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JP2010539940A - 核酸検出の二重オリゴヌクレオチド法 - Google Patents

核酸検出の二重オリゴヌクレオチド法 Download PDF

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Abstract

核酸を増幅及び検出するための方法、並びに５’標識されたオリゴヌクレオチドのセットについて記載する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／９７６，２６０号の利益を請求するものであり、この仮出願は参考として本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本書類は、核酸を検出するための方法及び材料に関する。より具体的には、本書類は、互いに相補的な配列、及び標的核酸の異なる部分に相補的な配列を含有する２本の５’標識されたオリゴヌクレオチドを用いて核酸を検出するための方法に関する。
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）機構は、分子ビーコン及びタックマン（Taqman）アッセイを含む、核酸を検出するための種々のアッセイに組み込まれている。エプスタイン（Epstein）ら（２００２年）、アナリティカ・ケミカ・アクタ（Analytica Chimica Acta）、４６９巻：３〜３６頁を参照。分子ビーコンでは、ヘアピン構造を形成できる一本鎖プローブが用いられる。プローブは二重に標識されており、一端はフルオロフォア、もう一端はクエンチャーを含有する。プローブがヘアピン形状になったとき、蛍光が消光される。その標的にハイブリダイズしたとき、蛍光が観察される。タックマンアッセイは、二重に標識されたプローブを分解するＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性に依存し、これは蛍光標識されたヌクレオチドをクエンチャーから物理的に分離し、蛍光を増加させるものである。
二重に標識されたプローブ又は２つを超えるオリゴヌクレオチドを必要としない核酸の検出方法に対する要求が存在する。
５’相補的配列及び３’標的特異的配列を含有する、２本の５’標識されたオリゴヌクレオチドを用いる、核酸を増幅及び検出する簡易な方法を開示する。オリゴヌクレオチドがその標的にアニーリングしたとき、蛍光が観察される。対照的に、オリゴヌクレオチドが互いにアニーリングしたとき、蛍光が消光される。本明細書に記載する方法は、従来のリアルタイム増幅技術に比べて低いバックグラウンドを有し、種々のサンプルからの核酸を検出するために用いることができる。
１つの態様では、本発明は、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドのセットを特徴とする。オリゴヌクレオチドのセットは、第１及び第２オリゴヌクレオチドを含む。第１オリゴヌクレオチドは、５’及び３’ヌクレオチド配列を含み、５’ヌクレオチド配列は、第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、３’配列は標的核酸の第１部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一であり、蛍光部分が第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で（例えば、５’末端ヌクレオチドに）結合する。第２オリゴヌクレオチドは、５’及び３’ヌクレオチド配列を含み、５’ヌクレオチド配列は、第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、３’ヌクレオチド配列は標的核酸の第２部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一であり、アクセプター部分が第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で（例えば、５’末端ヌクレオチドに）結合する。第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は、第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一である。各オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、第１オリゴヌクレオチドに結合する蛍光部分と又は第２オリゴヌクレオチドに結合するアクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない。第１及び第２オリゴヌクレオチドは、２５〜５０ヌクレオチドの長さの配列であってもよい。
第１及び第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は、第１又は第２オリゴヌクレオチドのいずれかの３’ヌクレオチド配列が標的核酸にアニーリングするのに必要な温度より低い温度で互いにアニーリングする。例えば、第１及び第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は、第１又は第２オリゴヌクレオチドの両方の３’ヌクレオチド配列が標的核酸にアニーリングするのに必要な温度より低い温度で互いにアニーリングすることができる。
アクセプター分子はクエンチャー（例えば、アイオワブラック（IOWA BLACK））であってもよい。オリゴヌクレオチドは、４２℃〜５０℃で互いにアニーリングすることができ、蛍光部分の蛍光はこのアニーリング温度で消光され得る。蛍光は、消光の非存在下における蛍光部分の蛍光に対して少なくとも５０％消光され得る。蛍光部分の最大発光スペクトルは、４２０〜６２０ｎｍ（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ローダミングリーン、オレゴングリーン、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）又はインドジカルボシアニン３（Ｃｙ３））であってもよい。
オリゴヌクレオチドのセットは更に、異なる標的核酸を検出するための第３及び第４オリゴヌクレオチドを含んでもよい。第３オリゴヌクレオチドは、５’及び３’ヌクレオチド配列を含んでもよく、５’ヌクレオチド配列は、第３オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、３’配列は異なる標的核酸の第１部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一であり、蛍光分子が第３オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で（例えば、５’末端ヌクレオチドに）結合する。第４オリゴヌクレオチドは、５’及び３’ヌクレオチド配列を含んでもよく、５’ヌクレオチド配列は、第４オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、３’ヌクレオチド配列は異なる標的核酸の第２部分と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一であり、アクセプター分子が第４オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で（例えば、５’末端ヌクレオチドに）結合する。第３オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は、第４オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％又は９９％）同一である。第３及び第４オリゴヌクレオチドのそれぞれの３’ヌクレオチド配列は、第１若しくは第３オリゴヌクレオチドに結合する蛍光部分と又は第２若しくは第４オリゴヌクレオチドに結合するアクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない。
本発明はまた、生体サンプル中の標的核酸の存在又は非存在を検出するための方法を特徴とする。方法は、（ａ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、生体サンプルをオリゴヌクレオチドのセットに接触させて、蛍光標識されたアンプリコンを生成することと、（ｂ）アンプリコンの蛍光を検出することと、を含む。オリゴヌクレオチドのセットは、本明細書に記載のような２つのオリゴヌクレオチドを含む。接触及び検出工程は、リアルタイムＰＣＲ条件下で行うことができる。検出工程は、蛍光の量を定量化することを含んでもよい。アンプリコンは、３０〜５００（例えば、５０〜１５０）ヌクレオチドの長さであってもよい。
別の態様では、本発明は、生体サンプル中の少なくとも２つの標的核酸の存在又は非存在を検出するための方法を特徴とする。方法は、（ａ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、生体サンプルをオリゴヌクレオチドのセットに接触させて、２つの蛍光標識されたアンプリコンを生成することと、（ｂ）アンプリコンの蛍光を検出することと、を含む。オリゴヌクレオチドのセットは、本明細書に記載のような４つのオリゴヌクレオチドを含む。
更に別の態様では、本発明は核酸を検出するためのキットを特徴とする。キットは、本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドのセットを含む。キットは更に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ又はデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含んでもよい。
本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応を蛍光に基づいて監視するための反応混合物を特徴とする。反応混合物は、本明細書に記載のようなオリゴヌクレオチドのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＭｇＣｌ２を含む。反応混合物は、蛍光で標識されたアンプリコンを更に含んでもよい。アンプリコンのセンス鎖の５’ヌクレオチド配列は、アンプリコンのアンチセンス鎖の５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有し、５’ヌクレオチド配列はアンプリコンの各鎖の５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、アンプリコンの一方の鎖の５’ヌクレオチド配列は蛍光部分で標識され、アンプリコンのもう一方の鎖の５’ヌクレオチド配列は適合性アクセプター部分で標識される。アンプリコンは、３０〜５００ヌクレオチドの長さであってもよい。
特に定義しない限り、本明細書で用いる技術的及び科学的用語は、本発明の関連する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を用いて本発明を実施することができ、好適な方法及び材料は以下に記載するものである。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献はその全容に亘って援用するものである。記載が矛盾する場合には、用語の定義を含め本明細書が優先するものとする。更に前記の材料、方法、及び実施例は説明を目的としたものであって、発明の限定を目的としたものではない。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付図及び以下の説明で明らかにする。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに請求項から明らかになる。
１対の５’標識されたプライマーを用いる増幅手順の概略。 １対の５’標識されたプライマーを用いる増幅手順の概略。 １対の５’標識されたプライマーを用いる増幅手順の概略。
一般に、２つのオリゴヌクレオチドのセットを用いて核酸を増幅及び検出するための材料及び方法を開示し、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は互いに相補的であり、３’ヌクレオチド配列は標的特異的配列の異なる部分に相補的である。各ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド配列（例えば、その５’末端（端）で）が標識され；一方のオリゴヌクレオチドは蛍光ドナー部分で標識され、他方のヌクレオチドは適合性アクセプター部分で標識される。以下に記載するように、オリゴヌクレオチドのこのような対は、二重標識又は追加のオリゴヌクレオチドプライマー若しくはプローブを必要とすることなく、リアルタイムで核酸を増幅及び検出するためのプライマーとして用いることができる。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマー又はその類似体を指す。核酸類似体は、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格を修飾して、例えば核酸の安定性、ハイブリダイゼーション又は溶解度を改善することができる。塩基部分の修飾としては、デオキシチミジンをデオキシウリジンに、並びにデオキシシチジンを５−メチル−２’−デオキシシチジン及び５−ブロモ−２’−デオキシシチジンに置換することが挙げられる。天然の塩基に代わって置換されてもよい核酸塩基の他の例としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル並びに他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン並びにグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル並びにシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。他の有用な核酸塩基としては、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているものが挙げられる。
糖部分の修飾としては、２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｏ−アリル糖を形成するための、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を挙げることができる。デオキシリボースホスフェート骨格を修飾してモルホリノ核酸を生成することができ、各塩基部分は６員モルホリノ環又はペプチド核酸に連結し、デオキシホスフェート骨格はシュードペプチド骨格（例えば、アミノエチルグリシン骨格）に置換され、４つの塩基は保持される。例えば、サマートン（Summerton）及びウェラー（Weller）（１９９７年）、アンチセンス・ニュークリーイク・アシッド・ドラッグ・ディブロップメント（Antisense Nucleic Acid Drug Dev.）７巻、１８７〜１９５頁；並びにヒラップ（Hyrup）ら（１９９６年）、バイオオーガニック＆メディシナル・ケミストリー（Bioorgan.Med.Chem.）４巻、５〜２３頁を参照。更に、デオキシホスフェート骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルホスホトリエステル骨格に置換してもよい。例えば、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドの調製方法については、米国特許第４，４６９，８６３号、同第５，２３５，０３３号、同第５，７５０，６６６号及び同第５，５９６，０８６号を参照。
本発明のオリゴヌクレオチドは、１５〜５０（例えば、１５〜３０、２５〜５０、３０〜４５、３３〜４０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３５、３７、３８、３９又は４０）ヌクレオチドの長さであってもよく、互いに相補的な５’ヌクレオチド配列を有してもよい。典型的には、５’ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドの５’端で始まる５〜２３ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイゼーションが生じるためには、オリゴヌクレオチドの配列が、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことは、当該技術分野において理解されている。むしろ、ハイブリダイゼーションは、あるオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列が、他のオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列の相補体に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するときに生じ得る。５’ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）サイクルのアニーリング温度における蛍光の水準に基づいて検出することができ、すなわち、２つのオリゴヌクレオチドがアニーリング温度下で互いにハイブリダイズするとき、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じ、蛍光が消光される。ハイブリダイゼーションが生じない場合、蛍光が発生する。
核酸配列の同一性の百分率は、以下のように決定することができる。まず、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４及びＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョンからＢＬＡＳＴ ２シークエンス（Ｂｌ２ｓｅｑ）を用いて、核酸配列を標的核酸配列と比較する。このスタンドアロンバージョンのＢＬＡＳＴＺは、フィッシュ＆リチャードソン（Fish & Richardson）のウェブサイト（www@fr.com/blast）、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイト（www@ncbi.nlm.nih.gov）、又はニューヨーク州立大学（State University of New York）のオールドウェストベリー図書館（Old Westbury Library）（ＱＨ ４９７．ｍ６７１４）から入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法を説明する指示書は、ＢＬＡＳＴＺに添付されているｒｅａｄｍｅファイルに見出すことができる。
Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮのアルゴリズムを用いて２つの配列間の比較を行う。２つの核酸配列を比較するために、以下のようなオプションが設定される：−ｉは、比較すべき第１の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較すべき第２の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｎに設定され；−ｏは任意の所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは−１に設定され；−ｒは２に設定され；全ての他のオプションはそのデフォルト設定用に残される。例えば、以下のコマンドを用いて、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを作成できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐ ｂｌａｓｔｎ−ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ −ｑ −１ −ｒ ２。第１の核酸配列が第２の核酸配列のいずれかの部分と相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは位置合わせされた配列として相同性領域を提示する。第１の核酸配列が第２の核酸配列のいずれの部分とも相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは位置合わせされた配列を提示しない。
いったん位置合わせすると、第２の核酸配列の配列と位置合わせされた状態で提示される第１の核酸配列から連続するヌクレオチドの数を数えることにより、長さが決定される。一致した位置は、標的と哺乳類の配列の両方に同一のヌクレオチドが存在する任意の位置である。ギャップはヌクレオチド又はアミノ酸残基ではないため、第１配列に存在するギャップは数えない。同様に第２配列に存在するギャップも数えない。
決定した長さに対する同一性の百分率は、その長さ全体の一致した位置の数を数え、その数を長さで除し、続いて得られた値に１００を乗じることにより決定される。例えば、（１）３００アミノ酸の標的配列を参照配列と比較する、（２）Ｂｌ２ｓｅｑプログラムが、参照配列のある領域と位置合わせした標的配列から２００個の連続するアミノ酸を提示する、及び（３）それら２００個の位置合わせしたアミノ酸全体で一致の数が１８０である場合、３００アミノ酸の標的配列は２００の長さを有するアミノ酸セグメントを含有し、その長さに対する同一性の百分率は９０である（すなわち、（１８０÷２００）×１００＝９０）。
配列同一性の百分率の値は小数第２位で四捨五入されることに留意すべきである。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３及び７５．１４は、７５．１に切り捨てされ、一方７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８及び７５．１９は７５．２に切り上げされる。長さの値は常に整数であることにも留意すべきである。
本発明のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの対を同じＰＣＲ反応で用いるとき、標的核酸の特定の領域を増幅することができるように（すなわち、複数のコピーが生成されるように複製される）、標的核酸の異なる部分に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。あるオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は増幅されるべき標的核酸の特定の領域のセンス鎖に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、一方で他方のオリゴヌクレオチドは標的核酸の特定の領域のアンチセンス鎖に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。典型的には、３’ヌクレオチド配列は、５〜４５ヌクレオチドの長さである。
ある実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、腸球菌のｖａｎＡ遺伝子のような、バンコマイシン耐性遺伝子の一部を含んでもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドのうちの１つの３’ヌクレオチド配列は、表１に示すような、配列番号１又は配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、第１オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含んでもよく、第２オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含んでもよい。
Figure 2010539940
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡ核酸標的にハイブリダイズすることができ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ２０６２８５（本明細書では配列番号３と呼ぶ）のヌクレオチド５９０〜６１１に対応し、それは腸球菌のｖａｎＡ部分遺伝子配列を記載したものである。配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、ｖａｎＡ核酸標的にハイブリダイズすることができ、配列番号３のヌクレオチド６６７〜６８９の逆相補体に対応する。
配列番号１に記載のような３’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載のような３’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号１に記載のような３’ヌクレオチド配列を含み、第２オリゴヌクレオチドが配列番号２に記載のような３’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。配列番号１に記載のような３’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載のような３’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号１に記載のような３’ヌクレオチド配列から本質的になり、第２オリゴヌクレオチドが配列番号２に記載のような３’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。
Figure 2010539940
配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号３にハイブリダイズすることができる。配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号３にハイブリダイズすることができる。
配列番号４に記載のようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号５に記載のようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号４に記載のようなヌクレオチド配列を含み、第２オリゴヌクレオチドが配列番号５に記載のようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。配列番号４に記載のようなヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号５に記載のようなヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号４に記載のようなヌクレオチド配列から本質的になり、第２オリゴヌクレオチドが配列番号５に記載のようなヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。
Figure 2010539940
オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列（例えば、配列番号４、５、６又は７に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つを含む又はそれから本質的になるオリゴヌクレオチド）は、５’ヌクレオチド配列が互いにアニーリングする温度が、３’ヌクレオチド配列とその標的との間のアニーリング温度より低いように設計される。例えば、５’ヌクレオチド配列のアニーリング温度は、３’ヌクレオチド配列がその標的にアニーリングする温度より５〜２０℃（例えば、６〜１８℃、７〜１７℃、８〜１４℃又は９〜１１℃）低くてもよい。これにより、オリゴヌクレオチドが互いにアニーリングする（すなわち、プライマーダイマーとして）前に、各オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列がその標的にアニーリングすることが可能になる。図１Ａ〜１Ｃを参照。５’ヌクレオチド配列が互いにアニーリングする温度と、３’ヌクレオチド配列がその標的配列にアニーリングする温度との差を大きくすることにより、オリゴヌクレオチドが互いにアニーリングしてプライマーダイマーを形成できる最終アニーリング温度に達する前に、オリゴヌクレオチドがその標的にアニーリングする方に反応を偏らせることができる。アニーリング温度は、経験的に、又はオリゴヌクレオチドの計算融解温度（Ｔｍ）から５〜１０℃減じることにより決定することができる。オリゴヌクレオチドのＴｍ値は、配列の長さ、配列のグアニン＋シトシン含量、並びに存在するカチオンの種類及び濃度、特にナトリウムイオン（Ｎａ＋）に依存し、サンタルシア（SantaLucia）（米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）（１９９８年）９５巻、１４６０〜５頁）の方法により算出することができる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列は、配列番号６又は配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含んでもよい。
Figure 2010539940
配列番号６に記載のような５’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号７に記載のような５’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号６に記載のような５’ヌクレオチド配列を含み、第２オリゴヌクレオチドが配列番号７に記載のような５’ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。配列番号６に記載のような５’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号７に記載のような５’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチド、又は第１オリゴヌクレオチドが配列番号６に記載のような５’ヌクレオチド配列から本質的になり、第２オリゴヌクレオチドが配列番号７に記載のような５’ヌクレオチド配列から本質的になるオリゴヌクレオチドの混合物を、本開示による標的核酸を検出する方法で用いることができる。
各オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列（例えば、配列番号４、５、６又は７に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つを含む又はそれから本質的になるオリゴヌクレオチド）は、蛍光ドナー部分又はアクセプター部分で標識される。各オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、セット中のいずれかのオリゴヌクレオチドに結合する蛍光部分又はアクセプター部分に適合する蛍光ドナー部分又はアクセプター部分では標識されない。多くの実施形態では、５’ヌクレオチド配列は、５’端が標識される、すなわち５’末端ヌクレオチドが標識される。例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’７’−ジメトキシ−４，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレセインのフッ素化類似体（例えば、オレゴングリーン３）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ；Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）を含む、フルオレセイン又はローダミン染料のようなキサンテン染料を含む非常に様々な蛍光ドナーが文献中で知られている。好適な蛍光ドナーはまた、アルファ又はベータ位にアミノ基を有するナフチルアミン染料を含む。ナフチルアミノ化合物の非限定的な例としては、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられる。他の蛍光ドナーとしては、３−フェニル−７−イソシアナトクマリンのようなクマリン；９−イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；インドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン５（Ｃｙ５）、インドジカルボシアニン５．５（Ｃｙ５．５）、３−（−カルボキシ−ペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣｙＡ）のようなシアニン；ｌＨ，５Ｈ，１ １Ｈ，１ ５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−１８−イウム、９−［２（又は４）−［［［６−［２，５−ジオキソ−ｌ−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］スルホニル］−４（又は２）−スルホフェニル］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−内塩（ＴＲ又はテキサスレッド）；ＢＯＤＩＰＹＴＭ染料；ベンゾオキサジアゾール；スチルベン；ピレン；等が挙げられる。
５’アクセプター部分は、５’ドナー蛍光部分に適合しなければならない。本明細書で使用するとき、「適合性アクセプター」は、その吸光スペクトルがドナーの発光スペクトルと重なる分子である。アクセプター部分はクエンチャー、すなわち、ドナー部分の蛍光発光強度を減少させる非蛍光分子、又はドナーから非放射的にエネルギーを受容し、アクセプターに特徴的な発光スペクトルでエネルギーを再放射する蛍光分子であってもよい。エプステイン（Epstein）ら（２００２年）、アナリティカ・ケミカ・アクタ（Analytica Chimica Acta）、４６９：３〜３６頁を参照。
アクセプター部分の非限定的な例としては、ＴＡＭＲＡ、ダブシル（Dabcyl）（４−（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン−４−カルボン酸）、ＢＨＱ（登録商標）−１（５００〜５５０ｎｍの波長範囲で最大限に光を吸収する）、ＢＨＱ（登録商標）−２、ＢＨＱ（登録商標）−３（６５０〜７００ｎｍの波長範囲で最大限に光を吸収する）のようなブラック・ホール・クエンチャー（Black Hole Quencher）（登録商標）、アイオワブラック（Iowa Black）３ＦＱ（４２０〜７００ｎｍ（例えば４２０〜６２０ｎｍ）で最大限に光を吸収する）、ＬＣ（商標）−レッド６４０、ＬＣ（商標）−レッド７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（５００〜７０５ｎｍで最大限に光を吸収する）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオン（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）の他のキレートが挙げられる。例えば、６−ＦＡＭ、ローダミングリーン（Rhodamine Green）、オレゴングリーン（Oregon Green）、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、又はＣｙ３を、蛍光ドナーとして用いてもよく、アイオワブラック３ＦＱをアクセプターとして用いてもよい。例えば、ダーククエンチャーの合成及びダーククエンチャーのオリゴヌクレオチドへの連結法については、米国特許出願公開第２００６０２６３８１６号を参照。ドナー及びアクセプター部分は、例えば、モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）（ジャンクションシティー（Junction City）、オレゴン州）、インテグレートＤＮＡテクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies, Inc.）（コーラルビル（Coralville）、アイオワ州）、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス（St.Louis）、ミズーリ州）から入手することができる。
５’標識されたオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズするとき、蛍光ドナー及び適合するアクセプター部分は、ＦＲＥＴが生じ得るようにごく近接していなければならない。ＦＲＥＴテクノロジー（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、及び同第６，１６２，６０３号）は、ドナー及び適合性アクセプター部分が互いにフォースター（Forster）距離内に位置するとき、２つの部分の間で、可視化できる又は他の方法で検出及び／若しくは定量化できるエネルギー転移が起こるという概念に基づいている。フォースター（Forster）距離は、適合性ＦＲＥＴ対間の共鳴エネルギー転移が５０％に低下する距離を指し、典型的には１０〜１００Åである。したがって、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズするとき、各オリゴヌクレオチドの５’ドナー及び５’アクセプター部分は、最大２３（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３）ヌクレオチド離れていてもよい。好ましくは、５’標識は、互いの１〜２０ヌクレオチド（例えば、３〜２０、４〜１９、６〜１８、８〜１５、又は１１〜１４）内に存在する。アクセプター部分がクエンチャーであるとき、２つのオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズするとき、蛍光発光強度の減少が観察される。消光の非存在下における蛍光分子の蛍光に比べて、ドナーの蛍光が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％低下することが特に有用である。アクセプター部分が別の蛍光部分であるとき、アクセプターに特徴的な発光スペクトルで蛍光が観察されるが、ドナー蛍光は減少する。
オリゴヌクレオチドの合成法は既知である。典型的には、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティ（Foster City）、カリフォルニア州）から入手可能なもののような、自動ＤＮＡ合成機が用いられる。いったんオリゴヌクレオチドが合成され、任意の保護基が取り除かれると、オリゴヌクレオチドを精製することができ（例えば、抽出及びゲル精製又はイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により）、オリゴヌクレオチドの濃度を決定することができる（例えば、分光光度計で２６０ｎｍの光学密度を測定することにより）。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成中にドナー若しくはアクセプター部分で標識することができる、又はドナー若しくはアクセプター部分を合成後に結合させることができる。リンカー分子を用いて、当該技術分野において既知である技術を用い、ドナー若しくはアクセプター部分をオリゴヌクレオチドに結合させることができる。例えば、ハンドブック−蛍光プローブ及び分子プローブからの標識技術の手引き（The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies from Molecular Probes）（probes.invitrogen.com/handbook）を参照。フルオレセインのようなドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドにカップリングさせるために用いられることの多いリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えば、フルオレセイン−ＣＰＧ（グレン・リサーチ（Glen Research）又はケムジーン（ChemGene）（アッシュランド（Ashland）、マサチューセッツ州））、アミドリンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル由来、フルオレセイン−ＣＰＧ（バイオ・ジェネックス（BioGenex）（サンラモン（San Ramon）、カリフォルニア州）のような）、又はオリゴヌクレオチド合成後フルオレセイン−ＮＨＳ−エステルのカップリングを必要とする３’−アミノ−ＣＰＧが挙げられる。
核酸の検出法
本明細書に開示する方法は、任意の微生物、植物又は動物（例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、カニクイザルのような非ヒト霊長類、又はヒトのような哺乳類）を含む、任意の生物の核酸を検出するために用いることができる。よって、この方法を用いて、生体サンプル（例えば、食品、又はヒト由来の血液若しくは組織サンプル）中の感染性病原体（例えば、ヒトの疾患を引き起こす微生物）の存在を診断することができる。
特に関心のある微生物としては、原核生物及び真核生物、特にグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、酵母、ウイルス、及び脂質エンベロープウイルスが挙げられる。典型的には、グラム陽性又はグラム陰性細菌は、細胞壁タンパク質をコードしている核酸のような、細菌に特徴的な細胞壁成分の存在を検出することにより同定できる。特に関連性のある生物としては、腸内細菌科若しくは球菌科、又はブドウ球菌属の種、連鎖球菌種、シュードモナス種、腸球菌種、サルモネラ菌種、レジオネラ菌種、赤痢菌種、エルニシア種、エンテロバクター種、エシェリキア種、バチルス種、リステリア種、ビブリオ種、コリネバクテリア種、並びにヘルペスウイルス、アスペルギルス種、フサリウム種、及びカンジダ種のメンバーが挙げられる。特に強い病原性を持つ菌としては、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の耐性菌株を含む）、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、化膿連鎖球菌、エンテロコッカス・フィカリス、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン中間体耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、炭疽菌、緑膿菌、大腸菌、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フミガツ、アスペルギルス・クラバタス、フザリウム・ソラニ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・クラミドスポラム、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ・コレラエスイス、チフス菌、ネズミチフス菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、エンテロバクター・サカザキ、大腸菌Ｏ１５７、及び複数の薬物耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）が挙げられる。典型的には、抗生物質耐性菌は、抗生物質耐性に関与する、膜タンパク質、輸送タンパク質、酵素等のような細胞内成分をコードしている核酸の存在により検出できる。
生体サンプル中の標的核酸の存在又は非存在は、標的核酸がサンプル中に存在する場合、生体サンプルを上記オリゴヌクレオチド対と接触させて、蛍光で標識されたアンプリコンを生成することにより、検出できる。本明細書で使用するとき、「アンプリコン」は、典型的には３０〜５００ヌクレオチドの長さ（例えば、３０〜３００、３０〜２００、３０〜１５０、又は５０〜１５０ヌクレオチドの長さ）である、二本鎖増幅産物を指す。蛍光で標識されたアンプリコン内では、センス鎖の５’ヌクレオチド配列は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。用語「センス鎖」及び「アンチセンス鎖」は、二本鎖核酸分子の各鎖を指定するために本明細書で用いられ、核酸のコード領域には限定されない。５’ヌクレオチド配列は、アンプリコンの各鎖の５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さである。更に、一方の鎖の５’ヌクレオチド配列は蛍光部分で標識され、他方の鎖の５’ヌクレオチド配列は適合性アクセプター部分で標識される。１つの実施形態では、各鎖の５’末端ヌクレオチドが標識される。例えば、図１Ｃを参照。
接触工程は、存在する場合、標的核酸を増幅させて、蛍光で標識されたアンプリコンを生成できるような、ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）条件下で行う。典型的には、リアルタイムＰＣＲ条件下で生成されるアンプリコンは、３０〜２００（例えば、３０〜１５０、又は５０〜１５０）ヌクレオチドの範囲の長さである。本明細書に記載の方法では、核酸分子の増幅は、テンプレート核酸を変性することと、プライマーの５’ヌクレオチド配列の融解温度より低い最終アニーリング温度に達するまで徐々に温度を下げることにより、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸に及び互いにアニーリングすることと、プライマーから酵素的に伸長させて蛍光で標識されたアンプリコンを産生することと、を含む。上述のように、オリゴヌクレオチドプライマーの３’ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの５’ヌクレオチド配列が互いにアニーリングする温度より高い温度で、その標的とアニーリングする。プライマーダイマーの形成は、消光が生じたときのバックグラウンド蛍光の一因となることはなく、プライマーダイマーはポリメラーゼにより延長することはできない。よって、プライマーダイマーの形成は、反応に干渉しない。
増幅は、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、プラチナ（Platinum）（登録商標）Ｔａｑ）、並びにポリメラーゼ酵素の活性を最適化するための適切な緩衝液及び／又は補助因子の存在を必要とする。ＰＣＲ条件は、典型的には、反応緩衝液中の塩濃度（例えば、ＭｇＣｌ２及びＫＣｌ）、並びに融解、アニーリング、及び伸長に利用される温度により定義される。オリゴヌクレオチドプライマー、標的核酸、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼの、具体的な濃度又は量もまた、設定され得る。例えば、１．５〜２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液、並びにそれぞれ９４〜９５℃、３５〜６５℃（例えば、４２〜５０℃）、及び６０〜７２℃の、融解、アニーリング、及び伸長温度を用いるＰＣＲ条件が、特に有用であり得る。いくつかの実施形態では、適切な濃度の緩衝液、塩、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを含有する市販の混合物（例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）製のジーンアンプ（GeneAmp）（登録商標）ファストＰＣＲマスターミックス（Fast PCR Master Mix）（２Ｘ））を用いることができる。変性、アニーリング及び伸長は、それぞれ、例えば、１サイクルあたり１５〜４５秒（例えば、３０秒）で、合計２５〜５０サイクル（例えば、４５サイクル）実行してもよい。初期変性工程（例えば、９４〜９５℃で１〜２分間）及び／又は最終伸長工程（例えば、６０〜７２℃で１〜１０分間）もまた有用であり得る。例えば、変性を９５℃で１分間行い、続いて９５℃で１５秒間変性、４５℃で３０秒間アニーリング、及び６０℃で３０秒間伸長を、４５サイクル実行してもよい。温度は、必要に応じて、変性、アニーリング、及び伸長工程の間に、１秒あたり５〜３０℃（例えば、２０℃）低下又は上昇させることができる。
単一のＰＣＲ反応混合物は、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含有してもよい。１セットのプライマーは、１対の、すなわち２つのオリゴヌクレオチドである。あるいは、単一の反応混合物は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有してもよく、この場合複数のアンプリコンが産生され得る。各セットのプライマーは、例えば、コード領域若しくはその一部（例えば、完全長コード配列、１つのエクソン、又はエクソンの一部）、又は非コード領域若しくはその一部（例えば、プロモータ若しくはイントロン、又はその一部）を増幅することができる。２つ以上のセットのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる実施形態では、各セットのオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列は、２つ以上の標的核酸（例えば、１つ以上の微生物の群を検出するために）、又は同じ標的核酸の２つ以上の領域（例えば、遺伝的変異を有する微生物に対する試験の包括性（inclusivity）を最大化するために）からアンプリコンが生成されるように設計してもよい。プライマー対の５’ヌクレオチド配列は、同じ又は異なるヌクレオチド配列を有してもよい。
アンプリコンの蛍光は検出することができ、いくつかの実施形態では、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロックミラー及び特定の範囲で蛍光発光を監視するためのフィルタを含む）、光子計数光電子増倍管システム又は蛍光光度計を用いて定量化することができる。エネルギー転移を開始させるための励起は、アルゴンイオンレーザー、高輝度水銀（Ｈｇ）アーク灯、光ファイバー光源、又は所望の範囲で励起するために適切に濾光された他の高輝度光源を用いて実行してもよい。蛍光検出は、最終アニーリング温度に達し、オリゴヌクレオチドが互いにアニーリングした後に実施してもよい。ＦＲＥＴが検出可能であるサイクル数（すなわち、Ｃｔ値）は、生体サンプル中の標的核酸の量と相関し得る。
より典型的には、複数の接触及び検出工程は、ライトサイクラー（LIGHTCYCLER）（ロシュ（Roche））（ユタ大学研究財団（University of Utah Research Foundation）、国際公開第９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、及び同第９７／４６７１２号）、Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステム（ストラタジーン（Stratagene）（ラホーヤ（La Jolla）、カリフォルニア州））、又はバイオラッド（Bio-Rad）から入手可能な増幅装置のようなサーモサイクラー装置内で行う。本発明はマイクロ流体装置と接続して実施することが好ましい場合がある。「マイクロ流体」は、５００μｍ未満、典型的には０．１μｍ〜５００μｍである、例えば深さ、幅、長さ、直径等の少なくとも１つの内部断面寸法を有する、１つ以上の流体通路、チャンバ、又は導管を有する装置を指す。典型的には、マイクロ流体装置は、複数のチャンバ（例えば、増幅反応チャンバ、装填チャンバ等）を含み、各チャンバは収容するサンプルの体積を画定する。潜在的に好適なマイクロ流体装置のいくつかの例は、米国特許第６，６２７，１５９号（ベディンガム（Bedingham）ら）、同第６，７２０，１８７号（ベディンガムら）、同第６，７３４，４０１号（ベディンガムら）、同第６，８１４，９３５号（ハームス（Harms）ら）、同第６，９８７，２５３号（ベディンガムら）、同第７，０２６，１６８号（ベディンガムら）、同第７，１６４，１０７号（ベディンガムら）、及び同第７，１９２，５６０号（パルタサラティ（Parthasarathy）ら）に記載されている。本発明は、アンプリコンの増幅及び検出に用いられる装置に限定されないことが理解される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、混入を避けるための工程を含んでもよい。例えば、あるサーモサイクラーの実行と次の実行との間の混入を低減する又はなくすために、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法が、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載されている。更に、本発明の方法を実施するとき、標準的な研究所封じ込めの実践及び手順が望ましい。封じ込めの実践及び手順としては、方法の異なる工程の作業領域を分離すること、封じ込めフード、バリアフィルターピペットチップ、及び専用排気ピペットが挙げられるが、これらに限定されない。臨床サンプルを取り扱う診断研究所では、正確を期すために、作業者による一貫した封じ込めの実施及び手順が実施される。
対照サンプルもまた、ＰＣＲの各ラウンド（例えば、各サーモサイクラーの実行）内でサイクルを繰り返してもよい。陽性対照サンプルは、例えば、対照オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸対照テンプレートを増幅することができる（例えば、プラスミドから）。このようなプラスミド対照は、内部で（例えば生体サンプル内で）、又は試験サンプルと同時に実行される別のサンプル内で増幅することができる。各サーモサイクラーの実行は、例えば、標的核酸を欠く陰性対照を含んでもよい。このような対照は、増幅及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。それ故、対照反応は、例えば、プライマーの配列特異的にアニーリングする能力、伸長を開始させる能力、及びＦＲＥＴを生じさせる能力を容易に決定することができる。
製造物品
本発明のオリゴヌクレオチドは、梱包材料と組み合わせて、生体サンプルの核酸を検出するためのキットとして販売することができる。例えば、キットは、特定の微生物（例えば、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡを含む）、表皮ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア（S. agalactiae）、化膿性連鎖球菌、糞便連鎖球菌、ＶＲＥ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、炭疽菌、緑膿菌、大腸菌、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・フミガタス（A. fumigatus）、アスペルギルス・クラバタス（A. clavatus）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）、フザリウム・クラミドスポラム（F. chlamydosporum）、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）、コレラ菌、腸炎ビブリオ、豚コレラ菌、チフス菌、ネズミチフス菌、鵞口瘡カンジダ、カンジダ・グラブラータ（C. glabrata）、カンジダ・クルセイ（C. krusei）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）、大腸菌Ｏ１５７及びＭＤＲを検出するためのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。製品を製造する構成要素及び方法は周知である。製品は、本明細書に記載のような２つ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせてもよい。更に、製品は、複数の核酸産物が産生され得るように、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの追加セット（例えば、３、４、５又は６つのプライマー対）を含んでもよい。
本発明の製品はまた、オリゴヌクレオチドを標識するための１つ以上のドナー蛍光部分又はアクセプター部分を含んでもよく、あるいはキットに同梱されているオリゴヌクレオチドを標識してもよい。例えば、製品は、オリゴヌクレオチドのうちの１つを標識するためのドナー蛍光部分、及び他方のオリゴヌクレオチドを標識するための適合性クエンチャー部分を含んでもよい。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分、及び適合性アクセプター部分の例は、上記で提供したものである。
製品はまた、本明細書に開示した方法を実行するための試薬を含んでもよい（例えば、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰ、補助因子、対照核酸、混入を防ぐための剤、又はＰＣＲ反応を実施するための他の有用な試薬）。このような試薬は、本明細書に記載する市販の機器の１つに特異的であってもよい。核酸を検出するためにどのようにオリゴヌクレオチドを用い得るかを説明する指示書もまた、このようなキットに含まれてもよい。
いくつかの実施形態では、製品は、ＰＣＲを蛍光に基づいて監視するための反応混合物を含んでもよい。反応混合物は、本明細書で論じているようなオリゴヌクレオチドのセット及びＰＣＲ反応を実施するための試薬を含んでもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＭｇＣｌ２、又はＫＣｌが、反応混合物に含まれてもよい。このような製品は、更に、核酸を検出するためにどのように反応混合物を用い得るかを説明する指示書を含んでもよい。
本発明を以下の実施例で更に説明するが、これらは請求項に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
この実施例では、１対の５’標識されたプライマーを用いて、バンコマイシン耐性腸球菌（ＡＴＣＣ ７００２２１、マナッサス（Manassas）、バージニア州）（ＶＲＥ）のｖａｎＡ遺伝子を増幅及び検出した。腸球菌を血液寒天培地上に画線し、３７℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、新鮮成長（fresh growth）サンプルをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で、０．５のマックファーランド（McFarland）標準（およそ１×１０８ＣＦＵ／ｍＬと同等である）まで希釈することにより、細胞懸濁液を調製した。腸球菌のＤＮＡを、製造業者の指示書に従って、ＭａｇＮＡピュアＬＣ ＤＮＡ単離キットＩＩＩ（MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III）（細菌、真菌）キット（機器及び試薬はロシュ（Roche）（インディアナポリス（Indianapolis）、インディアナ州）から入手した）を用いて１００ＴＬの細胞懸濁液から抽出し、単離した。
以下のプライマーは、インテグレートＤＮＡテクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies）（コーラルビル（Coralville）、アイオワ州）により合成された。ｖａｎＡのフォワードプライマー配列、５’ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧ ３’（配列番号４）の５’位を６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）（インテグレートＤＮＡテクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies）（コーラルビル（Coralville）、アイオワ州））により標識した。ｖａｎＡのリバースプライマー配列、５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡ ３’（配列番号５）の５’位をアイオワブラック（Iowa Black）３ＦＱ（インテグレートＤＮＡテクノロジーズ社（Integrated DNA Technologies）（コーラルビル（Coralville）、アイオワ州））により標識した。
精製した腸球菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ増幅に付し、これは変化するプローブ濃度を有する３．５μＬの各サンプルを用いて２度繰り返して実施した。具体的には、ＰＣＲ増幅は、３．５μＬのサンプル及び６．５μＬの以下の混合物：２μＭ及び４μＭ（それぞれ０．５μＬ）の変化する初期濃度の２つのプライマー、及びジーンアンプ（GeneAmp）（登録商標）ファストＰＣＲマスターミックス（Fast PCR Master Mix）（５．５μＬの２ｘ、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティ（Foster City）、カリフォルニア州））を含有する合計１０μＬの体積で実施した。増幅は、以下のプロトコール：９５℃で６０秒間初期変性、続いて９５℃で１５秒間（２０℃／秒の勾配）、４５℃で３０秒間（２０℃／秒の勾配、単一獲得（single acquisition））、及び６０℃で３０秒間（２０℃／秒の勾配）を４５ＰＣＲサイクル、を用いてストラタジーン（Stratagene）Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステム（ストラタジーン（Stratagene））で実施した。結果を、ストラタジーンＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステムとともに提供されたソフトウェアを用いて解析した。表５に示すように、この実施例で提示した条件下では、プローブがうまくｖａｎＡ遺伝子を増幅した。表５中のＣｔ値は、蛍光の増加が指数関数的であり、閾値を超えるサイクル数を指す。
Figure 2010539940
これらの結果は、ｖａｎＡ遺伝子がうまく増幅され、配列番号４及び配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有する５’標識プライマーを用いて検出されたことを示す。２．２％アガロース・フラッシュ・ゲル（ロンザ（Lonza）、バーゼル（Basel）、スイス）上で各反応の反応産物を分析したところ、テンプレート対照無を除いて各サンプルの産物が示された。
他の実施形態
本発明について、その詳細な説明とともに述べてきたが、上記の説明は、例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されよう。他の態様、利点、及び修正形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (39)

  1. 標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、該オリゴヌクレオチドのセットが、
    ａ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第１オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第１オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第２オリゴヌクレオチドと、を含み、
    前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、オリゴヌクレオチドのセット。
  2. 前記第１及び第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１又は第２オリゴヌクレオチドのいずれかの３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸にアニーリングするのに必要な温度より低い温度でアニーリングする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  3. 前記第１及び第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１又は第２オリゴヌクレオチドの両方の前記３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸にアニーリングするのに必要な温度より低い温度でアニーリングする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  4. 前記アクセプター分子がクエンチャーである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  5. 前記オリゴヌクレオチドが４２℃〜５０℃でアニーリングし、前記蛍光部分の蛍光が前記アニーリング温度で消光される、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  6. 蛍光が、消光の非存在下における前記蛍光部分の前記蛍光に比べて少なくとも５０％消光される、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  7. 前記クエンチャー部分がアイオワブラックである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  8. 前記蛍光部分の最大発光スペクトルが４２０〜６２０ｎｍである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  9. 前記蛍光部分が、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ローダミングリーン、オレゴングリーン、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）又はインドジカルボシアニン３（Ｃｙ３）である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  10. 前記第１及び第２オリゴヌクレオチドが２５〜５０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  11. 前記第１又は第２ヌクレオチド配列の前記３’端が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  12. 前記第１又は第２ヌクレオチド配列の前記３’端が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  13. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記３’配列が配列番号１に記載のヌクレオチド配列に記載されているオリゴヌクレオチドを含み、前記第２オリゴヌクレオチドの前記３’配列が配列番号２に記載のヌクレオチド配列に記載されているオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  14. 前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  15. 前記セットが、異なる標的核酸を検出するための第３及び第４オリゴヌクレオチドを更に含み、前記第３オリゴヌクレオチドが５’及び３’ヌクレオチド配列を含み、前記５’ヌクレオチド配列が前記第３オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記異なる標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、前記蛍光分子が前記第３オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列内で結合し、
    前記第４オリゴヌクレオチドが、５’及び３’ヌクレオチド配列を含み、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第４オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記異なる標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター分子が前記第４オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列内で結合し、前記第３オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第４オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記第３及び第４オリゴヌクレオチドの前記３’ヌクレオチド配列が、前記第１若しくは第３オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２若しくは第４オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  16. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の前記相補体と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  17. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の前記相補体と少なくとも９９％同一である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  18. 前記蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに結合する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  19. 前記アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに結合する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  20. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号６又は配列番号７を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  21. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号６を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号７を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  22. 前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号４又は配列番号５から本質的になる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  23. 前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号４から本質的になり、前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号５から本質的になる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  24. 生体サンプル中の標的核酸の存在又は非存在を検出するための方法であって、該方法が、
    （ａ）前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、蛍光で標識されたアンプリコンを生成するために前記生体サンプルをオリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドのセットが、
    ｉ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第１オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第１オリゴヌクレオチドと、
    ｉｉ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第２オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、オリゴヌクレオチドのセットである、接触させる工程と、
    （ｂ）前記アンプリコンの蛍光を検出する工程と、を含む方法。
  25. 前記接触及び検出工程をリアルタイムＰＣＲ条件下で行う、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記検出工程が、蛍光の量を定量化することを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記アンプリコンが３０〜５００ヌクレオチドの長さである、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記アンプリコンが５０〜１５０ヌクレオチドの長さである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号６又は配列番号７を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号６を含み、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が配列番号７を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号４又は配列番号５から本質的になる、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号４から本質的になり、前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号５から本質的になる、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  33. 生体サンプル中の少なくとも２つの標的核酸の存在又は非存在を検出するための方法であって、該方法が、
    （ａ）前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、２つの蛍光で標識されたアンプリコンを生成するために前記生体サンプルをオリゴヌクレオチドのセットと接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドのセットが、
    ｉ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第１オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記第１標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第１オリゴヌクレオチドと、
    ｉｉ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記第１標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列内で結合し、前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一である、第２オリゴヌクレオチドと、
    ｉｉｉ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第３オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第３オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記第２標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光分子が前記第３オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第３オリゴヌクレオチドと、
    ｉｖ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第４オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第４オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記第２標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター分子が前記第４オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列内で結合する、第４オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第３オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第４オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列が、前記第１若しくは第３オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２若しくは第４オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、オリゴヌクレオチドのセットである、接触させる工程と、
    （ｂ）前記アンプリコンの蛍光を検出する工程と、を含む方法。
  34. オリゴヌクレオチドのセットを含む、核酸を検出するためのキットであって、前記オリゴヌクレオチドのセットが、
    ａ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第１オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第１オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第２オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、オリゴヌクレオチドのセットである、キット。
  35. 前記キットが、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ又はデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を更に含む、請求項３４に記載のキット。
  36. ポリメラーゼ連鎖反応を蛍光に基づいて監視するための反応混合物であって、前記反応混合物が、オリゴヌクレオチドのセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＭｇＣｌ２を含み、前記オリゴヌクレオチドのセットが、
    ａ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第１オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’配列が前記標的核酸の第１部分と少なくとも８０％同一であり、蛍光部分が前記第１オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第１オリゴヌクレオチドと、
    ｂ）５’及び３’ヌクレオチド配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記３’ヌクレオチド配列が前記標的核酸の第２部分と少なくとも８０％同一であり、アクセプター部分が前記第２オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチド配列内で結合する、第２オリゴヌクレオチドと、を含み、前記第１オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列が、前記第２オリゴヌクレオチドの前記５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％同一であり、各前記オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチド配列が、前記第１オリゴヌクレオチドに結合する前記蛍光部分と又は前記第２オリゴヌクレオチドに結合する前記アクセプター部分と適合する、蛍光部分又はアクセプター部分では標識されない、オリゴヌクレオチドのセットである、反応混合物。
  37. 蛍光で標識されたアンプリコンを更に含む、請求項３６に記載の反応混合物。
  38. 前記アンプリコンのセンス鎖の５’ヌクレオチド配列は、前記アンプリコンのアンチセンス鎖の５’ヌクレオチド配列の相補体と少なくとも８０％の同一性を有し、前記５’ヌクレオチド配列は前記アンプリコンの各鎖の５’端で始まる、５〜２３ヌクレオチドの長さの配列であり、前記アンプリコンの一方の鎖の前記５’ヌクレオチド配列は蛍光部分で標識され、前記アンプリコンのもう一方の鎖の前記５’ヌクレオチド配列は適合性アクセプター部分で標識される、蛍光で標識されたアンプリコン。
  39. 前記アンプリコンが３０〜５００ヌクレオチドの長さである、請求項３８に記載の蛍光で標識されたアンプリコン。
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