JP2013249278A - マツ材線虫病の防除剤および防除方法 - Google Patents

Abstract

【課題】環境に対して低負荷であり、野生生物に対する安全性に優れ、かつ、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対して高い防除効果を有するマツ材線虫病の防除剤および防除方法を提供すること。
【解決手段】キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含む、マツ材線虫病の防除剤、マツノザイセンチュウの防除剤およびマツノマダラカミキリの防除剤を提供する。また、これらの防除剤をマツ属植物、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリのいずれか１種以上に適用することを含む、マツ材線虫病の防除方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、植物病害防除の技術分野に属し、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリの防除剤および防除方法、ならびにこれら生物によって引き起こされるマツ材線虫病の防除剤および防除方法に関する。

マツ材線虫病（松枯れ）の原因であるマツノザイセンチュウ（線形動物門、幻器綱、アフェレンコイデス目、アフェレンコイデス科、Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle）およびその媒介虫であるマツノマダラカミキリ（節足動物門、昆虫綱、コウチュウ目、カミキリムシ科、Monochamus alternatus Hope）は、１９０５年に造船材料として北米から輸入された木材によって長崎に侵入し、その後、北海道、青森を除く全地域に拡大し、平成２２年度の松枯れ病の被害量は約５８万立方メートル（被害材積量）に及ぶ。日本に分布するアカマツやクロマツ、南西諸島の固有種であるヤクタネゴヨウ（絶滅危惧種）やリュウキュウマツが甚大な被害を受けており、日本各地に存在する松原が本病の脅威にさらされている。特に琉球列島に分布するリュウキュウマツは他の種に比べて本病に対する感受性が高く、大きな被害を被っている。本病害は日本のみならず、中国、台湾、韓国、ヨーロッパ地域においても発生しており、上記の種に加えてタイワンアカマツ、チョウセンゴヨウ、ヨーロッパアカマツ、フランスカイガンショウなどを含むマツ属（Pinus）植物（以下、単に「マツ」と称することもある）が本病に感受性である。ヨーロッパ諸国では感染拡大を防止するためマツ材の輸入に関して検疫を行っている。

マツ材線虫病は、５〜７月に枯れた松の幹から羽化・脱出したマツノマダラカミキリ（マツノザイセンチュウを体内に保持、一般的には８千〜数万頭）が性成熟のためにマツの若枝に飛来し、表皮を摂食する。表皮が剥がれた部位からマツノザイセンチュウを誘引するβミルセンやエタノールなどの化学物質が揮発し、マツノザイセンチュウに対して正の走化性を示すと考えられている。これによりマツノザイセンチュウがマツ組織内に寄生を果たす（６〜９月）。寄生後、速い場合では２〜３週間程度で松枯れ症状を呈する。７〜８月に枯死したマツにマツノマダラカミキリ雌成虫が飛来し、マツの樹皮下に産卵する。孵化したマツノマダラカミキリ幼虫は、樹皮下を摂食しながら成長し、１１〜５月に蛹室を形成して蛹となり、５〜６月に羽化に至る。

本病の防除は一般的にマツノザイセンチュウに対する予防剤、媒介虫であるマツノマダラカミキリに対する殺虫剤、また枯死木の伐倒、薫蒸処理などが行われているが、これらの方法は有効である一方で、野生生物や環境への影響、農薬のドリフト（飛散）被害、労働および経費負担が問題視されている。特にマツノマダラカミキリに使用される有機リン系殺虫剤は、人や他の生物にも影響することが懸念され、さらに農薬の連用は、薬剤耐性昆虫の出現を誘発することが知られている。また抵抗性マツを利用する方法もあるが、抵抗性系統が少なく、挿木による繁殖が困難であること、外国産の系統は日本の風土に適さないなどの欠点がある。

このように現在、マツ材線虫病（松枯れ病）の防除は、環境負荷が大きい防除手段が講じられていることから、特に生物多様性保護の観点から、可能な限り農薬のみに依存した防除方法からの脱却が望まれている。

マツノザイセンチュウまたはマツノマダラカミキリの防除方法には、網、化学物質、酵素、電流、微生物等を用いた方法があり、植物由来抽出物または成分を利用したものとしては、マツ由来の有機溶媒抽出物（特許文献１）、ヒガンバナ科球根圧搾液（特許文献２）、アフリカンマリーゴールド油 、スイートバジル油およびパルマローザ油（特許文献３）などを利用する方法があるが、キク科センダングサ属植物を利用する方法は知られていない。特許文献１〜３において利用される植物は、木材、燃料、食材、精油原料、観賞用植物、土壌改良用作物等として既に広く利用されているものであり、病害虫防除剤の原料として大量に調達すること等が容易でない場合もある。また、これら植物を病害虫防除に用いることにより、例えば食料として有用な資源を消費してしまうことにも繋がりかねないという問題も有している。

