JP2004069309A - 細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞外電位測定デバイスにおいて複数のウエルを基板内に高密度に配置する必要があるときに、被験体細胞を保持する窪みのウエル側の開口部の大きさと貫通口側の大きさを二段階にする必要があり、この形状を正確に実現する方法が期待されていた。
【解決手段】基板１がベース２と、このベース２とは異なる材料による中間層３と、ベースとほぼ同じ材料による薄板４の積層構造からなり、前記ベース２内に少なくとも一つ以上のウエル５と、前記薄板４内に前記ウエル５と基板１の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口６を設ける。
【選択図】 図１
【解決手段】基板１がベース２と、このベース２とは異なる材料による中間層３と、ベースとほぼ同じ材料による薄板４の積層構造からなり、前記ベース２内に少なくとも一つ以上のウエル５と、前記薄板４内に前記ウエル５と基板１の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口６を設ける。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（たとえば、細胞の分子生物学、第三版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法ではマイクロピペットの作成及び操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要するため大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要で測定においては色素の影響によるバックグラウンドが高い上に時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点がある。
【０００６】
これに代わる方法として、既に特願２００１−００１９８０号および特願２００１−１７０３４１号により開示される方法は、パッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものである。これらの先行技術では、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する、いわゆる細胞外電位測定デバイスについて開示されている。今少し、上記先行技術で開示される細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて説明する。
【０００７】
図２０は上記先行技術で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル４０内に培養液４８が入れられ、被験体細胞４７は基板４２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板４２に形成された窪み４１および開口部を介して、この窪み４１に連絡する貫通口４４を備えている。さらに、貫通口４４の中にはセンサー手段である測定電極４５が配置されており、この測定電極４５は配線を経て信号検出部に連結されている。
【０００８】
測定の際には、被験体細胞４７を貫通口４４側から吸引ポンプなどの手段によりこの被験体細胞４７が窪み４１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞４７の活動により発生する電気信号はウエル４０中の培養液４８側に漏れることなく、貫通口４４側に設けた測定電極４５によって検出される。
【０００９】
ここで、窪み４１部に被験体細胞４７を保持させるためには窪み４１の上部に被験体細胞４７、培養液４８およびこれと反応する薬剤を混合させるための容器であるウエル４０が必要である。従来の例では、ウエル４０は基板４２とは別に設けられ、図２０のように窪み４１の上部にセットされていた。
【００１０】
さらに、被験体細胞４７を保持する窪み４１部の大きさは１０〜３０μｍ程度であり、貫通口４４側の大きさが１〜５μｍと２段階になっている上、貫通口４４の長さは、通常１０μｍ程度にする必要がある。この形状を正確に実現するためには、２種類のマスクを用いて、まず、第一のマスクによって窪み４１のドライエッチングを行った後、第二のマスクによって貫通口４４のドライエッチングを行う必要がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような細胞外電位測定デバイスにおいて特に問題となるのはウエル４０と貫通口４４と窪み４１の形成された基板４２とを別々に設けると、ウエル４０と基板４２の貼り合わせが必要であるとともに正確な位置合わせも必要である。特に複数のウエル４０を基板４２内に高密度に配置する必要がある場合には、位置合わせに加えて液体が漏れ出さないように確実に貼り合わせる必要があり、その作業は困難なものとなる。
【００１２】
さらに、上述のように２種類のマスクを用いて行うと第一のマスクによるドライエッチングを行った後、第二のマスクを用いてドライエッチングを行う際にマスクのアライメントずれが生じるという課題が発生する。
【００１３】
又、２枚のマスクを用意して、それぞれ別々にフォトリソグラフィを行うので製造的にも手間がかかり、コスト高を招くことがある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスであり、ベース内にウエルが設けられているので、別途ウエルを設ける必要がなく、基板の中にウエル、貫通口が一体化されている極めてコンパクトな細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１５】
本発明の請求項２に記載の発明は、貫通口のウエル側に窪みを有するとともに、この窪みの開口部を貫通口の開口部より大きくした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、被験体細胞は貫通口側に引き込まれるとともに、窪み内に確実に保持することができる。
【００１６】
本発明の請求項３に記載の発明は、窪みの内壁を円錐形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、円錐形とすることにより、ウエル側から被験体細胞が容易に進入することが可能であり、かつ円錐形内には一つの被験体細胞しか進入できないので、被験体細胞の保持がより確実にできる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１７】
本発明の請求項４に記載の発明は、窪みの内壁を半球形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、一つの被験体細胞が進入可能なことに加えて、貫通口との接続面が半球形であるので、この貫通口との接続面に被験体細胞の表面がより確実に接することとなり、被験体細胞の保持を確実にすることができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１８】
本発明の請求項５に記載の発明は、中間層の電気抵抗率を薄板の電気抵抗率よりも高くした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、貫通口および窪みを薄板側からドライエッチングによって形成する際に、エッチングイオンが電気抵抗率の大きい中間層に蓄積することにより、エッチングイオンが中間層の近辺の薄板部分をもドライエッチングするようになるので貫通口のドライエッチング時に同時に窪みを形成できるという製造上の利点を有する細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１９】
本発明の請求項６に記載の発明は、中間層と薄板を構成する材料を同じエッチングガスに対するエッチングレートの比が異なる材料で構成した請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、薄板に貫通口と窪みをドライエッチングによって形成する際に、エッチングが中間層に達した後も中間層をドライエッチングしてしまわないようにできるので、より高精度な貫通口および窪みの形成を実現できるという製造上の利点を有する細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２０】
本発明の請求項７に記載の発明は、ベース及び薄板がシリコンからなり、中間層が二酸化シリコンからなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、シリコンと二酸化シリコンは同じドライエッチングガス、例えばＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２に対して大きなエッチングレートの差を持つことから、薄板に貫通口および窪みを高精度に形成できるという請求項６に記載の発明の効果を補完するものである。
【００２１】
本発明の請求項８に記載の発明は、窪みの開口部が１０〜１００μｍであり、貫通口の開口部が１〜１０μｍである請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、例えば被験体細胞の大きさが１０μｍである場合に、窪みの開口部の大きさを１５μｍ、貫通口の大きさを５μｍとすれば、被験体細胞は窪み内に一つしか進入できず、かつ貫通口を通り抜けることはできないので、確実に窪みに保持される細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
