JP3016759B2 - 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 - Google Patents
競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移Info
- Publication number
- JP3016759B2 JP3016759B2 JP10045690A JP4569098A JP3016759B2 JP 3016759 B2 JP3016759 B2 JP 3016759B2 JP 10045690 A JP10045690 A JP 10045690A JP 4569098 A JP4569098 A JP 4569098A JP 3016759 B2 JP3016759 B2 JP 3016759B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- fluorophore
- quencher
- nucleic acid
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 title description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 15
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-benzoxadiazole Chemical class C1=CC=C2ON=NC2=C1 SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGGCPIFVRJFAKF-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 BGGCPIFVRJFAKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTRBOZNMGVDGHY-UHFFFAOYSA-N 6-(4-methylanilino)naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1NC1=CC=C(C=C(C=C2)S(O)(=O)=O)C2=C1 VTRBOZNMGVDGHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150034533 ATIC gene Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 150000005002 naphthylamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical group [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 150000001629 stilbenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001018 xanthene dye Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一方のプローブ上
に発蛍光団（fluorophore）を有し、他方のプローブ上
に消光剤（quencher）を有する、等しくない長さの相補
的プローブに関する。発蛍光団および消光剤は、発蛍光
団への消光剤の近接により発蛍光団の蛍光が消されるよ
うに並置される。これらのプローブは配列相補性を有す
るヌクレオチドの検出に有用である。その検出能力は、
等しくない長さのプローブの使用により起こる競争的ハ
イブリダイゼーション、およびその後この競争的ハイブ
リダイゼーションにより引き起こされる消光の抑制によ
るものである。
に発蛍光団（fluorophore）を有し、他方のプローブ上
に消光剤（quencher）を有する、等しくない長さの相補
的プローブに関する。発蛍光団および消光剤は、発蛍光
団への消光剤の近接により発蛍光団の蛍光が消されるよ
うに並置される。これらのプローブは配列相補性を有す
るヌクレオチドの検出に有用である。その検出能力は、
等しくない長さのプローブの使用により起こる競争的ハ
イブリダイゼーション、およびその後この競争的ハイブ
リダイゼーションにより引き起こされる消光の抑制によ
るものである。
【０００２】
【従来の技術】核酸増幅法は、非常に少量のヌクレオチ
ドを高濃度としていくつかの手段により検出されうるよ
うにするための方法の１つとなっている。いくつかの増
幅方法が使用できる。もっとも広く行われている方法
は、ポリメラーゼ連鎖反応（あるいは現在一般的にＰＣ
Ｒと呼ばれている）である。増幅法によって検出または
回収および使用できる標的ヌクレオチド配列数が増加す
るが、増幅生成物の検出には高感度の方法が必要であ
る。また、増幅法は、増幅プロセスのリアルタイムモニ
タリングの恩恵を受ける。リアルタイムモニタリングに
より反応性のない増幅を検出でき、あるいはプロセスの
無効率を検出できる。増幅反応を妨害せずにかかるモニ
タリングを行うことができる場合には、リアルタイムモ
ニタリングを用いた負荷オリゴヌクレオチドの定量も可
能である。
ドを高濃度としていくつかの手段により検出されうるよ
うにするための方法の１つとなっている。いくつかの増
幅方法が使用できる。もっとも広く行われている方法
は、ポリメラーゼ連鎖反応（あるいは現在一般的にＰＣ
Ｒと呼ばれている）である。増幅法によって検出または
回収および使用できる標的ヌクレオチド配列数が増加す
るが、増幅生成物の検出には高感度の方法が必要であ
る。また、増幅法は、増幅プロセスのリアルタイムモニ
タリングの恩恵を受ける。リアルタイムモニタリングに
より反応性のない増幅を検出でき、あるいはプロセスの
無効率を検出できる。増幅反応を妨害せずにかかるモニ
タリングを行うことができる場合には、リアルタイムモ
ニタリングを用いた負荷オリゴヌクレオチドの定量も可
能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明手順は、互いに配列相補性を有する発
蛍光団標識プローブおよび消光剤標識プローブの間の蛍
光エネルギー転移に基づいている。使用プローブは等し
くない長さであり、そのことは一方のプローブがその相
補的プローブにアニーリングする以上に標的核酸配列に
アニーリングすることを促進する。プローブ配列に相補
的または同一の配列を有する核酸（標的配列）の不存在
下では、２つのプローブは互いにアニーリングするであ
ろう。２つのプローブが互いにアニーリングする場合、
発蛍光団への消光剤の近接により発蛍光団の蛍光の消光
が起こる。プローブ配列に相補的または同一の配列を有
する核酸の存在下では、発蛍光団標識プローブのいくつ
かは相補的配列を有する核酸にハイブリダイゼーション
し、消光剤から離され、増大した（消光されない）蛍光
を生じるであろう。標的配列を有する核酸の存在の特異
的検出にこの蛍光の相違を用いることができる。
めの手段】本発明手順は、互いに配列相補性を有する発
蛍光団標識プローブおよび消光剤標識プローブの間の蛍
光エネルギー転移に基づいている。使用プローブは等し
くない長さであり、そのことは一方のプローブがその相
補的プローブにアニーリングする以上に標的核酸配列に
アニーリングすることを促進する。プローブ配列に相補
的または同一の配列を有する核酸（標的配列）の不存在
下では、２つのプローブは互いにアニーリングするであ
ろう。２つのプローブが互いにアニーリングする場合、
発蛍光団への消光剤の近接により発蛍光団の蛍光の消光
が起こる。プローブ配列に相補的または同一の配列を有
する核酸の存在下では、発蛍光団標識プローブのいくつ
かは相補的配列を有する核酸にハイブリダイゼーション
し、消光剤から離され、増大した（消光されない）蛍光
を生じるであろう。標的配列を有する核酸の存在の特異
的検出にこの蛍光の相違を用いることができる。
【０００４】第１の態様において、本発明は、標的ポリ
ヌクレオチドについて核酸増幅を行うこと（第１のオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび長さが少なくとも約２塩
基対短いことにより長さの異なる第２のオリゴヌクレオ
チドプローブを用いる何れかの方法を用いて増幅を行
い、第１のプローブは発蛍光団を有し、第２のプローブ
は第１のプローブに相補的で、該発蛍光団の蛍光を消す
ことのできる消光剤分子を有するものであり、発蛍光団
および消光剤は、プローブがハイブリダイゼーションし
た場合に消光剤分子が発蛍光団の蛍光を消す位置でそれ
らの個々のプローブ上に結合するものであり、長い方の
プローブは優先的に標的ポリヌクレオチドに結合し、優
先的に標的ポリヌクレオチドに結合する場合、発蛍光団
の蛍光強度は、第２のプローブにハイブリダイゼーショ
ンする場合の発蛍光団の蛍光強度よりも大きいものであ
る）、次いで、発蛍光団の蛍光、すなわち核酸増幅の存
在に対応する蛍光の発生をモニターすることを特徴とす
る核酸増幅のモニタリング方法に関する。また本発明
は、等しくない長さのプローブを用いて標的ポリヌクレ
オチドの存在を検出する方法にも関する。発蛍光団およ
び消光剤とアニーリングしたプローブも本発明の一部分
である。
ヌクレオチドについて核酸増幅を行うこと（第１のオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび長さが少なくとも約２塩
基対短いことにより長さの異なる第２のオリゴヌクレオ
チドプローブを用いる何れかの方法を用いて増幅を行
い、第１のプローブは発蛍光団を有し、第２のプローブ
は第１のプローブに相補的で、該発蛍光団の蛍光を消す
ことのできる消光剤分子を有するものであり、発蛍光団
および消光剤は、プローブがハイブリダイゼーションし
た場合に消光剤分子が発蛍光団の蛍光を消す位置でそれ
らの個々のプローブ上に結合するものであり、長い方の
プローブは優先的に標的ポリヌクレオチドに結合し、優
先的に標的ポリヌクレオチドに結合する場合、発蛍光団
の蛍光強度は、第２のプローブにハイブリダイゼーショ
ンする場合の発蛍光団の蛍光強度よりも大きいものであ
