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JP2013542211A - グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド類似体 - Google Patents

グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド類似体 Download PDF

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JP2013542211A
JP2013542211A JP2013535378A JP2013535378A JP2013542211A JP 2013542211 A JP2013542211 A JP 2013542211A JP 2013535378 A JP2013535378 A JP 2013535378A JP 2013535378 A JP2013535378 A JP 2013535378A JP 2013542211 A JP2013542211 A JP 2013542211A
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molecular weight
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JP2013535378A
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ダンホ，ウォリード
エーリック，ジョージ
カーン，ワジハ
スウィストク，ジョセフ
ティリー，ジェファーソン・ライト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Abstract

本発明は、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）の類似体である化合物、及びこのような化合物の薬学的に許容しうる塩を提供する。これらの化合物は、ＧＩＰレセプターのアゴニストとしての活性を有する。

Description

本発明は、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）の類似体である化合物、及びこのような化合物の薬学的に許容しうる塩を提供する。本発明の化合物又はその薬学的に許容しうる塩は、例えば、肥満症、糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、異常脂質血症、空腹時グルコースの異常、及び耐糖能異常を含む代謝性疾患並びに代謝障害を処置するのに使用され得る。
ある実施態様では、当該化合物は、式Ｉ：
Figure 2013542211
（式中：
Ｒ１は、
Figure 2013542211
からなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｌｙｓ又はＡｌａであり；
Ｒ３は、Ｌｙｓ又はＰＥＧ化Ｌｙｓであり；
Ｙは、アシルであり；
Ｒ１が
Figure 2013542211
である場合、ｎは、１であり；そして
Ｒ１がＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｐｈｅである場合、ｎは、０である）
の化合物又はその薬学的に許容しうる塩である。
インスリンは、肝臓、筋肉及び脂肪組織におけるグルコースの取り込みを刺激することによって、グルコース代謝のレギュレーションにおいて主な役割を果たすホルモンである。グルコースは、このような組織に貯蔵され、エネルギーのために代謝される。インスリン産生不全、インスリンの異常調節、又はインスリン抵抗性は、代謝性疾患及び代謝障害、例えば糖尿病につながる。
グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）は、上部消化管によって分泌される４２残基のペプチドである。炭水化物及び脂質は両方とも、ＧＩＰの分泌を刺激する。ＧＬＰ−１と同様に、ＧＩＰはインクレチンであり、これは、ＧＩＰがインスリンの放出を刺激する能力を有することを意味する。ＧＩＰの作用は、ＧＩＰレセプター（ＧＩＰＲ）へのその結合によって媒介される。この結合は、膵臓β細胞におけるグルコース刺激性のインスリン放出を促進するｃＡＭＰを刺激すると考えられている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ネイティブなＧＩＰは、２つのＮ末端残基（Ｔｙｒ−Ａｌａ）を除去する酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに分解される。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるネイティブなＧＩＰの半減期は、種にもよるが、約２〜７分間である。代謝産物（ＧＩＰ３−４２）は、ＧＩＰＲを活性化せず、実際はＧＩＰＲのアンタゴニストとして働く。加えて、この代謝産物は、ヒトにおいて容易に排出される。そのため、治療薬としてのネイティブなＧＩＰの有効性は、制限されている。
本発明は、ＧＩＰの効力及びそのＧＩＰＲ結合能を保持する切断型ＧＩＰ（１−４２）類似体であって、そのアゴニストとして働き、ネイティブなＧＩＰと比較して改善された血漿安定性及び増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する切断型ＧＩＰ（１−４２）類似体の開発に関する。
図１は、実施例２０の化合物を含む反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図２は、実施例２０の精製した化合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図３は、実施例２０の化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。 図４は、実施例２１の化合物を含む反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図５は、実施例２１の精製した化合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図６は、実施例２１の化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。 図７は、実施例２２の化合物を含む反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図８は、実施例２２の精製した化合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図９は、実施例２２の化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
本明細書において言及されるすべてのペプチド配列は、特に示さない限り、通常の慣例に従って、Ｎ末端アミノ酸を左側に、またＣ末端アミノ酸を右側に表記される。２つのアミノ酸残基間の短い線は、ペプチド結合を示す。アミノ酸が異性体を有する場合、特に明示しない限り、表わされるのはアミノ酸のＬ型である。特に明記しない限り、残基はＰＥＧ化されていない。
本発明を説明する便宜上、様々なアミノ酸残基に関する通常の及び特殊な省略形が使用される。これらの省略形は、当業者にはよく知られているが、明確のために下に列挙する：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リシン；Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；及びＶａｌ＝Ｖ＝バリン。
さらに便宜上、及び当業者に容易に分かるように、以下の省略形又は記号が、本発明において使用される部分、試薬などを表わすのに使用される：
（Ｄ）Ｔｙｒ Ｄ−チロシン
ＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒ デスアミノチロシン
（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−フェニルアラニン
ＤｅｓＮＨ２−Ｐｈｅ デスアミノフェニルアラニン
（Ｄ）Ｔｒｐ Ｄ−トリプトファン
（Ｄ）３Ｐｙａ Ｄ−３−ピリジルアラニン
２−Ｃｌ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−２−クロロフェニルアラニン
３−Ｃｌ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−３−クロロフェニルアラニン
４−Ｃｌ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−４−クロロフェニルアラニン
２−Ｆ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−２−フルオロフェニルアラニン
３−Ｆ（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−３−フルオロフェニルアラニン
３，５−ＤｉＦ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−３，５−ジフルオロフェニルアラニン
３，４，５−トリＦ−（Ｄ）Ｐｈｅ Ｄ−３，４，５−トリフルオロフェニルアラニン
ＳＳＡ スクシンイミジルスクシンアミド
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＥＧｍ （メトキシ）ポリエチレングリコール
ＰＥＧｍ（１２，０００） 約１２ｋＤの分子量を有する（メトキシ）ポリエチレングリコール
ＰＥＧｍ（２０，０００） 約２０ｋＤの分子量を有する（メトキシ）ポリエチレングリコール
ＰＥＧｍ（３０，０００） 約３０ｋＤの分子量を有する（メトキシ）ポリエチレングリコール
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＨＯＢＴ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＮＭＰ Ｎ−メチル−ピロリドン
ＦＡＢ−ＭＳ 高速原子衝撃質量分析
ＥＳ−ＭＳ エレクトロスプレー質量分析
本明細書において使用される「ＰＥＧ部分」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体、例えば（メトキシ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧｍ）を指す。
本明細書において使用される「ＰＥＧ化ペプチド」は、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、リシン）がＰＥＧ部分にコンジュゲーションされたペプチドを指す。「コンジュゲーションされる」は、ＰＥＧ部分が、前記残基に直接的に連結されるか、又はスペーサー部分（例えば、架橋剤）を介して残基に連結されることを意味する。前記コンジュゲーションがリシン残基である場合、そのリシン残基は、本明細書において「ＰＥＧ化Ｌｙｓ」と称される。１つのＰＥＧ部分にのみコンジュゲーションされているペプチドは、「モノＰＥＧ化」されていると言われる。
本明細書において使用される「Ｌｙｓ−ＰＥＧ」及び「Ｌｙｓ−ＰＥＧｍ」は、それぞれ、ＰＥＧ及びＰＥＧｍにコンジュゲーションされたリシン残基を指す。「Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ）」は、適切な機能性ＳＳＡを使用してε−アミノ基がＰＥＧｍに架橋されたリシン残基を指す。「Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（ｌ２，０００））」は、適切な機能性ＳＳＡを使用してε−アミノ基がＰＥＧｍ（ｌ２，０００）に架橋されたリシン残基を指す；「Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（２０，０００））」は、適切な機能性ＳＳＡを使用してε−アミノ基がＰＥＧｍ（２０，０００）に架橋されたリシン残基を指す；そして「Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（３０，０００））」は、適切な機能性ＳＳＡを使用してε−アミノ基がＰＥＧｍ（３０，０００）に架橋されたリシン残基を指す。
本明細書において使用される「薬学的に許容しうる塩」という用語は、式（Ｉ）の化合物の任意の薬学的に許容しうる塩を意味する。塩は、無機酸及び無機塩基並びに有機酸及び有機塩基を含む薬学的に許容しうる非毒性の酸及び塩基から調製され得る。このような酸は、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ジクロロ酢酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、及びｐ−トルエンスルホン酸などを含む。一実施態様では、酸は、フマル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、コハク酸、硫酸、トリフルオロ酢酸又はメタンスルホン酸である。許容しうる塩基性塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）及びアルミニウム塩を含む。
「薬学的製剤」という用語は、そこに含まれる有効成分の生物学的活性を有効にし得るような形態の調製物であって、製剤が投与されるであろう被験体に対して許容し得ない毒性であるさらなる成分を含まない調製物を指す。
本明細書において使用される「薬学的に許容しうる担体」は、有効成分以外の薬学的製剤中の成分であって、被験体に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容しうる担体は、緩衝液、賦形剤、安定化剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などのその文法的変形）は、処置されている個体の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施され得る。処置の望ましい効果は、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせるのに使用される。
これらの化合物は、ＧＩＰレセプターのアゴニストとしての活性を有する。
また、本発明は、治療有効量の上記化合物又はその薬学的に許容しうる塩、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。
さらに、本発明は、薬剤の製造における、上記化合物又はその薬学的に許容しうる塩の使用に関する。
加えて、本発明は、代謝性疾患又は代謝障害、例えば、肥満症、糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、異常脂質血症、空腹時グルコースの異常、及び耐糖能異常を処置する方法であって、有効量の上記化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、前記処置を必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
さらに、本発明は、個体におけるグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドレセプター（ＧＩＰＲ）をアゴナイズする方法であって、上記化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、ＧＩＰＲをアゴナイズするのに有効な量で個体に投与することを含む方法に関する。
本発明は、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）の類似体である化合物、及びこのような化合物の薬学的に許容しうる塩を提供する。これらの化合物は、ＧＩＰレセプターのアゴニストとしての活性を有する。
ある実施態様では、当該化合物は、式（Ｉ）：
Figure 2013542211
（式中：
Ｒ１は、
Figure 2013542211
からなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｌｙｓ又はＡｌａであり；
Ｒ３は、Ｌｙｓ又はＰＥＧ化Ｌｙｓであり；
Ｙは、アシルであり；
Ｒ１が
Figure 2013542211
である場合、ｎは、１であり；そして
Ｒ１がＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｐｈｅである場合、ｎは、０である）
の化合物又はその薬学的に許容しうる塩である。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は、（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒからなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒである。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は、
Figure 2013542211
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｒｐである。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）３Ｐｙａである。
本発明の一実施態様では、Ｒ２はＬｙｓである。
本発明の一実施態様では、Ｒ２はＡｌａである。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓである。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＰＥＧ化Ｌｙｓである。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧである。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍである。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ）である。
本発明の一実施態様では、Ｒ３はＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ）であり、ここで前記ＰＥＧｍは約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ３は、Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（１２，０００））、Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（２０，０００））、及びＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（３０，０００））からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、Ｒ３は、Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（２０，０００））である。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、そしてＲ２はＡｌａである。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＰＥＧ化Ｌｙｓである。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分は約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、Ｒ１は（Ｄ）Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａであり、そしてＲ３はＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍは約２０，０００ダルトンの分子量を有する。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
Figure 2013542211

及びそれらの薬学的に許容しうる塩
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
及びそれらの薬学的に許容しうる塩
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
又はその薬学的に許容しうる塩である。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
及びそれらの薬学的に許容しうる塩
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
及びそれらの薬学的に許容しうる塩
からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、当該化合物は、
Figure 2013542211
又はその薬学的に許容しうる塩である。
本発明の化合物は、アミノ酸間のペプチド結合形成のための任意の公知の従来手法により、容易に合成され得る。このような従来手法は、例えば、保護されたカルボキシル基及び他の反応基を有するアミノ酸又はそのフラグメントの遊離αアミノ基と、保護されたアミノ基又は他の反応基を有する別のアミノ酸又はそのフラグメントの遊離一級カルボキシル基との間の縮合を可能にする、任意の溶液相の手法を含む。
本発明の新規な化合物を合成するためのこのような従来手法は、例えば、任意の固相ペプチド合成法を含む。このような方法では、新規な化合物の合成は、固相法の一般的な原則に従って、成長しているペプチド鎖に所望のアミノ酸残基を一度に１個ずつ順次組み込むことによって行われ得る。このような方法は、例えば、Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
ペプチドの合成中に、アミノ酸上の特定の反応基（例えば、α−アミノ基、ヒドロキシル基及び／又は反応性側鎖基）を保護して、それとの化学反応を防ぐことが望ましいかもしれない。これは、例えば、反応基を保護基（これは、その後除去され得る）と反応させることによって達成され得る。例えば、アミノ酸又はそのフラグメントのαアミノ基を保護して、それとの化学反応を防ぎつつ、アミノ酸又はそのフラグメントのカルボキシル基を別のアミノ酸又はそのフラグメントと反応させて、ペプチド結合を形成させ得る。この後、αアミノ保護基を選択的に除去して、例えば、別のアミノ酸又はそのフラグメントのカルボキシル基との次の反応をその部位で起こし得る。
αアミノ基は、例えば、アリールオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）並びに置換ベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）などの芳香族ウレタン型保護基；並びにｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、及びアリールオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン型保護基から選択される適切な保護基によって保護され得る。一実施態様では、Ｆｍｏｃがαアミノ保護に使用される。
アミノ酸のヒドロキシル基（ＯＨ）は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６ｄｉＣｌ−Ｂｚｌ）、及びｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）から選択される適切な保護基によって保護され得る。チロシン、セリン又はトレオニンのヒドロキシル基を保護することを意図する一実施態様では、例えば、ｔ−Ｂｕが使用され得る。
ε−アミノ酸基は、例えば、２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、アリル（ａｌｌｙ）カルボニル及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される適切な保護基によって保護され得る。リシンのε−アミノ基を保護することを意図する一実施態様では、例えば、Ｂｏｃが使用され得る。
β−及びγ−アミド基は、例えば、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４’−ジメトキシジチル（Ｄｏｄ）、ビス−（４−メトキシフェニル）−メチル及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される適切な保護基によって保護され得る。アスパラギン又はグルタミンのアミド基を保護することを意図する一実施態様では、例えば、Ｔｒｔが使用され得る。
インドール基は、例えば、ホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される適切な保護基によって保護され得る。トリプトファンのインドール基を保護することを意図する一実施態様では、例えば、Ｂｏｃが使用され得る。
イミダゾール基は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される適切な保護基によって保護され得る。ヒスチジンのイミダゾール基を保護することを意図する一実施態様では、例えば、Ｔｒｔが使用され得る。
固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂にカップリングすることによって、ペプチドのＣ端末側終端から開始され得る。このような出発物質は、α−アミノ保護アミノ酸を、エステル結合によりｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Wang）樹脂に結合することによって、又はｐ−（（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Rinkリンカー）などのＦｍｏｃ−リンカーとのアミド結合によりベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂に結合することによって調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、当技術分野において周知である。Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成される所望のペプチドが非置換アミドをＣ末端に有する場合に一般に使用される。
一実施態様では、ペプチド合成は、マイクロ波支援される。マイクロ波支援ペプチド合成は、固相ペプチド合成を加速させるための魅力的な方法である。これは、マイクロ波ペプチドシンセサイザー、例えばLiberty peptide synthesizer (CEM Corporation, Matthews, NC)を使用して実施され得る。マイクロ波支援ペプチド合成により、反応を設定温度で設定時間コントロールする方法を作り出すことが可能になる。当該シンセサイザーは、反応に送達される出力量を自動でレギュレーションして、温度を設定値に維持する。
典型的には、アミノ酸又は模倣物は、２〜５当量のアミノ酸及び適切なカップリング試薬を用いて、Ｆｍｏｃ保護型のアミノ酸又は模倣物を使用して、Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂上にカップリングする。カップリング後、樹脂を洗浄し、真空下で乾燥させ得る。樹脂へのアミノ酸のローディングは、Ｆｍｏｃアミノ酸樹脂の一部のアミノ酸分析によって、又はＵＶ分析によるＦｍｏｃ基の測定によって決定し得る。未反応のアミノ基はすべて、塩化メチレン中で樹脂を無水酢酸及びジイソプロピルエチルアミンと反応させることによって、キャッピングし得る。
樹脂に数回の反復サイクルを行って、アミノ酸を順次付加する。αアミノＦｍｏｃ保護基は、塩基性条件下で除去する。ＤＭＦに溶解させたピペリジン、ピペラジン又はモルホリン（２０〜４０％v/v）をこの目的に使用し得る。一実施態様では、ＤＭＦに溶解させた２０％ピペリジンを利用する。
αアミノ保護基を除去した後、次の保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングして、中間体（保護ペプチド−樹脂）を得る。ペプチドの固相合成においてアミノ酸のカップリングに使用される活性化試薬は、当技術分野において周知である。例えば、このような合成のための適切な試薬は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）である。一実施態様では、試薬は、ＨＢＴＵ又はＤＩＣである。他の活性化剤は、Barany and Merrifield (The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284)によって記載されている。合成サイクルを最適化するために、１ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及び３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢＴ）などの様々な試薬をカップリング混合物に加え得る。一実施態様では、ＨＯＢＴを加える。
ペプチド合成の後、保護基を除去し、ペプチドを樹脂から切断し得る。例えば、ペプチド−樹脂を、樹脂１グラム当たり１００μLのエタンジチオール、１００μLの硫化ジメチル、３００μLのアニソール及び９．５mLのトリフルオロ酢酸により室温で１８０分間処理し得る。あるいは、ペプチド−樹脂を、樹脂１グラム当たり１．０mLのトリイソプロピルシラン及び９．５mLのトリフルオロ酢酸により室温で９０分間処理し得る。次いで、樹脂をろ過して除去し、冷却したエチルエーテルを加えることによってペプチドを沈殿させ得る。次いで、沈殿物を遠心し、エーテル層をデカントし得る。
粗ペプチドの精製は、例えば、Shimadzu LC-8A systemで高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により逆相Ｃ１８カラム（５０×２５０mm、３００Å、１０μm）で実施し得る。ペプチドを最少量の水及びアセトニトリルに溶解させ、カラムへ注入し得る。勾配溶出は、一般に、２％〜７０％のＢで７０分間にわたって、６０ml／分の流速で開始し得る（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）。ＵＶ検出は、２２０／２８０nmに設定する。生成物を含む画分を分離し、それらの純度を、Shimadzu LC-10AT analytical systemで２．５ml／分の流速、勾配（２〜７０％）［緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ］、１０分間にわたる逆相PursuitＣ１８カラム（４．６×５０mm）を使用して判断し得る。次いで、高純度であると判断した画分をプールし、凍結乾燥し得る。
上述のように、ある実施態様では、例えば、ＳＳＡを使用して、本発明のペプチドの３０位のリシン残基を、ε−アミノ基においてＰＥＧ部分と架橋する。架橋は、架橋試薬が主なアミン（例えば、ε−アミン）と優先的に反応する塩基性ｐＨの溶液中で実施し得る。得られたＰＥＧ化ペプチドを、安定なアミド結合によって共有結合する。次いで、陽イオン／陰イオン交換クロマトグラフィー（交換樹脂の選択は、一般に、コンジュゲートの正味荷電に依存する）によって、ＰＥＧ化ペプチドを反応混合物から単離し得る。
本発明の化合物は、薬学的に許容しうる塩の形態で提供され得る。好ましい塩の例は、薬学的に許容しうる有機酸、例えば、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はパモン酸、及びポリマー酸（例えば、タンニン酸又はカルボキシメチルセルロース）と形成された塩、並びにハロゲン化水素酸（例えば、塩酸）、硫酸、又はリン酸などの無機酸との塩である。当業者に公知の薬学的に許容しうる塩を得るための任意の手順が使用され得る。
また、本発明は、部分的には、代謝性疾患又は代謝障害を処置する方法であって、治療有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、前記処置を必要とする患者に投与することを含む方法に関する。代謝性疾患又は代謝障害は、例えば、肥満症、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、異常脂質血症、空腹時グルコースの異常、又は耐糖能異常であり得る。
本発明の方法の実施において、本発明の化合物若しくはその薬学的に許容しうる塩のいずれか１つ、又は本発明の化合物若しくはその薬学的に許容しうる塩のいずれかの組み合わせの有効量は、当技術分野において公知の通常の許容しうる方法のいずれか単独で、又は組み合わせて投与される。投与は、例えば、１日に１回、３日に１回、又は１週間に１回であり得る。化合物又は組成物は、例えば、錠剤及び懸濁液を含む固体、液体又は気体の剤形で、経口（例えば、口腔）投与、舌下投与、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、又は皮下）投与、直腸投与（例えば、坐剤又は洗液によって）、経皮投与（例えば、皮膚エレクトロポレーション）され得るか、又は吸入によって（例えば、エアロゾルによって）投与され得る。投与は、単一単位剤形の持続的療法で、又は単回投与療法で適宜に行われ得る。治療組成物は、パモン酸などの脂肪親和性塩と併せて油乳剤又は分散剤の形態、又は皮下投与若しくは筋肉内投与のための生体分解性持続放出組成物の形態でもあり得る。
本発明の方法は、例えば、症状の軽減が特に必要であるか、又は恐らく切迫している場合に実施され得る。あるいは、本発明の方法は、例えば、連続的処置又は予防処置として有効に実施され得る。
また、本発明は、部分的には、治療有効量の本発明の化合物又はその薬学的に許容しうる塩、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。
本発明の組成物の調製に有用な薬学的担体は、固体、液体又は気体であり得る；従って、組成物は、錠剤、丸薬、カプセル剤、坐剤、粉剤、腸溶性コーティング製剤又は他の保護製剤（例えば、イオン交換樹脂への結合、又は脂質−タンパク質ベシクルへの封入）、持続放出製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアロゾルなどの形態をとり得る。担体は、石油、動物油、植物油又は合成起源の油、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、などを含む様々な油から選択され得る。水、食塩水、水性デキストロース、及びグリコールは、特に（血液と等張の場合）注射剤に好ましい液体担体である。例えば、静脈内投与用の製剤は、固体の有効成分を水に溶解させて水溶液を作製し、この溶液を滅菌にすることによって調製される有効成分の滅菌水溶液を含む。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、タルク、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、などを含む。組成物は、保存剤、安定化剤、湿潤化剤又は乳化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝液などの通常の薬学的添加剤に供され得る。適切な薬学的担体及びそれらの製剤化は、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、いずれの場合も、有効量の活性化合物を、レシピエントへ適切な投与に適切な剤形を調製するための適切な担体と一緒に含むであろう。
さらに、本発明は、個体におけるグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドをアゴナイズする方法であって、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドレセプターをアゴナイズするのに有効な量で個体に投与することを含む方法に関する。
本発明の化合物の用量は、例えば、投与方法、被験体の年齢及び体重、並びに処置されるべき被験体の状態などの多数の要因に依存し、最終的には、主治医又は獣医によって決定されるであろう。主治医又は獣医によって決定される活性化合物のこのような量は、本明細書及び特許請求の範囲において「有効量」と称される。例えば、鼻腔内投与の用量は、典型的には、約０．００１〜約０．１mg/kg体重の範囲である。ヒトにおいて、好ましい皮下用量は、約０．００１mg〜約１００mg；例えば、約０．１mg〜約１５mgである。
上記に加えて、本発明は、部分的には、薬剤の製造における、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容しうる塩の使用に関する。当該薬剤は、例えば、代謝性疾患又は代謝障害の処置において使用され得る。一実施態様では、当該薬剤は、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドレセプターのアゴニストとして使用され得る。
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書において使用される省略形は、以下の通りである。
Ｅｔ２Ｏ ジエチルエーテル
ｈｒ 時間
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ トリイソプロピルシラン
すべての溶媒、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ−メチルピロリノン（ＮＭＰ）は、Fisher 又は Burdick & Jacksonから購入し、さらに蒸留せずに使用した。
トリフルオロ酢酸は、Halocarbon又はFlukaから購入し、さらに精製せずに使用した。
ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Fluka又はAldrichから購入し、さらに精製せずに使用した。
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、硫化ジメチル（ＤＭＳ）及び１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）は、Sigma Chemical Co.から購入し、さらに精製せずに使用した。
保護アミノ酸は、一般に、Ｌ配置のものであり、Bachem又はNeosystemから市販されているものであった。
これらの試薬の純度は、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ及び融点によって使用前に確認した。
ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）は、Bachem又はAdvanced Chemtechから入手したスチレン−１％ジビニルベンゼン（１００〜２００又は２００〜４００メッシュ）の共重合体であった。これらの樹脂の全窒素含量は、一般に、０．３〜１．２meq/gであった。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、CLASS-VP-7.3ソフトウェアシステムを備える自動Shimadzu HPLCで行った。分析ＨＰＬＣは、逆相モードでPursuitＣ１８カラム（４．５ｘ５０mm）を使用して実施した。
分取ＨＰＬＣ分離は、逆相Varian（Pursuit）又はWaters（Xtera又はXbridge）Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０mm）で行った。
実施例１
以下は、室温におけるペプチド合成のプロトコールである。
プロトコール１
工程 試薬 時間
１ ＤＭＦ ２ｘ３０秒
２ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ ５分
３ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ １５分
４ ＤＭＦ ２ｘ３０秒
５ ｉＰｒＯＨ ２ｘ３０秒
６ ＤＭＦ ３ｘ３０秒
７ カップリング ６０分〜１８時間
８ ＤＭＦ ２ｘ３０秒
９ ｉＰｒＯＨ １ｘ３０秒
１０ ＤＭＦ １ｘ３０秒
１１ ＣＨ２Ｃｌ２ ２ｘ３０秒
すべての洗浄及びカップリングのための溶媒を測定して、１０〜２０ml/g樹脂の容量とした。カイザーニンヒドリン試験によって合成中のカップリング反応をモニタリングして、完了度を決定した（Kaiser et at. Anal.Biochem.34, 595-598 (1970)）。不完全なカップリング反応はすべて、新たに調製した活性化アミノ酸で再カップリングするか、又はペプチド樹脂を上記無水酢酸で処理することによってキャッピングした。十分に会合したペプチド−樹脂を真空で数時間乾燥させた。
実施例２
以下の実施例は、マイクロ波ペプチド合成のプロトコールを説明する。
製造業者により供給されたソフトウェアを使用してプレロードの０．２５mmolサイクルを改変することによって、Liberty peptide synthesizer (CEM Corporation, Matthews, NC)をダブルカップリング及びキャッピングにプログラムした。マイクロ波エディタを使用して、Ｆｍｏｃ脱保護、アミノ酸カップリング、及び無水酢酸によるキャッピング中に使用するためのマイクロ波出力方式をプログラムした。アミノ酸付加及び最終脱保護に関するデフォルトのサイクルをサイクルエディタで選択し、ペプチドを作製しながら自動でローディングした。
合成は、Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡ樹脂（４５０mg、０．２５mmol；AnaSpec, Inc., Fremont, CAから入手）を使用して、０．２５mmolスケールで行った。脱保護は、ＤＭＦ溶液に溶解させた２０％ピペリジンを用いて実施した。すべてのカップリング反応は、０．５Ｍ ＨＢＴＵ及び２Ｍ Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いて実施し、各アミノ酸カップリング後に、ＤＭＦに溶解させた２５％無水酢酸でキャッピングした（プロトコール２）。脱保護、カップリング及びキャッピングの反応はそれぞれ、マイクロ波を使用して、７５℃、３５ワットの電力及び窒素バブリングで３６０秒間行った。
各アミノ酸カップリングに関して、以下の０．２５mmolカップリングサイクルを使用した。
プロトコール２
樹脂を容器にトランスファーする
２０％ピペリジン脱保護（１０mL）を加える
１回目の脱保護のためのマイクロ波法（最大７５℃で３０秒）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で洗浄する
２回目の脱保護のためのマイクロ波法（最大７５℃で１８０秒）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で３回洗浄する
０．２Ｍアミノ酸（５mL）を加える
０．５Ｍ活性化剤（ＨＢＴＵ）（２mL）を加える
２Ｍ活性化塩基（ＮＭＭ）（１mL）を加える
カップリングのためのマイクロ波法（最大７５℃で６分）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で洗浄する
０．２Ｍアミノ酸（５mL）を加える
０．５Ｍ活性化剤（ＨＢＴＵ）（２mL）を加える
２Ｍ活性化塩基（ＮＭＭ）（１mL）を加える
カップリングのためのマイクロ波法（最大７５℃で６分）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で３回洗浄する
最後のアミノ酸カップリング後に、ＤＭＦに溶解させた２５％無水酢酸でペプチドをキャッピングした（プロトコール３）。
プロトコール３
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で３回洗浄する
２０％ピペリジン脱保護（１０mL）を加える
１回目の脱保護のためのマイクロ波法（最大７５℃で３０秒）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で洗浄する
２回目の脱保護のためのマイクロ波法（最大７５℃で１８０秒）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で３回洗浄する
キャッピング（無水酢酸１０mL）を加える
マイクロ波法（キャッピング）（最大７５℃で１８０秒）
樹脂をＤＭＦ（１０mL）で３回洗浄する
実施例３
本実施例は、ＰＥＧｍ（３０，０００）−ＳＳＡの調製を説明する。続いて、同様の手順により、ＰＥＧｍ（１２，０００）−ＳＳＡ及びＰＥＧｍ（２０，０００）−ＳＳＡを製造した。
ＰＥＧｍ（３０，０００）−メシラートの合成
Figure 2013542211
（式中、ｎは、〜６８２である）
磁気撹拌棒、ディーンスタークトラップ、還流冷却器及びアルゴン注入口バブラーを備える丸底フラスコに、１００ｇ（３．３４mmol）のＰＥＧｍ（３０，０００）−ＯＨ及び５００mLのトルエンを入れた。ＰＥＧをトルエンに溶解させた溶液を蒸留によって共沸乾燥させ、次いで、室温に冷却した。２００mLの無水ジクロロメタンを加え、溶液を０〜５℃に冷却した。トリエチルアミン（０．６７mL、４．８４mmol）及びメタンスルホニルクロリド（０．３３mL、４．３４mmol）を加え、混合物を約４℃で２時間撹拌し、次いで、アルゴン下、室温で一晩撹拌した。
ロータリーエバポレーターを使用して、塩化メチレンを減圧下で除去した。残留塩をろ過して除去し、生成物を冷イソプロピルアルコール及びジエチルエーテル（３０：７０、v/v）で沈殿させた。生成物を回収し、真空下、室温で乾燥させた。収率は、〜９０％であった。
ＰＥＧｍ（３０，０００）−アミンの合成
Figure 2013542211
（式中、ｎは、〜６８２である）
磁気撹拌棒及びアルゴン注入口バブラーを備える丸底フラスコに、９０ｇ（３．００mmol）のＰＥＧｍ（３０，０００）−メシラート及び１６００mLの水酸化アンモニウム水溶液（３０％、v/v）を入れた。塩化アンモニウム（１６０ｇ）を加え、溶液を室温で４８時間撹拌した。塩化ナトリウム１６０ｇ（１０wt％）を加え、ＰＥＧアミンをジクロロメタンで抽出した。一緒にした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで脱水した。硫酸ナトリウムをろ過して除去し、残った塩化メチレンをロータリーエバポレーターで除去した。生成物を冷ジエチルエーテルで沈殿させた。生成物を回収し、真空下、室温で一晩乾燥させた。収率は、〜９４％であった。
ＰＥＧｍ（３０，０００）−スクシンアミド酸（ＳＡＡ）の合成
Figure 2013542211
（式中、ｎは、〜６８２である）
磁気撹拌棒及びアルゴン注入口バブラーを備える丸底フラスコに、６０ｇ（２．００mmol）のＰＥＧｍ（３０，０００）−アミン及び５００mLの無水アセトニトリルを入れた。溶液を約４℃に冷却し、次いで、２ｇ（２０．０mmol）の無水コハク酸を溶解させた５０mLの無水アセトニトリルを、滴下漏斗を通してゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌した。
完了後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、次いで、生成物を４００mLの水に溶解させた。溶液のｐＨを１Ｍ ＮａＯＨ溶液で７．０に調整し、１時間撹拌した。塩化ナトリウム（４０ｇ、１０wt.％）を加え、ｐＨを６Ｎ ＨＣｌ溶液で〜４．２に調整した。生成物をジクロロメタンで３回抽出した。一緒にした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで脱水した。硫酸ナトリウムをろ過によって除去し、ロータリーエバポレーターを使用してろ過物を濃縮した。生成物を冷ジエチルエーテルで沈殿させた。生成物を回収し、真空下で一晩乾燥させた。収率は、〜９３％であった。
ＰＥＧｍ（３０，０００）−スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）の合成
Figure 2013542211
（式中、ｎは、〜６８２である）
磁気撹拌棒及びアルゴン注入口バブラーを備える丸底フラスコに、５６ｇ（１．８７mmol）のＰＥＧｍ（３０，０００）−スクシンアミド酸及び５００mLの無水ジクロロメタンを入れた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２４ｇ、２．０５mmol）及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．４６ｇ、２．２４mmol）をゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン下、室温で一晩撹拌した。
完了後、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去した。次いで、生成物を無水トルエンに溶解させた。残留塩をろ過によって除去し、生成物を冷無水イソプロピルアルコール及びジエチルエーテル（３０：７０、v/v）中に沈殿させた。生成物を回収し、真空下、室温で一晩乾燥させた。収率は、８０％であった。
実施例４
Figure 2013542211
の合成
ＣＥＭマイクロ波ペプチドシンセサイザーでＦｍｏｃ化学を使用して、上記ペプチドを合成した。プロトコール２に記載したモジュールを使用して、シンセサイザーをダブルカップリングにプログラムした。合成は、Ｆｍｏｃ Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）Wang樹脂（サブ：６meq/g；使用４００mg）を使用して、０．２５０mmolスケールで行った。合成終了時に、切断のために、樹脂を振盪機上の反応容器にトランスファーした。１７mLの９７％ＴＦＡ（３％水）並びに１mLのＴＩＳ及びプロパンチオール（１：２）を使用して、室温で１．５時間かけて、ペプチドを樹脂から切断した。脱保護溶液を１００mLの冷Ｅｔ２Ｏに加え、１mLのＴＦＡ及び３０mLの冷Ｅｔ２Ｏで洗浄して、ペプチドを沈殿させた。２ｘ５０mLのポリプロピレンチューブ中で、ペプチドを遠心分離した。個々のチューブからの沈殿物を単一チューブ中で一緒にし、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウスバキューム下、デシケーターで乾燥させた。
粗ペプチドを、分取ＨＰＬＣ（Shimadzu）によりXteraＣ１８−カラム（２５０ｘ５０mm、粒径１０μm）で精製し、１０〜９９％Ｂの直線勾配（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で９０分、流速６０mL／分で溶出させ、２２０／２８０nmで検出した。画分を回収し、分析ＨＰＬＣによって検査した。すべての分析ランは、Shimadzu HPLCで、Ｃ１８逆相Waters Xtera/pursuit４．６ｘ５０カラムを使用して、１０〜９９％の勾配（Ａ：０．１％水／ＴＦＡ及びＢ：０．１％アセトニトリル／ＴＦＡを使用）を使用して実施した。純粋な生成物を含む画分を一緒にし、凍結乾燥して、１３８mg（６．１％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ２２６Ｈ３３８Ｎ６０Ｏ６６Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は４９８３．６４であり、実測値は４９８３．６２であった。
実施例５
Figure 2013542211
の合成
ＣＥＭマイクロ波ペプチドシンセサイザーでＦｍｏｃ化学を使用して、上記ペプチドを合成した。プロトコール２及び３に記載したモジュールを使用して、シンセサイザーをダブルカップリングにプログラムした。合成は、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（サブ：．４５meq/g；使用４５０mg）を使用して、０．２５mmolスケールで行った。合成終了時に、切断のために、樹脂を振盪機上の反応容器にトランスファーした。１７mLの９７％ＴＦＡ（３％水）並びに１mLのＴＩＳ及びプロパンチオール（１：２）を使用して、室温で１．５時間かけて、ペプチドを切断した。脱保護溶液を１００mLの冷Ｅｔ２Ｏに加え、１mLのＴＦＡ及び３０mLの冷Ｅｔ２Ｏで洗浄して、ペプチドを沈殿させた。２ｘ５０mLのポリプロピレンチューブ中で、ペプチドを遠心分離した。個々のチューブからの沈殿物を単一チューブ中で一緒にし、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄し、ハウスバキューム下、デシケーターで乾燥させた。
粗ペプチドを、分取ＨＰＬＣ（Shimadzu）によりXteraＣ１８−カラム（２５０ｘ５０mm、粒径１０μm）で精製し、１０〜９９％Ｂの直線勾配（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で９０分、流速６０mL／分で溶出させ、２２０／２８０nmで検出した。画分を回収し、分析ＨＰＬＣによって検査した。すべての分析ランは、Shimadzu HPLCで、Ｃ１８逆相Waters Xtera/pursuit４．６ｘ５０カラムを使用して、１０〜９９％の勾配（Ａ：０．１％水／ＴＦＡ及びＢ：０．１％アセトニトリル／ＴＦＡを使用）を使用して実施した。純粋な生成物を含む画分を一緒にし、凍結乾燥して、１８０mg（１８．９％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４２Ｎ４０Ｏ４８Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５７４．０６であり、実測値は３５７４．０４であった。
実施例６
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、１０８mg（１１．４％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４２Ｎ４０Ｏ４８Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５７４．０６であり、実測値は３５７４．０４であった。
実施例７
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、７０mg（７％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６２Ｈ２３９Ｎ３９Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５１７．０１であり、実測値は３５１６．９１であった。
実施例８
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、８０mg（８．３％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４２Ｎ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５５８．０６であり、実測値は３５５８．１１であった。
実施例９
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、１２０mg（１２．７％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６２Ｈ２３９Ｎ３９Ｏ４６Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５０１．０１であり、実測値は３５００．９８であった。
実施例１０
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、６２mg（６．４％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６６Ｈ２４３Ｎ４１Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５９７．１０であり、実測値は３５９６．９９であった。
実施例１１
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、４０mg（４％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６３Ｈ２４１Ｎ４１Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５５９．０５であり、実測値は３５５９．０１であった。
実施例１２
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、９４mg（９．７％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４１ＣｌＮ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５９２．５１であり、実測値は３５９２．４９であった。
実施例１３
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、７０mg（７．２％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４１ＣｌＮ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５９２．５１であり、実測値は３５９２．４８であった。
実施例１４
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、９６mg（１０％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４１ＣｌＮ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５９２．５１であり、実測値は３５９２．５０であった。
実施例１５
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、９２mg（９．５％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４１ＦＮ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５７６．０５であり、実測値は３５７６．０４であった。
実施例１６
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、１００mg（１０．４％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４１ＦＮ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５７６．０５であり、実測値は３５７６．０４であった。
実施例１７
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、６４mg（６．６％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２４０Ｆ２Ｎ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５９４．０４であり、実測値は３５９３．９９であった。
実施例１８
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、３０mg（３％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６４Ｈ２３９Ｆ３Ｎ４０Ｏ４７Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３６１２．０３であり、実測値は３６１２．０１であった。
実施例１９
Figure 2013542211
の合成
実施例５の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂（４５０mg、０．２５mmol）を固相合成及び精製に供して、８０mg（９％）の白色の非晶質粉末を得た。Ｃ１６１Ｈ２３５Ｎ３９Ｏ４８Ｓの（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（「ｃａｌｃｄ」）は３５１６．９６であり、実測値は３５１６．９４であった。
実施例２０〜２２の分析方法
以下の逆相ＨＰＬＣ／ＵＶ手順を使用して、試験物質及びコントロール物質を分析した。
機器 フォトダイオードアレイ検出器を備えるWaters Acquity System
注入量 ２μL
注入器温度 環境
検出器波長 ２８０nm
カラム Acquity BEH-C8、１．８ミクロン、５０mmｘ２．１mm ｉ．ｄ．
カラム温度 ２５℃
流速 ０．２５mL／分（〜５０００psi）
移動相Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水
移動相Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル
ランタイム 約１０分
サンプル調製 約０．２〜０．５mg/ml
希釈剤 脱イオン水
Figure 2013542211
実施例２０
Figure 2013542211
の合成
ＰＥＧｍ（１２，０００）部分を実施例１９の化合物にコンジュゲーションした。
実施例１９のペプチド１０mgを量り分け、５０mMホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた。実施例３の手順に従って調製したＰＥＧｍ（１２，０００）−スクシンイミジルスクシンアミド１３０mgを量って、４：１のＰＥＧ：ペプチドモル比を達成し、溶解させたペプチドに加えた。反応混合物を２０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍希釈する前に室温で一晩撹拌し、陰イオン交換クロマトグラフィーによりQ-Sepharose（登録商標）FF (GE Healthcare)で精製した。図１は、反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。この反応により、３８．１％のＰＥＧ化ペプチドが得られた。
ＮａＣｌ勾配の工程を使用して、モノＰＥＧ化ペプチドを溶出させた。所望のモノＰＥＧ化ペプチドを２００mM ＮａＣｌで溶出させた。溶出液を１Ｍ ＮａＯＡｃで酸性にし、Amicon ultrafiltration cellで３kDa ＭＷのカットオフ膜を使用して濃縮した。次いで、それを２０mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で一度に１０倍ダイアフィルトレーションした。
次いで、濃縮したＰＥＧ化ペプチドを分析に供し、アッセイし、４℃で保管した。図２は、精製したＰＥＧｍ（１２，０００）−ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである（ＲＴ＝２．７２分）。ＰＥＧ化ペプチドの純度は、＞９８％であると決定した。図３は、ＰＥＧｍ（１２，０００）−ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表すグラフであり、これは、分子量を確認するために実施した。
実施例２１
Figure 2013542211
の調製
ＰＥＧｍ（２０，０００）部分を実施例１９の化合物にコンジュゲーションした。
実施例１９のペプチド１０mgを量り分け、５０mMホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた。実施例３の手順に従って調製したＰＥＧｍ（２０，０００）−スクシンイミジルスクシンアミド２２５mgを量って、４：１のＰＥＧ：ペプチドモル比を達成し、溶解させたペプチドに加えた。反応混合物を２０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍希釈する前に室温で一晩撹拌し、陰イオン交換クロマトグラフィーによりQ-Sepharose（登録商標）FF (GE Healthcare)で精製した。図４は、反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。この反応により、５４．９％のＰＥＧ化ペプチドが得られた。
ＮａＣｌ勾配の工程を使用して、モノＰＥＧ化ペプチドを溶出させた。所望のモノＰＥＧ化ペプチドを２００mM ＮａＣｌで溶出させる。溶出液を１Ｍ ＮａＯＡｃで酸性にし、Amicon ultrafiltration cellで３kDa ＭＷのカットオフ膜を使用して濃縮した。次いで、それを２０mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で一度に１０倍ダイアフィルトレーションした。
濃縮したＰＥＧ化ペプチドを分析に供し、アッセイし、４℃で保管した。図５は、精製したＰＥＧｍ（２０，０００）−ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである（ＲＴ＝２．７０分）。ＰＥＧ化ペプチドの純度は、＞９８％であると決定した。図６は、ＰＥＧｍ（２０，０００）−ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表すグラフであり、これは、分子量を確認するために実施した。
実施例２２
Figure 2013542211
の調製
ＰＥＧｍ（３０，０００）部分を実施例１９の化合物にコンジュゲーションした。
実施例１９のペプチド５０mgを量り分け、５０mMホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた。実施例３の手順に従って調製したＰＥＧｍ（３０，０００）−スクシンイミジルスクシンアミド１６２５mgを量って、４：１のＰＥＧ：ペプチドモル比を達成し、溶解させたペプチドに加えた。反応混合物を２０mMトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍希釈する前に室温で一晩撹拌し、陰イオン交換クロマトグラフィーによりQ-Sepharose（登録商標）FF (GE Healthcare)で精製した。図７は、反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。この反応により、８５．０％のＰＥＧ化ペプチドが得られた。
ＮａＣｌ勾配の工程を使用して、モノＰＥＧ化ペプチドを溶出させた。いつも通り、所望のモノＰＥＧ化ペプチドを２００mM ＮａＣｌで溶出させた。溶出液を１Ｍ ＮａＯＡｃで酸性にし、Amicon ultrafiltration cellで３kDa ＭＷのカットオフ膜を使用して濃縮した。次いで、それを２０mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で一度に１０倍ダイアフィルトレーションした。
濃縮したＰＥＧ化ペプチドを分析に供し、アッセイし、４Ｃで保管した。図８は、精製したＰＥＧｍ（３０，０００）−ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである（ＲＴ＝２．５９分）。ＰＥＧ化ペプチドの純度は、＞９８％であると決定した。図９は、ＰＥＧｍ（３０，０００）−ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを表すグラフであり、これは、分子量を確認するために実施した。
実施例２３
４時間及び２４時間後のWistar Hannoverラット血漿並びにヒト血漿における実施例１９の化合物の安定性を評価するために、以下の研究を行った。
実施例１９の化合物２．０８mgを量り分け、４mLの琥珀色のバイアルに入れた。１．０mLのＤＭＳＯをこれに加えた。バイアルを慎重にボルテックスして、化合物の５７３μMストック溶液を作製した。
Wistar Hannoverラット血漿及びヒト血漿（抗凝固剤ナトリウムＥＤＴＡ）を水浴で３７℃に３０分間予熱した。ラット血漿のｐＨは７．４５であり、ヒト血漿のｐＨは７．４７であった。１．５mLの微小遠心バイアルを使用した。
実施例１９の化合物の５７３μMストック溶液８．７μLを４９１．３μLのラット血漿に加え、一方のバイアルに入れた。実施例１９の化合物の５７３μMストック溶液８．７μLを４９１．３μLのヒト血漿に加え、別のバイアルに入れた。２つのバイアルを穏やかにボルテックスして、適切に混合した。
６つの新たなバイアルを以下のようにラベリングした：ラットＴ０、ラットＴ４、ラットＴ２４、ヒトＴ０、ヒトＴ４、ヒトＴ２４。５０μLの処理血漿をこれらの各バイアルに加えた。Ｔ４バイアル及びＴ２４バイアルに蓋をかぶせ、３７℃のインキュベーター中にそれぞれ４時間及び２４時間置いた。
ゼーレンセン緩衝液５０μLと、アセトニトリルに溶解させた１．０％酢酸２００μLとを、２つの各Ｔ０バイアルに加えた。次いで、Ｔ０バイアルに蓋をかぶせ、ボルテックスし、１００００ｘｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の終了後、各バイアルの上清１００μLを９６ウェル注入ブロックの別々のウェルに加えた。次いで、Milli-Q（登録商標）water (Millipore)に溶解させた０．１％酢酸２００μLを各ウェルに加えた。
Ｔ０バイアルに関して記載した上記手順を、２つのＴ４バイアルに関しては４時間の時間点で繰り返し、２つのＴ２４バイアルに関しては２４時間の時間点で繰り返した。サンプルの分解がなかったことを保証するために、各時間点で、新たなＴ０サンプルを上記のように調製した。
すべてのサンプルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。得られたクロマトグラフを加工して、各サンプルのピーク領域を得た。各時間点で残存する化合物を対照Ｔ０サンプル中に存在する量と比較したパーセントを計算した。
Figure 2013542211
このデータは、化合物がラット血漿中において４時間の時点では安定していたが、２４時間の時間点では許容範囲（７５〜１２５％）をわずかに下回ることを示している。ペプチドは、ヒト血漿中において４時間及び２４時間の時間点の両方で安定していた。
実施例２４
DiscoverX Corporation (Freemont, CA)から、ヒトＧＩＰＲを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を入手した。この細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎仔血清、８００μg/mlジェネティシン、３００μg/mlヒドロマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、及びペニシリン−ストレプトマイシン（１００単位、１００μg）を補充したHam's F-12栄養培地中、３７℃で培養した。細胞を９０％コンフルエンスで回収した。
細胞をHam's F-12栄養培地に懸濁して、細胞２００，０００個／mlの濃度とした。次いで、１ウェル当たり０．０２５mlの懸濁液を加えて、細胞を３８４ウェルプレートにプレートした。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベーションした。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を試験化合物で刺激し、産生されたｃＡＭＰレベルを測定することによって、化合物の活性を決定した。ＧＩＰはｃＡＭＰ産生を刺激するので、化合物の活性をネイティブなＧＩＰの活性と比較した。６μlの試験化合物を溶解させた刺激緩衝液（９９０mlのHank’s平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（１Ｘ）（Invitrogen Corp #14025-092）、１０mlのＨｅｐｅｓ緩衝溶液（１mol.L）（Invitrogen Corp 15630-080）、１ｇのＢＳＡ（最終０．１％）、及び１mlの新たにＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich I 5879）に調製したＩＢＭＸ ２５０mMストック）を細胞に加え、その後、６μlのAlexa Fluor（登録商標）６４７−抗ｃＡＭＰ抗体（Perkin Elmer）を溶解させた刺激緩衝液を加えた。加えて、コントロールとして、６μlのネイティブなＧＩＰ（実施例４の化合物）を溶解させた刺激緩衝液を１つのウェルの細胞に加えた。ウェルプレートを３００rpmで３分間遠心分離し、室温で４５分間インキュベーションした。１２μlの検出混合液（ビオチンｃＡＭＰ及びＥＵＷ８０４４ラベル化ストレプトアビジン（Ｅｕ−ＳＡ）を溶解させたｃＡＭＰ検出緩衝液（Perkin Elmer））を加え、室温で６０分間インキュベーションした。
Perkin Elmer LANCE cAMP Assay Perkin Elmer Lance cAMP Kitのマニュアルに概説されている詳細なプロトコールに従って、産生されたｃＡＭＰレベルを測定した。化合物の活性をネイティブなＧＩＰの活性と比較した。
プレートをＴＲＦ検出機器EnVision（登録商標）（Perkin Elmer）（３４０nMの励起及び６６５nMの発光）で読み込んだ。ｃＡＭＰシグナルの値をｃＡＭＰ標準曲線から得て、最大刺激量、及びｃＡＭＰシグナルを刺激するためのＥＣ５０を決定するのに使用する。
Figure 2013542211

Claims (48)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2013542211
    （式中：
    Ｒ１は、
    Figure 2013542211
    からなる群より選択され；
    Ｒ２は、Ｌｙｓ又はＡｌａであり；
    Ｒ３は、Ｌｙｓ又はＰＥＧ化Ｌｙｓであり；
    Ｙは、アシルであり；
    Ｒ１が
    Figure 2013542211
    である場合、ｎは、１であり；そして
    Ｒ１がＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒ；（Ｄ）Ｐｈｅ又はＤｅｓＮＨ２−Ｐｈｅである場合、ｎは、０である）
    を有する、化合物又はその薬学的に許容しうる塩。
  2. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒである、請求項１記載の化合物。
  3. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒである、請求項１又は２記載の化合物。
  4. Ｒ１が、
    Figure 2013542211
    からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
  5. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｒｐである、請求項１記載の化合物。
  6. Ｒ１が（Ｄ）３Ｐｙａである、請求項１記載の化合物。
  7. Ｒ２がＬｙｓである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. Ｒ２がＡｌａである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
  9. Ｒ３がＬｙｓである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  11. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  12. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  13. Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ＰＥＧ部分が約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
  14. Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ＰＥＧ部分が約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜１０又は１３のいずれか一項に記載の化合物。
  15. Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ＰＥＧ部分が約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜１０、１３又は１４のいずれか一項に記載の化合物。
  16. Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ＰＥＧ部分が約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜１０又は１３〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
  17. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ＰＥＧｍが約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜９又は１１のいずれか一項に記載の化合物。
  18. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ＰＥＧｍが約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜９、１１又は１７のいずれか一項に記載の化合物。
  19. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ＰＥＧｍが約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜９、１１又は１７〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
  20. Ｒ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ＰＥＧｍが約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜９、１１又は１７〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. Ｒ３がＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
  22. Ｒ３が、Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（１２，０００））、Ｌｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（２０，０００））、及びＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（３０，０００））からなる群より選択される、請求項１〜９又は２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. Ｒ３がＬｙｓ（ε−ＳＳＡ−ＰＥＧｍ（２０，０００））である、請求項１〜９、２１又は２２のいずれか一項に記載の化合物。
  24. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａである、請求項１記載の化合物。
  25. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、Ｒ３がＰＥＧ化Ｌｙｓである、請求項１記載の化合物。
  26. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分が約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は２５記載の化合物。
  27. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分が約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１、２５又は２６のいずれか一項に記載の化合物。
  28. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分が約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は２５〜２７のいずれか一項に記載の化合物。
  29. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＰＥＧ化Ｌｙｓであり、ここでＰＥＧ部分が約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は２５〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
  30. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍが約５，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１記載の化合物。
  31. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍが約１０，０００〜約３０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は３０記載の化合物。
  32. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍが約１５，０００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１、３０又は３１のいずれか一項に記載の化合物。
  33. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒ又はＤｅｓＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍが約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は３０〜３２のいずれか一項に記載の化合物。
  34. Ｒ１が（Ｄ）Ｔｙｒであり、Ｒ２がＡｌａであり、そしてＲ３がＬｙｓ−ＰＥＧｍであり、ここでＰＥＧｍが約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１又は３０〜３３のいずれか一項に記載の化合物。
  35. Figure 2013542211
    Figure 2013542211

    及びそれらの薬学的に許容しうる塩
    からなる群より選択される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物。
  36. Figure 2013542211
    及びそれらの薬学的に許容しうる塩
    からなる群より選択される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の化合物。
  37. Figure 2013542211
    又はその薬学的に許容しうる塩である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
  38. Figure 2013542211
    並びにそれらの薬学的に許容しうる塩
    からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
  39. Figure 2013542211
    及びそれらの薬学的に許容しうる塩
    からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
  40. Figure 2013542211
    又はその薬学的に許容しうる塩である、請求項１記載の化合物。
  41. 治療有効量の請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩、及び薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
  42. 代謝性疾患若しくは代謝障害の処置における使用のための、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩。
  43. 薬剤の製造における、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩の使用。
  44. 薬剤が、代謝性疾患又は代謝障害の処置のためのものである、請求項４３記載の使用。
  45. 薬剤が、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドレセプターのアゴニストとして使用するためのものである、請求項４３又は４４記載の使用。
  46. 代謝性疾患又は代謝障害を処置する方法であって、有効量の請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、前記処置を必要とする患者に投与することを含む、方法。
  47. 個体におけるグルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドをアゴナイズする方法であって、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容しうる塩を、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチドレセプターをアゴナイズするのに有効な量で個体に投与することを含む、方法。
  48. 本明細書において前述の発明。
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