JP2012072164A

JP2012072164A - リパーゼ阻害剤

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Publication number: JP2012072164A
Application number: JP2011254444A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Nakai; 正晃中井; Yuko Fukui; 祐子福井; Sumio Asami; 純生浅見; Fumio Hashimoto; 文雄橋本
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2004-07-05
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2012-04-12
Anticipated expiration: 2025-07-05
Also published as: EP1767204A1; CN1980654A; KR20070031430A; US8668921B2; JP5159108B2; EP1767204B1; ES2614410T3; SG10201403828PA; EP1767204A4; WO2006004114A1; KR20120118078A; JPWO2006004114A1; TW200605799A; KR101296418B1; KR101234392B1; JP5498471B2; KR101296420B1; WO2006004114A9; KR20120118077A; US20080317821A1

Abstract

【課題】肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させる脂肪の過剰摂取の抑制する手段として、食事制限により摂取カロリーを減らすのではなく、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制する飲食料、医薬品の提供。
【解決手段】茶に起源を発するフラバン−３−オールの２量体（アッサミカイン類、テアシネンシン類、テアフラピン類）を含むリパーゼ阻害剤および該阻害剤を添加した飲食料、医薬品。
【選択図】なし

Description

本発明は、茶由来のフラバン−３−オールの２量体を含むリパーゼ阻害剤を提供する。

近年、日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取が増加の一途をたどっている。平成11年国民栄養調査によると、エネルギー摂取量は年々減少しているにもかかわらず、その脂質エネルギー比は適正比率である25%を超え、中性脂肪値やコレステロール値が高い人の割合は60歳以上で5〜6割に認められたとの報告がある（厚生労働省平成11年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 2001; 98(5): 577-588）。

肥満は現代社会における最も重大な疾患の1つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。この肥満に対する治療薬として、国内では、食欲抑制剤のマジンドール(登録商標)が唯一承認されているが、口渇、便秘、胃部不快感、悪心・嘔吐等の副作用が報告されている（臨床評価 1985; 13(2): 419-459、臨床評価 1985; 13(2): 461-515）。また、海外においては、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル(登録商標)が肥満改善薬として市販されているが、やはり脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告され、必ずしも安全とは言いがたい（Lancet 1998; 352: 67-172）。

肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段ではあるものの、しっかりとした栄養指導を受けなければならず、日常生活においての実行は困難である場合が多い。そこで、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制することは、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進の目的で、現実的で有用な方策であると考えられる。

このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。今までに食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える食品素材としては、膵リパーゼ阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（J. Nutr. 1988; 128: 56-60、日本臨床・食糧学会誌 1999; 52(2): 71-77、健康・栄養食品研究 2002; 5(3): 131-144）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を持つジアシルグリセロール（J. Am. Coll. Nutr. 2000; 19(6): 789-796、Clin. Chim. Acta. 2001; 11(2): 109-117）、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）などが特定保健用食品として発売されている。

一方、植物由来のリパーゼ阻害活性物質も最近注目されつつあり、特に、リパーゼ阻害活性を有するポリフェノール類に関しては、植物樹皮由来のタンニン（特公昭60-11912）、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体(特開平8-259557)、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品（特開平3-228664）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶、などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平3-219872）、フラボンおよびフラボノール類（特開平7-61927）ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平1-102022）、トリテルペン類化合物およびその誘導体（特開平9-40689）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平9-291039）などが報告されており、またブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用(Nutrition 2003; 19(10): 876-879)、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用(J. Nutr. 2002; 132: 1819-1824)、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用(Int. J. Obes. 1999; 23: 98-105)などが知られている。

しかしながら、上に示した既報の植物由来のリパーゼ阻害剤は、効果が十分なものとはいえない。例えば、ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にリパーゼ阻害活性を維持させることは困難である。また、嗜好性の低い植物由来の阻害剤の場合、飲食物として利用するには、香味に影響を及ぼすという問題がある。例えば、ウーロン茶の脂質改善効果を示した報告には、市販ウーロン茶を1日1330mlずつ6週間飲用させ、血中中性脂肪値の有意な低下が認められたとの報告（日本栄養・食糧学会誌 1991; 44(4): 251-259）や、単純性肥満症の男女102名を対照に、ウーロン茶（2g×4/日）を6週間連続経口摂取させた結果、67％の被験者に1kg以上の体重減少が認められ、さらに、血中中性脂肪値が高値を示した被験者においてウーロン茶摂取後に有意な改善効果が認められたとの報告（日本臨床栄養学会雑誌 1998; 20(1): 83-90）がある。このようにウーロン茶の大量飲用では効果が認められているものの、日常生活のなかで続けていくことは難しい。また、単純に濃縮したウーロン茶を提供したとしても、苦味・渋味が強く、カフェイン量も増えることより、現実的な方策として適当ではない。

特公昭60-11912 特開平8-259557 特開平3-228664 特開平3-219872 特開平7-61927 特開平1-102022 特開平9-40689 特開平9-291039

厚生労働省平成11年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 2001; 98(5): 577-588 臨床評価 1985; 13(2): 419-459、臨床評価 1985; 13(2): 461-515 Lancet 1998; 352: 67-172 J. Nutr. 1988; 128: 56-60, 1988 日本臨床・食糧学会誌 1999; 52(2): 71-77 健康・栄養食品研究 2002; 5(3): 131-144 J. Am. Coll. Nutr. 2000; 19(6): 789-796 Clin. Chim. Acta. 2001; 11(2): 109-117 Nutrition 2003; 19(10): 876-879 J. Nutr. 2002; 132: 1819-1824 Int. J. Obes. 1999; 23: 98-105 日本栄養・食糧学会誌 1991; 44(4): 251-259 日本臨床栄養学会雑誌 1998; 20(1): 83-90 Chem. Pharm. Bull 1987; 35(2): 611-616 Chem. Pharm. Bull 1989; 37(12): 3255-3563 Chem. Pharm. Bull. 1988; 36(5): 1676-1684 Chem. Pharm. Bull. 1983; 31(11): 3906-3914 Chem. Pharm. Bull. 1992; 40(6): 1383-1389 Chem. Pharm. Bull. 1989; 37(1): 77-85 FEMS Microbiol. Lett. 1996; 143: 35-40

本発明は、嗜好性が高い茶に含まれる成分に着目し、茶に起源を発するフラバン−３−オールの２量体の少なくとも一種を含むリパーゼ阻害剤を提供する。

本発明はさらに、上記リパーゼ阻害剤が添加され、嗜好性が高くて、かつ血中の中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を提供する。

本発明はさらに、上記リパーゼ阻害剤を含み、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑える医薬組成物を提供する。

上記課題を解決する手段として、茶より脂肪吸収に必須な膵リパーゼを阻害する成分を見出し、そこに存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価し、フラバン−３−オールの２量体に強いリパーゼ阻害活性があることを突き止めた。

より具体的には、本発明のリパーゼ阻害剤は、次式：

（式中、Ｇはガロイル基である）
で表されるアッサミカイン類、次式：

（式中、Ｒ₁はＧまたはＨであり、Ｒ₂はＧである)
で表されるテアシネンシン類および次式：

（式中、Ｒ₁およびＲ₂はそれぞれ独立にＧまたはＨである）
で表されるテアフラビン類から選択されるフラバン−３−オールの２量体のうち少なくとも一種を含むことを特徴とする。なお、ガロイル基Ｇの構造式は、

である。

本発明は、茶葉に由来するフラバン−３−オールの２量体の少なくとも一種を含むリパーゼ阻害剤を添加し、香味を損なうことなく、嗜好性の高くて、かつ中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料が提供できる。食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事とともに摂取することが望ましく、茶から得られた有効成分を強化した飲料は意義が大きい。特に、これらの成分を増強する事により、抗肥満作用、健康増進を目的とした飲料の提供が可能になった。

実施例３でリパーゼ阻害活性の評価に供した化合物の化学構造式を示す。

本発明のリパーゼ阻害剤に含まれるアッサミカイン類の例として、アッサミカインA (assamicain A)(化合物9)およびアッサミカインB (assamicain B)(化合物10)があげられる。

本発明のリパーゼ阻害剤に含まれるテアシネンシン類の例として、テアシネンシンA (theasinensin A)(化合物11)、テアシネンシンB (theasinensin B)(化合物12)、テアシネンシンD (theasinensin D)(化合物13)およびデヒドロ-ジカテキンA (dehydro-dicatechin A)(化合物14)があげられる。

本発明のリパーゼ阻害剤に含まれるテアフラビン類の例として、テアフラビン (theaflavin)(化合物15)、テアフラビン 3'-O-ガレート(theaflavin 3'-O-gallate)(化合物16)およびテアフラビン 3,3'-O-ガレート(theaflavin 3,3'-O-gallate)(化合物17)があげられる。

本発明のフラバン−３−オールの２量体は、市販されているものもあるが、市販緑茶、紅茶、ウーロン茶等の天然材料から抽出して得ることができる。例えば、ウーロン茶葉からのフラバン−３−オールの２量体の精製はChem. Pharm. Bull. 1987; 35(2): 611-616, Chem. Pharm. Bull. 1988; 36(5): 1676-1684, Chem. Pharm. Bull. 1983; 31(11): 3906-3914, Chem. Pharm. Bull. 1992; 40(6): 1383-1389, Chem. Pharm. Bull. 1989; 37(12): 3255-3563, Chem. Pharm. Bull. 1989; 37(1): 77-85で報告されている。デヒドロジカテキンＡは、FEMS Microbiol. Lett. 1996; 143: 35-40に記載された方法で、本明細書の実施例２に記載するようにして取得できる。
リパーゼ阻害剤
本発明のフラバン−３−オールの２量体は、他の成分を含まずに単独でリパーゼ阻害剤として使用することもでき、または溶媒や固体担体とともにリパーゼ阻害剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明のリパーゼ阻害剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、中性脂肪の蓄積を予防するための食品、医薬品の有効成分としての使用が例示される。
リパーゼ阻害活性測定方法
本発明のリパーゼ阻害剤は、リパーゼ、特に膵リパーゼに対する強い阻害作用を有する。その阻害活性は、実施例１に具体的に記載する方法で測定できる。
リパーゼ阻害剤含有飲食料
本発明のフラバン−３−オールの２量体を含むリパーゼ阻害剤を、リパーゼ阻害活性成分として飲食料に添加して、食事からの脂肪分の摂取に伴う血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止し、および／または上昇した血中中性脂肪を低減させることができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は、通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、調味料、ドレッシング、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。

飲食料に対する本発明のリパーゼ阻害剤の添加量は、１食あたりのフラバン−３−オールの２量体の摂取量が0.1mg〜10gとなるよう添加する。ただし、本発明のフラバン−３−オールの２量体は、食品に由来するため、安全性が非常に高く、飲食料に対する添加量に実質的上限はない。
リパーゼ阻害剤含有医薬品
本発明のフラバン−３−オールの２量体を含むリパーゼ阻害剤は、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止および／または低下させるための薬剤の有効成分としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤に含まれる本発明のフラバン−３−オールの２量体の量は、１回服用量当たり、0.1mg〜10gである。

本発明の医薬品は、リパーゼ阻害成分の安全性が高いため、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、生活習慣病としての肥満の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。

実施例１リパーゼ阻害活性の測定
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（4-UMO）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。

測定にあたり、緩衝液は、150 mM NaCl、1.36mM CaCl₂を含む 13 mM Tris-HCl (pH 8.0) を用いた。基質である4-UMO（Sigma社製）は0.1MのDMSO溶液として調製したものを上記緩衝液で1000倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（Sigma社製）を同様に上記緩衝液を用い400U/ml溶液として調製したものを酵素測定に供した。

酵素反応は、25℃条件下において、96 穴マイクロプレートに50 μｌの4-UMO緩衝液溶液、25 μl の蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、25 μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。30分間反応を行った後に、100 μｌの0.1M クエン酸緩衝液（pH 4.2）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長355nm、蛍光波長460nm）を蛍光プレートリーダー（Labsystems社製 Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。

被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して50%阻害を与える試料量 IC₅₀（μM）として求めた。
測定サンプル
カテキン（C）、エピカテキン（EC）、ガロカテキン（GC）、エピガロカテキン（EGC）、カテキンガレート（CG）、エピカテキンガレート（ECG）、ガロカテキンガレート（GCG）、エピガロカテキンガレート（EGCG）は和光純薬（株）より購入した。

カテキン類の2量体のうち、デヒドロジカテキンAは茶葉酵素による合成を行った。方法は実施例2に示した。

それ以外の化合物は下記論文に記載の方法で得た。Chem. Pharm. Bull. 1987; 35(2): 611-616, Chem. Pharm. Bull. 1988; 36(5): 1676-1684, Chem. Pharm. Bull. 1983; 31(11): 3906-3914, Chem. Pharm. Bull. 1992; 40(6): 1383-1389, Chem. Pharm. Bull. 1989; 37(12): 3255-3563, Chem. Pharm. Bull. 1989; 37(1): 77-85。概略を述べると、ウーロン茶葉を80%アセトンにて抽出した後、アセトンを除去し、セファデックスLH-20（ファルマシア社製）にて水、メタノール、50%アセトンを用いて分画を行った。各分画物をMCI-gel CHP-20P（三菱化学社製）およびFuji gel ODS-G3（富士シリシア化学社製）により精製した。
実施例２デヒドロジカテキンAの合成
茶葉品種・京研129号（京都府立茶業研究所より供与）100gを液体窒素中で粉砕し、抽出用緩衝液（0.01M KH₂PO₄と0.02M K₂HPO₄によりpH7.0に調整）600mlとポリアミド100mlを加え撹拌後、ガーゼで濾過した。ろ液を8000rpmで20分間遠心分離した。上清500mlにあらかじめ-20℃に冷却したアセトン500mlを加え撹拌後、4℃で1時間静置した。この溶液を8000rpmで4℃、20分間遠心分離し、白色の沈殿を得た。この沈殿を反応用緩衝液（0.01Mクエン酸と0.02M KH₂PO₄でpH5.6に調整）100mlに溶解し酵素溶液とした。

酵素溶液100mlにD-(+)-catechinを100mgと8.8mMのH₂O₂を加え、32℃で静置反応を行った。5時間後に、100mlの1%TFAを含む90%アセトニトリルを加え反応を停止した。この溶液を水で5倍希釈し、吸着樹脂HP-20（200ml、三菱化学社製）に負荷し、水洗い後、400mlの0.1%TFAを含む90%アセトニトリルで反応生成物を溶出し、減圧濃縮後、凍結乾燥した。反応物は以下の分取HPLCにより精製した。
カラム： Develosil C30-UG-5（20mmφ×250mm，野村化学社製）
移動相：(A) 0.1%TFA/H₂O、(B)90%CH₃CN，0.1％TFA
検出：A280nm
流速：6ml/min
グラジエント：B20％からB70％のリニアグラジエント溶出を40分間行った。

このクロマトグラフィーにより溶出時間21分にdehydro-dicatechinAが得られた。（参考論文：FEMS Microbiol. Lett. 143 35-40, 1996）
実施例３カテキン類およびそれらの2量体のリパーゼ阻害活性
茶の主要なポリフェノールであるカテキン類（単量体）およびカテキン類が重合し、2量体となった化合物について、実施例1の方法に従ってリパーゼ阻害活性を測定した。その結果を表1に示した。なお、図1には評価に供した化合物の化学構造式を記載した。茶に存在している主要なカテキン類（8種類）のなかでリパーゼ阻害活性を示したものは、没食子酸がエステル結合しているフラバン-3-オールであった。特に茶に多く含まれるエピガロカテキンガレート（EGCG）は主要なカテキン類の中で最も強い活性を示した。

2量体のポリフェノールでは、構造内にガレート基を有するもの、特にEGCGの2量体がEGCGそのものよりも強いリパーゼ阻害活性を有することが判明した。

以上の結果より、茶には主要なカテキン類（8種）の他にも、非常に強い活性を有する2量体が存在することが明らかとなった。

Claims

次式：

（式中、Ｇはガロイル基である）
で表されるアッサミカイン類、および次式：

（式中、Ｒ_１はＧまたはＨであり、Ｒ_２はＧである）
で表されるテアシネンシン類の少なくとも一種を有効成分として含む、リパーゼ阻害剤。
該アッサミカイン類から選択される少なくとも一種を含む、請求項１記載のリパーゼ阻害剤。
該テアシネンシン類から選択される少なくとも一種を含む、請求項１記載のリパーゼ阻害剤。
食事由来の脂肪の吸収抑制用である、請求項１〜３のいずれか１項記載のリパーゼ阻害剤。
血中中性脂肪の上昇抑制用である、請求項１〜３のいずれか１項記載のリパーゼ阻害剤。
中性脂肪の蓄積予防用である、請求項１〜３のいずれか１項記載のリパーゼ阻害剤。
次式：

（式中、Ｇはガロイル基である）
で表されるアッサミカイン類、および次式：

（式中、Ｒ_１はＧまたはＨであり、Ｒ_２はＧである）
で表されるテアシネンシン類の少なくとも一種を
用いる、食事由来の脂肪の吸収を抑制する方法、又は血中中性脂肪の上昇を抑制する方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。