特許文献４には、キク科植物の抽出物を有効成分とするネコブセンチュウ防除剤が記載されている。また、特許文献５には、アワユキセンダングサの抽出物を有効成分とするネグサレセンチュウ又はシストセンチュウの防除剤が記載されている。しかし、特許文献４および５に記載された防除剤は土壌有害線虫を対象とするものであり、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリについては記載が無い。特許文献４および５に記載のネコブセンチュウ類、ネグサレセンチュウ類およびシストセンチュウ類はいずれもティレンクス目プラティレンクス科に属し、本発明で対象となるマツノザイセンチュウ（アフェレンコイデス目アフェレンコイデス科）とは分類学上異なる生物である。また、特許文献４および５に記載された防除剤が対象とする線虫類は、土壌線虫類に含まれ、野菜類の根を犯すものである。したがって、これらの土壌線虫類は、樹木の地上部組織に寄生するマツノザイセンチュウとは全く異なる生態を有するものである。

特許文献６には、キク科センダングサ属植物の抽出物を主成分とする害虫防除剤が記載されている。しかし、特許文献６に記載の害虫防除剤が対象とする害虫は、ヨトウムシ類（チョウ目、ヤガ科）、アブラムシ類（カメムシ目、アブラムシ科）、シロチョウ類（チョウ目、シロチョウ科）、ハダニ類（ダニ目、ハダニ科）およびコナジラミ類（カメムシ目、コナジラミ科）であり、マツノマダラカミキリ（コウチュウ目、カミキリムシ科）とは異なる分類群に属するものである。また、これらの害虫類はいずれも、野菜類または草本植物を食害するものである。したがって、特許文献６の防除剤が対象とする害虫類は、樹木の若枝と樹皮下組織を食害するマツノマダラカミキリとは全く異なる生態を有するものである。

特開平５−２７９２２３号公報 特開２００９−２６８４５３号公報 特表２００９−５３６９３７号公報 特許第４５２８９８２号公報 特開２０１１−６８６１２号公報 特開２０１０−２０８９９４号公報

Deba, F., Xuan, T. D., Yasuda, M. and Tawata, S. (2008) Chemical composition and antioxidant, antibacterial and antifungal activities of the essential oil from Bidens pilosa Linn. var. Radiata. Food Control 19, 346-352. 増澤幹男・増澤真実子・前田亜希子・宮田聡子・勝岡憲生（2005）．Livedo reticularis with summer ulcerationの夏季潰瘍に対するかんぽう茶（登録商標）の予防効果．日皮会報115（1），7-13． 宇佐美英治・草野源次郎・片寄貴則・輪千浩史・瀬山義幸（2004）．天然物中の水溶性抗酸化因子及び脂溶性抗酸化因子による抗酸化作用の評価．YAKUGAKU ZASSHI 123（11），847-850．

本発明は、環境に対して低負荷であり、野生生物に対する安全性に優れ、かつ、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対して高い防除効果を有するマツ材線虫病の防除剤および防除方法を提供することを目的とする。

本発明は、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツ材線虫病の防除剤（以下、「本発明のマツ材線虫病防除剤」とも称する）を提供する。

また、本発明は、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツノザイセンチュウの防除剤（以下、「本発明のマツノザイセンチュウ防除剤」とも称する）、ならびにキク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツノマダラカミキリの防除剤（以下、「本発明のマツノマダラカミキリ防除剤」とも称する）を提供する。

さらに、本発明は、本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤およびマツノマダラカミキリ防除剤のいずれかを、マツ属植物、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリのいずれか１種以上に適用することを含む、マツ材線虫病の防除方法（以下、「本発明のマツ材線虫病防除方法」とも称する）を提供する。

本発明のマツ材線虫病防除剤は、キク科センダングサ属植物の抽出物に含まれる成分がマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対して不動化、忌避および殺虫効果を発揮することにより、これら２種害虫によって生じるマツ材線虫病（松枯れ）を予防または軽減することができるものである。

本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤およびマツノマダラカミキリ防除剤の有効成分の原料となるキク科センダングサ属植物、例えばアワユキセンダングサは、日本および熱帯・亜熱帯地域に広く分布しており、かつ、生育が旺盛で資源量が豊富であるため、入手が容易である。したがって、本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤およびマツノマダラカミキリ防除剤は、従来の植物由来成分等を利用した病害虫防除剤と比較して、安価に製造することが可能である。加えて、かかる植物はこれまで雑草・害草として扱われ、ほとんど利用されていないのが現状であるため、本発明は未利用生物資源の有効活用にもつながるものと期待される。

また、アワユキセンダングサ等のキク科センダングサ属植物は、一部地域においては漢方茶等として利用されており、高い安全性を有している。さらに、最近では該植物の成分が皮膚炎や成人病に有効とする報告もあるほか、主要な農作物や土壌微生物に対しても悪影響がないことが知られている。したがって、本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤およびマツノマダラカミキリ防除剤は、ヒトを含む生物や環境への影響が小さく、生物多様性を損なうことがないものである。

