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CN117214426A - 一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法 - Google Patents

一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法 Download PDF

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CN117214426A
CN117214426A CN202311211008.8A CN202311211008A CN117214426A CN 117214426 A CN117214426 A CN 117214426A CN 202311211008 A CN202311211008 A CN 202311211008A CN 117214426 A CN117214426 A CN 117214426A
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antibody
antibody diluent
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arginine
serum albumin
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CN202311211008.8A
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王露
董洪梅
佘日升
林宇晟
马佳康
崔伟恒
陈双龙
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Jinan University
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Jinan University
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Abstract

本发明属于生物检测试剂技术领域,公开了一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法。该抗体稀释液包括:牛血清蛋白、咪唑、稳定剂、表面活性剂和抑菌剂;所述稳定剂为精氨酸和组氨酸。本发明提供的抗体稀释液,其本身稳定性强,于25℃下保存后两年,仍然无沉淀产生,溶液呈透明状;利用其稀释抗体,能够维持多种抗体分子的稳定性,最大程度地保持抗体的生物活性,延长抗体分子的保存期,减少使用时抗体的非特异性结合,其检测强度高。

Description

一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测试剂技术领域,具体涉及一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法。
背景技术
免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透,免疫学涉及的范围不断扩大,新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大,不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法,也为众多学科的研究提供了方便。
用于免疫组织化学检测的抗体,都是以高浓度的储存液或冻干粉形式进行储存,购买后使用根据不同的检测需求,采用抗体稀释液稀释至工作浓度,再进行检测。抗体稀释液的配方对免疫组织化学的检测强度及抗体产品的稳定性起关键作用。抗体稀释液最主要的作用有三点︰第一,缓冲体系,为抗体提供稳定的工作环境(离子浓度,pH等);第二,保护体系,长时间保持抗体稳定,防止抗体在低浓度下效价降低;第三,封闭体系,辅助提高抗体特异性,减少非特异结合。目前现有的抗体稀释液普遍存在检测强度低、抗体存储稳定性差等问题,对免疫组织化学检测造成了一定的影响。
因此,亟需提供一种存储稳定性强、检测强度高的用于免疫组织化学检测的抗体稀释液。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液及其制备方法。本发明提供的抗体稀释液,其存储稳定性强、检测强度高。
本发明提供了一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液。
具体地,所述抗体稀释液包括:牛血清蛋白、咪唑、稳定剂、表面活性剂和抑菌剂;所述稳定剂为精氨酸和组氨酸。
优选地,所述精氨酸与所述组氨酸的质量比为(0.5-2):1;进一步优选地,所述精氨酸与所述组氨酸的质量比为(0.6-1.5):1;更优选地,所述精氨酸与所述组氨酸的质量比为(0.8-1.2):1。
优选地,所述抗体稀释液包括:0.05-0.5%m/V牛血清蛋白、0.03-0.2%m/V咪唑、0.02-0.3%m/V稳定剂、0.1-0.5%V/V表面活性剂和0.02-0.2%V/V抑菌剂。
m/V代表质量浓度,单位为kg/L,如0.1%m/V牛血清蛋白表示在所述抗体稀释液中牛血清蛋白的质量浓度为0.1%kg/L,即1g/L。V/V代表体积浓度,如0.1%V/V抑菌剂表示在所述抗体稀释液中抑菌剂的体积浓度为0.1%L/L,即1mL/L。
进一步优选地,所述抗体稀释液包括:0.05-0.4%m/V牛血清蛋白、0.05-0.2%m/V咪唑、0.05-0.3%m/V稳定剂、0.1-0.4%V/V表面活性剂和0.05-0.15%V/V抑菌剂。
更优选地,所述抗体稀释液包括:0.1-0.4%m/V牛血清蛋白、0.1-0.2%m/V咪唑、0.05-0.2%m/V稳定剂、0.1-0.3%V/V表面活性剂和0.1-0.15%V/V抑菌剂。
优选地,所述表面活性剂选自吐温-20、吐温80、TritonX-100中的一种或几种。
优选地,所述抑菌剂为Proclin-300。
优选地,所述抗体稀释液还包括缓冲溶液。
优选地,所述缓冲溶液的pH值为6-9;进一步优选地,所述缓冲溶液的pH值为6-8。
优选地,所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Tris-HCl缓冲液。
优选地,所述抗体稀释液还包括0.01-0.2%m/V润湿剂;进一步优选地,所述抗体稀释液还包括0.05-0.1%m/V润湿剂。
优选地,所述润湿剂选自海藻多糖、山梨醇、甘露醇中的至少一种。
本发明还提供了一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的制备方法。
具体地,一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
将各组分溶于缓冲溶液中,然后经滤膜过滤,制得抗体稀释液。
本发明还提供了一种用于免疫组织化学检测的抗体稀释液的应用。
具体地,上述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液在制备免疫检测试剂中的应用。
本发明还提供了一种免疫检测试剂。
具体地,一种免疫检测试剂,包含上述用于免疫组织化学检测的抗体稀释液。
相对于现有技术,本发明的有益效果如下:
(1)本发明提供的抗体稀释液,以牛血清蛋白、咪唑、稳定剂、表面活性剂和抑菌剂为主要组分,并选择精氨酸和组氨酸搭配使用作为抗体稀释液的稳定剂,咪唑与精氨酸、组氨酸共同作用能够提高体系的稳定性,保持抗体分子的生物活性。
(2)本发明提供的抗体稀释液,其本身稳定性强,于25℃下保存后两年,仍然无沉淀产生,溶液呈透明状;利用其稀释抗体,能够维持多种抗体分子的稳定性,最大程度地保持抗体的生物活性,延长抗体分子的保存期,减少使用时抗体的非特异性结合,其检测强度高。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案,现列举以下实施例进行说明。需要指出的是,以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明,均可从常规商业途径得到,或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.15%m/V咪唑、0.08%m/V精氨酸、0.08%m/V组氨酸、0.2%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
实施例2
一种抗体稀释液,包括:0.35%m/V牛血清蛋白、0.18%m/V咪唑、0.08%m/V精氨酸、0.08%m/V组氨酸、0.25%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.1%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
实施例3
一种抗体稀释液,包括:0.25%m/V牛血清蛋白、0.12%m/V咪唑、0.08%m/V精氨酸、0.08%m/V组氨酸、0.15%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.15%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
实施例4
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.3%m/V咪唑、0.08%m/V精氨酸、0.08%m/V组氨酸、0.05%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
实施例5
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.15%m/V咪唑、0.12%m/V精氨酸、0.04%m/V组氨酸、0.2%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
实施例6
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.15%m/V咪唑、0.02%m/V精氨酸、0.14%m/V组氨酸、0.2%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为7.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
对比例1
一种抗体稀释液,包括:0.35%m/V牛血清蛋白、0.09%m/V精氨酸、0.09%m/V组氨酸、0.25%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.15%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、精氨酸、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
对比例2
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.15%m/V咪唑、0.16%m/V组氨酸、0.2%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、组氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
对比例3
一种抗体稀释液,包括:0.3%m/V牛血清蛋白、0.15%m/V咪唑、0.16%m/V精氨酸、0.2%V/V吐温-20、0.15%m/V海藻多糖和0.12%V/V Proclin-300,剩余为磷酸钾缓冲溶液(pH值为6.5)。
上述抗体稀释液的制备方法,包括以下步骤:
向磷酸钾缓冲溶液中加入依次加入牛血清蛋白、咪唑、精氨酸、吐温-20、海藻多糖和Proclin-300,搅拌,充分溶解,然后0.22μm的滤膜进行过滤除菌,得到抗体稀释液。
产品效果测试
1.研究实施例1-6和对比例1-3制备的抗体稀释液在25℃下保存后的稳定性情况。检测结果如表1所示。
表1 25℃下保存后的稳定性结果
由表1可知,本发明实施例制备抗体稀释液的稳定性强,能够在稳定保存12个月;本发明实施例1-3制备的抗体稀释液能够稳定保存24个月,保存后抗体稀释液仍然呈透明液体,且无沉淀。而本发明对比例提供的抗体稀释液,其稳定性较差,保质期短,无法满足实际免疫组织化学检测的应用。
2.研究实施例1-6和对比例1-3制备的抗体稀释液对CD3(分化簇3)抗体(易普森CD3抗体)的稀释保存效果。
采用实施例1-6和对比例1-3制备的抗体稀释液分别将CD3(分化簇3)抗体稀释,稀释比为1:2000。稀释后的抗体于4℃下放置100天,然后对抗体的活性进行检测,采用酶联免疫吸附剂测定进行检测,在490nm波长下读取吸光值。测试结果见表2。
表2 CD3(分化簇3)抗体活性检测结果
由表2可知,实施例1-6制备的抗体稀释液稀释CD3(分化簇3)抗体,放置100天后,其吸光值明显高于对比例1-3。本发明提供的抗体稀释液对CD3(分化簇3)抗体具有良好的保护作用,能够保持CD3(分化簇3)抗体在存储过程中的活性。
3.研究实施例1-6和对比例1-3制备的抗体稀释液对p16抗体(宫颈癌组织)的稀释和保护效果。
分别采用实施例1-6和对比例1-3制备的抗体稀释液对p16抗体稀释1500倍,置于4℃下,放置不同时间检测。
将载有宫颈癌组织样本的切片置于60℃烤片1小时。然后依次浸入2缸脱蜡液中,每次10分钟。再将切片经乙醇溶液浸泡。取出切片后复水10分钟。将切片置于预先加热至沸腾状态的抗原修复液中,保持微沸腾15分钟,待恢复至室温后将样本切片取出。添加3%过氧化氢溶液,室温孵育10分钟去除内源性过氧化物酶。使用上述稀释好的一抗孵育切片,室温孵育30分钟。添加偶联了HRP的多聚物二抗,室温孵育30分钟。添加DAB显色液,室温孵育2分钟。显色结束后进行苏木素复染、脱水透明。以PBS缓冲液(pH值6.5)为对照,染色结果如表3所示。
表3染色结果
由表3可知,本发明提供的抗体稀释液对p16抗体具有良好的保护作用,在保存18个月后,仍然能够进行染色,且染色结果合格。

Claims (10)

1.一种抗体稀释液,其特征在于,包括:牛血清蛋白、咪唑、稳定剂、表面活性剂和抑菌剂;所述稳定剂为精氨酸和组氨酸。
2.根据权利要求1所述的抗体稀释液,其特征在于,所述精氨酸与所述组氨酸的质量比为(0.5-2):1;优选地,所述精氨酸与所述组氨酸的质量比为(0.6-1.5):1。
3.根据权利要求1或2所述的抗体稀释液,其特征在于,所述抗体稀释液包括:0.05-0.5%m/V牛血清蛋白、0.03-0.2%m/V咪唑、0.02-0.3%m/V稳定剂、0.1-0.5%V/V表面活性剂和0.02-0.2%V/V抑菌剂。
4.根据权利要求3所述的抗体稀释液,其特征在于,所述抗体稀释液包括:0.05-0.4%m/V牛血清蛋白、0.05-0.2%m/V咪唑、0.05-0.3%m/V稳定剂、0.1-0.4%V/V表面活性剂和0.05-0.15%V/V抑菌剂。
5.根据权利要求1、2、4中任一项所述的抗体稀释液,其特征在于,所述表面活性剂选自吐温-20、吐温80、TritonX-100中的一种或几种。
6.根据权利要求1、2、4中任一项所述的抗体稀释液,其特征在于,所述抑菌剂为Proclin-300。
7.根据权利要求1或2所述的抗体稀释液,其特征在于,所述抗体稀释液还包括缓冲溶液;所述缓冲溶液的pH值为6-9。
8.权利要求7所述的抗体稀释液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将各组分溶于缓冲溶液中,然后经滤膜过滤,制得抗体稀释液。
9.权利要求1-7中任一项所述的抗体稀释液在制备免疫检测试剂中的应用。
10.一种免疫检测试剂,其特征在于,包含权利要求1-7中任一项所述的抗体稀释液。
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