る）、次いで、発蛍光団の蛍光、すなわち核酸増幅の存
在に対応する蛍光の発生をモニターすることを特徴とす
る核酸増幅のモニタリング方法に関する。また本発明
は、等しくない長さのプローブを用いて標的ポリヌクレ
オチドの存在を検出する方法にも関する。発蛍光団およ
び消光剤とアニーリングしたプローブも本発明の一部分
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、いずれかの方法による
標的ポリヌクレオチドの増幅とともに用いられる。これ
らの増幅方法は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）、ギャップＬＣＲ、転写により媒介される増幅（Ｔ
ＭＡ）核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、および鎖
置換増幅（ＳＤＡ）を包含する。ＰＣＲは最も興味深
い。ＰＣＲは、Innis,et al,editors,PCR Protocols (A
cademic Press,New York,1989)；Sambrook et al.,Mole
cular Cloning,Second Edition (Cold Sprong Harbor L
aboratory,New York,1989)等多くの文献に記載されてい
る。オリゴヌクレオチドプローブ結合部位は、標的ポリ
ヌクレオチドを増幅するのに用いるＰＣＲプライマー間
に存在する。いずれのポリメラーゼを用いてＰＣＲを行
ってもよい。標的ポリヌクレオチドから生じる複製物が
多いほど蛍光シグナル強度は強くなるので、標的ポリヌ
クレオチド数を増加させるポリメラーゼはこの方法に都
合がよい。好ましくは、耐熱性ポリメラーゼを用いてＰ
ＣＲを行う。好ましい酵素はＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ、例えば、AmplitaqTM（Perkin-Elmer,Norwalk,Con
n.）または同等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐ
ＣＲのアニーリング温度は、使用オリゴヌクレオチドプ
ローブの融解温度よりも約５ないし１０℃低い温度であ
ろう。ポリメラーゼＰｗｏは本発明でうまく用いられ
た。
標的ポリヌクレオチドの増幅とともに用いられる。これ
らの増幅方法は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）、ギャップＬＣＲ、転写により媒介される増幅（Ｔ
ＭＡ）核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、および鎖
置換増幅（ＳＤＡ）を包含する。ＰＣＲは最も興味深
い。ＰＣＲは、Innis,et al,editors,PCR Protocols (A
cademic Press,New York,1989)；Sambrook et al.,Mole
cular Cloning,Second Edition (Cold Sprong Harbor L
aboratory,New York,1989)等多くの文献に記載されてい
る。オリゴヌクレオチドプローブ結合部位は、標的ポリ
ヌクレオチドを増幅するのに用いるＰＣＲプライマー間
に存在する。いずれのポリメラーゼを用いてＰＣＲを行
ってもよい。標的ポリヌクレオチドから生じる複製物が
多いほど蛍光シグナル強度は強くなるので、標的ポリヌ
クレオチド数を増加させるポリメラーゼはこの方法に都
合がよい。好ましくは、耐熱性ポリメラーゼを用いてＰ
ＣＲを行う。好ましい酵素はＴａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ、例えば、AmplitaqTM（Perkin-Elmer,Norwalk,Con
n.）または同等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐ
ＣＲのアニーリング温度は、使用オリゴヌクレオチドプ
ローブの融解温度よりも約５ないし１０℃低い温度であ
ろう。ポリメラーゼＰｗｏは本発明でうまく用いられ
た。
【０００６】本明細書の用語「オリゴヌクレオチド」
は、天然または修飾モノマーまたは連結物からなる直鎖
状オリゴマーを包含し、デオキシリボヌクレオチド、リ
ボヌクレオチド等があり、それらはワトソン−クリック
型の塩基対合等のごときモノマー対モノマーの通常のパ
ターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合しう
る。通常には、モノマーはホスホジエステル結合または
その類似結合により結合しており、数個のモノマー単
位、例えば３ないし４個ないし数十個のモノマー単位の
サイズのオリゴヌクレオチドを形成している。オリゴヌ
クレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のごとき文字配列によ
り表される場合、そのヌクレオチドは左から右へ５’か
ら３’方向を表すものとし、特記しない限り、「Ａ」は
デオキシアデノシン、「Ｃ」はデオキシシチジン、
「Ｇ」はデオキシグアノシン、「Ｔ」はチミジンを表
す。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラニリデ
ート、ホスホラミダイト等がある。一般的には、本発明
オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端近傍に十分
な数のホスホジエステル結合を有しており、使用するエ
キソヌクレアーゼ活性は５’から３’方向へと効果的に
結合プローブを分解してリポーターおよび消光剤分子を
分離させることができる。
は、天然または修飾モノマーまたは連結物からなる直鎖
状オリゴマーを包含し、デオキシリボヌクレオチド、リ
ボヌクレオチド等があり、それらはワトソン−クリック
型の塩基対合等のごときモノマー対モノマーの通常のパ
ターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合しう
る。通常には、モノマーはホスホジエステル結合または
その類似結合により結合しており、数個のモノマー単
位、例えば３ないし４個ないし数十個のモノマー単位の
サイズのオリゴヌクレオチドを形成している。オリゴヌ
クレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のごとき文字配列によ
り表される場合、そのヌクレオチドは左から右へ５’か
ら３’方向を表すものとし、特記しない限り、「Ａ」は
デオキシアデノシン、「Ｃ」はデオキシシチジン、
「Ｇ」はデオキシグアノシン、「Ｔ」はチミジンを表
す。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラニリデ
ート、ホスホラミダイト等がある。一般的には、本発明
オリゴヌクレオチドプローブはその５’末端近傍に十分
な数のホスホジエステル結合を有しており、使用するエ
キソヌクレアーゼ活性は５’から３’方向へと効果的に
結合プローブを分解してリポーターおよび消光剤分子を
分離させることができる。
【０００７】２本鎖についていう「完全に対合」とは、
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が他の鎖
と２本鎖構造を形成して、各鎖の各ヌクレオチドがワト
ソン−クリック型の塩基対合をしていることを意味す
る。また、その用語は、デオキシイノシン、２−アミノ
プリン塩基と一緒になったヌクレオシド等のごときヌク
レオシドアナログの対合も包含し、それらを用いること
ができる。逆に、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレ
オチドプローブもしくはプライマーとの間の２本鎖にお
ける「ミスマッチ」は、２本鎖中のヌクレオチドペアー
がワトソン−クリック型の結合をしないことを意味す
る。
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が他の鎖
と２本鎖構造を形成して、各鎖の各ヌクレオチドがワト
ソン−クリック型の塩基対合をしていることを意味す
る。また、その用語は、デオキシイノシン、２−アミノ
プリン塩基と一緒になったヌクレオシド等のごときヌク
レオシドアナログの対合も包含し、それらを用いること
ができる。逆に、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレ
オチドプローブもしくはプライマーとの間の２本鎖にお
ける「ミスマッチ」は、２本鎖中のヌクレオチドペアー
がワトソン−クリック型の結合をしないことを意味す
る。
【０００８】多くの方法により、例えば、Ozaki et al,
Nucleic Acids Research,20:5205-5214(1992);Agrawal
et al,Nucleic Acids Research,18:5419-5423(1990)等
の方法により本発明オリゴヌクレオチドプローブを合成
することができる。便利には、本発明オリゴヌクレオチ
ドプローブを、例えばBeaucage and Iyer,tetrahedron,
48:2223-2311(1992)；Molkoらの米国特許第４９８０４
６０号；Kosterらの米国特許第４７２５６７７号；Caru
thersらの米国特許第４４１５７３２号、４４５８０６
６号および４９７３６７９号等の文献に開示されたホス
ホラミダイト化学のごとき標準的な化学を用いて、自動
ＤＮＡ合成装置、例えば、Applied Biosystems,Inc.Fos
ter City,Calif.の３９２または３９４型ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ合成装置により合成する。別の化学、例えばホスホロ
チオエート、ホスホラミダイトのごとき非天然骨格グル
ープを用いてもよいが、得られるオリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーション効率および／または使用エキソ
ヌクレアーゼの開裂効率が悪影響を受けないことが必要
である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの長
さは１５ないし６０ヌクレオチドの範囲である。より好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの長さは１８な
いし３０ヌクレオチドの範囲である。本発明オリゴヌク
レオチドプローブの正確な配列および長さは、一部に
は、結合する標的ポリヌクレオチドの性質による。特定
の具体例のためには、結合位置および長さを変化させて
適切なアニーリングおよび融解特性を得てもよい。好ま
しくは、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレ
オチドはブロックされているか、または核酸ポリメラー
ゼにより伸長できなくされている。便利には、結合基に
よりオリゴヌクレオチドプローブの末端３’炭素にリポ
ーターもしくは消光剤分子を結合させることにより、か
かるブロッキングを行う。好ましくは、リポーター分子
は、結合基を介してプローブの末端３’炭素もしくは末
端５’炭素に結合することを目的に蛍光有機色素誘導体
化される。好ましくは、消光剤分子も有機色素であり、
本発明具体例にもよるが蛍光性であってもなくてもよ
い。例えば、本発明の好ましい具体例において、消光剤
分子は蛍光性である。一般的には、消光剤分子が蛍光性
であるかどうか、あるいはリポーター分子からの転移エ
ネルギーを非放射性崩壊により放出するかどうかにかか
わらず、消光剤の吸収バンドは実質的にリポーター分子
の蛍光エミッションバンドと重なるべきである。励起リ
ポーター分子からのエネルギーを吸収するが放射性エネ
ルギーを放出しない非蛍光性消光剤分子は、本明細書で
色素原分子（chromogenic molecules）と呼ばれる。特
定のプローブのための適当なリポーター−消光剤ペアー
を選択するために、文献中に多数の利用可能な実際的な
指針があり、例えば、下記文献がある：Clegg "Fluores
cence resonance energy transfer and nucleic acid
s",Methods inEnzymology,211:353-389(1992);Wu et a
l.,"Resonance energy transfer:methods and applicat
ions",Anal.Biochem.218:1-13(1994);Pesce et al,edit
ors,Fluorescence Spectrometry (Marcel Dekker,Ner Y
ork,1971);White et al,Fluorescence Analysis:A Prac
tical Approach (Marcel Dekker,New York,1970)等。ま
た、文献は、リポーター−消光剤ペアーを選択するため
の蛍光性分子および色素原分子ならびにそれらの重要な
光学的特性の完全なリストを提供する文献も含み、例え
ばBerlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Arom
atic Molecules,2ndEdition (Academic Press,New Yor
k,1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organ
ic Molecules (Academic Press,New York,1976);Bisho
p,editor,Indicators (pregamin Press,Oxford,1972);H
augland,Handbook of Fluorescent Probes and Researc
h Chemicals (Molecular Probes,Eugene,1992);Pringsh
eim,Fluorescence and Phosphorescence (Interscience
Publishers,New York,1949)等がある。さらに、オリゴ
ヌクレオチドに付加できる通常の反応性の基を介して共
有結合させるためにリポーター分子および消光剤分子を
誘導体化するための文献もあり、例えば、Haugland（上
記）；Ullmanらの米国特許第３９９６３４５号；Khanna
らの米国特許第４３５１７６０号等がある。
Nucleic Acids Research,20:5205-5214(1992);Agrawal
et al,Nucleic Acids Research,18:5419-5423(1990)等
の方法により本発明オリゴヌクレオチドプローブを合成
することができる。便利には、本発明オリゴヌクレオチ
ドプローブを、例えばBeaucage and Iyer,tetrahedron,
48:2223-2311(1992)；Molkoらの米国特許第４９８０４
６０号；Kosterらの米国特許第４７２５６７７号；Caru
thersらの米国特許第４４１５７３２号、４４５８０６
６号および４９７３６７９号等の文献に開示されたホス
ホラミダイト化学のごとき標準的な化学を用いて、自動
ＤＮＡ合成装置、例えば、Applied Biosystems,Inc.Fos
ter City,Calif.の３９２または３９４型ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ合成装置により合成する。別の化学、例えばホスホロ
チオエート、ホスホラミダイトのごとき非天然骨格グル
ープを用いてもよいが、得られるオリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーション効率および／または使用エキソ
ヌクレアーゼの開裂効率が悪影響を受けないことが必要
である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの長
さは１５ないし６０ヌクレオチドの範囲である。より好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの長さは１８な
いし３０ヌクレオチドの範囲である。本発明オリゴヌク
レオチドプローブの正確な配列および長さは、一部に
は、結合する標的ポリヌクレオチドの性質による。特定
の具体例のためには、結合位置および長さを変化させて
適切なアニーリングおよび融解特性を得てもよい。好ま
しくは、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレ
オチドはブロックされているか、または核酸ポリメラー
ゼにより伸長できなくされている。便利には、結合基に
よりオリゴヌクレオチドプローブの末端３’炭素にリポ
ーターもしくは消光剤分子を結合させることにより、か
かるブロッキングを行う。好ましくは、リポーター分子
は、結合基を介してプローブの末端３’炭素もしくは末
端５’炭素に結合することを目的に蛍光有機色素誘導体
化される。好ましくは、消光剤分子も有機色素であり、
本発明具体例にもよるが蛍光性であってもなくてもよ
い。例えば、本発明の好ましい具体例において、消光剤
分子は蛍光性である。一般的には、消光剤分子が蛍光性
であるかどうか、あるいはリポーター分子からの転移エ
ネルギーを非放射性崩壊により放出するかどうかにかか
わらず、消光剤の吸収バンドは実質的にリポーター分子
の蛍光エミッションバンドと重なるべきである。励起リ
ポーター分子からのエネルギーを吸収するが放射性エネ
ルギーを放出しない非蛍光性消光剤分子は、本明細書で
色素原分子（chromogenic molecules）と呼ばれる。特
定のプローブのための適当なリポーター−消光剤ペアー
を選択するために、文献中に多数の利用可能な実際的な
指針があり、例えば、下記文献がある：Clegg "Fluores
cence resonance energy transfer and nucleic acid
s",Methods inEnzymology,211:353-389(1992);Wu et a
l.,"Resonance energy transfer:methods and applicat
ions",Anal.Biochem.218:1-13(1994);Pesce et al,edit
ors,Fluorescence Spectrometry (Marcel Dekker,Ner Y
ork,1971);White et al,Fluorescence Analysis:A Prac
tical Approach (Marcel Dekker,New York,1970)等。ま
た、文献は、リポーター−消光剤ペアーを選択するため
の蛍光性分子および色素原分子ならびにそれらの重要な
光学的特性の完全なリストを提供する文献も含み、例え
ばBerlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Arom
atic Molecules,2ndEdition (Academic Press,New Yor
k,1971);Griffiths,Colour and Constitution of Organ
ic Molecules (Academic Press,New York,1976);Bisho
p,editor,Indicators (pregamin Press,Oxford,1972);H
augland,Handbook of Fluorescent Probes and Researc
h Chemicals (Molecular Probes,Eugene,1992);Pringsh
eim,Fluorescence and Phosphorescence (Interscience
Publishers,New York,1949)等がある。さらに、オリゴ
ヌクレオチドに付加できる通常の反応性の基を介して共
有結合させるためにリポーター分子および消光剤分子を
誘導体化するための文献もあり、例えば、Haugland（上
記）；Ullmanらの米国特許第３９９６３４５号；Khanna
らの米国特許第４３５１７６０号等がある。
【０００９】典型的なリポーター−消光剤ペアーを、フ
ルオレセイン類を包含するキサンテン色素、およびロー
ダミン色素から選択してもよい。多くの適当な形態のこ
れらの化合物は広く市販されており、それらは結合部位
としてまたはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合
官能基として使用可能な置換基をフェニル部分に有して
いる。別のグループの蛍光性化合物はアルファまたはベ
ータ位にアミノ基を有するナフチルアミン類である。１
−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−ア
ニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−ト
ルイジニル−６−ナフタレンスルホネートはかかるナフ
チルアミの化合物に包含される。他の色素としては３−
フェニル−７−イソシアネートクマリン、アクリジン
類、例えば９−イソチオシアネートアクリジンおよびア
クリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリ
ル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール類、
スチルベン類、ピレン類等がある。好ましくは、リポー
ターおよび消光剤分子をフルオレセイン色素およびロー
ダミン色素から選択する。これらの色素およびオリゴヌ
クレオチドへの適当な結合法は多くの文献に記載されて
おり、例えば、Khannaら（上記）、Marshall,Histochem
ical J.,299-303(1975)；Mechnenらの米国特許第５１８
８９３４号、Mechnenらの欧州特許出願第８７３１０２
５６．０号；およびBergotらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９
０／０５５６５がある。後の４つの文献を参照により本
明細書に記載されているものとみなす。
ルオレセイン類を包含するキサンテン色素、およびロー
ダミン色素から選択してもよい。多くの適当な形態のこ
れらの化合物は広く市販されており、それらは結合部位
としてまたはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合
官能基として使用可能な置換基をフェニル部分に有して
いる。別のグループの蛍光性化合物はアルファまたはベ
ータ位にアミノ基を有するナフチルアミン類である。１
−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−ア
ニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−ト
ルイジニル−６−ナフタレンスルホネートはかかるナフ
チルアミの化合物に包含される。他の色素としては３−
フェニル−７−イソシアネートクマリン、アクリジン
類、例えば９−イソチオシアネートアクリジンおよびア
クリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリ
ル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール類、
スチルベン類、ピレン類等がある。好ましくは、リポー
ターおよび消光剤分子をフルオレセイン色素およびロー
ダミン色素から選択する。これらの色素およびオリゴヌ
クレオチドへの適当な結合法は多くの文献に記載されて
おり、例えば、Khannaら（上記）、Marshall,Histochem
ical J.,299-303(1975)；Mechnenらの米国特許第５１８
８９３４号、Mechnenらの欧州特許出願第８７３１０２
５６．０号；およびBergotらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９
０／０５５６５がある。後の４つの文献を参照により本
明細書に記載されているものとみなす。
【００１０】リポーター分子または消光剤分子をオリゴ
ヌクレオチドの３’または５’末端に結合させるための
多くの結合基および方法があり、下記文献に示されてい
る：Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogue
s:A Practical Approach (IRLPress,Oxford,1991);Zuck
erman et al,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(19
87)（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Sharm
a et al,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)（３’
スルフヒドリル）；Giusti et al,PCR Methodsand Appl
ications,2:223-227(1993)およびFungらの米国特許第４
７５７１４１号（Applied Biosystems,Foster City,Cal
if.から市販されているAminolinkTM IIを介した５’ホ
スホアミノ基）；Stabinskyの米国特許第４７３９０４
４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Agrawal et
al,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)（ホスホ
ラミダイト結合を介する結合）；Sproat et al,Nucleic
Acids Research,15:4837(1987)（５’メルカプト
基）；Nelson et al,Nucleic Acids Research,17:7187-
7194(1989)（３’アミノ基）等。好ましくは、合成中に
オリゴヌクレオチドに結合しうる市販結合基、例えば、
Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)から市販さ
れているものを用いる。
ヌクレオチドの３’または５’末端に結合させるための
多くの結合基および方法があり、下記文献に示されてい
る：Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogue
s:A Practical Approach (IRLPress,Oxford,1991);Zuck
erman et al,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(19
87)（オリゴヌクレオチド上の３’チオール基）；Sharm
a et al,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)（３’
スルフヒドリル）；Giusti et al,PCR Methodsand Appl
ications,2:223-227(1993)およびFungらの米国特許第４
７５７１４１号（Applied Biosystems,Foster City,Cal
if.から市販されているAminolinkTM IIを介した５’ホ
スホアミノ基）；Stabinskyの米国特許第４７３９０４
４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Agrawal et
al,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)（ホスホ
ラミダイト結合を介する結合）；Sproat et al,Nucleic
Acids Research,15:4837(1987)（５’メルカプト
基）；Nelson et al,Nucleic Acids Research,17:7187-
7194(1989)（３’アミノ基）等。好ましくは、合成中に
オリゴヌクレオチドに結合しうる市販結合基、例えば、
Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)から市販さ
れているものを用いる。
【００１１】また、便利には、ホスホラミダイト基で誘
導体化した色素を用いる固相合成の最後にオリゴヌクレ
オチドの５’ヒドロキシルにローダミンおよびフルオレ
セイン色素を結合させる（例えば、Wooらの米国特許第
５２３１１９１号；およびHobbs,Jr.の米国特許第４９
９７９２８号参照）。
導体化した色素を用いる固相合成の最後にオリゴヌクレ
オチドの５’ヒドロキシルにローダミンおよびフルオレ
セイン色素を結合させる（例えば、Wooらの米国特許第
５２３１１９１号；およびHobbs,Jr.の米国特許第４９
９７９２８号参照）。
【００１２】本発明に使用するプライマーおよびプロー
ブの選択は当業者の選択による。本発明は、プライマー
またはプローブの選択について特殊必要事項がなく、ま
た制限もない。かかる選択は当業者の範囲内である。
ブの選択は当業者の選択による。本発明は、プライマー
またはプローブの選択について特殊必要事項がなく、ま
た制限もない。かかる選択は当業者の範囲内である。
【００１３】プローブは、本発明の実施ができる長さで
あればいずれの長さであってもよいが、基準として、長
いほうのプローブは少なくとも３塩基対を有していなけ
ればならず、実施問題として、長いほうのプローブは３
塩基対よりも多い塩基対を含むであろう。しかしなが
ら、ＦＥＴＣＨの使用による長さの上限はない。長いほ
うのプローブの長さはＦＥＴＥＣＨの適用によっては支
配されない。なぜなら、ＦＥＴＣＨは少なくとも３塩基
対である必要性のあるいずれの長さのプローブについて
も適合するからである。実際問題として、長いほうのプ
ローブは、標的ポリヌクレオチドおよび短いほうのプロ
ーブにユニークにハイブリダイゼーションすることを保
証する長さを有するであろう。短いほうのプローブは、
長いほうのプローブよりも少なくとも２塩基対短いであ
ろう。このことは、短いほうのプローブを作成する場合
の基礎的事項である。アリーリングしたプローブの解離
温度を計算することによりプローブ間の長さの相違に関
する良好な適合が得られることがわかっている。一般則
として、プライマーの解離温度としては約５５℃以上９
０℃未満であることが必要である。この計算を行うため
の便利な手段は、GeneRuner (Hastings Software,Inc.)