マツノザイセンチュウに対するアワユキセンダングサ抽出液の殺虫効果を示す顕微鏡写真である（アワユキセンダングサ抽出液中の死亡した線虫）。 マツノザイセンチュウに対するアワユキセンダングサ抽出液の忌避効果を示す図である。 罹病マツ組織内線虫に対するアワユキセンダングサ抽出液の影響を示す図である。値は平均±標準偏差であり、異なるアルファベットは有意差を示す（Tukeyの多重比較検定、p<0.05）。 マツノマダラカミキリ成虫に対するアワユキセンダングサ抽出液の殺虫効果を示す写真である。左がアワユキセンダングサ抽出液を噴霧し死亡したマツノマダラカミキリ、右が滅菌水を噴霧したマツノマダラカミキリ（対照：生存）。 マツノマダラカミキリ成虫に対するアワユキセンダングサ抽出液の忌避効果を示す写真である。アワユキセンダングサ抽出液をマツの若枝に噴霧した場合（左）と水を噴霧した場合（右）のマツノマダラカミキリの食痕を示す。 マツノマダラカミキリ幼虫に対するアワユキセンダングサ抽出液の殺虫効果を示す写真である。左および中がアワユキセンダングサ抽出液により死亡したマツノマダラカミキリ幼虫（左：10倍希釈液、中：原液）であり、右が滅菌水を処理した生存幼虫の写真である。

本発明のマツ材線虫病防除剤、マツノザイセンチュウ防除剤およびマツノマダラカミキリ防除剤（以下、「本発明の防除剤」とも称する）の有効成分は、キク科センダングサ属植物から得られる抽出物である。該抽出物の原料として用い得るキク科センダングサ属植物としては、例えばコセンダングサ（Bidens pilosa L.）およびその変種とされるアワユキセンダングサ（B. pilosa L. var. radiata Scherff.）、ならびにタチアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. Bip）およびその品種であるハイアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. f. decumbens Scherff.）などが挙げられる。これらの植物の中でも、アワユキセンダングサを抽出物の原料として用いることが好ましい。

抽出物の原料として用いるキク科センダングサ属植物は、開花期のものであっても栄養生長期のものであってもよく、生の状態であっても乾燥させたものであってもよいが、乾燥させた植物体を用いることが好ましい。乾燥の目安としては、限定されるものではないが、例えば水分含量が０％〜１５％未満であることが好ましく、アワユキセンダングサであれば、通常、４０〜８０℃の温風下で２４時間または１００℃で２時間程度の条件で乾燥させれば十分である。また、抽出効率の点から、植物体を適宜細断ないし粉砕等したもの、例えば粉末状のものを抽出原料として用いることが好ましい。植物体の部位に関しては、花、葉、茎、根などを含む全草を抽出原料として用いることが可能であるが、根を除いた地上部を用いることが好ましい。

本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、一般的な植物成分抽出方法を用いて得ることができる。かかる抽出方法としては、例えば、煮沸抽出法、浸漬抽出法、振とう抽出法、ソックスレー抽出法、水蒸気蒸留法などが挙げられ、これらの中でも煮沸抽出法が好ましい。

また、抽出に用い得る溶媒としては、水だけでなく低級アルコール類（例えばメタノール、エタノール等）、ケトン類（例えばアセトン、メチルエチルケトン等）、親水性有機溶媒（例えばアセトニトリル、酢酸エチル等）、エーテル類（例えばエチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、芳香族炭化水素類（例えばトルエン、キシレン等）、ハロゲン化炭化水素類（例えば塩化メチレン、クロロホルム等）などの疎水性有機溶媒が挙げられ、これらの混合溶媒も利用できる。本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、溶媒として水を用いて抽出されるものが好ましい。一つの好ましい態様において、本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、溶媒として水を用いる煮沸抽出法によって得られる抽出物（水煮沸抽出物）である。また、水煮沸抽出以外の方法を用いる場合であっても、当業者であれば適宜、溶媒や抽出時間等の条件を設定してキク科センダングサ属植物の抽出物を得ることが可能である。

また、得られた抽出物を、必要によりカラム分画法や溶媒分画法などにより精製することも可能である。

本明細書において、「抽出物」の用語には、溶媒を用いる各種抽出方法によって得られる抽出液のほかに、該抽出液を濃縮した濃縮液、該抽出液を適当な溶媒で希釈した希釈液、該抽出液またはその濃縮液もしくは希釈液から加熱乾燥や凍結乾燥などの種々の方法によって溶媒を除くことにより得られる固形の抽出物（粉末状や粒状のもの等）、ならびに固形化剤やゲル化剤の添加等によって得られる固形もしくは半固形の抽出物も含まれるものとする。

