JP2011518327A

JP2011518327A - アッセイ方法および装置

Info

Publication number: JP2011518327A
Application number: JP2011504963A
Authority: JP
Inventors: メリン・ヨナス; ヨンソン・クリスティーナ
Original assignee: Amic AB
Current assignee: Amic AB
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2011-06-23
Also published as: BRPI0910647A2; EP2274614B1; EP2274614A1; WO2009128774A1; CA2720839A1; CA2720839C; US8822231B2; EP2274614A4; CN102066936A; US20110117674A1; SE0800871L; RU2538652C2; RU2010146454A; SE533515C2

Abstract

液体サンプル中の少なくとも２つの分析物を分析する方法を提供する。この方法は、ａ）基板を提供する工程であって、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が、基板上に固定化されており、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有する、工程と、ｂ）サンプルを捕捉分子と接触させる工程と、ｃ）分析されるべき少なくとも１つの分析物について、捕捉分子と、その分析物に対して特異的親和性を有する標識検出分子との間の接触を誘導し、分析されるべき少なくとも１つの別の分析物について、捕捉分子と、標識バージョンの分析物との間の接触を誘導する工程と、ｄ）基板上の標識検出分子および標識分析物からの検出可能な信号を測定する工程であって、標識分析物の濃度は、サンプル中の分析物の濃度に適応している、工程と、を含む。

Description

開示の内容

〔技術分野〕
本発明は、液体サンプル分析のための方法およびアッセイ装置に関する。

〔背景〕
多くのアッセイにおいて、１つのサンプル中の２つ以上の分析物の濃度を同時に測定することが望ましい。これは、イムノアッセイなど、親和性に基づくアッセイにも当てはまる。しばしば、分析物は、大きく異なる濃度で存在する。これは、異なる分析物の濃度が同時に測定される場合、親和性に基づくアッセイでは問題となることがあり、それは、１つの分析物の測定から生じる信号が、その他から生じる信号を飽和させるかまたは信号に影響を及ぼし得る恐れがあるためである。

飽和は、捕捉手段を含む、親和性に基づくアッセイでは、例えば全ての捕捉部位がふさがれている場合に、起こる可能性がある。飽和はまた、標識分子から蛍光を測定するセンサーなどの変換器が飽和した場合に起こることもある。

先行技術では、親和性に基づくアッセイで、大きく異なる濃度の２つ以上の分析物を測定するためにこの問題を解決するよう努力されてきた。１つのアプローチは、サンプルをいくつかのアリコートに分けることであり、アリコートは、異なる濃度に希釈される。別のアプローチは、変換器、検出器またはセンサーのゲインを、異なる濃度に調節することである。

ＵＳ７，２７１，００９は、粒子の使用を含む、サンプル中のいくつかの生物学的マーカーのための免疫学的アッセイを開示している。各粒子は、親和性に基づくアッセイに関与する１種類の分子でコーティングされる。それぞれが１種類の分子でコーティングされた、いくつかの種類の粒子がある。様々な分析物の濃度（levels）がかなり異なる状況に対処するため、希釈剤の使用により分析物の一部について信号を減じる。希釈剤は、分析物のいずれかとの特定の結合に携わっていないことが記載されている。希釈剤は、粒子上で利用可能な部位を争い、分析物のコーティング密度を下げる。したがって、捕捉される分析物分子の数は、希釈剤を使用することで減少する。特定の分析物に対する感受性を増大させる薬剤で、一部の粒子がコーティングされる実施形態も記載されている。

最新技術による一部の分析装置では、捕捉抗体（capturing antibody）または捕捉分子が、１つ以上の分析物を捕捉する。捕捉部位への分析物の結合は、信号が高くなりすぎないように、全捕捉部位が飽和する前、平衡状態になる前に、妨げられる。

場合によっては、検出されるべき分析物のうち少なくとも１つで利用可能なただ１つの結合エピトープがある。

先行技術による技術が使用されているが、サンプルがいくつかのアリコートにおいて数工程で希釈されなければならない場合があること、ならびに／または変換器、検出器および／もしくはセンサーのゲインが、異なる濃度レベルに適応するように調節されなければならないことに関しては、改善の余地がある。例えば粒子を扱う必要のない、可能な限り少ない工程の迅速なアッセイを有することも望ましい。希釈剤を添加する必要のないアッセイを有することも望ましい。ただ１つのエピトープで少なくとも１つの分析物を測定することができるアッセイも望ましい。液体サンプル混合物中においてただ１つのエピトープで分析物の濃度を測定できるアッセイを有することも望ましい。

〔発明の概要〕
本発明の１つの目的は、先行技術の欠点の少なくとも一部を取り除く方法を実行するための、改善された方法および装置を提供することである。

この方法および装置の利点は、別様に希釈されるいくつかのアリコートに、サンプルを分ける必要がないことを含む。

別の利点は、変換器、検出器および／またはセンサーのゲインが、大きく異なる濃度レベルを考慮するように調節されなくてよいことである。

さらなる利点は、親和性に基づくアッセイで希釈剤を捕捉分子に加えなくてよいことである。また、親和性増強添加物も加えなくてよい。

利点には、いかなる粒子も処理されなくてよいことも含まれ、この方法は、実行する工程が少ないので、実行するのが単純で容易である。

別の利点は、平衡状態に到達するまで、捕捉分子に対する分析物分子の結合が行われ得ることである。したがって、全ての捕捉部位を飽和させないように、平衡状態に到達する前にこの結合を止める必要がない。これは、明確な時間に結合を停止させる必要がないという利点を有する。したがって、１つの利点は、平衡状態に達することにより、高い精度を達成することができるということである。先行技術による技術では、毎回厳密に同じ段階で結合を停止することは困難である。これは、結合率に影響を及ぼす全パラメーターを制御するのが困難なためである。

さらなる利点は、抗体が結合し得るただ１つのエピトープを、少なくとも１つの分析物が有する場合に、いくつかの分析物を測定するのが可能なことである。

装置の製造は、容易であり、費用効果が高い。単純さにより、方法も非常に費用効果が高くなる。

第１の態様では、液体サンプル中の少なくとも２つの分析物を分析する方法が提供され、この方法は、
ａ）基板を提供する工程であって、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が基板上で固定され、各種類の捕捉分子が分析物に対して特異的な親和性を有する、工程と、
ｂ）サンプルを捕捉分子と接触させる工程と、
ｃ）分析されるべき少なくとも１つの分析物については、捕捉分子と、その分析物に対して特異的な親和性を有する標識検出分子との間の接触を誘導し、分析されるべき少なくとも１つの別の分析物については、捕捉分子と、標識バージョン（labelled version）の分析物との間の接触を誘導する工程と、
ｄ）基板上の標識検出分子および標識分析物からの検出可能な信号を測定する工程であって、標識分析物の濃度は、サンプル中の分析物の濃度に適応する、工程と、を含む。

第２の態様では、この方法に適した装置を提供する。

本発明のさらなる態様および実施形態が、参照により本明細書に組み込まれる請求項において定められる。

本発明は、以下の説明、実施例、および添付図面においてさらに詳細に説明される。

〔定義〕
本発明の方法および装置を説明する前に、本発明は、本明細書に開示する特定の構成、方法工程、および装置に限定されないことを理解されたい。というのは、このような構成、工程および装置は、幾分変えることができるためである。本明細書で利用される専門用語が、特定の実施形態を説明する目的のみで使用されており、限定的となることを意図していないことも理解されたい。これは、本発明の範囲は、請求項およびその等価物によってのみ限定されるためである。

本明細書および請求項で使用される、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈が別段明確に示していない限り複数の指示物を含むことも注意されなければならない。したがって、例えば、「１つの抗体（an antibody）」を含有する反応混合物に対する言及は、２つ以上の抗体の混合物を含む。

本発明を説明および主張する上で、以下の専門用語は、本明細書に述べる定義に従って使用される。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、数値の文脈で使用される場合、用語「約（about）」は、当業者にはよく知られており容認される、精度の区間（interval of accuracy）を示す。この区間は、±１０％である。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「分析物」は、１つ以上の性質が分析処置で決定される、物質または化学的もしくは生物学的成分を意味する。分析物または成分自体はしばしば測定できないが、分析物の測定可能な性質は測定することができる。例えば、グルコース濃度を測定することができる。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「捕捉分子」は、分析物分子に結合し、分析物分子を捕捉する能力を有する分子を意味する。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「検出可能な基（detectable group）」は、基板上に存在する場合に検出され得る分子または原子の任意の配列を意味する。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「検出可能な信号」は、検出され得る任意の信号を意味し、これには、電磁波、電気信号、電気化学的信号、化学信号、磁場、放射線学的信号、およびmasstagsが含まれるが、これらに限定されない。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「検出分子（detection molecule）」は、分析物に結合する能力を有し、検出可能な基を含む分子を意味する。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「標識分析物（labelled analyte）」は、検出可能な基を含む分析物を意味する。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「標識検出分子」は、検出可能な基を含む検出分子を意味する。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「サンプル」は、分析されるべき混合物または溶液を意味する。サンプルの例には、血液、血漿、血清、汗、唾液、尿、涙液（lachrymal fluid）、水サンプル、および食品サンプルの懸濁液または溶液が含まれるが、これらに限定されない。

請求項および説明全体にわたり使用されるように、用語「基板」は、分析に関わる分子を支持する担体を意味する。

〔詳細な説明〕
第１の態様では、液体サンプル中の少なくとも２つの分析物を分析する方法が提供され、この方法は、
ａ）基板を提供する工程であって、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が基板上で固定化され、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有する、工程と、
ｂ）サンプルを捕捉分子と接触させる工程と、
ｃ）分析されるべき少なくとも１つの分析物について、捕捉分子と、その分析物に対して特異的親和性を有する標識検出分子との間の接触を誘導し、分析されるべき少なくとも１つの別の分析物について、捕捉分子と、標識バージョンの分析物との間の接触を誘導する工程と、
ｄ）基板上の標識検出分子および標識分析物からの検出可能な信号を測定する工程であって、標識分析物の濃度は、サンプル中の分析物の濃度に適応している、工程と、を含む。

固定化捕捉分子が存在する基板が提供される。一実施形態では、捕捉分子は、別個のエリアで固定化される。一実施形態では、異なるエリアが、異なる、固定化された種類の捕捉分子を有する。捕捉分子は、分析されるべき分析物に対して親和性を有する。一実施形態では、各種類の捕捉分子は、分析されるべき少なくとも１つの分析物に対して親和性を有する。一実施形態では、分析されるべき分析物それぞれに対して１種類の捕捉分子がある。一実施形態では、１種類の捕捉分子は、１つの分析物に対して特異的親和性を有する。一実施形態では、２つの異なる種類の捕捉分子がある。一実施形態では、基板上の２つの別個の独立したエリアに対して固定化された、２つの異なる種類の捕捉分子がある。代替的実施形態では、異なる種類の捕捉分子が、同じ別個のエリア（same distinct area）に対して固定化される。一実施形態では、同じエリアに固定化された捕捉分子は、アッセイで使用される検出可能な基の種類により識別され得る。一実施形態では、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が、基板上の少なくとも２つの異なるエリアで固定化される。

一実施形態では、数種類の捕捉分子が固定化されている基板が提供される。一実施形態では、各種類の捕捉分子は、少なくとも１つの別個のエリアに固定化される。

一実施形態では、２つ以上の異なる種類の捕捉分子の付着混合物（attached mixtures）があるエリアが存在する。

捕捉分子の例には、抗体、アプタマー、核酸プローブ、および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。核酸プローブの例には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが含まれるがこれらに限定されない。抗体断片の例には、ＦａｂおよびｓｃＦｖが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、捕捉分子は抗体である。別の実施形態では、捕捉分子は、抗体、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、抗体断片、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖ断片から選択される少なくとも１つの分子である。さらなる実施形態では、各捕捉分子は、抗体、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、抗体断片、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から独立して選択される。

サンプルは、捕捉分子と接触し、サンプル中の分析物は、その分析物が特異的親和性を有する捕捉分子に結合することができる。一実施形態では、サンプルは、装置の基板にサンプルを加えることにより、捕捉分子と接触する。一実施形態では、サンプルは、装置と接触する。一実施形態では、サンプルは、捕捉分子に対する分析物分子の結合について平衡状態に達するよう十分長い時間にわたり、捕捉分子と接触させられる。反応を平衡状態に進めることができることは利点である。

サンプルが捕捉分子と接触すると、少なくとも２つの異なる種類の分子は、捕捉分子と接触する。捕捉分子と接触するこれらの分子の種類は、使用されるべき分析物およびアッセイに適応している。少なくとも１つの種類の標識検出分子が加えられる。検出分子は、分析物に対して特異的親和性を有しており、任意の手段により検出分子を検出する基を含んでいる。少なくとも１つの標識分析物がさらに加えられる。標識分析物の代わりとして、またはそれに加えて、分析物の標識断片が加えられてもよく、この断片は、捕捉分子に結合する能力を有するエピトープを含む。標識分析物は、検出可能な基を含む分析物である。

検出可能な基の例には、フルオロフォア、放射標識、masstags、バイオルミネセンス基（bioluminescence groups）、ケモルミネセンス基（chemoluminescence groups）、および電気化学的標識を含むがこれらに限定されない。

低濃度でサンプル中に存在することが予測される分析物について、標識検出分子が加えられる。標識検出分子は、捕捉分子に結合する分析物分子に結合する。標識により、検出分子の検出が可能となる。検出された信号は、分析物の濃度の関数である。検出された信号は、分析物の濃度の増大と共に増大する。これは、サンドイッチアッセイである。

高濃度でサンプル中に存在することが予測される分析物について、標識分析物がサンプルに加えられる。標識分析物は、検出可能な基を含む分析物である。あるいは、またはさらに、分析物の類似体を加えてもよい。標識分析物は、捕捉分子上の結合部位について分析物と競合する。標識分析物の量は、サンプル中の分析物分子の濃度に適応する。当業者は、この説明にかんがみて、サンプル中の分析物分子の所定の濃度で、異なる濃度の標識分析物での日常の実験を行うことができる、ゆえに、標識分析物の適切な量を決定することができる。加えた後、（標識および非標識の）捕捉された分析物の量は、平衡値に近づく。捕捉された標識分析物および非標識分析物の割合は、サンプル中のこれらの種の割合を反映する。検出された信号は、分析物の濃度の関数である。検出された信号は、分析物の濃度の増大と共に減少する。これは、競合アッセイである。

標識検出分子、および標識分析物は、一実施形態では、同時に基板に加えられる。代替的実施形態では、これらは、連続して加えられる。一実施形態では、少なくとも１つの標識分析物が最初に加えられ、その後、少なくとも１つの標識検出分子が加えられる。代替的実施形態では、少なくとも１つの標識検出分子が最初に加えられ、その後、少なくとも１つの標識分析物が加えられる。

一実施形態では、標識検出分子、および標識分析物が基板に加えられる。一実施形態では、標識検出分子が、基板上に予め分配される。一実施形態では、標識分析物が、基板上に予め分配される。一実施形態では、標識検出分子および標識分析物の双方が、基板上に予め分配される。一実施形態では、標識検出分子および／または標識分析物が予め分配され、標識検出分子および／または標識分析物が基板に加えられる。

一実施形態では、捕捉分子と標識分析物との間の接触は、標識分析物を最初にサンプルに加え、その後、サンプルを捕捉分子と接触させることにより、誘導される。よって、サンプルを、分析されるべき少なくとも１つの分析物と混合し、その後、サンプルを装置に加えて、分析物を含むサンプルを捕捉分子と接触させるようにする可能性がある。

一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は１工程で行われる。

予め分配された標識検出分子、または予め分配された標識分析物は、一実施形態では、基板に物質を塗布し、溶媒が蒸発するようその物質を乾燥させることにより、作られる。一実施形態では、溶媒は水である。そのようにして、予め分配された、乾燥した物質は、基板上にくる。一実施形態では、少なくとも１つの薬剤を、溶媒に加える。そのような添加物の例には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、およびトレハロースが含まれるがこれらに限定されない。

液体サンプルが加えられると、予め分配された１つの物質／複数の物質は溶解し始める。一実施形態では、装置は、固定化された捕捉分子に比べて上流で、予め分配された１つの物質／複数の物質を有し、溶解した、予め分配された１つの物質／複数の物質は、下流に流れ、捕捉分子のエリアで反応することができる。

一実施形態では、装置は時間ゲートを有し、時間ゲートにより、液体サンプルが捕捉分子に接触し、しばらくすると、予め分配された１つの物質／複数の物質が溶解し、分析物および捕捉分子と反応する。時間間隔の間に液体を止めるための微小流体スイッチが、例えばＵＳ２００４／０２０６４０８により既知であり、この特許出願公開は、参照により全体として本明細書に明確に組み込まれる。

一実施形態では、装置は、液体サンプル中の第１および第２の分析物の濃度を分析するために使用されることが意図されている。第１の分析物は低濃度で存在し、第２の分析物は高濃度で存在する。第１の分析物は、低濃度で存在すると予測され、サンドイッチアッセイを使用して分析される。第２の分析物は、高濃度で存在すると予測され、競合アッセイを使用して分析される。基板上の第１のエリアに対しては、第１の分析物に特異的に結合する能力を有する固定化された捕捉分子があり、基板上の第２のエリアに対しては、第２の分析物に特異的に結合する能力を有する固定化された捕捉分子がある。サンプルが捕捉分子と接触すると、第１の分析物に特異的に結合する能力を有する標識検出分子を加える。標識バージョンの第２の分析物も加えられる。標識検出分子、および標識バージョンの分析物は、しばらくしてから検出される。

検出分子の例には、抗体、抗体断片、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、検出分子は抗体である。一実施形態では、検出分子は、抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブから選択される少なくとも１つの分子である。

一実施形態では、サンプルは、捕捉分子に対する分析物分子の結合について平衡状態に達するように十分長い時間にわたり、捕捉分子と接触させられる。

一実施形態では、微小流体装置を使用してアッセイを行う。

一実施形態では、少なくとも１つのチャネルを含む装置を使用する。一実施形態では、固定化された捕捉分子を有するエリアを備える少なくとも１つのチャネルを含む装置を使用する。一実施形態では、このようなチャネルは、予め分配された標識分析物分子および／または予め分配された標識検出分子をさらに含む。サンプルが装置に加えられ、サンプルは、少なくとも１つのチャネルに沿って、捕捉分子および予め分配された物質まで流れる。

一実施形態では、基板は、前記表面に実質的に垂直で、かつ、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（reciprocal spacing）（ｘ１、ｙ１）を有する突出部により少なくとも部分的に覆われている。

一実施形態では、基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、およびサンプル添加ゾーンと受容ゾーンとの間の流体接続を確立する少なくとも１つの接続ゾーンを含む。

一実施形態では、サンプル添加ゾーン、受容ゾーン、およびサンプル添加ゾーンと受容ゾーンとを接続するゾーンは、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有する、前記表面に実質的に垂直な突出部を含む。

第２の態様では、基板を含む分析装置が提供され、基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、およびサンプル添加ゾーンと受容ゾーンとの間の流体接続を確立する少なくとも１つの接続ゾーンを含み、これらのゾーンは、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有する、前記表面に実質的に垂直な突出部により少なくとも部分的に覆われている。この基板は、基板上で固定化された、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子を含み、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有する。

一実施形態では、基板は、少なくとも１つの予め分配された物質をさらに含む。

一実施形態では、基板は、少なくとも１つの予め分配された標識検出分子を含む。

一実施形態では、基板は、少なくとも１つの予め分配された標識分析物を含む。

一実施形態では、基板は、予め分配された標識検出分子、および予め分配された標識分析物を含む。

一実施形態では、基板は、少なくとも１つの予め分配された標識検出分子、および少なくとも１つの予め分配された標識分析物を含む。

〔実施例〕
実施例１
微小流体チップを基板として使用した。この基板は、熱可塑性物質（Zeonor 1060R、Zeon、日本）に射出成形され、酸素プラズマで酸化された。酸化は、作動圧力２６Ｐａ（０．２６ｍｂａｒ）、１０００Ｗ、１００ｍＬ／分の酸素流量で、プラズマチャンバ（400 Plasma System）内において６分間行われた。チップを、９５％エタノール（Kemetyl、スウェーデン）中の３容量％のＡＰＴＥＳ（Fluka）溶液に２時間浸した。硬化が、空中にて室温で、一晩で行われ、これにより、シランの架橋が可能となり、結果として、安定なアミン官能基化表面を生じた。ＡＰＴＥＳでコーティングした表面は、その後、酸化２％デキストラン溶液（Dextran T40（６．６４×１０^−２０ｇ（４０ｋＤａ））、Pharmacosmos、デンマーク）中に２時間浸され、ＭｉｌｌｉＱ−Ｈ_２Ｏですすぎ、３０ｍＭのＮａＩＯ_４（Sigma Aldrich）中で２時間さらに酸化した。

成形されたチップは、サンプルが添加され得る１つのサンプル添加ゾーン、サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する１つの受容ゾーン、および受容ゾーンとサンプル添加ゾーンとの間の流体接続を確立する１つの接続ゾーンを有した。接続ゾーンは、装置の中央に位置する捕捉抗体を有するエリアを有した。サンプル添加ゾーン、受容ゾーン、および接続ゾーンは、高さ７０μｍ、直径９０μｍおよび間隔５０μｍの、基板表面に垂直な突出部を有し、サンプルが加えられたときに横方向毛細管流動が生じた。

装置は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびＮＴｐｒｏＢＮＰの２乗測定（2-plexed measurement）のため使用された。血清中のＣＲＰの臨床的に関連する濃度範囲は、約０．５〜５００μｇ／ｍＬであるのに対し、ＮＴｐｒｏＢＮＰについては、１０〜１００００ｐｇ／ｍＬ、すなわち、４桁超の濃度差である。このような大きな濃度差の分析物を測定できるようにするため、ＣＲＰは、競合フォーマットで測定され、ＮＴｐｒｏＢＮＰはサンドイッチフォーマットで測定された。

両分析物の濃度は、最初に接続ゾーンの異なる位置で２つの分析物の捕捉抗体を固定化することにより、同じ液体サンプル中で同時に決定された。捕捉抗体（モノクローナルαＣＲＰおよびαＮＴｐｒｏＢＮＰ）は、流体チャネルにわたり２列にスポッティングされた。スポッティング溶液は、１容量％のトレハロース（Sigma Aldrich）、５０ｍＭのＮａＰＯ_４（ｐＨ７．５、Sigma Aldrich）緩衝液、および０．５ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体を含んだ。この混合物は、湿った条件（相対湿度７５％）下で、ナノプロッターＮＰ２．１（Nano-plotter NP 2.1）(Ge-Sim、ドイツ）により、流体チャネルにわたってスポッティングされ、〜０．５ｘ２ｍｍのバンドを結果として生じた。各バンドの総堆積容量は、５．２５ｎＬであった。

アッセイは、Alexa 647標識ＣＲＰ（２５０ｎｇ／ｍＬ）と混合された１５μＬの血清サンプル溶液をチップのサンプルゾーンに加えることにより実行された。サンプルは、接続チャネルを通って流れ、このため、サンプルが捕捉抗体と接触した。サンプル液滴全てがピラーアレイ（pillar array）内に移動すると、５μＬのAlexa 647標識検出抗体（血清中２０μｇ／ｍＬ、モノクローナルαＮＴｐｒｏＢＮＰ、捕捉抗体ではなく異なるエピトープに向けられる）は、サンプルゾーンに加えられる。最後に、洗浄工程として１５μＬの血清がサンプルゾーンに加えられた。微小流体接続チャネルに沿った蛍光信号強度が、線を照らす蛍光スキャナー（line illuminating fluorescence scanner）を用いて記録され、明瞭なピークを示し、そこで捕捉抗体が堆積した。図１は、微小流体チャネルにおける位置の関数としての相対蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。各線は、１つのチップに記録された蛍光信号を示す。垂直線は、積分境界（integration boundaries）を示す。新しいチップを各アッセイに使用した。

この手順は、スウェーデンのウプサラ大学病院で中央検査室により決定された既知のＮＴｐｒｏＢＮＰおよびＣＲＰ濃度の、５つの患者血清サンプルについて繰り返された。得られた強度プロファイルのピークは、中央検査室により測定された濃度の関数として積分されプロットされた。図２ａおよび図２ｂを参照。ＮＴｐｒｏＢＮＰのアッセイは、分析物濃度に対する線形信号応答を示す（図２ａ）が、ＣＲＰの信号は、分析物濃度（図２ｂ）と共に減少している。最も高いＣＲＰ濃度（２１μｇ／ｍＬ）は、最も低いＮＴｐｒｏＢＮＰ（５５ｐｇ／ｍＬ）より３８００００倍以上高い。

実施例２
実施例１の実験を繰り返したが、今回は、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）およびＣＲＰの組み合わせをアッセイした。チップおよびアッセイを、実施例１について述べたのと同じように準備および実行したが、ｃＴｎＩの捕捉および検出にモノクローナルαｃＴｎＩを使用する修正を加えた。ＣＲＰは競合フォーマットで測定し、ｃＴｎＩはサンドイッチフォーマットで測定した。血清サンプルは、既知のＣＲＰおよびｃＴｎＩ濃度のＣＲＰ欠損血清をスパイクする（spiking）ことにより準備された。一定のＣＲＰ濃度（５μｇ／ｍＬ）および増大するｃＴｎＩ濃度（０、２、１０、５０、２５０ｎｇ／ｍＬ）を有する５つのサンプルが準備され、アッセイされた。

図３は、微小流体チャネルにおける位置の関数としての相対蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。積分ピークが、実施例１で説明したように、濃度の関数としてプロットされた。ｃＴｎＩのアッセイは、分析物濃度に対する線形信号応答を示した（図４）が、ＣＲＰの信号は一定である。ＣＲＰ信号は、ｃＴｎＩ信号のバリエーションの影響を受けない。

本発明は、発明者らに現在既知の最良の様式を構成する、その好適な実施形態に関して説明されたが、当業者には明らかとなるであろう様々な変更および改変を、請求項に記載する本発明の範囲から逸脱することなく、行うことができることは理解されるべきである。

〔実施の態様〕
（１）液体サンプル中の少なくとも２つの分析物を分析する方法において、
ａ．基板を提供する工程であって、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が前記基板上に固定化され、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有する、工程と、
ｂ．前記サンプルを前記捕捉分子と接触させる工程と、
ｃ．分析されるべき少なくとも１つの分析物について、前記捕捉分子に結合された分析物分子と、前記分析物に対して特異的親和性を有する標識検出分子との間の接触を誘導し、分析されるべき少なくとも１つの別の分析物について、前記捕捉分子と、標識バージョンの前記分析物との間の接触を誘導する工程と、
ｄ．前記基板上の前記標識検出分子および前記標識分析物からの検出可能な信号を測定する工程であって、前記標識分析物の濃度は、前記サンプル中の非標識分析物の濃度に適応している、工程と、
を含む、方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記捕捉分子はそれぞれ、抗体、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、抗体断片、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から独立して選択される、方法。
（３）実施態様１に記載の方法において、
前記捕捉分子は、抗体である、方法。
（４）実施態様１〜３のいずれかに記載の方法において、
前記検出分子は、抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブから選択される、少なくとも１つの分子である、方法。
（５）実施態様１〜３のいずれかに記載の方法において、
前記検出分子は、抗体である、方法。

（６）実施態様１〜５のいずれかに記載の方法において、
前記捕捉分子と標識検出分子との間の前記接触は、標識検出分子を装置に加えることにより誘導される、方法。
（７）実施態様１〜５のいずれかに記載の方法において、
前記捕捉分子と標識検出分子との間の前記接触は、装置上で予め分配された物質を溶解させることにより誘導される、方法。
（８）実施態様１〜７のいずれかに記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、標識分析物を前記装置に加えることにより誘導される、方法。
（９）実施態様１〜７のいずれかに記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、最初に、標識分析物を前記サンプルに加え、次に、前記サンプルを前記捕捉分子と接触させることにより、誘導される、方法。
（１０）実施態様１〜７のいずれかに記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、前記装置上で予め分配された物質を溶解させることにより誘導される、方法。

（１１）実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法において、
前記サンプルを、前記捕捉分子に対する分析物分子の結合について平衡状態に達するように十分長い時間にわたって前記捕捉分子と接触させる、方法。
（１２）実施態様１〜１１のいずれかに記載の方法において、
前記基板は少なくとも部分的に、前記表面に実質的に垂直な突出部を有し、前記突出部は、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有する、方法。
（１３）実施態様１〜１２のいずれかに記載の方法において、
前記基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、前記サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、および、前記サンプル添加ゾーンと前記受容ゾーンとの間の流体接続を確立する少なくとも１つの接続ゾーンを含む、方法。
（１４）実施態様１〜１３のいずれかに記載の方法において、
前記少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子は、前記基板上の少なくとも２つの異なるエリアで固定化される、方法。
（１５）分析装置において、
基板、
を含み、
前記基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、および、前記サンプル添加ゾーンと前記受容ゾーンとの間の流体接続を達成する少なくとも１つの接続ゾーンを含み、前記ゾーンは、前記表面に実質的に垂直な突出部により少なくとも部分的に覆われ、前記突出部は、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有し、
前記基板は、前記基板上に固定化された少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子を含み、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有し、
前記基板は、予め分配された標識検出分子、および予め分配された標識分析物をさらに含む、装置。

微小流体チャネルにおける位置の関数としての、相対蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（ａ）はＮＴｐｒｏＢＮＰのアッセイ結果を示し、（ｂ）はＣＲＰのアッセイ結果を示す。別の微小流体チャネルにおける位置の関数としての、相対蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。ｃＴｎｌおよびＣＲＰのアッセイ結果を示す。

Claims

液体サンプル中の少なくとも２つの分析物を分析する方法において、
ａ．基板を提供する工程であって、少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子が前記基板上に固定化され、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有する、工程と、
ｂ．前記サンプルを前記捕捉分子と接触させる工程と、
ｃ．分析されるべき少なくとも１つの分析物について、前記捕捉分子に結合された分析物分子と、前記分析物に対して特異的親和性を有する標識検出分子との間の接触を誘導し、分析されるべき少なくとも１つの別の分析物について、前記捕捉分子と、標識バージョンの前記分析物との間の接触を誘導する工程と、
ｄ．前記基板上の前記標識検出分子および前記標識分析物からの検出可能な信号を測定する工程であって、前記標識分析物の濃度は、前記サンプル中の非標識分析物の濃度に適応している、工程と、
を含む、方法。
請求項１に記載の方法において、
前記捕捉分子はそれぞれ、抗体、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、抗体断片、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から独立して選択される、方法。
請求項１に記載の方法において、
前記捕捉分子は、抗体である、方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、
前記検出分子は、抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、アプタマー、核酸プローブ、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびＰＮＡプローブから選択される、少なくとも１つの分子である、方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法において、
前記検出分子は、抗体である、方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、
前記捕捉分子と標識検出分子との間の前記接触は、標識検出分子を装置に加えることにより誘導される、方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、
前記捕捉分子と標識検出分子との間の前記接触は、装置上で予め分配された物質を溶解させることにより誘導される、方法。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、標識分析物を前記装置に加えることにより誘導される、方法。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、最初に、標識分析物を前記サンプルに加え、次に、前記サンプルを前記捕捉分子と接触させることにより、誘導される、方法。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、
前記捕捉分子と標識分析物との間の前記接触は、前記装置上で予め分配された物質を溶解させることにより誘導される、方法。
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において、
前記サンプルを、前記捕捉分子に対する分析物分子の結合について平衡状態に達するように十分長い時間にわたって前記捕捉分子と接触させる、方法。
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、
前記基板は少なくとも部分的に、前記表面に実質的に垂直な突出部を有し、前記突出部は、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有する、方法。
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において、
前記基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、前記サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、および、前記サンプル添加ゾーンと前記受容ゾーンとの間の流体接続を確立する少なくとも１つの接続ゾーンを含む、方法。
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法において、
前記少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子は、前記基板上の少なくとも２つの異なるエリアで固定化される、方法。
分析装置において、
基板、
を含み、
前記基板は、少なくとも１つのサンプル添加ゾーン、サンプルの少なくとも一部を受容する容量を有する少なくとも１つの受容ゾーン、および、前記サンプル添加ゾーンと前記受容ゾーンとの間の流体接続を達成する少なくとも１つの接続ゾーンを含み、前記ゾーンは、前記表面に実質的に垂直な突出部により少なくとも部分的に覆われ、前記突出部は、前記液体サンプルの横方向毛細管流動が達成される、高さ（Ｈ１）、直径（Ｄ１）および相互間隔（ｘ１、ｙ１）を有し、
前記基板は、前記基板上に固定化された少なくとも２つの異なる種類の捕捉分子を含み、各種類の捕捉分子は、分析物に対して特異的親和性を有し、
前記基板は、予め分配された標識検出分子、および予め分配された標識分析物をさらに含む、装置。