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JP2012508194A - アセナフトヘテロ環式化合物、そのシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体、並びにそれらがＢＨ３タンパク質類似体、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における使用 - Google Patents

アセナフトヘテロ環式化合物、そのシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体、並びにそれらがＢＨ３タンパク質類似体、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における使用 Download PDF

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JP2012508194A JP2011534990A JP2011534990A JP2012508194A JP 2012508194 A JP2012508194 A JP 2012508194A JP 2011534990 A JP2011534990 A JP 2011534990A JP 2011534990 A JP2011534990 A JP 2011534990A JP 2012508194 A JP2012508194 A JP 2012508194A
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桂葉 呉
ティン 宋
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Abstract

本発明は、アセナフトヘテロ環式化合物、そのシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体、並びにＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造におけるそれらの使用に関する。アセナフトヘテロ環式化合物は、８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの３位、４位、及び６位においてオキソ−、チオ−、カルボニル、エステル、又はアシルを導入すること、或いは９−シアノをカルボキシル、エステル、又はアミドでさらに置換することによって得られる。化合物は、インビトロ又は細胞内でＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、及びＭｃｌ−１タンパク質と競合的に結合し、拮抗するＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のシミュレーションをして、細胞のアポトーシスを誘導することができる。シクロデキストリン包接化合物及び複合体は効果を改善することができる。したがって、これらはすべて、抗癌性化合物の製造において使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、新しいタイプのアセナフトヘテロ環式化合物、及びナノテクノロジーを用いて調製されるそのシクロデキストリン包接化合物又はシクロデキストリン複合体に関し、また、これらの化合物が、インビトロ及びインビボでＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質を模倣して、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＭｃｌ−１タンパク質に競合的に結合し、拮抗し、それによって細胞のアポトーシスを誘導し、抗癌性化合物としての使用に関する。
分子標的抗腫瘍薬は、細胞毒性類抗腫瘍薬に続き新薬研究開発及び製品化の新世代製品となりつつある。Ｂｃｌ−２タンパク質は、悪性腫瘍の不死性に拮抗し、不死性を覆すのに最も重要な分子標的である。したがって、Ｂｃｌ−２タンパク質に特異的に拮抗する薬物は、腫瘍細胞のみにおいてアポトーシスを誘導することによって、高選択性、安全性、高性能、及び低苦痛の抗癌療法という目標を実現できるものである。Ｂｃｌ−２阻害剤のうちで、ＢＨ３類似体（ＢＨ３模倣体）は、最も著しい抗腫瘍効果、最良の薬力学的活性、及び最小の毒性副作用を示す。さらに、このような阻害剤は、Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス性メンバー（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、及びＭｃｌ−１タンパク質を含む）に関して広域スペクトルの拮抗能力も所有しなければならない。
しかし、今のところ、Ｂｃｌ−２を標的とする抗腫瘍製品はまだ市販されていない。既存の１９種の前臨床段階のＢｃｌ−２阻害剤のうちで、３種の最適な製品がそれぞれ、第Ｉ相、第ＩＩ相、及び第ＩＩＩ相臨床試験の段階にある。これらは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡで研究開発されたＡＢＴ−７３７、Ｇｅｍｉｎ Ｘで研究開発されたオバトクラックス（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ）（ＧＸ１５−０７０）、及び米国のＡｓｃｅｎｔａで研究開発されたＡＴ−１０１である。これらはすべて、ＢＨ３類似体である。競合的結合定数は、Ｂｃｌ−２タンパク質についてｎＭオーダーであり、他の１５個の同様の分子より遥かに高い。しかし、これらはすべて、ゴシポール（Ｇｏｓｓｙｐｏｌ）及びオバトクラックスのＢＨ３類似レベルは不十分であり、これらは絶対的ＢＨ３類似体ではないという欠点を有する。言い換えれば、これらは、ＢＡＸ／ＢＡＫとは無関係の細胞毒性を有する。これは、他の標的点が存在し、したがってこれらは毒性副作用を有することを示す。この欠点のため、オバトクラックスは、淘汰される危機に直面している。ＡＢＴ−７３７は絶対的ＢＨ３類似体であるが、Ｍｃｌ−１と反応することができず、且つ広域スペクトルでＢｃｌ−２ファミリータンパク質を阻害することができず、それによってその用途範囲が大幅に制限される。
本発明者らは、８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのアセナフトヘテロ環式化合物を開示し、これらの化合物は、細胞のアポトーシスを誘導することにより腫瘍増殖を阻害する活性を有することを開示した（中国特許、授権公告ＣＮ１３０４３７０Ｃ）。しかし、アポトーシスに基づく有望な抗腫瘍薬として、その研究開発は、同様の薬物と同じ困難である、アポトーシスシグナルのゲートウェイの複雑さ、潜在的及び強い細胞毒性、並びに必然的に薬品の盲目的な適用を引き起こす。これらはすべて、同様のこのような薬物の開発における失敗の重大な理由である。したがって、薬物の標的指向性効果は、研究の過程において顕著に強調されるべきである。
一方、薬物の物理化学的特性は、薬理効果の発現に影響を及ぼす重要な因子であり、薬物の開発時において薬理効果の正確な評価にも影響を及ぼすことがある。このような問題は初期の研究期間に認められた。従来の研究におけるこれらの化合物は、水溶性が比較的悪く、したがってその研究及び使用をより大幅に制限された。
本発明は、より強い標的指向性を有し、ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、及びＭｃｌ−１タンパク質を含む）の阻害剤として使用することができるアセナフトヘテロ環式化合物を提供し、それに基づいて、現代のナノテクノロジーと組み合わせることによって、シクロデキストリン包接体又はシクロデキストリン複合体の形成により、水溶性及びバイオアベイラビリティを改善して、標的指向性抗腫瘍性製剤としてのその使用を十分に展開することを目的とする。
本発明のアセナフトヘテロ環式化合物は、以下の構造式を有する。
Figure 2012508194

Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ、３位、４位、６位、及び９位における置換基である。
式中、
（Ｉ）Ｒ１＝ＸＲ５、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ又はチオモルホリニル、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６又はＣＯＮＨＲ７、
（ＩＩ）Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＸＲ５、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ又はチオモルホリニル、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６又はＣＯＮＨＲ７、
（ＩＩＩ）Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｈ、ＸＲ５、テトラヒドロピラン−４−オキシ−、テトラヒドロチアピラン−４−オキシ−、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ又はチオモルホリニル、Ｒ４＝ＣＮ、
（ＩＶ）Ｒ１＝ＸＲ５、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝ＸＲ５、Ｒ４＝ＣＮ
であり、
式中、
Ｘ＝Ｏ、Ｓ、カルボニル、エステル又はアミド、
Ｒ５＝ａ：（ＣＨ２）ｎＡｒ−（ｏ、ｍ、ｐ）Ｙ（Ｙ＝ＣＨ３、ＮＯ２、Ｐｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＯＣＨ３、ＳＣＨ３又はＮＨ２、ｎ＝０〜４）、
ｂ：テトラヒドロピラン又はテトラヒドロチアピラン、
Ｒ６＝ＣＨ３又はＣ２Ｈ５、
Ｒ７＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５又はＡｒ
である。
本発明の化合物は、以下の２つの経路で合成することができる。
第１の経路では、優れた剛性、共平面性、及び強い電子欠損性を有する原材料の８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルは、アルコール、チオアルコール、フェノール又はチオフェノールなどの求核試薬を用いた芳香族水素求核置換反応を経て、３位、４位又は６位置換８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを生じる。カルボニトリルの加水分解、エステル化、及びアミド化を行った後、対応する酸、エステル、及びアミドが得られる。化学反応式は以下の通りである。
Figure 2012508194
溶媒（テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ピリジン、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド）中の８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを、２０〜１００℃の温度で適正な量のアルコール、チオアルコール、フェノール又はチオフェノールなどの求核試薬と０．５〜２４時間反応させる。冷却後、溶媒の一部を減圧条件下で蒸発させる。次いで、濾過又は直接カラムクロマトグラフィーにより、生成物の３位又は６位置換８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを得ることができる。
濃硫酸の存在下で、３位又は６位置換８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを加水分解して、対応する酸を得ることができ、次いで対応するアルコール及びアミンと反応させることにより、対応するエステル又はアミド化合物を得ることができる。
第２の経路では、原材料のアセナフテンキニーネ及び溶媒の濃硫酸を液体臭素に添加し、２時間還流して、ブロモアセナフテンキニーネを得る。得られたブロモアセナフテンをアルコール、チオアルコール、フェノール又はチオフェノールと反応させて、対応する置換アセナフテンキニーネを得る。得られた置換アセナフテンキニーネを、シリカゲルなどの弱酸条件下でアセトニトリルと反応させて、３−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルを得る。その後、反応生成物にＫ２ＣＯ３を触媒として使用し、アセトニトリルを加えて０．５〜６時間還流する。次いで、冷却し、溶媒の一部を減圧条件下で蒸発させる。濾過又は直接カラムクロマトグラフィーにより、対応する３位又は４位置換オキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られる。その後の加水分解、エステル化、アミド化の条件は、第１の経路のものと同じである。
