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JP2010518820A - Ｅｒｂｂ３に対する抗体およびその使用 - Google Patents

Ｅｒｂｂ３に対する抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＥｒｂＢ３受容体に結合し、種々のＥｒｂＢ３機能を阻害する新しいクラスのモノクローナル抗体を提供する。例えば、本明細書に記載されている抗体は、ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンドを介した受容体のリン酸化を阻害することができる。ＥＧＦ様リガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、ビレグリン（ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）およびアンフィレグリンが含まれ、それらは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との二量化を誘導する。この二量化は、ＥｒｂＢ３のリン酸化を引き起し、その受容体を介してシグナル伝達を活性化する。このようにして、本発明のモノクローナル抗体は、ＥｒｂＢ３を介した細胞のシグナル伝達と関連した様々な癌の処置および診断に有用である。

Description

ポリペプチド増殖因子受容体のＥｒｂＢ／ＨＥＲサブファミリーには、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ｎｅｕ癌遺伝子産物（ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２）、ごく最近に同定されたＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４が挙げられる（例えば、非特許文献１を参照されたい）。これらの受容体の各々は、細胞外のリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインおよびＣ末端リン酸化ドメインからなることが予測されている（例えば、非特許文献２を参照されたい）。
インビトロでの実験によって、ＥｒｂＢ３タンパク質のタンパク質チロシンキナーゼ活性は、他のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーメンバーのものと比較して顕著に減衰しており、この減衰は、部分的には、ＥｒｂＢ３の予測される触媒ドメインにおける非保存的なアミノ酸置換の発生によることが示された（例えば、非特許文献３；非特許文献４を参照されたい）。しかしながら、ＥｒｂＢ３タンパク質は、様々な細胞状況においてリン酸化されることが示されている。例えば、ＥｒｂＢ３は、このタンパク質を過剰発現するヒト乳癌細胞系統のサブセットにおいて、チロシン残基に構造的にリン酸化される（例えば、非特許文献５；Ｋｉｍら、上掲を参照されたい；また、非特許文献６、並びに、非特許文献７を参照されたい）。
癌におけるＥｒｂＢ３の役割が研究されてはいるが（例えば、Ｈｏｒｓｔら（２００５）１１５，５１９−５２７；非特許文献８）、ＥｒｂＢ３は、臨床的介入の標的として、依然としてそれほど評価されていない。現在の免疫治療は、主に、ＥｒｂＢ２の作用、特に、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３複合体のヘテロ二量化の阻害に焦点が当てられている（例えば、非特許文献９を参照されたい）。したがって、本発明の目的は、ＥｒｂＢ３シグナル伝達を効果的に阻害し、様々な癌を処置および診断するために用いることができる改善された免疫治療を提供することである。
Ｈｙｎｅｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １１９８，１６５−１８４ Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４，１８９−１９５ Ｇｕｙら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，８１３２−８１３６ Ｓｉｅｒｋｅら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２２，７５７−７６３ Ｋｒａｕｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，２９００−２９０４ Ｓｃｈａｅｆｅｒら（２００６）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８（７）：６１３−２２ Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００４）６４（１０）：３３９５−４０５ Ｘｕｅら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，１４１８−１４２６ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４）
本発明は、ＥｒｂＢ３受容体に結合し、種々のＥｒｂＢ３機能を阻害する新しい種類のモノクローナル抗体を提供する。例えば、本明細書に記載されている抗体は、ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンドを介した受容体のリン酸化を阻害することができる。本明細書に記載されるように、ＥＧＦ様リガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、ビレグリン（ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）およびアンフィレグリンが含まれ、それらは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲとＥｒｂＢ３との二量化を誘導する。次に、この二量化は、ＥｒｂＢ３のリン酸化を引き起し、その受容体を介してシグナル伝達を活性化する。このようにして、本発明のモノクローナル抗体は、ＥｒｂＢ３を介した細胞のシグナル伝達と関連した様々な癌の処置および診断に有用である。したがって、一態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するモノクローナル抗体（およびその抗原結合部分）を提供する。
別の態様では、抗体は、さらに、１以上の下記の特徴：（ｉ）ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびＢＩＲなどのＥｒｂＢ３リガンドのＥｒｂＢ３への結合によって媒介されるシグナル伝達を含む、ＥｒｂＢ３リガンドを介したシグナル伝達の阻害；（ｉｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖阻害；（ｉｉｉ）細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力（例えば、ＥｒｂＢ３の内在化を誘導することによる）；（ｉｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害；（ｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（ｖｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）増殖の阻害；および／または（ｖｉｉ）ＥｒｂＢ３のドメインＩ（残基２０−２０９）に位置したエピトープ、例えば、ＥｒｂＢ３のアミノ酸配列の残基２０−２０２を含むかまたはそれにかかっているエピトープへの結合によって特徴付けられる。
本発明の特定のモノクローナル抗体およびその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定すると、ＫＤが５０ｎＭ以下を示す
さらなる態様では、本発明の特定のモノクローナル抗体およびその抗原結合部分は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３５、または配列番号３７に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の他の特定のモノクローナル抗体およびその抗原結合部分は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３６、または配列番号３８に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。また、抗体は、前記の重鎖および軽鎖可変領域の両方を含んでもよい。
抗体またはその抗原結合部分の可変重鎖および軽鎖領域は、典型的には、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。これらには、１以上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が含まれる。したがって、本発明の他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本発明のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本発明のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本発明のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、配列番号３９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；およびそれらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
本発明のさらに他の特定の抗体およびその抗原結合部分には、および配列番号４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；それらの組み合わせから選択される１以上のＣＤＲ配列が含まれる。
また、抗体およびその抗原結合部分は、前記のＣＤＲのいずれかまたはＣＤＲの組み合わせと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一である１以上のＣＤＲを含んでもよい。
一態様では、抗体およびその抗体部分は、完全にヒトである（即ち、ヒトＣＤＲおよびフレームワーク配列を含む）。本発明の特定のヒト抗体は、ヒトＶＨ３生殖細胞系列遺伝子由来である重鎖可変領域、および／またはヒトＶＬ２生殖細胞系列遺伝子由来である軽鎖可変領域を有するものが含まれる。
また、本明細書に記載されている抗体またはその部分のいずれかによって結合される、同じであるかまたは重複しているエピトープ（即ち、ＥｒｂＢ３のドメインＩに位置したエピトープ、例えば、ＥｒｂＢ３のアミノ酸配列の残基２０−２０２を含むかまたはそれにかかっているエピトープ）に結合するモノクローナル抗体およびその部分が、本発明に包含される。また、本明細書に記載されている抗体と同じ活性を有する抗体、例えば、Ａｂ＃６と同じ配列を有する抗体が本発明に包含される。
本発明の抗体には、全ての知られている形態の抗体、並びに抗体様の特性を有する他のタンパク質骨格が含まれる。例えば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体または抗体様の特性を有するタンパク質骨格、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリン（ａｎｋｙｒｉｎ）リピートであり得る。また、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはドメイン抗体であってもよい。また、抗体は、次のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかを有することができる。
なお別の態様では、本発明は、さらに、許容される担体および／またはアジュバントとともに調合される、本明細書に記載されている抗体または抗原結合部分の組み合わせを含む組成物を提供する。特定の態様では、組成物は、ＥｒｂＢ３に結合しない抗癌抗体と組み合わせた、本明細書に記載されているＥｒｂＢ３または抗体の異なるエピトープに結合する２以上の抗体を含む。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている抗体およびその抗原結合部分をコードする単離された核酸を提供する。特定の態様では、核酸は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、もしくは配列番号３７と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド配列、または高ストリンジェントな条件下で配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３５、もしくは配列番号３７にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域；または、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、もしくは配列番号３８と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド配列、または高ストリンジェントな条件下で配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３６、もしくは配列番号３８にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；あるいは、このような重可変領域および軽可変領域の組み合わせをコードする。
本発明は、さらに、本明細書に記載されている抗体または抗原結合部分を発現および／または産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、ハイブリドーマ、およびトランスジェニック植物を提供する。
また、本発明は、本明細書に記載されている１以上の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合部分、場合により、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患、例えば癌の処置または診断に用いるための取扱説明書を含むキットを提供する。
本発明の抗体および抗原結合部分は、多様な治療および診断用途、特に腫瘍用途に用いることができる。したがって、別の局面では、本発明は、ＥＧＦ様の媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するのに十分な量で、本明細書に記載されている１以上の抗体または抗原結合部分を投与することによって、被験体におけるＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する方法を提供する。本発明は、さらに、癌を処置するのに十分な量で、本明細書に記載されている１以上の抗体または抗原結合部分を投与することによって、被験体における種々の癌、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌腫、消化管／結腸癌、肺癌、明細胞肉腫、および前立腺癌を処置する方法を提供する。抗体または抗原結合部分は、単独で、または他の治療薬物、例えば、抗癌剤、例えば他の抗体、化学療法薬および／または放射線と併用して投与され得る。
なお他の態様では、本発明は、ＥｒｂＢ３と関連した疾患（例えば、癌）を診断および予測する方法を提供する。一態様では、これは、本発明の抗体または抗原結合部分（例えば、エクスビボまたはインビボ）と被験体から得られる細胞とを接触させ、細胞上のＥｒｂＢ３への結合レベルを測定することによって達成され、この場合、異常に高いレベルのＥｒｂＢ３への結合は、被験体がＥｒｂＢ３と関連した癌を有することを示す。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、特許請求の範囲から明らかとなる。