本発明の防除剤におけるキク科センダングサ属植物の抽出物は、例えば、キク科センダングサ属植物の乾燥植物体１重量部に対して５〜１０００重量部、好ましくは５〜１００重量部の水を加えて加熱し、３０〜６０分間、好ましくは３０分間沸騰させることによって得ることができる。かかる方法によって得られる抽出物（抽出液）は、上述の通り、必要に応じて希釈もしくは濃縮することができ、溶媒を除去して固形の抽出物とすることもできる。

本発明の防除剤の有効成分であるキク科センダングサ属植物の抽出物は、好ましくは、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチルおよびミリスチン酸からなる群より選択される１種以上の化合物を含むものである。

また、上記の化合物以外にも、アワユキセンダングサは、アルカロイド、タンニン、サポニン、フラボノイド、カルコン系物質、カフェオイル誘導体、リノール系化合物、ジテルペン、精油、フェニルプロパノイド配糖体、フェノール類、フラボノイド類、フラボン配糖体およびポリアセチレン類、フェルラ酸、ケルセチン、カフェ酸、ピロカテチン、サリチル酸、p-ビニルグワヤコール、ジメソキシフェノール、オイゲノール、4-エチル-1,2-ベンゼネジオール、イソバニリン、2-ハイドロ-6-メチルベンザルデハイド、バニリン、バニリン酸、p-ハイドロキシベンゼン酸、プロトカテチュイック酸およびクマリン（クマリック）酸を含有することが報告されている（非特許文献１〜３）。したがって、本発明の防除剤の有効成分であるキク科センダングサ属植物の抽出物は、これらの物質のうち１種以上を含むものであってもよい。また、本発明の防除剤は、これらの物質のうち１種以上とキク科センダングサ属植物の抽出物とを組み合わせて含むものであってもよく、さらに各種展着剤および浸透移行剤等と組み合わせてマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリの防除ならびにマツ材線虫病の防除に利用することもできる。

本発明の防除剤を効果的に適用できる植物はマツ属(Pinus)植物であり、より具体的には、マツ材線虫病に対して感受性であるマツ属植物である。かかるマツ属植物としては、これらに限定されないが、例えばアカマツ（Pinus densiflora Sieb. ＆ Zucc.）、クロマツ（Pinus thunbergii Parl.）、ヤクタネゴヨウ（Pinus amamiana Koidz.）、リュウキュウマツ（Pinus luchuensis Mayr）、タイワンアカマツ（Pinus massoniana Lambert, 1803）、チョウセンゴヨウ（Pinus koraiensis Siebold et Zucc.）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris L.）、フランスカイガンショウ（Pinus pinaster Aiton）等が挙げられる。

以下、アワユキセンダングサの乾燥植物体１重量部に対して５重量部の水を加えて加熱し、３０分間沸騰させることによって得られる抽出液（以下、便宜上「抽出原液」と称する）を有効成分として含む本発明の防除剤を例にとり、キク科センダングサ属植物抽出物の好適濃度について記載する。

マツノザイセンチュウに対して一定の防除効果を得るためには、抽出原液の２０〜１００倍程度までの希釈液を用いることが好ましく、ほぼ１００％の防除効果を得るためには、抽出原液もしくはその１０倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。

また、マツノザイセンチュウに対する即効性、すなわち殺虫効果を目的とする場合は、抽出原液またはその１００倍程度までの希釈液を用いることが好ましく、マツノザイセンチュウに対する不動化あるいは忌避作用によってマツノザイセンチュウのマツノマダラカミキリ羽化成虫体内への侵入を阻止することを目的とする場合は、抽出原液またはその２００倍程度までの希釈液を用いることが好ましく、マツノマダラカミキリの後食時におけるマツノザイセンチュウのマツ属植物組織内への侵入を阻止することを目的とする場合は、抽出原液またはその２０倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。

一方、マツノマダラカミキリ成虫に対して殺虫効果および忌避性を発揮させるためには、抽出原液を用いることが好ましい。

また、マツノマダラカミキリ幼虫に対して即効性、すなわち殺虫効果を発揮させるためには、抽出原液またはその２０倍程度までの希釈液を用いることが好ましい。

本発明の防除剤の有効成分であるキク科センダングサ属植物の抽出物は、マツノザイセンチュウならびにマツノマダラカミキリ幼虫および成虫に対して不動化および殺虫作用を示すものである。したがって、本発明の防除剤を、マツ属植物、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリのいずれか１種以上に適用することにより、マツ材線虫病を防除することが可能である。

例えば、マツ材線虫病に罹病したマツ属植物に本発明の防除剤を適用すれば、(1)マツ属植物の組織内に存在するマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリ幼虫を殺虫すること、(2)マツノザイセンチュウの媒介虫であるマツノマダラカミキリ体内への移行を阻止すること、および(3)該媒介虫の羽化を阻止することが可能であり、その結果、マツ材線虫病の予防および防除が可能となる。

