；ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤；およびｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

本発明は、さらにａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌのＴ１ｈ抗体；ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供するヒスチジン緩衝剤；ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤；およびｄ）凍結乾燥保護剤または凍結防止剤を含むヒスチジン−トレハロース製剤に関する。

本発明の一実施形態では、製剤は、凍結乾燥ケーキまたは粉末である。

本発明の一実施形態では、製剤は、注射用滅菌水または注射用静菌水中でさらに再構成される。

本発明の主な目的は、抗体、緩衝種、ポリオールおよび界面活性剤を含む安定な液体医薬組成物を提供することである。

有利なことに、本発明による組成物の製剤は、貯蔵中に安定である組成物になることが見出された。貯蔵中に安定であるとは、免疫グロブリンが実質的に凝集も分解もせず、許容可能なレベルのインビトロおよびインビボ活性を維持することを意味すると解釈される。

本発明の別の態様は、抗体製剤を調製する方法に関する。

本発明は、治療的活性成分としての抗体を含む液体医薬組成物およびその調製において有用な方法に関する。本発明の目的のために、医薬組成物または製剤に関する「液体」という用語は、「水性」という用語を含むことが意図される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、天然の（ネイティブの）、合成された、および組換えの抗体およびタンパク質、ならびに本明細書の別の場所で適格性が保証されているその生物活性変異体を包含する。「治療的活性成分」により、医薬組成物を対象に投与したとき、その対象内の疾患または状態の治療、予防、または診断に関して所望の治療応答をもたらすように、抗体が組成物に特に組み込まれていることが意図される。

より具体的には、本発明の組成物は、その治療的活性成分が、通常は液体医薬製剤中での貯蔵中に凝集体形成を示す抗体を含む安定化された液体医薬組成物である。「凝集体形成」により、溶けたままであり得るオリゴマー、または溶液から沈殿する目に見える巨大な凝集体の形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用が意図される。「貯蔵中」により、一旦調製された液体医薬組成物または製剤が、すぐには対象に投与されないことが意図される。どちらかと言えば、調製後、それは、貯蔵のために、液体形態、凍結状態、もしくは後に液体形態へと再構成するための乾燥形態のいずれか、または対象への投与に好適な他の形態で包装される。液体医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼし、医薬組成物の治療効力を失わせることもある。さらに、凝集体形成は、ポリペプチド含有医薬組成物を、注入システムを用いて投与するときに、チューブ、メンブレン、またはポンプの閉塞などの他の問題を引き起こす可能性がある。

本発明の安定化された液体医薬組成物は、一定量の緩衝種をさらに含む。これらの緩衝種としては、主に、リン酸塩またはヒスチジンが挙げられる。製剤の緩衝種は、ｐＨを維持することが意図される。リン酸塩製剤のｐＨを７に設定し、ヒスチジン製剤のｐＨを６に設定したが、それは、これらのｐＨがこれらの緩衝種の緩衝範囲にあるからである。

本発明の組成物に添加される界面活性剤の安定化量は、抗体含有組成物における凝集体形成または濁りを阻害するのに十分な量である。そのような凝集体形成は、例えば、長期貯蔵、機械的撹拌、凍結および融解によって起こることがある。凝集または濁りの顕著な阻害が観察され、濁り／凝集体形成は、界面活性剤を含む抗体含有組成物では、界面活性剤を含まない同等の製剤よりも少なくとも１０％少なく、好ましくは少なくとも５０％少なく、より好ましくは少なくとも７０％少なく、最も好ましくは少なくとも９０％少ない。３２０ｎｍでの吸光度についてバイアルおよび抗体含有組成物の目視検査をモニタリングして、溶液中のタンパク質分子を維持するポリソルベート８０の能力を決定すべきである。主に、溶液中での分子の散乱の結果として生じる３２０ｎｍでの吸光度は、ポリソルベート８０を欠くサンプルでは、はるかに顕著であった。