第１の経路と第２の経路の違いは、置換が輪状構造形成前に行われることであり、こうして３位、６位ではなく３位、４位における２つの異性体を得ることができる。化学反応式は以下の通りである。
Figure 2012508194
多くの方法を使用して、上記の経路で得られた化合物のＢＨ３類似レベル並びにＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害が検出された。その結果から、上記のアセナフトヘテロ環式化合物は極めて高いＢＨ３類似レベルを有し、Ｍｃｌ−１及びＢｃｌ−２タンパク質を有効に阻害できることが実証されている。このような属性のため、この化合物を使用して、ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤を調製することができ、さらに、この化合物を使用して、標的指向性の高い抗腫瘍薬を調製することができる。
アセナフトヘテロ環式化合物の研究過程において、水溶性の低化は、最も顕著な問題であり、化合物の研究及び応用を大幅に制限することもわかった。Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００９、β−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６， ３（３）：３１−３３、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ，２００６， ５４（１）２６−３２）を参照のこと。本発明の別の態様は、このような化合物をシクロデキストリンで包接又はシクロデキストリン複合体形成させることによって、包接化合物又は複合体を形成し、それによって水溶性を改善し、バイオアベイラビリティを向上させることである。
本発明によれば、上記のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物は、以下の方法で調製することができる。
（１）所定量のシクロデキストリンを計量し、シクロデキストリンを水に添加し、次いで加熱撹拌し、飽和溶液を生成させるステップ（ここで、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである）、
（２）所定量の包接用アセナフトヘテロ環式化合物を計量するステップ（ここで、化合物とシクロデキストリンのモル比は１：３〜１０である）、
（３）包接用アセナフトヘテロ環式化合物を、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトンに溶解させ、得られた溶液をシクロデキストリンの水溶液に線状に滴下し、次いで沈澱が析出するまで、４０〜６５℃の温度で１〜６日加熱撹拌するステップ、
（４）上記の溶液を濾過し、濾過ケーキを少量の蒸留水で洗浄し、次いで遊離した状態の化合物を少量のアセトンで洗い流し、５０〜７０℃の温度で２４〜４８時間真空乾燥した後、上記アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物を得るステップ。
本発明によれば、上記のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン複合体は、以下の方法で調製することができる。
（１）乾燥シクロデキストリン及び複合体用アセナフトヘテロ環式化合物を計量するステップ（ここで、シクロデキストリンとアセナフトヘテロ環式化合物のモル比は１：１．５〜３であり、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである）、
（２）複合体用アセナフトヘテロ環式化合物をＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと１：１〜２のモル比で混合し、次いで複合体用アセナフトヘテロ環式化合物のＤＭＳＯ溶液中の濃度が０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｍＬとなるまでＤＭＳＯに溶解させ、次いで室温で３０〜６０分間撹拌するステップ、
（３）ステップ（１）で計量したシクロデキストリン及び０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｍＬのトリエタノールアミンをＤＭＳＯ溶液に添加し、室温で１８〜２４時間反応させるステップ、
（４）０．５０〜１．０ｍｇ／ｍＬのアセトンをステップ（３）の反応系に添加し、減圧条件下で反応系から析出物を分離させるステップ、
（５）濾過し、精製して、上記アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン複合体を得るステップ。
精製は、イオン交換カラムによって実施することができる。条件は、吸着剤としてダイアイオン（ＤＩＡＩＯＮ）（商標）ＨＰ−２０イオン交換樹脂、及び分割にメタノールと水との混合溶媒を採用することである。混合溶媒中のメタノールの量を徐々に増加させ、薄層クロマトグラフィーを使用して、溶離プロセスを試験する。溶離剤の水中のメタノールの量が４０〜５５％に到達すると、いくつかの複合体が溶離によって得られる。得られた溶離液中のメタノールを減圧下で遠心脱水した後、残留溶液を凍結乾燥して、複合体を得る。
本発明によれば、得られたアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物又はシクロデキストリン複合体は、相溶解度法、蛍光分光法、円二色性分光法、赤外分光光度法、熱重量分析、走査電子顕微鏡、及びＨ核磁気共鳴、質量分析法、単結晶Ｘ線回折法などの特性決定技法で特性決定を行い、包接体又は複合体形成の前及び後のアセナフトヘテロ環式化合物の溶解度、Ｍｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害が比較のために検出される。その結果から、シクロデキストリンを使用することによる処理方法は、アセナフトヘテロ環式化合物の水への溶解度を大幅に増大させ、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害能力をある程度強化することが実証される。製剤を使用して、ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤を調製することもでき、さらには標的指向性の高い抗腫瘍薬を調製することができる。
したがって、本発明の別の目的は、ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における上記のアセナフトヘテロ環式化合物、そのシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体の使用を実現することである。
上記のＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤又は対応する抗腫瘍薬は、単一化合物の製剤、化合物のシクロデキストリン包接化合物又はシクロデキストリン複合体の製剤、或いは有効用量のアセナフトヘテロ環式化合物、又はそのシクロデキストリン包接化合物、複合体と、適量の医薬品添加剤とを含む組成物とすることができ、医薬の需要及び従来の医薬製剤方法に従って所望の製剤に作製することができる。
本発明においては、１４の図面がある。
Ｂｃｌ−２タンパク質に競合的に結合する化合物及びＦＡＭ−Ｂｉｄペプチドの蛍光偏光法で検出された動態曲線である。 化合物（種々の濃度）によって干渉された、Ｂｃｌ−２とＢａｘとの細胞レベルでの相互作用を示す図である。 化合物によって（種々の作用時間）干渉された、Ｂｃｌ−２とＢａｘとの細胞レベルでの相互作用を示す図である。 Ｂａｘタンパク質とコンドリオソームの共局在で検出される、化合物のＢＨ３類似性のポジティブな結果を示す図である。 Ｂａｘタンパク質とコンドリオソームの共局在で検出される、化合物のＢＨ３類似性のネガティブな結果を示す図である。 ＢＡＸ／ＢＡＫに応じた、化合物の細胞毒性の結果を示す図である（ゴシポールは非特異的比較である）。 化合物のＭｃｌ−１に対する阻害を示すウェスタンブロッティング電気泳動図である。 化合物のＢｃｌ−２に対する阻害を示すウェスタンブロッティング電気泳動図である。 化合物３−チオモルホリン−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害を示す半定量曲線である。 化合物３−チオモルホリン−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのＢｃｌ−２タンパク質に対する阻害を示す半定量曲線である。 アセナフトヘテロ環式化合物並びにそのシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体のＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害を示すウェスタンブロッティング電気泳動図である。 化合物３−チオモルホリン−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及びその包接化合物のＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害を示す半定量曲線である。 化合物３−チオモルホリン−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及びその包接化合物のＢｃｌ−２タンパク質に対する阻害を示す半定量曲線である。 インビボ腫瘍モデルにおける化合物及びその包接化合物のＭｃｌ−１に対する阻害を示すウェスタンブロッティング電気泳動図である（図中、１はブランク対照群、２は対照群（１）、３は対照群（２）、４は実験群（１）、５は実験群（２）、６は実験群（３）、７は実験群（４））。
次に、添付図面を引用しながら、本発明の様々な実施形態をさらに詳細に説明する。
パートＩ：アセナフトヘテロ環式化合物の調製及び特性決定
実施例１：８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
５００ｍＬの一口フラスコに、０．１ｍｏｌのアセナフテンキノン、０．１１ｍｏｌのマロノニトリル、及び１５０ｍＬのアセトニトリルを順に添加した。反応混合物を、不透明な淡黄色から透明な橙赤色に変色するまで４時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却した後、濾過し、橙赤色の濾過ケーキを回収して、１−ジシアノメチレン−２−オキソ−アセナフテンを得た。５００ｍＬの一口フラスコに、０．０５ｍｏｌの１−ジシアノメチレン−２−オキソ−アセナフテン、１ｇのＫ２ＣＯ３、及び２００ｍＬのアセトニトリルを順に添加、反応混合物を４時間加熱還流した。大量の黄土固体が析出した。濾過し、濾過ケースを回収し、大量の温水で洗浄し、次いで乾燥し、計量した。収率は９５％であった。
融点２７５〜２７７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＤＭＳＯ）：δ ８．７０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．６６２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．４１１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．０６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９８４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例２：３−（４−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び０．４７ｇのｐ−メチルフェノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加した。混合物を３時間還流撹拌した。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率４０％で生成物３−（４−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。
構造決定結果：融点２３２〜２３３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．９１６（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６２３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４４７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．１０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．２５６（ｓ，３Ｈ）。
