JP2011022153A - 細胞電位測定デバイスとそれに用いる基板、細胞電位測定デバイス用基板の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の貫通孔との密着性を高め、細胞電位測定デバイスの測定精度を向上させる。
【解決手段】上記課題を解決するため本発明の細胞電位測定デバイス用基板は、第１面と前記第１面に対向する第２面とを有し、（１００）面配向のダイヤモンド構造を有する単結晶の基板１５からなり、前記第１面に凹部２０が形成されるとともに、前記凹部２０から前記第２面に向けて貫通孔２１が形成され、前記凹部２０は前記貫通孔２１の開口部から外周へ広がり、湾曲して前記第１面に繋がる内壁を備え、前記貫通孔２１の直径が０μｍより大きく３μｍ以下であるとした。
これにより凹部２０内壁の表面粗さを低減し、細胞と貫通孔２１との密着性を高めることが出来、その結果細胞電位測定デバイス１１の測定精度を向上させることが出来る。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞の電気生理活動を測定するための細胞電位測定デバイスとそれに用いる基板、および細胞電位測定デバイス用基板の製造方法に関する。

パッチクランプ法は、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりする従来の方法の一つである。パッチクランプ法では、マイクロピペットの先端部分で細胞膜の微小部分（パッチ）を軽く吸引する。そしてマイクロピペットに設けられた微小電極プローブを用いて、固定された膜電位においてパッチを横切る電流を測定する。これにより、パッチに存在する１個または少数個のイオンチャネルの開閉の様子を電気的に計測する。この方法は、細胞の生理機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである。

しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作製や操作に特殊な技術、技能を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要する。そのため、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。これに対し近年、微細加工技術を利用した平板型の微小電極プローブが開発されている。このような微小電極プローブは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。以下にその例を説明する。

例えば特許文献１は、細胞保持基板に設けられた複数の貫通孔の下方に配置した電極で、貫通孔の開口部に接着された被験体細胞の電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術を開示している。また近年、シリコン酸化物製の細胞保持基板の内部に２．５μｍの貫通孔を形成し、この貫通孔にヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術も開示されている。

特許文献２は図２７に示す細胞電位測定デバイス１を開示している。細胞電位測定デバイス１は基板２と、基板２の上方に配置された電極層３とを有する。基板２の上面には凹部４が形成され、凹部４の下部から基板２の下面まで貫通する貫通孔５が設けられている。電極層３の内部には第１電極６が配置され、貫通孔５の内部には第２電極７が配置されている。さらに第２電極７は、配線８を経て信号検出部に連結されている。

次に細胞電位測定デバイス１の動作方法について説明する。まず、電極層３内に被験体細胞（以下、細胞）１０と電解液９とを注入する。細胞１０は凹部４によって捕捉され、保持される。測定の際に細胞１０は貫通孔５の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔５の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、貫通孔５がガラスピペットの先端穴と同様の役割を果たす。細胞１０のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、反応前後の第１電極６と第２電極７との間の電圧、あるいは電流を測定し、細胞１０の内外の電位差を求めることによって分析される。なお、上記のように凹部４を設けることによって、機械的強度を確保するために厚い基板２を用いても貫通孔５の長さは小さくなり、加工が容易になる。また基板２の下方からの細胞１０に対する吸引力が高まる。

なお、この出願の発明に関する先行技術文献としては、下記の特許文献が挙げられる。

特表２００２−５１８６７８号公報 国際公開第０２／０５５６５３号

しかしながらドライエッチングなどを用いた従来の技術では、基板２に凹部４と貫通孔５とを加工している間、どの程度加工が進んでいるかを把握できない。そのため凹部４や貫通孔５の深さを高精度に管理できない。その結果、貫通孔５の長さがばらつきやすく、細胞１０を貫通孔５に的確に密着させることができないことがある。細胞１０を吸引する際、貫通孔５の長さによっては、細胞１０に掛かる圧力が不足する。結果として細胞１０が破損する、あるいは細胞１０と貫通孔５との密着性（シール抵抗）が低下し、細胞電位測定デバイス１の測定精度が低くなることがある。

また凹部４を形成する際、凹部４の内壁の、特に貫通孔５の周囲の表面粗さが増大する。そしてこの現象は、貫通孔５を形成するために基板２の上面に開口径が３μｍ以下のマスクホールを有するレジストマスクを設け、このレジストマスクを介して基板２をドライエッチングして貫通孔５を形成する場合に特に顕著である。また、凹部４を形成する場合、水平方向のエッチング速度が深さ方向のエッチング速度より速く、凹部４の中間で段差が形成されるなど、凹部４の形状対称性は低い。

これらの原因についてはまだ明らかとなっていないが、例えば微細なマスクホールからエッチングガスを凹部４の内部に充填するとエッチングガスが均一に拡散しないことに起因すると考えられる。このように凹部４の表面粗度は大きく、形状の対称性が低い。これも一因となって細胞１０と貫通孔５との密着性（シール抵抗）が低下し、細胞電位測定デバイス１の測定精度が低くなる。