本明細書で使用される「界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」は、親水性領域と疎水性領域を有する任意の界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を包含すると定義され、これには、非イオン性、カチオン性、アニオン性および両性界面活性剤が含まれる。好適な界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０もしくは「ＴＷＥＥＮ」８０としても知られる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０もしくは「ＴＷＥＥＮ」２０としても知られる）、またはＮ−ラウリルサルコシン（ｌａｕｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、本明細書に記載の製剤に好ましい。そのような非イオン性界面活性剤は、以下の界面活性剤、例えば、ポリオキサマーまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０）から選択することができる。ポリソルベート８０は、本発明の組成物に好ましい。界面活性剤は、０．０１重量％〜０．５重量％の濃度で存在することができる。

免疫グロブリンサブユニットポリペプチドは各々、定常領域と可変領域を含む。ほとんどの種では、重鎖可変領域（すなわち、ＶＨドメイン）と軽鎖可変領域（すなわち、ＶＬドメイン）が組み合わさって、「相補性決定領域」またはＣＤＲという、特定のエピトープの抗原結合部位に特に寄与する免疫グロブリン分子の部分から構成された抗原結合ドメインを形成する。通常、重鎖と軽鎖は各々３つのＣＤＲを有しており、これらが組み合わさって、免疫グロブリンの抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン分子の「抗原結合ドメイン」は、必ずしもそうではないが、通常、ジスルフィド結合で結合している、１つの重鎖の可変ドメインの少なくとも一部と１つの軽鎖の可変ドメインの少なくとも一部からなる。Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能に必須である。エフェクター機能としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を開始すること、貪食細胞および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を開始すること、ならびにトランスサイトーシスにより抗体を細胞障壁の向こうに移動させること挙げられる。さらに、Ｆｃ領域は、ＩｇＧクラスの抗体の血清半減期を維持するのに極めて重要である（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５））。

さらなる態様では、本発明は、改変された抗体またはＦａｂ、Ｆｃもしくはそれらの部分から選択される機能断片を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能断片を、医薬として許容される希釈剤または担体とともに含む医薬組成物を提供する。

組成物は、１以上の緩衝種、１以上のポリオール、および１以上の界面活性剤を含むことができる。

組成物は、医薬として許容される担体を含む。医薬として許容される担体としては、食塩水、滅菌水、リン酸塩緩衝食塩水などが挙げられるが、これらに限定されない。患者への送達に好適な他の緩衝剤、分散剤、および無毒な不活性物質を本発明の組成物に含めることができる。組成物は、投与に好適な溶液であってもよく、通常、滅菌性で、かつ望ましくない粒子状物質を含まない。

本発明との関連で用いられる緩衝剤は、好ましくは、リン酸塩またはヒスチジンである。最も好ましくは、本発明の製剤で用いられる緩衝剤は、酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジンおよびリン酸塩に限定されない。これらは、そのままでまたは組み合わせて用いることができる。

製剤の溶液のｐＨは、５〜７．５の範囲とすることが望ましく、溶液のｐＨは、必要に応じて、最終的なｐＨを所望のレベルに調整して、５．５〜６の範囲とすることが好ましい。

本発明との関連で用いられるポリオールは、抗体の安定化剤、張性修飾剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）および凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）などの、いくつかの役割を果たす還元糖であり、これも、製剤に含められる。最も好ましくは、本発明の製剤で用いられるポリオールは、スクロースまたはトレハロースなどの非還元糖である。

当業者に周知の他の医薬として許容される賦形剤もまた、本組成物の一部を形成することができる。これには、例えば、様々な増量剤が含まれ、ここで、増量剤は、グリシンまたはマンニトールから選択される。

一実施形態では、製剤の糖成分（スクロースおよびトレハロース）は、多面的な目的を有する：糖は、抗体の安定化剤として働き、抗体を分解から保護する；糖は、（凍結と乾燥の両方を伴う）凍結乾燥プロセスにおいて抗体を保護する凍結防止剤／凍結乾燥保護剤である；糖は張性修飾剤でもあり、その濃度を調整して、製品を等張にすることができる。等張製品は、注射部位での痛みを顕著に軽減することができるので、張性は、本製品のような皮下投与される製品では重要である。スクロースとトレハロースは両方とも非還元糖類であり、タンパク質を安定化するのに広く用いられているので、これらを評価用に選択した。糖の濃度は、皮下投与用の等張溶液を提供するように選択した。