また、キク科センダングサ属植物の抽出物はマツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対して忌避性を示すため、健全なマツ属植物に本発明の防除剤を適用することにより、マツノマダラカミキリの後食（成熟のための行動：若枝の樹皮を摂食する）およびマツノザイセンチュウのマツ属植物組織内への侵入を阻止または軽減することができる。

ここで、本発明の防除剤の「適用」とは、該防除剤を適用対象物（例えばマツ属植物、マツノザイセンチュウまたはマツノマダラカミキリ）と接触させることをいう。防除剤の適用方法としては、これらに限定されないが、噴霧、塗布、浸漬、樹幹内注入、土壌灌注（根からの吸収）等が挙げられる。

本発明の防除剤は、所望の適用方法に応じ、農薬等において採用され得る各種の剤形に製剤化することが可能である。剤形の例としては、これらに限定されないが、粉剤（一般粉剤、DL粉剤、フローダスト(FD)剤を含む）、粒剤、ペースト剤、水和剤、水溶剤、液剤、乳剤、フロアブル剤、マイクロエマルション剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。また、防除剤の製剤化のために、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、媒体、担体、添加剤等を適宜選択して用いることが可能である。例えば、増量剤、有効成分を溶解または分散させるための媒体（溶媒や分散媒等）、分散剤、乳化剤、固形化もしくは半固形化のための固形化剤やゲル化剤、徐放性付与のためのマトリックス等を用いることができる。

マツ属植物への適用に関しては、マツ属植物の生木または枯死木内に液状の防除剤を注入することができ、また、マツ属植物の生木または枯死木の表面に液状または固形（例えば粉状）の防除剤を適用することもできる。この場合の適用は、キク科センダングサ属植物の抽出物をマツ属植物の表面に定着させるかあるいはマツ属植物の組織内に浸透移行させることを目的としている。したがって、該抽出物を単独で適用することもできるが、マツ属植物の表面への定着性やマツ属植物の組織内への浸透性を良くするために、各種の展着剤や浸透移行剤を併用することもできる。展着剤や浸透移行剤とは、一般に界面活性剤を主成分とする液体であり、例えば一般展着剤（スプレッダー）、機能性展着剤（アジュバント）、固着性展着剤（スチッカー）などを併用することができる。

例えば、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアリキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、Ｎ―オクチルピロリドン、アセチレン系界面活性剤などがある。アニオン系界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホネート、ジアルキルスルホサクシネート、リグニンスルホネート、ナフタレンスルホネートのホルマリン縮合物などがある。固着性を良くするものには、アニオン性界面活性剤として、リグニンスルホンジェート、ナフタレンスルホネートの縮合物、パラフィン、ワックス、モタンワックス、ポリオキシエチレン樹脂酸エステル、ポリビニルアルコール、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体などがある。浸透性を付与するものにはポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステルやポリオキシエチレンドデシルエーテルなどがある。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。

１．供試線虫
本明細書に記載される実験に供試したマツノザイセンチュウは、以下の手順に従って得られたものである。
（１）手動の直径１５mm木工用ドリルを用いて琉球大学校構内の罹病リュウキュウマツから木くずを採取した。
（２）得られた木くずを用いて、ベルマン法（線虫学実験法、２００４、ｐ８７〜８８、編集者：線虫学実験法編集委員会、発行者：真宮靖治、発行所：日本線虫学会）により組織内の線虫を滅菌済み遠沈管に１０ml分離し、遠心機で３，０００rpm（１分間）遠心した。
（３）遠心後、上澄みの９mlをパスツールピペットで取り除く行程を５回行なった後に、１０％に希釈した乳酸をパスツールピペットを用いて９ml加えて遠心分離し、上澄みの９mlを取り除き、再度滅菌水を９ml加え遠心した後、上澄みの９mlを取り除いて線虫を洗浄した。
（４）得られた表面殺菌済みの線虫を、あらかじめPDA培地（ジャガイモ：２００〜３００g、ブドウ糖：１０〜２０g、寒天：１０〜２０g、水：１，０００ml）上で学内保存菌Botrytis cinerea Persoonを前培養した培地上で７日間増殖させた後、パスツールピペットを用いて滅菌水を約１０ml滴下し、良く懸濁して回収したものを実験に使用した。

２．供試昆虫
１）マツノマダラカミキリ成虫
沖縄県森林資源研究センターから、飼育ゲージ内の罹病リュウキュウマツから羽化、脱出し、１〜２週間経過したマツノマダラカミキリ成虫を分譲して頂いたものを以下の実験に供試した。

２）マツノマダラカミキリ幼虫
沖縄県森林資源研究センターから分譲して頂いた罹病リュウキュウマツの丸太内の蛹室から、薪割り機およびピンセットを用いてマツノマダラカミキリの幼虫を採取した。その後、２５℃暗黒条件下に１日静置し状態の良いものを選抜して以下の実験に供試した。