の例えばバージョン３．０４と呼ばれるソフトウェアを
使用することである。
あればいずれの長さであってもよいが、基準として、長
いほうのプローブは少なくとも３塩基対を有していなけ
ればならず、実施問題として、長いほうのプローブは３
塩基対よりも多い塩基対を含むであろう。しかしなが
ら、ＦＥＴＣＨの使用による長さの上限はない。長いほ
うのプローブの長さはＦＥＴＥＣＨの適用によっては支
配されない。なぜなら、ＦＥＴＣＨは少なくとも３塩基
対である必要性のあるいずれの長さのプローブについて
も適合するからである。実際問題として、長いほうのプ
ローブは、標的ポリヌクレオチドおよび短いほうのプロ
ーブにユニークにハイブリダイゼーションすることを保
証する長さを有するであろう。短いほうのプローブは、
長いほうのプローブよりも少なくとも２塩基対短いであ
ろう。このことは、短いほうのプローブを作成する場合
の基礎的事項である。アリーリングしたプローブの解離
温度を計算することによりプローブ間の長さの相違に関
する良好な適合が得られることがわかっている。一般則
として、プライマーの解離温度としては約５５℃以上９
０℃未満であることが必要である。この計算を行うため
の便利な手段は、GeneRuner (Hastings Software,Inc.)
の例えばバージョン３．０４と呼ばれるソフトウェアを
使用することである。
【００１４】長いほうの遺伝子の５’末端切断物として
短いほうの遺伝子を調製してもよい。あるいは、３’末
端切断物であってもよい。３番目の選択肢は、長いほう
の遺伝子の５’および３’末端を切断することにより短
いほうのプローブを作成することである。これらの３つ
の形態の短いほうのプローブのいずれか１つであればう
まくいくであろう。２種またはそれ以上の末端切断形態
を用いることができるが、１の形態のみ、好ましくは
５’末端切断形態のみを用いることが最も簡単である。
短いほうの遺伝子を調製してもよい。あるいは、３’末
端切断物であってもよい。３番目の選択肢は、長いほう
の遺伝子の５’および３’末端を切断することにより短
いほうのプローブを作成することである。これらの３つ
の形態の短いほうのプローブのいずれか１つであればう
まくいくであろう。２種またはそれ以上の末端切断形態
を用いることができるが、１の形態のみ、好ましくは
５’末端切断形態のみを用いることが最も簡単である。
【００１５】２つのプローブがハイブリダイゼーション
した場合、消光剤により発蛍光団の蛍光が効果的に消さ
れる限り、発蛍光団および消光剤をどのような組み合わ
せの塩基対上に置いてもよい。最も簡単な方法は、長い
ほうのプローブの５’末端ヌクレオチド上に発蛍光団を
置き、短いほうのプローブの３’末端ヌクレオチド上に
消光剤を置くことである。この方法は、発蛍光団の蛍光
に対する消光剤分子の影響を最適化することができる。
好ましくは、５’および３’結合基を用いて発蛍光団お
よび消光剤分子をプローブの末端５’炭素および末端
３’炭素に結合する。しかしながら、本発明において有
用な少なくとも一定数の発蛍光団については、発蛍光団
および消光剤が離れて存在してもやはり作動しうること
が示されている。例えば、発蛍光団および消光剤を数塩
基離してもよいことが開示されている米国特許第５５３
８８４８号参照。その特許によれば、発蛍光団および消
光剤が少なくとも１５ヌクレオチドまたはそれ以上離れ
ているが有用性を示すことが開示されている。同様に、
２つのプローブがハイブリダイゼーションした場合、離
すことが発蛍光団のシグナルへの消光剤の影響能を実質
的に低下させない限り、発蛍光団および消光剤を離すこ
とが可能である。もちろん、発蛍光団および／または消
光剤をプローブ内部のヌクレオチドに結合させることも
できる。しかしながら、合成の容易さならびにプローブ
対標的およびプローブ対プローブのハイブリダイゼーシ
ョンの最適化を理由として、上記のごとく発蛍光団およ
び消光剤をプローブの５’および３’末端に置くことが
好ましい。実際、発蛍光団および消光剤を各々のオリゴ
ヌクレオチドの５’または３’末端ヌクレオチド上に置
くと、アッセイが機能的になるであろう。短いほうのプ
ローブ上に発蛍光団を置き、長いほうのプローブ上に消
光剤を置くための別の配置をとってもよい。さらに、こ
の配置において、長いほうのプローブは優先的に標的に
結合し、かくして、発蛍光団を伴うプローブから十分に
離れるため、その蛍光を効果的に消えないこととなる。
しかしながら、好ましい構築物は、長いほうのプローブ
上に発蛍光団を有するべきである。
した場合、消光剤により発蛍光団の蛍光が効果的に消さ
れる限り、発蛍光団および消光剤をどのような組み合わ
せの塩基対上に置いてもよい。最も簡単な方法は、長い
ほうのプローブの５’末端ヌクレオチド上に発蛍光団を
置き、短いほうのプローブの３’末端ヌクレオチド上に
消光剤を置くことである。この方法は、発蛍光団の蛍光
に対する消光剤分子の影響を最適化することができる。
好ましくは、５’および３’結合基を用いて発蛍光団お
よび消光剤分子をプローブの末端５’炭素および末端
３’炭素に結合する。しかしながら、本発明において有
用な少なくとも一定数の発蛍光団については、発蛍光団
および消光剤が離れて存在してもやはり作動しうること
が示されている。例えば、発蛍光団および消光剤を数塩
基離してもよいことが開示されている米国特許第５５３
８８４８号参照。その特許によれば、発蛍光団および消
光剤が少なくとも１５ヌクレオチドまたはそれ以上離れ
ているが有用性を示すことが開示されている。同様に、
２つのプローブがハイブリダイゼーションした場合、離
すことが発蛍光団のシグナルへの消光剤の影響能を実質
的に低下させない限り、発蛍光団および消光剤を離すこ
とが可能である。もちろん、発蛍光団および／または消
光剤をプローブ内部のヌクレオチドに結合させることも
できる。しかしながら、合成の容易さならびにプローブ
対標的およびプローブ対プローブのハイブリダイゼーシ
ョンの最適化を理由として、上記のごとく発蛍光団およ
び消光剤をプローブの５’および３’末端に置くことが
好ましい。実際、発蛍光団および消光剤を各々のオリゴ
ヌクレオチドの５’または３’末端ヌクレオチド上に置
くと、アッセイが機能的になるであろう。短いほうのプ
ローブ上に発蛍光団を置き、長いほうのプローブ上に消
光剤を置くための別の配置をとってもよい。さらに、こ
の配置において、長いほうのプローブは優先的に標的に
結合し、かくして、発蛍光団を伴うプローブから十分に
離れるため、その蛍光を効果的に消えないこととなる。
しかしながら、好ましい構築物は、長いほうのプローブ
上に発蛍光団を有するべきである。
【００１６】消光剤を有するプローブと発蛍光団を有す
るプローブとの割合を変化させることによりアッセイを
最適化することができる。１：１の割合が良好な結果を
もたらす。しかしながら、発蛍光団を有するプローブに
対する消光剤を有するプローブの割合が２：１の場合、
より良好な結果が得られた。本発明のこの態様は最適化
されていないが、当業者は、異なる割合について通常の
試験によるアッセイを行って、最適化しうることがわか
る。
るプローブとの割合を変化させることによりアッセイを
最適化することができる。１：１の割合が良好な結果を
もたらす。しかしながら、発蛍光団を有するプローブに
対する消光剤を有するプローブの割合が２：１の場合、
より良好な結果が得られた。本発明のこの態様は最適化
されていないが、当業者は、異なる割合について通常の
試験によるアッセイを行って、最適化しうることがわか
る。
【００１７】
【実施例】下記実施例は本発明の説明のためのものであ
り、特許請求された本発明の範囲を限定的に解するもの
ではない。 一般的説明 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転
移（ＦＥＴＣＨ）の利用を、ヒト・標本中のＣ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）のＰＣＲによる検出のためのアッセイ
として開発した。前方のプローブ、すなわち短いほうの
プローブはＴＡＭＲＡ色素（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラ
メチル−６−カルボキシローダミン）を３’位置に有し
ていた（よって、３’ＯＨはＰＣＲ中に伸長不可能）。
一般的に使用される蛍光性色素ＦＡＭを発蛍光団として
使用した。蛍光性色素ＴＡＭＲＡはＦＡＮのエミッショ
ンバンドと重なる吸収バンドを有しており、この適用例
において消光剤として使用した。
り、特許請求された本発明の範囲を限定的に解するもの
ではない。 一般的説明 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転
移（ＦＥＴＣＨ）の利用を、ヒト・標本中のＣ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）のＰＣＲによる検出のためのアッセイ
として開発した。前方のプローブ、すなわち短いほうの
プローブはＴＡＭＲＡ色素（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラ
メチル−６−カルボキシローダミン）を３’位置に有し
ていた（よって、３’ＯＨはＰＣＲ中に伸長不可能）。
一般的に使用される蛍光性色素ＦＡＭを発蛍光団として
使用した。蛍光性色素ＴＡＭＲＡはＦＡＮのエミッショ
ンバンドと重なる吸収バンドを有しており、この適用例
において消光剤として使用した。
【００１８】実施例１ プライマーおよびプローブの選択 ＨＣＶポリヌクレオチド配列を文献から同定した。すべ
ての既知ＨＣＶ株を捕らえることのできるアッセイを行
うために、すべての株のＲＮＡ配列に共通したポリヌク
レオチド配列を有する２つのプライマーおよび２つのプ
ローブを選択した。それらがすべての既知ＨＣＶ株にア
ニーリングし、類似の解離温度を有し、互いに広範囲に
わたる３’相補性を有しない等の条件を満たすようにプ
ライマーを選択した。選択したものは、文献記載のヌク
レオチド番号３２９０から３５４３までのＨＣＶの５’
非コーディング領域の２５４ｂｐのセグメントの横にあ
るものであった。ＨＣＶ配列のデータはプライマーに依
存した。選択したプローブを下表１−２および４に示
す。
ての既知ＨＣＶ株を捕らえることのできるアッセイを行
うために、すべての株のＲＮＡ配列に共通したポリヌク
レオチド配列を有する２つのプライマーおよび２つのプ
ローブを選択した。それらがすべての既知ＨＣＶ株にア
ニーリングし、類似の解離温度を有し、互いに広範囲に
わたる３’相補性を有しない等の条件を満たすようにプ
ライマーを選択した。選択したものは、文献記載のヌク
レオチド番号３２９０から３５４３までのＨＣＶの５’
非コーディング領域の２５４ｂｐのセグメントの横にあ
るものであった。ＨＣＶ配列のデータはプライマーに依
存した。選択したプローブを下表１−２および４に示
す。
【００１９】
【表１】
【表２】
【表３】 Ｃ２の配列についての慣用的でない表示（３’から５’
へと表示）はそのＣ１に対する相補性を目立たせること
に役立つ。 表４ 塩基数 分子量 標識 プローブＣ１ ２０ ６９１４ ６−ＦＡＭ プローブＣ２ １７ ６０６５ ＴＡＭＲＡ Gene Runerバージョン３．０４（Hastings Software In
c.）により分子量を計算した。
へと表示）はそのＣ１に対する相補性を目立たせること
に役立つ。 表４ 塩基数 分子量 標識 プローブＣ１ ２０ ６９１４ ６−ＦＡＭ プローブＣ２ １７ ６０６５ ＴＡＭＲＡ Gene Runerバージョン３．０４（Hastings Software In
c.）により分子量を計算した。
【００２０】実施例２ プローブの合成 ２個のプローブをTriLink Biotechnologies,Inc.(11585
Sorrento Valley Rd.,Suite 105,San Diego,CA 92121)
において注文合成した。それらは下記のごとく合成され
た。 工程１ オリゴヌクレオチド合成 支持体上でオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護して
３’リン酸基を生じさせた（Glen Researchカタログ番
号２０−２９１３）。 工程２ ６−ＦＭＡ付加 次いで、支持体結合オリゴヌクレオチドを１５当量の６
−ＦＡＭアミダイト（Glen Researchカタログ番号１０
−５９０１）と手動で反応させて高効率を保証した。 工程３ オリゴヌクレオチド脱保護 新鮮な濃アンモニア水を用いてＦＡＭ標識オリゴを室温
で３６時間脱保護した。脱保護後、試薬をデンカンテー
ションで除去し、ビーズを濯ぎ、溶液と一緒に乾燥させ
た。 工程４ 精製 逆相ＨＰＬＣを用いてＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを
精製した。ＦＡＭは全長の物質上にある唯一のものであ
り、親油性条件下での取り扱いに有用であり、良好な分
離をもたらす。精製後、化合物を乾燥して沈殿するよう
にした。ＥｔＯＨを用いて化合物を０．３Ｍ ＮａＯＡ
ｃから沈殿させた。高速遠心分離により生成物を回収
し、ＥｔＯＨで２回洗浄した。 工程５ 最終分析 乾燥生成物を水に再懸濁し、定量し、ＨＰＬＣにより純
度を分析した。次いで、化合物を再乾燥して発送できる
ようにした。
Sorrento Valley Rd.,Suite 105,San Diego,CA 92121)
において注文合成した。それらは下記のごとく合成され
た。 工程１ オリゴヌクレオチド合成 支持体上でオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護して
３’リン酸基を生じさせた（Glen Researchカタログ番
号２０−２９１３）。 工程２ ６−ＦＭＡ付加 次いで、支持体結合オリゴヌクレオチドを１５当量の６
−ＦＡＭアミダイト（Glen Researchカタログ番号１０
−５９０１）と手動で反応させて高効率を保証した。 工程３ オリゴヌクレオチド脱保護 新鮮な濃アンモニア水を用いてＦＡＭ標識オリゴを室温
で３６時間脱保護した。脱保護後、試薬をデンカンテー
ションで除去し、ビーズを濯ぎ、溶液と一緒に乾燥させ
た。 工程４ 精製 逆相ＨＰＬＣを用いてＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを
精製した。ＦＡＭは全長の物質上にある唯一のものであ
り、親油性条件下での取り扱いに有用であり、良好な分
離をもたらす。精製後、化合物を乾燥して沈殿するよう
にした。ＥｔＯＨを用いて化合物を０．３Ｍ ＮａＯＡ
ｃから沈殿させた。高速遠心分離により生成物を回収
し、ＥｔＯＨで２回洗浄した。 工程５ 最終分析 乾燥生成物を水に再懸濁し、定量し、ＨＰＬＣにより純
度を分析した。次いで、化合物を再乾燥して発送できる
ようにした。
【００２１】実施例３ ＦＥＴＣＨを用いる逆転写酵素−ＰＣＲによるＨＣＶ
ＲＮＡの検出 １工程の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応としてアッ
セイを行った。ヒト・血清または血漿からＨＣＶ ＲＮ
Ａを単離し、精製した。血清または血漿試料を高変性条
件下で溶解させてＲＮＡアーゼを不活性化させ、無傷の
ＲＮＡの単離を保証した。ＲＮＡをエタノールで沈殿さ
せ、ＲＮＡに結合するＱＩＡｍｐスピンカラム（Qiage
n,Chatsworth,CA）に移した。次いで、カラムを水洗
し、ＲＮＡを溶離させた。精製ＲＮＡ鋳型（１０μｌ）
をＨＣＶマスターミックス（master mix）（表５参照）
（４０μｌ）と混合し、次いで、逆転写してＤＮＡと
し、表６にあるようにPerkin Elmer 7700配列分析装置
にて同じ試験管中でＰＣＲにより増幅し、検出を行っ
た。ＰＣＲを行っている間、いくつかのＦＡＭ標識プロ
ーブおよびいくつかのＴＡＭＲＡ標識プローブがＰＣＲ
生成物にアニーリングし、かくしてＦＡＭ蛍光の消光が
抑制され、検出すべき蛍光が増強された。図１に示すよ
うにＦＡＭの蛍光は温度サイクリングのサイクル数の増
加に伴い増大し、ＰＣＲ生成物量の増加に対応してい
た。 表５ 典型的なＨＣＶマスターミックス 試薬 １本の試験管中の 最終濃度 μｌ数 （４０μｌ） ＲＮａｓｅ不含の水 ２６.８ −−− １０Ｘ TaqManTMバッファー ５ １Ｘ ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ） ５ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ） ０.６ ３００ｍＭ プライマー ＨＣＶＣ１（１００μＭ） ０.２５ ５００ｎＭ プライマー ＨＣＶＣ２（１００μＭ） ０.２５ ５００ｎＭ プローブＣ１（２５μＭ） ０.２ １００μＭ プローブＣ２（２５μＭ） ０.２ １００μＭ ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μｌ） ０.５ １０Ｕ ＭＵ／Ｖ ＲＴ（５０Ｕ／μｌ） ０.５ ２５Ｕ Amplitaqゴールド（５Ｕ／μｌ） ０.５ ２.５Ｕ TaqManはRoch Molecular Systems,Inc.の商標である。 表６ サイクル 温度 時間 繰り返し ランプタイム 自動インクレメント 回数 （Ramp Time） （Auto Increment） しない ４８℃ ６０分 自動 しない ９５℃ １０分 自動 する ９３℃ １５秒 ４０ 自動 ５７℃ ３０秒 ７２℃ ３０秒
ＲＮＡの検出 １工程の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応としてアッ
セイを行った。ヒト・血清または血漿からＨＣＶ ＲＮ
Ａを単離し、精製した。血清または血漿試料を高変性条
件下で溶解させてＲＮＡアーゼを不活性化させ、無傷の
ＲＮＡの単離を保証した。ＲＮＡをエタノールで沈殿さ
せ、ＲＮＡに結合するＱＩＡｍｐスピンカラム（Qiage
n,Chatsworth,CA）に移した。次いで、カラムを水洗
し、ＲＮＡを溶離させた。精製ＲＮＡ鋳型（１０μｌ）
をＨＣＶマスターミックス（master mix）（表５参照）
（４０μｌ）と混合し、次いで、逆転写してＤＮＡと