本発明の別の実施形態では、製剤スクリーニング試験の結果は、２〜８℃で、凍結／融解に供したとき、製剤間で、ＨＭＷＰまたはＬＭＷＰにそれほど大きな違いが見られなかったことを示している。しかしながら、４０℃でインキュベートしたとき、抗体の物理的安定性は、特に凝集に関して、リン酸塩ベースの製剤と比べて、ヒスチジン含有緩衝剤で改善される（図１１）。ヒスチジントレハロース製剤のＴ１ｈサンプルは、一貫して、最も高いパーセンテージのモノマーを示し、結果として、試験した４つの全製剤のうち最も低い分解物パーセンテージを示した。

本発明のまた別の実施形態では、電荷変異体分布は、２〜８℃での、または凍結／融解下での抗体のインキュベーションによって変化しなかった。しかしながら、４０℃での抗体のインキュベーションによって、各製剤により与えられる安定化の程度に違いが生じた。ヒスチジンベースの製剤は、この場合もやはり、リン酸塩製剤と比べて、酸性変異体を蓄積するのが遅かった。ヒスチジン製剤の中で、ヒスチジントレハロースは、ヒスチジンスクロースと比べて、一貫して少ない酸性変異体を示し、したがって、高い主要ピーク％を示した（図５：４０℃でインキュベートしたサンプルにおける電荷変異体分布。図２８：４０℃でインキュベートしたサンプルにおける電荷変異体分布）。抗体の効力／生物活性は、どの製剤および／または条件でも変化しておらず、標準と同程度である。異なる製剤を識別するのに十分な活性／効力アッセイがまだ開発されていないために、このような結論に至ったのかも知れない。これは、ヒスチジンベースの製剤がリン酸塩製剤よりも良好に抗体を分解から保護することができるという事実に照らすと、考慮すべき重要な側面である可能性がある。

本発明の別の実施形態では、蛍光分光法およびＤＳＣでアッセイしたときの抗体の構造安定性は、試験した製剤のいずれにおいてもそれほど変化していなかった。蛍光実験では、（抗体の３Ｄ構造の変化を示すことができる）λ最大値に変化は見られない（図３）。同様に、Ｔ０サンプルと４０℃サンプルとで見られる融解温度には大きな違いが見られず、これは、抗体の異なるドメインが依然として、試験の開始とほぼ同じように折り畳まれずにいることを示している。

本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、実例として与えられるに過ぎないことを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、かつその精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行ない、それを様々な用途および条件に適合させることができる。

本発明は、以下の実施例によってより良好に理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、これらの実施例が、以下に示す特許請求の範囲で定義される本発明の単なる例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。

本発明を以下の実施例および図によって詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を表す。

実験例
実施例１
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
精製抗体を接線流濾過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔａｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）またはＵＦ／ＤＦを用いて所要の高濃度まで濃縮し、その後、緩衝剤を製剤緩衝剤に交換する。

精製抗体を接線流濾過（ＴＦＦ）またはＵＦ／ＤＦを用いて２０〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、その後、緩衝剤を製剤緩衝剤に交換する。次に、このサンプルを凍結乾燥に供し、凍結乾燥したら、所要の最終薬物製品濃度に達するように、ケーキを適量のＷＦＩ中で再構築する。

大量の製剤原料を凍結乾燥させ、その後、所要の濃度まで製剤緩衝剤中に溶解する。

抗体は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー技術を用いて、必要な高濃度にまで濃縮される。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースが最も優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼすモノマーの減少速度に違いを示したが、このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図に見られる。

ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｍＡｂをリン酸塩／ＮａＣｌ製剤およびヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

実施例２：
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
Ｔ１ｈ抗体を含む製剤を、実施例１で示したのと同様に調製する。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。図５および６は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、電荷変異体が増大したことを示している。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合は酸性変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したもの（ｒｅｖｉｓｅｄ）の値）から５７．４８へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から５７．４６へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、電荷分布は、リン酸塩製剤と比べてより低い。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合は、酸性電荷変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から４９．１１へしか増大せず、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合は、３２．６３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から４５．４８へしか増大しない。

したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースが最も優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、図８に観測されるとおり、モノマーの減少速度に違いを示し、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼした。

図８は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のモノマーの減少％が増大したことを示している。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９３．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８７．１へ減少し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９２．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８７．４へ減少する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で２週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９１．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８７．９へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９３．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９０．５へしか減少しない。

このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図９に見られる。

図９は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中の分解物の増大％が減少したことを示している。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．９へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は７．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．６へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が８．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．１へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は６．７（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．５へしか増大しない。

以下に示しかつ説明するように、ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図１０）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図１１）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１０は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＬＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が５．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．６へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．６へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で２週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１０．７へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８．３へしか増大しない。

図１１は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＨＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が２．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．３へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は２．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．０へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で２週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が１．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．４へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は１．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．２へしかならない。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１６は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された１ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布（ｓｉｚｅ ｖａｒｉａｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．２３（４週間後のＰＢＳ Ｔ４での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．７２（４週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ４の値）に減少したことを示す。

図１７は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された０．５ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９５．８７（４週間後のＰＢＳ Ｔ４での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．８２（４週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ４の値）に減少したことを示す。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｔ１ｈモノクローナル抗体を、ヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。

一方、図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

実施例３：
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
Ｔ１ｈ抗体を含む製剤を、実施例１で示したのと同様に調製する。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。図５および６は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、電荷変異体が増大したことを示している。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合は酸性変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から６３．７９へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から６３．３１へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、電荷分布は、リン酸塩製剤と比べてより低い。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合は、酸性電荷変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から５４．０２へしか増大せず、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合は、３２．６３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から４９．５９へしか増大しない。

したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースが最も優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、図８に観測されるとおり、モノマーの減少速度に違いを示し、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼした。

図８は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のモノマーの減少％が増大したことを示している。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９３．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８７．４へ減少し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９２．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８５．０へ減少する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で３週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９１．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８６．０へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９３．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８９．３へしか減少しない。

このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図９に見られる。

図９は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中の分解物の増大％が減少したことを示している。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．６へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は７．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１５．０へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で３週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が８．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１４．０へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は６．７（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１０．７へしか増大しない。

以下に示しかつ説明するように、ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図１０）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図１１）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１０は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＬＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が５．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．２へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１１．５へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で３週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．５へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．３へしか増大しない。

図１１は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＨＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で３週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が２．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．３へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は２．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．５へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で３週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が１．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．４へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は１．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．５へしかならない。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１６は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された１ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．５２（３週間後のＰＢＳ Ｔ３での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．８９（３週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ３の値）に増大したことを示す。

図１７は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された０．５ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．３１（３週間後のＰＢＳ Ｔ３での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．９０（３週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ４の値）に増大したことを示す。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｔ１ｈモノクローナル抗体を、ヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。

一方、図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

実施例４：
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
Ｔ１ｈ抗体を含む製剤を、実施例１で示したのと同様に調製する。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。図５および６は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、電荷変異体が増大したことを示している。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合は酸性変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から６８．８５へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から６８．９５へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、電荷分布は、リン酸塩製剤と比べてより低い。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合は、酸性電荷変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から５８．６２へしか増大せず、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合は、３２．６３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から５３．７８へしか増大しない。

したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースが最も優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、図８に観測されるとおり、モノマーの減少速度に違いを示し、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼした。

図８は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のモノマーの減少％が増大したことを示している。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９３．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８６．４へ減少し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９２．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８５．０へ減少する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で４週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９１．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８５．７へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９３．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８９．５へしか減少しない。

このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図９に見られる。

図９は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中の分解物の増大％が減少したことを示している。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１３．６へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は７．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１５．０へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で４週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が８．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１４．３へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は６．７（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１０．５へしか増大しない。

以下に示しかつ説明するように、ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図１０）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図１１）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１０は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＬＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が５．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１０．１へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１１．９へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で４週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．８へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から９．４へしか増大しない。

図１１は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＨＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で４週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が２．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．５へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は２．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．１へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で４週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が１．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．５へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は１．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．０へしかならない。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１６は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された１ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．８１（２週間後のＰＢＳ Ｔ２での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．８８（２週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ２の値）に増大したことを示す。