３．マツノザイセンチュウの同定
マツノザイセンチュウの同定は、ベルマン法により分離された線虫を実体顕微鏡で口腔、食道および陰門部などの形態的特徴を観察し同定を行なった。属の同定は、検索表（Williamら、１９９６）を用いて行なった。次に、形態的にBursaphelenchus属と同定した個体１頭を用いてPCR-RFLP法（Iwahoriら、１９９８）により種の同定を行い、さらに該線虫の18Sおよび26S rRNA遺伝子間スペーサー領域の配列を解読し（PCR増幅および配列決定のために使用したプライマーは、18Sプライマー（配列番号１：5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'）および 26Sプライマー（配列番号２：5'-GGAATCATTGCCGCTCACTTT-3'））、得られた配列についてDDBJ（DNA Data Bank of Japan）のWebサイトでBLAST検索を行なって種を特定した。その結果、上記いずれの手法においても、以下の実験に供試したセンチュウは、マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle）であると同定された。

[試験例１]
アワユキセンダングサ抽出液の作製
琉球大学農学部フィールドセンター内に自生する開花期のアワユキセンダングサの地上部を刈り取り、乾熱滅菌機で、１００℃、２時間乾燥させたアワユキセンダングサを切断し、ミキサーでさらに細かく粉砕したものをビーカーに１０g入れ、５０mlの水を加えた。これにアルミ箔で蓋をして、３０分間煮沸し、濾紙で濾過することにより抽出液を得た（以下、「試験例１の抽出液」とも称する）。

[試験例２]
アワユキセンダングサ含有成分の分析
（１）採取したアワユキセンダングサを乾燥（１００℃、２時間）および細断し、細断物１０gあたり５０mlの水を加え、試験例１と同様の方法で（アルミ箔で蓋をして）３０分間煮沸した。煮沸後に遠心分離および濾過を行い、約２５ mlの原液を得た。
（２）該原液２５mlを、回転石を入れた１００mlビーカーに移し、水酸化ナトリウム（４Ｎ）を１：１の割合で加え、ウォーターバスを用いて５０℃、４時間撹拌した。撹拌後、塩酸（１２Ｎ）を加え溶液をpH１に調製した。濃度の測定はリトマス紙を用いた。
（３）pHの調整後、分液漏斗に得られた溶液の半分量（２５ml）と酢酸エチル１００mlを入れて撹拌し、しばらく静置した。酢酸エチル層と水層の分離を確認後、下層にある水層を５０ml容量ビーカーに回収し、残った酢酸エチル分画を１,０００ml容量三角フラスコに回収した。回収した水層は同様の操作を２回繰り返した。残り半分の溶液についても同様な操作を行い、計６００mlの酢酸エチル分画を得た。また、回収した酢酸エチル分画中に微量に混入している水を除去するため、硫酸ナトリウムを薬さじ１杯程度加え十分に撹拌し、冷室（２℃）に保存した。
（４）該酢酸エチル分画を濾過し、１００mlを半分に分け、１００ml容量ナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて酢酸エチルを揮発させ、固形の物質を得た。得られた物質をアセトンで溶解して１０,０００ppmに調製し、濾過した後に２ml容量のバイアルに約１．５ml入れたものをサンプルとした。
（５）該サンプルについて、GC-MS（GCMS-QP2010、カラム：DB-SMS、カラム長：３０m、内径φ０．２５mm）を用いて成分分析を行った。

その結果、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチルおよびミリスチン酸が検出された。

[実施例１]
マツノザイセンチュウに対する殺虫および不動化実験
（１）メスピペット（１ ml）を用いて、試験例１の抽出液（原液）ならびにその１０、２０および１００倍希釈液を滅菌済み小型試験管に１ ml加えた後、マイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて１００頭/０．１mlに調整したマツノザイセンチュウの線虫懸濁液を添加し、パラフィルムで蓋をしてインキュベーター（２５℃条件下）に静置し、1、４および７日後に不動化した線虫を光学顕微鏡下で計数した。対照として滅菌水区を設けた。また、致死した線虫を８日後に計数した。実験は７反復行い、不動化および致死率は百分率（％）で算出した。
（２）実験開始後７日目に、動いている線虫と不動化している線虫の数をカウントし、不動化率を求めた。
（３）不動化線虫を計数した１日後に上澄みを取り除き、顕微鏡（４０倍）において生存および致死線虫数を計数して、全線虫のうちの致死線虫の割合（致死率）を求めた。

その結果、全ての濃度において、高い致死および不動化作用が認められた（表１および図１）。具体的には、不動化率では、原液から１００倍希釈区の全てにおいて８６．５〜１００％の高い致死性を示した（表１）。また、致死率については、原液〜２０倍希釈の防除剤では７６．４〜１００％の値を示し、１００倍希釈液では１２．６％と減少した（表１）。