し、表６にあるようにPerkin Elmer 7700配列分析装置
にて同じ試験管中でＰＣＲにより増幅し、検出を行っ
た。ＰＣＲを行っている間、いくつかのＦＡＭ標識プロ
ーブおよびいくつかのＴＡＭＲＡ標識プローブがＰＣＲ
生成物にアニーリングし、かくしてＦＡＭ蛍光の消光が
抑制され、検出すべき蛍光が増強された。図１に示すよ
うにＦＡＭの蛍光は温度サイクリングのサイクル数の増
加に伴い増大し、ＰＣＲ生成物量の増加に対応してい
た。 表５ 典型的なＨＣＶマスターミックス 試薬 １本の試験管中の 最終濃度 μｌ数 （４０μｌ） ＲＮａｓｅ不含の水 ２６.８ −−− １０Ｘ TaqManTMバッファー ５ １Ｘ ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ） ５ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ） ０.６ ３００ｍＭ プライマー ＨＣＶＣ１（１００μＭ） ０.２５ ５００ｎＭ プライマー ＨＣＶＣ２（１００μＭ） ０.２５ ５００ｎＭ プローブＣ１（２５μＭ） ０.２ １００μＭ プローブＣ２（２５μＭ） ０.２ １００μＭ ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μｌ） ０.５ １０Ｕ ＭＵ／Ｖ ＲＴ（５０Ｕ／μｌ） ０.５ ２５Ｕ Amplitaqゴールド（５Ｕ／μｌ） ０.５ ２.５Ｕ TaqManはRoch Molecular Systems,Inc.の商標である。 表６ サイクル 温度 時間 繰り返し ランプタイム 自動インクレメント 回数 （Ramp Time） （Auto Increment） しない ４８℃ ６０分 自動 しない ９５℃ １０分 自動 する ９３℃ １５秒 ４０ 自動 ５７℃ ３０秒 ７２℃ ３０秒
【図１】 等しくない長さのプローブを用いる標的ＨＣ
Ｖ ＲＮＡのＰＣＲ増幅により得られた蛍光シグナルを
示す。長い方のプローブは５’末端炭素上に発蛍光団を
有し、短いほうのプローブは３’末端炭素上に消光剤を
有しており、短いほうのプローブは長いほうのプローブ
の５’末端から３塩基対欠失させることにより調製され
た。
Ｖ ＲＮＡのＰＣＲ増幅により得られた蛍光シグナルを
示す。長い方のプローブは５’末端炭素上に発蛍光団を
有し、短いほうのプローブは３’末端炭素上に消光剤を
有しており、短いほうのプローブは長いほうのプローブ
の５’末端から３塩基対欠失させることにより調製され
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョゼ・エフ・クアン アメリカ合衆国93041カリフォルニア州 ポート・ヒューネーム、イースト・スー ルサイド・ドライブ211番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ ＭＥＤＬＩＮＥ
Claims (12)
- 【請求項１】 標的ポリヌクレオチドについて核酸増幅
を行うこと（第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび
長さが少なくとも約２塩基対短いことにより長さの異な
る第２のオリゴヌクレオチドプローブを用いる何れかの
方法を用いて増幅を行い、第１のプローブは発蛍光団を
有し、第２のプローブは第１のプローブに相補的で、該
発蛍光団の蛍光を消すことのできる消光剤分子を有する
ものであり、発蛍光団および消光剤は、プローブがハイ
ブリダイゼーションした場合に消光剤分子が発蛍光団の
蛍光を消す位置でそれらの個々のプローブ上に結合する
ものであり、長い方のプローブは優先的に標的ポリヌク
レオチドに結合し、優先的に標的ポリヌクレオチドに結
合する場合、発蛍光団の蛍光強度は、第２のプローブに
ハイブリダイゼーションする場合の発蛍光団の蛍光強度
よりも大きいものである）、次いで、発蛍光団の蛍光、
すなわち核酸増幅の存在に対応する蛍光の発生をモニタ
ーすることを特徴とする核酸増幅のモニタリング方法 - 【請求項２】 核酸ポリメラーゼが耐熱性核酸ポリメラ
ーゼである請求項１の方法。 - 【請求項３】 第１のプローブ上の発蛍光団および第２
のプローブ上の消光剤分子が同一のハイブリダイゼーシ
ョンした塩基対上にある請求項１の方法。 - 【請求項４】 発蛍光団および消光剤分子が互いに約１
個ないし３個のハイブリダイゼーションした塩基対中に
ある請求項１の方法。 - 【請求項５】 発蛍光団および消光剤分子が互いに３個
またはそれ以上のハイブリダイゼーションした塩基対中
にある請求項１の方法。 - 【請求項６】 発蛍光団が第１のプローブの５’末端ヌ
クレオチド上にあり、消光剤が第２のプローブの３’末
端ヌクレオチド上にある請求項１の方法。 - 【請求項７】 発蛍光団が第１のプローブの３’末端ヌ
クレオチド上にあり、消光剤が第２のプローブの５’末
端ヌクレオチド上にある請求項１の方法。 - 【請求項８】 第１のプローブのヌクレオチド配列から
の３個またはそれ以上の３’末端ヌクレオチドの欠失に
より第２のプローブが第１のプローブよりも短い請求項
１の方法。 - 【請求項９】 第１のプローブのヌクレオチド配列から
の３個またはそれ以上の５’末端ヌクレオチドの欠失に
より第２のプローブが第１のプローブよりも短い請求項
１の方法。 - 【請求項１０】 第１のプローブの３個またはそれ以上
の５’末端ヌクレオチドの欠失および第１のプローブの
１個またはそれ以上の３’末端ヌクレオチドの欠失によ
り第２のプローブが第１のプローブよりも短い請求項１
の方法。 - 【請求項１１】 第１および第２のプローブが２℃また
はそれ以上異なる解離温度を有する請求項１の方法。 - 【請求項１２】 核酸試料を適当な溶液中に入れ、第１
のオリゴヌクレオチドプローブおよび長さが少なくとも
約２塩基対短いことにより長さの異なる第２のオリゴヌ
クレオチドプローブとともにインキュベーションするこ
と（第１のプローブは発蛍光団を有し、第２のプローブ
は第１のプローブに相補的で、該発蛍光団の蛍光を消す
ことのできる消光剤分子を有するものであり、発蛍光団
および消光剤は、プローブがハイブリダイゼーションし
た場合に消光剤分子が発蛍光団の蛍光を消す位置でそれ
らの個々のプローブ上に結合するものであり、長い方の
プローブは優先的に標的ポリヌクレオチドに結合し、優
先的に標的ポリヌクレオチドに結合する場合、発蛍光団
の蛍光強度は、第２のプローブにハイブリダイゼーショ
ンする場合の発蛍光団の蛍光強度よりも大きいものであ
る）、次いで、発蛍光団の蛍光、すなわち特定の核酸配
列の存在に対応した蛍光の発生をモニターすることを特
徴とする、調製された核酸試料中の特定の核酸配列の存
在の検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3958397P | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| US60/039583 | 1997-02-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262700A JPH10262700A (ja) | 1998-10-06 |
| JP3016759B2 true JP3016759B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=21906247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10045690A Expired - Lifetime JP3016759B2 (ja) | 1997-02-28 | 1998-02-26 | 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0861906B1 (ja) |
| JP (1) | JP3016759B2 (ja) |
| DE (1) | DE69833606T2 (ja) |
| ES (2) | ES2396379T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸の検出法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7803528B1 (en) | 1997-02-28 | 2010-09-28 | Quest Diagnostics Incorporated | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization |
| US5935791A (en) * | 1997-09-23 | 1999-08-10 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| WO1999042615A1 (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-26 | Dade Behring Inc. | Methods for determining amounts of nucleic acids |