実施例３：３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
０．９３ｇのフェノキシアセナフテンキノン及び０．３ｇのマロノニトリルを計量し、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。赤色固体が重量１０．１ｇ及び収率９２％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．６ｇの３−フェノキシ−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加した。混合物を３時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝２：１）で分離して、橙赤色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で試験して１：０．３であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２６５〜２６７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．９２７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．６３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４５０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８７６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．７５４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．３９２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．２３３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．０２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２８２〜２８３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．０４７（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．８５０（ｄｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．２１３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６１（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．４１０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．２５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、６．８９９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例４：３−（ｐ−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−（ｐ−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
１ｇのｐ−メチルフェノキシアセナフテンキノン及び０．３ｇのマロノニトリルを、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。赤色固体が重量１１．２ｇ及び収率９３％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．７ｇの３−フェノキシ−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加した。混合物を４時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝１：１）で分離して、橙赤色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で試験して１：０．４であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２３２〜２３３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．９１６（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６２３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４４７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．１０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．３５１（ｓ，３Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２５８〜２６０℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．９８７（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．８５８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．２０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９８６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３３３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．１１２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．８８９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．３４９（ｓ，３Ｈ）。
実施例５：３−（ｍ−メチルフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−（ｍ−メチルフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
１ｇのｍ−メチルフェニルチオアセナフテンキノン及び０．３ｇのマロノニトリルを、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。赤色固体が重量１２．２ｇ及び収率９１％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．７ｇの２−フェニルチオ−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加した。混合物を４時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝１：１）で分離して、赤色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で検査して１：０．２５であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２５５〜２５７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８２６（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．５１３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．３２７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．６５９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．９０１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．８９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．３５３（ｓ，３Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２６９〜２７１℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８７７（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．７４８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．１０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．１２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．８９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．６７９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．３５５（ｓ，３Ｈ）。
実施例６：６−（チエニル−２−メトキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び０．５ｇのチエニルメタノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加した。混合物を３時間還流撹拌した。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率４５％で生成物６−（２−チエニルメトキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。
融点２４１〜２４３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．６８５（ｄｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）、８．４３３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．７５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．２５１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．９８５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．２３２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．４５４（ｓ，２Ｈ）。
実施例７：３−（３−フルオロフェニルホルミル）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−（３−フルオロフェニルホルミル）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
１ｇのｍ−フルオロフェニルカルボニルアセナフテンキノン及び０．４ｇのマロノニトリルを、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。緋色固体が重量１０．５ｇ及び収率８５％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．８ｇの２−フルオロカルボニル−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加し、混合物を３時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝２：１）で分離して、緋色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で検査して１：０．２であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２８５〜２８７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．７２６（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４２３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５９８（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．００３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．８５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．７５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２６９〜２７１℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．５６８（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４７８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．００６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６８（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．０４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．９０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．５９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例８：３−（Ｎ−フェニルホルミル）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−（Ｎ−フェニルホルミル）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
１ｇのフェニルアミドアセナフテンキノン及び０．４ｇのマロノニトリルを、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。緋色固体が重量１１．２ｇ及び収率８６％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．８ｇのフェニルアミド−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加した。混合物を３時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝２：１）で分離して、緋色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で検査して１：０．４であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２８１〜２８３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．１１２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．９４５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６８２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．４５２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３１２（ｓ，１Ｈ）、７．９８６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．６２７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．４３３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．２４１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２９３〜２９４℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．２１３（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、９．０１２（ｄｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．６８５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．４２８（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３２０（ｓ，１Ｈ）、７．８９６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．６７５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５３１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．０１５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例９：３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル−４−オキソ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ａ）及び４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル−４−オキソ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル（Ｂ）の合成及び特性決定
１．０ｇのテトラヒドロピラニルオキシルアセナフテンキノン及び０．４ｇのマロノニトリルを、ジクロロメタンに溶解した。混合物をシリカゲルカラムに加え、急速に溶離した。混合物をすべて通過させた後、カラムを遠心脱水した。緋色固体が重量１１．２ｇ及び収率８６％で得られた。０．０８ｇのＫ２ＣＯ３及び２０ｍＬのアセトニトリルを、０．８ｇの４−テトラヒドロピラニル−（２−オキソ−２Ｈ−アセナフテン）−マロノニトリルに添加した。混合物を９時間加熱還流した。反応が終了した後、反応溶液を遠心脱水し、クロマトグラフカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：石油エーテル＝２：１）で分離して、深紅色固体を得た。異性体比は、核磁気共鳴で検査して１：０．４ であった。得られた異性体を液相分離で分離して、２つの異性体を得た。
第１の成分Ａ：融点２３０〜２３１℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．６０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．１３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４５（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．８２２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，４Ｈ）、３．８１５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ）、３．７６６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
第２の成分Ｂ：融点２４２〜２４４℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．５６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．１１５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３２６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７９６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，４Ｈ）、３．８０７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ）、３．７９１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例１０：３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸の合成及び特性決定
５０ｍｌの一口フラスコに、６０ｍＬの濃硫酸又は２５ｍＬの発煙硫酸を添加した。それに、０．０５ｍｏｌの３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを、０〜５℃の温度でバッチごとに１時間以内で添加した。その後、反応を、室温でさらに１６時間実施した。得られた反応混合物は、粘性で深茶褐色であった。次いで、得られた混合物を砕氷に徐々に滴下し、激しく撹拌した。その後、混合物を静置し、濾過した。濾過ケーキが中性になるまで、大量の水で洗浄した。濾過ケーキを乾燥して、濃黄色生成物を収率９６％で得た。
融点２４８℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ １１．４２（ｓ，１Ｈ）、８．９６５（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．７５０（ｄｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．３１３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９９（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６１（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．４１０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．２５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、６．９６３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例１１：３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボキシラートの合成及び特性決定
１００ｍｌの一口フラスコに、０．０１ｍｏｌの３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、溶媒として５０ｍｌのアセトニトリル、脱酸試薬として０．０２ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３、及び１０倍を超すヨードメタンを順に添加した。窒素保護下で、混合物を４０℃まで加熱し、反応を１５時間続けた。アセトニトリルを減圧条件下で蒸発させ、ジクロロメタンを添加することによって、反応物質を完全に溶解した。濾過した後、濾液を遠心脱水して、黄褐色粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフ分離（展開剤：ジクロロメタン−メタノール＝４０：１）により、濃黄色生成物が得られた。収率は９２％であった。
融点２１３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．１０２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．９６５（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．８５０（ｄｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．２３３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５６（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５３（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．３５０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．３２５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．２１３（ｓ，３Ｈ）。
実施例１２：３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアミドの合成及び特性決定
１００ｍｌの一口フラスコに、０．０１ｍｏｌの３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸、溶媒として５０ｍｌのＤＭＦ、０．０２ｍｍｏｌのトリエチルアミン、０．０１ｍｍｏｌの（ＥｔＯ）２Ｐ（＝Ｏ）ＣＮ、及び１０倍を超えるｔｅｒｔ−ブチルアミドを順に添加し、室温で１時間反応させた。次いで、反応が終了した後、黄色固体が得られた。収率は８５％であった。融点２３７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．７４６（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．６５０（ｄｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．２１３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．８４６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３５２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．２１０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．９６３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７２１（ｓ，３Ｈ）、３．１１３（ｍ，２Ｈ）、１．５６８（ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、１．４２１（ｍ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）、０．９６８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）。
実施例１３：３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び３．２ｇの４−ブロモチオフェノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加し、室温で２時間反応させた。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率４０％で化合物３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。
融点２６２〜２６３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８５２（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．８１３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．０１５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．０９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．００６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。
実施例１４：３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び６．５ｇの４−ブロモチオフェノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加し、室温で３６時間反応させた。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率２０％で化合物３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。
融点２６２〜２６３℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８１５（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．８８１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５５１（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ）、７．２１５（ｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ）、６．４７２（ｓ，１Ｈ）。
実施例１５：６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び２．５ｇの４−アミノチオフェノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加し、室温で２時間反応させた。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率３０％で化合物６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。融点２５５〜２５７℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８３２（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．８０１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．９８５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９２５（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５７０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、６．９９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．００６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．２７１（ｓ，２Ｈ）。
実施例１６：３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの合成及び特性決定
１ｇの８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及び５．０ｇの４−アミノチオフェノールを、５０ｍＬのアセトニトリルに添加し、室温で３０時間反応させた。溶媒の一部を蒸発させた。クロマトグラフカラムにより、収率２５％で化合物３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルが得られた。融点２８８〜２９０℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．８３５（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．６８２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．９７３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５８１（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ）、７．２３４（ｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ）、６．６５１（ｓ，１Ｈ），６．２６９（ｓ，４Ｈ）。
パートＩＩ：アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体の調製及び特性決定
このパートは、アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物及びシクロデキストリン複合体の調製及び特性決定を含む。用いた特性決定方法には、紫外分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、赤外分光法、熱重量分析、及びＳＥＭが含まれる。特別な説明のない限り、このパートにおける装置及び検出方法については以下の資料を参照のこと。
相溶解度図：Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、２００７年、５５巻（９号）、３５３５〜３５３９頁に記載の方法に従って作図。
紫外分光法：ＨＰ８４５３（米国）、検出方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７３巻（２００５年）、３１９〜３２７頁を参照のこと。
蛍光分光法：ＰＴＩ−７００（米国）、検出方法については、Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ（２００８年）、１８巻：１１０３〜１１１４頁を参照のこと。
円二色性分光法：Ｊ−８１０（日本）、検出方法については、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ、２００６年、１１０巻（１３号）、７０４４〜７０４８頁を参照のこと。
赤外分光法：ＦＴ／ＩＲ−４３０（日本）、検出方法については、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００８年、５巻（２号）、３５８〜３６３頁を参照のこと。
熱重量分析：ＴＧＡ／ＳＤＴ８５１ｅ（スイス）、検出方法については、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００８年、５巻（２号）、３５８〜３６３頁を参照のこと。
ＳＥＭ：ＪＳＭ−５６００ＬＶ（日本）、検出方法については、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００３年、４６巻、４６３４〜４６３７頁を参照のこと。
Ｈ ＮＭＲ：ブルーカーアバンス（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ）ＩＩ４００Ｍ（スイス）、検出条件は、（溶媒ＣＤＣｌ３、４００Ｍ）である。
質量分析：ＧＣ−Ｔｏｆ ＭＳ（英国）、検出方法については、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０００年、６５巻、９０１３〜９０２１頁を参照のこと。
単結晶Ｘ線回折：ＸＤ−３Ａ（日本）、検出方法については、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００８年、７３巻、８３０５〜８３１６頁、８３０５を参照のこと。
実施例１７：３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのβ−シクロデキストリン包接化合物の調製及び特性決定
最初に、二次再結晶し、完全に乾燥させたβ−シクロデキストリン１．８５ｇ（１．６３ｍＭｏｌ）を水１００ｍＬに添加し、次いで完全に溶解するまで加熱撹拌した。検出対象化合物０．１７９ｇ（０．５４ｍＭｏｌ）をアセトン３５ｍＬで溶解させた後、β−シクロデキストリンの水溶液に線状に滴下した。混合物を６０℃の温度で３日間加熱撹拌した。その結果、若干の析出物がそれから分離した。濾過し、濾過ケーキを少量の蒸留水で洗浄した。遊離した状態の化合物を少量のアセトンで洗い出した。５０℃の温度で２４時間真空乾燥した後、藤色固体が得られた。
紫外分光法を用いた検出結果は、β−シクロデキストリンの濃度の増大と共に、化合物の紫外吸収及び溶解度が増大することを示した。このことから、対応する包接化合物が形成されたことがわかる。
相溶解度図の結果から、化合物の溶解度が０．２１μＭから０．３６μＭに１．５倍増大したことを知ることができる。
蛍光分光法を用いた検出結果は、検出対象化合物の濃度が一定不変に維持される条件下で、β−シクロデキストリンの濃度の増大と共に、蛍光スペクトルの値が増大することを示した。蛍光発光波長は変化しなかったが、化合物がシクロデキストリンの空洞に入り込んだ後、空洞における環境変化が、励起状態の化合物分子を大量の分子及び消光剤との接触から保護したので、強度は増大した。蛍光スペクトルの変化は、化合物とβ−シクロデキストリンが対応する包接化合物を形成したことを示唆した。
円二色性分光法を用いた検出結果は、β−シクロデキストリンの存在下で、検出対象化合物の誘導円二色性が、２６０ｎｍ〜３７５ｎｍにおいて強い正のコットン効果を示し、４００ｎｍ〜５００ｎｍにおいて弱い正のコットン効果を示すことを示した。これは、化合物がβ−シクロデキストリンのキラルな空洞に入り込んだ後に誘導円二色性効果が生じたことを示唆し、このことから、包接化合物が形成されたことが示された。
赤外分光法を用いた検出結果は、β−シクロデキストリンが３４１０．１８及び１０２９．２２ｃｍ−１において強い吸収帯を示し、指紋領域の５７９〜９１１ｃｍ−１において一連の特性吸収帯を示すことを示した。化合物は、２２１８．５５ｃｍ−１及び１６２５．０８ｃｍ−１において鋭い特性吸収帯を２本示した。赤外スペクトルでは、２２１９．１３ｃｍ−１及び１６２５．４８ｃｍ−１における特性吸収ピークの強度が低下し、わずかな変位が生じた。一方では、１７０６ｃｍ−１に新しい鋭いピークが現れ、このことから、包接化合物が形成されたことが示された。
熱重量分析を用いた検出結果は、β−シクロデキストリンが２９８℃において変曲点を示し、分解し始めることを示した。しかし、β−シクロデキストリンとは異なり、包接化合物は２６９℃で変曲点を示し、分解し始めた。これによって、包接化合物が形成されたことが示された。シクロデキストリン含有量は７３．１％であった。したがって、包接モデルは１：１であった。
ＳＥＭの結果から、３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルは針状の外観を有し、β−シクロデキストリンはより大きい四角形の外観を有することがわかった。化合物とβ−シクロデキストリンとの混合物のＳＥＭ図は、針と四角形の外観が混合したものであった。しかし、β−シクロデキストリン包接化合物は、規則正しいダイヤモンド状の外観を有し、上記の３種類とは明らかに異なるものであった。外観が明らかに異なることから、包接化合物が形成されたことを知ることができる。
他の包接化合物の調製及び特性決定：
実施例１７と同様にして、同じ一連の他の化合物を様々な種類のシクロデキストリンで包接させた。これらの生成物についても、包接化合物の形成を証明するために紫外分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、赤外分光法、熱重量分析、及びＳＥＭで特性決定を行った。相溶解度実験により、化合物及びその包接化合物について包接前及び後の溶解度の変化を比較のために検出した。詳細な結果を表１に示した。
表１から、様々な種類のシクロデキストリンで包接されたアセナフトヘテロ環式化合物の溶解度は、化合物自体の溶解度と比較すると大幅に増大したことがわかる。
Figure 2012508194
実施例１８：３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸のγ−シクロデキストリン複合体の調製及び特性決定
３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸（０．２６３ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（０．１７９ｇ）を、３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。混合物を室温で３０分間撹拌した後、γ−シクロデキストリン（０．６４８５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）及び４ｍＬのトリエタノールアミンを混合物に添加した。反応を室温で１８時間続けた。反応が終了した後、約２００ｍＬのアセトンを試薬に添加した。減圧下で、析出物が分離した。得られた析出物をイオン交換カラムで精製し、得られた生成物をメタノールと水の混合溶媒で洗浄し、次いで溶液を凍結乾燥した後、０．４２ｇの３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸／γ−シクロデキストリンの複合体が収率２５％で得られた。
Ｈ核磁気共鳴及び質量スペクトルによる検出結果は、下記を示した。１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｍ，Ｄ２Ｏ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．８７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．５８〜８．５５（ｍ，２Ｈ）、７．９１（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．３９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）、５．０３（ｍ，８Ｈ）、３．８３（ｍ，８Ｈ）、３．８０（ｍ，８Ｈ）、３．７４（ｍ，８Ｈ）、３．７２〜３．７０（ｍ，３−Ｎ（ＣＨ２＊）２（ＣＨ２）２Ｓ，４Ｈ）、３．５９（ｍ，８Ｈ）、３．５２（ｍ，８Ｈ）、２．９８〜２．９６（ｍ，３−Ｎ（ＣＨ２）２（ＣＨ２）２＊Ｓ，４Ｈ）；（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）−（１６２９ｍ／ｚ）。
単結晶Ｘ線回折で特性決定を行った結果から、γ−シクロデキストリンは１２°及び１５〜２３°において一連の鋭いピークを示したが、化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸は１１°及び７°において鋭いピークを示しただけであることがわかった。しかし、複合体では、６°において新しい鋭いピークが現れ、１１°における鋭いピークは消失し、同時に複合体は、１４〜１８°及び２０〜２５°において一連の鋭いピークを示した。複合体は、化合物及びシクロデキストリンに比べて、新しい鋭いピークを有するものであった。これによって、複合体が形成されたことが示された。
化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸は、γ−シクロデキストリンで複合体形成された後、水に対する溶解度が明らかに増大した。相溶解度曲線の当てはめ式は、Ｙ＝０．６８＋０．１４×Ｘであった。化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸の水に対する溶解度は、元の０．６８μＭから１１．２μＭに１６．５倍増大した。
他の複合体の調製及び特性決定：
実施例１８と同様にして、同じ一連の他の化合物を様々な種類のシクロデキストリンで複合体形成した。これらの生成物についても、複合体の形成を証明するために紫外分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、赤外分光法、熱重量分析、及びＳＥＭで特性決定を行った。相溶解度実験により、化合物及びその複合体について複合体形成前及び後の溶解度の変化を比較のために検出した。詳細な結果を表２に示した。
表２から、様々な種類のシクロデキストリンで複合体形成されたアセナフトヘテロ環式化合物の溶解度は、化合物自体の溶解度と比較すると大幅に増大したことがわかる。
Figure 2012508194
パートＩＩＩ：アセナフトヘテロ環式化合物、そのシクロデキストリン包接化合物及び複合体の物理化学的特性の検出
実施例１９：蛍光偏光アッセイによる化合物のＢＨ３類似度の検出
２１個のアミノ酸を有するＢｉｄ ＢＨ３ペプチド（アミノ酸：７９〜９９：ＱＥＤＩＩＲＮＩＡＲＨＬＡＱＶＧＤＳＭＤＲ）を合成し、６−カルボキシフルオレセインＮ−スクシンイミジルエステル（ＦＡＭ）を蛍光性タグ（ＦＡＭ−Ｂｉｄ）としてＮ末端において標識した。競合的結合実験で使用される反応系は、ＧＳＴ−Ｂｃｌ−２タンパク質（４０ｎＭ）又はＭｃｌ−１タンパク質であった。これを、ＦＡＭ−Ｂｉｄポリペプチド（５ｎＭ）と共に反応緩衝液（１００ｍＭ Ｋ３ＰＯ４、ｐＨ ７．５、１００μｇ／ｍｌウシγアルブミン、０．０２％アジ化ナトリウム）に溶解した。９６ウェルプレートにおいて、１００μＬの反応系を各ウェルに添加した。次いでそこに、ＤＭＳＯに溶解させた異なる濃度の検出対象である３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル母液１μＬを、最終濃度が実験計画の要件を満たすまで添加した。一方、２つの対照群を設置した。反応系を含む一群は、Ｂｃｌ−２又はＭｃｌ−１及びＦＡＭ−Ｂｉｄを含有するだけであり（阻害率０％に相当）、反応系を含む他群は、ＦＡＭ−Ｂｉｄペプチドを含有するだけである。インキュベーションを４時間行った後、９６ウェルプレートを酵素標識計器で検出した。５３０ｎｍの波長によって励起され、発生させた発光波長４８５ｎｍにおいて、蛍光偏光値（ｍＰ）を試験した。Ｋｉ値を、計算式に従って演繹した。実験結果を図１に示した。化合物とＢｃｌ−２との競合的結合定数は３１０ｎＭであった。
上述された実験方法で、他の９種の化合物のＢＨ３類似度を検出した。それらの化合物とＢｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質との結合定数もｎＭレベルであった。詳細な結果を表３に示した。
Figure 2012508194
実施例２０：細胞内蛍光偏光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による化合物のＢＨ３類似度の検出
２μｇのＢｃｌ−２−ＣＦＰ及びＢａｘ−ＹＦＰプラスミドを、リン酸カルシウム共沈法でＨｅｌａ細胞に別々に又は同時にトランスフェクトし、２４時間後、細胞を６ウェルプレートに播種し（２×１０５細胞／ウェル）、そこに、ＤＭＳＯに溶解させた検出対象化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを、最終濃度（２、５、１０、及び１５μＭ）が実現されるまで添加した。２４時間後（図２を参照のこと）、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。蛍光値は、ＧＥＮＩＯＳ蛍光酵素標識計器（ＴＥＣＡＮ、スイス）で検出された。時間依存的な実験において、トランスフェクトされた細胞を６ウェルプレートに播種し、その後、４０μＭの化合物をそれに添加した。３、６及び２４時間後（図３）、蛍光強度をプレートリーダーで検出した。Ｂｃｌ−２−ＣＦＰプラスミドだけをトランスフェクトさせた細胞群に関して、４７５ｎｍの発光波長及び４３３ｎｍの励起波長における値を記録した。Ｂａｘ−ＹＦＰプラスミドのみをトランスフェクトさせた細胞群に関して、５２７ｎｍの発光波長及び５０５ｎｍの励起波長における値を記録した。Ｂｃｌ−２−ＣＦＰとＢａｘ−ＹＦＰプラスミドを共トランスフェクトさせた細胞群に関して、５２７ｎｍ及び４７５の発光波長並びに４３３ｎｍの励起波長における値を記録した。５２７ｎｍと４７５ｎｍの発光波長における蛍光強度の比がＦＲＥＴであった。プラスミドを単独でトランスフェクトさせた対照群のＦＲＥＴを１．０と設定した。これは、２つのタンパク質に関して蛍光偏光エネルギー移動が生じないことを意味した。共トランスフェクトされた細胞では、Ｂｃｌ−２タンパク質とＢａｘタンパク質との相互作用により、ＦＲＥＴは２．０まで増大したが、２つのタンパク質間の相互作用への干渉が増大すると、ＦＲＥＴは、薬物濃度の増大及び時間と共に低減した。細胞生存能力をＭＴＴ法で検出した。実験結果を図２及び３に示した。化合物の濃度が２μＭに到達すると、Ｂｃｌ−２とＢａｘの相互作用は３時間後に干渉を受けるおそれがあり、その結果は濃度−時間依存的傾向を示した。
他の７種の化合物も、上述された方法と同じ実験方法で検出され、化合物はすべて、細胞においてＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質を刺激する機能を有し、様々な濃度及び時間の条件下でＢｃｌ−２とＢａｘの相互作用に明らかに干渉することができることが実験的に証明された。詳細な結果を表４に示した。
ここで、濃度及び時間とは、検出された化合物が、その濃度でその時間、Ｂｃｌ−２とＢａｘの相互作用に干渉したことを意味する。
Figure 2012508194
実施例２１：Ｂａｘタンパク質とコンドリオソームとの間の共局在性による化合物のＢＨ３類似度の検出
リン酸カルシウム共沈法で、５μｇのＢａｘ−ＹＦＰプラスミドをＭＣＦ−７細胞にトランスフェクトし、２４時間後、細胞を６ウェルプレートに播種し（０．２×１０６細胞／ウェル）、１０μＭの検出対象化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルをそれに添加した。６時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、光を避けて５０ｎＭのＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（コンドリオソーム特異的プローブ、赤色）で１０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ラジアンス（Ｒａｄｉａｎｃｅ）２０００レーザー共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を用いて、蛍光像を走査した。一方、二波長走査を実施した。１つの波長は、Ｂａｘ−ＹＦＰの緑色蛍光を走査するのに使用し、もう１つの波長は、コンドリオソームを示唆するためのＣＭＸＲｏｓプローブの赤色蛍光を走査するのに使用した。二波長像を重ね合せることによって、共局在の状況が示された。Ｂａｘタンパク質がコンドリオソームに局在すると、図４に示すように緑色と赤色の蛍光が重なり合って、オレンジ色になった。比較のための図５から、ＢＡＸをコンドリオソームに移動するようにすることはできず、すなわち共局在化は成功しなかったことがわかった。
他の８種の化合物を、上述された方法と同じ実験方法で検出した。その結果から、これらの化合物はすべて、ＢＡＸをコンドリオソームに移動させるようにする機能を有することがわかった。これによって、これらの化合物はすべて、細胞においてＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質を刺激する機能を有することが示された。詳細な結果を表５に示した。ここで、濃度及び時間とは、検出された化合物が、その濃度及びその時間で、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質をシミュレーションし、ＢＡＸをコンドリオソームに移動させるようにすることを意味する。
Figure 2012508194
実施例２２：ＢＡＸ／ＢＡＫに応じた化合物の細胞毒性によるＢＨ３類似体の特性に関する実験的試験
リン酸カルシウム共沈法で、３μｇのＢＡＸ／ＢＡＫ干渉プラスミドをＭＣＦ−７細胞にトランスフェクトし、２４時間後、細胞を回収した。ＢＡＸ及びＢＡＫタンパク質がＲＮＡを干渉した後の発現をウェスタン法で検出し、プラスミドをトランスフェクトしていない細胞群を同様に処理し、対照群と設定した。トランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートに播種し（１×１０５細胞／ウェル）、プラスミドをトランスフェクトしていない細胞群の対照実験を並行して実施した。それに、検出対象化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを、実験前に設計された濃度勾配に従って添加した。４８時間後、細胞生存能力をＭＴＴで検出した。実験結果を図６に示した。並行して、ゴシポールを非特異的ＢＨ３類似体として処理した。その結果から、３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルは、ＢＡＸ／ＢＡＫに対して絶対的に依存する細胞毒性を有することがわかった。
他の８種の化合物（化合物（１）〜（８）と称する）も、上述された方法と同じ実験方法で検出した。その結果から、検出された化合物も、ＢＡＸ／ＢＡＫに対する絶対的依存性という特性を有することがわかった。これらの化合物は、以下の通りである。
（１）８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（２）３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（３）６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（４）３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（５）３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（６）３−（３−フルオロフェニルホルミル）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（７）６−（チエニル−２−メトキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（８）３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸。
実施例２３：ウェスタンブロッティングによる化合物のＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害の検出
細胞試料を回収し、低温において１×１０６／５０μｌの細胞溶解液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ブロムフェノールブルー）で粉砕し、次いで溶液を遠心し、タンパク質上澄液を回収した。試料を１００℃で５分間煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）電気泳動で分離し、移動させた。対象のタンパク質を対応する抗体で検出した。細胞中における対象のタンパク質の発現は、ＥＣＬ着色法と組み合わせて西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体で検出した。検出対象化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害を別々に、図７及び図８に示した。これらの図から、検出対象化合物が腫瘍細胞に対して作用する時間が経過するにつれて、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質の帯が次第に明るくなったことを知ることができる。このことは、化合物がこれらの２つのタンパク質に対する阻害を有することを意味した。ウェスタン像のタンパク質帯の濃度について、半定量分析、及びコダックゲルロジック（ＫＯＤＡＫ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ）１５００画像処理システムソフトウェアを用いた規格化処理を実施した。タンパク質帯の濃度を図９及び図１０に示した。
以下の８種の化合物も、上述された方法と同じ方法で検出した。これらの化合物はすべて、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対して阻害したことを知ることができる。これらの化合物は下記を含む。
（１）８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（２）３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（３）６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（４）３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（５）３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（６）３−フェノキシ−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアミド、
（７）６−（チエニル−２−メトキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（８）４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル−４−オキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル。
半定量分析によるこれらの化合物に関するＭｃｌ−１タンパク質及びＢｃｌ−２タンパク質の減少結果をそれぞれ、表６及び表７に示した。
Figure 2012508194

Figure 2012508194
実施例２４：ウェスタンブロッティングによるアセナフトヘテロ環式化合物並びにそのシクロデキストリン包接化合物及び複合体のＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害の比較
細胞を６ウェルプレートに播種した（２×１０５細胞／ウェル）。化合物群では、化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルを、最終濃度が１０μＭに到達するまでＤＭＳＯに溶解した。包接群では、水に溶解させておいた１０μＭの化合物に相当するγ−シクロデキストリン包接体を細胞に添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで細胞試料を回収し、低温において１×１０６／５０μｌの細胞溶解液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ｐＨ ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ブロムフェノールブルー）で粉砕し、次いで溶液を遠心し、タンパク質上澄液を回収した。試料を１００℃で５分間煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）電気泳動で分離し、移動させた。対象のタンパク質を対応する抗体で検出した。細胞における対象のタンパク質の発現は、ＥＣＬ着色法と組み合わせて西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体で検出した。検出結果を図１１に示した。この図から、３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルのγ−シクロデキストリン包接化合物のＢｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害は、化合物自体の阻害より明らかに高いことを知ることができる。すなわち、γ−シクロデキストリン包接化合物は、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害能力を明らかに増大させた。
ウェスタン図のタンパク質帯の濃度について、半定量分析、及びコダックゲルロジック１５００画像処理システムソフトウェアを用いた規格化処理を実施した。タンパク質帯の濃度を図１２及び図１３に示した。
この例においては、β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、及びヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンで包接された３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、並びに以下の化合物を、上述された方法と同じ方法で検出した。その結果から、細胞においてＢｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対する包接された化合物の阻害能力は、化合物自体の阻害能力より高いことがわかった。
（１）８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（２）３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（３）６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（４）３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（５）３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、
（６）４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル−４−オキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル。
半定量分析によるこれらの化合物及びその包接化合物に関するＭｃｌ−１タンパク質及びＢｃｌ−２タンパク質の減少結果をそれぞれ、表８及び表９に示した。
Figure 2012508194

Figure 2012508194
γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンで複合体形成された３−（ｐ−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボキサミド、３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸、３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボキサミドなど、同じ種類の他の化合物を、この実施例において上述された方法と同じ方法で検出した。実験結果から、細胞において、これらの化合物のシクロデキストリン複合体のＢｃｌ−２及びＭｃｌ−１タンパク質に対する阻害能力は、化合物自体の阻害能力より高いことがわかった。
実施例２５：ウェスタンブロッティングによる、腫瘍モデルにおける化合物と包接化合物のＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２に対する阻害のインビボ比較
昆明マウス（中国）をランダムに群に割付け、各群１０匹のマウスとした。培養された肝ガン細胞Ｈ２２を、マウスの腋下に２００μＬ／マウスで皮下接種した。癌細胞を５日間担持した後、皮下腫瘍が形成された。次いで、化合物３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル及びそのγ−シクロデキストリン包接化合物を腹膜注射で投与し、γ−シクロデキストリンで包接された検出対象化合物を経口投与した。検出条件は下記を含む。
ブランク対照群：担癌後、マウスにはいかなる処置も施さなかった、
対照群（１）：担癌後、マウスにＤＭＳＯ溶液を１日おきに全部で１０日間腹膜注射した、
対照群（２）：担癌後、マウスにシクロデキストリン溶液を１日おきに全部で１０日間腹膜注射した、
実験群（１）：担癌後、マウスに、０．０３ｍｇ／ｋｇのＢＷ化合物に相当するＤＭＳＯ溶液を１日おきに全部で１０日間腹膜注射した、
実験群（２）：担癌後、マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのＢＷ化合物に相当するＤＭＳＯ溶液を１日おきに全部で１０日間腹膜注射した、
実験群（３）：担癌後、マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのＢＷ化合物に相当する包接化合物水溶液を１日おきに全部で１０日間腹膜注射した、
実験群（４）：担癌後、マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのＢＷ化合物に相当する包接化合物水溶液を１日おきに全部で１０日間胃内投与した。
実験期間中、腫瘍の長径（ａ）及び長径と直角を成す短径（ｂ）を、毎週２回検出した。肉眼的腫瘍体積を、式：１／２ａｂ２に従って決定した。動物の生存期間を観察した。４０日目に、腫瘍阻害率を腫瘍体積によって算出した。結果を下記に示した。
実験群（２）（化合物のＤＭＳＯ溶液注射群）：腫瘍阻害率は２２．３％であった、
実験群（３）（包接化合物注射群）：腫瘍阻害率は６１．５％であった、
実験群（４）（包接化合物の経口投与群）：腫瘍阻害率は４３．７％であった。
対照群における動物の平均生存期間は２８±２．１日であり、化合物群における動物の平均寿命は３３±３．１日であり、包接化合物の注射群における動物の平均生存期間は４８±５．１日であり、包接化合物の経口投与群における動物の平均生存期間は４２±１．１日であった。統計処理の結果から、Ｐ＜０．０５であることがわかった。
マウスが死亡又は屠殺した後、皮下腫瘍を取り出した。体積１：３の生理食塩水を使用して、細胞懸濁液調製用の組織ホモジネートを作製した。腫瘍細胞におけるＢｃｌ−２、Ｍｃｌ−１タンパク質の発現を、実施例２４に記載の方法と同じウェスタン検出方法で検出した。その結果を図１４に示した。ここで、電気泳動パス６におけるタンパク質帯は、電気泳動パス５におけるタンパク質帯より明るい。これは、インビボにおいて包接化合物のＢｃｌ−２、Ｍｃｌ−１に対する阻害能力が、化合物自体の阻害能力より高いことを示唆した。
β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、及びヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンで包接された３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリル、並びに以下の化合物は、下記を含む同じ抗腫瘍効果をインビボで有した。
（１）実験群（２）と同じ条件下で、８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約６０％であった、実験群（３）と同じ条件下で、γ−シクロデキストリンで包接された化合物２９−１の腫瘍阻害率は約８０％であった、
（２）実験群（２）と同じ条件下で、３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約４０％であった、実験群（３）と同じ条件下で、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで包接された化合物２９−２の腫瘍阻害率は約６０％であった、
（３）実験群（２）と同じ条件下で、６−（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約３０％であった、実験群（３）と同じ条件下で、γ−シクロデキストリンで包接された化合物２９−３の腫瘍阻害率は約４０％であった、
（４）実験群（２）と同じ条件下で、３，６−ジ（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約７８％であった、実験群（３）と同じ条件下で、メチル−β−シクロデキストリンで包接された化合物２９−４の腫瘍阻害率は約８５％であった、
（５）実験群（２）と同じ条件下で、３，６−ジ（４−アミノフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約５０％であった、実験群（３）と同じ条件下で、γ−シクロデキストリンで包接された化合物２９−５の腫瘍阻害率は約６０％であった、
（６）実験群（２）と同じ条件下で、４−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル−４−オキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボニトリルの腫瘍阻害率は約４０％であった、実験群（３）と同じ条件下で、β−シクロデキストリンで包接された化合物２９−６の腫瘍阻害率は約５５％であった。
他の化合物の腫瘍阻害率は３０％〜５０％であった。シクロデキストリン包接化合物の腫瘍阻害率は、化合物自体の腫瘍阻害率より一般に高い（Ｐ＜０．０５）。
γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンで複合体形成された以下の化合物も化合物自体より、Ｂｃｌ−２及びＭｃｌ−１に対する阻害能力が強く、腫瘍阻害率が高いものであった。
ここで、
３−（ｐ−メチルフェノキシ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボキサミドの腫瘍阻害率は３０％であり、メチル−β−シクロデキストリンで複合体形成されたとき、腫瘍阻害率は約３８％に到達した、
３−（４−ブロモフェニルチオ）−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボン酸の腫瘍阻害率は４５％であり、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンで複合体形成されたとき、腫瘍阻害率は５５％に到達した、
３−チオモルホリニル−８−オキソ−８Ｈ−アセナフト［１，２−ｂ］ピロール−９−カルボキサミドの腫瘍阻害率は４５％であり、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで複合体形成されたとき、腫瘍阻害率は６０％に到達した。

Claims (6)

  1. 以下の構造式を有するアセナフトヘテロ環式化合物。
    Figure 2012508194

    ［式中、
    （Ｉ）Ｒ１＝ＸＲ５、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ、又はチオモルホリニル、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６又はＣＯＮＨＲ７、
    （ＩＩ）Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＸＲ５、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ、又はチオモルホリニル、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ６又はＣＯＮＨＲ７、
    （ＩＩＩ）Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｈ、ＸＲ５、テトラヒドロピラン−４−オキシ−、テトラヒドロチアピラン−４−オキシ−、チオフェンメトキシル、チオフェンメチルアミノ、又はチオモルホリニル、Ｒ４＝ＣＮ、
    （ＩＶ）Ｒ１＝ＸＲ５、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝ＸＲ５、Ｒ４＝ＣＮ
    であり、
    式中、
    Ｘ＝Ｏ、Ｓ、カルボニル、エステル又はアミド、
    Ｒ５＝ａ：（ＣＨ２）ｎＡｒ−（ｏ、ｍ、ｐ）Ｙ（Ｙ＝ＣＨ３、ＮＯ２、Ｐｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＯＣＨ３、ＳＣＨ３又はＮＨ２、ｎ＝０〜４）、
    ｂ：テトラヒドロピラン又はテトラヒドロチアピラン、
    Ｒ６＝ＣＨ３又はＣ２Ｈ５、
    Ｒ７＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５又はＡｒ
    である］
  2. 以下の方法で調製される、請求項１に記載のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物：
    （１）所定量のシクロデキストリンを計量し、水に添加し、次いで加熱撹拌し、飽和溶液を生成させるステップ（ここで、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである）、
    （２）所定量の包接用アセナフトヘテロ環式化合物を計量するステップ（ここで、化合物とシクロデキストリンのモル比は１：３〜１０である）、
    （３）包接用アセナフトヘテロ環式化合物を、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトンに溶解し、得られた溶液をシクロデキストリンの水溶液に線状に滴下し、次いで沈澱が析出するまで、４０〜６５℃の温度で１〜６日加熱撹拌するステップ、
    （４）上記の溶液を濾過し、濾過ケーキを少量の蒸留水で洗浄し、次いで遊離状態の化合物を少量のアセトンで洗い流し、５０〜７０℃の温度で２４〜４８時間真空乾燥した後、前記アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物を得るステップ。
  3. 以下の方法で調製される、請求項１に記載のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン複合体：
    （１）乾燥シクロデキストリン及び複合体用アセナフトヘテロ環式化合物を計量するステップ（ここで、シクロデキストリンとアセナフトヘテロ環式化合物のモル比は１：１．５〜３であり、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである）、
    （２）複合体用アセナフトヘテロ環式化合物をＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと１：１〜２のモル比で混合し、次いで複合体用アセナフトヘテロ環式化合物のＤＭＳＯ溶液中の濃度が０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｍＬとなるまでＤＭＳＯに溶解させ、次いで室温で３０〜６０分間撹拌するステップ、
    （３）ステップ（１）で計量したシクロデキストリン及び０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｍＬのトリエタノールアミンをＤＭＳＯ溶液に添加し、室温で１８〜２４時間反応させるステップ、
    （４）０．５０〜１．０ｍｇ／ｍＬのアセトンをステップ（３）の反応系に添加し、減圧条件下で反応系から析出物を分離させるステップ、
    （５）濾過し、精製して、前記アセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン複合体を得るステップ。
  4. ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における請求項１に記載のアセナフトヘテロ環式化合物の使用。
  5. ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における請求項２に記載のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン包接化合物の使用。
  6. ＢＨ３類似体であるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の阻害剤の製造における請求項３に記載のアセナフトヘテロ環式化合物のシクロデキストリン複合体の使用。
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