本発明の請求項９に記載の発明は、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースとほぼ同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、ベースにエッチングによって前記ウエルを設ける工程と、薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって前記貫通口を設ける工程と、ウエルの底部の中間層をドライエッチングによって除去する工程と、外方側より薄膜技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、薄板に貫通口を形成する際に貫通口のウエル側に貫通口の大きさより広い窪みを１種類のマスクを用いるだけで容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２３】
本発明の請求項１０に記載の発明は、薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって貫通口を設ける工程において、外方側よりドライエッチングによって形成されるとともに、このドライエッチングは少なくともエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて行う請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスを用いると、ドライエッチングの抑制と促進の割合を制御しながらドライエッチングできるので、貫通口の穴サイズが少なくとも外方側においてマスクと同じ大きさになるように垂直にドライエッチングすることが可能になる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２４】
本発明の請求項１１に記載の発明は、貫通口を形成する際のドライエッチングにおいて、エッチングを抑制するガスを用いる工程とエッチングを促進するガスを用いる工程とを交互に繰り返して行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の穴形状がより垂直にドライエッチングできるようになるという請求項１０に記載の発明の効果を補完するものである。
【００２５】
本発明の請求項１２に記載の発明は、貫通口を設ける工程において、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるエッチングの比率がエッチングが進むに従って高くなるようにエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の形成工程が進むにつれてドライエッチングを促進するガスの割合が増えると、貫通口のウエル側のエッチング径が広がり、ウエル側に窪みが容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２６】
本発明の請求項１３に記載の発明は、貫通口を設ける工程において、ドライエッチングを促進する工程とドライエッチングを抑制する工程を繰り返して行うドライエッチングは二酸化珪素からなる中間層に達する前に止め、次にエッチングを促進するガスのみで二酸化珪素による中間層に達するまでドライエッチングを行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、中間層に達する前にドライエッチング条件を変えるので、貫通口と窪みを連続的に容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２７】
本発明の請求項１４に記載の発明は、ドライエッチングを促進するガスを用いる工程とエッチングを抑制するガスを用いる工程において、前記ガスを分解するための手段としてコイルによる誘導結合法を用い、ドライエッチングを促進する工程の際には基板に高周波をかけて行い、ドライエッチングを抑制する工程の際には基板に高周波をかけないで行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、ドライエッチングを促進する時に基板に高周波を印加するとともにエッチングを抑制する時には印加しないので均一な保護膜の形成が可能となる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２８】
本発明の請求項１５に記載の発明は、貫通口を形成する工程において、ドライエッチングを促進する工程とドライエッチングを抑制する工程を繰り返して行い、二酸化珪素を主体とする中間層にドライエッチングが達した後も過剰に薄板をドライエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、中間層に達した後も過剰にドライエッチングを行うことでエッチングイオンを中間層の表面に蓄積させることができ、このためドライエッチングは中間層付近ではエッチングが横方向に広がるようになる。そのために貫通口の形成と同時にウエル側に窪みを容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２９】
本発明の請求項１６に記載の発明は、ベースと薄板がシリコンよりなり、中間層が二酸化珪素よりなる細胞外測定デバイスの製造方法であって、下部層に貫通口を形成する際に使用するガスとして、エッチングを促進するガスがＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスであり、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８，ＣＨＦ３のうちいずれか一つを含むガスを用いる請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の外方側はマスクと同じ大きさの垂直なドライエッチング形状であり、ウエル側はこれよりも広い窪みとすることができる請求項１０〜１５に記載の発明の効果を補完するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００３１】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１及び図１〜図１３により請求項１〜３、６〜１２、１４及び１６に記載の発明について説明する。
【００３２】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの一実施の形態を示す斜視図であり、図２及び図３はその断面図である。また図４〜図５は同要部の拡大断面図である。更に図６〜図１３は細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。
【００３３】
図１〜図３において、基板１はシリコンからなるベース２、二酸化珪素からなる中間層３及びシリコンからなる薄板４の積層構造で構成されている。このベース２には被験体細胞を含むサンプル溶液を貯め、被験体細胞１０とこれの培養液１１と薬剤を混ぜ合わせるためのウエル５が設けられており、さらにウエル５の底部の薄板４には貫通口６が設けられている。この貫通口６のウエル５側に窪み７が設けられており、ウエル５側の開口部の大きさが基板１の下面の開口部より大きい形状に加工してある。
【００３４】
なお、貫通口６、窪み７の大きさは被験体細胞１０の大きさ・性質によって決めることができる。例えば被験体細胞１０の大きさが１０μｍであれば、窪み７の大きさは１０μｍ以上、２０μｍ以下とし、貫通口６の大きさは５μｍ以下とすることが好ましい。
【００３５】
また、本実施の形態１においては窪み７の内壁部はウエル５側を底面とする円錐形をしている。
【００３６】
次に、少なくともウエル５の内壁および底面、貫通口６の内壁および窪み７の内壁、薄板４の下面にはシリコンの上に二酸化シリコンによる絶縁体９が設けられており、さらに貫通口６の内壁、薄板４の外方側には上記絶縁体９の上に金を主体とする検出電極８が設けられている。
【００３７】
又、一般的に細胞の大きさは５〜２０μｍであるので窪み７の開口部は１０〜１００μｍとし、貫通口６の開口部は１〜１０μｍの範囲とすることが好ましい。
【００３８】
上記のような構成を有する細胞外電位測定デバイスは次のような動作によって細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。この動作について図面を用いて説明する。
【００３９】
図３は細胞外電位測定デバイスに被験体細胞１０と培養液１１をウエル５内に投入したときの様子を断面図で示しており、図４〜図５は貫通口６および窪み７の部分の要部拡大断面図である。
【００４０】
図３に示すように、ウエル５内に培養液１１と被験体細胞１０を入れると、しばらく被験体細胞１０は培養液１１中に浮遊している。また培養液１１は液体であるのでウエル５内だけでなく窪み７、貫通口６を満たした後、ウエル５の下面側にも流れ出す。このようにすると、浮遊している被験体細胞１０はウエル５内の圧力によつて、図４に示すように窪み７へ引き込まれる。引き込みの圧力が足りない場合には貫通口６側から吸引ポンプなどの手段により吸引すると浮遊している被験体細胞１０はより確実に窪み７側に吸引することができる。
【００４１】
次に、窪み７へ到達した被験体細胞１０は貫通口６側からの吸引あるいはウエル５側からの培養液１１によって圧力を受けていることから、図４のように窪み７に保持される。このような状態でウエル５内の培養液１１に薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液１１内に浸透し、図５に示すように被験体細胞１０が薬剤とイオンの交換による反応が発生して活性化された場合に、貫通口６内で発生した電気信号は貫通口６に満たされている培養液１１の電位を変化させることになる。この電位の変化は培養液１１に接している検出電極８によって外部に取り出される。
【００４２】
このように、本発明の細胞外電位測定デバイスではウエル５の底面に窪み７が設けてあるので、従来のように別途ウエルを設ける必要がなく、ウエル５内に被験体細胞１０と培養液１１および薬剤を直接混合させることができる。また、ウエル５と底面に設けられた窪み７および貫通口６は一体化されているので、培養液１１が不用意にウエル５外に漏れ出すこともなく確実に貫通口６側へ流れることができる。
【００４３】
さらに、窪み７の内壁、貫通口６の内壁、薄板４の下面、ウエル５の底面および内壁には二酸化シリコンからなる絶縁体９が設けられているので、検出電極８はウエル５側とは電気的に絶縁されている。さらに、窪み７の内壁はウエル５側を底面とする円錐形をしているので、被験体細胞１０が貫通口６側に滞ることなく引き込まれて安定に保持することができる。一例として被験体細胞１０の大きさが１０μｍである場合において、窪み７のウエル側の大きさ、つまり円錐形の底面の大きさは２０μｍ以下とすることにより、２つ以上の被験体細胞１０が同時に窪み７の中に進入することがなくなり、貫通口６の大きさは５μｍ以下とすることにより、被験体細胞１０が貫通口６を通り抜けることはない。
【００４４】
このように、測定の際には被験体細胞１０は窪み７に確実に保持されている状態を実現することができる。つまり、貫通口６側の培養液１１と、ウエル５側の培養液１１とは電気的に絶縁された状態にあるので、被験体細胞１０の活動により発生する電気信号はウエル５側の培養液１１に漏れることなく、貫通口６側に設けた検出電極８によって検出することができる。なお、上記絶縁層９はシリコンの表層の表面抵抗率が低いときに貫通口６付近で発生する信号が微小であり、わずかでもウエル５側にリークすると測定できなくなってしまう場合においてのみ必要となってくる。
【００４５】
従って、シリコン自体の表面抵抗率が十分高ければ被験体細胞１０が保持されるだけで十分電気的な絶縁性が実現されるので、わずかなリークが問題ない程度に細胞外電位が大きいのであれば絶縁体９は必ずしも必要ではない。
【００４６】
次に本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図６〜図１３を用いて説明する。
【００４７】
上記細胞外電位測定デバイスの製造方法は図６に示すようにシリコンからなるベース２と、二酸化シリコンからなる中間層３と、シリコンからなる薄板４で構成される基板１を用意し、薄板４側にレジストマスク１２を形成する。なお、上記のような基板１は一般にＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であるのでこの基板の製造方法については省略する。
【００４８】
次に、ドライエッチングによって貫通口６を薄板４の所定のエッチング深さに達するまで形成する。図７は図６のＡ部の要部拡大図を示している。このときのエッチング法はドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることが重要である。
【００４９】
このエッチングを促進するガスにはＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２などを用いることができるが、これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用がある。
【００５０】
そこでＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８，ＸｅＦ２などのエッチングを抑制するガスを混合させておくことで、ドライエッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜を作製することにより、図７に示すようにドライエッチングによる貫通口６の形成をレジストマスク１２の下方のみに進行させることが可能となる。
【００５１】
また、エッチング形状を垂直にする別の方法として、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。
【００５２】
実験では、大きさ５μｍの貫通口６を形成するためにＳＦ６を１３０ｓｃｃｍ流しながら１３秒間プラズマ発生させることで約１μｍのドライエッチングを行い、その後Ｃ４Ｆ８を８５ｓｃｃｍ流しながら７秒間プラズマ発生させて約０．０１μｍの保護膜を形成し、またドライエッチングを行うという作業を６回繰り返した結果、約７μｍの深さのほぼ垂直なエッチング形状とすることができた。なお、エッチングを抑制するガスによって保護膜は貫通口６の壁面だけでなく底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は壁面に形成された保護膜に比べてエッチングを促進するガスによって容易に除去することができるので、エッチングは下方のみに進むことが可能となる。
【００５３】
さらにエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法による高周波を基板１に加えることで基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５ ＋やＣＦ３ ＋が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングはより垂直な方向に進むことになる。
【００５４】
また、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。
【００５５】
さらに図８に示すように、ドライエッチングによって中間層３に達するまでドライエッチングを行うが、本工程において重要なことは薄板４側からドライエッチングを行って掘り進めていく際に、エッチングが進むにつれてエッチングを促進するガスの割合を徐々に増やしていく、あるいはエッチングを促進するガスによるエッチング時間を徐々に増やすことである。つまり、ドライエッチングが促進される工程とドライエッチングが抑制される工程が繰り返される過程において、ドライエッチングが促進される工程の割合をドライエッチングが進むにつれて徐々に増やすのである。
【００５６】
これによりエッチングの形状は図８に示すようにウエル５側が広くなるようにテーパ形状が設けられるようになり、貫通口６は薄板４の下面側の開口部よりウエル５側の開口部の方が大きくなるように形成することができる。
【００５７】
このドライエッチングの工程において、中間層３として二酸化シリコンが設けてあるので、貫通口６のドライエッチングが完了して中間層３に達したときに、ドライエッチングをすぐに止めなくても支障は発生しない。それはエッチングガスがすぐには中間層３をエッチングすることはないからである。
【００５８】
特に、エッチングを促進するガスにＳＦ６を用いた場合には、このエッチングガスはシリコンと二酸化シリコンのエッチングレートの比が１０以上であるので、貫通口６のドライエッチングが二酸化シリコンまで到達した後しばらくエッチングしても、二酸化シリコンの中間層３を簡単には除去しないので高寸法精度の窪み７を容易に形成することができる。
【００５９】
次に、図９に示すようにベース２側にフォトリソグラフィーによってレジストマスク１３を形成した後、図１０に示すようにエッチングによって中間層３に達するまでベース２をエッチングし、ウエル５を形成する。このときのエッチング方法としては前述のようなエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングがウエル５を高密度に配置するためには有利であるが、それほど高密度に配置する必要がないのであればＴＭＡＨやＫＯＨを用いたウェットエッチングでも可能である。
【００６０】
次に図１１に示すように、ウエル５の底面に露出した二酸化シリコンの中間層３をエッチングによって除去する。このときの方法はＨＦによるウェットエッチングの他、ＣＦ４ガスによるドライエッチングなどが利用できる。
【００６１】
その後、図１２に示すように、レジストマスク１３を除去した後に、熱酸化法によってベース２及び薄板４を構成しているシリコンの表面に二酸化シリコンを形成する。これによって、少なくともウエル５の内壁および底面、窪み７の内壁、貫通口６の内壁、薄板４の下面に二酸化シリコンによる絶縁層９が形成される。
【００６２】
次に、図１３に示すように、薄板４の下面側から金を蒸着やスパッタにより検出電極８を形成する。これにより、検出電極８は薄板４の下面だけではなく、貫通口６の内壁にも形成される。なお、この検出電極８の材料は培養液１１と反応しない電極材料であれば使用することができるが、特に金、白金、銀、塩化銀、アルミニウムなどを用いることがより好ましい。どの電極材料を設けるかはサンプル溶液の種類によって適当な材料が選ばれるべきである。
【００６３】
このように、本発明の製造方法を用いることにより、薄板４に形成する貫通口６が円錐形の窪み７をウエル５側に連結された状態で１枚のフォトマスクと薄板４側からの一度のエッチングだけで細胞外電位測定デバイスを容易に且つ高精度に形成することができる。
【００６４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２及び図１４〜図１６により請求項４，１３に記載の発明を説明する。図１４は本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの構成とその製造方法を説明するための断面図であり、図１５及び図１６はその要部拡大断面図である。
【００６５】
次に、実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの構成とその製造方法について説明する。実施の形態２で開示される発明は実施の形態１で開示される細胞外電位測定デバイスと基本的な構成は同じであり、同じ構成についての説明は省略し、異なる構成についてのみ説明する。
【００６６】
図１４は本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図であり、薄板１８に形成された窪み２１の形状が図１４に示すように半球形をしている点で異なっている。窪み２１をこのような半球形の形状とすることにより、被験体細胞１０はより密着して窪み２１へ保持することができることから貫通口２０の培養液１１の電位変化をより捉えやすくすることが可能となるものである。
【００６７】
次に、この細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明する。
【００６８】
本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの製造方法は実施の形態１の製造方法とほぼ同じ工程を経て作製することができるが、異なる点は薄板１８に貫通口２０及び窪み２１を形成する方法のみであり、この部分の製造方法について図面を用いて説明する。
【００６９】
この工程は図１５に示すように、中間層１７と薄板１８が積層された状態で薄板１８側にレジストマスク２４を形成した後貫通口２０を形成するためにエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるドライエッチングを行い、所定の深さに達したときにエッチングを終了する。この所定の深さとは二酸化珪素からなる中間層１７に達する前に止めることであり、窪み２１の寸法形状に応じて最適な深さを適宜選択することができる。
【００７０】
そして、このとき重要なことはエッチングの終了時にはエッチングを抑制するガスの供給を止めてエッチングを行った後に終了することである。
【００７１】
又、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜（図示せず）を少しだけ形成する工程を繰り返すドライエッチングを行うときのエッチングの終了はエッチングを促進するガスによるドライエッチングの工程で終了することが重要である。これは、エッチングを抑制するガスによって形成される保護膜をエッチングの底面から除去するためである。
【００７２】
次に、図１６に示すように窪み２１を形成するためのエッチングではＸｅＦ２ガスを導入してドライエッチングを行うものである。
【００７３】
この作業により、ドライエッチングはシリコンが露出している底面から進み、ウエル１９側に進むに従って広がるようにエッチングが進む。
【００７４】
この時、貫通口２０の側壁には前の工程でエッチングを抑制するガスによって形成された保護膜（図示せず）が形成されているためにＸｅＦ２によってドライエッチングされることはない。このようにして、窪み２１は図１６のように半球形をした形状に形成することができる。
【００７５】
その後、実施の形態１と同じように図９〜図１３の工程を経て細胞外電位測定デバイスを作製することができる。
【００７６】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３及び図１７〜図１９により請求項５，１５に記載の発明を説明する。図１７は本発明の実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図であり、図１８及び図１９はその要部拡大断面図である。
【００７７】
本実施の形態３では実施の形態１、実施の形態２で開示される貫通口６，２０と窪み７，２１を形成する別の製造方法について開示する。
【００７８】
実施の形態１及び２で説明してきた製造法と異なる点は薄板２６に貫通口３０を形成する方法のみであるので、この部分の形成方法について図面を用いて説明する。
【００７９】
図１７は二酸化珪素よりなる中間層２５とシリコンよりなる薄板２６が積層された状態で薄板２６側にレジストマスク２７を形成した後、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによる貫通口３０を形成するためにドライエッチングを行った状態を示している。この状態において、エッチングは中間層２５に達するまで過剰に行うことが特徴である。
【００８０】
そして、このドライエッチングが中間層２５に達した後もさらにエッチングを続ける。このときの中間層２５は絶縁体であり、シリコンなどからなる薄板２６はこの中間層２５より絶縁抵抗が低い。このような構成で上記のようなエッチングを過剰に続けると、中間層２５の面にはエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、図１８に示すようにエッチングイオン２８（たとえばＳＦ５ ＋）が滞留するようになり、プラズマ中から供給されるエッチングイオン２９は図１８に示す矢印の方向にはじかれるようになる。
【００８１】
その結果、このような構成においてドライエッチングを過剰に行うと中間層２５の側壁近傍に集中的にドライエッチングが行われるようになり、図１９に示すように貫通口３０のウエル側が広がった窪み３１を形成することができる。
【００８２】
実験では直径３μｍの貫通口３０のドライエッチングを中間層２５に達した後も過剰に行うことで、１０μｍの窪み３１を形成することができた。
【００８３】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、ベース内にウエルと薄板内に貫通口が設けられ、この貫通口はウエル側の開口部の方が外方側より大きい窪みを有した細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するデバイスおよびこの製造方法を実現することによって、別途ウエルを設ける必要がなく、基板の中にウエル、貫通口が一体化形成されている極めてコンパクトな細胞外電位測定デバイスとすることができる。
【００８４】
又、上記デバイスを製造する場合、２種類のマスクをウエル側からフォトリソグラフィーを行う必要がなくなるとともにウエルを設けた基板のように凸凹がある場合においても凸凹面にも均一にレジストをコーティングするスプレーコーティング装置やフォトマスクと基板が非接触で高精度なパターンが露光できるプロジェクションやステッパなど高価な装置を必要とせずに、極めて高精度な貫通口および窪みをウエル底面に設けられる製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図
【図２】（ａ）同断面図（ｂ）同要部拡大断面図
【図３】同細胞外電位測定デバイスの動作を示す断面図
【図４】同要部拡大断面図
【図５】同要部拡大断面図
【図６】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図
【図７】同要部拡大断面図
【図８】同要部拡大断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同断面図
【図１２】同断面図
【図１３】同断面図
【図１４】本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１５】同細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための要部拡大断面図
【図１６】同要部拡大断面図
【図１７】本発明の実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための要部拡大断面図
【図１８】同要部拡大断面図
【図１９】同要部拡大断面図
【図２０】従来の細胞外電位測定デバイスの模式断面図
【符号の説明】
１ 基板
２ ベース
３ 中間層
４ 薄板
５ ウエル
６ 貫通口
７ 窪み
８ 検出電極
９ 絶縁体
１０ 被験体細胞
１１ 培養液
１２ レジストマスク
１３ レジストマスク
１５ 基板
１６ ベース
１７ 中間層
１８ 薄板
１９ ウエル
２０ 貫通口
２１ 窪み
２２ 検出電極
２３ 絶縁体
２４ レジストマスク
２５ 中間層
２６ 薄板
２７ レジストマスク
２８ エッチングイオン
２９ エッチングイオン
３０ 貫通口
３１ 窪み
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（たとえば、細胞の分子生物学、第三版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法ではマイクロピペットの作成及び操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要するため大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要で測定においては色素の影響によるバックグラウンドが高い上に時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点がある。
【０００６】
これに代わる方法として、既に特願２００１−００１９８０号および特願２００１−１７０３４１号により開示される方法は、パッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものである。これらの先行技術では、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する、いわゆる細胞外電位測定デバイスについて開示されている。今少し、上記先行技術で開示される細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて説明する。
【０００７】
図２０は上記先行技術で開示される細胞外電位測定デバイスのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル４０内に培養液４８が入れられ、被験体細胞４７は基板４２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板４２に形成された窪み４１および開口部を介して、この窪み４１に連絡する貫通口４４を備えている。さらに、貫通口４４の中にはセンサー手段である測定電極４５が配置されており、この測定電極４５は配線を経て信号検出部に連結されている。
【０００８】
測定の際には、被験体細胞４７を貫通口４４側から吸引ポンプなどの手段によりこの被験体細胞４７が窪み４１部分に密着保持される。このようにして被験体細胞４７の活動により発生する電気信号はウエル４０中の培養液４８側に漏れることなく、貫通口４４側に設けた測定電極４５によって検出される。
【０００９】
ここで、窪み４１部に被験体細胞４７を保持させるためには窪み４１の上部に被験体細胞４７、培養液４８およびこれと反応する薬剤を混合させるための容器であるウエル４０が必要である。従来の例では、ウエル４０は基板４２とは別に設けられ、図２０のように窪み４１の上部にセットされていた。
【００１０】
さらに、被験体細胞４７を保持する窪み４１部の大きさは１０〜３０μｍ程度であり、貫通口４４側の大きさが１〜５μｍと２段階になっている上、貫通口４４の長さは、通常１０μｍ程度にする必要がある。この形状を正確に実現するためには、２種類のマスクを用いて、まず、第一のマスクによって窪み４１のドライエッチングを行った後、第二のマスクによって貫通口４４のドライエッチングを行う必要がある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような細胞外電位測定デバイスにおいて特に問題となるのはウエル４０と貫通口４４と窪み４１の形成された基板４２とを別々に設けると、ウエル４０と基板４２の貼り合わせが必要であるとともに正確な位置合わせも必要である。特に複数のウエル４０を基板４２内に高密度に配置する必要がある場合には、位置合わせに加えて液体が漏れ出さないように確実に貼り合わせる必要があり、その作業は困難なものとなる。
【００１２】
さらに、上述のように２種類のマスクを用いて行うと第一のマスクによるドライエッチングを行った後、第二のマスクを用いてドライエッチングを行う際にマスクのアライメントずれが生じるという課題が発生する。
【００１３】
又、２枚のマスクを用意して、それぞれ別々にフォトリソグラフィを行うので製造的にも手間がかかり、コスト高を招くことがある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の請求項１に記載の発明は、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスであり、ベース内にウエルが設けられているので、別途ウエルを設ける必要がなく、基板の中にウエル、貫通口が一体化されている極めてコンパクトな細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１５】
本発明の請求項２に記載の発明は、貫通口のウエル側に窪みを有するとともに、この窪みの開口部を貫通口の開口部より大きくした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、被験体細胞は貫通口側に引き込まれるとともに、窪み内に確実に保持することができる。
【００１６】
本発明の請求項３に記載の発明は、窪みの内壁を円錐形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、円錐形とすることにより、ウエル側から被験体細胞が容易に進入することが可能であり、かつ円錐形内には一つの被験体細胞しか進入できないので、被験体細胞の保持がより確実にできる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１７】
本発明の請求項４に記載の発明は、窪みの内壁を半球形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、一つの被験体細胞が進入可能なことに加えて、貫通口との接続面が半球形であるので、この貫通口との接続面に被験体細胞の表面がより確実に接することとなり、被験体細胞の保持を確実にすることができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１８】
本発明の請求項５に記載の発明は、中間層の電気抵抗率を薄板の電気抵抗率よりも高くした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、貫通口および窪みを薄板側からドライエッチングによって形成する際に、エッチングイオンが電気抵抗率の大きい中間層に蓄積することにより、エッチングイオンが中間層の近辺の薄板部分をもドライエッチングするようになるので貫通口のドライエッチング時に同時に窪みを形成できるという製造上の利点を有する細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１９】
本発明の請求項６に記載の発明は、中間層と薄板を構成する材料を同じエッチングガスに対するエッチングレートの比が異なる材料で構成した請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、薄板に貫通口と窪みをドライエッチングによって形成する際に、エッチングが中間層に達した後も中間層をドライエッチングしてしまわないようにできるので、より高精度な貫通口および窪みの形成を実現できるという製造上の利点を有する細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２０】
本発明の請求項７に記載の発明は、ベース及び薄板がシリコンからなり、中間層が二酸化シリコンからなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイスであり、シリコンと二酸化シリコンは同じドライエッチングガス、例えばＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２に対して大きなエッチングレートの差を持つことから、薄板に貫通口および窪みを高精度に形成できるという請求項６に記載の発明の効果を補完するものである。
【００２１】
本発明の請求項８に記載の発明は、窪みの開口部が１０〜１００μｍであり、貫通口の開口部が１〜１０μｍである請求項２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、例えば被験体細胞の大きさが１０μｍである場合に、窪みの開口部の大きさを１５μｍ、貫通口の大きさを５μｍとすれば、被験体細胞は窪み内に一つしか進入できず、かつ貫通口を通り抜けることはできないので、確実に窪みに保持される細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
本発明の請求項９に記載の発明は、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースとほぼ同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、ベースにエッチングによって前記ウエルを設ける工程と、薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって前記貫通口を設ける工程と、ウエルの底部の中間層をドライエッチングによって除去する工程と、外方側より薄膜技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、薄板に貫通口を形成する際に貫通口のウエル側に貫通口の大きさより広い窪みを１種類のマスクを用いるだけで容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２３】
本発明の請求項１０に記載の発明は、薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって貫通口を設ける工程において、外方側よりドライエッチングによって形成されるとともに、このドライエッチングは少なくともエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて行う請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスを用いると、ドライエッチングの抑制と促進の割合を制御しながらドライエッチングできるので、貫通口の穴サイズが少なくとも外方側においてマスクと同じ大きさになるように垂直にドライエッチングすることが可能になる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２４】
本発明の請求項１１に記載の発明は、貫通口を形成する際のドライエッチングにおいて、エッチングを抑制するガスを用いる工程とエッチングを促進するガスを用いる工程とを交互に繰り返して行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の穴形状がより垂直にドライエッチングできるようになるという請求項１０に記載の発明の効果を補完するものである。
【００２５】
本発明の請求項１２に記載の発明は、貫通口を設ける工程において、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるエッチングの比率がエッチングが進むに従って高くなるようにエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の形成工程が進むにつれてドライエッチングを促進するガスの割合が増えると、貫通口のウエル側のエッチング径が広がり、ウエル側に窪みが容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２６】
本発明の請求項１３に記載の発明は、貫通口を設ける工程において、ドライエッチングを促進する工程とドライエッチングを抑制する工程を繰り返して行うドライエッチングは二酸化珪素からなる中間層に達する前に止め、次にエッチングを促進するガスのみで二酸化珪素による中間層に達するまでドライエッチングを行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、中間層に達する前にドライエッチング条件を変えるので、貫通口と窪みを連続的に容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２７】
本発明の請求項１４に記載の発明は、ドライエッチングを促進するガスを用いる工程とエッチングを抑制するガスを用いる工程において、前記ガスを分解するための手段としてコイルによる誘導結合法を用い、ドライエッチングを促進する工程の際には基板に高周波をかけて行い、ドライエッチングを抑制する工程の際には基板に高周波をかけないで行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、ドライエッチングを促進する時に基板に高周波を印加するとともにエッチングを抑制する時には印加しないので均一な保護膜の形成が可能となる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２８】
本発明の請求項１５に記載の発明は、貫通口を形成する工程において、ドライエッチングを促進する工程とドライエッチングを抑制する工程を繰り返して行い、二酸化珪素を主体とする中間層にドライエッチングが達した後も過剰に薄板をドライエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、中間層に達した後も過剰にドライエッチングを行うことでエッチングイオンを中間層の表面に蓄積させることができ、このためドライエッチングは中間層付近ではエッチングが横方向に広がるようになる。そのために貫通口の形成と同時にウエル側に窪みを容易に形成できる細胞外電位測定デバイスの製造方法を実現することができる。
【００２９】
本発明の請求項１６に記載の発明は、ベースと薄板がシリコンよりなり、中間層が二酸化珪素よりなる細胞外測定デバイスの製造方法であって、下部層に貫通口を形成する際に使用するガスとして、エッチングを促進するガスがＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスであり、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８，ＣＨＦ３のうちいずれか一つを含むガスを用いる請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法であり、貫通口の外方側はマスクと同じ大きさの垂直なドライエッチング形状であり、ウエル側はこれよりも広い窪みとすることができる請求項１０〜１５に記載の発明の効果を補完するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法について実施の形態および図面を用いて説明する。
【００３１】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１及び図１〜図１３により請求項１〜３、６〜１２、１４及び１６に記載の発明について説明する。
【００３２】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの一実施の形態を示す斜視図であり、図２及び図３はその断面図である。また図４〜図５は同要部の拡大断面図である。更に図６〜図１３は細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。
【００３３】
図１〜図３において、基板１はシリコンからなるベース２、二酸化珪素からなる中間層３及びシリコンからなる薄板４の積層構造で構成されている。このベース２には被験体細胞を含むサンプル溶液を貯め、被験体細胞１０とこれの培養液１１と薬剤を混ぜ合わせるためのウエル５が設けられており、さらにウエル５の底部の薄板４には貫通口６が設けられている。この貫通口６のウエル５側に窪み７が設けられており、ウエル５側の開口部の大きさが基板１の下面の開口部より大きい形状に加工してある。
【００３４】
なお、貫通口６、窪み７の大きさは被験体細胞１０の大きさ・性質によって決めることができる。例えば被験体細胞１０の大きさが１０μｍであれば、窪み７の大きさは１０μｍ以上、２０μｍ以下とし、貫通口６の大きさは５μｍ以下とすることが好ましい。
【００３５】
また、本実施の形態１においては窪み７の内壁部はウエル５側を底面とする円錐形をしている。
【００３６】
次に、少なくともウエル５の内壁および底面、貫通口６の内壁および窪み７の内壁、薄板４の下面にはシリコンの上に二酸化シリコンによる絶縁体９が設けられており、さらに貫通口６の内壁、薄板４の外方側には上記絶縁体９の上に金を主体とする検出電極８が設けられている。
【００３７】
又、一般的に細胞の大きさは５〜２０μｍであるので窪み７の開口部は１０〜１００μｍとし、貫通口６の開口部は１〜１０μｍの範囲とすることが好ましい。
【００３８】
上記のような構成を有する細胞外電位測定デバイスは次のような動作によって細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。この動作について図面を用いて説明する。
【００３９】
図３は細胞外電位測定デバイスに被験体細胞１０と培養液１１をウエル５内に投入したときの様子を断面図で示しており、図４〜図５は貫通口６および窪み７の部分の要部拡大断面図である。
【００４０】
図３に示すように、ウエル５内に培養液１１と被験体細胞１０を入れると、しばらく被験体細胞１０は培養液１１中に浮遊している。また培養液１１は液体であるのでウエル５内だけでなく窪み７、貫通口６を満たした後、ウエル５の下面側にも流れ出す。このようにすると、浮遊している被験体細胞１０はウエル５内の圧力によつて、図４に示すように窪み７へ引き込まれる。引き込みの圧力が足りない場合には貫通口６側から吸引ポンプなどの手段により吸引すると浮遊している被験体細胞１０はより確実に窪み７側に吸引することができる。
【００４１】
次に、窪み７へ到達した被験体細胞１０は貫通口６側からの吸引あるいはウエル５側からの培養液１１によって圧力を受けていることから、図４のように窪み７に保持される。このような状態でウエル５内の培養液１１に薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液１１内に浸透し、図５に示すように被験体細胞１０が薬剤とイオンの交換による反応が発生して活性化された場合に、貫通口６内で発生した電気信号は貫通口６に満たされている培養液１１の電位を変化させることになる。この電位の変化は培養液１１に接している検出電極８によって外部に取り出される。
【００４２】
このように、本発明の細胞外電位測定デバイスではウエル５の底面に窪み７が設けてあるので、従来のように別途ウエルを設ける必要がなく、ウエル５内に被験体細胞１０と培養液１１および薬剤を直接混合させることができる。また、ウエル５と底面に設けられた窪み７および貫通口６は一体化されているので、培養液１１が不用意にウエル５外に漏れ出すこともなく確実に貫通口６側へ流れることができる。
【００４３】
さらに、窪み７の内壁、貫通口６の内壁、薄板４の下面、ウエル５の底面および内壁には二酸化シリコンからなる絶縁体９が設けられているので、検出電極８はウエル５側とは電気的に絶縁されている。さらに、窪み７の内壁はウエル５側を底面とする円錐形をしているので、被験体細胞１０が貫通口６側に滞ることなく引き込まれて安定に保持することができる。一例として被験体細胞１０の大きさが１０μｍである場合において、窪み７のウエル側の大きさ、つまり円錐形の底面の大きさは２０μｍ以下とすることにより、２つ以上の被験体細胞１０が同時に窪み７の中に進入することがなくなり、貫通口６の大きさは５μｍ以下とすることにより、被験体細胞１０が貫通口６を通り抜けることはない。
【００４４】
このように、測定の際には被験体細胞１０は窪み７に確実に保持されている状態を実現することができる。つまり、貫通口６側の培養液１１と、ウエル５側の培養液１１とは電気的に絶縁された状態にあるので、被験体細胞１０の活動により発生する電気信号はウエル５側の培養液１１に漏れることなく、貫通口６側に設けた検出電極８によって検出することができる。なお、上記絶縁層９はシリコンの表層の表面抵抗率が低いときに貫通口６付近で発生する信号が微小であり、わずかでもウエル５側にリークすると測定できなくなってしまう場合においてのみ必要となってくる。
【００４５】
従って、シリコン自体の表面抵抗率が十分高ければ被験体細胞１０が保持されるだけで十分電気的な絶縁性が実現されるので、わずかなリークが問題ない程度に細胞外電位が大きいのであれば絶縁体９は必ずしも必要ではない。
【００４６】
次に本発明の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図６〜図１３を用いて説明する。
【００４７】
上記細胞外電位測定デバイスの製造方法は図６に示すようにシリコンからなるベース２と、二酸化シリコンからなる中間層３と、シリコンからなる薄板４で構成される基板１を用意し、薄板４側にレジストマスク１２を形成する。なお、上記のような基板１は一般にＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であるのでこの基板の製造方法については省略する。
【００４８】
次に、ドライエッチングによって貫通口６を薄板４の所定のエッチング深さに達するまで形成する。図７は図６のＡ部の要部拡大図を示している。このときのエッチング法はドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることが重要である。
【００４９】
このエッチングを促進するガスにはＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２などを用いることができるが、これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用がある。
【００５０】
そこでＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８，ＸｅＦ２などのエッチングを抑制するガスを混合させておくことで、ドライエッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜を作製することにより、図７に示すようにドライエッチングによる貫通口６の形成をレジストマスク１２の下方のみに進行させることが可能となる。
【００５１】
また、エッチング形状を垂直にする別の方法として、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。
【００５２】
実験では、大きさ５μｍの貫通口６を形成するためにＳＦ６を１３０ｓｃｃｍ流しながら１３秒間プラズマ発生させることで約１μｍのドライエッチングを行い、その後Ｃ４Ｆ８を８５ｓｃｃｍ流しながら７秒間プラズマ発生させて約０．０１μｍの保護膜を形成し、またドライエッチングを行うという作業を６回繰り返した結果、約７μｍの深さのほぼ垂直なエッチング形状とすることができた。なお、エッチングを抑制するガスによって保護膜は貫通口６の壁面だけでなく底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は壁面に形成された保護膜に比べてエッチングを促進するガスによって容易に除去することができるので、エッチングは下方のみに進むことが可能となる。
【００５３】
さらにエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法による高周波を基板１に加えることで基板１にマイナスのバイアス電圧が発生することにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５ ＋やＣＦ３ ＋が基板１に向かって衝突するのでドライエッチングはより垂直な方向に進むことになる。
【００５４】
また、ドライエッチングを抑制させる際には基板１に高周波を加えなければ基板１にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。
【００５５】
さらに図８に示すように、ドライエッチングによって中間層３に達するまでドライエッチングを行うが、本工程において重要なことは薄板４側からドライエッチングを行って掘り進めていく際に、エッチングが進むにつれてエッチングを促進するガスの割合を徐々に増やしていく、あるいはエッチングを促進するガスによるエッチング時間を徐々に増やすことである。つまり、ドライエッチングが促進される工程とドライエッチングが抑制される工程が繰り返される過程において、ドライエッチングが促進される工程の割合をドライエッチングが進むにつれて徐々に増やすのである。
【００５６】
これによりエッチングの形状は図８に示すようにウエル５側が広くなるようにテーパ形状が設けられるようになり、貫通口６は薄板４の下面側の開口部よりウエル５側の開口部の方が大きくなるように形成することができる。
【００５７】
このドライエッチングの工程において、中間層３として二酸化シリコンが設けてあるので、貫通口６のドライエッチングが完了して中間層３に達したときに、ドライエッチングをすぐに止めなくても支障は発生しない。それはエッチングガスがすぐには中間層３をエッチングすることはないからである。
【００５８】
特に、エッチングを促進するガスにＳＦ６を用いた場合には、このエッチングガスはシリコンと二酸化シリコンのエッチングレートの比が１０以上であるので、貫通口６のドライエッチングが二酸化シリコンまで到達した後しばらくエッチングしても、二酸化シリコンの中間層３を簡単には除去しないので高寸法精度の窪み７を容易に形成することができる。
【００５９】
次に、図９に示すようにベース２側にフォトリソグラフィーによってレジストマスク１３を形成した後、図１０に示すようにエッチングによって中間層３に達するまでベース２をエッチングし、ウエル５を形成する。このときのエッチング方法としては前述のようなエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングがウエル５を高密度に配置するためには有利であるが、それほど高密度に配置する必要がないのであればＴＭＡＨやＫＯＨを用いたウェットエッチングでも可能である。
【００６０】
次に図１１に示すように、ウエル５の底面に露出した二酸化シリコンの中間層３をエッチングによって除去する。このときの方法はＨＦによるウェットエッチングの他、ＣＦ４ガスによるドライエッチングなどが利用できる。
【００６１】
その後、図１２に示すように、レジストマスク１３を除去した後に、熱酸化法によってベース２及び薄板４を構成しているシリコンの表面に二酸化シリコンを形成する。これによって、少なくともウエル５の内壁および底面、窪み７の内壁、貫通口６の内壁、薄板４の下面に二酸化シリコンによる絶縁層９が形成される。
【００６２】
次に、図１３に示すように、薄板４の下面側から金を蒸着やスパッタにより検出電極８を形成する。これにより、検出電極８は薄板４の下面だけではなく、貫通口６の内壁にも形成される。なお、この検出電極８の材料は培養液１１と反応しない電極材料であれば使用することができるが、特に金、白金、銀、塩化銀、アルミニウムなどを用いることがより好ましい。どの電極材料を設けるかはサンプル溶液の種類によって適当な材料が選ばれるべきである。
【００６３】
このように、本発明の製造方法を用いることにより、薄板４に形成する貫通口６が円錐形の窪み７をウエル５側に連結された状態で１枚のフォトマスクと薄板４側からの一度のエッチングだけで細胞外電位測定デバイスを容易に且つ高精度に形成することができる。
【００６４】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２及び図１４〜図１６により請求項４，１３に記載の発明を説明する。図１４は本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの構成とその製造方法を説明するための断面図であり、図１５及び図１６はその要部拡大断面図である。
【００６５】
次に、実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの構成とその製造方法について説明する。実施の形態２で開示される発明は実施の形態１で開示される細胞外電位測定デバイスと基本的な構成は同じであり、同じ構成についての説明は省略し、異なる構成についてのみ説明する。
【００６６】
図１４は本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図であり、薄板１８に形成された窪み２１の形状が図１４に示すように半球形をしている点で異なっている。窪み２１をこのような半球形の形状とすることにより、被験体細胞１０はより密着して窪み２１へ保持することができることから貫通口２０の培養液１１の電位変化をより捉えやすくすることが可能となるものである。
【００６７】
次に、この細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明する。
【００６８】
本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの製造方法は実施の形態１の製造方法とほぼ同じ工程を経て作製することができるが、異なる点は薄板１８に貫通口２０及び窪み２１を形成する方法のみであり、この部分の製造方法について図面を用いて説明する。
【００６９】
この工程は図１５に示すように、中間層１７と薄板１８が積層された状態で薄板１８側にレジストマスク２４を形成した後貫通口２０を形成するためにエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるドライエッチングを行い、所定の深さに達したときにエッチングを終了する。この所定の深さとは二酸化珪素からなる中間層１７に達する前に止めることであり、窪み２１の寸法形状に応じて最適な深さを適宜選択することができる。
【００７０】
そして、このとき重要なことはエッチングの終了時にはエッチングを抑制するガスの供給を止めてエッチングを行った後に終了することである。
【００７１】
又、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜（図示せず）を少しだけ形成する工程を繰り返すドライエッチングを行うときのエッチングの終了はエッチングを促進するガスによるドライエッチングの工程で終了することが重要である。これは、エッチングを抑制するガスによって形成される保護膜をエッチングの底面から除去するためである。
【００７２】
次に、図１６に示すように窪み２１を形成するためのエッチングではＸｅＦ２ガスを導入してドライエッチングを行うものである。
【００７３】
この作業により、ドライエッチングはシリコンが露出している底面から進み、ウエル１９側に進むに従って広がるようにエッチングが進む。
【００７４】
この時、貫通口２０の側壁には前の工程でエッチングを抑制するガスによって形成された保護膜（図示せず）が形成されているためにＸｅＦ２によってドライエッチングされることはない。このようにして、窪み２１は図１６のように半球形をした形状に形成することができる。
【００７５】
その後、実施の形態１と同じように図９〜図１３の工程を経て細胞外電位測定デバイスを作製することができる。
【００７６】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３及び図１７〜図１９により請求項５，１５に記載の発明を説明する。図１７は本発明の実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図であり、図１８及び図１９はその要部拡大断面図である。
【００７７】
本実施の形態３では実施の形態１、実施の形態２で開示される貫通口６，２０と窪み７，２１を形成する別の製造方法について開示する。
【００７８】
実施の形態１及び２で説明してきた製造法と異なる点は薄板２６に貫通口３０を形成する方法のみであるので、この部分の形成方法について図面を用いて説明する。
【００７９】
図１７は二酸化珪素よりなる中間層２５とシリコンよりなる薄板２６が積層された状態で薄板２６側にレジストマスク２７を形成した後、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによる貫通口３０を形成するためにドライエッチングを行った状態を示している。この状態において、エッチングは中間層２５に達するまで過剰に行うことが特徴である。
【００８０】
そして、このドライエッチングが中間層２５に達した後もさらにエッチングを続ける。このときの中間層２５は絶縁体であり、シリコンなどからなる薄板２６はこの中間層２５より絶縁抵抗が低い。このような構成で上記のようなエッチングを過剰に続けると、中間層２５の面にはエッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、図１８に示すようにエッチングイオン２８（たとえばＳＦ５ ＋）が滞留するようになり、プラズマ中から供給されるエッチングイオン２９は図１８に示す矢印の方向にはじかれるようになる。
【００８１】
その結果、このような構成においてドライエッチングを過剰に行うと中間層２５の側壁近傍に集中的にドライエッチングが行われるようになり、図１９に示すように貫通口３０のウエル側が広がった窪み３１を形成することができる。
【００８２】
実験では直径３μｍの貫通口３０のドライエッチングを中間層２５に達した後も過剰に行うことで、１０μｍの窪み３１を形成することができた。
【００８３】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、ベース内にウエルと薄板内に貫通口が設けられ、この貫通口はウエル側の開口部の方が外方側より大きい窪みを有した細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定するデバイスおよびこの製造方法を実現することによって、別途ウエルを設ける必要がなく、基板の中にウエル、貫通口が一体化形成されている極めてコンパクトな細胞外電位測定デバイスとすることができる。
【００８４】
又、上記デバイスを製造する場合、２種類のマスクをウエル側からフォトリソグラフィーを行う必要がなくなるとともにウエルを設けた基板のように凸凹がある場合においても凸凹面にも均一にレジストをコーティングするスプレーコーティング装置やフォトマスクと基板が非接触で高精度なパターンが露光できるプロジェクションやステッパなど高価な装置を必要とせずに、極めて高精度な貫通口および窪みをウエル底面に設けられる製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの斜視図
【図２】（ａ）同断面図（ｂ）同要部拡大断面図
【図３】同細胞外電位測定デバイスの動作を示す断面図
【図４】同要部拡大断面図
【図５】同要部拡大断面図
【図６】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための断面図
【図７】同要部拡大断面図
【図８】同要部拡大断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同断面図
【図１２】同断面図
【図１３】同断面図
【図１４】本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの断面図
【図１５】同細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための要部拡大断面図
【図１６】同要部拡大断面図
【図１７】本発明の実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明するための要部拡大断面図
【図１８】同要部拡大断面図
【図１９】同要部拡大断面図
【図２０】従来の細胞外電位測定デバイスの模式断面図
【符号の説明】
１ 基板
２ ベース
３ 中間層
４ 薄板
５ ウエル
６ 貫通口
７ 窪み
８ 検出電極
９ 絶縁体
１０ 被験体細胞
１１ 培養液
１２ レジストマスク
１３ レジストマスク
１５ 基板
１６ ベース
１７ 中間層
１８ 薄板
１９ ウエル
２０ 貫通口
２１ 窪み
２２ 検出電極
２３ 絶縁体
２４ レジストマスク
２５ 中間層
２６ 薄板
２７ レジストマスク
２８ エッチングイオン
２９ エッチングイオン
３０ 貫通口
３１ 窪み
Claims (16)
- 基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイス。
- 貫通口のウエル側に窪みを有するとともに、この窪みの開口部を貫通口の開口部より大きくした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 窪みの内壁を円錐形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 窪みの内壁を半球形とした請求項２に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 中間層の電気抵抗率を薄板の電気抵抗率よりも高くした請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 中間層と薄板を構成する材料を同じエッチングガスに対するエッチングレートの比が異なる材料で構成した請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
- ベース及び薄板がシリコンからなり、中間層が二酸化シリコンからなる請求項１に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 窪みの開口部が１０〜１００μｍであり、貫通口の開口部が１〜１０μｍである請求項２に記載の細胞外電位測定デバイス。
- 基板がベースとこのベースとは異なる材料による中間層とベースと同じ材料による薄板の積層構造からなり、前記ベース内に被験体細胞及び培養液及び薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルと、前記薄板内に前記ウエルと基板の外方に通じる少なくとも一つ以上の貫通口が設けられた細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する細胞外電位測定デバイスの製造方法であって、ベースにエッチングによって前記ウエルを設ける工程と、薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって前記貫通口を設ける工程と、ウエルの底部の中間層をドライエッチングによって除去する工程と、外方側より薄膜技術により検出電極を形成する工程を含む細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- 薄板に１種類のマスクを用いたドライエッチングによって貫通口を設ける工程において、外方側よりドライエッチングによって形成されるとともに、このドライエッチングは少なくともエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの２種類を用いて行う請求項９に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- 貫通口を形成する際のドライエッチングにおいて、エッチングを抑制するガスを用いる工程とエッチングを促進するガスを用いる工程とを交互に繰り返して行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- 貫通口を設ける工程において、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるドライエッチングの比率がエッチングが進むに従って高くなるようにエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- 貫通口を設ける工程において、エッチングを促進する工程とエッチングを抑制する工程を繰り返して行うドライエッチングは二酸化珪素からなる中間層に達する前に止め、次にエッチングを促進するガスのみで二酸化珪素による中間層に達するまでドライエッチングを行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- エッチングを促進するガスを用いる工程とエッチングを抑制するガスを用いる工程において、前記ガスを分解するための手段としてコイルによる誘導結合法を用い、ドライエッチングを促進する工程の際には基板に高周波をかけて行い、ドライエッチングを抑制する工程の際には基板に高周波をかけないで行う請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- 貫通口を形成する工程において、ドライエッチングを促進する工程とドライエッチングを抑制する工程を繰り返して行い、二酸化珪素を主体とする中間層にドライエッチングが達した後も過剰に薄板をドライエッチングする請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
- ベースと薄板がシリコンよりなり、中間層が二酸化珪素よりなる細胞外測定デバイスの製造方法であって、下部層に貫通口を形成する際に使用するガスとして、エッチングを促進するガスがＳＦ６，ＣＦ４，ＸｅＦ２のうちいずれか一つを含むガスであり、エッチングを抑制するガスがＣ４Ｆ８，ＣＨＦ３のいずれかまたはこれらを含むガスを用いる請求項１０に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。
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