図１７は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された０．５ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．２８（２週間後のＰＢＳ Ｔ２での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．８３（２週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ２の値）に減少したことを示す。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｔ１ｈモノクローナル抗体を、ヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。

一方、図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

実施例５：
Ａ．ｍＡＢを含む製剤を以下のように調製することができる。
Ｔ１ｈ抗体を含む製剤を、実施例１で示したのと同様に調製する。

Ｂ．水性製剤の化学的安定性
２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解ストレスに供したサンプルは、イオン交換でいかなる変動性も示さなかった。分解における違いは、４０℃でインキュベートしたサンプルでのみ観察された。

４０℃でインキュベートしたサンプルのイオン交換クロマトグラフィーは、酸性変異体が、ヒスチジン製剤では、リン酸塩ベースの製剤と比べて、低い程度しか増加しないことを明確に示している。ヒスチジン製剤の中で、トレハロース含有製剤は、ヒスチジンスクロース製剤と比べて、酸性変異体集団が少ない。図５および６は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、電荷変異体が増大したことを示している。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合は酸性変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から７３．４９へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から７３．２４へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、電荷分布は、リン酸塩製剤と比べてより低い。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、ヒスチジン−スクロース製剤の場合は、酸性電荷変異体が３３．９１（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から６２．１２へしか増大せず、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合は、３２．６３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から５７．２１へしか増大しない。

したがって、イオン交換クロマトグラフィーによると、ヒスチジントレハロースが最も優れた製剤である。

ＳＥＣによると、２〜８℃でインキュベートしたサンプルおよび凍結融解でストレスをかけたサンプルは、評価した４つの製剤間で分解パターンの違いをほとんどまたは全く示さなかった。

しかしながら、４０℃でインキュベートしたサンプルは、図８に観測されるとおり、モノマーの減少速度に違いを示し、結果として分解物（ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰ）の蓄積に影響を及ぼした。

図８は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のモノマーの減少％が増大したことを示している。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９３．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８４．１へ減少し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９２．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８４．１へ減少する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で５週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のモノマーの減少％が９１．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８３．５へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は９３．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から８７．１へしか減少しない。

このことは、ヒスチジン／トレハロース製剤が、モノマーの分解についてより遅い速度に従うのに対し、他の３つの製剤がより速く分解するように思われることを示す。同じことは、分解物の増加の図９に見られる。

図９は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中の分解物の増大％が減少したことを示している。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１５．９へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は７．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１５．９へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で５週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中の分解物の増大％が８．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１６．５へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は６．７（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．９へしか増大しない。

以下に示しかつ説明するように、ＨＭＷＰおよびＬＭＷＰの増加をより詳細に観察すると、ＬＭＷＰの増加のパターンが全ての製剤で同様の傾向に従うことが示され（図１０）、ヒスチジン製剤は、ＨＭＷＰの蓄積において、リン酸塩ベースの製剤と異なっている（図１１）。５．５週の最後に、残存するモノマーが最も多くかつ分解物の％が最も低いのは、ヒスチジン／トレハロース含有製剤である。

図１０は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＬＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が５．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．１へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１２．１へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で５週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＬＭＷＰの増大％が７．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１５．０へしか増大せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は５．４（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１１．８へしか増大しない。

図１１は、一定の時間間隔後に観察したときに、リン酸塩−スクロース製剤からリン酸塩−トレハロース製剤まで、サンプル中のＨＭＷＰの増大％が増大したことを示している。これを、４０℃で５週間インキュベートした製剤について観測すると、リン酸塩−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が２．０（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．８へ増大し、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は２．２（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から３．８へ増大する。

一方、ヒスチジン製剤を観測すると、４０℃で５週間インキュベートした製剤について、ヒスチジン−スクロース製剤の場合はサンプル中のＨＭＷＰの増大％が１．６（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．５へしか減少せず、一方、リン酸塩−トレハロース製剤の場合は１．３（４０℃、Ｔ０改良したものの値）から１．１へしかならない。