図１Ａおよび１Ｂは、ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ ６４７二次抗体を用いて、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞に発現したＥｒｂＢ３に対する、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体候補（Ｆａｂ、本明細書ではＡｂとも称する）の結合を示す棒グラフである。 図１Ａおよび１Ｂは、ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ ６４７二次抗体を用いて、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞に発現したＥｒｂＢ３に対する、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体候補（Ｆａｂ、本明細書ではＡｂとも称する）の結合を示す棒グラフである。 図２Ａ〜２Ｄは、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値を示すグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて測定した、それぞれ抗体＃６（Ａｂ＃６と称する）および抗体＃３（Ａｂ＃３と称する）のＫＤ値を示すグラフである。図２Ｃおよび２Ｄは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞を用いた細胞結合アッセイを用いて測定した、それぞれＡｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値を示すグラフである。 図２Ａ〜２Ｄは、種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の候補のＫＤ値を示すグラフである。図２Ａおよび２Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて測定した、それぞれ抗体＃６（Ａｂ＃６と称する）および抗体＃３（Ａｂ＃３と称する）のＫＤ値を示すグラフである。図２Ｃおよび２Ｄは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞を用いた細胞結合アッセイを用いて測定した、それぞれＡｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡを用いた、ＥｒｂＢ３に対する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の結合特異性を示すグラフである。ＥＧＦＲ、ＢＳＡおよびＴＧＦ−αを対照として用いた。 ＥＬＩＳＡを用いて測定した、インビトロでのＭＡＬＭＥ−３Ｍメラノーマ細胞における全ＥｒｂＢ３レベルを低下させる抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３受容体をダウンレギュレートする抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。図５Ａは、抗体のＩｇＧ１アイソタイプを用いた結果を示す。図５Ｂは、抗体のＩｇＧ２アイソタイプを用いた結果を示す。 図６Ａ−６Ｄは、ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 図６Ａ−６Ｄは、ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、抗体を介したＥｒｂＢ３ダウンレギュレーション（Ａｂ＃６）の時間経過を示すグラフである。 インビボでのメラノーマ細胞におけるＥｒｂＢ３をダウンレギュレートする種々の抗ＥｒｂＢ３抗体の能力を示す棒グラフである。 インビボでのＡＤＲｒ異種移植におけるＥｒｂＢ３をダウンレギュレートする抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示す棒グラフである。 Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏｗアッセイにおけるＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 卵巣細胞系統であるＡＤＲｒにおける細胞増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 ＡＣＨＮ細胞の増殖を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 インビボでのＡＤＲｒ異種移植におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示す棒グラフである。 図１３Ａ−１３Ｃは、ＡＤＲｒ細胞におけるベータセルリンおよびヘレグリンが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１３Ａ−１３Ｃは、ＡＤＲｒ細胞におけるベータセルリンおよびヘレグリンが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１３Ａ−１３Ｃは、ＡＤＲｒ細胞におけるベータセルリンおよびヘレグリンが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１４Ａ−１４Ｂは、卵巣腫瘍細胞系統であるＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。 図１５Ａ−１５Ｃは、ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合の欠失（図１７Ａ）；それぞれ１０ｎＭ（図１７Ｂ）および２００ｎＭ（図１７Ｂ）の濃度でのＥｒｂＢ１陽性ＡＤＲｒ細胞への結合によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにＥｒｂｉｔｕｘによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 図１５Ａ−１５Ｃは、ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合の欠失（図１７Ａ）；それぞれ１０ｎＭ（図１７Ｂ）および２００ｎＭ（図１７Ｂ）の濃度でのＥｒｂＢ１陽性ＡＤＲｒ細胞への結合によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにＥｒｂｉｔｕｘによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 図１５Ａ−１５Ｃは、ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合の欠失（図１７Ａ）；それぞれ１０ｎＭ（図１７Ｂ）および２００ｎＭ（図１７Ｂ）の濃度でのＥｒｂＢ１陽性ＡＤＲｒ細胞への結合によって示される、ＥｒｂＢ１に結合するベータセルリン（ＢＴＣ）の能力、並びにＥｒｂｉｔｕｘによるこのような結合の阻害を示すグラフである。 図１６Ａ−１６Ｂは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞におけるヘレグリンが媒介したシグナル伝達を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６ ＩｇＧ２アイソタイプ）の能力を示すグラフである。図１６Ａは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞におけるヘレグリンが媒介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示し、１６Ｂは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞におけるＡＫＴのリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を示す。 図１７Ａ−Ｄは、異種移植研究を介した、（Ａ）卵巣（ＡＤＲｒ細胞）、（Ｂ）前立腺Ｄｕ１４５細胞）、（Ｃ）卵巣（ＯｖＣＡＲ８細胞）、および（Ｄ）膵臓（Ｃｏｌｏ３５７細胞）腫瘍成長を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１７Ａ−Ｄは、異種移植研究を介した、（Ａ）卵巣（ＡＤＲｒ細胞）、（Ｂ）前立腺Ｄｕ１４５細胞）、（Ｃ）卵巣（ＯｖＣＡＲ８細胞）、および（Ｄ）膵臓（Ｃｏｌｏ３５７細胞）腫瘍成長を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１７Ａ−Ｄは、異種移植研究を介した、（Ａ）卵巣（ＡＤＲｒ細胞）、（Ｂ）前立腺Ｄｕ１４５細胞）、（Ｃ）卵巣（ＯｖＣＡＲ８細胞）、および（Ｄ）膵臓（Ｃｏｌｏ３５７細胞）腫瘍成長を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１７Ａ−Ｄは、異種移植研究を介した、（Ａ）卵巣（ＡＤＲｒ細胞）、（Ｂ）前立腺Ｄｕ１４５細胞）、（Ｃ）卵巣（ＯｖＣＡＲ８細胞）、および（Ｄ）膵臓（Ｃｏｌｏ３５７細胞）腫瘍成長を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の能力を示すグラフである。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＦＡＣＳ分析を用いて測定した、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３へのヘレグリン結合を阻害するＡｂ＃６（図１８Ａ）およびＡｂ＃３のＦａｂ（図１８Ｂ）の能力を示すグラフである。 図１９Ａおよび１９Ｂは、ＡＤＲｒ細胞のＥｒｂＢ３へのエピレグリンの結合を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである。図１９Ａは、ＡＤＲｒ細胞へのエピレグリンの結合を示し、図１９Ｂは、ＡＤＲｒ細胞へのエピレグリン結合を阻害するＥｒｂｉｔｕｘおよびＡｂ＃６の両者の能力を示す。 図２０Ａおよび図２０Ｂは、ＡＤＲｒ細胞のＥｒｂＢに結合するヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の能力（図２０Ａ）、並びにこのような結合を阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６）の不能力（図２０Ｂ）を示すグラフである。 図２１Ａ−２１Ｃは、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列を示す。 図２１Ａ−２１Ｃは、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列を示す。 図２１Ａ−２１Ｃは、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列を示す。 図２２Ａ−２２Ｂは、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、およびＡｂ＃１４の可変重鎖および軽鎖領域のヌクレオチド配列を示す。 図２２Ａ−２２Ｂは、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃３、およびＡｂ＃１４の可変重鎖および軽鎖領域のヌクレオチド配列を示す。 図２３は、対応する生殖細胞系列のアミノ酸配列に戻された、抗体：Ａｂ＃６、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９の可変軽鎖領域のアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基の変化に下線が付される。 図２４Ａ−２４Ｃは、腫瘍細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである。 図２４Ａ−２４Ｃは、腫瘍細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである。 図２４Ａ−２４Ｃは、腫瘍細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を示すグラフである。 細胞移動におけるＡｂ＃６の効果を示すグラフである。 図２６Ａ−Ｃは、（Ａ）ＡｄｒＲ細胞におけるスフェロイド増殖の阻害、（Ｂ）ＡｄｒＲにおけるＨＲＧ誘導のスフェロイド増殖の阻害、および（Ｃ）Ｄｕ１４５細胞におけるＨＲＧ誘導のスフェロイド増殖の阻害を示すグラフである。 図２７ＡおよびＢは、ＡｄｒＲ細胞への（Ａ）ＨＲＧおよび（Ｂ）ＢＴＣの結合に対するＡｂ＃６の効果を示すグラフである。 ＨＧＦ誘導のＥｒｂＢ３リン酸化におけるＡｂ＃６の効果を示すグラフである。 図２９ＡおよびＢは、（Ａ）ｐＥｒｂＢ１とｐＥｒｂＢ３、並びに（Ｂ）ＨＲＧ誘導のＥｒｂＢ２／３複合体形成のリン酸化におけるＡｂ＃６の効果を示す。 Ａｂ＃６がＥｒｂＢ３のアミノ酸残基２０−２０２に結合することを示すグラフである。
本発明がより容易に理解され得るために、ある種の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な記載を通じて示されている。
Ｉ．定義
用語「ＥｒｂＢ３」、「ＨＥＲ３」、「ＥｒｂＢ３受容体」、および「ＨＥＲ３受容体」とは、本明細書中で互換可能に使用されるとき、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質を指し、米国特許第５，４８０，９６８号、並びにＰｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４９０５−４９０９（１９９０）に記載されている；また、Ｋａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：１５８４２−８５７（２００５），ＣｈｏおよびＬｅａｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１３３０−１３３３（２００２））を参照されたい。
用語「ＥＧＦ様リガンド」とは、本明細書中で使用するとき、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のリガンドを指し、それには、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）および密接に関連したタンパク質、例えば形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ビレグリン（ＢＩＲ）およびアンフィレグリン（ＡＲ）が含まれ、それらは、細胞表面のＥＧＦＲに結合し、受容体の内在性のタンパク質−チロシンキナーゼ活性を刺激する。具体的には、ＥＧＦ様リガンドは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１とも称する）とＥｒｂＢ３タンパク質との複合体の形成を誘導し（例えば、Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３３４：１８９−１９５を参照されたい）、複合体に含まれるチロシン残基のリン酸化をもたらす。
本発明の抗体およびその抗原結合部分は、ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害し、ある種の態様では、１以上の下記の追加の特徴を示す：（ｉ）ＥｒｂＢ３を介した１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリン（ＢＩＲ）に媒介されるシグナル伝達の阻害；（ｉｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖阻害；（ｉｉｉ）細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力；（ｉｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害；（ｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（ｖｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および／または（ｖｉｉ）ＥｒｂＢ３のドメインＩに位置したエピトープ、例えば、ＥｒｂＢ３のアミノ酸配列の残基２０−２０２を含むかまたはそれにかかっているエピトープへの結合。
用語「阻害」とは、本明細書中で使用するとき、活性の完全なブロックを含む生物学的活性のいずれかの統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指すことができる。
したがって、句「ＥＧＦ様リガンドを介したＥｒｂＢ３のリン酸化の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、未処理（対照）細胞におけるリン酸化と比較して、ＥＧＦ様リガンドによって誘導されたＥｒｂＢ３のリン酸化を統計的に有意に減少させる、抗体または抗原結合部分の能力を指す。ＥｒｂＢ３を発現している細胞は、自然に存在している細胞または細胞系統であってもよく、あるいは、宿主細胞へのＥｒｂＢ３をコードする核酸を導入することによって組換え的に生産されてもよい。一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％までＥＧＦ様リガンドによって媒介されるＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害し、それは、例えば、Ｋｉｍら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３３４：１８９−１９５、並びに以下の実施例に記載されるウェスタンブロッティング、続く、抗ホスホチロシン抗体を用いた探査によって測定される。
句「ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンに媒介されるシグナル伝達の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合（対照）のシグナル伝達と比較して、ＥｒｂＢ３を通したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリン）によって媒介されたシグナル伝達を統計的に有意に減少させる、抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。また、ＥｒｂＢ３リガンドは、本明細書において「ヘレグリン様リガンド」とも称される。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在下において、対照（抗体なし）と比較して、ＥｒｂＢ３を発現細胞における、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンおよびビレグリンによって媒介されるシグナルが統計的に有意に減少されることを意味する。ＥｒｂＢ３リガンド媒介のシグナルは、ＥｒｂＢ３基質、および／またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードに存在するタンパク質のレベルまたは活性を評価することによって測定することができる。一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３基質のレベルもしくは活性、および／またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードに存在するタンパク質のレベルもしくは活性を、そのような抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）のレベルまたは活性と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少させる。このようなＥｒｂＢ３リガンド媒介のシグナル伝達は、ＥｒｂＢ３の基質（例えば、ＳＨＣもしくはＰＩ３Ｋ）、またはＥｒｂＢ３と関係する細胞カスケードのタンパク質（例えば、ＡＫＴ）を、このようなタンパク質のためのキナーゼアッセイを用いて測定する従来認識されている技術を用いて測定することができる（例えば、Ｈｏｒｓｔら．上掲，Ｓｕｄｏら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２２：３８８−９２；並びに、Ｍｏｒｇａｎら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：７６１−７６７を参照されたい）。
特定の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３へのＥｒｂＢ３リガンド（例えば、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を阻害することによって、ＥｒｂＢ３を介したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達を阻害する。いくつかのリガンド（例えば、ビレグリンまたはＢＩＲ）は、ＥＧＦ様リガンド（即ち、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１に結合する）として、並びにＥｒｂＢ３様リガンド（即ち、ＥｒｂＢ３に結合する）として両方に機能する。
句「ＥｒｂＢ３へのヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合における結合（対照）と比較して、ＥｒｂＢ３へのＥｒｂＢ３リガンド（例えば、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在下において、対照（抗体なし）と比較して、ＥｒｂＢ３に結合するＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の量が統計的に有意に減少されることを意味する。ＥｒｂＢ３を結合するＥｒｂＢ３リガンドの量は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の存在下において、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）の量と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少させることができる。ＥｒｂＢ３リガンドの結合の減少は、抗体またはその抗原結合部分の存在または欠如（対照）において、ＥｒｂＢ３を発現している細胞への標識されたＥｒｂＢ３リガンド（例えば、放射線同元素標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ）ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合レベルを測定する従来認識される技術を用いて測定することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合における増殖と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。一態様では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の増殖は、細胞が本発明の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）において測定された増殖と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少され得る。細胞増殖は、（例えば、細胞力価増殖アッセイまたはチミジン取り込みを用いて）細胞分裂の速度、細胞分裂を行っている細胞集団内の細胞の分画、および／または最終分化もしくは細胞死による細胞集団からの細胞損失の率を測定する従来認識されている技術を用いて評価することができる。
句「細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少させる能力」とは、本明細書中で使用するとき、未処理（対照）細胞と比較して、抗体に晒された細胞の表面に見いだされるＥｒｂＢ３の量を統計的に有意に低下させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。例えば、細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルの減少は、ＥｒｂＢ３の内在化の増加（またはＥｒｂＢ３のエンドサイトーシスの増加）に起因する場合がある。一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）の細胞表面発現または内在化と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％までＥｒｂＢ３の細胞表面発現を減少させ、および／または少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％までＥｒｂＢ３受容体の内在化を増加させる。抗体またはその抗原結合部分の欠如および存在における細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルおよび／またはＥｒｂＢ３受容体の内在化は、従来認識されている技術、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲、並びに本明細書中の実施例に記載される技術を用いて容易に測定することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合のＶＥＧＦ分泌と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。一態様では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）のＶＥＧＦ分泌は、細胞が本発明の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）において測定されたＶＥＧＦ分泌と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。ＶＥＧＦ分泌は、本明細書に記載される技術などの従来認識されている技術を用いて評価することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合における細胞の移動と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。一態様では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の移動は、細胞が本発明の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）において測定された細胞移動と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。細胞移動は、本明細書に記載される技術などの従来認識されている技術を用いて評価することができる。
句「ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害」とは、本明細書中で使用するとき、抗体が存在しない場合における細胞の移動と比較して、ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動を統計的に有意に減少させる抗体またはその抗原結合部分の能力を指す。一態様では、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の移動は、細胞が本発明の抗体またはその抗原結合部分と接触されると、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合（対照）に測定される細胞移動と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％まで減少されてもよい。細胞移動は、本明細書に記載される技術などの従来認識されている技術を用いて評価することができる。用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書中において互換可能に使用するとき、全抗体、その任意の抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬから構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、それらは、下記：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で、アミノ末端からカルボキシ末端に整列されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）などの宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。本発明の典型的な抗体には、抗体＃１、３および１４、並びにその抗原結合部分が含まれる。
抗体の「抗原結合部分」（または、単に「抗体部分」）なる用語は、本明細書中で使用するとき、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって行われ得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨおよびＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６）；（ｖｉｉ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ；（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｉｘ）場合により合成リンカーによって接続されてもよい２以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、一価の分子を形成させるためにＶＬおよびＶＨ領域が対となる単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３−４２６；並びに、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，５８７９−５８８３、を参照されたい）としてそれらを作製することができる合成リンカーによって接続され得る。また、このような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、断片は、完全な抗体と同じような有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用するとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であって、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して指向される。モノクローナル抗体は、任意の従来認識されている技術、および本明細書に記載されている技術、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されるハイブリドーマ法、例えば、（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照）によって記載されるトランスジェニック動物、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）を用いて、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、並びに、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いるファージ抗体ライブラリーを用いて調製することができる。モノクローナル抗体には、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体が含まれ、自然に存在するかまたは組換え的に生成されてもよい。
用語「組換え抗体」は、組換え手法によって調製、発現、作製または単離された抗体を指し、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）に対してトランスジェニックであるかもしくは導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）、またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するために形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）ファージディスプレイを用いた組換え、コンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離された抗体、（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のスプライシグを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体が挙げられる。このような組換え抗体は、ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列から得られる可変領域および定常領域を含んでもよい。しかしながら、ある種の態様では、このような組換えヒト抗体は、インビトロの変異誘発に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、およびそれらと関連するが、インビボでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリーには、自然に存在しない場合がある。
用語「キメラ免疫グロブリン」またはキメラ抗体とは、可変領域が第１の種由来であり、定常領域が第２の種由来である免疫グロブリンまたは抗体を指す。キメラ免疫グロブリンまたはキメラ抗体は、例えば、遺伝子操作によって、異種に属する免疫グロブリン遺伝子のセグメントから構築することができる。
用語「ヒト抗体」とは、本明細書中で使用するとき、フレームワーク領域とＣＤＲ領域との両方が、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）によって記載されるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書中で使用するとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列から得られるＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移入された抗体を含むことは意図されない。
ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていない、活性を高めるアミノ酸残基で置換された少なくとも１以上のアミノ酸を有することができる。典型的には、ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列の部分ではないアミノ酸残基で置換された最大２０箇所を有することができる。特定の態様では、これらの置換は、下記に詳述されるように、ＣＤＲ領域内にある。
用語「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖（即ち、少なくとも１つのヒト化軽鎖または重鎖）を含む免疫グロブリンまたは抗体を指す。用語「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（即ち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）とは、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体から得られる可変フレームワーク領域、および実質的にはヒトでない免疫グロブリンまたは抗体から得られる複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）を含み、さらに、定常領域（例えば、軽鎖の場合には少なくとも１つの定常領域またはその部分、好ましくは重鎖の場合には３つの定常領域）を含む可変領域を有する免疫グロブリンまたは抗体鎖（即ち、それぞれ軽鎖または重鎖）を指す。用語「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）とは、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体から得られる可変フレームワーク領域、および実質的にヒトでない免疫グロブリンまたは抗体から得られる複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を指す。
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９，３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照されたい。特定の態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３とＩＧＦ１−Ｒ（即ち、インスリン様増殖因子１−受容体）との両方に対する結合部位を含む。別の態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３とＣ−ＭＥＴとの両方に対する結合部位を含む。他の態様では、二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に対する結合部位、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ、ルイスＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、Ｃ−ＫＩＴ、または任意のＦＧＦ受容体に対する結合部位を含む。
本明細書中で使用するとき、「異種抗体」は、このような抗体を生成するトランスジェニック非ヒト生物または植物に関して定義される。
「単離された抗体」とは、本明細書中で使用するとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する単離された抗体は、ＥｒｂＢ３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことが意図される。さらに、単離された抗体は、典型的には、他の細胞の材料および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一態様では、異なるＥｒｂＢ３結合特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、明確な組成物に組み合わせられる。
本明細書中で使用するとき、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体アイソタイプから選択されるアイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。ある態様では、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。他の態様では、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体またはその抗原結合部分である。
本明細書中で使用するとき、「アイソタイプスイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」とは、抗体のクラス、またはアイソタイプが、１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスのうちの１つに変化する現象を指す。
本明細書中で使用するとき、「スイッチされないアイソタイプ（ｎｏｎｓｗｉｔｃｈｅｄ ｉｓｏｔｙｐｅ）」とは、アイソタイプスイッチングが起こらない場合に生成される重鎖のアイソタイプクラスを指す；スイッチされないアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には、機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流にある第１のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチングは、古典的または非古典的なアイソタイプスイッチングとして分類されている。古典的なアイソタイプスイッチングは、抗体をコードする遺伝子の少なくとも１つのスイッチ配列領域を含む組換え事象によって発生する。非古典的なアイソタイプスイッチングは、例えば、ヒトσμとヒトΣμ（δ−関連欠失）との間の相同組換えによって発生する場合がある。とりわけ、トランスジーン間（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｇｅｎｅ）および／または染色体間（ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）の組換えなどの代替の非古典的なスイッチングメカニズムが発生し、アイソタイプスイッチングを生じさせる場合がある。
本明細書中で使用するとき、用語「スイッチ配列」とは、スイッチ組換えに関与するそれらのＤＮＡ配列を指す。「スイッチドナー」配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるコンストラクト領域の５’（即ち、上流）である。「スイッチアクセプター」領域は、欠失されるコンストラクト領域と置換定常領域（例えば、γ、εなど）との間にある。組換えがいつも起こる特定の部位は存在しないため、最終の遺伝子配列は、典型的には、コンストラクトから予測され得ない。
「抗原」は、抗体またはその抗原結合部分が結合する実体（例えば、タンパク性実体またはペプチド）である。本発明の種々の態様では、抗原は、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ３様分子である。本発明に係る特定の態様では、抗原はヒトＥｒｂＢ３である。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両者から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露に対して保持され、そこでは三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理に対して消失する。エピトープは、典型的には、独自の１つの空間構造にある少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を測定する方法には、当該技術分野における技術、および本明細書に記載される技術、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
また、本発明の抗体と同じであるかまたは重複しているエピトープに結合する抗体、即ち、ＥｒｂＢ３への結合に競合するか、または本明細書に記載される抗体によって結合されるエピトープ、即ち、ＥｒｂＢ３のドメインＩに位置したエピトープと重複するエピトープに結合する抗体が本発明に包含される。同じエピトープを認識する抗体は、例えば標的抗原への別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示すことによる免疫アッセイ、即ち、競合結合アッセイなどの日常的な技術を用いて同定することができる。競合結合は、試験用の免疫グロブリンがＥｒｂＢ３などの共通の抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて測定される。多数のタイプの競合結合アッセイが知られている。例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４を参照されたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら（１９９０）Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７）が挙げられる。典型的には、このようなアッセイは、これらの未標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンのいずれかを持つ固体表面または細胞に結合された精製された抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）の使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で、固体表面または細胞に結合された標識量を測定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在している。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％７０〜７５％以上まで、参照抗体による共通抗原への特異的結合を阻害する。
本明細書中で使用するとき、用語「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、および「選択的に結合する」とは、抗体またはその抗原結合部分が特定の抗原またはエピトープに感知できる（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ）親和性を示し、一般に、他の抗原およびエピトープとは有意な交差反応を示さないことを意味する。「感知できる」または好ましい結合には、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性を有する結合が含まれる。１０７Ｍ−１を超える親和性、好ましくは１０８Ｍ−１を超える親和性がより好ましい。また、本明細書に記載されている値の中間の値も本発明の範囲内にあることが意図され、好ましい結合親和性は、親和性の範囲、例えば、１０６〜１０１０Ｍ−１、好ましくは１０７〜１０１０Ｍ−１、より好ましくは１０８〜１０１０Ｍ−１として指示され得る。「有意な交差反応を示さない」抗体は、望ましくない実体（例えば、望ましくないタンパク性実体）に感知可能に結合されないものである。例えば、一態様では、ＥｒｂＢ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、そのＥｒｂＢ３分子に感知可能に結合するが、他のＥｒｂＢ分子および非ＥｒｂＢタンパク質またはペプチドとは有意に反応しない。特異的または選択的結合は、このような結合を測定するための任意の従来認識されている手段にしたがって、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイにしたがって測定することができる。
用語「ＫＤ」とは、本明細書中で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に対する抗体の親和性を指すことが意図される。一態様では、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分は、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に結合し、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定すると、親和性（ＫＤ）は５０ｎＭまたはそれよりも良好（即ち、小さい）（例えば、４０ｎＭまたは３０ｎＭまたは２０ｎＭまたは１０ｎＭまたはそれよりも小さい）である。特定の態様では、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３に結合し、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを用いて測定すると、親和性（ＫＤ）は８ｎＭまたはそれよりも良好（例えば、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１ｎＭまたはそれよりも小さい）である。他の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に結合し、親和性（ＫＤ）は、分析物として組換えＥｒｂＢ３とリガンドとして抗体を用いたＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定すると、約１０−７Ｍ未満、例えば、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはそれよりもさらに低く、この抗体またはその抗原結合部分は、所定の抗原に結合し、親和性は、所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい。
用語「Ｋｏｆｆ」とは、本明細書中で使用するとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するｏｆｆ速度定数を指すことが意図される。
用語「ＥＣ５０」とは、本明細書中で使用するとき、インビトロアッセイまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大応答の５０％、即ち、最大応答とベースラインとの間の中間である、応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
本明細書中で使用するとき、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合で結合される炭水化物単位のパターンとして定義される。
用語「自然に存在する」とは、本明細書中で使用するとき、被験体に適用される場合、被験体が自然に見出され得る事実を指す。例えば、有機体（ウイルスを含む）に存在し、自然の供給源から単離することができ、実験室にいる者によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は自然に存在する。
用語「再配列された」とは、本明細書中で使用するとき、重鎖または軽鎖免疫グロブリンの座（ｌｏｃｕｓ）の立体配置を指し、ここで、Ｖセグメントは、それぞれ完全なＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードする立体配座におけるＤ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して位置される。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞系列ＤＮＡと比較することによって同定することができる；再配列された座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体の相同エレメントを有する。
用語「再配列されていない」または「生殖細胞系列の立体配置」とは、Ｖセグメントと関連して本明細書中で使用するとき、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントと直接隣接するようには組み換えられていない立体配置を指す。
用語「核酸分子」とは、本明細書中で使用するとき、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
用語「単離された核酸分子」とは、ＥｒｂＢ３に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連して本明細書中で使用するとき、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＥｒｂＢ３以外の抗原に結合する抗体をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を指すことが意図され、その場合、他の配列は、ヒトゲノムＤＮＡの核酸の側面に自然に位置してもよい。
用語「改変すること」または「改変」とは、本明細書中で使用するとき、抗体またはその抗原結合部分において１以上のアミノ酸を変化させることを指すことが意図される。この変化は、１以上の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失させることによって生じさせることができる。この変化は、ＰＣＲ変異誘発などの知られている技術を用いて生じさせることができる。例えば、ある態様では、本発明の方法を用いて同定された抗体またはその抗原結合部分は改変され、それによって、ＥｒｂＢ３に対する抗体またはその抗原結合部分の結合親和性を改変することができる。
また、本発明は、本発明の抗体の配列において「保存アミノ酸置換」、即ち、抗原、即ちＥｒｂＢ３に対する、ヌクレオチド配列によってコードされる抗体、またはＥｒｂＢ３に対するアミノ酸配列を含む抗体の結合を無効にしないヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変を含む。保存アミノ酸置換には、同じクラスのアミノ酸による、あるクラスのアミノ酸の置換が含まれ、この場合、クラスは、例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスによって測定すると、自然に見いだされる相同なタンパク質における共通の物理化学的なアミノ酸配列特性および高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の６個の一般的なクラスが分類され、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；クラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基によるＡｓｐの置換は、保存置換である。このようにして、抗ＥｒｂＢ３抗体における予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスから得られる別のアミノ酸残基により置換される。抗原結合をなくさないヌクレオチドおよびアミノ酸保存置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；並びに、Ｂｕｒｋｓら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
用語「非保存アミノ酸置換」とは、別のクラスから得られるアミノ酸を用いた１つのクラスのアミノ酸の置換を指す：例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎなどのクラスＩＩＩ残基を用いて、クラスＩＩ残基であるＡｌａの置換が挙げられる。
あるいは、別の態様では、変異（保存または非保存）は、飽和変異誘発によるなどの抗ＥｒｂＢ３抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、無作為に導入することができ、得られた改変された抗ＥｒｂＢ３抗体は、結合活性についてスクリーニングされ得る。
「コンセンサス配列」は、関連する配列のファミリーにおける最も頻繁に発生するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列である（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）を参照されたい。タンパク質のファミリーでは、コンセンサス配列の各位置は、ファミリーのその位置で最も頻繁に発生するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸は等しく頻繁に発生する場合、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。免疫グロブリンの「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。
同様に、ＣＤＲに対するコンセンサス配列は、本発明のＥｒｂＢ３抗体のＣＤＲアミノ酸配列の最適アラインメントによって誘導することができる。
核酸に関して、用語「実質的に相同な」は、２つの核酸、またはその指定された配列が、最適に整列および比較された場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を含み、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％で同一であることを示す。あるいは、実質的な相同性は、鎖（ｓｔｒａｎｄ）の相補体に対して、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（即ち、相同性％＝同一の位置の数／位置の全体の数×１００）であり、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、２つの配列の最適アラインメントに対して導入される必要がある。配列の比較、および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非制限的な実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）を用いて、ＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを使用して測定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）、４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入された、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム内に組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて決定できる。
さらに、本発明の核酸およびタンパク質の配列は、例えば、関連した配列を同定するために、公的なデータベースに対する検索を実施するための、「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として用いることができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行可能である。比較を目的としたギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用可能である。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、標準的な技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、当該技術分野において周知である他の技術によって、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から切り離して精製された場合、「単離されている」または「実質的に純粋の状態にある」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。
本発明の核酸組成物は、多くの場合、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはそれらの混合物のいずれかから天然の配列（改変された制限部位などを除く）にあるが、遺伝子配列を与えるために標準的な技術に従って変異させることができる。コーディング配列については、これらの変異は、目的どおりにアミノ酸配列に影響を与えることができる。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ、および本明細書に記載される他のこのような配列に実質的に相同であるかまたはそれらから得られるＤＮＡ配列が意図される（この場合、「由来する」は、配列が別の配列と同一であるかまたは改変されることを示す）。
用語「操作可能に連結されている」とは、別の核酸配列と機能的な関連性があるように配置されている核酸配列を指す。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現される場合、このＤＮＡは該ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーが、コーディング配列の転写に影響を与える場合、それらは該コーディング配列に操作可能に連結されている；またはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように位置されている場合、それはコーディング配列に操作可能に連結されている。一般的に、「操作可能に連結されている」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合には、隣接し、読み取られる状態にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、慣用の実施に従って用いられる。核酸は、別の核酸配列と機能的な関連性があるように置かれている場合に「操作可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に操作可能に連結されている。転写制御配列に関して、操作可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接し、２つのタンパク質のコーディング領域を連結することが必要なところでは、隣接し、読み取りフレームにあることを意味する。スイッチ配列に関して、操作可能に連結されているとは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用するとき、それが連結されている別の核酸の輸送を可能にする核酸分子を指すことが意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントが連結されてもよい環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指向することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用性のある発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。用語「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に用いられてもよい。しかしながら、本発明は、同等の機能を供給するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのこのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）とは、本明細書中で使用するとき、組換え発現ベクターが導入される細胞を指すことが意図される。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫を指すことが意図される。ある種の改変は、変異または環境の影響のいずれかにより、続く世代において発生する場合があるため、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、なおも、本明細書中で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」とは、本明細書で使用するとき、本明細書に記載される治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、疾患もしくは障害または再発性の疾患もしくは障害の１以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度の減少、または改善するために、あるいは、このような処置がない場合に期待されるものを超えて被験体の生存を延長するために、被験体に、例えば、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患または障害を患っている被験体、またはこのような疾患または障害を患い易い被験体への本発明の抗体または抗原結合部分の投与に使用する。
用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」、または「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した障害」には、本明細書中で使用するとき、ＥｒｂＢ３のレベル上昇および／またはＥｒｂＢ３が関与した細胞カスケードの活性化が見られる疾患状態および／または疾患状態と関連した症状が含まれる。ＥｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ３のレベル上昇が見られる場合に、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２などの他のＥｒｂＢタンパク質と異種二量化するものと理解されている。したがって、用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」にも、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３異種二量体のレベル上昇が見られる疾患状態および／または疾患状態と関連した症状が含まれる。一般に、用語「ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患」とは、ＥｒｂＢ３の関与を必要とする任意の障害、症状の開始、進行または持続を指す。例示的なＥｒｂＢ３媒介の障害には、限定されないが、例えば、癌が含まれる。
用語「癌」および「癌性」とは、典型的には、制御されない細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたはそれを記載するものである。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア芽腫および神経線維腫症などのグリア細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、メラノーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性の癌腫、および種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。特定の態様では、本発明の方法を用いて処置または診断される癌は、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌腫、胃腸／結腸癌、肺癌、および前立腺癌から選択される。
用語「有効な量」とは、本明細書中で使用するとき、被験体に投与された場合、本明細書に記載されるように、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患の処置、予測または診断を達成させるのに十分である、ＥｒｂＢ３に結合する抗体またはその抗原結合部分の量を指す。治療的に有効な量は、当業者によって容易に測定され得る、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに依存して変化する。投与のための投薬量は、例えば、本発明に係る抗体またはその抗原結合部分の約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ、または約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇの範囲であり得る。投薬計画は、最適な治療応答を与えるように調整されてもよい。また、有効な量は、抗体またはその抗原結合部の任意の毒性または有害な影響（即ち、副作用）が最小化され、および／または有益な効果が上回るものである。
用語「患者」とは、予防的または治療的処置のいずれかを受けているヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。
本明細書中で使用するとき、用語「被験体」には、いずれかのヒトまたはヒト以外の動物が含まれる。例えば、本発明の方法および組成物は、癌を患っている被験体を処置するために用いることができる。特定の態様では、被験体はヒトである。用語「ヒト以外の動物」には、全ての脊椎動物が含まれ、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。
用語「試料」とは、患者または被験体からの組織、体液、または細胞を指す。通常、組織または細胞は、患者から取り出されるが、インビボでの診断も意図される。固形腫瘍の場合には、組織試料は、外科的に取り出された腫瘍から採取することができ、従来技術によって試験のために調製することができる。リンパ腫および白血病の場合には、リンパ球、白血病細胞、またはリンパ組織が得られ、適切に調製することができる。また、尿、涙、血清、脳脊髄液、糞便、痰、細胞抽出物などを含む他の患者試料も特定の腫瘍については有用であり得る。
用語「抗癌剤」および「抗腫瘍剤」とは、癌性増殖などの悪性腫瘍を処置するために用いられる薬物を指す。薬物治療は、単独で、または外科的処置もしくは放射線治療などの他の処置と併用して用いられてもよい。いくつかのクラスの薬物は、関与する臓器の性質に依存して、癌処置に用いることができる。例えば、乳癌は、通常、エストロゲンによって刺激され、性ホルモンを不活性化する薬物で処置されてもよい。同様に、前立腺癌は、男性ホルモンであるアンドロゲンを不活性化する薬物で処置されてもよい。本発明の抗癌剤には、とりわけ、下記の薬物が含まれる。
１以上の抗癌剤は、本発明の抗体またはその抗原結合部の投与と同時またはその前またはその後に投与されてもよい。
本発明の種々の局面が、下記の小節においてさらに詳細に記載されている。
ＩＩ．本発明の抗体を生成する方法
（ｉ）モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、種々の知られている技術、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載される標準的な体細胞のハイブリダイゼーション技術、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換またはヒト抗体遺伝子のライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を用いて生成することができる。特定の態様では、抗体は、完全なヒトモノクローナル抗体である。
したがって、一態様では、ハイブリドーマ法は、ＥｒｂＢ３に結合する抗体を生成するために用いられる。この方法では、免疫付与のために用いられる抗原に特異的に結合する抗体を生成するかまたはそれを生成することができるリンパ球を誘発するために、適切な抗原を用いて、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫することができる。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫されてもよい。次に、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成させるために、ポリエチレングリコールなどの適した融合剤を用いて、ミエローマ細胞と融合することができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、抗原に指向されたモノクローナル抗体の生産について評価される。所望の特異性、親和性、および／または活性のある抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし得、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培池が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から分離することができる。
別の態様では、ＥｒｂＢ３に結合する抗体および抗体部分は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）．Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１），Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、並びにＨｏｅｔら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，３４４−３４８；Ｌａｄｎｅｒらに関する米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８；Ｄｏｗｅｒらに関する米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに関する米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号；並びに、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらに関する米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号および同第６，５９３，０８１号に記載される技術を用いて生じさせた抗体ファージライブラリーから単離することができる。さらに、チェインシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、並びに非常に巨大なファージライブラリー（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を構築するための戦略としてのコンビナトリアルインフェクションおよびインビボでの組換えによる高親和性（ｎＭレンジ）のヒト抗体の生成も用いてもよい。
特定の態様では、ＥｒｂＢ３に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部は、Ｈｏｅｔら、上掲、によって記載されるファージディスプレイ技術を用いて生産される。この技術は、ヒトドナーから単離された免疫グロブリン配列の独特の組み合わせを有し、重鎖ＣＤＲにおける合成多様性を有するヒトＦａｂライブラリーの産生を含む。次に、このライブラリーは、ＥｒｂＢ３に結合するＦａｂについてスクリーニングされる。
さらに別の態様では、ＥｒｂＢ３に指向されるヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニックまたはトランス染色体マウスを用いて産生することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４），上掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１に概説される；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３、並びに、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６を参照されたい。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに関する米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらに関する米国特許第５，５４５，８０７号；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに関するＰＣＴ国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号および同第９９／４５９６２号；並びに、Ｋｏｒｍａｎらに関するＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい）。
別の態様では、本発明のヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランス染色体にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えば、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を担持するマウスを用いて生じさせることができる（例えば、Ｉｓｈｉｄａらに関するＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号を参照されたい）。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系は、当該技術分野において利用可能であり、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を生じさせるために用いることができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）として言われているトランスジェニック系を用いることができる；このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに関する米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランス染色体の動物系は、当該技術分野において利用可能であり、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を生じさせるために用いることができる。例えば、ヒト重鎖トランス染色体とヒト軽鎖トランス染色体の両方を担持するマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７に記載されるように用いることができる。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を担持するウシは、当該技術分野（Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４）において記載されており、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を生じさせるために用いることができる。