本発明は、貫通孔の深さのばらつきを低減させ、測定精度が向上した細胞電位測定デバイスとそれに用いる基板、細胞電位測定デバイス用基板の製造方法である。本発明の細胞電位測定デバイスは、基板と第１電極槽と第１電極と第２電極槽と第２電極とを有する。第１電極槽は基板の上方に、第２電極槽は基板の下方にそれぞれ配置されている。第１電極は第１電極槽の内部に、第２電極は第２電極槽の内部にそれぞれ配置されている。基板は（１００）面配向または（１１０）面配向のダイヤモンド構造を有する単結晶板からなる。基板は凹部が形成された第１面とこの第１面に対向する第２面を有する。また凹部から第２面に向けて貫通孔が形成されている。凹部は貫通孔の開口部から外周へ広がり、湾曲して第１面に繋がる内壁を有する。貫通孔の直径は０μｍより大きく３μｍ以下である。

このような基板は以下のようにして作製される。すなわち、上記のような単結晶板材の第１面にフォトマスクを用いてマスクホールを有するレジストマスクを形成し、第１面にドライエッチングにより凹部を形成する。そして凹部から第２面までドライエッチングにより基板を貫通させ、マスクホールと同開口径を有する貫通孔を設ける。

これにより、貫通孔の長さのばらつきを低減し、細胞電位測定デバイスの測定精度を高めることができる。

本発明の実施の形態１による細胞電位測定デバイスの断面図 図１に示す細胞電位測定デバイスにおけるチップの斜視図 図２に示すチップの断面図 図３に示すチップの拡大断面図 図２に示すチップの製造ステップを示す断面図 図２に示すチップの、図５に続く製造ステップを示す断面図 図２に示すチップの、図６に続く製造ステップを示す断面図 図２に示すチップの、図７に続く製造ステップを示す断面図 図２に示すチップの、図８に続く製造ステップを示す断面図 図１に示す細胞電位測定デバイスにおける基板の走査型電子顕微鏡観察像を示す図 図１０Ａに示す走査型電子顕微鏡観察像の模式図 本発明の実施の形態１による細胞電位測定デバイスの基板である、（１００）面配向の単結晶シリコン板における（１１１）面配向の位置を示す模式図 本発明の実施の形態２による細胞電位測定デバイスにおけるチップの斜視図 図１２に示すチップの断面図 本発明の実施の形態２による細胞電位測定デバイスの基板である、（１１０）面配向の単結晶シリコン板における（１１１）面配向の位置を示す模式図 本発明の実施の形態３による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図 図１５に示すチップの製造ステップを示す断面図 図１５に示すチップの、図１６に続く製造ステップを示す断面図 図１５に示すチップの、図１７に続く製造ステップを示す断面図 図１５に示すチップの、図１８に続く製造ステップを示す断面図 図１５に示すチップの、図１９に続く製造ステップを示す断面図 図１５に示すチップの、図２０に続く製造ステップを示す断面図 本発明の実施の形態４による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図 本発明の実施の形態５による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図 図２３に示すチップの拡大断面図 本発明の実施の形態６による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図 図２５に示すチップの拡大断面図 従来の細胞電位測定デバイスの断面図

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお各実施の形態において先行する実施の形態と同様の構成をなすものには同じ符号を付して説明し、詳細な説明を省略する場合がある。また本発明は以下の各実施の形態に限定されるものではない。

（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１による細胞電位測定デバイスの断面図である。図２は図１に示す細胞電位測定デバイスにおけるチップの斜視図である。図３は図２に示すチップの断面図である。図４は図３に示すチップの拡大断面図である。細胞電位測定デバイス１１は、ウェルプレート１２と、ウェルプレート１２の下面に配置されたチッププレート１３と、チッププレート１３の下面に配置された流路プレート１４とを有する。

チッププレート１３の開口部には基板１５と基板１５の下面から起立した側壁２２Ａとを有するチップ２２が挿入され、基板１５の上方には第１電極槽１６が設けられている。第１電極槽１６の内部であって、チッププレート１３の上面には第１電極１７が配置されている。またチッププレート１３の下方には流路プレート１４との間に第２電極槽１８が設けられている。第２電極槽１８の内部であって、チッププレート１３の下面には第２電極１９が配置されている。

図２、図３に示すように、基板１５の上面（第１面）には凹部２０が形成され、凹部２０の最深部から基板１５の下面（第２面）に向けて貫通孔２１が垂直に形成されている。すなわち、基板１５は第１面とこの第１面に対向する第２面とを有し、第１面に凹部２０が形成されるとともに、凹部２０から第２面に向けて貫通孔２１が形成されている。

凹部２０は貫通孔２１の開口部を中心にその外周へ広がり、上方に向けて滑らかに湾曲して立ち上がる内壁を有する略半球形状に形成されている。貫通孔２１の内壁の表面粗度は、凹部２０の内壁の表面粗度よりも大きい。

基板１５はダイヤモンド構造を有するシリコンの単結晶板であり、面方位が（１００）である。図３における矢印Ｂは（１００）面配向の法線ベクトルを示している。基板１５の厚みは約２０μｍである。なお、（１００）面配向は、結晶構造の対称性によって等価となる（０１０）面配向、（００１）面配向を含む。

凹部２０の開口部の直径は約３０μｍであり、貫通孔２１の最小開口径は３μｍである。凹部２０は略半球形状を有するため、凹部２０の深さは約１５μｍであり、貫通孔２１の長さは約５μｍである。

貫通孔２１の最小開口径と凹部２０の開口部の直径とは、被験体である細胞２５の大きさ、形状、性質によって決定される。細胞２５が５〜５０μｍ程度の大きさの場合、細胞２５と貫通孔２１との密着性を高く維持するためには、貫通孔２１の最小開口径を０μｍより大きく３μｍ以下とすることが望ましい。なお、第１電解液２３を吸引しにくい場合は、最小開口径を０．１μｍ以上にすると流動性が向上するため好ましい。また貫通孔２１の長さは、後述のように、細胞２５を貫通孔２１に的確に吸引するため、吸引時の圧力に応じて設定される。本実施の形態では、貫通孔２１の長さは２μｍ〜１０μｍ程度に設定されている。

次に細胞電位測定デバイス１１の動作について説明する。図４に示すように、まず第１電極槽１６に細胞２５と第１電解液２３を満たし、第２電極槽１８には第２電解液２４を満たしておく。

そして基板１５の下方を減圧するか、上方を加圧することにより、細胞２５と第１電解液２３とを貫通孔２１に引き付ける。この時、細胞２５は凹部２０に捕捉され、貫通孔２１の開口部を塞ぐように保持される。その後、減圧または加圧により細胞２５を凹部２０に保持したまま、保持されない細胞を生理食塩水で洗い流して取り除く。

なお、細胞２５が哺乳類筋細胞の場合、第１電解液２３としては、例えばカリウムイオン（Ｋ⁺）を１５５ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｄｍ³）、ナトリウムイオン（Ｎａ⁺）を１２ｍＭ、塩素イオン（Ｃｌ^-）を４．２ｍＭ添加した水溶液を用い、第２電解液２４としては、Ｋ⁺を４ｍＭ、Ｎａ⁺を１４５ｍＭ、Ｃｌ^-を１２３ｍＭ添加した水溶液を用いる。なお、第１電解液２３と第２電解液２４とは、本実施の形態のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。

次に、基板１５の下方から吸引するか、あるいは基板１５の下方からナイスタチンなどの薬剤を投入し、細胞２５に微細小孔を形成する。その後、細胞２５に化学的刺激、あるいは物理的刺激を付与する。化学的刺激としては、化学薬品、毒物、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。細胞２５がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、細胞２５はその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。すると、細胞２５を通るイオン電流が発生し、細胞２５内外の電位勾配が変化する。この変化を反応前後の第１電極１７と第２電極１９との間の電圧、あるいは電流を測定することによって検出する。

次に、本発明の実施の形態における細胞電位測定デバイス１１の製造方法に関する発明について図５〜図９を用いて説明する。図５〜図９はそれぞれ図２に示すチップの製造ステップを示す断面図である。

まず図５に示すように、（１００）面配向した単結晶シリコン板材からなるチップ基板２６の下面にレジストマスク２７を形成する。次に、図６のようにチップ基板２６の下面から所定の深さだけエッチングし、上面に基板１５を有するチップ２２を形成する。その後、レジストマスク２７を除去する。

次に、図７に示すように基板１５の上面（第１面）にレジストマスク２８を形成する。このとき、レジストマスク２８のマスクホール２９の形状は、図３の貫通孔２１の開口部の形状とほぼ同じになるように設計しておく。本実施の形態では、貫通孔２１の最小開口径を３μｍとするため、マスクホール２９の開口径も３μｍとする。またレジストマスク２８はマスクホール２９の形状が変わらないよう、エッチングされにくい材料で構成することが好ましい。具体的にはシリコン酸化物、シリコン窒化物、シリコンオキシ窒化物またはこれらの混合物を用いることが望ましい。

その後、図８のように、ドライエッチング法により、基板１５の上面に凹部２０を形成する。基板１５がシリコンである場合、エッチングを促進するエッチングガスとしてＳＦ₆またはＣＦ₄またはＮＦ₃またはＸｅＦ₂、またはこれらのうち２種以上の混合ガスのいずれかを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、水平方向へのエッチングも促進する作用があるため、基板１５を半球形状の碗型にエッチングする。

次に、図９に示すようにレジストマスク２８を配置した状態で、凹部２０の最深部から基板１５の下面（第２面）までを垂直方向に貫く貫通孔２１を形成する。貫通孔２１を形成する際にはエッチングを促進する前述のエッチングガス（ＳＦ₆、ＣＦ₄、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂の少なくともいずれか一つ）とエッチングを抑制するガスとを交互に用いてドライエッチング加工を行う。エッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈、あるいはこれらの混合ガスを用いることができる。このようなガスを、エッチングされた壁面に吹き付けると、その表面にＣＦ₂のポリマーである保護膜が形成される。そのため、貫通孔２１を凹部２０の最深部から基板１５の下面に向けて垂直に進行させることができる。

以上のように貫通孔２１を形成した後、レジストマスク２８を除去すれば、図１０Ａの走査型電子顕微鏡観察像と図１０Ｂの模式図に示すような凹部２０と貫通孔２１とが設けられた基板１５が完成する。なお、図１０Ａは、基板１５の表面より３０°の角度からの観察結果である。

なお基板１５を斜めに傾けた状態で前述のようなエッチング加工をすることにより、貫通孔２１を基板１５の下面に向けて垂直に形成する以外に、貫通孔２１の方向に傾斜をつけることができ、このようにしてもよい。

以上のように貫通孔２１を形成した後、図１に示すように、チッププレート１３の上面に第１電極１７を、下面に第２電極１９を金属蒸着や無電解めっきなどでパターニングする。なお、第１電極１７、第２電極１９は、チップ２２毎に形成してもよく、複数のチップ２２と共有させてもよい。

次に接着剤を用いて、チッププレート１３の上面にウェルプレート１２を貼り付けるとともに、チッププレート１３の開口部にチップ２２を実装する。そしてチッププレート１３の下面に流路プレート１４を貼り付ける。このようにして基板１５の上方に第１電極槽１６を、基板１５の下方に第２電極槽１８をそれぞれ配置して細胞電位測定デバイス１１が完成する。

本実施の形態では図１０Ａに示すように、基板１５に（１００）面配向のダイヤモンド構造のシリコン単結晶板を用いている。そのため、凹部２０をドライエッチングで形成しても凹部２０の表面の凹凸が少なくなり、エッチングが均一に進む。その結果、形成された凹部２０は貫通孔２１の開口部を中心とした対称性に優れた形状を有する。これにより、凹部２０の深さは、外観から測定できる凹部２０の開口径から容易に算出することができる。そして凹部２０の深さと基板１５の厚みとから貫通孔２１の長さを算出できる。その結果、貫通孔２１の長さのばらつきを低減させて、細胞電位測定デバイス１１の測定精度を向上することができる。

また上述のように凹部２０内壁の表面粗さが低減する。そのため、平滑な凹部２０に細胞２５を捕捉することによって、貫通孔２１と細胞２５との密着性（シール抵抗）を高めることができる。結果として細胞電位測定デバイス１１の測定精度を向上させることができる。

ここで凹部２０の内壁の表面粗さを低減できる理由を、図１１を用いて説明する。図１１は本実施の形態で用いた（１００）面配向の単結晶シリコン板からなる基板１５の模式図である。ベクトルＡは（１００）面配向の基板１５における（１１１）面配向の法線ベクトルを示しており、ベクトルＢは（１００）面配向の法線ベクトルを示している。

ベクトルＡは基板１５の上面に対して３５．３°の傾きを有し、基板１５の上面に対し、５４．７°の角度で（１１１）面配向を有している。基板１５はこのようなベクトルＡを中心Ｏから同心半球状に均等な位置に有している。

基板１５を形成するシリコンはダイヤモンド結晶構造を有し、どのシリコン原子も４個の結合肢で互いに結びついている。そしてこの（１１１）面配向はシリコン原子密度が最も高く、またシリコン同士の結合肢は３個が基板１５表面から下部へと伸び、表層にある自由な結合肢は１個しかない構造となっている。一方、（１００）面配向は二本の自由な結合肢が基板１５の表面から突き出すように存在し、反応性が高くなっている。よって、（１００）面配向の法線ベクトルＢの方向のエッチングは、（１１１）面配向の法線ベクトルＡの方向のエッチングと比較し、非常に速くなる。

すなわち、本実施の形態で用いた（１００）面配向のシリコン基板１５は、ベクトルＢの方向のエッチングが速いことから凹部２０の深さ方向のエッチングが促進される。さらにベクトルＡが均等な放射状に存在していることから、エッチングが対称に進みやすく、凹部２０内壁の表面粗さを低減することができると考えられる。その結果、凹部２０の形状は対称性の優れた半球形状となる。

エッチング加工時間などのエッチング条件は、凹部２０の外観を光学顕微鏡などで確認しながら、容易に調整でき、製造プロセスを簡易にすることができる。そして凹部２０の深さと基板１５の厚みとから貫通孔２１の長さを高精度に設定することができる。また凹部２０の表面が平滑になることにより、細胞２５と貫通孔２１との密着性が高まり、細胞電位測定デバイス１１の測定精度が向上する。

なおドライエッチングに用いるエッチングガスに、Ｎ₂、Ａｒ、Ｈｅ、Ｈ₂またはこれらの混合ガスであるキャリアガスを混合して用いてもよい。またエッチングガスのキャリアガスに対するモル比は、０を超え、２．０以下であることが望ましい。このような組成およびモル比のキャリアガスを用いることによって前述のエッチングガスの拡散が均一となり、凹部２０の平滑性を向上させることができる。また凹凸などの形状を左右する複雑な因子を極力減らし平滑にすることによって、複数の凹部２０を実質的に同一形状に形成することが容易となる。

なおドライエッチング加工では、エッチングガスをレジストマスク２８の上方から凹部２０の内部へ注入し、所定時間充填する。その後、エッチングガスを吸引（除去）して回収し、再びエッチングガスを充填・回収する。このような操作を複数回繰り返すことが好ましい。これによりエッチングガスを均一に拡散することが容易となる。そして貫通孔２１の内壁に僅かな凹凸を繰り返し形成しながら略直線に貫通孔２１を形成することができる。したがって、貫通孔２１の長さをより高精度に設計することができると共に、貫通孔２１の開口部付近では、その凹凸に細胞２５が食い込み、細胞２５と貫通孔２１との密着性が向上する。

さらに本実施の形態では、図９に示すように１枚のレジストマスク２８を用い、ドライエッチングによって凹部２０、貫通孔２１の順に形成している。そのため、貫通孔２１の開口部の位置を凹部２０の最深部に正確に定めることができる。細胞２５は重力に従って落下するため、凹部２０の最深部にトラップされやすい。したがって、貫通孔２１の開口部の位置を凹部２０の最深部にすることによって細胞電位測定デバイス１１の測定精度が向上する。また、凹部２０と貫通孔２１との複数の組を略同形状に形成することができ、これらの組の間での形状ばらつきによる測定誤差のばらつきが減少するため測定精度が向上する。さらに２種類のレジストマスクを用いる場合と比較して製造の手間が省かれ、コスト低減に寄与する。

本実施の形態では、凹部２０が貫通孔２１の開口部から外周上方へと滑らかに湾曲して立ち上がる内壁を有している。細胞２５は重力に従い、この内壁に沿って滑らかに貫通孔２１へと転がることができる。したがって、細胞２５が的確に凹部２０に捕捉され、細胞２５と貫通孔２１との密着性が高まり、細胞電位測定デバイス１１の測定精度向上に寄与する。

（実施の形態２）
図１２、図１３はそれぞれ本発明の実施の形態２による細胞電位測定デバイスにおけるチップの斜視図と断面図である。図１４は本実施の形態による細胞電位測定デバイスの基板である、（１１０）面配向の単結晶シリコン板における（１１１）面配向の位置を示す模式図である。本実施の形態と実施の形態１との違いは、基板１５Ａの材料として（１１０）面配向の単結晶シリコンを用いていることである。それ以外は実施の形態１と同様である。なお、（１１０）面配向は、結晶構造の対称性によって等価となる（１０１）面配向、（０１１）面配向を含む。

図１４に示すように（１１０）面配向の単結晶シリコン板からなる基板１５Ａは、表面に対し９０°及び３５．３°の角度で（１１１）面配向を有している。すなわち、ベクトルＡは（１１０）面配向における（１１１）面配向の法線ベクトルであり、基板１５Ａの中心Ｏから９０°または５４．７°の傾きを有している。またベクトルＣは（１１０）面配向の法線ベクトルであり、点線は基板１５Ａ上の基準線を示している。

本実施の形態では、実施の形態１と異なり、凹部２０Ａの形状は略半楕円球形状となる。これは図１４に示すように、（１１１）面配向の法線ベクトルＡが中心Ｏから同心半球状に均等に配置していないことから、基板１５Ａの表面のエッチング形状は楕円に近い形状となるためである。

このように本実施の形態では、基板１５Ａとして（１１０）面配向の単結晶シリコン板を用いている。この場合も凹部２０Ａの内壁の表面粗さは低減され、平滑な形状となる。そのため凹部２０Ａは貫通孔２１の開口部を中心に対称性に優れた形状となる。したがって、エッチング条件毎に凹部２０Ａの開口径と深さとの関係を算出しておけば、同じエッチング条件においては外観から計測できる凹部２０Ａの開口径から凹部２０Ａの深さを算出することができる。結果として貫通孔２１の長さを高精度に設計することができる。

なお、本実施の形態では、実施の形態１と異なり、（１１０）基板の表面に存在するシリコン原子の自由な結合肢は１個しかないが、２個は基板１５Ａの表面に平行に存在している。そのため、結合肢は反応しやすい状態にある。よって、（１１０）面配向のシリコン基板１５Ａを用いた場合も、（１００）面配向のシリコン基板１５を用いた場合と同様に、（１１０）面配向の法線ベクトルＣ方向のエッチングは速くなる。そしてシリコン原子の水平方向のエッチング速度が顕著に速くなることは抑制される。また法線ベクトルＡは半球状ではないが、対称性をもって放射状に配置されているため、エッチングは法線ベクトルＣに対し左右対称に進みやすいと推測される。

以上のように本実施の形態でも、凹部２０Ａの内壁の表面粗さが低減され、凹部２０Ａは平滑な形状となる。よって貫通孔２１と細胞２５との密着性が高まり、細胞電位測定デバイス１１の測定精度が向上する。

また、本実施の形態では、凹部２０Ａの形状が略半楕円球形状となる。そのため楕円球形状の細胞２５を測定対象とする場合に、凹部２０Ａに細胞２５を安定して保持することができ、測定精度の向上に寄与する。

（実施の形態３）
図１５は本発明の実施の形態３による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図である。本実施の形態３と実施の形態１との違いは、基板１５の下面（第２面）上にシリコン酸化物層３０が形成されている点である。すなわち、本実施の形態におけるチップ３１は、約２０μｍの基板１５と厚み約２μｍのシリコン酸化物層３０と厚み４００〜５００μｍ程度の下部シリコン層３２とを有する。シリコン酸化物層３０は基板１５の下面に配置され、下部シリコン層３２はシリコン酸化物層３０の下面に形成され、基板１５の下面から起立した側壁を構成している。基板１５は（１００）面配向した単結晶シリコン板からなる。これ以外は実施の形態１と同様である。なお、図１５で示すベクトルＢは（１００）面配向の法線ベクトルを示す。

次に、チップ３１の製造方法について図１６〜図２１を用いて説明する。図１６〜図２１は図１５に示すチップの製造ステップを示す断面図である。

まず、図１６に示すように、チップ基板３３の基板１５の上面にレジストマスク３４を形成する。チップ基板３３は基板１５とシリコン酸化物層３０と下部シリコン層３２の３層で構成されている。基板１５は厚みが約２０μｍであり（１００）面配向した単結晶シリコン板からなる。厚みが約２μｍのシリコン酸化物層３０は基板１５の下面に配置されている。厚みが４００〜５００μｍ程度の下部シリコン層３２はシリコン酸化物層３０の下面に配置されている。

レジストマスク３４のマスクホール３５の形状は図１５の貫通孔２１の形状とほぼ同じになるように設計しておく。本実施の形態では貫通孔２１の最小開口径を３μｍとするので、マスクホール３５の開口径も３μｍである。

その後、図１７に示すようにＳＦ₆、ＣＦ₄、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂の少なくともいずれかであるエッチングガスを用いドライエッチングによって基板１５の上面からエッチングを行い、凹部２０を形成する。凹部２０の形成方法は実施の形態１と同様である。

次に、図１８に示すように、凹部２０から基板１５の下面までドライエッチングを行い、貫通孔２１となるホール２１Ａを形成する。このとき、ドライエッチングガスとしてシリコンのエッチングを促進するＳＦ₆などを用いると、エッチンググレートの差によりシリコン酸化物層３０がエッチングストップ層となる。すなわちシリコン酸化物層３０は基板１５を構成する材料よりもエッチンググレートの小さいエッチングストップ層である。そして、ホール２１Ａの長さを設計通り一定に形成することができ、簡便な方法で高精度にホール２１Ａを形成することができる。

次に、図１９に示すように、シリコン酸化物層３０を、基板１５の上面から例えばＣＦ₄などのガスを用いてエッチングする。これにより貫通孔２１を形成する。その後、レジストマスク３４を除去する。そして、図２０に示すように、下部シリコン層３２の下面にレジストマスク３８を形成する。その後、図２１のように下部シリコン層３２の下面からシリコン酸化物層３０までエッチングして貫通孔２１を完成させる。このときも、シリコン酸化物層３０がエッチングストップ層となるので、高精度に基板１５の厚みを調整することができる。その結果、貫通孔２１を高精度な長さにすることができる。その他の効果については実施の形態１と同様であるため省略する。

なお、基板１５には（１００）面配向の単結晶シリコン層を用いたが、（１１０）面配向の単結晶シリコン層を用いても、凹部２０の表面粗さを低減し、表面形状を平滑にすることができる。また内壁形状は段差のない対称性の優れた形状とすることができる。さらに表面に凹凸が少ないと、形状を左右する因子が少なくなるため、凹部２０を複数個形成した場合、それらの形状の均一性を高めることができる。すなわち実施の形態２と同様の効果が得られる。

また本実施の形態では基板１５がシリコンの場合にシリコン酸化物層３０をエッチングストップ層としたが、その他シリコン窒化物（Ｓｉ₃Ｎ₄）でエッチングストップ層を形成してもよい。

（実施の形態４）
図２２は本発明の実施の形態４による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図である。本実施の形態と実施の形態１との違いは、基板１５の上面と凹部２０の内壁とがシリコン酸化物の膜３７で被覆されている点にある。すなわち、少なくとも凹部２０の表面に絶縁材料からなる膜３７が設けられている。それ以外の構成は実施の形態１と同様である。

これによりさらに凹部２０の内壁の表面粗さが小さくなり、平滑になる。したがって、細胞２５が貫通孔２１の開口部に密着しやすくなり、細胞電位測定デバイス１１の測定精度が向上する。また膜３７の材料として絶縁物を用いることにより、貫通孔２１の上部と下部との電気絶縁性が高まり、測定精度の信頼性向上に寄与する。

膜３７の材料としてはシリコン酸化物以外にシリコン窒化物、シリコンオキシ窒化物、またはこれらの混合物などの材料を用いることができる。例えばシリコン酸化物やシリコン窒化物からなる膜３７は、シリコン酸化物やシリコン窒化物をスパッタ成膜することによって形成することができる。このような方法を用いるとアスペクト比の大きい貫通孔２１の内壁には膜３７が形成されにくく、基板１５の上面と凹部２０の内壁にのみ膜３７が形成される。また酸素雰囲気でシリコンからなるチップ２２を熱処理すればチップ２２の表面全体にシリコン酸化物からなる膜３７が形成される。このように膜３７は少なくとも凹部２０の表面に絶縁材料からなる膜３７が設けられていればよい。

膜３７としてシリコン酸化物を用いる場合、膜３７を被覆しない場合と比較して凹部２０の内壁の親水性が向上する。一般に、細胞２５の表面は親水性を有するため、凹部２０の内壁の親水性が向上することによって、細胞２５は凹部２０の内壁により密着して保持される。具体的には、膜３７を設けることによって膜３７がない場合と比べて細胞２５と凹部２０表面との接触角が約１／３まで低減する。その他の効果については実施の形態１と同様であるため省略する。

（実施の形態５）
図２３は本発明の実施の形態５による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図である。図２４は図２３に示すチップの拡大断面図である。本実施の形態と実施の形態１との違いは、チップ２２を上下反転させて図１のチッププレート１３に配置している点である。

すなわち本実施の形態は、基板１５は（１００）面配向のシリコン板であり、基板１５の上面（第２面）には貫通孔２１が形成され、下面（第１面）には凹部２０が形成されている。そして凹部２０は略半球形状であって、貫通孔２１の開口部から外周へ広がり、滑らかに湾曲して上面に繋がる内壁を有している。

これにより本実施の形態では、貫通孔２１の長さのばらつきが低減されるだけでなく、貫通孔２１から図１に示す第２電極槽１８にかけて流路の断面積変化が緩やかになり、流体抵抗が小さくなって電解液等が流れやすくなる。また基板１５の下方からの吸引がしやすくなり、細胞２５を的確に貫通孔２１の開口部に密着させることができる。またナイスタチンなど、基板１５の下方から注入する薬液が貫通孔２１に流れ込みやすくなり、細胞２５に迅速に到達させることができる。

さらに、凹部２０の内壁表面が平滑であるため、凹部２０の内壁に発生する気泡が低減される。そのため細胞２５を貫通孔２１に吸引する際の圧力が気泡の存在によって伝達しにくくなるのを抑制することができる。したがって、細胞２５を的確に貫通孔２１に密着させることができる。

また、貫通孔２１の表面粗度を凹部２０の表面粗度よりも大きくしておくことが好ましい。これによって、貫通孔２１の内壁の凹凸が細胞２５に対するアンカー効果となり、基板１５上面に凹部２０を形成しなくとも、貫通孔２１との密着性をより向上させることができ、測定精度を高めることができる。その他、実施の形態１と同様の構成・効果については、説明を省略する。

なお、本実施の形態では、基板１５として（１００）面配向のシリコン板を用いたが、実施の形態２と同様に基板１５として（１１０）面配向のシリコン板を用いても同様の効果が得られる。また、凹部２０の内壁や基板１５の下面を、実施の形態４と同様にシリコン酸化物等の絶縁性の膜３７で被覆してもよい。これにより凹部２０の内壁がさらに平滑になり、貫通孔２１の上部と下部との電気絶縁性が高まる。

（実施の形態６）
図２５は本発明の実施の形態６による細胞電位測定デバイスにおけるチップの断面図である。図２６は図２５に示すチップの拡大断面図である。本実施の形態と実施の形態３との違いは、チップ３１を上下反転させて図１に示すチッププレート１３に配置させるとともに、基板１５の上面（第２面）にシリコン酸化物層３０が形成されている点である。

すなわち、チップ３１は、厚み約２０μｍの基板１５と厚み約２μｍのシリコン酸化物層３０と厚み４００〜５００μｍ程度の上部シリコン層４０とを有する。シリコン酸化物層３０は基板１５の上面に配置され、上部シリコン層４０はシリコン酸化物層３０の上に形成されている。このように本実施の形態は、実施の形態３と実施の形態５とを組み合わせた構成となる。

この構成でも実施の形態３と同様に、シリコン酸化物層３０がエッチングストップ層となり、基板１５の厚みを高精度に設計できる。また凹部２０の深さも実施の形態１と同様に、高精度に設計できることから、結果として貫通孔２１の長さの管理精度が向上する。合せて実施の形態５と同様の効果も得られる。

さらに本実施の形態では、凹部２０からシリコン酸化物層３０まで基板１５に貫通孔２１を形成した後、シリコン酸化物層３０にホール４１を形成する。したがって、基板１５に貫通孔２１を形成するためのエッチングガス（例えばＳＦ₅ ⁺）がシリコン酸化物層３０上で溜まり、このエッチングガスのプラスイオン同士が反発して、貫通孔２１の横方向に拡散し、意図的にエッチングを横方向に進ませることができる。

その結果、図２６に示すように、基板１５とシリコン酸化物層３０との接触面において、貫通孔２１の開口径がシリコン酸化物層３０のホール４１より広がり、貫通孔２１内壁に窪み４２ができる。ホール４１の開口部に密着した細胞２５は窪み４２に引っかかり、ホール４１開口部と細胞２５との密着性がより向上する。なお、本実施の形態も基板１５に（１１０）面配向のシリコン板を用いてもよい。

また、実施の形態１〜６では基板１５としてシリコン板を用いたが、その他ダイヤモンドなど、ダイヤモンド構造の単結晶板を用いてもよい。なお、ダイヤモンドの場合、エッチングガスとして酸素などを用いることができる。またチップ２２、３１は基板１５の下面から起立した側壁２２Ａまたは下部シリコン層３２を有しているが、基板１５のみをチッププレート１３の開口部に固定してもよい。

本発明による基板とその製造方法では、貫通孔の長さを管理することができ、高精度に貫通孔の長さを同等にすることができる。また基板に設けられ、細胞を保持する凹部の内壁の表面形状が平滑になる。これらによりこの基板を用いた細胞電位測定デバイスの測定精度が向上する。したがって、高精度の測定が求められる医療・バイオ分野における、微小電子機械システム（ＭＥＭＳ）技術を応用したデバイスに有用である。

１１ 細胞電位測定デバイス
１２ ウェルプレート
１３ チッププレート
１４ 流路プレート
１５，１５Ａ 基板
１６ 第１電極槽
１７ 第１電極
１８ 第２電極槽
１９ 第２電極
２０，２０Ａ 凹部
２１ 貫通孔
２１Ａ ホール
２２，３１ チップ
２２Ａ 側壁
２３ 第１電解液
２４ 第２電解液
２５ 細胞
２６，３３ チップ基板
２７，２８，３４，３８ レジストマスク
２９，３５ マスクホール
３０ シリコン酸化物層（エッチングストップ層）
３２ 下部シリコン層
３７ 膜
４０ 上部シリコン層
４１ ホール
４２ 窪み

Claims (18)

1. 第１面と前記第１面に対向する第２面とを有し、（１００）面配向のダイヤモンド構造を有する単結晶板からなり、
   前記第１面に凹部が形成されるとともに、前記凹部から前記第２面に向けて貫通孔が形成され、前記凹部は前記貫通孔の開口部から外周へ広がり、湾曲して前記第１面に繋がる内壁を備え、
   前記貫通孔の直径が０μｍより大きく３μｍ以下である、
   細胞電位測定デバイス用基板。
2. 前記凹部は半球形状である、
   請求項１記載の細胞電位測定デバイス用基板。
3. 前記凹部の表面に配置された絶縁材料からなる膜をさらに備えた、
   請求項１記載の細胞電位測定デバイス用基板。
4. 前記基板の前記第２面上に形成され、前記基板を構成する材料よりもエッチングレートの小さいエッチングストップ層をさらに備えた、
   請求項１記載の細胞電位測定デバイス用基板。
5. 請求項１記載の細胞電位測定デバイス用基板と、
   前記基板の上方に配置された第１電極槽と、
   前記第１電極槽の内部に配置された第１電極と、
   前記基板の下方に配置された第２電極槽と、
   前記第２電極槽の内部に配置された第２電極と、を備えた、細胞電位測定デバイス。
6. 第１面と前記第１面に対向する第２面とを有し、（１１０）面配向のダイヤモンド構造を有する単結晶板からなり、
   前記第１面に凹部が形成されるとともに、前記凹部から前記第２面に向けて貫通孔が形成され、前記凹部は前記貫通孔の開口部から外周へ広がり、湾曲して前記第１面に繋がる内壁を備え、
   前記貫通孔の直径が０μｍより大きく３μｍ以下である、
   細胞電位測定デバイス用基板。
7. 前記凹部は半楕円球形状である、
   請求項６記載の細胞電位測定デバイス用基板。
8. 前記凹部の表面に配置された絶縁材料からなる膜をさらに備えた、
   請求項６記載の細胞電位測定デバイス用基板。
9. 前記基板の前記第２面上に形成され、前記基板を構成する材料よりもエッチングレートの小さいエッチングストップ層をさらに備えた、
   請求項６記載の細胞電位測定デバイス用基板。
10. 請求項６記載の細胞電位測定デバイス用基板と、
    前記基板の上方に配置された第１電極槽と、
    前記第１電極槽の内部に配置された第１電極と、
    前記基板の下方に配置された第２電極槽と、
    前記第２電極槽の内部に配置された第２電極と、を備えた、
    細胞電位測定デバイス。
11. 第１面と前記第１面に対向する第２面とを有し、（１００）面配向のダイヤモンド構造と（１１０）面配向のダイヤモンド構造とのいずれかを有する単結晶板の前記第１面にフォトマスクを用いてマスクホールを有するレジストマスクを形成するステップと、
    前記第１面にドライエッチングにより半球形状の碗型に凹部を形成するステップと、
    前記凹部から前記第２面までドライエッチングにより前記単結晶板を貫通させ、前記マスクホールと同開口径を有する貫通孔を設けるステップと、を備え、
    前記マスクホールの開口径が０μｍより大きく３μｍ以下である、
    細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
12. 前記凹部を形成するステップにおいてエッチングガスを用い、前記エッチングガスがＣＦ₄、ＳＦ₆、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂の少なくともいずれか一つである、
    請求項１１記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
13. 前記凹部を形成するステップにおいてエッチングガスとキャリアガスとを用い、前記キャリアガスがＮ₂、Ａｒ、Ｈｅ、Ｈ₂の少なくともいずれか一つである、
    請求項１１記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
14. 前記凹部を形成するステップにおいてエッチングガスとキャリアガスとを用い、前記エッチングガスの前記キャリアガスに対するモル比が０を超え、２．０以下である、
    請求項１１記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
15. 前記凹部を形成するステップにおいてエッチングガスを用い、前記エッチングガスの充填と除去とを複数回繰り返す、
    請求項１１記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
16. 前記貫通孔を形成するステップにおいてエッチングガスとエッチング抑制ガスとを交互に用いる、
    請求項１１記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
17. 前記エッチングガスがＣＦ₄、ＳＦ₆、ＮＦ₃、ＸｅＦ₂の少なくともいずれか一つである、
    請求項１６記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。
18. 前記エッチング抑制ガスがＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈の少なくともいずれか一つである、
    請求項１６記載の細胞電位測定デバイス用基板の製造方法。