[実施例２]
マツノザイセンチュウに対する忌避実験
（１）乾熱滅菌したシャーレ底面の中央部にあらかじめ黒マジックで直径２cmの円を描いた。
（２）そのシャーレに素寒天培地（寒天：１０g、蒸留水：１，０００ml）を１０ml分注し凝固させた後、円内にマイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて、試験例１の抽出液（原液）ならびにその１０、２０、１００および２００倍希釈液を３．５μl滴下し、クリーンベンチ内で１０分間風乾させた。
（３）次に各区の円内にマイクロピペット（２０〜２００μl）を用いて１００頭/３．５μlに調整したマツノザイセンチュウの線虫懸濁液を添加し、２５℃条件下に静置した。その後、３０分から２４時間後まで光学顕微鏡下で円内に残存したマツノザイセンチュウを計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は７反復行なった。

その結果、全ての濃度の抽出液において時間経過と共に円内線虫頭数は減少傾向にあり、処理後２４時間後では、滅菌水では３９．３頭であるのに対し、原液、１０および２０倍希釈液区では、それぞれ１０．１、７．１、１８．７と円内線虫頭数が減少した（図２）。

[実施例３]
罹病マツ組織内線虫に対する殺虫および不動化実験
（１）３mmメッシュの篩を乗せた漏斗に約１０cmのゴム管を付け、その下から２〜３cmのところをピンチクランプで止めた。
（２）次に、琉球大学校内の罹病リュウキュウマツから手動の直径１５mm木工用ドリルで採取した木くず２０gを２枚重ねにしたキムワイプで包み、篩の上に置いて、試験例１の抽出液（原液）ならびにその１０、２０、５０、１００および２００倍希釈液を注ぎ静置した。
（３）１、３および５日後にピンチクランプをゆっくり開け、線虫を含む１０mlの液体を滅菌済み小型試験管に取り、遠心機で３,０００rpm（1分間）遠心した後、上澄みの９mlをパスツールピペットで取り除き、残り１ ml中の線虫を計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は７反復行なった。

その結果、滅菌水では４５８．８頭分離されたのに対し、原液、１０、２０、５０、１００および２００倍希釈液では分離線虫数が、それぞれ、８、３２．８、１０３．４、２１３．６、２１４．４、２８５．８と減少した。また、抽出液区間では濃度が高くなるにつれ、分離線虫頭数が減少する傾向を示した（図３）。

[実施例４]
（１）マツノマダラカミキリ成虫に対する殺虫および不動化実験
マツノマダラカミキリ成虫１頭に対し、試験例１の抽出液（原液）２mlを噴霧器を用いて直接噴霧した。その成虫を円柱型プラスチック容器（直径６cm、高９cm）に琉球大学校内から採取した健全なリュウキュウマツの若枝（長さ５cm、幅２cm）と共に入れ、２５℃条件下に静置した。その後、１、２および３日後にプラスチック容器内の不動化および致死した成虫をそれぞれ計数した。対照として滅菌水区を設け、実験は６反復行なった。

その結果、原液処理区では１日後には全ての供試虫が不動化あるいは致死に至り、３日後に全ての個体が致死に至った（表２および図４）。

（２）マツノマダラカミキリ成虫の忌避性に及ぼす影響
リュウキュウマツの若枝（長さ５cm、幅cm）３本に対して、試験例１の抽出液（原液）２mlを噴霧器を用いて直接噴霧し、健全なマツノマダラカミキリ成虫と共にプラスチック容器に入れ、２５℃条件下に静置した。その後、１、２および３日後に該マツの若枝の摂食痕の大きさを測定した。判定基準は処理したマツの若枝に摂食痕が全くみられないものを強い忌避性有り（＋＋）、１本あたりの摂食痕の総面積が１cm²以下のものを忌避性有り（＋）、それ以上のものを忌避性無し（−）とした。対照として滅菌水区を設け実験は６反復行なった。

その結果、処理１日後に全ての個体が強い忌避性を示した（表３および図５）。また個体によっては日数が経過するにつれ、その効果が低下する場合もあった（表３）。

（３）マツノマダラカミキリ幼虫に対する殺虫効果実験
滅菌済みシャーレ上で、マツノマダラカミキリ幼虫１頭に対し、メスピペット（２ml）を用いて試験例１の抽出液（原液）ならびにその１０、２０および１００倍希釈液を２ml滴下した後、２５℃暗黒条件下に静置した。その後、１、３および７日後に致死幼虫を計数した。対照として滅菌水区および無処理区を設け、実験は５反復行なった。

その結果、無処理および滅菌水では殺虫作用がみられなかったのに対し、アワユキセンダングサ抽出液を処理した場合は全ての濃度で殺虫作用が認められ、原液では１００％、１０倍希釈では８０％、２０倍希釈では６０％、１００倍希釈では２０％であった（表４および図６）。

以上の結果から、キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分とする本発明の防除剤は、その濃度を適切に設定することにより、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリに対する高い防除効果を示すことが実証された。

マツノザイセンチュウに対しては、本発明の防除剤が該線虫に対して接触すれば、マツ属植物の組織内および媒介虫であるマツノマダラカミキリの体内において殺虫性を発揮する。

また、マツノマダラカミキリおよびマツノザイセンチュウが共にキク科センダングサ属植物の抽出物に対して忌避性を示したことから、本発明の防除剤をマツ属植物の表面に適用することにより、マツ属植物の組織内へのマツノザイセンチュウの侵入を防止できることが確認された。

さらに、キク科センダングサ属植物の抽出物がマツノマダラカミキリ成虫および幼虫に対して殺虫性を示したことから、成虫に対しては本発明の防除剤を直接接触させることにより、また、幼虫に対しては本発明の防除剤をマツ属植物の組織内に適用することにより、殺虫効果を発揮できることが確認された。

[参考文献]
William, F. M. and Peter, G. M. with Howard, H. L. and Kent L.（1996）Plant-parasitic nematodes a pictorial key to genera, 5 th edition, pp.1-277, Comstock publishing associates a division of cornel university press, Ithaca and London.
Iwahori, H. Tsuda, K. Kanzaki, N. Izui, K.& Futai, K（1998）PCR-RFLP and sequencing analysis of ribosomal DNA of Bursaphelenchus nematodes related to pine wilt disease. Fundam. appl. Nematol.,21(6).655-666

本発明のマツ材線虫病防除剤は、昨今注目されている環境および生物多様性を保全するための環境配慮型防除を促進するものであり、また単一の防除剤でありながら、マツ材線虫病の病原であるマツノザイセンチュウとその媒介虫であるマツノマダラカミキリの双方に対して高い抗虫活性（殺虫および忌避効果）を有することから、効率的なマツ材線虫病の防除剤および防除方法として有効に利用可能である。

Claims (11)

1. キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツ材線虫病の防除剤。
2. キク科センダングサ属植物が、コセンダングサ（Bidens pilosa L.）、アワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Scherff.）、タチアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. Bip）およびハイアワユキセンダングサ（Bidens pilosa L. var. radiata Sch. f. decumbens Scherff.）からなる群より選択される１種以上の植物である、請求項１に記載の防除剤。
3. キク科センダングサ属植物がアワユキセンダングサである、請求項２に記載の防除剤。
4. 抽出物が、煮沸抽出法、浸漬抽出法、振とう抽出法、ソックスレー抽出法および水蒸気蒸留法からなる群より選択される抽出方法によって得られるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の防除剤。
5. 抽出物が、水を用いる煮沸抽出法によって得られるものである、請求項４に記載の防除剤。
6. 抽出物が、アビエチン酸エチル、イソバニリン、α-カリオフィレン、β-カリオフィレン、クマラン、桂皮酸、デヒドロアビエチン酸メチルエステル、シリンガアルデヒド、ステアリン酸、バニリン酸、パルミチン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、4H-ピラン-4-オン,2,3-ジヒドロ-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル、ブチルヒドロキシトルエン、2(4H)-ベンゾフラノン,5,6,7,7a-テトラヒドロ-4,4,7a-トリメチルおよびミリスチン酸からなる群より選択される１種以上の化合物を含むものである、請求項１〜５のいずれかに記載の防除剤。
7. アルカロイド、タンニン、サポニン、フラボノイド、カルコン系物質、カフェオイル誘導体、リノール系化合物、ジテルペン、精油、フェニルプロパノイド配糖体、フェノール類、フラボノイド類、フラボン配糖体およびポリアセチレン類、フェルラ酸、ケルセチン、カフェ酸、ピロカテチン、サリチル酸、p-ビニルグワヤコール、ジメソキシフェノール、オイゲノール、4-エチル-1,2-ベンゼネジオール、イソバニリン、2-ハイドロ-6-メチルベンザルデハイド、バニリン、バニリン酸、p-ハイドロキシベンゼン酸、プロトカテチュイック酸およびクマリン酸からなる群より選択される１種以上の物質をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の防除剤。
8. 粉剤、粒剤、ペースト剤、水和剤、水溶剤、液剤、乳剤、フロアブル剤、マイクロエマルション剤およびマイクロカプセル剤からなる群より選択される剤形のものである、請求項１〜７のいずれかに記載の防除剤。
9. キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle）の防除剤。
10. キク科センダングサ属植物の抽出物を有効成分として含むマツノマダラカミキリ（Monochamus alternatus Hope）の防除剤。
11. 請求項１〜１０のいずれかに記載の防除剤を、マツ属植物、マツノザイセンチュウおよびマツノマダラカミキリのいずれか１種以上に適用することを含む、マツ材線虫病の防除方法。