図１４〜１７のＳＥＣ結果は、凝集体が、繰り返しの凍結融解（−８０℃）下、リン酸塩／ＮａＣｌサンプルで４週間にわたって増加し、凝集の増加がＨｉｓ／Ｔｒｅ製剤で４週間にわたって観察されないことを示している。凝集の増加は、０．５ｍｌ充填容量サンプルでは約１．７５％、１ｍｌ充填サンプルでは１．４１％である。

図１６は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された１ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９６．８８（１週間後のＰＢＳ Ｔ１での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９７．９１（１週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ１の値）に増大したことを示す。

図１７は、一定の時間間隔後に観察したときに、繰り返しの凍結融解（−８０℃）された０．５ｍｌサンプル中のサイズ変異体分布は、リン酸塩緩衝剤食塩水の場合はモノマー％が９７．６７（ＰＢＳ Ｔ０での値）から９７．４２（１週間後のＰＢＳ Ｔ１での値）に減少し、一方、ヒスチジン−トレハロース製剤の場合はモノマー％が９７．８６（Ｔ０でのＨｉｓ−Ｔｒｅの値）から９８．０２（１週間後のＨｉｓ−Ｔｒｅ Ｔ１の値）に減少したことを示す。

図１８〜２１の弱陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｔ１ｈモノクローナル抗体を、ヒスチジントレハロース製剤中で４週間の試験期間にわたって繰り返し凍結（−８０℃）および融解したときに、電荷変異体分布がそれほど大きく変化しないことを示している。

しかしながら、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌサンプルでは、増加量のタンパク質が４０分で緩衝剤ピークと共溶出する。

一方、図１２〜１３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

図２４〜２７の凍結状態安定性試験は、電荷変異体プロファイルに違いは見られないが、Ｐｈｏｓ／ＮａＣｌ製剤では凝集がわずかに増加し、Ｈｉｓ／Ｔｒｅ製剤では増加しないことを示している。図２２〜２３に示すように、ｐＨ、濃度などの他のパラメータは、ある製剤の別の製剤に対する優位性を示していない。

Claims (17)

1. 抗体、緩衝剤および医薬として許容される賦形剤を含む製剤。
2. 抗体またはその断片、緩衝剤および凍結乾燥保護剤を含む製剤。
3. 前記緩衝剤が、ＴＲＩＳ、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、イミダゾール、グリシン、Ｌ−アルギニン、ヒスチジンおよびそれらの組合せから選択される、請求項１または２に特許請求された製剤。
4. 緩衝剤が好ましくはヒスチジンである、請求項１または２に特許請求された製剤。
5. 前記凍結乾燥保護剤が、ポリオールまたは糖類から選択される、請求項２に特許請求された製剤。
6. 前記凍結乾燥保護剤が、ＰＥＧ、グリセロール、スクロース、トレハロースおよびマンニトールのように非還元性の性質である、請求項５に特許請求された製剤。
7. 前記製剤が凍結防止剤をさらに含む、請求項１または２に特許請求された製剤。
8. 前記凍結防止剤が好ましくはトレハロースである、請求項７に特許請求された製剤。
9. 界面活性剤をさらに含む、請求項１または２に特許請求された製剤。
10. 前記界面活性剤が、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０を含む群から選択される、請求項９に特許請求された製剤。
11. 前記製剤が増量剤をさらに含む、請求項１または２に特許請求された製剤。
12. 前記増量剤が、グリシンおよびマンニトールを含む群から選択される、請求項１１に特許請求された製剤。
13. ａ）約２５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤を含む、安定な抗体製剤。
14. ａ）約５０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤およびｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む、安定な抗体製剤。
15. ａ）約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの抗体、ｂ）ｐＨ５〜ｐＨ７．５を提供する緩衝剤；ｃ）約０．００１％〜約０．０５％の非イオン性界面活性剤；ならびにｃ）凍結乾燥保護剤および／または凍結防止剤を含む、安定な抗体製剤。
16. 前記製剤が凍結乾燥ケーキまたは粉末である、請求項１５に特許請求された製剤。
17. 前記製剤が、注射用滅菌水または注射用静菌水中でさらに再構成される、請求項１５に特許請求された製剤。