| DE19811730A1 (de) * | 1998-03-18 | 1999-09-23 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren und Vorrichtung zum Identifizieren einer Markierung |
| GB2359625B (en) | 1999-12-10 | 2004-10-20 | Molecular Light Tech Res Ltd | Monitoring oligonucleotide binding process using chemiluminescence quenching |
| US20050123975A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Applera Corporation | Methods for determining the degradation state or concentration of nucleic acids |
| CA2548205C (en) | 2003-12-03 | 2017-06-27 | Abbott Laboratories | Double stranded linear nucleic acid probe and uses thereof |
| DE602004026111D1 (de) | 2003-12-19 | 2010-04-29 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Verfahren zum testen von nukleinsäuren unter verwendung davon sowie dafür zu verwendende nukleinsäuresonde |
| DE102007044664B4 (de) * | 2007-09-18 | 2012-01-05 | Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh | Verdrängungsassay zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen |
| WO2009042851A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-02 | 3M Innovative Properties Company | Dual oligonucleotide method of nucleic acid detection |
| EP2430187A2 (en) * | 2009-05-12 | 2012-03-21 | Abacus Diagnostica OY | Method for detecting nucleic acids |
| EP3415636B1 (en) | 2016-02-09 | 2020-11-25 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method for detecting target nucleic acid and nucleic acid probe used therein |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| AU693023B2 (en) * | 1995-05-05 | 1998-06-18 | Applied Biosystems, Llc | Methods and reagents for combined PCR amplification and hybridization probing assay |
| US5691145A (en) * | 1996-08-27 | 1997-11-25 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids using G-quartets |
-
1998
- 1998-02-26 JP JP10045690A patent/JP3016759B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DE DE69833606T patent/DE69833606T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 EP EP98301581A patent/EP0861906B1/en not_active Revoked
- 1998-03-02 ES ES06110485T patent/ES2396379T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 ES ES98301581T patent/ES2259809T3/es not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013065574A1 (ja) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 栄研化学株式会社 | 標的核酸の検出法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69833606T2 (de) | 2006-12-14 |
| EP0861906B1 (en) | 2006-03-01 |
| ES2259809T3 (es) | 2006-10-16 |
| EP0861906A1 (en) | 1998-09-02 |
| ES2396379T3 (es) | 2013-02-21 |
| DE69833606D1 (de) | 2006-04-27 |
| JPH10262700A (ja) | 1998-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4040087B2 (ja) | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 | |
| CA2201756C (en) | Self-quenching fluorescence probe and method | |
| JP4527789B2 (ja) | 増加した標的特異的ｔｍを持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法 | |
| JP3016759B2 (ja) | 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 | |
| US9228230B2 (en) | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization | |
| US20050176014A1 (en) | Fluorescent hybridization probes with reduced background | |
| EP1666609B1 (en) | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization | |
| AU695561C (en) | Self-quenching fluorescence probe and method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991116 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081224 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081224 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091224 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101224 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101224 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111224 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111224 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121224 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121224 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224 Year of fee payment: 14 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |