JP2012082181A - 内因性エリスロポエチン発現増強剤及び有機イオントランスポーター発現増強剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の主要な合併症のひとつである腎性貧血に、腎機能の評価である推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）の低下と共に蓄積する尿毒症物質が、どのように関与しているかを明らかにすることを課題とした。
【解決手段】本発明者らは、尿毒症物質のひとつインドキシル硫酸が、ＧＡＴＡ３の発現を増強すること及び、有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を抑制すること、さらにエリスロポエチンの発現を抑制することを見いだした。そして、活性炭の一種である球形吸着炭（クレメジン）が内因性エリスロポエチン発現を増強する機能を有し、腎性貧血治療薬として利用できること、また有機アニオントランスポーター（ＳＬＣＯ４Ｃ１）の発現を増強する機能を有し、尿毒症物質排泄増強剤として利用できることを明らかにした。
【選択図】図９

Description

本発明は、吸着炭等の尿毒症物質吸着剤を有効成分とする、内因性エリスロポエチン発現増強剤及び有機イオントランスポーター発現増強剤などに関する。

腎不全患者等の腎疾患を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っている。腎臓の機能のひとつは、血液中に流れている薬物や尿毒症物質などを取り込み、尿中に送り出して体外に排泄する排泄作用である。そのため腎機能が低下すると、薬物や尿毒症物質が体内に蓄積しやすくなり、腎臓の細胞が傷害され腎機能のさらなる低下を引き起こす。また、腎機能の低下した人は、正常の人と較べて何倍も脳卒中や心筋梗塞になりやすいことが知られている。したがって尿毒症物質などを排泄する機能を維持することは、腎障害を悪化させない上で非常に重要な意味を持つと同時に、脳卒中や心臓病の予防という点でも重要である。現在２０万人の患者が、尿毒症物質などを人工的に除去するために透析治療を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となり社会的な問題でもある。

近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤとは、腎障害を示す所見や腎機能低下が慢性的に続く状態で、適切な治療を行わずにいると末期腎不全となり、人工透析や腎移植を受けなければ生きられなくなる疾患である。末期腎不全は全世界的に増え続けており、現在、日本には約１，３３０万人のＣＫＤ患者がいるといわれており、成人の約８人に１人にあたる数である。また、人工透析を受けている患者も、前述したように増え続けているのが現状であり、ＣＫＤの早期発見、早期治療が急務の課題となっている。このような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎疾患の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することが期待されている。

ＣＫＤにおいて腎性貧血は主要な合併症のひとつであり、腎性貧血の病態は、内因性エリスロポエチン（Ｅｐｏ）産生の低下を基盤とすることが知られている。腎機能の低下がどのようにエリスロポエチン産生に影響を及ぼすかは明らかになっていないが、血液透析によって腎性貧血が改善したという報告があることから、尿毒症物質がその原因のひとつである可能性が示唆されている。エリスロポエチンは赤血球の産生を促進する造血促進因子の一つであり、エリスロポエチンの欠乏は貧血の一因となる。エリスロポエチンは主に腎臓で生成されるため、慢性腎不全によりエリスロポエチンの発現量が低下し、貧血が起こる。そのため、腎性貧血の主な治療法はエリスロポエチンの投与であるが、エリスロポエチン製剤は高価で、頻回の注射が必要であるなどの問題があった。

これまで発明者らは、ヒト腎臓近位尿細管血管側にのみ発現する有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１が尿毒症物質の排泄に関わっており、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を調節することで尿毒症物質排泄を制御するという新たなＣＫＤ治療の可能性を報告した（非特許文献１）。

また、エリスロポエチン遺伝子の上流のＧＡＴＡ配列にＧＡＴＡ転写因子が結合し、エリスロポエチン遺伝子発現を負に制御しているため、ＧＡＴＡ３阻害剤によって、エリスロポエチンの発現が増強されることが知られている。そして、腎不全で蓄積されるＬ−ＮＭＭＡ（NG-monomethyl L-arginine）により、ＧＡＴＡ結合活性・ｍＲＮＡ発現レベルが亢進することによりエリスロポエチン遺伝子発現が抑制されて腎性貧血が発症することが報告されている（非特許文献２）。

現在臨床的に使用されている腎不全用製剤のひとつに、経口投与可能な尿毒症物質吸着機能を有する製剤として、活性炭の一種、球形吸着炭クレメジン（登録商標：呉羽化学）がある。クレメジンは、石油系炭化水素由来の球形微多孔質炭素を高温で酸化・還元処理して得た黒色球形の粒子であり、体内に吸収されずに、消化管に存在する有害物質を吸着し、便とともに排泄されることにより尿毒症物質の除去及び腎機能の低下を抑える目的で使用されている経口吸着剤である。また、クレメジンは、腎性貧血治療のために投与された遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤（ｒＨｕＥＰＯ）の作用を増強することも知られているが、その詳細なメカニズムは明らかではない（特許文献１）。

本願発明者らは、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）を用いてＣＫＤ患者４１名の血清を解析し、腎機能の評価である推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）の低下と共に蓄積する尿毒症物質としてインドキシル硫酸を含めた５２個（うち新規物質３６個）の物質を同定した（非特許文献３）。

特開平６−１９９６８９号公報

Toyohara T. et al., J Am Soc Nephrol., 20: 2546-2555 (2009) Imagawa S. et al., Kidney International. 61. 396-404 (2002) Toyohara T. et al., Hypertens Res. 2010 Sep;33(9):944-52. (2010)

本願発明者らは、腎機能の評価であるｅＧＦＲの低下と共に蓄積する尿毒症物質を同定したが（特願２００９−２０５０３３、非特許文献３）、これらの物質がどのようにＣＫＤの病態に関与しているかはほとんどわかっていなかった。そこで、本発明の課題は、ＣＫＤの主要な合併症のひとつである腎性貧血に、これらの尿毒症物質がどのように関与しているか明らかにすることを課題とした。

本発明者らは、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸（ＩＳ；Indoxyl Sulfate）が、ＧＡＴＡ３の発現やＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現に与える影響を調べ、エリスロポエチン産生に与える作用とその機序を検証した。さらに、活性炭（クレメジン）がＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現を増強し、内因性エリスロポエチンの発現を増強することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）尿毒症物質吸着剤を有効成分とする内因性エリスロポエチン発現増強剤や、（２）尿毒症物質吸着剤が活性炭である上記（１）記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤や、（３）活性炭が球形吸着炭である上記（２）記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤や、（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤を含む腎性貧血治療薬に関する。

また、本発明は（５）尿毒症物質吸着剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤や、（６）尿毒症物質吸着剤が活性炭である上記（５）記載の有機イオントランスポーター発現増強剤や、（７）活性炭が球形吸着炭である上記（６）記載の有機イオントランスポーター発現増強剤や、（８）有機イオントランスポーターが、有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１である上記（５）〜（７）のいずれか記載の有機イオントランスポーター発現増強剤や、（９）上記（５）〜（８）のいずれか記載の有機イオントランスポーター発現増強剤を含む尿毒症物質排泄増強剤に関する。

本発明の活性炭を有効成分とする内因性エリスロポエチン発現増強剤によれば、生体内で発現するエリスロポエチン量を増強し、腎性貧血を治療することができる。また、本発明の活性炭を有効成分とする有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤によれば、ＳＬＣＯ４Ｃ１量を増加させ、尿毒症物質排泄作用を増強することができる。

エリスロポエチン産生ヒト肝細胞株Ｈｅｐ３Ｂに尿毒症物質（アニオン）を添加し、エリスロポエチン産生能への影響を調べた結果を示す図である。 エリスロポエチン産生ヒト肝細胞株Ｈｅｐ３Ｂに尿毒症物質（カチオン）を添加し、エリスロポエチン産生能への影響を調べた結果を示す図である。 ＨＫ−２細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を抑制することを示す図である。 ＨＫ−２細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現を増強することを示す図である。 腎不全ラットおいて、クレメジン投与によりＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現が増強されることを示す図である。 ＡＣＨＮ細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）や１−メチルアデノシン（1-Methyladenosine）がエリスロポエチンの発現を転写レベルで抑制することを示す図である。 ＡＣＨＮ細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を転写レベルで抑制し（左のグラフ）、ＧＡＴＡ３の発現を転写レベルで増強する（右のグラフ）ことを示す図である。 腎性貧血患者に対するクレメジン投与により、エリスロポエチンの発現が増強されることを示す図である。 クレメジンが尿毒症物質を吸着、排除し、尿毒症物質によるＧＡＴＡ３の発現増強及びＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現抑制を抑えることにより、ＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターやエリスロポエチンの発現を増強する機序を表す図である。

本発明における尿毒症物質吸着剤としては、尿毒症物質を吸着し体外に排出することにより体内の尿毒症物質を減少させ、それにより尿毒症物質が増強していたＧＡＴＡ３の発現が減少し、ＧＡＴＡ３によるエリスロポエチンの発現抑制が解除されて内因性エリスロポエチンの発現が増強される目的で使用できる尿毒症物質を吸着する物質や、ＧＡＴＡ３による有機イオントランスポーターの発現抑制が解除されて、有機イオントランスポーターの発現が増強される目的で使用できる尿毒症物質を吸着する物質であれば特に制限されない。例えば、活性炭、有機ポリマー、ゼオライトや白土、クレイなどの無機吸着剤、デンプン類やセルロース類、キチンやキトサン等の経口吸着剤を挙げることができ、中でも活性炭が好ましい。さらに、活性炭の中でも、石油系炭化水素由来の微多孔質炭素を高温で酸化・還元処理して得た黒色粒子であり、直径０．０５〜２ｍｍ、好ましくは直径０．１〜１ｍｍ、さらに好ましくは直径０．２〜０．４ｍｍの、無数の細孔を有する高純度炭素微粒子である球形吸着炭が好ましい。かかる球形吸着炭は、市販の製品、クレメジン（Kremezin、登録商標）として入手することができ、例えば呉羽化学工業株式会社製「クレメジン（登録商標）細粒」や「クレメジン（登録商標）カプセル２００」、マイラン製薬株式会社製「球形吸着炭細粒マイラン」を使用することができる。本明細書においては、これらの球形吸着炭を総称してクレメジンと記載することもある。

本発明の内因性エリスロポエチン発現増強剤の好ましい態様は、尿毒症物質吸着剤として球形吸着炭を有効成分とするものであり、その有効量を、ヒトを含む哺乳動物に投与することによってエリスロポエチンの発現量を増強することができるものであり、賦形剤等の担体と併用することにより薬剤やサプリメントとすることができる。この薬剤やサプリメントを腎不全のヒトを含む哺乳動物に投与することによって、生体内のエリスロポエチンの発現量が増加し、腎性貧血の予防又は治療に利用することができる。かかるエリスロポエチンとしては、例えばマウスエリスロポエチン遺伝子（NM_007942；GenBankアクセッション番号）、ラットエリスロポエチン遺伝子（NM_017001）やヒトエリスロポエチン遺伝子（NM_000799）、及びこれらから発現するタンパク質などを挙げることができる。

本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤の好ましい態様は、尿毒症物質吸着剤として球形吸着炭を有効成分とするものであり、その有効量を、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって有機イオントランスポーターの発現量を増強することができる薬剤である。この薬剤は、腎不全のヒトを含む哺乳動物に投与することによって、有機イオントランスポーターの発現量を増加させることにより、尿毒症物質の排出を増加させることができる。有機イオントランスポーターとしては、ＳＬＣＯ４Ｃ１、ＯＣＴ１（organic cation transporter1）、ＯＣＴ２及びＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１（novelorganic cation transporter1）やＯＣＴＮ２、ＯＡＴ１（organic anion transporter1）、ＯＡＴ２及びＯＡＴ３を挙げることができ、中でも有機アニオントランスポーターであるＳＬＣＯ４Ｃ１を好適に示すことができる。かかるＳＬＣＯ４Ｃ１としては、ラットＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（NM_001002024）、マウスＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（NM_172658）やヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（AY273896）、及びこれらから発現する発現するタンパク質などを挙げることができる。

上記本発明の内因性エリスロポエチン発現増強剤を含む本発明の腎性貧血治療薬や、上記本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤を含む本発明の尿毒症物質排泄増強剤は、経口的に投与されるが、その投与量は、対象（動物又はヒト）、年齢、個人差、病状などに依存する。例えば、球形吸着炭（クレメジン）をヒトに経口投与する場合の投与量は、通常１日当たり、クレメジン０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜５０ｇ、さらに好ましくは３〜２０ｇであり、１回又は２〜４回に分けて服用してもよく、また症状により投与量を適宜増減してもよい。例えば、クレメジン等の活性炭は、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、スティック剤、分包包装体又は懸濁剤などの任意の投与形態で与えることができる。なお、本明細書における腎性貧血治療薬及び尿毒症物質排泄増強剤の投与対象は、ヒトだけでなく、他の非ヒト動物含むが、ヒト及び非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

本願発明者らは、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）を用いてＣＫＤ患者４１名の血清を解析し、腎機能の評価である推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）の低下と共に蓄積する尿毒症物質としてインドキシル硫酸を含めた５２個（うち新規物質３６個）を同定した（非特許文献３、特願２００９−２０５０３３）。このうち３１種類の尿毒症物質化合物を入手し、これらの化合物を含んだ培地で、低酸素条件下でエリスロポエチン産生が誘導される細胞を培養し、エリスロポエチン産生能への影響を以下の方法で評価した。

エリスロポエチン産生ヒト肝細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手）は、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（GIBCO社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（GIBCO社製）、１０％ウシ胎児血清（GIBCO社製）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ）（GIBCO社製）で５％ＣＯ_２／９５％空気、３７℃で維持した。各種薬物のエリスロポエチン産生能に対する影響を検討するために、１２穴細胞培養プレートに１穴あたり１×１０^５個のＨｅｐ３Ｂ細胞をまき、２４時間後に培養液を被検物質（各１ｍＭ、１−メチルアデノシンは０．１ｍＭ）あるいは１％ＤＭＳＯ又は水が入った培養液に交換した。コントロール群は通常の培養細胞装置で５％ＣＯ_２／９５％空気、３７℃の条件で、エリスロポエチン産生誘導群は低酸素チャンバーを用いて５％ＣＯ_２／１％Ｏ_２、３７℃の低酸素条件で２４時間培養した。２４時間培養の後、上清中のエリスロポエチンの濃度をBender Med Systems社製のヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキットを用いて測定し、また細胞のタンパク濃度をBio-Rad社製のＢＣＡ蛋白測定キットを用いて測定した。測定した上清中のエリスロポエチン量の値を、細胞のタンパク質量の値で割り、一定細胞量あたりのエリスロポエチン産生量を算出した。さらに１％ＤＭＳＯ又は水を含む培養液、５％ＣＯ_２／１％Ｏ_２、３７℃条件下で培養した場合の一定細胞量あたりのエリスロポエチン産生量を１００％として、各被検物質を添加した場合のエリスロポエチン産生量を求めた。アニオンの被検物質を用いた場合の結果のグラフを図１に、カチオンの被検物質を用いた場合の結果のグラフを図２に示す。

その結果、アニオンではインドキシル硫酸（Indoxyl sulfate：ＩＳ）、イソクエン酸（Isocitrate）、シトラコン酸（Citraconate）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸（N-Ace-L-Glu）、ホモバニリン酸（Homovanilate）、Ｎ−アセチル−アスパラギン酸−グルタミン酸（N-Ace-Asp-Glu）、マンデル酸（Mandelate）、Ｌ−システイン−Ｓ−硫酸（L-cystein-S-sulfate）、カチオンではヒポタウリン（Hypotaurine）、１−メチルアデノシン（1-Methyladenosine）、インドール−３−酢酸（Indole-3-acetate）、キヌレニン（Kynurenine）、Ｎ−モノメチル−アルギニン（ＮＭＭＡ）の１３種類の物質（図１、２にアスタリスク及びシャープで示す）は、その添加によりエリスロポエチン産生能の有意な低下が認められた。

［インドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制作用］
ＨＫ−２細胞におけるインドキシル硫酸（ＩＳ）によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制作用について検証した。６穴細胞培養プレートに５×１０^５個のＨＫ−２細胞を蒔いた後、２４時間インキュベーションした。その後インドキシル硫酸（０．３、１、３ｍＭの３濃度）又は水を含んだ培地に交換し、２４時間インキュベーションした後にＲＮＡを抽出した。SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製したのち、ＧＡＰＤＨを内部標準としてＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲで測定した。細胞培養培地には腎上皮細胞培養キット（Lonza社製）を用い、定量ＰＣＲはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assaysを使用し（ＧＡＰＤＨ；Assay ID: Rn99999916_s1、ＳＬＣＯ４Ｃ１；Assay ID: Rn01427754_m1のTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems社製）を使用）、Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）により行った。その結果、インドキシル硫酸の濃度依存的にＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡの発現が抑制されることが示された（図３）。すなわち、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸は、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を抑制することにより、尿毒症物質の排出を抑制して腎不全を亢進する可能性が示唆された。

［インドキシル硫酸によるＧＡＴＡ３発現誘導作用］
ＨＫ−２細胞におけるインドキシル硫酸（ＩＳ）によるＧＡＴＡ３発現誘導作用について検証した。６穴細胞培養プレートに５×１０^５個のＨＫ−２細胞を蒔いた後、２４時間インキュベーションした。その後インドキシル硫酸（０．３、１、３ｍＭの３濃度）又は水を含んだ培地に交換し、２４時間インキュベーションした後にＲＮＡを抽出した。SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製したのち、ＧＡＰＤＨを内部標準としてＧＡＴＡ３のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲで測定した。細胞培養培地には腎上皮細胞培養キット（Lonza社製）を用い、定量ＰＣＲはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assaysを使用し（ＧＡＰＤＨ；Assay ID: Rn99999916_s1、ＧＡＴＡ３；Assay ID: Hs00231122_m1のTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems社製）を使用）、Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）により行った。その結果、インドキシル硫酸の濃度依存的にＧＡＴＡ３のｍＲＮＡの発現が誘導されることが示された（図４）。すなわち、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸は、エリスロポエチンの発現を抑制する因子であるＧＡＴＡ３の発現を誘導することにより、エリスロポエチンの発現を抑制する可能性が示唆された。

［腎不全ラットおけるクレメジン投与によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現誘導作用］
次に、尿毒症物質を吸着することにより体外に排出する機能を有する球形吸着炭、クレメジンが、腎不全ラットにおけるＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現へ与える影響を調べた。１０週齢のオスのWistarラットに対し５／６腎摘出を施し、慢性腎不全ラットを作成した。腎摘後１０週に血圧、採血、２４時間蓄尿を行い、コントロール群１３、クレメジン群１１に振り分け、クレメジン（粉餌に８％混合）投与を開始した。４週間投与を行った後に再び血圧測定、採血、２４時間蓄尿を行った後、安楽死させた。摘出腎臓からＲＮＡを抽出し、SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製した後、ＧＡＰＤＨを内部標準としてＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を測定した（図５）。クレメジン４週投与後のＣｃｒ（クレアチニンクリアランス；Creatinine Clearance）が１．０ｍｌ／ｍｉｎから２．０ｍｌ／ｍｉｎのラット（コントロール１０、クレメジン８）に対しＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡの発現量をｔ検定にて検定したところ、有意差が確認された。すなわち、腎不全ラットに対するクレメジン投与により、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現が増強されることが確認された。

［インドキシル硫酸及び１−メチルアデノシンによるエリスロポエチン発現抑制作用］
インドキシル硫酸及び１−メチルアデノシンがエリスロポエチン転写活性へ与える影響を調べるため、マウスエリスロポエチン遺伝子の５’上流域を用いたルシフェラーゼアッセイを以下の方法で行った。

［プラスミドＤＮＡ］
マウスエリスロポエチン遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性ルシフェラーゼアッセイ用のプラスミドベクターHE-mPro-lucは、マウスエリスロポエチン遺伝子のエクソン１の翻訳開始点を起点として−５７１から＋５３ｂｐの長さの領域を制限酵素XbaIとSacIで切り出し、ルシフェラーゼレポーターベクターpXP2（Nordeeen SK. BioTechniques. 6:454-453.1988) に挿入して作製した。

[培養細胞]
ヒト腎癌由来培養細胞株ＡＣＨＮはＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO社製）に最終濃度で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（GIBCO社製）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンと１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（GIBCO社製）となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の条件で培養した。

［トランスフェクションとルシフェラーゼレポーターアッセイ］
Ｈｅｐ３Ｂ細胞は２４穴細胞培養プレートに１穴あたり１０×１０^４個の細胞数で調整して継代し、検鏡下で７０−８０％の細胞密度となったＨｅｐ３Ｂ細胞に対してルシフェラーゼレポーターアッセイ用のプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを施行した。トランスフェクション用の溶液組成は１穴あたりHE-mPro-luc ２μｇ、pRh-TK（Promega社製）５０ｎｇ、Lipofectamine2000（Invitrogen社製）２μｌをＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（GIBCO社製）１００μｌに混合してから室温で２０分インキュベーションして調製し、無血清のＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地０．５ｍｌでプレインキュベーションした２４穴細胞培養プレートＡＣＨＮ細胞に添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の条件にて無血清かつ抗生物質添加無しで４時間インキュベーションした。その後、インドキシル硫酸（１０μＭ）、１−メチルアデノシン（１μＭ）、又はＤＭＳＯ（０．１％）を添加した通常培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ_２／１％Ｏ_２の低酸素条件で３６時間インキュベートした。その後、培地を無血清のＰＢＳ ０．５ｍｌに交換して細胞を穏やかに洗浄後ＰＢＳを吸引除去する作業を２回施行してから、passive lysis buffer（Promega社製）１００μｌを加えて２０分室温にて混和し溶解した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはDual Luciferase Reporter Assay System（Promega社製）を使用し、測定はルミノメーターLumat LB9507（NERTHOLD TECHNOLOGIES社製）を用いてFire fly及びRenillaのルシフェラーゼ量を測定した。そして、Fire flyルシフェラーゼ量をRenillaルシフェラーゼ量で割ることにより、エリスロポエチン遺伝子の転写活性を算出した。

その結果、ＤＭＳＯを添加したコントロールに比べ、インドキシル硫酸の添加によりエリスロポエチン遺伝子の転写活性は５３％、１−メチルアデノシンの添加によりエリスロポエチン遺伝子の転写活性６３％に減少した（図６）。すなわち、尿毒症物質であるインドキシル硫酸及び１−メチルアデノシンがエリスロポエチン遺伝子の転写活性を有意に低下させることが明らかとなった。

［インドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制及びＧＡＴＡ３発現誘導作用］
次に、インドキシル硫酸及び１−メチルアデノシンがＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子転写活性へ与える影響を調べるため、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写調節領域及びＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性を検出するルシフェラーゼアッセイを以下の方法で行った。

［プラスミドＤＮＡ］
ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性ルシフェラーゼアッセイ用のプラスミドベクターSLCO4C1-3886/+110-pGL3cは、翻訳開始点より−３８８６から＋１１０ｂｐの長さの領域をＰＣＲ法を用いて増幅し、pGL3 basic luciferase expression vector（Promega社製）に挿入して作製した。ＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性ルシフェラーゼアッセイ用のプラスミドベクターpGATA3-lucは、ＧＡＴＡ３プロモーター領域の３．５ｋｂを制限酵素BamHIとNcoIで切り出し、ルシフェラーゼ蛋白をコードする２ｋｂの遺伝子カセットと連続してpBluscriptSK+（Novagen社製）ベクターに挿入することで作製した。

［トランスフェクションとルシフェラーゼレポーターアッセイ］
ＡＣＨＮ細胞は上述の方法で維持し、２４穴細胞培養プレートに１穴あたり２０×１０^４個の細胞数で調整して継代し、検鏡下で７０−８０％の細胞密度となったＡＣＨＮ細胞に対してルシフェラーゼレポーターアッセイ用のプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを施行した。トランスフェクション用の溶液組成は、１穴あたりFire fly luciferase vector（ＳＬＣＯ４Ｃ１-3886/+110-pGL １．２μｇ又はpGATA3-luc ２μｇ）、Renilla Luciferase Reporter VectorとしてpRh-TK （Promega社製）５０ｎｇ、トランスフェクション試薬としてLipofectamine2000（Invitrogen社製）２μｌを無血清培地のＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（GIBCO社製）１００μｌに混合してから室温で２０分インキュベーションして調製した。このトランスフェクション用溶液を、無血清のＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地０．５ｍｌでプレインキュベーションした２４穴細胞培養プレートのＡＣＨＮ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて無血清かつ抗生物質添加無しで４時間インキュベーションした。その後培地をインドキシル硫酸（１００μＭ）又はＤＭＳＯを添加した通常培地（１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ_２にて４４時間インキュベーションした。その後に、培地を無血清のＰＢＳ０．５ｍｌに置換して細胞を穏やかに洗浄しＰＢＳを吸引除去する作業を２回施行してから、passive lysis buffer（Promega社製）１００μｌ加えて２０分室温にて混和し溶解した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはDual Luciferase Reporter Assay System（Promega社製）にて、ルミノメーターLumat LB9507（NERTHOLD TECHNOLOGIES社製）を用いてFire fly及びRenillaのルシフェラーゼ量を測定した。そして、Fire flyルシフェラーゼ量をRenillaルシフェラーゼ量で割ることにより、ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子及びＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性を算出した。

ＤＭＳＯを添加したコントロールサンプルの転写活性を１とした場合の、インドキシル硫酸を添加した場合のＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子又はＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性を図７に示す。その結果、インドキシル硫酸添加により、ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写活性が減少し、ＧＡＴＡ３の転写活性が増加することが示された。すなわち、インドキシル硫酸は、転写レベルでＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子発現を減少させ、ＧＡＴＡ３遺伝子発現を増加させる制御を行うことが示された。

［腎性貧血患者に対するクレメジン投与によるエリスロポエチン発現増強作用］
腎性貧血を示す腎不全疾患の成人男性３人、女性１人の計４人の患者に、クレメジンを１日６ｇ、３回に分けて、２２ヶ月にわたり投与した。クレメジン投与の前と後に血液を採取し、血中のエリスロポエチンの濃度をBender Med Systems社製のヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。その結果、クレメジン投与前と比較して、クレメジン投与後には、血液中のエリスロポエチン量が３人で増加し、一人では変化がなかった（図８）。腎不全によりエリスロポエチン量が減少することが知られており、すなわち、クレメジン投与により、内因性エリスロポエチンの発現量が増加した結果、エリスロポエチン量の減少が防がれ、増加したことが示唆された。

以上より、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸が、ＧＡＴＡ３の発現を増強すること、ＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現を抑制すること、さらにエリスロポエチンの発現を抑制することが明らかになった。そして、クレメジンの投与により、ＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現が増強し、エリスロポエチン発現も増強されることが示された。これは、クレメジンに尿毒症物質が吸着、排除されることによって、尿毒症物質によるＧＡＴＡ３の発現増強及びＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現抑制が抑えられ、それにより、ＧＡＴＡ３によるエリスロポエチンの発現抑制が解除され、またＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現が増強されることによりＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターによる尿毒症物質の排泄が促進されることにより、内因性エリスロポエチン発現も増強されると考えられる（図９）。

［腎不全ラットにおけるクレメジン投与により変動する物質のＣＥ−ＭＳ解析］
１０週齢のオスのWistarラットに対し５／６腎摘出を施し、慢性腎不全ラットを作成した。基本飼料を与えた慢性腎不全ラット（ｎ＝１２）をコントロール群、クレメジンを添加した飼料（粉餌に８％混合）を与えた慢性腎不全ラット（ｎ＝１０）をクレメジン群、クレメジを添加した飼料（粉餌に８％混合）を与えた正常なWistarラットをSham群（ｎ＝３）とした。４週間飼育した後、血漿サンプルを採取し、以下の方法でＣＥ−ＭＳ分析を行った。内標準物質を調整したメタノール溶液を各血漿サンプルに添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。

その結果、コントロール群とクレメジン群で有意差のあるアニオン６物質は、４−オキソペンタン酸（4-oxopentanoate）、ｏ−ヒドロキシ安息香酸（o-Hydroxybenzoate）、馬尿酸（Hippurate）、３−インドキシル硫酸（3-Indoxyl sulfate）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（N-Acetylneuraminate）、コール酸（Cholate）であり、これらは全てコントロール群に比べクレメジン群で低い値であった。また、コントロール群とクレメジン群で有意差のあるカチオン１５物質は、グリシン（Glycine）トリメチルアミンＮ−オキシド（Trimethylamine N-oxide）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、シトシン（Cytosine）、ニコチン酸アミド（Nicotinamide）、イミダゾール−４−酢酸（Imidazole-4-acetate）、クレアチン（Creatine）、アスパラギン（Asparagine）、γ−グアニジノブチラート（γ-Guanidinobutyrate）、γ−ブチロベタイン（γ-Butyrobetaine）、グルタミン（Glutamine）、アラントイン（Allantoin）、Ｎ−γ−エチルグルタミン（N-γ-Ethylglutamine）、トリプトファン（Tryptophan）、グリセリルホスホリルコリン（Glycerophosphorylcholine）であり、このうちトリメチルアミンＮ−オキシドとトリプトファンはコントロール群に比べクレメジン群で有意に高い値であった。また、カチオンである５−メチルシトシン（5-Methylcytosine）とアントラニル酸（Anthranilate、別名ｏ−アミノ安息香酸）はコントロール群のみで検出され、Shamやクレメジン群ではほとんど検出されなかった。

本発明は、腎性貧血治療薬や、尿毒症物質排泄薬の分野に好適に利用することができる。

Claims (9)

1. 尿毒症物質吸着剤を有効成分とする内因性エリスロポエチン発現増強剤。
2. 尿毒症物質吸着剤が活性炭である請求項１記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤。
3. 活性炭が球形吸着炭である請求項２記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤。
4. 請求項１〜３のいずれか記載の内因性エリスロポエチン発現増強剤を含む腎性貧血治療薬。
5. 尿毒症物質吸着剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤。
6. 尿毒症物質吸着剤が活性炭である請求項５記載の有機イオントランスポーター発現増強剤。
7. 活性炭が球形吸着炭である請求項６記載の有機イオントランスポーター発現増強剤。
8. 有機イオントランスポーターが、有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１である請求項５〜７のいずれか記載の有機イオントランスポーター発現増強剤。
9. 請求項５〜８のいずれか記載の有機イオントランスポーター発現増強剤を含む尿毒症物質排泄増強剤。