なお別の態様では、本発明の抗体は、このような抗体を生成するトランスジェニック植物および／または培養された植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシおよびアオウキクサ）を用いて調製することができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニックタバコの葉は、例えば、誘導プロモーターを用いることによって、このような抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｃｒａｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５ １１８（１９９９）を参照されたい）。また、トランスジェニックトウモロコシを用いて、このような抗体およびその抗原結合部分を発現させることができる（例えば、Ｈｏｏｄら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．４６４：１２７ １４７（１９９９）を参照されたい）。また、抗体は、例えば、タバコの種子およびジャガイモ塊茎を用いて、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体部分を含むトランスジェニック植物種子から大量に生成することができる（例えば、Ｃｏｎｒａｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１ １０９（１９９８）を参照されたい）。また、植物における抗体または抗原結合部分を生成する方法は、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９ １０８（１９９９）Ｍａら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２ ７（１９９５）；Ｍａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１ ６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０ ９４４（１９９４）、並びに米国特許第６，０４０，４９８号および同第６，８１５，１８４号に見出すことができる。
本明細書に開示された技術を含むいずれかの技術を用いて調製されたＥｒｂＢ３に結合するモノクローナル抗体またはその部分の結合特異性は、免疫沈降によるか、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などインビトロの結合アッセイによって測定することができる。また、モノクローナル抗体またはその部分の結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
ある種の態様では、上記で検討された方法のいずれかを用いることによって生成されたＥｒｂＢ３抗体またはその部分は、本明細書に記載される技術などの従来認識されている技術を用いて、所望の結合特異性および／または親和性を達成するためにさらに変更または最適化されてもよい。
一態様では、ＥｒｂＢ３抗体から得られる部分的な抗体配列は、構造的および機能的に関連した抗体を生成するために用いられてもよい。例えば、抗体は、６個の重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置されるアミノ酸残基を主に介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲを除く配列よりも各抗体間でより様的である。ＣＤＲ配列は、大部分の抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列に移入された特定の自然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の自然に存在している抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；および、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得ることができる。
このようにして、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体の１以上の構造的特徴、例えばＣＤＲは、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特徴、例えば、ＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害すること；ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン媒介のシグナル伝達の１以上を阻害すること；増殖またはＥｒｂＢ３を発現している細胞を阻害すること；および／または細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少させることを保持している、構造的に関連した抗ＥｒｂＢ３抗体を作製するために用いることができる。
特定の態様では、配列番号７〜１２、配列番号１３〜１８、配列番号１９〜２４、配列番号３９〜４４、および配列番号４５〜５０から選択される１以上のＣＤＲ領域は、知られているヒトのフレームワーク領域およびＣＤＲを用いて組換え的に組み合わさって、追加的な組換え操作されて本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を作製する。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同一であるかまたは異なった抗体配列から得ることができる。
抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ，１４９：１６０５−１６１２（１９９２）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３１８−５３２９（１９９４）；Ｊａｈｎら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ，１９３：４００−４１９（１９９５）；Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ＳｃＬ ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｄｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７：７３９−７４９（１９９６）を参照されたい）。したがって、ある種の態様では、本明細書に記載される特定の抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ（例えば、配列番号９、１５、２１、４１、４７および／または配列番号１２、１８、２４、４４、５０）を含む抗体が産生される。抗体は、さらに、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２（例えば、配列番号７〜８および／または配列番号１０〜１１；配列番号１３〜１４および／または配列番号１６〜１７；配列番号２０〜２１および／または配列番号２２〜２３；配列番号３９〜４０および／または配列番号４２〜４３；配列番号４５〜４６および／または配列番号４８〜４９）を含むことができる。
上記される操作された抗体のＣＤＲ１、２、および／または３領域は、本明細書中に開示されるものとして正確なアミノ酸配列（単数または複数）（例えば、配列番号７〜１２、１３〜１８、１９〜２４、３９〜４４、および４５〜５０に記載される、それぞれＡｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、またはＡｂ＃１９のＣＤＲ）を含むことができる。しかしながら、当業者は、効果的にＥｒｂＢ３に結合する抗体の能力をなおも保持しながら、正確なＣＤＲ配列からのいくつかの逸脱は可能であり得ることを承認する（例えば、保存的アミノ酸置換）。したがって、別の態様では、操作された抗体は、例えば、Ａｂ＃６、Ａｂ＃３またはＡｂ＃１４の１以上の１以上のＣＤＲに対して、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％同一である１以上のＣＤＲから構成されてもよい。
別の態様では、ＣＤＲの１以上の残基は、より特別な結合のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）を達成するために、結合を改変するように変更されてもよい。この戦略を用いて、例えば１０１０Ｍ−１以上である極めて高い結合親和性を有する抗体が達成され得る。当該技術分野において周知である親和性成熟技術、並びに本明細書に記載されている技術を用いて、ＣＤＲ領域（単数または複数）を変更することができ、その後、結合における所望の変化について、得られた結合分子をスクリーニングする。あるいは、ＣＤＲ（単数または複数）が変更されるため、結合親和性並びに免疫原性の変化は、抗体が最良の組み合わせ結合に対して最適化された抗体、および低い免疫原性が達成されるようにモニターされ、スコア化できる。
ＣＤＲ内の改変に加えて、またはそれに代えて、これらの改変が抗体の結合親和性を排除する限り、改変も、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域の１以上のフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４内で行われ得る。
別の態様では、抗体は、例えば、癌の処置における抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して、さらに改変される。たとえば、システイン残基（単数または複数）は、Ｆｃ領域に導入されてもよく、それにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして産生されたホモ二量化抗体は、内在化能力改善し、および／または補体媒介の細胞死および抗体に依存した細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増加させる場合がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）、並びにＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。また、抗腫瘍活性が高まったホモ二量化抗体は、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を高めた可能性がある抗体が操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
また、下記に記載される二重特異性抗体および免疫結合体も本発明に包含される。
（ｉｉ）二重特異性抗体
本発明の二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に対する少なくとも１つの結合特異性、および癌遺伝子の生成物などの別の抗原に対する少なくとも１つの結合特異性を含む。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、国際公開第０５１１７９７３号および同第０６０９１２０９号を参照されたい）。例えば、全長の二重特異性抗体の生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくことができ、この場合、２つの鎖は、異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）を参照されたい）。二重特異性抗体を生じさせるための更なる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）、並びに、二重特異性抗体を作製するための化学的連結法を記載するＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）に見いだすことができる。また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されている（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略が報告されている（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）。
特定の態様では、二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３に結合する第１抗体またはその結合部分、およびＥｒｂＢ２、ＥＲｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、Ｃ−ＭＥＴ、ルイスＹ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、Ｃ−ＫＩＴ、またはＦＧＦ受容体のいずれかに結合する第２抗体またはその結合部分を含む。
（ｉｉｉ）免疫結合体
本発明の免疫結合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を別の治療薬に結合させることによって形成することができる。適切な薬剤には、例えば、細胞傷害性剤（例えば、化学療法剤）、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、および／または放射性同位体（即ち、放射線結合体）が挙げられる。このような免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は、上記されている。用いることができる酵素的に活性な毒素およびそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性な断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。種々の放射性核種が、放射線結合された抗ＥｒｂＢ３郊外の生成に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
本発明の免疫結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性なエステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トリレン−２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。
炭素１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン トリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合させるための典型的なキレート剤である（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい）。
ＩＩＩ．本発明の抗体をスクリーニングするための方法
ＥｒｂＢ３に結合する抗体または抗原結合部分を生成後、このような抗体、またはその部分は、当該技術分野において周知である種々のアッセイを用いて、種々の特性、例えば本明細書に記載される特性についてスクリーニングすることができる。
一態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、抗体またはその抗原結合部分の存在および欠如において、ＥＧＦ様リガンドを用いて、ＥｒｂＢ３を発現している細胞を処理することによって行うことができる。次に細胞を溶解し、粗製溶解物を遠心分離して、不溶性物質を除去することができる。ＥｒｂＢ３リン酸化は、例えば、ウェスタンブロッティング、その後の抗ホスホチロシン抗体を用いた探査（ｐｒｏｂｉｎｇ）により測定可能であり、Ｋｉｍら、上掲、並びに下記の実施例に記載されている。
他の態様では、抗体および抗原結合部分は、さらに、下記の特性：（１）ＥｒｂＢ３を介したＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達の阻害；（２）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖阻害；（３）細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力（例えば、ＥｒｂＢ３の内在化を誘導することによる）；（４）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害；（５）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；（６）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および／または（７）ＥｒｂＢ３のドメインＩに位置したエピトープへの結合、の１以上についてスクリーニングされ、各々は、従来認識されている技術、並びに本明細書において検討された技術を用いて容易に測定することができる。
ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンによって媒介されるシグナル伝達の１以上の阻害は、日常的なアッセイ、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲、に記載されるアッセイを用いて容易に測定することができる。例えば、ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンによって媒介されるシグナル伝達を阻害する、抗体またはその抗原結合部分の能力は、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの１以上によって刺激後、例えば、Ｈｏｒｓｔら、上掲，Ｓｕｄｏら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２２：３８８−９２；並びに、Ｍｏｒｇａｎら（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：７６１−７６７に記載される、例えば、ＳＨＣおよびＰＩ３Ｋなどの既知のＥｒｂＢ３の基質についてのキナーゼアッセイによって測定することができる。したがって、ＥｒｂＢ３を発現している細胞は、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンを用いて刺激され、候補抗体またはその抗原結合部分とともにインキュベートすることができる。その後にこのような細胞から調製された細胞溶解物は、ＥｒｂＢ３の基質（またはＥｒｂＢ３に関与する細胞経路にあるタンパク質）に対する抗体、例えば、抗ＪＮＫ−１抗体を用いて免疫沈降され、従来認識されている技術を用いて、キナーゼ活性（例えば、ＪＮＫキナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ活性）についてアッセイすることができる。抗体またはその抗原結合部分が存在する場合のＥｒｂＢ３基質またはＥｒｂＢ３に関与する経路にあるタンパク質のレベルまたは活性（例えば、キナーゼ活性）の減少または完全な消失は、
抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合のレベルまたは活性と比較して、１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン媒介のシグナル伝達を阻害する抗体または抗原結合部分を示す。
ある種の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３への１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合を減少させることによって、ＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）媒介のシグナル伝達を阻害する。
ＥｒｂＢ３への１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合を阻害するそれらの抗体またはその抗原結合部分について選択するために、ＥｒｂＢ３を発現する細胞（例えば、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞、下記の実施例において記載される）は、抗ＥｒｂＢ３抗体またはその抗原結合部分の欠如（対照）または存在下で、標識されたＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、放射線同位元素標識されたヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）と接触させることができる。抗体またはその抗原結合部分がＥｒｂＢ３へのヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリンの結合を阻害すれば、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合の量と比較して、回収された標識量（例えば、放射線同位元素標識されたヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）における統計的に有意な減少が観察される。
抗体またはその抗原結合部分は、任意のメカニズムによって、ＥｒｂＢ３−リガンド（例えば、ヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を阻害することができる。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３リガンドと同じＥｒｂＢ３の部位または重複している部位に結合することによって、ＥｒｂＢ３へのＥｒｂＢ３リガンド（例えば１以上のヘレグリン、エピレグリン、エピゲンまたはビレグリン）の結合を阻害してもよい。あるいは、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３の構造を変更させるかまたは歪めることによって、ＥｒｂＢ３リガンドの結合を阻害してもよく、その結果、ＥｒｂＢ３リガンドに結合できなくなる。
細胞表面のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる抗体およびその抗原結合部分は、腫瘍細胞のＥｒｂＢ３をダウンレギュレートするそれらの能力によって同定することができる。ある種の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、Ｅｒｂｂ３の内在化を誘導する（またはエンドサイトーシスを増加する）ことによって、ＥｒｂＢ３の細胞表面の発現を減少させる。これを試験するために、ＥｒｂＢ３は、ビオチニル化することができ、細胞表面のＥｒｂＢ３分子の数は、例えば、Ｗａｔｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），２７３：１３８１９−２７に記載されるように、抗体またはその抗原結合部分の存在または欠如下で、培養中の細胞の単層上のビオチン量を測定し、その後、ＥｒｂＢ３を免疫沈降し、ストレプトアビジンを用いて探査することによって、容易に測定することができる。抗体または抗原結合部分の存在下で、ビオチニル化されたＥｒｂＢ３の経時的な検出における減少は、細胞表面のＥｒｂＢ３レベルを減少する抗体を示す。
また、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞、例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害するそれらの能力について、従来認識されている技術、例えば、下記の実施例に記載されるセル・タイター・グローアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ）を用いて試験することができる（さらに、例えば、Ｍａｃａｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．（１９９８）２０；９５（２）：７０８−１３；Ｐｅｒｅｚら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５，３９２−３９８を参照されたい）。
別の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ．＃ＤＹ２９３Ｂ）から利用可能なＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットなどの周知なアッセイを用いることによってなされ得る。同様に、この抗体または部分は、本明細書に記載されるように、トランスウェルアッセイ（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ ａｓｓａｙ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，Ｃａｔ ＃ＥＣＭ５５２）を用いて、ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞）の移動を阻害する能力についてスクリーニングすることができる。
別の態様では、抗体またはその抗原結合部分は、ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、本明細書に記載されるように、発達している腫瘍増殖の状態を近似するアッセイ（例えば、Ｈｅｒｍａｎら（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎを参照されたい）を用いることによって行うことができる。
また、本発明の１以上の抗体と同じであるかまたは重複しているエピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分は、当該技術分野において知られている標準的な技術、並びに本明細書に記載される技術を用いることによって同定することができる。例えば、興味のある抗体によって結合されるＥｒｂＢ３の同じであるかまたは重複しているエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、交差ブロッキングアッセイ、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるアッセイを行うことができる。
ＩＶ．医薬組成物
別の局面では、本発明は、薬学的に許容される担体とともに調合される、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（単数または複数）の１つまたは組み合わせを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。一態様では、組成物は、ＥｒｂＢ３の異なるエピトープに結合する、本発明の複数（例えば、２以上）の単離された抗体の組み合わせを含む。
本明細書中で使用するとき、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての生理学的に適合する溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に依存して、活性化合物、即ち、抗体、二重特異性および多重特異性分子は、酸の作用、並びに化合物を不活性化し得る他の天然の状態から化合物を保護するために物質で被覆されてもよい。
「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いずれの望ましくない毒性学的影響も与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒な無機酸から得られるもの、並びに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒な有機酸から誘導さるものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から得られるもの、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒な有機アミンから得られるものが含まれる。
本発明の医薬組成物は、単独で、または併用治療、即ち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用治療は、本発明の組成物を少なくとも１以上の追加の治療薬、例えば、下記に記載される抗癌剤とともに含むことができる。また、本発明の医薬組成物は、放射線治療および／または外科的処置と併用して投与することができる。
本発明の組成物は、当該技術分野において知られている種々の方法によって投与することができる。当業者に承認されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に依存して変更される。活性化合物は、急速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製可能であり、例えば、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達システムなど放出制御処方物が挙げられる。生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類、およびポリ乳酸を用いることができる。このような処方物の調製のための多くの方法は、特許にされているか、または、一般に、当業者に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
ある種の投与経路による本発明の化合物を投与するためには、化合物の失活を防ぐ物質を用いて化合物を被覆するか、または化合物と同時に投与することが必要な場合がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤に入れて被験体に投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームには、水中油中水ＣＧＦエマルジョン、並びに従来のリポソームが含まれる（Ｓｔｒｅｊａｎら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
薬学的に許容される担体には、無菌水性溶液または分散液、並びに無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。このような媒体および薬学的に活性な作用物質（ａｇｅｎｔ）の使用は、当該技術分野において知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と不適合でない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物に取り入れることができる。
治療用組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造および保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、または他の秩序ある構造として調合することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの適した混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期化された吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに組み込んだ後、滅菌微細ろ過により、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性の分散媒体と、上記で列挙されたものから必要とされる他の成分とを含む無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は、減圧乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であり、その結果、有効成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が、予め滅菌ろ過されたその溶液から生じる。
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療的応答）が得られるように調節される。例えば、一個のボーラスを投与してもよく、いくつかに分割された用量を経時的に投与してもよく、または用量は治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に減少もしく増加させてもよい。例えば、本発明のヒト抗体は、皮下注射により週に１回または２回、あるいは皮下注射により月に１回または２回投与されてもよい。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口用組成物を単位剤形に調合することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書中で使用するとき、処置される被験体にとって単一の投薬量として調整された物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、および達成されるべき特定の治療効果、並びに（ｂ）このような活性化合物を、個体の感受性の処置に対して配合する当該技術分野に備わる限界によって決定され、それらに直接的に依存する。
薬学的に許容される抗酸化剤の例には：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
治療用組成物に関して、本発明の処方物には、経口、鼻腔、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適したものが含まれる。処方物は、都合良くは、単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野において知られている任意の方法によって調製されてもよい。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される被験体、および特定の投与様式に応じて変更する。単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．００１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、好ましくは約０．００５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約０．０１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
また、膣投与に適した本発明の処方物には、当該技術分野において適していることが知られているこのような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー処方物もまた含まれる。本発明の組成物の局所または経皮投与用の剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性化合物は、薬学的に許容される担体、および必要とされ得るいずれかの保存剤、緩衝剤、または抛射薬と無菌条件下で混合されてよい。
句「非経口投与」および「非経口的に投与される」とは、本明細書中で使用するとき、通常、注射による経腸的および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
本発明の医薬組成物中に用いられてもよい、適した水性および非水性の担体の例には、水、エタノール、多価アルコール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類が含まれる。適した流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
また、これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳濁剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。当該技術分野において周知であるアジュバントの具体例としては、例えば無機アジュバント（アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよびアルミニウム水酸化物など）、有機アジュバント（例えば、スクアレン）、油性アジュバント、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（例えば、インフルエンザから得られる膜結合ヘマグルチニン（ｈｅａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）およびノイラミニダーゼを含むビロソーム）が挙げられる。
微生物の存在の予防は、上掲の滅菌手順によって、並びに、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有の両者によって確保され得る。また、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望まれる場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の長期化された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅らせる作用物質の含有によってもたらすことができる。
本発明の化合物が医薬品としてヒトおよび動物に投与される場合、それらは、単独で、または、例えば０．００１〜９０％（より好ましくは、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の有効成分を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物としても与えることができる。
選択した投与経路に関係なく、適した水和型で用いられてもよい本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容される剤形に調合される。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物、および投与様式にとって所望の治療応答を達成するために有効な量の有効成分を得るように変更されてもよい。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、または、そのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時期、用いられる特定の化合物の排出速度、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および以前の医療歴など、医療の分野において周知である因子を含め、様々な薬物動態学的因子に依存する。当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効な量を容易に決定および処方することができる。例えば、この医師または獣医師は、医薬組成物に用いられる本発明の化合物の投薬量を、所望の治療効果を得るために必要な量より少ないレベルで開始し、この投薬量を所望の効果が得られるまで次第に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適した１日あたりの投薬量は、治療効果を生むために有効な最も少ない投薬量である化合物の量である。このような有効な投薬量は、一般に、上記された因子に依存する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。必要に応じて、治療用組成物の有効な１日あたりの投薬量は、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の小分けした投薬量に分けて別々に、全日にわたって適切な間隔を置きながら、場合により単位剤形で投与されてもよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、該化合物を医薬処方物（組成物）として投与することが好ましい。
治療用組成物は、当該技術分野において知られている医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、好ましい態様では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されたデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で薬物を調剤するインプラント可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通じて薬物を投与する治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達する薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー・コンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のこのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは当業者に知られている。
ある種の態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて適切な分布を確保するように調合され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために（もし希望するなら）、例えばリポソームにそれらを調合することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送されて、標的化の薬物送達を高める１以上の成分を含んでいてもよい（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。典型的な標的成分には、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらによる米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；その様々な種が本発明の処方物、並びに本発明の分子の成分を含んでもよいサーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられる；さらに、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。
Ｖ．本発明の抗体を用いる方法
また、本発明は、様々なエクスビボおよびインビボにおける診断用途および治療用途において、ＥｒｂＢ３に結合する抗体およびその抗原結合部分を用いる方法を提供する。例えば、本発明の抗体は、種々の癌を含む、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患を処置するために用いることができる。
一態様では、本発明は、疾患を処置するために有効な量で、本発明の抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与することによって、ＥｒｂＢ３に依存したシグナル伝達と関連した疾患を処置するための方法を提供する。適した疾患には、例えば、限定されないが、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、消化管癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌が含まれる。
抗体は、ＥｒｂＢ３が媒介したシグナル伝達と関連した疾患を処置するために、単独で、または抗体と共同してまたはそれと相乗的に作用する別の治療薬とともに投与されてもよい。このような治療薬には、例えば、下記に記載される抗癌剤（例えば、細胞毒素、化学療法剤、小分子および放射線）が含まれる。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体または抗原結合部分を（例えば、エクスビボまたはインビボにおいて）被験体から得られる細胞と接触させ、細胞のＥｒｂＢ３への結合レベルを測定することによって、被験体におけるＥｒｂＢ３アップレギュレーションと関連した疾患（例えば、癌）を診断する方法を提供する。ＥｒｂＢ３への結合の異常に高いレベルは、被験体がＥｒｂＢ３アップレギュレーションと関連した疾患を有することを示す。
また、ＥｒｂＢ３アップレギュレーションおよび／またはＥｒｂＢ３依存性のシグナル伝達と関連した疾患の処置または診断において用いるための指図書を場合により含む、本発明の抗体およびその抗原結合部分を含むキットは、本発明の範囲内である。このキットは、キットの成分の意図された使用を指示するラベルを含んでもよい。用語のラベルには、いずれかの書類、キットにまたはキットとともに供給されるマーケッティング資料または記録資料、あるいは他にキットに添付されるものが含まれる。
本発明の他の態様は、下記の実施例に記載されている。
本発明は、下記の実施例によってさらに例証されるが、それを更なる限定として解釈すべきでない。配列表、図面、並びに本出願の全体にわたって引用されている全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書中に明確に援用される。
材料および方法
実施例の全体を通して、下記の材料および方法は、特に記述がない限り用いられる。
一般に、本発明の実施は、他に指示がなければ、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、並びにポリペプチド調製における標準的な技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，ＩｒＩ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）。ＨＣＶ生物学のアッセイのためのインビトロおよびインビボのモデル系が記載されている、例えば、ｉｎ Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｐａｒｔ ＩＩ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．（ＮＹ）．；３４（２）：３９−４７（２００５）およびｉｎ Ｔｈｅ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ＩＬＡＲ Ｊ．；４２（２）：１１７−２６（２００１）を参照されたい。
細胞系統
下記に記載される実験に用いられる全ての細胞系統は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得られ、または指示されるように研究者によって提供された。
細胞系統：
ＭＣＦ７−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−２２
Ｔ４７Ｄ−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−１３３
Ｃｏｌｏ３５７−これらの細胞は、アカデミックな研究者から得られ、Ｋｏｌｂら（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０：５１４−５２３によって記載されている。
Ｄｕ１４５−ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ−８１
ＯＶＣＡＲ８−仮出願に既に記載されている供給源
Ｈ１９７５ ＡＴＣＣ ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−５９０８
腫瘍細胞の粉砕
腫瘍の粉砕のために凍結粉砕機（ｃｒｙｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）を用いた。特別のバック（腫瘍を添加する前に予め計量される）に腫瘍を保存し、それらを操作しながら液体窒素に入れた。小さな腫瘍については、２００μＬのＬｙｓｉｓバッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）が、腫瘍を含むバックに初めに添加され、液体窒素中で凍結され、次に、バックからの腫瘍の回収を改善するために粉砕された。粉砕された腫瘍を２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、更なる処理の直前まで液体窒素に置いた
腫瘍細胞の溶解
プロテアーゼおよびホスファターゼで補充されたＬｙｓｉｓバッファー中で腫瘍を溶解させた。約６２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度の腫瘍アリコートにＬｙｓｉｓバッファーを添加した。腫瘍試料は、３０秒間ボルテックスしてホモジナイズし、氷上で約３０分間インキュベートした。溶解物は、試料の更なる均質化のために、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム中で約１０分間回転させた。澄明になった溶解物は、さらに処理するために新しいチューブに分注された。
ＢＣＡアッセイ
ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）は、全ての腫瘍試料について、製造業者のプロトコールに従って行われた。各腫瘍試料の全タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬで）は、後に、ＥＬＩＳＡ結果の標準化において用いられた。
ＥＬＩＳＡアッセイ
全体およびホスホ−ＥｒｂＢ３ ＥＬＩＳＡのための全てのＥＬＩＳＡ試薬は、ＤｕｏｓｅｔキットとしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートは、５０μＬの抗体を用いて被覆され、室温で一晩インキュベートされた。翌朝、プレートは、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いて３回洗浄した。その後、ＰＢＳに含まれる２％ＢＳＡを用いて、約１時間、室温でプレートをブロックした。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄した。５０％Ｌｙｓｉｓバッファーおよび１％ＢＳＡで希釈された５０μＬの細胞溶解物と標準物は、更なる処理のために２点測定に用いられた。プレートシェーカー上で２時間、４℃で試料をインキュベートし、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いて３回洗浄した。２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴで希釈された約５０μＬの検出抗体を添加し、約１時間、室温でインキュベートした。リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−ＥｒｂＢ３について、検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接結合させ、２時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄した。約５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、３０分間、室温でインキュベートした（ｐＥｒｂＢ３を除く）。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄した。約５０μＬのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ ＥＬＩＳＡ基質を添加し、プレートをＦｕｓｉｏｎプレートリーダーで読んだ。データはＥＸＣＥＬを用いて分析された。２点測定の試料は、平均され、エラーバーは、２つの複製物間での標準偏差を表すために用いられた。
（実施例１）
ファージディスプレイを用いた抗体の生成
本明細書においてＡｂ＃６、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７、およびＡｂ＃１９と称されるヒト抗ＥｒｂＢ３抗体を得るために、ヒトドナーから得られた免疫グロブリン配列の独自の組み合わせを含むヒトＦａｂ−ファージライブラリー（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ． 上掲、その全てが本明細書中に参照として援用される）が、ＥｒｂＢ３結合物について最初にスクリーニングされた。
精製されたＥｒｂＢ３、細胞表面ＥｒｂＢ３を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞系統を用いて、ライブラリーから得られる７３個の独自のＦａｂ配列を同定した。次に、これらの７３個のクローンは、ファージを含まないＦａｂのみとして再フォーマットされた。ハイスループット法を用いて、これらのＦａｂは、小スケールで発現させ、ＥＬＩＳＡ、並びにハイスループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術であるＦｌｅｘｃｈｉｐを用いて結合について試験された。ファージを含まない７３個のＦａｂは、チップ表面にスポットされ、ＥｒｂＢ３−ｈｉｓ融合標的タンパク質またはＥｒｂＢ３−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する結合反応速度およびエピトープブロックを測定した。Ｆａｂについての平衡結合定数およびオン／オフレートは、得られたデータから計算された。
次に、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への種々のＦａｂの結合は、約５００ｎＭのＦａｂ、および１：７５０に希釈したヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて調べられた。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、いくつかの候補Ｆａｂは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の感知できる染色を示した。
（実施例２）
抗ＥｒｂＢ３ Ｆａｂの最適化
ＥｒｂＢ３リガンドであるヘレグリンによるＥｒｂＢ３への結合をブロックしたＦａｂの同定に続いて、ＦａｂのＶＨおよびＶＬ配列を下記のようにコドン最適化した。
具体的には、ＶＨおよびＶＬ領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプとして発現するための発現構築物を用いて再フォーマットされた。構築物は、適切な重鎖および軽鎖配列の置換のために設計されたカセットを有するＳｅｌｅｘｉｓ骨格を含んでいた。Ｓｅｌｅｘｉｓベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびマッチングポリＡシグナルを含んでいた。
Ａｂ＃６のコドン最適化されたＶＨおよびＶＬについての核酸配列は、それぞれ配列番号２５および２６に記載され、Ａｂ＃３についての核酸配列は、それぞれ配列番号２７および２８に記載され、図２２に示される。
（実施例３）
ＥｒｂＢ３に対する結合親和性
抗ＥｒｂＢ３抗体の解離定数は、２つの独立した技術、即ち、表面プラズモン共鳴アッセイおよびＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いた細胞結合アッセイを用いて測定された。
表面プラズモン共鳴アッセイ
表面プラズモン共鳴アッセイ（またはＦｌｅｘｃｈｉｐアッセイとも称される）は、Ｗａｓｓａｆら（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５１：２４１−２５３に記載されるように行った。ＫＤ値は、式ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａに基づいて計算された。
Ａｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値は、それぞれ、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定すると、図２Ａおよび２Ｂに示される。Ａｂ＃６は、ＫＤ値が約４ｎＭであり、Ａｂ＃３は、ＫＤ値が約８ｎＭであり、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示される。
細胞結合アッセイ
Ａｂ＃６およびