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JP2011520961A - 多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質 - Google Patents

多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質 Download PDF

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JP2011520961A JP2011510517A JP2011510517A JP2011520961A JP 2011520961 A JP2011520961 A JP 2011520961A JP 2011510517 A JP2011510517 A JP 2011510517A JP 2011510517 A JP2011510517 A JP 2011510517A JP 2011520961 A JP2011520961 A JP 2011520961A
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マルコ・エム・ゴッターディス
ジョーン・カーボニ
リカード・エム・アッター
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Abstract

本発明は、ポリペプチドリンカーを介して結合している少なくとも２つのフィブロネクチン足場ドメインを含む多価ポリペプチドに関する。本発明はまた、診断、研究および治療的用途において使用するための多価ポリペプチドに関する。本発明はさらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞に、またこの革新的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

Description

関連出願
本出願は、２００８年５月２２日に出願された米国仮出願第６１／１２８，６５１号；２００９年４月１７日に出願された第６１／２１２，９８２号；および２００９年５月１４日に出願された第６１／１７８，３９５号の利益を主張する。上記で参照された出願のすべての教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、診断、研究および治療的用途において使用するための、多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインに関する。本発明はさらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞に、またこの革新的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
フィブロネクチンをベースとする足場は、対象とする任意の化合物と結合するよう進化させることができるタンパク質のファミリーである。通常、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメインに由来する足場を使用するこれらのタンパク質は、天然の抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体）に特徴的な形で機能し、さらに、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、普通は抗体における構造および機能の喪失につながる条件下でも、フォールディング、安定性および溶解性が最適となるように設計されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の一例として、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ，ａ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）がある。
フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞−細胞相互作用において重要な役割を果たす大きなタンパク質であり、３種の（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）の小さなドメインの多数の反復からなる（Baron et al., 1991）。Ｆｎ３自体が、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカイン受容体、シャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）および炭水化物結合ドメインの部分を含む大きなサブファミリーのパラダイムである。総説については、Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 1;89(19):8990-4; Bork et al., J Mol Biol. 1994 Sep 30;242(4):309-20; Campbell & Spitzfaden, Structure. 1994 May 15;2(5):333-7; Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 May 13;238(4):528-39）参照。
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、βまたはβ様鎖、Ａ：ループ、ＡＢ；βまたはβ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；βまたはβ様鎖、Ｃ；ループ、ＣＤ；βまたはβ様鎖、Ｄ；ループ、ＤＥ；βまたはβ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；βまたはβ様鎖、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびβまたはβ様鎖、Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造上および機能上の両面で類似している。米国特許第７，１１５，３９６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＴＮＦαバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。米国公開第２００７／０１４８１２６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＶＥＧＦＲ２バインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。
治療および診断目的の両方で、改善されたフィブロネクチンドメイン足場タンパク質を得ることは有利であろう。本開示内容は、このような改善されたタンパク質を提供する。
本出願の一態様は、第１の標的分子と５００ｎＭ未満のＫＤで結合する第１のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むＮ末端ドメインと、第２の標的分子と５００ｎＭ未満のＫＤで結合する第２の１０Ｆｎ３を含むＣ末端ドメインとを含む多価ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、５〜５０、５〜２０、５〜１０、１０〜５０または１０〜２０個のアミノ酸を有するポリペプチドなどのポリペプチドリンカーを介して連結している。いくつかの実施形態では、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２１および２２などのグリシン−セリンベースのリンカーから選択されるポリペプチドを介して連結している。いくつかの実施形態では、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２０に表されるポリペプチドを介して連結している。いくつかの実施形態では、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号３２、３３および３４などのグリシン−プロリンベースのリンカーから選択されるポリペプチドを介して連結している。いくつかの実施形態では、第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号６０、６１および６２などのプロリン−アラニンベースのリンカーから選択されるポリペプチドを介して連結している。
１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループ、ＥＦ；およびループ、ＦＧを各々含み、各々独立に、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１によって表される天然に存在するヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも５０、６０、７０または８０％同一であるアミノ酸配列を各々含む。
いくつかの実施形態では、第１の１０Ｆｎ３ドメインは、第１の標的分子と１００ｎＭ未満のＫＤで結合し、第２の１０Ｆｎ３ドメインは、第２の標的分子と１００ｎＭ未満のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的分子および第２の標的分子は同一である。いくつかの実施形態では、第１の標的分子および第２の標的分子は異なっている。いくつかの実施形態では、第１の標的分子は、ＩＧＦ−ＩＲであり、第２の標的分子は、ＶＥＧＦＲ２である。いくつかの実施形態では、第１の標的分子は、ＶＥＧＦＲ２であり、第２の標的分子は、ＩＧＦ−ＩＲである。
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの少なくとも２つのループが変化している。いくつかの実施形態では、ループＢＣおよびループＦＧは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの少なくとも３つのループが変化している。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの少なくとも２つのループが、標的分子と結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインの３つのループが標的分子と結合する。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２の１０Ｆｎ３ドメインは、そのＣ末端で、配列番号１７、１８、１９、５０、５１、５２、７１もしくは７２から選択されるアミノ酸配列またはＥ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳもしくはＥＧＣと連結している。いくつかの実施形態では、第１の１０Ｆｎ３ドメインは、そのＣ末端で、配列番号１９もしくは５０のアミノ酸配列またはＥ、ＥＩもしくはＥＩＤと連結している。いくつかの実施形態では、第２の１０Ｆｎ３ドメインは、そのＣ末端で、配列番号１７、１８、５１、５２、７１もしくは７２のアミノ酸配列と連結している。
いくつかの実施形態では、配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のいずれかと少なくとも７０、８０、９０、９５または１００％同一のアミノ酸配列を含む多価ポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質およびＦｃ断片から選択される１種または複数の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリオキシアルキレン部分であり、前記ポリオキシアルキレン部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＣｙｓまたはＬｙｓアミノ酸を介して多価ポリペプチドと共有結合によって連結している。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．５ｋＤａから約１００ｋＤａの間である。
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリペプチドの１つまたは複数の薬物動態特性、例えば、バイオアベイラビリティ、血清半減期、インビボ(in vivo)の安定性および薬物分布を改善する。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、多価ポリペプチドの血清半減期を、多価ポリペプチド単独と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００％またはそれ以上増大する。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分をさらに含む多価ポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日の血清インビボ半減期を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分および１０Ｆｎ３ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖(polymeric sugar)またはポリエチレングリコール部分を介して連結している。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分および１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１７、１８または２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを介して連結している。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、結合部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、抗体部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体部分は、５０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、４０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合しているＦｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、ダイアボディーまたは全抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ヒトタンパク質と結合する。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＧＦＲまたはヒトＣＤ３と結合する。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、リポカリンの誘導体；テトラネクチンの誘導体；アビマー（ａｖｉｍｅｒ）；またはアンキリンの誘導体をさらに含む。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、ヒトタンパク質と結合する。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＧＦＲまたはヒトＣＤ３と結合する。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を介して連結している結合部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．５ｋＤａから約１００ｋＤａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＣｙｓまたはＬｙｓ残基を介してポリペプチドおよび結合部分とコンジュゲートしている。
一態様では、本出願は、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを除去するよう脱免疫化されている（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）多価ポリペプチドを提供する。一態様では、本出願は、１つまたは複数のＢ細胞エピトープを除去するよう脱免疫化されている多価ポリペプチドを提供する。
一態様では、本出願は、１０Ｆｎ３ドメインが、ａ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインコード配列とは異なる候補フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメイン配列を各々含む候補核酸分子の集団を生成する工程であって、前記核酸分子が、前記候補１０Ｆｎ３ドメインコード配列と作動可能に連結している翻訳開始配列および開始コドンを各々含み、各々が３’末端で核酸−ピューロマイシンリンカーと作動可能に連結している工程と、ｂ）前記候補１０Ｆｎ３ドメインコード配列をインビトロ(in vitro)で翻訳して、候補核酸−１０Ｆｎ３融合物の集団を生成する工程と、ｃ）候補核酸−１０Ｆｎ３融合物の前記集団を標的分子と接触させる工程と、ｄ）そのタンパク質部分が、標的分子に対する前記ヒト１０Ｆｎ３の結合親和性または特異性と比較して変化している、標的分子に対する結合親和性または特異性を有する、核酸−１０Ｆｎ３融合物を選択する工程とを含む方法によって選択される、多価ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、選択された核酸−１０Ｆｎ３融合物は、１個または複数の核酸残基を変化させることおよび標的分子を用いて融合物を再スクリーニングして改善されたバインダーを選択することによってさらに最適化される。いくつかの実施形態では、候補核酸分子はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、候補核酸分子はＤＮＡである。
一態様では、本出願は、多価ポリペプチドを含む医薬上許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本質的にエンドトキシンを含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、微生物汚染を実質的に含まず、これによって、インビボ投与に適したものとなる。組成物は、例えば、ＩＶ、ＩＰまたは皮下投与のために製剤され得る。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される多価ポリペプチドをコードする核酸を提供する。このようなタンパク質のポリヌクレオチドを含有するベクターも同様に含まれる。適したベクターとして、例えば、発現ベクターが挙げられる。本出願のさらなる態様は、多価ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、ベクターまたは発現ベクターを含む細胞を提供する。配列は、使用される細胞種において発現を最大にするよう最適化されることが好ましい。発現は大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）においてであることが好ましい。多価ポリペプチドはまた、例えば、酵母（例えば、ピキア（ｐｉｃｈｉａ）またはセレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または藍藻を含む真核細胞微生物において発現され得る。酵母細胞は、所望のグリコシル化を生じるよう操作され得る。本発明の細胞は、哺乳類細胞であり得る。一態様では、哺乳類細胞は、所望のグリコシル化を生じるよう操作され得る。一態様では、細胞は、フィブロネクチンベースの足場タンパク質を発現する。一態様では、フィブロネクチンベースの足場タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、選択された細胞種における発現について最適化されたコドンである。また、多価ポリペプチドをコードする核酸を含むヌクレイック（ｎｕｃｌｅｉｃ）、ベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程と、発現された多価ポリペプチドを培養物から回収する工程とを含む、本明細書に記載される多価ポリペプチドを生成する方法も提供される。
図１ 種々のＨＴＰＰ精製されたＶ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースのバインダーは、同様の発現プロフィールを示した。以下を示す：「ＧＳ５」（配列番号２１）および「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図２ ＨＴＰＰ精製されたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２ＢのＳＥＣは、主に単量体タンパク質を示す。 図３ ＨＴＰＰ精製されたコンストラクトＶ２Ｂ−Ｆｎ−３８５Ａ０８のＳＥＣは、単量体および二量体タンパク質の混合物を示す。 図４ 特定のＶ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースのバインダーのＬＣ−ＭＳによって測定される分子量およびＤＳＣによるＴｍ決定を示す。以下を示す：「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図５ ３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ペグ化されている、ｈｉｓタグなし）のＳＥＣは、このタンパク質が９５．１％単量体であることを示す。 図６ ３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ペグ化されている、ｈｉｓタグなし）のＤＳＣ分析は、タンパク質が、５６℃で半分がフォールディングされておらず、４５℃までアンフォールディングは検出されないということを示した。 図７ コンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの４０ｋＤの分岐または直鎖ペグ化型を投与されたマウスは、分岐の１４．６時間対直鎖の１０．５時間の半減期を示した。いくつかの個々のマウスには、図に示されるように分岐または直鎖ペグ化型のコンストラクトを投与した。 図８ ＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲタンデムは、ＶＥＧＦＲ２またはＩＧＦ−ＩＲ個々のバインダーと、細胞において等しい効力を有する。コンストラクトは、ＩＧＦ−ＩＲとの結合についてＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、ＩＣ５０を調べるためにＢａ／Ｆ３およびＲｈ４１アッセイにおいて試験した（実施例５および７を参照）。分子型の配列は、実施例１に記載されている。以下を示す：「ＧＳ５」（配列番号２１）および「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図９ 特定のＶ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースのバインダーを、ＩＧＦ−ＩＲおよびＶＥＧＦＲ２に対する動態的挙動について評価した。以下を示す：「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図１０ ペグ化コンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓのＨｉｓタグおよび非ｈｉｓタグ型を、ＩＧＦ−ＩＲおよびＶＥＧＦＲ２に対するその動態的挙動について評価した。 図１１ 細胞と結合したＶＥＧＦＲ−２について、標識されたＰｅｇ−Ｖ２ＢＳｈｏｒｔと競合する、Ｐｅｇ−Ｖ２ＢＳｈｏｒｔおよび３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ＰＥＧおよびｈｉｓタグを有する）の相対能力が、細胞株２９３：ＫＤＲで評価された。 図１２ 細胞と結合したＩＧＦ−ＩＲについて、標識されたＡＴ５８０−ＰＥＧ２０−ＡＴ５８０と競合するＡＴ５８０−ＰＥＧ４０および３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ＰＥＧおよびｈｉｓタグを有する）の相対能力を細胞株Ｒ＋で評価した。 図１３ Ｖ／Ｉ １０Ｆｎ３をベースとするバインダーを、細胞ベースのアッセイＲｈ４１およびＨＭＶＥＣ−Ｌにおいて評価した。以下を示す：「ＧＳ５」（配列番号２１）および「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図１４ ペグ化コンストラクト３８５Ａ９８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓのｈｉｓタグおよび非ｈｉｓタグを含む選択されたコンストラクトを、細胞ベースのアッセイＮＣＩ−Ｈ９２９およびＢａ／Ｆ３において対照と比較して、その活性について評価した。 図１５ ＨＥＫ２９３／ＫＤＲおよびＰＡＥ／ＫＤＲ細胞は、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲを発現し、両受容体は、その同族リガンドの存在下で活性化される。ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３およびＰＡＥ細胞を、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１または両因子（ＶＥＧＦ／ＩＧＦ１）で刺激した。細胞溶解物のウエスタンブロットを、リン酸化ＶＥＧＦＲ（ｐ−Ｆｌｋ−１／Ｔｙｒ９９６）、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲ、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＭＡＰＫまたは総アクチンについてプロービングした。 図１６ フィブロネクチンベースの足場多量体は、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲのリガンド誘導性リン酸化を妨げ、ＨＥＫ２９３／ＫＤＲ細胞の増殖を阻害する。細胞をＶＥＧＦおよびＩＧＦ１（「−」は、刺激されていない対照を示す）および実施例８に記載されるフィブロネクチン足場ドメインタンパク質で処理した。細胞溶解物のウエスタンブロットを、リン酸化ＶＥＧＦＲ（ｐ−Ｆｌｋ−１／Ｔｙｒ９９６）、総ＶＥＧＦＲ（Ｆｌｋ−１）、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲ、総ＩＧＦ−ＩＲ、リン酸化Ａｋｔ、総Ａｋｔ、リン酸化ＭＡＰＫ、総ＭＡＰＫ、または総アクチンについてプロービングした。細胞増殖を、種々のコンストラクトに対する曝露後の［３Ｈ］−チミジン取り込みおよびＩＣ５０として報告された結果によって評価した。以下を示す：「ＧＳ５」（配列番号２１）および「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図１７ フィブロネクチンベースの足場多量体は、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲのリガンド誘導性リン酸化を妨げ、ＨＥＫ２９３／ＫＤＲ細胞の増殖を阻害する。細胞を、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ１および実施例８に記載されるフィブロネクチン足場ドメインタンパク質で処理した。細胞溶解物のウエスタンブロットを、リン酸化ＶＥＧＦＲ（ｐ−Ｆｌｋ−１／Ｔｙｒ９９６）、総ＶＥＧＦＲ（Ｆｌｋ−１）、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲ、総ＩＧＦ−ＩＲ、リン酸化Ａｋｔ、総Ａｋｔ、リン酸化ＭＡＰＫ、総ＭＡＰＫまたは総アクチンについてプロービングした。細胞増殖を、種々のコンストラクトに対する曝露後の［３Ｈ］−チミジン取り込みおよびＩＣ５０として報告された結果によって評価した。以下を示す：「ＧＳ５」（配列番号２１）および「ＧＳ１０」（配列番号２２）。 図１８ 細胞増殖アッセイ：７２時間の曝露後のＨＭＶＥＣ細胞における種々のＶ／Ｉ １０Ｆｎ３ベースのバインダーの効果。 図１９ ウエスタンブロット解析：ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、漸増濃度の種々のコンストラクトに１時間曝露し、続いて、ＶＥＧＦ／ＩＧＦ−１リガンド（両方とも５０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）を用いて、３７℃で１０分間活性化し、その後、溶解した。未処理対処理サンプルにおいてホスホ−シグナルの比を比較することによって、ローディングコントロールとして使用されるＧＡＰＤＨに対して正規化した後に、ｐＩＧＦ−１Ｒ、ｐＡｋｔおよびｐＭＡＰＫ活性の阻害を測定した。 図２０ ウエスタンブロット解析：Ｒｈ４１細胞を、漸増濃度の化合物に対して１時間曝露し、続いて、ＩＧＦ−１リガンド（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間活性化し、その後、溶解した。未処理対処理サンプルにおいてホスホ−シグナルの比を比較することによって、ローディングコントロールとして使用されるＧＡＰＤＨに対して正規化した後に、ｐＩＧＦ−１ＲおよびｐＡｋｔ活性を測定した。 図２１ １時間の曝露後のＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるカルシウム放出に対する種々のコンストラクトの効果。細胞をＥＢＭ培地において一晩血清を欠乏させ、次いで、漸増量の種々のコンストラクトの存在下で１時間インキュベートした。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦリガンドで刺激した。リガンド添加の６０秒後にＣａ２＋流動を測定した。 図２２ 単回用量レベルでのＲＨ−４１腫瘍異種移殖片モデルにおけるペグ化されｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓの抗腫瘍活性。Ａ．３×ｗｋ×３レジメン後の増殖曲線。Ｂ．媒体処理群と比較して、１ＴＶＤＴにわたって５０％を超えるＴＧＩを示す増殖阻害パーセントプロット。黒三角は、投与レジメンを示す。 図２３ 複数用量レベルでのＲＨ−４１腫瘍異種移殖片モデルにおけるペグ化されｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓの抗腫瘍活性。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、各薬剤の指示される用量レベルを示す。黒三角は、投与レジメンを示す。 図２４ 複数用量レベルでのＡ５４９腫瘍異種移殖片肺モデルにおけるペグ化されｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓの抗腫瘍活性。指示される用量レベルは、ＡおよびＣに示されており、ＢおよびＤにおけるＴＧＩ％に相当する。黒三角は、投与レジメンを示す。 図２５ 複数用量レベルでのＧＥＯ腫瘍異種移殖片結腸モデルにおけるペグ化されｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓの抗腫瘍活性。指示される用量レベルは、ＡおよびＣに示されており、ＢおよびＤにおけるＴＧＩ％に相当する。黒三角は、投与レジメンを示す。 図２６ Ａ６７３ユーイング肉腫異種移殖片腫瘍における、ペグ化されたｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ媒介性腫瘍増殖阻害は、モノネクチン（ｍｏｎｏｎｅｃｔｉｎ）ＰＥＧ−Ｖ２Ｂ−ｓｈｏｒｔ、ペグ化抗ＶＥＧＦＲ−２アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）のものに匹敵する。 図２７ ３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）の薬物動態パラメータ。 図２８ Ａ６７３腫瘍を有するヌードマウスへの２０および２００ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）およびｍＶＥＧＦ−Ａの適合させた対観察された血漿中濃度−時間プロフィール。 図２９ Ａ６７３腫瘍を有するヌードマウスへの２０および２００ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓなし）およびｍＶＥＧＦ−Ａの適合させた対観察された血漿中濃度−時間プロフィール。 図３０ サルにおける３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）の薬物動態パラメータ。 図３１ サルへの３および３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後の、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓを有する）およびｈＶＥＧＦ−Ａの適合させた対観察された血漿中濃度−時間プロフィール。 図３２ サルにおける３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓタグがついていない）の薬物動態パラメータ。 図３３ サルへの３ｍｇ／ｋｇ（第１の用量）のＩＶ投与後の、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓなし）およびｈＶＥＧＦ−Ａの適合させた対観察された血漿中濃度−時間プロフィール。
定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、２個以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されるものなどの天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい（例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい；カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい；またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するよう修飾されていてもよい）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの、環状化合物またはその他の分子などの別の構造の結合を含み得、また１個または複数のアミノ酸を変化した立体配置（すなわち、ＲもしくはＳまたはＬもしくはＤ）で含有するポリペプチドを含み得る。
用語「ＰＫ」は、「薬物動態（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ）」の頭辞語であり、例として、被験体による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を包含する。「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部分」とは、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与される場合に、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を指す。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例として、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（米国公開第２００５０２８７１５３号および同２００７０００３５４９号に開示されるような）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃ断片および糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して評価できる。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
「変異体Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域のものとは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と比較して、または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に、約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは、 約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書において変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域と、および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくとも約８０％の配列同一性を、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、それと少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合されている抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同５，８２１，３３７号に記載されるものなどのインビトロ ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、対象とする分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価してもよい。
本明細書において、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列同一性の一部として保存的置換は全く考慮することなく、最大配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的上、アラインメントは、当技術分野における技術の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定できる。しかし、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載されるように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃによって書かれ、ユーザー文書とともに米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に保管されており、ここでは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．を通じて公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄで使用するために作成されるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
本明細書における目的上、所与のアミノ酸配列Ｂと、それに関して、または、それに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、それに関して、または、それに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現される場合もある）は、以下のとおりに算出される：１００×比Ｘ／Ｙ（式中、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。当然のことではあるが、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくならない。
「単離された」ポリペプチドとは、同定および分離および／またはその天然環境の成分から回収されているものである。その天然環境の夾雑成分とは、ポリペプチドの診断または治療的使用を干渉する物質であり、これとして、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定される、９５重量％を超える、最も好ましくは、９９重量％を超えるポリペプチドに、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは、銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性に精製される。単離ポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないので、組換え細胞内でのｉｎ ｓｉｔｕポリペプチドを含む。しかし、通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
標的はまた、前記標的の断片であり得る。したがって、標的はまた、免疫応答を誘発できる前記標的の断片でもある。標的はまた、全長標的に対する単一ドメイン抗体と結合できる前記標的の断片でもある。
本明細書において、断片とは、１００％未満（例えば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）であるが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個またはそれ以上のアミノ酸を含む配列を指す。断片は、１×１０−６Ｍまたはそれより良好な親和性で対象とする相互作用が維持されるような十分な長さのものである。
本明細書において、断片とはまた、標的の、野生型標的に対する単一ドメイン抗体と結合する能力を実質的に変化させない、１個または複数のアミノ酸の所望による挿入、欠失および置換を指す。アミノ酸の挿入、欠失または置換の数は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９個または７０個のアミノ酸であることが好ましい。
用語「治療上有効な量」とは、哺乳類において疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合には、薬物の治療上有効な量は、癌細胞の数を低減し得る；腫瘍の大きさを低減し得る；末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍増殖をある程度阻害し得る；および／または障害と関連している症状のうち１種または複数をある程度軽減し得る。薬物が増殖を妨げ、かつ／または既存の癌細胞を死滅させ得る限り、細胞分裂停止性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療について、インビボでの有効性は、例えば、無増悪期間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）（ＴＴＰ）を評価することおよび／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定できる。
アミノ酸配列または化合物の半減期は、通常、インビボでポリペプチドの血清濃度が、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって５０％低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、薬物動態分析によってなど、それ自体公知の任意の方法で決定できる。適した技術は、当業者には明らかであり、例えば、通常、治療される霊長類に、アミノ酸配列または化合物の適した用量を適宜投与する工程；前記霊長類から定期的に血液サンプルまたはその他のサンプルを採取する工程；前記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのように得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比較して５０％低減されるまでの時間を算出する工程を含み得る。例えば、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)などの標準的なハンドブックが参照される。Marcel Dekker、2nd Rev. edition (1982)によって公開された「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perronが参照される。
半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表現され得る。本明細書において、「半減期の増大」とは、これらのパラメータのうちいずれか１種、例えば、これらのパラメータのうち任意の２種、または本質的に３種のこれらのパラメータのすべての増大を指す。特に、「半減期の増大」とは、ｔ１／２−αおよび／またはＡＵＣまたは両方の増大を伴うか、または伴わない、ｔ１／２−βの増大を指す。
本明細書において、用語「多価」とは、２種以上の生物学的に活性なセグメントを組み込む組換え分子を指す。多価分子を形成するタンパク質断片は、構成要素と結合し、各々が独立に機能するのを可能にするポリペプチドリンカーを介して所望により連結されていてもよい。
概説
本出願は、Ｆｎ３ドメインなどの２種以上のフィブロネクチンベースの足場タンパク質を含む多価ポリペプチドを提供する。Ｆｎ３ドメインは、同一標的と結合し、それによって、結合価、したがって、標的結合の結合力を増大し得、または、異なる標的と結合し、それによって複数のエフェクター機能を示し得る。
米国特許第６，８１８，４１８号には、共有結合によって、または非共有結合によって連結され得るフィブロネクチン足場多量体が記載されている。本出願には、ポリペプチドリンカーを介して共有結合によって結合しており、多価ポリペプチドが単一コンストラクトとして発現されるのを可能にする改善された多量体が記載されている。本出願は、幾分かは、ポリペプチドリンカーを介して結合しているＦｎ３ドメインが互いに独立に正しくフォールディングし、高親和性結合を保持するという驚くべき発見およびドメインの各々がその機能特性を保持するという驚くべき発見に関する。
フィブロネクチンベースの足場
本出願の一態様は、各々が標的分子と結合し、ポリペプチドを介して連結している少なくとも２種のＦｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。各Ｆｎ３ドメインは、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチン由来のＦｎ３ドメイン、特に、配列番号１に示される、フィブロネクチンの第１０Ｆｎ３ドメイン（１０Ｆｎ３）である。種々の変異株１０Ｆｎ３足場が報告されている。一態様では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３のうち１つまたは複数が、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）などの別のアミノ酸によって置換されている。これらの突然変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨでの変異株１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３参照）。有益または中立のいずれかである１０Ｆｎ３足場中の種々のさらなる変化が開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng. 2002 Dec;15(12):1015-20; Koide et al.,Biochemistry 2001 Aug 28;40(34):10326-33参照。
変異体および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方とも、同一構造、すなわち、ＡからＧと表される７つのβ鎖ドメイン配列および７つのβ鎖ドメイン配列を接続する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ）を特徴とする。Ｎ末端およびＣ末端の最も近くに位置するβ鎖は、溶液中でβ様コンホメーションをとり得る。配列番号１中、ＡＢループは、残基１５〜１６に対応し、ＢＣループは、残基２１〜３０に対応し、ＣＤループは、残基３９〜４５に対応し、ＤＥループは、残基５１〜５６に対応し、ＥＦループは、残基６０〜６６に対応し、ＦＧループは、７６〜８７に対応する（Xu et al., Chemistry & Biology 2002 9:933-942）。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、分子の１つの面に沿って整列し、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは、分子の反対側の面に沿って整列している。配列番号１中、β鎖Ａは、残基９〜１４に対応し、β鎖Ｂは、残基１７〜２０に対応し、β鎖Ｃは、残基３１〜３８に対応し、β鎖Ｄは、残基４６〜５０に対応し、β鎖Ｅは、残基５７〜５９に対応し、β鎖Ｆは、残基６７〜７５に対応し、β鎖Ｇは、残基８８〜９４に対応する。鎖は、対応するループによって互いに接続しており、例えば、鎖ＡおよびＢは、ループＡＢを介して、鎖Ａ、ループＡＢ、鎖Ｂの構成で接続している、などとなる。疎水性コアの形成に関与している残基（「コアアミノ酸残基」）として、配列番号１の以下のアミノ酸に相当するアミノ酸が挙げられ：Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０およびＹ９２、ここで、コアアミノ酸残基は、一文字アミノ酸コードと、それに続く、それらが配列番号１内で位置している位置によって表されている。例えば、Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994)参照。
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ポリペプチドは、配列番号１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインと、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であり得る。変異性の多くは、通常、１つまたは複数のループ中で起こる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのβまたはβ様鎖の各々は、このような変動が、生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を乱さないという条件で、本質的に、配列番号１の対応するβまたはβ様鎖の配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。
いくつかの実施形態では、本開示内容は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、ループＡＢ、ループＢＣ、ループＣＤ、ループＤＥ、ループＥＦおよびループＦＧを含み、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＢＣおよびＦＧループが変化している。いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが変化している、すなわち、Ｆｎ３ドメインが、天然に存在しないループを含む。「変化した」とは、鋳型配列（対応するヒトフィブロネクチンドメイン）に対する１つまたは複数のアミノ酸配列の変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の変化は、通常、核酸コード配列の意図的な、盲検的な(blind)または自発的な配列変動によって達成され得、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラー−プローンＰＣＲまたは化学的ＤＮＡ合成によって起こり得る。
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つまたは複数のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの実施形態では、ループの長さは、２〜２５個のアミノ酸伸長され得る。いくつかの実施形態では、ループの長さは、１〜１１個のアミノ酸減少され得る。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループは、１２残基長であるが、抗体重鎖中の対応するループは、４〜２８残基の範囲である。したがって、抗原結合を最適化するために、４〜２８残基のＣＤＲ３範囲に及び、抗原結合において最大のあり得る可動性および親和性を得るよう、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さを、長さにおいて、ならびに、配列において変化させてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のＦｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変化している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２のＦｎ３ドメインを含み、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループが変化している。いくつかの実施形態では、変化したＢＣループは、最大１０のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１０のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、変化したＤＥループは、最大６のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１３のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、ＦＧループは、最大１２のアミノ酸置換、最大１１のアミノ酸欠失、最大２５のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。
１０Ｆｎ３ドメインは、通常、配列番号１のアミノ酸番号１で始まる。しかし、アミノ酸欠失を有するドメインも本発明に包含される。いくつかの実施形態では、配列番号１の最初の８個のアミノ酸が欠失している。ＮまたはＣ末端に、さらなる配列が付加されている場合もある。例えば、Ｆｎ３ドメインのＮ末端に、特に、第１のＦｎ３ドメインのＮ末端に、さらなるＭＧ配列が配置されてもよい。Ｍは、通常、切断除去され、Ｎ末端にＧが残る。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に、配列が配置されていてもよい、例えば、配列番号１７、１８または１９。その他の実施形態では、Ｃ末端に配置される配列は、例えば、以下のアミノ酸配列のうちの１種（一文字アミノ酸コードによって表される）：Ｅ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＩＤＫＰ（配列番号５０）、ＥＩＤＫＰＳ（配列番号５１）またはＥＩＤＫＰＣ（配列番号５２）を含む配列番号１７、１８または１９のＣ末端で末端切断される断片であり得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＧループを有する第１および／または第２の１０Ｆｎ３ドメインを含み、Ｆｎ３ドメインは、ＩＧＦ−ＩＲと結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号６のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＧループを有する第１および／または第２の１０Ｆｎ３ドメインを含み、Ｆｎ３ドメインは、ＶＥＧＦＲ２と結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のうちいずれか１種のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のいずれか１種と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
フィブロネクチンは、そのインテグリン結合モチーフ、「アルギニン-グリシン-アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を介して特定の種類のインテグリンと天然に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフを欠く１０Ｆｎ３ドメインを含む。
一実施形態では、多価ポリペプチドは、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するポリペプチドを含み、式中、Ａは、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるポリペプチドであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるポリペプチドである。別の実施形態では、多価ポリペプチドは、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するポリペプチドを含み、式中、Ａは、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｃは、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるポリペプチドである。構造Ａ−Ｂ−Ｃを有する多価ポリペプチドの特定の例として、（ｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のいずれか１種に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０に示されるアミノ酸配列のいずれか１種と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドがある。
特定の実施形態では、ＡまたはＣ領域は、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであり、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の構造：β鎖Ａ、ループＡＢ、β鎖Ｂ、ループＢＣ、β鎖Ｃ、ループＣＤ、β鎖Ｄ、ループＤＥ、β鎖Ｅ、ループＥＦ、β鎖Ｆ、ループＦＧ、β鎖Ｇを有し、ここで、ＢＣループは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号７のアミノ酸配列を有し、１０Ｆｎ３ドメインは、抗体重鎖可変領域様構造にフォールディングし、ポリペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２と結合する。ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインは、７つのβ鎖が、互いに集まる２つのβシートの間に分散されて安定なコアを形成し、溶媒にさらされる６つのループによって該β鎖がつながっている構造にフォールディングすることが好ましい。例示的な実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、８０〜１５０個のアミノ酸長である。
特定の実施形態では、ＡまたはＣ領域は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号６のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＧループを含む、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、１０Ｆｎ３ドメインは、１００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２と結合する。例示的ＶＥＧＦＲ２バインダーは、以下の配列によって表される：
Figure 2011520961
配列番号４７において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、太字で示される固定された配列を有し、ＡＢループは、Ｘｎ１によって表され、ＣＤは、Ｘｎ２によって表され、ＥＦループは、Ｘｎ３によって表され、β鎖Ａ〜Ｇには下線が引かれている。Ｘは、任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付文字は、アミノ酸の数の整数を表す。特に、ｎ１は、１〜１５、２〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３または１〜２個のアミノ酸の範囲であり得、ｎ２およびｎ３は、各々独立に、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７または６〜７個のアミノ酸の範囲であり得、ａ１〜ａ６は、各々独立に、０〜１０、０〜５、１〜１０、１〜５または２〜５個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ｎ１は、２個のアミノ酸であり、ｎ２は、７個のアミノ酸であり、ｎ３は、７個のアミノ酸であり、ａ１〜ａ６は０個のアミノ酸である。β鎖の配列は、配列番号１に示される対応するアミノ酸と比較して、７つの足場領域すべてにわたって０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。例示的な実施形態では、β鎖の配列は、配列番号１に示される対応するアミノ酸と比較して、７つの足場領域すべてにわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の保存的置換を有し得る。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２バインダーは、以下のアミノ酸配列によって表される：
Figure 2011520961
配列番号４０において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの配列は、太字で示される固定された配列を有し（例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号６のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するＦＧループ）、下線が引かれている残りの配列（例えば、７つのβ鎖ならびにＡＢ、ＣＤおよびＥＦループの配列）は、配列番号４０に示される対応するアミノ酸と比較して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１個の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を有する。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１個のアミノ酸の長さのＮ末端伸長を所望により含んでいてもよい。例示的Ｎ末端伸長として、（一文字アミノ酸コードによって表される）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４５）、ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４６）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４８）、または配列番号４５、４６もしくは４８のいずれか１種のＮ末端切断物が挙げられる。その他の適したＮ末端伸長として、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号５３）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号５４）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号５５）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号５６）、ＸｎＲＤＬ（配列番号５７）、ＸｎＤＬ（配列番号５８）、またはＸｎＬが挙げられ、ここで、ｎ＝０、１または２個のアミノ酸であり、ｎ＝１である場合は、Ｘは、ＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合には、Ｘは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙである。ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｃ末端テールを所望により含んでいてもよい。例示的Ｃ末端テールとして、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１個のアミノ酸の長さであるポリペプチドが挙げられる。Ｃ末端テールの特定の例として、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号１７）、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１８）およびＥＩＤＫ（配列番号１９）が挙げられる。その他の実施形態では、適したＣ末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列のうちの１種（一文字アミノ酸コードによって表される）：Ｅ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＩＤＫＰ（配列番号５０）、ＥＩＤＫＰＳ（配列番号５１）またはＥＩＤＫＰＣ（配列番号５２）を含む配列番号１７、１８または１９のＣ末端で末端切断される断片であり得る。その他の適したＣ末端テールとして、例えば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号７１）またはＥＧＳＧＣ（配列番号７２）が挙げられる。特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、Ａ領域は、ＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まるＮ末端伸長およびシステイン残基を含まないＣ末端伸長を含み、Ｂ領域は、Ｍｅｔで始まらないＮ末端伸長およびシステイン残基を含むＣ末端伸長を含む。ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインの特定の例として、（ｉ）配列番号１６、２８および４０〜４４のいずれか１種に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号１６、２８および４０〜４４のいずれか１種に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドがある。
特定の実施形態では、ＡまたはＣ領域は、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであり、１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ向かって以下の構造：β鎖Ａ、ループＡＢ、β鎖Ｂ、ループＢＣ、β鎖Ｃ、ループＣＤ、β鎖Ｄ、ループＤＥ、β鎖Ｅ、ループＥＦ、β鎖Ｆ、ループＦＧ、β鎖Ｇを有し、ここで、ＢＣループは、配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＤＥループは、配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＦＧループは、配列番号４のアミノ酸配列を有し、１０Ｆｎ３ドメインは、抗体重鎖可変領域様構造にフォールディングし、ポリペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲと結合する。ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインは、７つのβ鎖が、互いに集まる２つのβシートの間に分散されて安定なコアを形成し、溶媒にさらされる６つのループによって該β鎖がつながっている構造にフォールディングすることが好ましい。例示的な実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、８０〜１５０個のアミノ酸長である。
特定の実施形態では、ＡまたはＣ領域は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＧループを含むＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、１０Ｆｎ３ドメインは、１００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲと結合する。例示的ＩＧＦ−ＩＲバインダーは、以下の配列によって表される：
Figure 2011520961
配列番号４９において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、太字で示される固定された配列を有し、ＡＢループは、Ｘｎ１によって表され、ＣＤループは、Ｘｎ２によって表され、ＥＦループは、Ｘｎ３によって表され、β鎖Ａ〜Ｇには下線が引かれている。Ｘは、任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付文字は、アミノ酸の数の整数を表す。特に、ｎ１は、１〜１５、２〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３または１〜２個のアミノ酸の範囲であり得、ｎ２およびｎ３は、各々独立に、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７または６〜７個のアミノ酸の範囲であり得、ａ１〜ａ６は、各々独立に、０〜１０、０〜５、１〜１０、１〜５または２〜５個のアミノ酸を含み得る。好ましい実施形態では、ｎ１は、２個のアミノ酸であり、ｎ２は、７個のアミノ酸であり、ｎ３は、７個のアミノ酸であり、ａ１〜ａ６は０個のアミノ酸である。β鎖の配列は、配列番号１に示される対応するアミノ酸と比較して、７つの足場領域すべてにわたって０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。例示的な実施形態では、β鎖の配列は、配列番号１に示される対応するアミノ酸と比較して、７つの足場領域すべてにわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１の範囲の保存的置換を有し得る。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＲバインダーは、以下のアミノ酸配列によって表される：
Figure 2011520961
配列番号３５において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの配列は、太字で示される固定された配列を有し（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号３のアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するＦＧループ）、下線が引かれている残りの配列（例えば、７つのβ鎖ならびにＡＢ、ＣＤおよびＥＦループの配列）は、配列番号３５に示される対応するアミノ酸と比較して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２または０〜１個の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を有する。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１個のアミノ酸の長さのＮ末端伸長を所望により含んでいてもよい。例示的Ｎ末端伸長として、（一文字アミノ酸コードによって表される）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４５）、ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４６）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号４８）、または配列番号４５、４６もしくは４８のいずれか１種のＮ末端で切断される断片が挙げられる。その他の適したＮ末端伸長として、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号５３）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号５４）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号５５）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号５６）、ＸｎＲＤＬ（配列番号５７）、ＸｎＤＬ（配列番号５８）、またはＸｎＬが挙げられ、ここで、ｎ＝０、１または２個のアミノ酸であり、ｎ＝１である場合は、Ｘは、ＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合には、Ｘは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙである。ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｃ末端テールを所望により含んでいてもよい。例示的Ｃ末端テールとして、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１個のアミノ酸の長さであるポリペプチドが挙げられる。Ｃ末端テールの特定の例として、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号１７）、ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号１８）およびＥＩＤＫ（配列番号１９）が挙げられる。その他の実施形態では、適したＣ末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列のうちの１種（一文字アミノ酸コードによって表される）：Ｅ、ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＩＤＫＰ（配列番号５０）、ＥＩＤＫＰＳ（配列番号５１）またはＥＩＤＫＰＣ（配列番号５２）を含む配列番号１７、１８または１９のＣ末端で切断される断片であり得る。その他の適したＣ末端テールとして、例えば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号７１）またはＥＧＳＧＣ（配列番号７２）が挙げられる。特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、Ａ領域は、ＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まるＮ末端伸長およびシステイン残基を含まないＣ末端伸長を含み、Ｂ領域は、Ｍｅｔで始まらないＮ末端伸長およびシステイン残基を含むＣ末端伸長を含む。ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインの特定の例として、（ｉ）配列番号２６〜２７および３５〜３９のいずれか１種に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号２６〜２７および３５〜３９のいずれか１種に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドがある。
Ｂ領域は、ポリペプチドリンカーである。例示的ポリペプチドリンカーとして、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個のアミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの特定の例は、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、リンカーは、本明細書に記載されるＣ末端テールポリペプチド、本明細書に記載されるＮ末端伸長ポリペプチドまたはそれらの組合せであり得る。
一実施形態では、多価ポリペプチドは、構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有するポリペプチドを含み、式中、Ｘ１は、所望によるＮ末端伸長であり、Ａは、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ２は、所望によるＣ末端テールであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｘ３は、所望によるＮ末端伸長であり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ４は、所望によるＣ末端テールである。別の実施形態では、多価ポリペプチドは、構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有するポリペプチドを含み、式中、Ｘ１は、所望によるＮ末端伸長であり、Ａは、ＩＧＦ−ＩＲと結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ２は、所望によるＣ末端テールであり、Ｂは、ポリペプチドリンカーであり、Ｘ３は、所望によるＮ末端伸長であり、Ｃは、ＶＥＧＦＲ２と結合する１０Ｆｎ３ドメインであり、Ｘ４は、所望によるＣ末端テールである。適したＮ末端伸長およびＣ末端テールの特定の例は、上記で記載されている。特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｂ、Ｘ３またはＸ４のうち１つまたは複数は、システインまたはリシン残基などのペグ化に適したアミノ酸残基を含み得る。例示的な実施形態では、Ｘ４は、システインまたはリシン残基などのペグ化に適した少なくとも１個のアミノ酸を含む。適したポリペプチドリンカーの特定の例は以下にさらに記載されている。構造Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｂ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４を有する多価ポリペプチドの特定の例として、（ｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のいずれか１種に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜７０のいずれか１種に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むポリペプチドがある。
例示的な実施形態では、本明細書に定義されるＸは、天然に存在するアミノ酸である。
ポリペプチドリンカー
本出願は、ポリペプチドリンカーを介して連結している少なくとも２つのＦｎ３ドメインを含む多価ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、第１のＦｎ３ドメインを含むＮ末端ドメインおよび第２のＦｎ３ドメインを含むＣ末端ドメインを含む。第１および第２のＦｎ３ドメインは、直接的またはポリペプチドリンカーを介して間接的に連結し得る。さらなるリンカーまたはスペーサー、例えば、配列番号１７、１８または１９は、第１のＦｎ３ドメインのＣ末端において、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入され得る。さらなるリンカーまたはスペーサーは、第２のＦｎ３ドメインのＮ末端において、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入され得る。
Ｆｎ３ドメインを結合するための適したリンカーとして、別個のドメインが、互いに独立にフォールディングして、標的分子との高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するのを可能にするものがある。本出願は、これらの必要条件を満たす適したリンカーが、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、プロリン−アラニンベースのリンカーならびに配列番号２０のリンカーを含むことを提供する。本明細書に記載される実施例は、これらのリンカーを介して結合されたＦｎ３ドメインがその標的結合機能を保持することを実証する。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０および１０〜２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として、配列番号２３、２４および２５が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号２１および２２から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０および３〜２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として、配列番号３２、３３および３４が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、プロリン−アラニンベースのリンカーである。これらのリンカーは、プロリンおよびアラニン残基を含み、３〜３０、１０〜３０、３〜２０および６〜１８個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として、配列番号６０、６１および６２が挙げられる。最適リンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野で周知の方法によって日常的な実験によって決定され得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号２０である。
薬物動態部分
一態様では、本出願は、薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む多価ポリペプチドを提供する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性に従って評価できる。おそらくは、タンパク質が、投与後の血清において利用可能なままである時間を増大することによって、バイオアベイラビリティを増大すること、および／または用量間の時間を増大することが望ましいことが多い。場合によっては、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違の減少）が望ましい。ポリペプチドは、哺乳類（例えば、マウス、ラットまたはヒト）においてポリペプチドのクリアランス速度を、修飾されていないポリペプチドと比較して３倍超低減する部分に結合させてもよい。薬物動態の改善のその他の尺度として、血清半減期を挙げることができ、これはα相およびβ相に分けられることが多い。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって大幅に改善され得る。
本明細書において「ＰＫ部分」と呼ばれる、血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向がある部分として、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）および耐容性良好であるタンパク質部分（例えば、Ｆｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリンまたは血清アルブミン）が挙げられる。ポリペプチドは、米国公開第２００７００４８２８２号に記載される、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体と融合してもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号および同２００７／０２６９４２２号に記載されるものである。
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されるものである。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。１つまたは複数のＰＥＧ分子を、タンパク質上の異なる位置に結合してもよく、このような結合は、アミン、チオールまたはその他の適した反応性基を用いる反応によって達成できる。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に見られる第一級アミンまたはリシンもしくはアルギニンなどのアミノ酸中に存在するアミン基であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ａ）Ｎ末端、ｂ）Ｎ末端と最もＮ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間、ｃ）標的結合部位と反対側のポリペプチドの面上に位置するループ、ｄ）Ｃ末端と最もＣ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間および ｅ）Ｃ末端からなる群から選択されるポリペプチド上の位置に結合している。
ペグ化は、部位指定ペグ化によって達成でき、この方法においては、ペグ化が優先的に起こる部位を作り出すために、適した反応性基がタンパク質に導入される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、所望の位置にシステイン残基を導入するよう修飾され、システイン上で部位指定ペグ化が可能となる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８などのＣｙｓ含有リンカーを含み、これによって、部位指定ペグ化が可能となる。いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ含有リンカーが、第２のＦｎ３ドメインの３’末端（すなわち、ポリペプチド中の最もＣ末端のドメイン）に導入される。ＰＥＧは、分子量が大きく変わり得、分岐している場合も、直鎖である場合もある。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインおよびＰＫ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリペプチドの血清半減期を、Ｆｎ３ドメイン単独と比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％を超えて、またはそれ以上増大する。
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、少なくとも１種のジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介してＦｎ３ドメインと連結している。例示的ポリペプチドリンカーとして、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号２０）、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号１７）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２１）などのＧＳリンカー、ならびにそれらの多量体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、トランスフェリンである。
標的
本出願は、第１の標的分子と結合する第１のＦｎ３ドメインおよび第２の標的分子と結合する第２のＦｎ３ドメインを含む多価ポリペプチドを提供する。第１および第２の標的分子は、同一または異なる標的分子であり得る。第１および第２の標的分子が同一である場合には、Ｆｎ３ドメイン、すなわち、結合ループは、同一であっても異なっていてもよい。したがって、第１および第２のＦｎ３ドメインは、同一標的と、ただし、異なるエピトープで結合し得る。ループ領域、特に、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧに配列変動を導入することによって、ほぼすべての標的分子と結合できるＦｎ３ドメインを作製できる。
標的分子とのポリペプチド結合は、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）の点で、また動態定数（例えば、結合速度定数（ｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）、ｋｏｎおよび解離速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）、ｋｏｆｆ）の点で評価できる。Ｆｎ３ドメインは、通常、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤで標的分子と結合するが、ｋｏｆｆが十分に低い、またはｋｏｎが十分に高い場合には、より高いＫＤ値も許容され得る。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＦｎ３ドメインは、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトＣＤ３、ＩＧＦ−ＩＲ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、繊維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、肝細胞増殖因子またはＴｉｅ２．３から選択される標的と結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｎ３ドメインは、Ｎ末端位置にあり、ＩＧＦ−ＩＲと結合し、第２のＦｎ３ドメインは、ＶＥＧＦＲ２と結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｎ３ドメインは、Ｎ末端位置にあり、ＶＥＧＦＲ２と結合し、第２のドメインはＩＧＦ−ＩＲと結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｎ３ドメインは、Ｎ末端位置にあり、ＩＧＦ−１Ｒと結合し、第２のドメインは、ＶＥＧＦＲ２と結合する。
特定の実施形態では、多価ポリペプチドは、異なる標的と結合する第１および第２のＦｎ３ドメインを含む。このような実施形態では、一方のＦｎ３結合ドメインの効力を、もう一方のＦｎ３結合ドメインに対して調整することが望ましい場合がある。例えば、第１のＦｎ３ドメインの結合親和性が、第２のＦｎ３ドメインの結合親和性よりも大幅に高い場合には、第１のＦｎ３ドメインの生物学的効果が、第２の第２のＦｎ３ドメインの効果を圧倒することもあり得る。したがって、特定の実施形態では、多価ポリペプチドの第１および第２のＦｎ３ドメインの結合親和性が互いに同様、例えば、互いの１００倍、３０倍、１０倍、３倍、１倍、０．３倍もしくは０．１倍以内の結合親和性、または互いに０．１倍〜１０倍以内、０．３倍〜１０倍以内、０．１倍〜３倍以内、０．３倍〜３倍以内、０．１倍〜１倍以内、０．３倍〜１倍以内、１倍〜１０倍以内、３倍〜１０倍以内、３倍〜３０倍以内もしくは１倍〜３倍以内の結合親和性であることが望ましい場合がある。
マルチドメイン実施形態
本出願の一態様は、結合部分をさらに含む多価ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、結合部分は、ヒト標的タンパク質と、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−９Ｍ未満のＫＤで結合する。
いくつかの実施形態では、結合部分は、腫瘍関連標的または抗原と結合する。いくつかの実施形態では、抗原ターゲッティングは、組織分布の点で多価ポリペプチドを局在させるのに役立ち、または局所濃度の増大は、組織または所望の細胞種のいずれかにおいて影響を及ぼす。
いくつかの実施形態では、結合部分は、例えば、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＢｒＥ３−抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧおよびそのサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｂａ７３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４−抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＧ−７２、ｐ５３、テネイシン、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、１７−１Ａ−抗原、血管新生マーカー（例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン）、癌遺伝子マーカー、癌遺伝子産物およびその他の腫瘍関連抗原などの腫瘍関連標的または抗原と結合する。腫瘍関連抗原に関する最近の報告書として、Mizukami et al., (2005、Nature Med. 11:992-97); Hatfield et al.,(2005、Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48);Vallbohmer et al. (2005、J. Clin. Oncol. 23:3536-44);およびRen et al. (2005、Ann. Surg. 242:55-63)が挙げられ、各々参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体部分から選択される。
抗体部分とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。そのようなものとして、抗体部分という用語は、全抗体分子だけでなく、抗体多量体および抗体断片ならびに抗体、抗体多量体および抗体断片の変異体（誘導体を含む）をも包含する。抗体部分の例として、これらには限らないが、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィドによって連結しているＦｖｓ（ｓｄＦｖｓ）およびＦｖｓが挙げられる。抗体部分は、例えば、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片、（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインおよびＣＨ１ドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦｄ’断片、（ｖ）抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341、544-546 (1989)）、（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結している２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片、（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird et al.,Science 242:423-426 (1988);およびHuston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)）、（ｘ）同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と接続されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディー(diabody)」（例えば、ＥＰ特許公報第４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444-6448 (1993)参照）、および（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、１対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)および米国特許第５，６４１，８７０号）から選択される。
いくつかの実施形態では、抗体部分は、単一ドメイン抗体である。例として、これらには限らないが、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠く抗体、従来の４鎖抗体から誘導された単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体から誘導されたもの以外の単一ドメイン足場が挙げられる。単一ドメイン抗体は、これらには限らないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含む任意の種に由来するものであり得る。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインなどの天然に存在する単一ドメイン抗体である。ＶＨＨは、ＷＯ９４／０４６７８に記載されるようなラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ビキューナ、アルパカおよびグアナコを含めた）に由来するものなどの、天然に軽鎖を欠く免疫グロブリンに由来する重鎖可変ドメインである。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。ＶＨＨは、空洞または溝などの「普通ではない」エピトープと結合することがわかっているので、このようなＶＨＨの親和性は、治療的処置にとってより適している可能性がある、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４９８０５。
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、米国公開第２００７０１７８０８２号に記載されるような、血清タンパク質と結合するＶＨＨである。血清タンパク質は、被験体の血清中に見られる任意の適したタンパク質またはその断片であり得る。いくつかの実施形態では、血清タンパク質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスフェリンまたはフィブリノゲンである。
本発明において使用される抗体断片を生成するために使用できる、抗体断片の生成のための種々の技術が開発されている。従来、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質消化によって得られた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)参照）。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接的に生成することができる。例えば、抗体断片は、上記で論じられた抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接的に回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離できる。抗体断片を生成するためのその他の技術は、当業者には明らかとなろう。その他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「直鎖抗体」であり得る。例えばこのような直鎖抗体断片は、単一特異性または二特異性であり得る。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のアビマー配列を含む。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインから、インビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって開発された（Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220）。得られたマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して、改善された親和性（場合によっては、ナノモル以下の）および特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーの構築方法および使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許公報第２００４０１７５７５６号、同２００５００４８５１２号、同２００５００５３９７３号、同２００５００８９９３２号および同２００５０２２１３８４号に開示されている。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のリポカリン関連配列、例えば、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）またはリポカリン誘導体を含む。アンチカリンまたはリポカリン誘導体は、本明細書に記載されるものを含む種々の標的分子に対して親和性および特異性を有する結合タンパク質の１種である。このようなタンパク質、米国特許公報第２００６００５８５１０号、同２００６００８８９０８号、同２００５０１０６６６０号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０５６４６４に記載されている。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のテトラネクチンＣ型レクチン関連配列またはトリネクチン（ｔｒｉｎｅｃｔｉｎ）、例えば、テトラネクチンＣ型レクチンまたはテトラネクチンＣ型レクチン誘導体を含む。テトラネクチンＣ型レクチンまたはテトラネクチンＣ型レクチン誘導体は、本明細書に記載されるものを含む種々の標的分子に対して親和性および特異性を有する結合タンパク質の１種である。種々のテトラネクチンＣ型レクチンおよび関連タンパク質が、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０５３５６８、ＷＯ２００５／０８０４１８、ＷＯ２００４／０９４４７８、ＷＯ２００４／０３９８４１、ＷＯ２００４／００５３３５、ＷＯ２００２／０４８１８９、ＷＯ９８／０５６９０６および米国特許公報第２００５０２０２０４３号に記載されている。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数の天然アンキリン反復タンパク質、例えば、ＤＡＲＰｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のＡｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）を含む。Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）は、ブドウ球菌性プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインから誘導されている。新規結合特性は、プロテインＡドメインの結合表面付近に位置する残基を変化させることによって達成できる。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のシステインノットをベースとするタンパク質足場、すなわち、ミクロボディー（Ｓｅｌｅｃｏｒｅ／ＮａｓｃａＣｅｌｌ）を含む。
いくつかの実施形態では、結合部分は、１種または複数のＴｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（商標）を含む。Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（商標）は、トランスフェリン足場（ＢｉｏＲｅｓｉｓ／Ｐｆｉｚｅｒ）に基づいている。
いくつかの実施形態では、結合部分は、γ−クリスタリンまたはユビキチンをベースとする結合タンパク質を含む。これらのいわゆるＡｆｆｉｌｉｎ（商標）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）分子は、タンパク質のβシート構造中の結合領域のｄｅ ｎｏｖｏ設計を特徴とする。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）分子は、米国公開第２００７０２４８５３６号に記載されている。
コンジュゲーション
多価ポリペプチドおよび結合部分は、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはＰＥＧ部分を介して連結し得る。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドおよび結合部分は、ポリペプチドを介して連結している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号１７、１８または２０である。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドおよび結合部分は、血液または標的組織においてプロテアーゼによって切断可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介して連結している。このような実施形態を使用して、より良好なデリバリーまたは治療的特性またはこのようなタンパク質を別個に生成することと比較して、より効率的な生成のために、２種以上の治療用タンパク質を放出できる。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドおよび結合部分は、重合糖などの生体適合性ポリマーを介して連結している。このような重合糖は、血液または標的組織において酵素によって切断可能である酵素切断部位を含み得る。このような実施形態を使用して、より良好なデリバリーまたは治療的特性またはこのようなタンパク質を別個に生成することと比較して、より効率的な生成のために、２種以上の治療用タンパク質を放出できる。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドおよび結合部分は、ポリマーリンカーを介して連結している。ポリマーリンカーを使用して、以下の特徴のうち１つまたは複数を有するタンパク質を作り出すために各タンパク質部分間の距離を最適に変えることができる：１）対象とするタンパク質との結合時の、１または複数のタンパク質ドメインの結合の立体障害の低減または増大、２）安定性または溶解度を増大するためにさらなるアミノ酸置換を探索することのない、タンパク質安定性または溶解度の増大（例えば、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌの溶解度）、３）安定性を低減するためのさらなるアミノ酸置換を探索することのない、タンパク質凝集の減少（例えば、ＳＥＣによって測定される）および４）さらなる結合ドメインの付加によるタンパク質の全結合力または親和性の増大。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、配列番号１８のリンカーを含む第２の１０Ｆｎ３ドメインを含む。ＰＥＧは、リンカー配列中のシステイン部分にコンジュゲートされ、多価ポリペプチドおよび結合部分を連結する。
ＰＥＧ化実施形態
本出願の一態様は、非タンパク質性ポリマーとの多価ポリペプチドの連結を提供する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同４，４９６，６８９号、同４，３０１，１４４号、同４，６７０，４１７号、同４，７９１，１９２号または同４，１７９，３３７号に記載されるような、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧ部分である。さらに、本出願は、抗体部分（例えば、ラクダ抗体およびその誘導体ならびに一本鎖およびドメイン抗体、特に、微生物から発現されるもの）および抗体様部分（例えば、リポカリン、アンキリン、複数のＣｙｓ−Ｃｙｓドメインおよびテトラネクチンの誘導体、特に、微生物から発現されるもの）との、ＮまたはＣ末端ＰＥＧコンジュゲーションを提供する。
ＰＥＧは、市販されているが、当技術分野で周知の方法に従うエチレングリコールの開環重合によって調製することもできる、周知の、水溶性ポリマーである（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）。用語「ＰＥＧ」は、広く使用され、大きさ、ＰＥＧの末端での修飾にかかわらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含し、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは、２０〜２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである）によって表され得る。一実施形態では、本発明のＰＥＧは、一方の末端でヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要な、分子の化学合成に起因する、または分子の部分の最適距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含み得る。さらに、このようなＰＥＧは、一緒に連結している１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなり得る。２以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアームの、または分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）およびソルビトールを含む種々のポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製できる。例えば、４アームの分岐ＰＥＧをペンタエリスリトール（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｏｌ）およびエチレンオキシドから調製できる。分岐ＰＥＧは、例えば、欧州公開出願番号第４７３０８４Ａ号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの１つの形として、リシンの第一級アミノ基を介して連結している２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
ペプチドまたはタンパク質とのＰＥＧコンジュゲーションは、通常、ＰＥＧの活性化および活性化されたＰＥＧ中間体の、標的タンパク質／ペプチドとの直接的な、またはリンカーとのカップリングを含み、リンカーは、その後に活性化され、標的タンパク質／ペプチドとカップリングされる（Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977)およびJ. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al., and Harris et. al., in: Poly(ethylene glycol） Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22参照）。ＰＥＧ分子を含有する結合ポリペプチドはまた、複合タンパク質としても知られているのに対し、結合しているＰＥＧ分子を欠くタンパク質は、コンジュゲートしていないと呼ばれることもあるということは留意されたい。
使用されるＰＥＧの大きさは、多価ポリペプチドの意図される用途を含む、いくつかの因子に応じて変わる。大きなＰＥＧは、身体、血液、非血液細胞外液または組織において半減期を増大することが好ましい。インビボ細胞活性のためには、約１０〜６０ｋＤａの範囲のＰＥＧ、ならびに約１００ｋＤａ未満のＰＥＧが好ましく、約６０ｋＤａ未満がより好ましいが、約１００ｋＤａを超える大きさも同様に使用できる。インビボイメージング適用には、大きなＰＥＧと同じ程度には半減期を増大せず、より迅速な分布およびより短い半減期を可能にする、より小さいＰＥＧ、通常、約２０ｋＤａ未満を使用してもよい。本発明のポリペプチドを結合するためのコンジュゲーションのために、種々の分子量の形態のＰＥＧ、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは、２０〜２３００である）を選択できる。ＰＥＧ中の反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量に対して見積もられている。活性化されたリンカー上のＰＥＧの組み合わされた分子量が、製薬学的用途にとって適していることが好ましい。したがって、一実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は、１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３ＰＥＧ分子が、リンカーと結合しており、各ＰＥＧ分子が、１２，０００Ｄａの同一分子量を有する場合には（各ｎが約２７０である）、リンカー上のＰＥＧの総分子量は、約３６，０００Ｄａである（総ｎは、約８２０である）。リンカーと結合しているＰＥＧの分子量は異なっていてもよく、例えば、リンカー上の３分子のうち２つのＰＥＧ分子が、各５，０００Ｄａであり（各ｎは、約１１０である）、１つのＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａであり得る（ｎは、約２７０である）。いくつかの実施形態では、１つのＰＥＧ部分が、多価ポリペプチドとコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０ＫＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約４０ＫＤａである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化多価ポリペプチドは、１、２またはそれ以上のＰＥＧ部分を含む。一実施形態では、ＰＥＧ部分（単数または複数）は、標的リガンドと接触するタンパク質の表面上にある、および／または表面から離れたアミノ酸残基と結合している。一実施形態では、ＰＥＧ結合ポリペプチド中のＰＥＧの組み合わされた分子量または総分子量は、約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａまたは約１０，０００Ｄａ〜３６，０００Ｄａである。一実施形態では、ペグ化結合ポリペプチド中のＰＥＧは、実質的に直線の、直鎖ＰＥＧである。
当業者ならば、例えば、ペグ化結合ポリペプチドが、どのように治療的に使用されるか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性およびその他の検討事項に基づいてＰＥＧの適した分子量を選択できる。タンパク質の特性を増強するためのＰＥＧおよびその使用についての論述については、N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993)を参照のこと。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、式：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの１つのポリ（エチレングリコール）基と、結合ポリペプチドのアミノ基の１つとアミド結合を形成するポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（すなわち、カルボニル）を用いて、共有結合によって連結している（Ｒは、低級アルキルであり、ｘは、２または３であり、ｍは、約４５０〜約９５０であり、ｎおよびｍは、コンジュゲートの分子量−結合ポリペプチドが、約１０〜４０ｋＤａであるよう選択される）。一実施形態では、結合ポリペプチドのリシンのε−アミノ基が、利用可能な（遊離）アミノ基である。
特定の一実施形態では、ＰＥＧ結合ポリペプチドコンジュゲートを形成するためにＰＥＧの炭酸エステルが使用される。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）を、ＰＥＧとの反応において使用して、活性な混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボネートを形成してもよく、これを続いて、リンカーの求核基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させてもよい（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号参照）。同様の種類の反応において、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カルボネートおよびジ−（２−ピリジル）カルボネートをＰＥＧと反応させて、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カルボネートをそれぞれ形成してもよい（米国特許第５，３８２，６５７号）。
多価ポリペプチドのペグ化は、最先端の方法に従って、例えば、結合ポリペプチドと求電子的に活性なＰＥＧとの反応によって実施できる（供給業者：Shearwater Corp., USA、www.shearwatercorp.com）。本発明の好ましいＰＥＧ試薬として、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたはｍＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分岐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがある（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。このような方法を使用して結合ポリペプチドのリシンのε−アミノ基または結合ポリペプチドのＮ末端アミノ基でペグ化してもよい。
別の実施形態では、ＰＥＧ分子を、結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基とカップリングしてもよい（Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343;米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同５，７６６，８９７号には、スルフヒドリル基とカップリングしてもよい例示的反応性ＰＥＧ種が記載されている。
いくつかの実施形態では、ペグ化多価ポリペプチドは、部位指定ペグ化によって、特に、ＮまたはＣ末端でのシステイン部分とのＰＥＧのコンジュゲーションによって生成される。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、ＰＥＧ部分と共有結合しているＦｎ３ドメインであり、前記Ｆｎ３ドメインの少なくとも１つのループが標的結合に関与する。ＰＥＧ部分は、部位指定ペグ化によって、例えば、Ｃｙｓ残基との結合によってＦｎ３ポリペプチドと結合させてもよく、ここで、Ｃｙｓ残基は、Ｆｎ３ポリペプチドのＮ末端に、またはＮ末端と最もＮ末端のβもしくはβ様鎖の間に、またはＦｎ３ポリペプチドのＣ末端に、またはＣ末端と最もＣ末端のβもしくはβ様鎖の間に位置し得る。Ｃｙｓ残基は、同様にその他の位置、特に、標的結合に関与しないループのいずれかに位置していてもよい。ＰＥＧ部分はまた、アミンとのコンジュゲーションによるものを含めて、その他の化学によって結合させてもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子が、結合ポリペプチド上のシステイン残基とコンジュゲートしている場合に、システイン残基は、結合ポリペプチドに対して天然であるのに対し、その他の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基が結合ポリペプチド中に操作されて入っている。結合ポリペプチドのコード配列中に変異を導入し、システイン残基を作製してもよい。これは、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基をシステインに変異することによって達成され得る。システイン残基に変異するための好ましいアミノ酸として、セリン、トレオニン、アラニンおよびその他の親水性残基が挙げられる。システインに変異される残基は、表面にさらされている残基であることが好ましい。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面到達性を予測するためのアルゴリズムは、当技術分野で周知である。あるいは、それに基づいて結合ポリペプチドが設計され、進化されるフレームワークの結晶構造が解かれていることを考えると、結合ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって表面残基を予測することができ（Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414 (6866):933-8参照）、したがって、表面にさらされている残基が同定される。一実施形態では、システイン残基が結合ポリペプチドに、Ｎおよび／またはＣ末端で、もしくはその付近で、またはループ領域内で導入される。システイン残基のペグ化は、例えば、ＰＥＧ−マレイミンド（ｍａｌｅｉｍｉｎｄｅ）、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドまたはＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドを使用して実施できる。
いくつかの実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基と共有結合しているＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化は、Pepinsky et al., (2001) JPET, 297, 1059および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されている。その他の利用可能な求核アミノ基を使用するタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号に、Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254, 12579に、およびChamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133に記載されている。
別の実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドは、リンカーと共有結合している１つまたは複数のＰＥＧ分子を含み、リンカーは、次いで、結合ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のαアミノ基と結合される。このようなアプローチは、米国公開第２００２／００４４９２１号およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／０１４５１に開示されている。
一実施形態では、結合ポリペプチドは、Ｃ末端においてペグ化される。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入およびその後のスタウディンガー反応によるメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによってＣ末端においてペグ化される。このＣ末端コンジュゲーション法は、Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity、Bioconjug Chem. 2004;15(5):1005-1009に記載されている。
サイズ排除（例えば、ゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離および精製技術を使用して、ＰＥＧ化結合ポリペプチドを精製できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して生成物を分離してもよい。分離できる生成物として、モノ、ジ、トリ−、ポリペグ化された、およびペグ化されていない結合ポリペプチド、ならびに遊離ＰＥＧが挙げられる。モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、溶出ピーク周辺の広い画分をプールすることによって制御し、組成物中のモノＰＥＧのパーセンテージを高めることができる。約９０パーセントのモノＰＥＧコンジュゲートは、収率および活性の良好なバランスに相当する。例えば、コンジュゲートの少なくとも９２パーセントまたは少なくとも９６パーセントが、モノＰＥＧ種である組成物が望ましいものであり得る。本発明の実施形態では、モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、９０パーセントから９６パーセントである。
本発明の一実施形態では、ペグ化多価ポリペプチド中のＰＥＧは、室温で、８〜１６時間かけて、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、４５０ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）を使用してＰＥＧ化アミノ酸残基から加水分解されず、したがって、安定である。一実施形態では、組成物の８０％超が、安定なモノＰＥＧ結合ポリペプチドであり、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％である。
別の実施形態では、ペグ化ポリペプチドは、非修飾タンパク質と関連する生物活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持することが好ましい。一実施形態では、生物活性とは、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆによって評価される標的分子と結合するその能力を指す。特定の一実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドタンパク質は、ペグ化されていない結合ポリペプチドと比較して、標的分子との結合の増大を示す。
ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス速度は、修飾されていない結合ポリペプチドのクリアランス速度と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％さえも低減され得る。ＰＥＧ修飾されたポリペプチドは、修飾されていないタンパク質の半減期と比較して増強されている半減期（ｔ１／２）を有し得る。ＰＥＧ結合ポリペプチドの半減期は、修飾されていない結合ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、またはさらに１０００％まで増強され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期は、緩衝生理食塩水中、または血清中などインビトロで決定される。その他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清またはその他の体液中のタンパク質の半減期などのインビボ半減期である。
多価ポリペプチドの脱免疫化（Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）
一態様では、本出願は、脱免疫化多価ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドの配列は、１つまたは複数のＢまたはＴ細胞エピトープを排除するよう変化している。
多価ポリペプチドは、所与の種に対して、非免疫原性またはより小さい免疫原性となるよう脱免疫化され得る。脱免疫化は、ポリペプチドの構造変化によって達成できる。当業者に公知の任意の脱免疫化技術を使用できる。例えば、タンパク質を脱免疫化するための１つの適した技術が、ＷＯ００／３４３１７に記載されており、その開示内容はその全文が本明細書に組み込まれる。要約すれば、本明細書に記載される一般法内の通常のプロトコールは、以下の工程を含む：
１．ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；
２．ペプチドのＭＨＣ分子との結合を調べること、ペプチド：ＨＬＡ複合体の、治療用タンパク質を受容する種に由来するＴ細胞受容体との結合を調べること、治療用タンパク質を受容する種のＨＬＡ分子を有するトランスジェニック動物を使用してポリペプチドまたはその一部を試験することまたは治療用タンパク質を受容する種に由来する免疫系細胞を用いて再構成されたこのようなトランスジェニック動物を試験することを含む任意の方法によって、ポリペプチドのアミノ酸配列内の潜在的Ｔ細胞エピトープを同定する工程；および
３．遺伝子工学または修飾されたポリペプチドを生成するためのその他の方法によって、１つまたは複数の潜在的Ｔ細胞エピトープを除去するためにポリペプチドを変化させる工程および試験のためにこのような変化したポリペプチドを生成する工程。
一実施形態では、ポリペプチドの配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在下で分析できる。例えば、ｓｉｔｅｗｅｈｉｌ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ．においてｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂ上の「モチーフ」データベースを検索することなどによって、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースとの比較を、例えば、行ってもよい。あるいは、ポリペプチドに由来する連続オーバーラップペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質とのその結合エネルギーについて試験している、Altuvia et al.によって考案されたものなどのコンピュータによるスレッディング法を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを同定してもよい（J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)）。コンピュータによる結合予測アルゴリズムとして、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）およびＭＨＣｐｒｅｄが挙げられる。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を補助するために、両親媒性およびＲｏｔｈｂａｒｄモチーフおよびカテプシンＢの切断部位およびその他のプロセシング酵素などの成功裏に提示されるペプチドと関連する関連配列特徴について検索できる。
潜在的（例えば、ヒト）Ｔ細胞エピトープが同定されると、次いで、Ｔ細胞エピトープを排除するために必要に応じて、１個または複数のアミノ酸を変化させることによってこれらのエピトープが排除される。通常、これは、Ｔ細胞エピトープ自体内の１個または複数のアミノ酸の変化を含む。これは、タンパク質の一次構造においてエピトープと隣接するアミノ酸または一次構造では隣接していないが、分子の二次構造において隣接するものを変化させることを含み得る。考慮される通常の変化は、アミノ酸置換であろうが、特定の場合には、アミノ酸付加または欠失が適当であるということもあり得る。すべての変化は、最終分子が、例えば、十分に確立された方法による組換え宿主からの発現によって調製され得るような組換えＤＮＡ技術によって達成できるが、タンパク質化学または分子変化の任意の他の手段の使用も使用できる。
同定されたＴ細胞エピトープが除去されると、脱免疫化配列を再度分析し、新規Ｔ細胞エピトープが作り出されていないことを確実にすることができ、有する場合には、エピトープ（単数または複数）を欠失させることができる。
すべてではないが、コンピュータによって同定されたＴ細胞エピトープは除去される必要がある。当業者ならば、個々のエピトープの「強度」またはむしろ潜在的免疫原性の有意性を理解するであろう。種々のコンピュータによる方法によって、潜在的エピトープのスコアが作成される。当業者ならば、高スコアのエピトープのみが除去される必要があり得るということを認識するであろう。また、当業者ならば、潜在的エピトープの除去とポリペプチドの結合親和性の維持の間にバランスがあるということを認識するであろう。したがって、１つの戦略は、ポリペプチドに置換を逐次導入し、次いで、抗原結合および免疫原性について試験することである。
一態様では、脱免疫化ポリペプチドは、ヒト被験体において元のポリペプチドよりも免疫原性ではない（またはむしろ、低減されたＨＡＭＡ反応を誘発する）。免疫原性を調べるアッセイは、十分に当業者の知識の範囲内にある。免疫応答を調べる当技術分野において認識される方法を実施して、個々の被験体において、または臨床試験の際にＨＡＭＡ反応をモニタリングできる。脱免疫化ポリペプチドを投与される被験体には、前記治療の投与の開始時およびその間中、免疫原性評価を与えることができる。ＨＡＭＡ反応は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む、当業者に公知の方法を使用して、被験体から得た血清サンプルにおいて脱免疫化ポリペプチドに対する抗体を検出することによって測定される。あるいは、Ｔ細胞活性化事象を測定するよう設計されたインビトロアッセイも、免疫原性を示す。
さらなる修飾
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、グリコシル化されている。Ｆｎ３ドメインは、通常、グリコシル化部位を含有しないが、このようなグリコシル化をタンパク質中に操作して入れてもよい。
タンパク質のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖との炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。これらは、本発明のタンパク質、特に、フィブロネクチンベースの足場タンパク質およびその対応するポリヌクレオチド中に操作して入れることができる。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的グリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンとの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用してもよい。
タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、１つまたは複数の上記のトリペプチド配列を含有するようアミノ酸配列を変化させることによって達成されることが好都合である（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。変化はまた、元の抗体の配列への１個または複数のセリンもしくはトレオニン残基の付加またはそれでの置換によって行ってもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するよう修飾される。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、Ｆｃ領域をさらに含むＦｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを増強する変異体である。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
一実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、ヒトエフェクター細胞の存在下で、より効率的に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し得る、またはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と、天然配列Ｆｃ領域よりも良好な親和性で結合し得る。このようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域の位置２５６、２９０、２９８、３１２、３２６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８または４３０のうち任意の１つまたは複数にアミノ酸修飾を含み得、ここで、Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数のものである。
核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本出願は、例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲまたはその他のタンパク質などのヒト標的と結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む多価ポリペプチドを提供する。特異的結合特性を有するＦｎ３ドメインを、迅速に生成し、試験する１つの方法は、Ａｄｎｅｘｕｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒ＆Ｄ企業の核酸−タンパク質融合技術である。この開示内容は、このようなインビトロ発現および核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を利用してタンパク質との結合にとって重要である、新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）と呼ばれるタグをつける技術の使用を記載している。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースの足場タンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、参照により本明細書に組み込まれる、Szostak et al.,米国特許第６，２５８，５５８号；同６，２６１，８０４号；同６，２１４，５５３号；同６，２８１，３４４号；同６，２０７，４４６号；同６，５１８，０１８号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／３４７８４；ＷＯ０１／６４９４２；ＷＯ０２／０３２９２５；およびRoberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297-12302, 1997参照。核酸−タンパク質融合技術のさらなる論述は、本出願の実施例ならびに材料および方法の節に見い出すことができる。
ベクター＆ポリヌクレオチド実施形態
本明細書に開示される種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成してもよい。コドン使用頻度(codon usage)は、細胞における発現を改善するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞種に応じて変わる。大腸菌およびその他の細菌、ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞については、特定化されたコドン使用パターンが開発されている。例えば、Mayfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 21;100(2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):96-105; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):446-9; Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512-38; and Sharp et al. Yeast. 1991 Oct;7(7):657-78参照。
核酸操作の一般的な技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning,: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)および定期的更新に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適した転写または翻訳調節エレメントと作動可能に連結されている。このような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御するための所望によるオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主において複製する能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。
本明細書に記載されるタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するその他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えによって生成してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであることが好ましい。天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダーまたはＰＣＴ公開ＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換してもよい。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレームでタンパク質をコードするＤＮＡとライゲートしてもよい。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、両者とも、ベクターが１種または複数の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。通常、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌にとって適しており、２ミクロンのプラスミド起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳類細胞中のクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は、通常、単に、それが初期プロモーターを含むために使用され得る）。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。通常の選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードするものであり、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
酵母において使用するための適した選択遺伝子として、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子がある（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１病変部が存在することは、ひいては、トリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を検出するのに効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する既知プラスミドによって補完される。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースの足場タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、その他の既知細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと作動可能に連結しているシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
真核生物のためのプロモーター配列は、公知である。実質的にすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域である（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）。ほとんどの真核細胞遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてが、真核細胞発現ベクターに適宜挿入される。
酵母宿主とともに使用するのに適した促進配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのその他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。
増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターであるその他の酵母プロモーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域がある。酵母発現において使用するための適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ特許公報番号７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られたプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するならば制御され得る。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として得られることが好都合である。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得られることが好都合である。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳類宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)も参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列(long terminal repeat)をプロモーターとして使用してもよい。
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大されることが多い。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）に由来する多数のエンハンサー配列が現在知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例として、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関しては、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、多価抗体をコードする配列の５’または３’側の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、プロモーターの５’側に位置することが好ましい。
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細胞生物に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のために、またｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。このような配列は通常、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’ 非翻訳領域、および場合により、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６およびそこで開示される発現ベクターを参照。
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例として、それだけには限らないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vector: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)中に見ることができ、その関連の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
発現コンストラクトは、当業者には明らかであるように、宿主細胞にとって適当な方法を使用して宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法が当技術分野で公知であり、これらには限らないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたはその他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性物質である）が挙げられる。
適した宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適した細菌として、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌またはバチルス種が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス種に由来する酵母、例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も、ポリペプチドの生成のために使用してよい。種々の哺乳類または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現することもできる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers, (Bio/Technology, 6:47, 1988)に総説されている。適した哺乳類宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製ポリペプチドは、組換えタンパク質を発現するのに適した宿主／ベクター系を培養することによって調製される。多数の適用のために、本明細書に開示される小さいサイズの多数のポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現を行う。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
本発明のグリコシル化されたタンパク質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体およびスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのために種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスを、本発明に従う本明細書におけるウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
いくつかの例では、グリコシル化などのために、脊椎動物細胞においてタンパク質を生成することが望ましく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養において増殖についてサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59. (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）; マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）；および骨髄腫またはリンパ腫細胞（例えば、Ｙ０、Ｊ５５８Ｌ、Ｐ３およびＮＳ０細胞）（米国特許第５，８０７，７１５号参照）が挙げられる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用できる。
タンパク質生成
宿主細胞は、タンパク質生成のために本明細書に記載される発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に改変された従来の栄養培地で培養される。本明細書に示される実施例では、ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）および中規模生成のために使用される宿主細胞は、ＨＭＳ１７４−細菌株であった。
本発明のタンパク質を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養してもよい。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地［（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）］、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地［（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）］などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号に記載される培地のいずれかも、宿主細胞のための培養培地として使用してよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートなど）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等なエネルギー供給源を用いて補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知である適当な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどといった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
本明細書に開示されるタンパク質はまた、細胞−翻訳系を使用して生成できる。このような目的上、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてｍＲＮＡを生成し、使用されている特定の無細胞系（哺乳類または酵母細胞などの真核細胞を含まない翻訳系または細菌細胞などの原核生物を含まない翻訳系）におけるｍＲＮＡの細胞を含まない翻訳を可能にするよう改変されなければならない。
本発明のタンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載される方法によって）生成できる。タンパク質への修飾も化学合成によって生成できる。
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られている、タンパク質の単離／精製法によって精製できる。限定されない例として、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドを、これらには限らないが、濾過および透析を含む当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって、異なるバッファーに交換してもよく、かつ／または、濃縮してもよい。
精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、最も好ましくは、少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは医薬製剤として使用するのに十分に純粋である。
イメージング、診断およびその他の適用
一態様では、本出願は、検出可能な部分で標識された多価ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、種々の診断的適用のために使用してもよい。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで生じることができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、Ｈ３、Ｃ１４もしくは１３、Ｐ３２、Ｓ３５またはＩ１３１などの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。
Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974);Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981);およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)によって記載される方法を含む、タンパク質を検出可能な部分にコンジュゲートするための当技術分野で公知の任意の方法を使用してもよい。インビトロ法は、ＣｙｓおよびＬｙｓなどの特定のアミノ酸のための化学などの、タンパク質と適合する化学を含む当技術分野で周知であるコンジュゲーション化学を含む。部分（ＰＥＧなど）を本発明のタンパク質に連結するために、連結基または反応性基が使用される。適した連結基は、当技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安的な基、感光基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安的な基が挙げられる。好ましい連結基として、適用に応じて、ジスルフィド基およびチオエーテル基がある。Ｃｙｓアミノ酸を含まないポリペプチドのためには、Ｃｙｓを、コンジュゲーションのための位置を作り出しながら、タンパク質の活性が存在するのを可能にする位置に操作して入れてもよい。
検出可能な部分で連結されている多価結合ポリペプチドはまた、インビボイメージングにとって有用である。ポリペプチドは、被験体に、好ましくは、血流中に投与される、放射線を通さない物質または放射性同位元素と連結でき、被験体中の標識されたタンパク質の存在および位置がアッセイされる。このイメージング技術は、悪性腫瘍のステージ分類および治療において有用である。タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学によってであれ、当技術分野で公知のその他の検出手段によってであれ、被験体において検出可能である任意の部分を用いて標識してもよい。
多価ポリペプチドはまた、アフィニティー精製物質として有用である。この過程では、ポリペプチドは、当技術分野で周知の方法を使用してセファデックス樹脂または濾紙のような適した支持体上に固定化されている。
多価ポリペプチドは、競合結合実験、直接および間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法において使用できる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)）。
特定の態様では、本開示内容は、サンプル中の標的分子を検出する方法を提供する。方法は、サンプルを、本明細書に記載される多価ポリペプチドと接触させる工程（前記接触は、ポリペプチド標的複合体形成を可能にする条件下で実施される）および前記複合体を検出し、それによって前記サンプル中の前記標的を検出する工程を含み得る。検出は、例えば、Ｘ線撮影、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴など、当技術分野で公知の任意の技術を使用して実施してもよい。サンプルは、生検、特に、腫瘍、疑わしい腫瘍の生検などの生物学的サンプルであることが多い。サンプルは、ヒトまたはその他の哺乳類に由来するものであり得る。多価ポリペプチドは、放射活性部分、蛍光部分、発色性部分、化学発光部分またはハプテン部分などの標識部分を用いて標識され得る。多価ポリペプチドは、固体支持体上に固定化され得る。
治療／インビボ使用
一態様では、本出願は、障害の治療において有用である多価ポリペプチドを提供する。本出願はまた、被験体に多価ポリペプチドを投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、哺乳類、特に、ヒトにとって医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、相当な有害な医学的結果を伴わずに動物に投与されるポリペプチドを指す。医薬上許容される多価ポリペプチドの例として、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメインおよび本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有する１０Ｆｎ３ドメインが挙げられる。
多価ポリペプチドは、癌などの障害において特に有用である。例示的な実施形態では、多価ポリペプチドは、２種の異なる標的と結合するＦｎ３ドメインを含む。２種の標的は、同一シグナル伝達経路内、または２種の別個のシグナル伝達経路内にあり得る。標的分子の一方は、多価ポリペプチドを、癌細胞などの特定の部位に「補充(recruit)」することができ、同時に、第２の標的分子との結合は、特定のシグナル伝達経路に影響を及ぼし得る。
本出願の一態様は、腫瘍の生物学に関与する１種または複数のタンパク質、例えば、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲなどを標的とする多価ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドの投与は、インビボでの腫瘍細胞増殖を阻害する。腫瘍細胞は、表皮、上皮、内皮、白血病、肉腫、多発性骨髄腫または中胚葉細胞を含む任意の細胞種に由来するものであり得るが、これに限定されない。異種移殖片腫瘍研究において使用するための一般的な腫瘍細胞株の例として、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞、ＤＵ−１４５（前立腺）細胞、ＭＣＦ−７（乳房）細胞、Ｃｏｌｏ２０５（結腸）細胞、３Ｔ３／］ＧＦ−ＩＲ（マウス繊維芽細胞）細胞、ＮＣＩ Ｈ４４１細胞、ＨＥＰ Ｇ２（肝細胞腫）細胞、ＭＤＡ ＭＢ２３１（乳房）細胞、ＨＴ−２９（結腸）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ（乳房）細胞、Ｕ２６６細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭ１８２２６およびＡ４３１細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、未処理動物における腫瘍の増殖と比較して、腫瘍細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、未処理動物における腫瘍の増殖と比較して、腫瘍細胞増殖を５０、６０、７０、８０％またはそれ以上阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の阻害は、動物がポリペプチドでの治療を開始した後、少なくとも７日または少なくとも１４日測定される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドとともに別の抗悪性腫瘍薬が動物に投与される。
特定の態様では、本開示内容は、腫瘍および／または腫瘍転移の治療および／または予防のために多価ポリペプチドを投与する方法を提供し、ここで、腫瘍は、脳腫瘍、尿生殖路の腫瘍、リンパ系の腫瘍、胃の腫瘍、咽頭腫瘍、単球性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌腫、膵臓癌、膠芽腫および乳癌からなる群から選択されることが特に好ましいが、それに制限されない。
特定の態様では、本開示内容は、多価ポリペプチドを、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭部癌、頚部癌、食道癌、婦人科の癌、甲状腺癌、リンパ腫、慢性白血病および急性白血病からなる癌性疾患の群から選択される疾患の治療のために投与する方法を提供する。
本発明の適当な実施形態とともに使用してもよいさらなる薬剤
本発明の一態様は、細胞傷害性薬剤と連結している多価ポリペプチドを提供する。このような実施形態は、必要に応じてインビトロまたはインビボ法によって調製できる。インビトロ法は、ＣｙｓおよびＬｙｓなどの特定のアミノ酸のための化学などの、タンパク質と適合する化学をはじめ、当技術分野で周知のコンジュゲーション化学を含む。細胞傷害性薬剤をポリペプチドと連結するために、連結基または反応性基が使用される。適した連結基は、当技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安的な基、感光基、ペプチダーゼに不安的な基およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。好ましい連結基として、ジスルフィド基およびチオエーテル基がある。例えば、コンジュゲートは、ジスルフィド交換反応を使用して、または抗体と細胞傷害性薬剤の間にチオエーテル結合を形成することによって構築できる。好ましい細胞傷害性薬剤として、マイタンシノイド、タキサンおよびＣＣ−１０６５の類似体がある。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、プロテアーゼ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピマーゼ（Ｒａｎｐｉｍａｓｅ）（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、酵素または蛍光タンパク質と連結している。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、マイタンシノイドまたはマイタンシノイド類似体と連結している。適したマイタンシノイドの例として、マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が挙げられる。適したマイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；同４，２５６，７４６号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６２，６６３号；同４，３６４，８６６号；同４，４５０，２５４号；同４，３２２，３４８号；同４，３７１，５３３号；同６，３３３，４１０号；同５，４７５，０９２号；同５，５８５，４９９号；および同５，８４６，５４５号に開示されている。
いくつかの実施形態では、多価ポリペプチドは、タキサンと連結している。本発明において使用するのに適したタキサンは、米国特許第６，３７２，７３８号および同６，３４０，７０１号に開示されている。
いくつかの実施形態では、多価は、ＣＣ−１０６５またはその類似体と連結している。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号；同６，３４０，７０１号；同５，８４６，５４５号および同５，５８５，４９９号に開示されている。
このような細胞傷害性コンジュゲートを調製するための魅力的な候補として、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された、強力な抗腫瘍抗生物質であるＣＣ−１０６５がある。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンなどのよく使用される抗癌剤よりもインビトロで約１０００倍強力である（B. K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)）。
メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシルおよびカリケアマイシンなどの細胞傷害性薬も、本発明のコンジュゲートの調製に適しており、薬物分子はまた、血清アルブミンなどの中間体担体分子を介して多価ポリペプチドと連結され得る。
その他の治療的処置または組成物では、多価ポリペプチドは、１種または複数のさらなる治療薬と同時投与されるか、または逐次投与される。適した治療薬として、これらには限らないが、標的治療薬、その他の標的生物製剤および細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤が挙げられる。場合によっては、同一または別個の治療上許容されるバイアル、シリンジまたは液体製剤を保持するその他の投与装置から薬剤を投与することが好ましい。
癌治療薬とは、患者に対して最小の影響しか有さずに、癌細胞を死滅させようとする、または癌細胞の増殖を制限しようとする薬剤である。したがって、このような薬剤は、癌細胞の特性（例えば、代謝、血管新生または細胞表面抗原提示）における、健常宿主細胞とのあらゆる相違を利用し得る。腫瘍形態学の相違は、介入のための可能性ある部位である：例えば、第２の治療薬は、固形腫瘍の内部の血管新生を遅延させ、それによって、その増殖速度を遅延させるのに有用である抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体であり得る。その他の治療薬として、これらには限らないが、グラニセトロンＨＣｌなどの補助剤、酢酸ロイプロリドなどのアンドロゲン阻害剤、ドキソルビシンなどの抗生物質、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、インターフェロンα−２ａなどの代謝拮抗薬、タキソールなどの細胞傷害性薬剤、ｒａｓファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤などの酵素阻害剤、アルデスロイキンなどの免疫調節物質およびメルファランＨＣｌなどのナイトロジェンマスタード誘導体などが挙げられる。
抗癌効力の改善のために多価ポリペプチドと組み合わせることができる治療薬として、オンコロジー治療において使用される多様な薬剤が挙げられ（Reference:Cancer, Principles & Practice of Oncology, DeVita、V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6th edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001）、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンチド、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリックス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ、トシツモマブ、インターフェロンα−２ｂ、メルファラム（ｍｅｌｐｈａｌａｍ）、ボルテゾミブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ、エルロニチブ（ｅｒｌｏｎｉｔｉｂ）、抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブまたはパニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ））、イクサベピロン、エポチロンまたはそれらの誘導体、ならびに細胞傷害性薬物と細胞表面受容体に対する抗体とのコンジュゲートが挙げられる。好ましい治療薬として、白金物質（カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、ゲムシタビンおよびカンプトセシンがある。
１種または複数のさらなる治療薬を、多価ポリペプチドの前に、それと同時に、またはその後に投与してもよい。当業者ならば、各治療薬について、特定の投与順序には利点があり得るということを理解するであろう。同様に、当業者ならば、各治療薬について、薬剤および本発明の抗体、抗体断片またはコンジュゲートが投与される間の時間の長さは変わるということを理解するであろう。
製剤および投与
本出願は、本明細書に記載される多価ポリペプチドを含む医薬上許容される組成物をさらに提供し、組成物は、本質的にエンドトキシンを含まない。多価ポリペプチドを含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する記載されるタンパク質を、所望による生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、水溶液、凍結乾燥された、またはその他の乾燥された製剤の形態で、保存のために調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これらの例として、リン酸、クエン酸およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；保存料（オクタデシイジメチルベンジル（ｏｃｔａｄｅｃｙｉｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストランを含めたその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
また、本明細書において製剤とは、治療されている特定の適応症にとって必要な２種以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。活性化合物の組合せの例が本明細書に提供される。このような分子は、意図される目的上効果的である量の組合せで適宜存在する。
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブランを通した濾過によって容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の適した例として、本発明のタンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、マトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタミンのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日にわたる分子の放出を可能にしながら、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。被包された本発明のタンパク質が体内に長時間とどまり得る場合には、それらは、３７℃で湿度に対する曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の可能性ある変化をもたらし得る。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考え出すことができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると見い出される場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適当な添加物を使用することおよび特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
当業者ならば、各治療薬の投与量は、薬剤の正体によって変わることは理解するであろうが、好ましい投与量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは、約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲であり得る。
治療適用のためには、多価ポリペプチドは、医薬上許容される剤形で被験体に投与される。それらは、ボーラスとして、または一定時間にわたる連続注入によって静脈内に、筋肉内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって投与され得る。タンパク質はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変部周囲経路によって投与され、局所ならびに全身治療効果を発揮し得る。適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況が必要とする際に、当業者によって決定され得る。適した担体、希釈剤および／または賦形剤の例として、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ ｗ／ｖ ＮａＣｌ）および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられる。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボ(ex vivo)で実施できる。
同時投与されるか、逐次投与されるかにかかわらず、多価ポリペプチドおよび１種または複数のさらなる治療薬の投与は、治療適用のために、上記のように起こり得る。同時投与に適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者によって、同時投与されている個々の治療薬の正体に応じて変わると理解される。
凍結乾燥されているのではなく水性の剤形で存在する場合には、タンパク質は、通常、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤されるが、これらの範囲の外側の広い変動も容認される。疾患の治療のための、多価ポリペプチドの適当な投与量は、上記で定義されるような、治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、予防または治療目的で抗体が投与されるかどうか、これまでの治療の経過、患者の病歴および抗体に対する反応ならびに主治医の裁量に応じて変わる。タンパク質は、１回で、または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。
さらなる特許参考文献
以下のさらなる特許出願および特許に記載される方法および組成物もまた、本開示内容に含まれる：
米国公開第２００５０１８６２０３号；同２００５００８４９０６号；同２００５０００８６４２号；同２００４０２０２６５５号；同２００４０１３２０２８号；同２００３０２１１０７８号；同２００６００８３６８３号；同２００６００９９２０５号；同２００６０２２８３５５号；同２００４００８１６４８号；同２００４００８１６４７号；同２００５００７４８６５号；同２００４０２５９１５５号；同２００５００３８２２９号；同２００５０２５５５４８号；同２００６０２４６０５９号；および米国特許第５，７０７，６３２号；同６，８１８，４１８号；および同７，１１５，３９６号；ならびにＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００５／０８５４３０；ＷＯ２００４／０１９８７８；ＷＯ２００４／０２９２２４；ＷＯ２００５／０５６７６４；ＷＯ２００１／０６４９４２；およびＷＯ２００２／０３２９２５。
参照による組み込み
本明細書に記載される特許文献およびウェブサイトを含めた、すべての文書および参考文献は、この文書中に全文で、または部分的に書かれるのと同程度に、参照によりこの文書に個別に組み込まれる。
配列表
ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに下線が引かれている１０Ｆｎ３（配列番号１）
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT

385A08 BCループ(配列番号2)
SWSARLKVAR

385A08 DEループ(配列番号3)
PKNVYT

385A08 FGループ(配列番号4)
TRFRDYQP

V2B BCループ(配列番号5)
SWRHPHFPTR

V2B DEループ(配列番号6)
PLQPPT

V2B FGループ(配列番号7)
TDGRNGRLLSIP

385A08-Fn-V2B (Serテール) (配列番号8)
Figure 2011520961
385A08-Fn-V2B (Cysテール) (配列番号9)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ

385A08-GS5 (配列番号21)-V2B (Serテール) (配列番号10)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ

385A08-GS10 (配列番号22)-V2B (Serテール) (配列番号11)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ

V2B-Fn-385A08 (Serテール) (配列番号12)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ (配列番号2)

V2B-Fn-385A08 (Cysテール) (配列番号13)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQ

V2B-GS5 (配列番号21)-385A08 (Serテール) (配列番号14)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ

V2B-GS10 (配列番号22)-385A08 (Serテール) (配列番号15)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ

V2B (Serテール) (配列番号16)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ

Serテール(配列番号17)
EIDKPSQ

Cysテール(配列番号18)
EIDKPCQ

Shortテール(配列番号19)
EIDK

Fnベースのリンカー(配列番号20)
PSTSTST

GS5リンカー(配列番号21)
GSGSGSGSGS

GS10リンカー(配列番号22)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS

(GGGGS)3 (配列番号23)
GGGGS GGGGS GGGGS

(GGGGS)5 (配列番号24)
GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS

G4SG4SG3SG (配列番号25)
GGGGSGGGGSGGGSG

AT577 (配列番号26)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ

AT580 (配列番号27)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQ

V2Bshort (配列番号28)
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ

385A08-GPG (配列番号32)-V2B (配列番号29)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

385A08-GPGPGPG (配列番号33)-V2B (配列番号30)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

385A08-GPGPGPGPGPG (配列番号34)-V2B (配列番号31)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

GPG (配列番号32)

GPGPGPG (配列番号33)

GPGPGPGPGPG (配列番号34)

385A08コア(配列番号35)
EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT

全Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含む３８５Ａ０８コア(配列番号36)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT

全Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含む３８５Ａ０８コアおよび短いテール（下線が引かれている）(配列番号37)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDK

Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含む３８５Ａ０８コアおよびSerテール（下線が引かれている）(配列番号38)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ

Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含む３８５Ａ０８コアおよびCysテール（下線が引かれている）(配列番号39)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQ

V2Bコア(配列番号40)
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含むV2Bコア(配列番号41)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT

全Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含むV2Bコアおよび短いテール（下線が引かれている）(配列番号42)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDK

全Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含むV2BコアおよびSerテール（下線が引かれている）(配列番号43)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ

全Ｎ末端伸長（下線が引かれている）を含むV2BコアおよびCysテール（下線が引かれている）(配列番号44)
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ

全Ｎ末端伸長(配列番号45)
MGVSDVPRDL

Ｎ末端伸長(配列番号46)
VSDVPRDL

Ｎ末端伸長(配列番号48)
GVSDVPRDL

PA3リンカー(配列番号60)
PAPAPA

PA6リンカー(配列番号61)
PAPAPAPAPAPA

PA9リンカー(配列番号62)
PAPAPAPAPAPAPAPAPA

385A08-Fn-V2B (修飾されたSerテール) (配列番号63)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS

385A08-Fn-V2B (修飾されたCysテール) (配列番号64)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC

385A08-PA3 (配列番号60)-V2B (修飾されたSerテール) (配列番号65)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS

385A08-PA3 (配列番号60)-V2B (修飾されたCysテール) (配列番号66)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC

385A08-PA6 (配列番号61)-V2B (修飾されたSerテール) (配列番号67)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS

385A08-PA6 (配列番号61)-V2B (修飾されたCysテール) (配列番号68)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC

385A08-PA9 (配列番号62)-V2B (修飾されたSerテール) (配列番号69)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS

385A08-PA9 (配列番号62)-V2B (修飾されたCysテール) (配列番号70)
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC

修飾されたSerテール(配列番号71)
EGSGS

修飾されたCysテール(配列番号72)
EGSGC
以下、本発明を、以下の実施例を参照することによって説明するが、これは、単に例示的なものであって、本発明を制限しようとするものではない。本発明は、特定の実施形態を参照して詳細に説明されているが、その趣旨および範囲を逸脱することなく、それに種々の変更および改変を行ってもよいということは当業者には明らかであろう。
いくつかのＶ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーを含む多価フィブロネクチン足場ドメインタンパク質
多価フィブロネクチン足場ドメインタンパク質の種々のコンストラクトを作製した。以下の表は、本明細書に記載されるコンストラクトおよびその配列番号を表す。
Figure 2011520961
Figure 2011520961
Figure 2011520961
３８５Ａ０８は、例示的ＩＧＦ−ＩＲバインダーである。Ｖ２Ｂは、例示的ＶＥＧＦＲ２バインダーである。２つのドメインは、グリシン−セリンベースのリンカー（例えば、ＧＳ５、配列番号２１およびＧＳ１０、配列番号２２）または第１および第２のヒトＦｎ３ドメインを結合するアミノ酸の修飾されたストレッチ（配列番号２０）のいずれかによって連結している。これらのＶ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーは、種々の方法で方向づけられ得る−例えば、Ｎ末端のＶ２ＢドメインまたはＮ末端のＩＧＦ−ＩＲドメイン。Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔは、Ｖ２Ｂのフィブロネクチンベースの足場ドメインの最初の８個のアミノ酸を欠くコンストラクトであり、その単一のシステイン残基でペグ化されている。ＡＴ５７７は、配列番号１７のＣ末端テールを有するＩＧＦ−ＩＲバインダーである。ＡＴ５８０は、配列番号１８のＣ末端テールを有するＩＧＦ−ＩＲバインダーである。具体的には、ＡＴ５８０は、配列番号２７によって表される。ＡＴ５８０−Ｐｅｇ２０−ＡＴ５８０は、ＰＥＧ結合を有する、その単一のシステイン残基によって結合されている２つのＩＧＦ−ＩＲバインダーである。ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０は、４０ｋＤペグが結合しているＩＧＦ−ＩＲバインダー（配列番号２７）である。以下の実験において使用される多価コンストラクトは、通常、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号５９）を含む。
Ｖ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーの発現
特定のＶ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーを、以下の材料および方法の節に記載されるハイスループットタンパク質生成プロセス（ＨＴＰＰ）を使用して精製した。図１は、Ｆｎリンカー、ＧＳ５リンカー（配列番号２１）およびＧＳ１０リンカー（配列番号２２）によって連結されているものを含めた、いくつかのＶ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーからの例示的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。図１は、試験された複数のコンストラクトの許容される発現レベルを示す。さらに、選択されたクローンはまた、不溶性バインダーの精製を包含していた中規模精製プロセスを使用して精製した。可溶性バインダーの精製を包含する代替法も使用できる。これらの中規模精製プロセスは、以下の材料および方法の節に記載されている。また、いくつかの特定のクローンは、以下の材料および方法の節に記載されている大規模精製プロセスを使用して精製した。
Ｖ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーの生物物理学的特徴
標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、特定のＨＴＰＰ中規模および大規模精製したＶ／Ｉ１０Ｆｎ３ベースのバインダーについて実施した。質量分析（ＬＣ−ＭＳ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析も、中規模および大規模プロセスから精製された特定のこれらのコンストラクトについて実施した。これらの分析法の各々は、以下の材料および方法の節に記載されている。
ＨＴＰＰ精製されたコンストラクトのＳＥＣ結果は、タンデム内の３８５Ａ０８（ＩＧＦ−ＩＲドメイン）またはＶ２Ｂ（ＶＥＧＦＲ−２ドメイン）サブユニットの配向に応じて変動した。Ｎ末端側に３８５Ａ０８サブユニット（すなわち、ｈｉｓタグを有する３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ）で、ＳＥＣは、図２に示されるように、主に単量体タンパク質を示した（球状分子量標準に対して２３ｋＤａ範囲に溶出される）。他方、Ｖ２Ｂサブユニットが、Ｎ末端側（すなわち、ｈｉｓタグを有するＶ２Ｂ−Ｆｎ−３８５Ａ０８、配列番号８）である場合には、これは、図３に示されるように、単量体（２３ｋＤａ）および二量体（球状分子量標準に対して４６ｋＤａ）の混合物をもたらした。Ｆｎリンカーの代わりに、ＧＳ５（配列番号２１）またはＧＳ１０リンカー（配列番号２２）が使用されたコンストラクトのＳＥＣ分析は、３８５Ａ０８およびＶ２Ｂサブユニットの配向に応じて同様の結果を示した。
中規模精製されたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（配列番号８）および３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９）のＳＥＣも評価した。中規模精製されたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグを有し、天然に存在するセリンをＣ末端に含む）については、ＳＥＣプロフィールは、主に単量体であり、球状分子量標準に基づいておよそ２３ｋＤａの範囲に溶出された。しかし、このコンストラクトのシステイン型（ｈｉｓタグを有する３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ）については、ＳＥＣは、単量体および二量体タンパク質の混合物を示した。通常、ペグ化目的でシステイン型が作り出されるということは留意すべきである。可溶性に発現され、精製された３８５Ａ０８−Ｆｎ−ＶＢ２（ｈｉｓタグを有する）および不溶性型で発現され、再フォールディングされた物質について、同等の結果が観察された。
選択された中規模コンストラクトを、ＬＣ−ＭＳによってさらに分析した。３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグを有する）のＬＣ−ＭＳによって測定された分子量は、２３，２６０ダルトンであり、これは、タンデムのアミノ酸組成から算出された「ｄｅｓＭｅｔ型」（第１のメチオニンが切断除去されているタンデムの型）の分子量に匹敵する。３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグを有する）のＬＣ−ＭＳによって測定される分子量は、２３，５８１ダルトンであり、これは、タンデムのアミノ酸組成に基づく理論的算出分子量の＋１７４ダルトンであり、このことは、最もあり得るＣｙｓ残基の翻訳後修飾を示す。さらに、３８５Ａ０８−ＧＳ１０（配列番号２２）−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグを有する、配列番号１１）のＬＣ−ＭＳは２４，０４０であり、このコンストラクトの理論的分子量に匹敵する。図４参照。
さらに、２種の中規模精製されたコンストラクトについて示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を実施した。実験的に決定された５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５における３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグを有する）のＴｍは、５１．４９℃に相当する。５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５における３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグを有する）のＤＳＣは、おそらくは、２つのタンデム間のジスルフィド結合形成による二量体の存在のために、４６．７７℃および５５．５２℃の２つの遷移状態を示した（図４参照）。
大規模精製され、ペグ化された３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ｈｉｓタグなし、配列番号９）についてもＳＥＣを実施した。このコンストラクトのＳＥＣは、図５に示されるように、９５．１％単量体である物質を示した。さらに、この同一コンストラクトでのＤＳＣ分析は、５６℃の温度で半分がアンフォールディングされており（図６参照）、最大４５℃までアンフォールディングは検出されないことを示した。
多価フィブロネクチンをベースとするタンパク質に対するペグ化の効果
フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、以下に記載される方法に従ってペグ化できる。直鎖または分岐ＰＥＧおよび種々の大きさのＰＥＧなど、種々の種類のＰＥＧを使用できる。特に、中規模および大規模精製された型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（配列番号９）を、４０ｋＤ直鎖および４０ｋＤ分岐ＰＥＧを用いてペグ化した。
マウスにおける１２０時間にわたる薬物濃度の分析は、分岐ＰＥＧを有するｈｉｓタグをつけた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓが１４．６時間の半減期を示し、一方で、このコンストラクトの直鎖ペグ化の型（ｈｉｓタグを有する）が１０．５時間の半減期を示すことを明らかにした（図７）。投与スケジュールおよび半減期算出の詳細は、以下の材料および方法の節に記載されている。ここおよび本文書の残りに報告されるアドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）のすべての濃度は、タンパク質に基づいており、化合物のＰＥＧ部分ではない。
多価フィブロネクチンをベースとするタンパク質についての、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析を使用する結合親和性の決定
いくつかのＶ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーを含む、選択されたＨＴＰＰ精製されフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を、以下の材料および方法の節に記載されるように、表面プラズモン共鳴を使用してＩＧＦ−ＩＲに対するその動態挙動について評価した。これらのクローンの解離定数、ＫＤは、図８の最初の列に示されている。
タンデムコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ペグ化なし、ｈｉｓタグをつけた型、配列番号８）の中規模精製の濃度系列も評価した。このコンストラクトの各ドメイン、具体的には、Ｖ２ＢドメインおよびＩＧＦ−ＩＲドメインの機能性を、以下の材料および方法の節に記載されるように評価した。Ｖ２Ｂドメインに関しては、ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃの３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２ＢのＫＤは、約０．３ｎＭであり、１．４×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１の平均結合速度、４．５×１０−４ｓｅｃ−１の平均解離速度を有していた。ＩＧＦ−ＩＲドメインに関しては、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃの３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２ＢのＫＤは、約２０ｐＭであり、１．１×１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１の結合速度および１．７×１０−４ｓｅｃ−１（１のｎ）の解離速度を有していた。
タンデム３８５Ａ０８−ＧＳ１０（配列番号２２）−Ｖ２Ｂ（配列番号１１）およびＶ２Ｂ−ＧＳ１０（配列番号２２）−３８５Ａ０８（配列番号１５）の中規模精製された材料のデータも集めた。両コンストラクトは、ｈｉｓタグを含んでいた。ＩＧＦ−ＩＲドメインのＫＤは、それぞれ、４０ｐＭおよび５０ｐＭであった。Ｖ２ＢドメインのＫＤは、それぞれ、０．５ｎＭおよび０．６ｎＭであった。直鎖ペグ化、ｈｉｓタグをつけた中規模精製された型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９）のさらなるデータを集めた。ＩＧＦ−ＩＲドメインのＫＤは、１．２ｎＭであった。Ｖ２ＢドメインのＫＤは、１４ｎＭであった。これらのデータは、図９に示されている。
ペグ化された型のタンデムコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９、ｈｉｓタグを有する、および有さない）の、中規模および大規模材料から、親和性データも測定した。これらの算出のための特定の材料および方法は、以下に記載される。結果は、ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃと結合している試験された種々のコンストラクトは、３．１５Ｅ＋０５Ｍ−１ｓ−１＋／−０．９４Ｅ＋０５Ｍ−１ｓ−１の平均結合速度、２．４７Ｅ−０４ｓ−１＋／−０．１８Ｅ−０４ｓ−１の平均解離速度を有するということを示す。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃについては、測定された平均結合速度は、１．１５Ｅ＋０４Ｍ−１ｓ−１＋／−０．６２Ｅ＋０４Ｍ−１ｓ−１であり、解離速度は、１．０２Ｅ−０４ｓ−１＋／−０．２１Ｅ−０４ｓ−１であった。これらのデータは、図１０に示されている。この実験形式を使用したＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ１Ｒの平均の算出された親和性は、それぞれ、１０．５±０．４８ｎＭおよび０．８４±０．２２ｎＭである。
競合ＩＧＦ１Ｒおよび競合ＶＥＧＦＲ−２阻害アッセイ
特定のタンデムコンストラクトを、インビトロで単一特異性ＩＧＦ−ＩＲおよびＶＥＧＦＲ−２バインダーと競合するその能力について評価した。特に、ペグ化されたｈｉｓタグのついた型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９）は、単一特異性のＩＧＦ−ＩＲ１０Ｆｎ３をベースとするバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）の、細胞表面ＩＧＦ−ＩＲとの相互作用を乱すことが示された。ＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する細胞株Ｒ＋を使用して、本発明者らは、高親和性の二価１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ１Ｒバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ２０−ＡＴ５８０、配列番号２７）の相互作用の阻害のＩＣ５０が、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓについて９００ｎＭであるのに対し、ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０については６００ｎＭであるということがわかった。このことは、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓは、ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０のものと同様のＩＧＦ−ＩＲ親和性を有するということを示唆する。図１１は、このデータを示す。
同様に、ペグ化されたｈｉｓタグのついたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓは、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）の、２９３：ＫＤＲ細胞上に存在するＶＥＧＦＲ−２との相互作用を阻害できた。２９３：ＫＤＲアッセイから得た結果は、ペグ化されたｈｉｓタグのついたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓについて約１４０ｎＭのＩＣ５０を示したのに対し、Ｐｅｇ−Ｖ２ＢｓｈｏｒｔのＩＣ５０は約２０ｎＭである（図１２参照）。Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔおよびペグ化されたｈｉｓタグのついたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ間の活性の７倍の相違は、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓのＶＥＧＦＲ−２結合部分が、Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔと比較して、ＶＥＧＦＲ−２に対して約５倍低い親和性を有するという事実と一致する。特に、Ｂａ／Ｆ３アッセイ（以下に記載される）では、単量体のペグ化されていないＶＥＧＦＲ２バインダーＶ２Ｂｓｈｏｒｔ（配列番号２８）のＩＣ５０は、約０．１〜３ｎＭであるのに対し、配列番号４４を有する単量体のペグ化されていないＶＥＧＦＲ２バインダー（例えば、Ｎ末端伸長を有する）のＩＣ５０は、約８〜１３ｎＭである。したがって、タンデムコンストラクト中に含まれるＶＥＧＦＲ２バインダーの型（例えば、Ｎ末端伸長を含む配列番号４４を有する）は、このアッセイに使用された単量体ＶＥＧＦＲ２バインダー（例えば、配列番号２８を有する）と比較して、ＶＥＧＦＲ２に対して約５倍低い親和性を有する。Ｒ＋および２９３：ＫＤＲ細胞をベースとする競合阻害アッセイの両方とも、以下の材料および方法の節に詳細に記載されている。
インビトロ増殖アッセイ
いくつかのＶ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーを含めた特定の精製されたコンストラクトを、Ｂａ／Ｆ３およびＲｈ４１細胞をベースとするアッセイにおいて評価して、活性を確認した。ＩＣ５０は、図８（列２、３）に表されている。さらに、特定の精製されたコンストラクトを、Ｒｈ４１およびＨＭＶＥＣ−Ｌ増殖アッセイ（同様に、以下の材料および方法の節に記載される）において評価した。これらのコンストラクトを、ＩＧＦ１Ｒ（ＭＡＢ３９１）に対する単一特異性抗体、ＶＥＧＦに対する単一特異性抗体（ベバシズマブ）、別の単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ１Ｒバインダー（ＡＴ−５７７、配列番号２６）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および標的と結合しない野生型１０Ｆｎ３をベースとするタンパク質（ＳＧＥ）と比較した。データは、タンデムのいずれの配向も（例えば、Ｉ部分がＮ末端であろうと、Ｖ部分がＮ末端であろうと）またはリンカーの選択も結果に影響を及ぼさなかったと示す。このデータは、図１３に要約されている。さらに、Ｂａ／Ｆ３およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞増殖アッセイを実施して、特定のｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのない型のペグ化コンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（配列番号９）を比較した。これらのコンストラクトを、ＭＡＢ３９１、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダーＡＴ５８０−ＰＥＧ４０（配列番号２７）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ２バインダーＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ（配列番号２８）と比較した。これらのデータは、図１４に要約されている。
細胞ベースのアッセイにおける、多価フィブロネクチンをベースとするタンパク質の活性化およびシグナル伝達活性
選択されたＶ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーを、リガンドによって刺激されるＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲ活性化ならびに下流のＭＡＰキナーゼシグナル伝達を直接干渉する能力についてスクリーニングした。ＨＥＫ／２９３細胞およびブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を、ＶＥＧＦＲ２を用いてトランスフェクトした。ＶＥＧＦによる刺激は、両細胞種において、ＶＥＧＦＲのリン酸化および下流のシグナル伝達を誘導する。ＩＧＦ１による刺激は、両細胞種において、ＩＧＦ−ＩＲのリン酸化および下流のシグナル伝達を誘導する。図１５参照。ＰＡＥおよびＨＥＫ／２９３アッセイに関するさらなる詳細は、以下の材料および方法の節に論じられている。
図１６は、ＨＥＫ／２９３細胞に対する種々の多価タンパク質の効果を表す。ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチン足場ドメインを含む多価タンパク質のすべてが、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲのレベルを、単一ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチン足場ドメインタンパク質（ＡＴ５７７）と比較して同様のレベルに低下させた。ＶＥＧＦＲ２結合フィブロネクチン足場ドメインを含む多価タンパク質のすべてが、リン酸化ＶＥＧＦＲのレベルを、単一ＶＥＧＦＲ２結合フィブロネクチン足場ドメインタンパク質（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ）と比較して同様のレベルに低下させた。細胞増殖を、種々のコンストラクトに対する曝露後の［３Ｈ］−チミジン取り込みによって評価した。
図１７は、ＰＡＥ細胞に対する種々の多価タンパク質の効果を表す。ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチン足場ドメインを含む多価タンパク質のすべてが、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲのレベルを、単一ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチン足場ドメインタンパク質（ＡＴ５７７）と比較して同様のレベルに低下させた。ＶＥＧＦＲ２結合フィブロネクチン足場ドメインを含む多価タンパク質のすべてが、リン酸化ＶＥＧＦＲのレベルを、単一ＶＥＧＦＲ２結合フィブロネクチン足場ドメインタンパク質（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ）と比較して同様のレベルに低下させた。細胞増殖を、種々のコンストラクトに対する曝露後の［３Ｈ］−チミジン取り込みによって評価した。
これらの結果は、例示的ポリペプチドリンカーは、フィブロネクチン足場ドメインを、リガンドとのその結合、したがって、受容体シグナル伝達を阻害するその能力が保持される配向で連結できるということを示す。
肺由来の初代ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）において、タンデムコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９、ＰＥＧを有する、および有さない；ｈｉｓタグを有する、および有さない）の特定の変種についてさらなる研究を実施した。ＨＭＶＥＣ−Ｌにおいて、以下を測定するアッセイを実施した：細胞増殖、リガンド誘導性ＶＥＧＦＲ−２およびＩＧＦ−１Ｒ活性の阻害（ウエスタンブロット解析による）、内皮細胞における細胞内カルシウムの動員（Ｃａ２＋流）および管として知られる新生毛細血管様構造の形成を阻害する能力。ウエスタンブロット解析による、リガンド誘導性ＶＥＧＦＲ−２およびＩＧＦ−１Ｒ活性の阻害を測定するさらなる研究も、Ｒｈ４１細胞において実施した。これらの各アッセイは、以下の材料および方法の節にさらに詳細に記載されている。
細胞増殖アッセイから得た結果は、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトの特定の変種は、ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞において増殖を阻害し、９０ｎＭから１６７ｎＭの間の範囲のＩＣ５０を有するということを示した（図１８参照）。一実施例では、ペグ化されたｈｉｓタグをつけていない型のこのコンストラクトは、ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞において増殖を阻害し、約１６７ｎＭのＩＣ５０を有していたのに対し、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）は、約４７ｎＭのＩＣ５０を有していた。
３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトの、ＩＧＦ−１ＲおよびＶＥＧＦＲ−２を阻害する能力を評価するために、ウエスタンブロット解析を行って、試験化合物の存在下または不在下での自己リン酸化によるＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞におけるリガンド誘導性ＶＥＧＦＲ−２およびＩＧＦ−１Ｒ活性の活性を測定した。適当な対照は、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）を含んでいた。コンストラクトは、ｐＶＥＧＦＲ−２（ｐＶＥＧＦＲ−２は、ホスホ−ＶＥＧＦＲ−２である；ｐ−Ｆｌｋ−１としても知られる）、ｐＩＧＦ−１ＲおよびｐＡＫＴ活性（図１９参照）を全般的に阻害した。ペグ化されたｈｉｓタグをつけていない型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトは、１０ｎＭで始まる用量に応じたｐＶＥＧＦＲ−２活性の阻害を示し、１００ｎＭでほぼ完全な阻害が達成された。この同じ化合物はまた、阻害のＩＣ５０が１００ｎＭであったＡＴ５８０−ＰＥＧ４０と比較して、１ｎＭから１０ｎＭの間でｐＩＧＦ−１Ｒ活性を強く阻害した。
３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトの特定の変種の、ＩＧＦ−１Ｒ駆動性腫瘍細胞株においてＩＧＦ−１Ｒを阻害する能力を評価するために、ウエスタンブロット解析を実施して、試験化合物の存在下または不在下での自己リン酸化によるＲｈ４１細胞におけるリガンド誘導性ＩＧＦ−１Ｒ活性の活性を測定した。ｐＩＧＦ−１Ｒ活性の阻害は、通常、すべての３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトについて１００ｎＭの用量で観察された。ｐＡＫＴの阻害は、試験されたすべての３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトについて、変動するレベルで観察された。一実施例では、ペグ化されたｈｉｓタグをつけていない型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトは、約１〜１０ｎＭの範囲で用量に応じて開始するｐＩＧＦ−１Ｒ活性の阻害を示し、阻害は、１００ｎＭでほぼ完全であった。これらのデータは、図２０に要約されいる。
ＶＥＧＦは、内皮細胞において細胞内カルシウムの動員を刺激するので（Ku, D.D., et al., Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries. Am J Physiol, 1993. 265(2 Pt 2): p. H586-92に記載されるように）、カルシウム放出（Ｃａ２＋）を阻害する能力は、ＶＥＧＦＲ−２阻害剤の、細胞をベースとするシグナル伝達のもう１つの尺度である。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞においてカルシウム放出を測定するアッセイでは、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓコンストラクトの特定の変種は、Ｃａ２＋放出の阻害を示し、４〜１０ｎＭのＩＣ５０を有していた。単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）について、同様のレベルの阻害が示された。この研究の結果は、図２１に要約されている。
多価フィブロネクチンをベースとするタンパク質に関する腫瘍異種移殖片有効性研究
ペグ化されたｈｉｓタグのついた型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、ＲＨ−４１ヒト横紋筋肉腫モデル、Ａ５４９ヒト肺モデル、ＧＥＯ結腸腫瘍異種移殖片モデルおよびＡ６７３ユーイング肉腫異種移殖片腫瘍モデルを使用して複数の腫瘍研究において評価した。ＲＨ−４１およびＡ６７３は、両モデルが、これまでにＩＧＦ−１Ｒ阻害に対して感受性を示しているので３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いるインビボ試験のために選択した。単量体ＶＥＧＦＲ２阻害剤であるＰＥＧ−Ｖ２Ｂ−ｓｈｏｒｔ（単一システイン残基でＰＥＧが結合している配列番号２８）と比べて、多価コンストラクトによるＶＥＧＦＲ２阻害の効力を比較するために、ＩＧＦ１Ｒ阻害に対してそれほど感受性ではないＡ５４９およびＧＥＯを選択した。これらのモデルは、以下の材料および方法の節により詳細に記載されている。
ＲＨ−４１腫瘍異種移殖片モデルは、ＩＧＦ−ＩＲ阻害に対して感受性であると示されている。ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、１００ｍｇ／ｋｇの単一用量レベルを使用して３×ｗｋスケジュールで投与した。図２２に例示されるように、セグメントＡ、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、このレジメンを使用して３週間投与した際に腫瘍増殖遅延の誘導において効果的であった。ＩＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の標的結合の同程度の化学量論を生じるはずである、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）の組合せと比較すると、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、同様の抗腫瘍活性をもたらした。さらに、多価コンストラクトを用いて達成された抗腫瘍活性は、腫瘍増殖阻害パーセント（％ＴＧＩ）に基づいて、これらの薬剤が個々に投与された場合に観察されたものよりも優れていた。これらの薬剤のいずれについても、罹病率、挙動変化または大幅な体重減少（例えば、＞５％）によって定義されるような明白な毒性は観察されなかった。図２２に要約されるように、セグメントＢ、これらの薬剤のすべては、＞５０％ＴＧＩをもたらすのに効果的であったが、ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの組合せ、ならびにペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ単独の両方とも、各薬剤単独と比較した場合にＴＧＩ％の増大をもたらした。
３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（Ｐｅｇを有する）コンストラクトは、マウスＩＧＦ１Ｒと結合するよりもかなり高い親和性でヒトＩＧＦ１Ｒと結合する。特に、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（Ｐｅｇを有する）は、ヒトＩＧＦ１Ｒと、２７７ｐＭのＫｄで、サルＩＧＦ１Ｒと、２１３ｐＭのＫｄで、ラットＩＧＦ１Ｒと、９２，０００ｐＭのＫｄで、マウスＩＧＦ１Ｒと、８６，０００ｐＭのＫｄで結合する。この研究に使用した腫瘍異種移殖片モデルは、ヒトＩＧＦ１Ｒを示すヒト腫瘍を含むが、マウスＩＧＦ１Ｒを発現するマウス内皮細胞も含む。マウスＩＧＦ１Ｒとの３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（Ｐｅｇを有する）の結合親和性が、ヒトＩＧＦ１Ｒのものよりもかなり低いので、このモデルで見られる効果は、腫瘍阻害に対する３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（Ｐｅｇを有する）の効果を過小評価し得る。特に、内皮細胞上に発現されたＩＧＦ１Ｒの結合親和性が高かった場合には、腫瘍増殖阻害はより大きいものであり得る。
ＲＨ−４１腫瘍異種移殖片モデルを使用する第２の研究では、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇを含めたいくつかの用量レベルにわたって評価した。これらのレベルはまた、個々にターゲッティングされる単一特異性バインダー、例えば、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）各々の組み合わせた同等なＡＰＩ（原薬（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ））用量レベルと比較した。この研究の結果は、図２３に例示されており、ここでは、明確にする目的で、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの各用量レベルが、個々のＡＴ５８０−ＰＥＧ４０およびＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの対応する組合せ用量レベルと比較して個々に示されている。ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０およびＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの組合せは、好都合なことに、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓに匹敵し、同様のＴＧＩ％をもたらした。さらに、すべての用量レベルのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、７５〜８３％ＴＧＩの範囲である同様の抗腫瘍活性をもたらした（図２３、セグメントＤに例示される）。結果として、確定的な抗腫瘍用量反応曲線を作成し、この腫瘍モデルにおける最小有効用量レベルを決定するためには、低用量レベルのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓでさらなる用量設定が必要となろう。
Ａ５４９腫瘍モデルにおいても、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの抗腫瘍活性を、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）、ならびにこれら２種の単一特異性バインダーを用いる併用療法（図２４参照）と比較して評価した。試験した２種の用量レベルでＡＴ５８０−ＰＥＧ４０に対する抗腫瘍反応がないこと（図２６、セグメントＡおよびＣ）を考え、また、５０％未満のＴＧＩに基づいて（図２６、セグメントＢおよびＤ）、このモデルは、ＩＧＦ−１Ｒの阻害に対して非感受性であると思われる。さらに、ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０およびＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの組合せは、試験された両投与レベルで活性であったＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ単独の投与と比較した場合に抗腫瘍活性の増強をもたらさなかった。ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いて達成された腫瘍増殖阻害のレベルは、単独で投与されたＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔを用いて見られたものに匹敵したという知見は、このモデルにおいて観察された抗腫瘍活性は、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓおよびＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの抗ＶＥＧＦＲ−２活性に属すると思われるということを示唆する。
匹敵する結果はまた、これらの薬剤が、同様にＩＧＦ−１Ｒの阻害に対して非感受性であると思われるＧＥＯヒト結腸異種移殖片モデルにおいて評価された場合にも得られた（図２５）。このモデルでは、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、１００ｍｇ／ｋｇで不活性であり（図２７、セグメントＡおよびＢ）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）は、試験された両用量レベルで不活性であった（図２５、セグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、２００ｍｇ／ｋｇという高用量レベルで活性であり、＞５０％ＴＧＩに基づく抗腫瘍活性を示した（図２５、セグメントＣおよびＤ）。Ａ５４９モデルを使用して得た知見と同様に、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）は、ＧＥＯモデルに対して活性であり、このことは、このモデルにおいて、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いて観察された抗腫瘍活性は、単に、抗ＶＥＧＦＲ−２成分によるものであり得るということ、およびＧＥＯモデルは、ＩＧＦ−ＩＲ阻害に対して非感受性であるということを示唆する。このモデルにおける、Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔを用いて観察された抗腫瘍活性の増大（ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓと比較した）（図２５、セグメントＡおよびＢに例示される）は、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓコンストラクト中に含まれるＶＥＧＦＲ２結合サブユニットと比較して、単量体Ｐｅｇ−Ｖ２ＢｓｈｏｒｔによるＶＥＧＦＲ−２に対する高い結合親和性の反映である可能性がある（上記の実施例６参照）。
Ａ６７３ユーイング肉腫異種移殖片モデルでは、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、図２６に示されるように、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）よりもわずかに弱い抗腫瘍活性を示した（それぞれ、ＴＧＩ＝７２．４％対８２％）。これは、Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔと比較した、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの抗ＶＥＧＦＲ２ドメインの低い親和性（約４〜５倍低い）の結果である可能性がある（上記の実施例６参照）。他方、組合せ群における抗腫瘍活性は、Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔのものに匹敵し（それぞれ、ＴＧＩ＝８０．２対８２％）、このことは、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）投与に対する反応（ＴＧＩ＝２４．７％）によって証明されるように、抗腫瘍活性全体へのＩＧＦ−ＩＲ阻害の貢献は、むしろ取るに足らないものであったので、Ａ６７３ユーイング肉腫異種移殖片モデルは、ＩＧＦ−ＩＲ阻害に対して非感受性であるということを示唆する。１００ｍｇ／ｋｇのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓならびにＰｅｇ−Ｖ２ＢｓｈｏｒｔおよびＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ＋ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０の組合せに由来する抗腫瘍活性は、媒体とは大幅に異なっていた。さらに、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（５０対１００ｍｇ／ｋｇ）に対して試験された２種の異なる用量間に、研究の最後に用量反応があると思われたが（１８日目、それぞれ、ＴＧＩ＝５６．８％対７２．４％）、統計的に有意な２種間の差には達しなかった（図２６）。
Ａ６７３ユーイング肉腫モデルにおいて、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ用量反応も評価した。２０ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ間の用量の抗腫瘍活性を比較した；この用量範囲は、最小対最大の有効用量を区別する可能性を最大化するよう選択した。種々の用量のペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、用量依存性抗腫瘍反応を示さなかった。実際、２０、６０および１００ｍｇ／ｋｇの用量は、互いに区別できず（それぞれ、ＴＧＩ＝５８．３、６７．１、６３．１）、２００ｍｇ／ｋｇは最大の阻害活性を有していた（ＴＧＩ＝８０．５％）。
多価フィブロネクチンをベースとするタンパク質に関するＰＫ／ＰＤ研究
マウスにおけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いた単回用量薬物動態研究
図２７には、マウスにおけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの薬物動態パラメータが要約されている。５または５０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投薬後、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ血清濃度は、わずかに二指数関数的低下を示した。ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓのＣＬＴｐは、０．１１〜０．１２ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇであった。Ｖｓｓ（０．１０〜０．１２Ｌ／ｋｇ）は、血漿容量よりも多かったが、細胞外液の容量（０．２Ｌ／ｋｇ）よりも少なかった。ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓのＭＲＴおよびＴ１／２は、それぞれ、１５．２〜１６．８および１３．０〜２１．４時間であった。
５または５０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ投薬後、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは迅速に吸収され（Ｔｍａｘ＝１．４〜３．０時間）、血清濃度−時間プロフィールは、ＩＶ投与後のものと同様である。吸収は、ほぼ完全であり、８３．１〜１０５．８％の絶対ＩＰバイオアベイラビリティを有していた。５および５０ｍｇ／ｋｇの平均Ｃｍａｘは、それぞれ、１．５および１４．４μＭであった。
Ｒｈ４１腫瘍を保有するヌードマウスにおけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いる単回用量薬物動態／薬力学的研究
Ｒｈ４１腫瘍を保有するヌードマウスへの２０および２００ｍｇ／ｋｇのｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓのＩＰ投薬後、ｍＶＥＧＦ−Ａレベルは、血漿において用量および時間依存性増大を示した（図２８）。間接反応ＰＤモデルを使用して、ＶＥＧＦＲ−２とのその結合を阻害することによって血漿からのｍＶＥＧＦ−Ａのクリアランスを阻害した、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの血漿ＩＣ５０を、２００ｍｇ／ｋｇにおいて１３．８μＭであると推定した。２０ｍｇ／ｋｇでは、ｍＶＥＧＦ−Ａ濃度のダイナミックレンジが、ＰＤパラメータの意味のある推定値を得るには低すぎる可能性がある。
Ａ６７３腫瘍を保有するヌードマウスにおける３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついていない）を用いる単回用量薬物動態／薬力学的研究
Ｒｈ４１腫瘍を保有するヌードマウスにおいて観察された知見と一致して、ｍＶＥＧＦ−Ａレベルは、Ａ６７３腫瘍を保有するヌードマウスへの２０および２００ｍｇ／ｋｇのｈｉｓタグのついていない３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓのＩＰ投薬後に、血漿において用量および時間依存性増大を示した、図２９。間接反応ＰＤモデルを使用して、ＶＥＧＦＲ−２とのその結合を阻害することによって血漿からのｍＶＥＧＦ−Ａのクリアランスを阻害した、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついていない）の血漿ＩＣ５０を、２００ｍｇ／ｋｇにおいて７．０μＭであると推定した。２０ｍｇ／ｋｇでは、ｍＶＥＧＦ−Ａ濃度のダイナミックレンジが、ＰＤパラメータの意味のある推定値を得るには低すぎる可能性がある。
サルにおけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いた単回用量薬物動態／薬力学的研究
図３０には、３または３０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投薬後の、サルにおけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの薬物動態パラメータが要約されている。ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ血漿濃度は、ＩＶ投薬後に一または二指数関数的低下を示し、最終相で濃度の大幅な低下があった。ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの血漿濃度の低下は、おそらくは、研究の血漿サンプルにおいて検出された中和抗体の形成による。結果として、最終時点での血漿濃度は、非コンパートメント解析に含めなかった。
サルでは、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓは、３および３０ｍｇ／ｋｇ間の薬物動態においてわずかな用量依存性を示した。３および３０ｍｇ／ｋｇでのＣＬＴｐは、それぞれ、０．０２９および０．０２３ｍＬ／分／ｋｇであった。Ｖｓｓは、０．０５６〜００７８Ｌ／ｋｇの範囲であり、血漿容量より多かった。３０ｍｇ／ｋｇでのｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ＣｙｓのＭＲＴおよびＴ１／２は、それぞれ、５７．９および４２．７時間であり、３ｍｇ／ｋｇで観察されたもの（それぞれ、３４．５および２３．２時間）よりもわずかに長かった。
ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの血漿濃度と、循環ｈＶＥＧＦ−Ａレベルの上昇の間の関係を理解するために、ＰＫ／ＰＤモデリングを実施した。最終相におけるｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの血漿濃度の低下に適合させるために、ＰＫモデルに中和抗体による追加のクリアランス機序を含めた。適合させた、対観察されたＰＫプロフィールは、図３１に示されている。ＶＥＧＦＲ−２とのその結合を阻害することによって血漿からのｈＶＥＧＦ−Ａのクリアランスを阻害した、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの血漿ＩＣ５０を、サルでは７７〜３４９ｎＭであると推定し、２２８ｎＭの総平均を有していた。
サルにおける３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）を用いた単回用量薬物動態／薬力学的研究
図３２には、３ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量ならびに同一用量での同一サルへの再投薬後の、サルにおける３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）の薬物動態パラメータが要約されている。ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓと同様に、第１の投薬後に最終相で３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）の血漿濃度の低下があった。結果として、最終時点での血漿濃度は、非コンパートメント解析に含めなかった。しかし、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）を同一サルに再投薬した場合には、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）の薬物動態に対する抗体の効果は大きなものではないと思われた（図３２）。さらに、サルでは、薬物動態３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）は、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓのものに匹敵した。
３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）の血漿濃度と、循環ｈＶＥＧＦ−Ａレベルの上昇の間の関係を理解するために、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓに行ったものと同様に、ＰＫ／ＰＤモデリングも実施した。適合させた、対観察されたＰＫプロフィールは、図３３に示されている。ＶＥＧＦＲ−２とのその結合を阻害することによって血漿からのｈＶＥＧＦ−Ａのクリアランスを阻害した、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ｈｉｓタグのついていない）の血漿ＩＣ５０を、サルでは６８〜２３１ｎＭであると推定し、１５９ｎＭの総平均を有していた。これらの結果は、ｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを用いて観察されたものと一致する。
材料および方法
ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）。Ｈｉｓ６タグ（配列番号５９）を含有する選択されたバインダーを、ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞に形質転換し、５ｍｌの５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地に２４ウェルフォーマットで播種し、３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物から２００μｌを吸引することおよび適当なウェルに分配することによって、誘導性発現のために、新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）培養物を調製した。培養物を３７℃でＡ６０００．６〜０．９まで増殖させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃で６時間発現させ、４℃における２，７５０×ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
細胞ペレット（２４ウェルフォーマット中）を、４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼ、２μｇ／ｍｌアプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１〜３時間振盪することによって溶解した。溶解物を清澄化し、９６ウェル、１．２ｍＬキャッチプレートが取り付けられた９６ウェルＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｄ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒに移すことによって９６ウェルフォーマットに再び入れ、陽圧によって濾過した。清澄化した溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化されている９６ウェルのＮｉキレートプレートに移し、５分間インキュベートした。結合してない物質を真空によって除去した。樹脂を、洗浄バッファー１番（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて２×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、各洗浄液を真空によって除去した。次いで、樹脂をＰＢＳを用いて３×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、各洗浄工程で真空によって除去した。溶出に先立って、各ウェルを５０μｌの溶出バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、洗浄液を真空によって廃棄した。各ウェルにさらなる１００μｌの溶出バッファーを適用することによってタンパク質を溶出した。室温で３０分インキュベーションした後、プレート（単数または複数）を、２００ｇで５分間遠心分離した。溶出されたタンパク質を、溶出に先立って溶出キャッチプレートの底に加えた５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含有する９６ウェルキャッチプレート中に集めた。溶出されたタンパク質を、ＳＧＥをタンパク質標準として用いるＢＣＡアッセイを使用して定量した。
不溶性フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの中規模発現および精製。発現のために、選択されたクローン（単数または複数）とそれに続くＨｉｓ６タグ（配列番号５９）を、ｐＥＴ９ｄ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞中で発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一プレーティングされたコロニーから作製した）を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１リットルのＬＢ培地に播種した。培養物を３７℃でＡ６０００．６〜１．０まで増殖させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃で６時間増殖させ、４℃において≧１０，０００ｇでの３０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。細胞ペレットを、氷上でＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘホモジナイザー（ＩＫＡ ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によって達成した。４℃、２３，３００×ｇで３０分間の遠心分離によって不溶性画分を分離した。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した。ペレットを、超音波処理を用いて２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中、６．０Ｍ塩酸グアニジンに再可溶化し、続いて、３７℃で１〜２時間インキュベートした。再可溶化されたペレットを０．４５μｍに濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６．０Ｍグアニジン、ｐＨ７．４バッファーで平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラムにロードした。ローディング後、カラムを、２０カラム容量（ＣＶ）の平衡バッファーを用いてベースラインのＵＶ Ａ２８０吸光度まで洗浄し、続いて、同一バッファーを用いて追加の２５ＣＶのために洗浄した。結合しているタンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６．０Ｍ Ｇｕａｎ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、５００ｍＭイミダゾールを用いて溶出した。精製されたタンパク質は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ４．５に対する透析によって再フォールディングされた。
可溶性フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの中規模発現および精製。不溶性バインダーの精製の代替として、可溶性バインダーの精製も使用してよい。発現では、選択されたクローン（単数または複数）とそれに続くＨｉｓ６タグ（配列番号５９）を、ｐＥＴ９ｄ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞中で発現させた。２０ｍｌの種菌培養物（単一プレーティングされたコロニーから作製した）を使用して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する１リットルのＬＢ培地に播種した。培養物を３７℃でＡ６０００．６〜１．０まで増殖させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した後、培養物を、３０℃で６時間増殖させ、４℃における≧１０，０００×ｇでの３０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、−８０℃で凍結させた。細胞ペレットを、氷上でＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘホモジナイザー（ＩＫＡ ｗｏｒｋｓ）を使用して、２５ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル−ＥＤＴＡ不含（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によって達成される。
４℃、２３，３００ｇで３０分間の遠心分離によって可溶性画分を分離した。上清を０．４５μｍフィルターによって清澄化する。清澄化された溶解物を、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で事前平衡化されたＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ）にロードする。次いで、カラムを、２５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４と、続いて、２０カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４、次いで、３５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４を用いて洗浄する。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール ｐＨ７．４を用いて溶出し、Ａ２８０での吸光度に基づいて画分をプールし、１×ＰＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析する。任意の沈殿物は、０．２２μｍでの濾過によって除去する。
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの大規模発現および精製も使用した。この方法は、生成される量以外は、不溶性中規模精製法と実質的に同様である。
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質バインダーの生物物理学的特徴
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。標準サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＴＰＰ中規模プロセスおよび大規模プロセスから精製したタンパク質について実施した（ＨＴＰＰについて０．１〜１μｇのタンパク質および中規模について１０〜５０μｇ）。ＨＴＰＰ由来材料のＳＥＣを、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍでのＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎｍ、発光＝３５０ｎｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ １１００または１２００ＨＰＬＣシステム上で、中規模材料のためにＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。ＳＥＣカラムの適当な流速において、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーを使用した。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、分子量較正のために使用した。
質量分析。中規模および大規模精製した１０Ｆｎ３をベースとするバインダーを、ＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴＯＦ ＡＰＩ質量分析計、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡを備えたＷａｔｅｒ’ｓ２６９５液体クロマトグラフィーＨＰＬＣシステム）によってさらに分析した。サンプルを、ＨＰＬＣ等級の水で約０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。約５μｌの希釈サンプルを、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラム（カタログ番号００Ｇ−４０５３−８０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上に注入した。バッファーＡ：ＨＰＬＣ等級の水中、０．０２％ ＴＦＡ＋０．０８％ギ酸。バッファーＢ：ＨＰＬＣ等級のアセトニトリル中、０．０２％ ＴＦＡ＋０．０８％ギ酸。勾配（表１）を０．２ｍｌ／分の流速で用いてサンプルを溶出した。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）。中規模および大規模精製した１０Ｆｎ３をベースとするバインダーの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を実施して、Ｔｍを求めた。１ｍｇ／ｍｌ溶液を、Ｎ−ＤＳＣ ＩＩ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ）で温度を、３気圧下で１分当たり１℃の速度で５℃から９５℃に勾配をつけることによってスキャンした。データは、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用し、最適適合を使用して、適当なバッファーの対照実施に対して分析した（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐ）。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析を使用する結合親和性の決定
選択されたＨＴＰＰ精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質ならびに選択された中規模および大規模の型のタンデムコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ペグ化されている、およびペグ化されていない型；ｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのついていない型）を、表面プラズモン共鳴を使用してＩＧＦ−ＩＲに対するその動態挙動について評価した。ヒトＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ融合物を使用する捕獲アッセイを展開した。同様の試薬が、Forbes et al. (Forbes et al. 2002, European J. Biochemistry, 269, 961-968)によって記載されている。ヒトＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメイン（ａａ１〜９３２）を、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよび定常領域を含有する哺乳類発現ベクターにクローニングした。プラスミドの一時的トランスフェクションによって、次に記載される融合タンパク質、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃが得られた。２９３Ｔ細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト胚性腎細胞株）は、Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）から入手し、製造業者の使用説明書に従って維持した。手短には、１２×１０６個の細胞を、適当なＤＮＡ調製物（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＯｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いるトランスフェクションのためにＴ１７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。７２時間で馴化培地(conditioned media)を回収し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）および抗ＩＧＦ−ＩＲポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用するウエスタンブロッティングによって発現を確認した。このＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ融合タンパク質を続いて、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
ＨＴＰＰ精製されたコンストラクト（ペグ化されていない、ｈｉｓタグのついた型）のために使用した動態測定値を得る１つの方法は、アミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に固定化されたプロテインＡ／Ｇ上のＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを捕獲することであった。動態分析は、プロテインＡ／Ｇ上のＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃの捕獲と、それに続く、溶液中のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の濃度系列の注入およびグリシンｐＨ２．０によるプロテインＡ／Ｇ表面の再生を含んでいた。ＨＴＰＰ材料から得られるタンパク質濃度は、おおよそのものであり、したがって、ＫＤ測定もおおよそのものである。各濃度でセンサーグラムを得、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎによって適合させ、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定した。解離定数、ＫＤは、速度定数ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から算出した。
代替法は、プロテインＡ上のＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを捕獲することである。この方法を、中規模および大規模材料から得た特定の形のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（ペグ化された、およびペグ化されていない、ならびにｈｉｓタグを有する、またはｈｉｓタグを有さないの両方）の親和性および動態を算出するために使用した。具体的には、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを、アミンカップリングによってＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ上に固定化されているプロテインＡ上で捕獲した。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃを、アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に直接固定化した。親和性および動態分析は、プロテインＡ上のＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃの捕獲と、それに続く、ＩＧＦ−ＩＲ−ＦｃおよびＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ上への溶液中のタンデムアドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）の注入を含んでいた。サンプル間で、グリシンｐＨ１．５を用いて分析表面を再生した。各濃度でセンサーグラムを得、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して評価し、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定した。
ＩＧＦ−ＩＲドメインの機能性を評価する別の方法は、抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上のＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを捕獲することである。これは、上記の実施例５に記載される、中規模精製されたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ペグ化されていない、ｈｉｓタグ）について行った。抗ヒトＩｇＧを、製造業者の使用説明書に従って、ＣＭ５チップ表面のフローセル１および２上に固定化した。１００ｎＭヒトＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃを、１０μｌ／分でフローセル２上に２分間注入した。その後、中規模調製物の濃度系列を、５０μＬ／分で両フローセル表面にかけて注入した。５０ｍＭグリシンｐＨ１．７の２回の注入を使用して、表面を再生した。
ＣＭ５チップ表面に直接固定化されたＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に対して、中規模および大規模精製のタンデムコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ（ペグ化された、およびペグ化されていない型、ｈｉｓタグをつけた、およびｈｉｓタグをつけていない型）の濃度系列を評価することによって、Ｖ２Ｂドメインの機能性を評価した。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を、約１３００ＲＵの固定化レベルのために、５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．０で１２μｇ／ｍＬに希釈した。溶液相中、変動する濃度の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂを、５０μＬ／分の流速で、結合（２分）および解離（１０分）動態についてモニタリングした。５０ｍＭグリシンｐＨ１．７の２回の３０秒注入を使用して、表面を再生した。
ペグ化
Ｖ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーなどの多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、種々の大きさおよび種類のＰＥＧを用いてペグ化できる。ペグ化を可能にするために、タンパク質は、通常、アミノ酸、通常、セリンの、システインへの単一点突然変異によってＣ末端付近で修飾される。単一システイン残基におけるタンパク質のＰＥＧ化は、種々のマレイミド誘導体化されたＰＥＧの形をコンジュゲートすること、ＰＥＧ試薬をタンパク質溶液と組み合わせることおよびインキュベートすることによって達成される。タンパク質のＰＥＧ化の確認は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび／またはＰＥＧ化されていないタンパク質を、ＰＥＧ化されたタンパク質から分離できるＳＥ−ＨＰＬＣ法によって確認できる。
例えば、コンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂを、位置２０３にあるセリンを、システインと置換することによってペグ化した。得られたコンストラクト、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、次いで、４０ｋＤのＰＥＧとコンジュゲートした。ＰＥＧ試薬を、溶液中タンパク質コンストラクト（３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ）と混合し、インキュベートした。ペグ化を確認するための研究も、上記の段落に記載されるように実施した。研究は、直鎖ＰＥＧを有するタンデムコンストラクトでも実施した。さらに、この種類のペグ化はまた、ｈｉｓタグのついたタンパク質を用いて行うこともできる。
さらに、直鎖および分岐ペグ化の型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを使用して、マウスにおいて特定の薬物動態研究を実施して、直鎖対分岐ＰＥＧ間の相違を評価した。両方とも４０ｋＤのＰＥＧであり、直鎖の型のこのコンストラクトはまた、ｈｉｓタグも含んでいた。
Ｖ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーはまた、代替法を使用してペグ化できる。５ｍｌの、Ｖ／Ｉ１０Ｆｎ３をベースとするバインダーをコードする、Ｔ７ポリメラーゼによって駆動されるｐＥＴ２９プラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞の種菌培養物を、単一プレーティングされたコロニーから作製し、１リットルの、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する自己誘導培地（「ＯＮＥ」培地、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に播種するために使用した。発現を、３７℃での初期増殖の後１８℃で実施し、４℃における約１０，０００×ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを８０℃で凍結した。細胞ペレットを、１０ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール（Ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）、ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ａｖｅｓｔｉｎホモジナイザーを使用して機械的に溶解した。可溶性画分を、４℃、２３，３００×ｇで１５分間の遠心分離によって分離する。上清をデカントし、ペレットを、４Ｍ〜６Ｍの塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）を補給した溶解バッファー（上記）に可溶化する。次いで、可溶化したタンパク質を、ＧｄｎＨＣＬを補給した溶解バッファーで事前に平衡化した、適したサイズのＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）で精製する。次いで、５〜１０カラム容量の同バッファーでカラムを洗浄し、続いて、３００ｍＭイミダゾールを補給した同バッファーで溶出する。対象とするタンパク質を含有するカラムから溶出された画分を、２〜３ｍｇｓ／ｍＬのタンパク質に希釈し、次いで、１．２〜１．５モル過剰の固体ＮＥＭ−ＰＥＧ（４０ｋＤａの分岐またはその他）と混合する。混合物を室温で、３０分間、または反応が完了するまで反応させる。次いで、全反応容量を透析バッグ（５，０００Ｄａ分子量カットオフ）に入れ、混合物を、透析再フォールディングプロセスに供する。この手順から得た透析物は、適宜フォールディングされた、ＰＥＧ化された材料および過剰の反応物を含む。ＰＥＧ化反応から得た生成物および過剰の反応物の混合物を、遠心分離または濾過によって清澄化し、その後、それらを陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｏｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする。カラムを、ＮａＯＡｃバックグラウンドバッファー中の１５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて展開する。ペグ化を確認するための研究を、上記のように実施する。
競合阻害アッセイ
Ｒ＋競合阻害アッセイ。Ｒｅｎａｔｏ Ｂａｓｅｒｇａ（Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）からの寄贈物であるＲ＋は、マウスＩＧＦ−ＩＲ遺伝子における欠失との関連でヒトＩＧＦ−ＩＲを過剰発現するマウス胚繊維芽細胞である。細胞を、５％ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、ウェルあたり２０，０００個細胞の濃度で９６ウェルプレートにプレーティングした。その翌日、細胞を、０．１％ ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有する血清不含ＤＭＥＭで２回洗浄した。洗浄後、細胞を、漸増濃度のＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストまたは対照を含有する結合バッファー（血清不含ＤＭＥＭ＋０．１％ ＢＳＡ）中、４℃で１０分間インキュベートした。通常の対照は、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）（陽性対照）または単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）（陰性対照）を含んでいた。アンタゴニストに対するこの短期間の曝露の後、Ｒ＋細胞を、製造業者の使用説明書（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）に従ってＩＲＤｙｅ ８００ＣＷで標識した、２００ｎＭの二価の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ２０−ＡＴ５８０、配列番号２７）に対してさらに曝露した。４℃で４時間インキュベートした後、細胞を結合バッファーで２回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で可視化した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して分析した。
２９３：ＫＤＲ競合阻害アッセイ。２９３：ＫＤＲ（Ｓｉｂｔｅｃｈ、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ、ＣＴ）を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、ウェルあたり２５，０００個細胞の濃度で９６ウェルプレートにプレーティングした。その翌日、細胞を０．１％ ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有する血清不含ＤＭＥＭで２回洗浄した。洗浄後、細胞を、漸増濃度のＶＥＧＦＲ−２アンタゴニストまたは対照を含有する結合バッファー（血清不含ＤＭＥＭ＋０．１％ ＢＳＡ）中、４℃で１０分間インキュベートした。通常の対照は、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）（陽性対照）または単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）（陰性対照）を含んでいた。アンタゴニストに対するこの短期間の曝露の後、２９３：ＫＤＲ細胞を、製造業者の使用説明書（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）に従ってＩＲＤｙｅ ８００ＣＷで標識した、２００ｎＭのＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔに対してさらに曝露した。４℃で４時間インキュベートした後、細胞を結合バッファーで２回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で可視化した。得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して分析した。
インビトロ増殖アッセイ
ＲＨ４１。ＲＨ４１細胞を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、グルタマックス、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ培地で増殖させた。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みまたは比色法によって評価した。［３Ｈ］−チミジン取り込みの評価のために、細胞を、最適密度（４Ｋ細胞／ウェル）で９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートし、次いで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の段階希釈に曝露した。７２時間インキュベートした後、４μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いて細胞に３時間パルスし、トリプシン処理し、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｂプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）上で回収し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ、ＣＴ）でシンチレーションを測定した。結果は、細胞増殖を、未処理対照細胞と比較して５０％阻害するのに必要な薬物濃度であるＩＣ５０として表した。各細胞株の複数の試験から得た平均ＩＣ５０および標準偏差を算出した。比色評価のために、細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有する９０μｌ／ウェルのＲＰＭＩ−グルタマックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、ウェルあたり５，０００個細胞の濃度で９６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ウェルに、１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストの１０μｌの１０Ｘ濃縮物を加え、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。増殖期間の後、細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６水性増殖試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に対して曝露し、さらに４時間インキュベートさせた。４９０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で測定し、得られたデータを、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ５ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
Ｂａ／Ｆ３。ＶＥＧＦＲ２融合タンパク質（ｈＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインおよびｈＥｐｏＲの細胞内ドメインを含む）を安定に発現するマウスＢａ／Ｆ３細胞を、１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａを含有する、９０μＬの増殖培地中、２５，０００個細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした。フィブロネクチン足場ドメインタンパク質の段階希釈を、１０×最終濃度で調製し、各ウェルに１０μＬのタンパク質を加えた。プレートを、３７℃／５％ ＣＯ２で４８〜７２時間インキュベートした。各ウェルに細胞増殖アッセイ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え（２０μＬ／ウェル）、プレートを３〜４時間さらにインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、９６ウェルプレートリーダーで吸光度を読み取った（Ａ４９０）。
ＨＭＶＥＣ−Ｌ。肺（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）に由来する初代ヒト微小血管内皮細胞をＬｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ−２５２７；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入し、ＥＧＭ−２ ＭＶ Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２０２）で維持し、次いで、増殖アッセイのために、２％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＶＥＧＦ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）および５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＩＧＦ−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補給したＲＰＭＩ−１６４０＋グルタマックスに交換した。増殖を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下での化合物に対する細胞の曝露後のＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジンの取り込みによって評価した。通常の対照は、以下を含んでいた：ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体ｍＡＢ３９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および標的と結合しない野生型の１０Ｆｎ３をベースとするタンパク質（ＳＧＥ）。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、９６ウェルマイクロタイターＦａｌｃｏｎプレート中、１，５００個細胞／ウェルでプレーティングした（細胞密度は、この細胞種のために最適化した）。３７℃で７２時間インキュベートした後、４μＣｉ／ｍｌ［６−３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）を用いて細胞に３時間パルスし、トリプシン処理し、ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ ＧＦ／Ｂプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）上で回収し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ、ＣＴ）でシンチレーションカウントを測定した。結果は、未処理対照細胞のものに対して、細胞増殖を５０％阻害するのに必要な薬物濃度（ＩＣ５０）として表される。
ＮＣＩ−Ｈ９２９。ＩＧＦ依存性ヒト形質細胞腫細胞株であるＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、ＩＧＦ−ＩＲアンタゴニストまたは対照の存在下、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中、ウェルあたり２５，０００個細胞の濃度で９６ウェルプレートにプレーティングした。通常の対照は、以下を含んでいた：ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体ＭＡＢ３９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）および標的と結合しない野生型の１０Ｆｎ３をベースとするタンパク質（ＳＧＥ）。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間増殖させた。増殖期間の後、細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ９６水性増殖試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に対して曝露し、さらに４時間インキュベートさせた。４９０ｎｍでの吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で測定し、得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して分析した。
細胞ベースのシグナル伝達アッセイ
ＨＥＫ２９３／ＫＤＲおよびＰＡＥ／ＫＤＲアッセイ。ＨＥＫ２９３／ＫＤＲおよびＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（Ｓｉｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳおよびピューロマイシンを含有するＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭで培養し、約７０％のコンフルエンシーに増殖させた。細胞を、飢餓培地（ＤＭＥＭ−ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．５％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳおよびピューロマイシン）中に３７℃で一晩置き、次いで、ＶＥＧＦまたはＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を用いて、３７℃で１０分間刺激した。未刺激細胞を対照として含めた。細胞を、氷上で氷冷ＰＢＳを用いて２回すすぎ、抽出物を、ＴＴＧ溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％グリセロール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）中で調製した。総細胞溶解物のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定した。溶解物（３０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にトランスファーし、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＢ）を含むＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー中で、ホスホＶＥＧＦＲ（Ｔｙｒ ９９６）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ホスホＩＧＦ１Ｒ／ＩＲ（Ｔｙｒ１１３５／１１３６）／インスリン受容体（Ｔｙｒ１１５０／１１５１）、ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）または総アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）に対する抗体を用いてイムノブロッティングした。メンブランを、適当な、Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）の赤外標識二次抗体および分子プローブ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともにインキュベートした。Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｄｙｓｓｅｙ 赤外イメージングシステムを使用して、タンパク質可視化を実施した。
ＨＥＫ２９３／ＫＤＲ細胞（Ｓｉｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）を、上記のように培養した。ＶＥＧＦＲ−ＩＧＦ−ＩＲ多価フィブロネクチン足場ドメインを、飢餓培地で希釈し、１００および１０ｎＭの最終濃度で、３７℃で１時間細胞に加えた。細胞を、ＶＥＧＦ−ＩＧＦ−１リガンド組合せ（両方とも５０ｎｇ／ｍｌ最終濃度、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を用いて、３７℃で１０分間刺激した。未刺激細胞を、対照として含めた。細胞溶解物を、上記のように調製した。溶解物（３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にトランスファーし、総ＶＥＧＦＲ、ホスホＶＥＧＦＲ（Ｔｙｒ９９６）、総ＩＧＦ−１Ｒ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ホスホＩＧＦ１Ｒ／ＩＲ（Ｔｙｒ１１３５／１１３６）／インスリン受容体（Ｔｙｒ１１５０／１１５１）、総Ａｋｔ、ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、総ＭＡＰＫ、ホスホ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）またはアクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）に対する抗体を用いてプロービングした。赤外標識二次抗体とともにインキュベートした後、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムを使用して抗体を検出した。
ＰＡＥ／ＫＤＲ細胞（Ｓｉｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）を、上記のように培養した。ＶＥＧＦＲ−ＩＧＦ−ＩＲ多価フィブロネクチン足場ドメインを、飢餓培地で希釈し、１００および１０ｎＭの最終濃度で、３７℃で１時間、細胞に加えた。細胞を、ＶＥＧＦ−ＩＧＦ−１リガンド組合せ（両方とも５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を用いて３７℃で１０分間刺激した。未刺激細胞は、対照として含めた。細胞溶解物を、上記のように調製した。溶解物（３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にトランスファーし、総ＶＥＧＦＲ、ホスホＶＥＧＦＲ（Ｔｙｒ９９６）、総ＩＧＦ−１Ｒ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ホスホＩＧＦ１Ｒ／ＩＲ（Ｔｙｒ１１３５／１１３６）／インスリン受容体（Ｔｙｒ１１５０／１１５１）、総Ａｋｔ、ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、総ＭＡＰＫ、ホスホ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）またはアクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）に対する抗体を用いてプロービングした。赤外標識二次抗体とともにインキュベートした後、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムを使用して抗体を検出した。
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞またはＲｈ４１細胞において阻害されるシグナル伝達経路を測定するためのウエスタンブロット解析
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、ＥＧＭ−２ＭＶ Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ完全培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２０２）で培養し、約７０％のコンフルエンスに増殖させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、飢餓培地（Ｂａｓａｌ ＥＢＭ−２培地、０．３％ＢＳＡ）に６時間入れた。試験試薬を飢餓培地で希釈し、細胞に、３７℃で１時間、１００ｎＭの最終濃度で加えた。細胞を、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１リガンドの組合せ（各５０ｎｇ／ｍｌ）、（ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９３−ＶＥ／ＣＦ；ＩＧＦ１番、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、１００−１１番）とともに３７℃で１０分間刺激した。未刺激細胞は、対照として使用した。
Ｒｈ４１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養し、約７０％のコンフルエンスに増殖させた。Ｒｈ４１は、Ｄｒ．Ｌｅｅ Ｈｅｌｍａｎ（ＮＩＨ）から入手し、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳの存在下、ＲＰＭＩ−１６４０＋グルタマックスで維持される、ヒト横紋筋肉腫腫瘍細胞株であり；Ｒｈ４１細胞は、ＩＧＦ依存性であり、ＩＧＦ−１Ｒのアンタゴニスト（すなわち、小分子、モノネクチン（ｍｏｎｏｎｅｃｔｉｎｓ）およびｍＡＢ３９１）による阻害に対して極めて感受性である。Ｒｈ４１細胞を、３７℃で一晩、飢餓培地（ＲＰＭＩ、０．３％ ＢＳＡ）に入れた。試験試薬を飢餓培地で希釈し、細胞に、３７℃で１時間、１００ｎＭの最終濃度で加えた。細胞を、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１リガンドの組合せ（各５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間刺激した。通常の対照は、以下を含んでいた：未刺激細胞、ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体ｍＡＢ３９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）または単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）。
ＨＭＶＥＣ−ＬまたはＲｈ４１細胞を、氷上で氷冷ＰＢＳを用いて２回すすぎ、抽出物を、ＴＴＧ溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％グリセロール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）中で調製した。総細胞溶解物のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して決定した。ゲル（ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の各ウェルに各溶解物から等量のタンパク質（４０μｇ）を加えた。タンパク質をＮｕＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にトランスファーし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１時間インキュベートした。リン酸化の阻害を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＢ）を含むＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー中で、ウエスタンブロットを、ＩＧＦ−１Ｒ（ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒβ、（Ｔｙｒ１１３５／１１３６）／ＩＲ、（Ｔｙｒ１１５０／１１５１）（１９Ｈ７）抗体、（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３０２４番））、ＩＧＦ−１Ｒβ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．ｓｃ−７１３）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４０５１番））、Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ９２７２番）、ＭＡＰＫ（ｐ−ｐ４４／４２）ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４０）（Ｅ１０）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ９１０６番）、（ＭＡＰＫ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ９１０２番）およびＶＥＧＦＲ−２（ｐＦｌｋ−１）（Ｔｙｒ９９６）−Ｒ、（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．ｓｃ−１６６２９Ｒ）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１）（Ｃ−１１５８）、（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．ｓｃ−５０４）、総ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ２１１８番）に対して特異的な抗体を用いて、室温で３時間プロービングすることによって測定した。メンブランを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで３回洗浄し、次いで、ＩＲ標識二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。タンパク質分析は、蛍光シグナルの同時または独立した検出を可能にするＯｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。
Ｃａ２＋流アッセイ
ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、ＥＧＭ２−ＭＶ Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ完全培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２０２）中、ポリ−Ｄ−リシンコーティングした９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ３５６６４０番）に、２．５×１０４個細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を、基礎ＥＢＭ培地（Ｌｏｎｚａ）で一晩飢餓にさせた。アッセイ当日、試験試薬を、ＨＨＰバッファー（ＨＢＳＳ ［ＧｉｂｃｏＢＲＬ１４０２５−０７６番］＋０．１％ ＢＳＡ中、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭプロベネシド［ＳｉｇｍａＰ８７６１番］）で段階希釈し、ＥＢＭ培地を吸引した後、細胞に加えた。カルシウム−４色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｒ８１４２番）を、ＨＨＰバッファーと同時に加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＨＧ０１４５番）の添加によって、Ｃａ２＋放出を誘発した。Ｃａ２＋流をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）での測定によってモニタリングした。
ヒト微小血管内皮細胞管形成
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）プレートを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５６２３７番）を、４℃で一晩解凍することによって調製した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（３００μｌ／ウェル）を、２４ウェルプレートに加え、続いて、ゲルが重合するよう３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を、ＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３２０２）で培養し、約７０％のコンフルエンスに増殖させた。細胞を、ＥＧＭ−２ＭＶ完全培地に、試験化合物（１００ｎＭ）とともに、または化合物を伴わずに再懸濁した（１×１０５個細胞／ｍｌ）。各ウェルに１ｍｌの細胞懸濁液を加えた。プレートを、５％ＣＯ２中、３７℃で１２時間インキュベートした。増殖培地を吸引し、各ウェルに、室温で３０分間、１ｍｌの０．３％グルタルアルデヒド（ＶＷＲ、ＧＸ０１５３０５−１番）を加えた。培地を吸引し、細胞を、１ｍｌの洗浄バッファー（細胞伝播試薬キット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｋ０６０００１１番）を用いて洗浄した。５００μｌの透過処理溶液を加え、続いて、室温で１５分間インキュベートした。培地を吸引し、細胞を１ｍｌの洗浄バッファーを用いて洗浄した。各ウェルに、５００μｌの染色溶液を加え、暗所、室温で１時間インキュベートした。溶液を吸引によって除去し、洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。プレートを密閉し、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳリーダーで画像を得た。各ウェルの微小血管によって占められる画像化領域の尺度である血管新生指数が、自動的に算出され、報告された。
マウスにおける単回用量ＰＫ
４０ｋＤ直鎖または４０ｋＤ分岐ＰＥＧでペグ化された３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（配列番号９）の薬物動態をマウスにおいて研究した。絶食していない動物の２つの群（Ｎ＝群あたり３〜４匹、２０−２５ｇ）には、アドネクチンを静脈内（ＩＶ）ボーラス用量として、尾静脈（５ｍＬ／ｋｇ）を介して投与した。用量は５０ｍｇ／ｋｇとした。投与に先立って、化合物を、保存溶液から適当な投薬溶液濃度に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。外側尾静脈に切れ目を入れることによって連続血液サンプル（約０．０５ｍＬ）を得た。ＩＶ経路については、サンプリング時点は、用量の０．０８、０．５、１、２、６、１２、２４、４８、９６および１７１時間後とした。血漿サンプルは、血液サンプルを、クエン酸リン酸デキストロース溶液に、１：１の比で希釈することによって回収し、−２０℃で分析まで保存した。
Ｒｈ４１腫瘍マウスにおける単回用量ＰＫ／ＰＤ研究
Ｒｈ４１腫瘍マウスにおいて、ペグ化されｈｉｓタグのついている型のコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ０Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（５０、１００、２００ｍｐｋ）または単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）および単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）の等用量（２５＋２５、５０＋５０、１００＋１００）での組合せの単回投薬後に、漸増濃度を使用して薬力学的研究を実施した。投薬後１、６および２４時間で腫瘍を回収し、処理した。ゲル（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の各ウェルに、各腫瘍溶解物から得た等量のタンパク質（６０μｇ）を加えた。タンパク質をＮｕＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にトランスファーし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温で１時間インキュベートした。タンパク質のリン酸化の阻害を、上記のようにウエスタンブロットをホスホ特異的抗体を用いてプロービングすることによって測定した。
マウスにおける腫瘍異種移殖片研究ＲＨ−４１、Ａ５４９およびＧＥＯ
雌のＢａｌｂ／ｃ胸腺欠損マウス（ｎｕ／ｎｕ）、５〜６週齢を、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。動物をアンモニアおよび病原体を含まない環境で維持し、水および食餌を自由に与えた。マウスは、腫瘍移植および有効性試験の７日前に隔離して維持した。すべての動物研究は、ＢＭＳ動物実験委員会（ＢＭＳ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認のもと、米国実験動物管理認証協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）（ＡＡＡＬＡＣ）に従って実施した。
ヒト腫瘍Ｒｈ−４１（横紋筋肉腫）、Ａ５４９（肺）およびＧＥＯ（結腸）を、通常、０．１〜０．２ｍｍ３未満の小断片として、１６ｇ外套針を使用して皮下に（ｓｃ）移植した。評価されたすべての腫瘍は、治療の開始前に１２５ｍｍ３のおおよその大きさに増殖させた。処理群および対照群の大きさは、６〜８匹のマウスからなるものとした。腫瘍の大きさを、週に２回測定した。腫瘍容量は、Ｖｅｒｎｉｅｒ目盛りノギスを使用して垂直腫瘍直径を測定することおよび楕円のための式：１／２（長さ×（幅）２）使用することによって算出した。腫瘍の大きさが１，５００ｍｍ３を超える場合、動物の体重減少が開始重量の２０％を超える場合または広範囲に及ぶ腫瘍壊死が生じた場合には、マウスを安楽死させた。すべての化合物は内服的に与え、２５ｇの滅菌皮下用ニードルを使用することによって腹腔内（ｉ．ｐ．）デリバリーによって投与した。媒体対照溶液は、通常、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とし、一方で単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５の製剤中で投与し、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）は、ＰＢＳ中で製剤し、ペグ化されたｈｉｓタグのついたコンストラクト３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９）は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ、４．５中で製剤した。
抗腫瘍有効性は、以下のように算出された腫瘍増殖阻害パーセント（ＴＧＩ％）として表される：
ＴＧＩ％＝｛１−［（Ｔｔ−Ｔｏ）／（Ｃｔ−Ｃｏ）］｝×１００
（式中、Ｃｔ＝時間ｔでの、媒体対照（Ｃ）マウスの中央値腫瘍容量（ｍｍ３）であり；Ｔｔ＝時間ｔでの処理されたマウス（Ｔ）の中央値腫瘍容量（ｍｍ３）であり；Ｃ０＝時間０での媒体対照（Ｃ）マウスの中央値腫瘍容量（ｍｍ３）であり；Ｔｔ＝時間０での処理されたマウス（Ｔ）の中央値腫瘍容量（ｍｍ３）である。１腫瘍容量倍加時間（ＴＶＤＴ）にわたる５０％以上のＴＧＩは、活性な抗腫瘍反応と考えられる。ＴＶＤＴは、腫瘍の線形増殖範囲、通常、２５０ｍｍ３〜１０００ｍｍ３の間の腫瘍の大きさにわたって測定される。
Ａ６７３モデルにおける腫瘍異種移殖片研究
（１）腫瘍細胞株。ヒトＡ６７３ユーイング肉腫細胞（ＣＲＬ−１５９８）を、ＡＴＣＣによって推奨される使用説明書に従って培養した。手短には、細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補給した基本培地であるダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において、５％Ｃ０２雰囲気下、３７℃で維持した。
（２）異種移殖片モデル。０．１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した１０×１０６個の細胞を、雌の７〜８週齢の、雌の胸腺欠損ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の背側側腹部領域に皮下注射した。マウスは、ＨＥＰＡフィルターを通した空気および温度制御されたバリアラック下で微小隔離飼育器ケージに収容した。それらは、１２時間明／暗周期で、自由に利用可能な、照射された食物およびオートクレーブ処理された水を給餌して維持し、その新規環境に適応させた。マウスは、無菌プロトコールを使用して操作し、腫瘍研究のすべての試験手順およびエンドポイントは、施設のガイドラインに従った。腫瘍移植は、ノギス測定を使用してモニタリングして、無作為化の前に腫瘍増殖速度を確立し、腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３の平均に達した時点でマウスを無作為化した。腫瘍が３，０００ｍｍ３の容量に達した時点で、マウスを安楽死させた。
（３）処理。各研究からのマウスを、以下に記載される処理群に割り当て、以下に示されるレジメンで腹腔内投与を与えた。媒体群には、再構成バッファー：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中の、単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＶＥＧＦＲ−２バインダー（Ｐｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、配列番号２８）を与えた。単一特異性の１０Ｆｎ３をベースとするＩＧＦ−ＩＲバインダー（ＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、配列番号２７）をＰＢＳ中で製剤し、ペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ（配列番号９）は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中で製剤した。図２６に記載される研究のために、各々、媒体、５０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔ、５０ｍｐｋのＡＴ５８０−ＰＥＧ４０、５０ｍｐｋのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓ、１００ｍｐｋのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓまたは５０ｍｐｋのＡＴ５８０−ＰＥＧ４０および５０ｍｐｋのＰｅｇ−Ｖ２Ｂｓｈｏｒｔの同時用量のいずれかを週に３回（ＴＩＷ）のスケジュールで投与された９匹のマウスからなる６つの処理群があった。上記で論じられた用量反応研究では（データは示さない）、各々、媒体または２０、６０、１００もしくは２００ｍｐｋのペグ化されたｈｉｓタグのついた３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−ｃｙｓのいずれかをＴＩＷスケジュールで投与された９匹のマウスからなる５つの処理群があった。
（４）腫瘍容量測定。腫瘍容量測定を、Ｖｅｒｎｉｅｒ目盛りノギスを使用して週に２回実施し、楕円式［π／６（ＬｘＷ２）］を使用して腫瘍容量（ｍｍ３）を算出した（式中、Ｌは、最大腫瘍直径（ｍｍ）を表し、Ｗは、最小腫瘍直径（ｍｍ）を表す）。腫瘍測定は、絶対値として言及された。動物の体重は、実験の過程の間、週に２回記録した。
（５）腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）。ＴＧＩは、対照群（媒体、Ｃ）からの処理（Ｔ）群の腫瘍増殖のパーセントとして算出した。腫瘍増殖は、実験の最後に、最終腫瘍容量から初期腫瘍容量（０日目）を差し引くことによって算出した。ＴＧＩ＝（１−［Ｔ−Ｔ０］／［Ｃ−Ｃ０］）＊１００。
マウスおよびサルモデルのＰＫ／ＰＤ研究法
血清または血漿中濃度の決定
定量的電気化学発光アッセイを開発して、血清または血漿サンプル中の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグを有する、および有さない）の濃度を検出した。このアッセイでは、分子のＶＥＧＦＲ２部分に特異的なマウスモノクローナル抗体を、標準Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレートに吸着させ、アドネクチンを４℃で一晩捕獲した。室温での１時間のインキュベーションのために、プレートに血清／血漿サンプルを加えた。捕獲されたアドネクチンを、ＳＵＬＦＯタグと連結しているヤギ抗ウサギ抗体と同時混合された、アドネクチンの足場領域に特異的なウサギポリクローナル抗体によって検出し、プレートに同時に加えた。任意の結合していないＳＵＬＦＯタグ試薬を洗浄して除去した後、各ウェルに読み取りバッファーを加え、電気化学発光検出を使用して結合事象を検出する。３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグを有するおよび有さない）の検量線の４パラメータ適合と比較した、サンプルのシグナルに基づいて、サンプル中の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグを有するおよび有さない）血漿／血清濃度を算出した。
マウスおよびサルにおけるＶＥＧＦ−Ａ濃度の決定
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）からのヒトおよびネズミＶＥＧＦ−Ａの定量的電気化学発光アッセイを製造業者の使用説明書に従って使用し、ＶＥＧＦ−Ａ血漿濃度を検出した。特異的抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレート上にプレコーティングする。プレートを４℃で一晩ブロッキングし、標準中に存在するＶＥＧＦ−Ａ、ＱＣｓおよびサンプルを、２時間のインキュベーション工程の間、固定化された抗体によって捕獲した。任意の結合していない物質を洗浄除去した後、ＳＵＬＦＯタグが連結しているポリクローナル検出抗体を、ウェルに２時間加える。任意の結合していないＳＵＬＦＯタグ試薬を洗浄して除去した後、各ウェルに読み取りバッファーを加え、電気化学発光検出を使用して、結合事象を検出する。サンプル中の血漿ＶＥＧＦ−Ａ濃度を、検量線の４パラメータ適合と比較した、サンプルのシグナルに基づいて算出した。
インビボ法−マウス
マウスにおける単回用量薬物動態。ｈｉｓタグのついた型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの薬物動態を、ヌードマウスにおいて研究した。４群の絶食していない動物（群あたりＮ＝３〜４、２０〜２５ｇ）には、ｈｉｓタグのついた型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、尾静脈（５ｍＬ／ｋｇ）を介した静脈内（ＩＶ）ボーラス用量または腹腔内（ＩＰ）用量（１０ｍＬ／ｋｇ）のいずれかとして投与した。用量は、両経路に対して５および５０ｍｇ／ｋｇとした。投与に先立って、化合物を、保存溶液から適当な投薬溶液濃度に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。外側尾静脈に切れ目を入れることによって連続血液サンプル（約０．０５ｍＬ）を得た。ＩＶ経路については、サンプリング時点は、用量の０．０８、０．５、１、２、６、１２、２４、４８、９６および１７１時間後とした。ＩＰ経路については、サンプリング時点は、投薬後、０．５、１、２、６、１２、２４、４８、９６、１２４および１７１時間後とした。血漿サンプルは、血液サンプルを、クエン酸リン酸デキストロース溶液に、１：１の比で希釈することによって回収し、−２０℃で分析まで保存した。
Ｒｈ４１腫瘍を保有するヌードマウスにおける単回用量薬物動態／薬力学的研究。Ｈｉｓタグのついた型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、Ｒｈ４１腫瘍を保有する絶食していないヌードマウス（２０〜２５ｇ）に、媒体群とともに２０および２００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与した。投与に先立って、薬物候補を、保存溶液から適当な投薬溶液濃度に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。血液サンプルは、薬物処理群では、用量の１、３、６、１６、２４、３２、４８および８０時間後の心臓穿刺によって、媒体群では、投薬後１、２４および３６に得られた。血清サンプルは、血液凝固後に得られ、−２０℃で薬物およびＶＥＧＦ−Ａ濃度の分析まで保存した。
Ａ６７３腫瘍を保有するヌードマウスにおける単回用量薬物動態／薬力学的研究。３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついていない）を、Ａ６７３腫瘍を保有する絶食していないヌードマウス（２０〜２５ｇ）に、２０および２００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に投与した。投与に先立って、薬物候補を、保存溶液から適当な投薬溶液濃度に、ＰＢＳで希釈した。用量の１、３、６、１６、２４、３２、４８、７２、９６および１２０時間後に、血漿サンプルを心臓穿刺によってナトリウムヘパリンコートされたＢＤバキュテナーチューブに回収し、−２０℃で薬物およびＶＥＧＦ−Ａ濃度の分析まで保存した。
インビボ法−サル
サルにおける単回用量薬物動態／薬力学的研究。ｈｉｓタグのついた型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓの薬物動態を、雄のカニクイザルにおいて評価した。一晩絶食した後、２匹の動物（約４ｋｇ）に、ｈｉｓタグのついた型の３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓを、３および３０ｍｇ／ｋｇの用量で、大腿静脈を介した１０分間の定速ＩＶ注入（５ｍＬ／ｋｇ）によって投与した。投与に先立って、薬物候補を、保存溶液から適当な投薬溶液濃度に、ＰＢＳで希釈した。投薬前、および投薬後 ０．１７、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、３０、５４、７２（３日目）、９６（４日目）、１６８（７日目）、２１６（９日目）、２６４（１１日目）、３３６（１４日目）、３８４（１６日目）、４３２（１８日目）、５０４時間（２１日目）に、血液サンプル（約１ｍＬ）を、大腿動脈からＫ２ＥＤＴＡチューブに回収した。血漿サンプルは、４℃（１５００〜２０００×ｇ）での遠心分離後に得、−２０℃で薬物およびＶＥＧＦ−Ａ濃度の分析まで保存した。
同一研究デザインを使用して、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついていない）を、３ｍｇ／ｋｇで、雄のカニクイザル（Ｎ＝３、約４ｋｇ）へＩＶ投与した後に研究した。３週間の研究およびさらなる３週間の休薬期間の後、３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついていない）を、同一サルに同一用量で再投与し、血液サンプルを、投薬後最大１週間回収した。
データ解析
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表されている。
３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのついていない）の薬物動態パラメータを、血漿（血清）濃度対時間データの非コンパートメント解析によって得た（ＫＩＮＥＴＩＣＡ（商標）ソフトウェア、バージョン４．２、ＩｎｎａＰｈａｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。ピーク濃度（Ｃｍａｘ）およびＣｍａｘの時間を、実験観察から直接記録した。時間ゼロから最後のサンプリング時間までの曲線下面積（ＡＵＣ（０−Ｔ））および時間ゼロから無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ（ＩＮＦ））を、線形台形および対数台形総和の組合せを使用して算出した。ＩＶ投与後、総血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）、定常状態分布容量（Ｖｓｓ）、終末相半減期（Ｔ１／２）および平均滞留時間（ＭＲＴ）を推定した。ＡＵＣおよびＴ１／２の推定は、定量化できる濃度を有する最小３時点を使用して行った。
マウスおよびサルにおいて作製した３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのついていない）の薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）データを、ＳＡＡＭ ＩＩ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．２．１、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してモデル化した。５および５０ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＩＰ投薬後に得られたマウスＰＫデータについては、未処理のプールされた血清濃度−時間データを、一次吸収動態を加味した２コンパートメントモデルを使用して同時に適合させた。
ＶＥＧＦ−Ａの生成が３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのついていない）の存在下で変化せず、かつ、その主要なクリアランス経路としてのＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦＲ−２との結合が３８５Ａ０８−Ｆｎ−Ｖ２Ｂ−Ｃｙｓ（ｈｉｓタグのついた、およびｈｉｓタグのついていない）によって阻害されたと仮定して、血漿または血清中のｍＶＥＧＦ−ＡまたはｈＶＥＧＦ−Ａ濃度のいずれかとして測定されたＰＤ反応を、間接反応モデルを使用してモデル化した。

Claims (24)

  1. （ａ）第１のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むＮ末端ドメインであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、（ｉｉ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、（ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、（ｉｖ）第１の標的分子と、５００ｎＭ未満のＫＤで結合するＮ末端ドメインと、
    （ｂ）第２のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むＣ末端ドメインであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、（ｉｉ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、（ｉｖ）第２の標的分子と、５００ｎＭ未満のＫＤで結合するＣ末端ドメインと
    を含み、
    該第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインが、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカーまたは配列番号２０のアミノ酸配列から選択されるポリペプチドを介して連結しているポリペプチド。
  2. 第１の１０Ｆｎ３ドメインが第１の標的分子と１００ｎＭ未満のＫＤで結合し、かつ、第２の１０Ｆｎ３ドメインが第２の標的分子と１００ｎＭ未満のＫＤで結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインのループＢＣおよびループＦＧが、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して変化したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 第１の１０Ｆｎ３ドメインが、そのＣ末端において配列番号１９のアミノ酸配列と連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 第２の１０Ｆｎ３ドメインが、そのＣ末端において配列番号１７または１８のアミノ酸配列と連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. （ｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
    （ｉｉ）配列番号８〜１５、２９〜３１および６３〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質、トランスフェリンおよびＦｃ断片から選択される１以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  8. ＰＫ部分が、ポリオキシアルキレン部分であり、該ポリオキシアルキレン部分が、ポリエチレングリコールである、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. ＰＫ部分およびポリペプチドが、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介して連結している、請求項７に記載のポリペプチド。
  10. 第１および第２の標的分子が同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
  11. 第１および第２の標的分子が異なっている、請求項１に記載のポリペプチド。
  12. 第１の標的分子がＩＧＦ−ＩＲであり、かつ、第２の標的分子がＶＥＧＦＲ２である、請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 第１の標的分子がＶＥＧＦＲ２であり、かつ、第２の標的分子がＩＧＦ−ＩＲである、請求項１１に記載のポリペプチド。
  14. １以上のＴ細胞エピトープを除去するよう脱免疫化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
  15. 第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインが、グリシン−セリンベースのリンカーを介して連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
  16. グリシン−セリンベースのリンカーが、配列番号２１および２２のアミノ酸配列から選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインが、ａ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインコード配列とは異なる候補１０Ｆｎ３ドメイン配列を各々が含む候補ＲＮＡ分子の集団を生成する工程であって、該ＲＮＡ分子各々が、該候補１０Ｆｎ３ドメインコード配列と作動可能に連結している翻訳開始配列および開始コドンを含み、かつ、３’末端において核酸−ピューロマイシンリンカーと作動可能に連結している工程と、ｂ）該候補１０Ｆｎ３ドメインコード配列をインビトロで翻訳して、候補ＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合物の集団を生成する工程と、ｃ）該候補ＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合物の集団を標的分子と接触させる工程と、ｄ）そのタンパク質部分が、標的分子に対する該ヒト１０Ｆｎ３の結合親和性または特異性と比較して変化している、標的分子に対する結合親和性または特異性を有するＲＮＡ−１０Ｆｎ３融合物を選択する工程とを含む方法によって選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  18. 請求項１に記載のポリペプチドを含み、本質的にエンドトキシンを含まない医薬上許容される組成物。
  19. 第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインが、グリシン−プロリンベースのリンカーを介して連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
  20. グリシン−プロリンベースのリンカーが、配列番号３２、３３および３４のアミノ酸配列から選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. （ａ）第１のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むＮ末端ドメインであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、（ｉｉ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、（ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、（ｉｖ）第１の標的分子と、５００ｎＭ未満のＫＤで結合するＮ末端ドメインと、
    （ｂ）第２のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むＣ末端ドメインであって、該１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み、（ｉｉ）ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較してアミノ酸配列が変化したループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、（ｉｖ）第２の標的分子と、５００ｎＭ未満のＫＤで結合するＣ末端ドメインと
    を含み、
    該第１および第２の１０Ｆｎ３ドメインが、プロリン−アラニンベースのポリペプチドリンカーを介して連結しているポリペプチド。
  22. （ｉ）配列番号６５〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド； および
    （ｉｉ）配列番号６５〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
    から選択される、請求項２１に記載のポリペプチド。
  23. 第１の標的分子がＩＧＦ−ＩＲであり、かつ、第２の標的分子がＶＥＧＦＲ２である、請求項２１に記載のポリペプチド。
  24. 第１の標的分子がＶＥＧＦＲ２であり、かつ、第２の標的分子がＩＧＦ−ＩＲである、請求項２１に記載のポリペプチド。
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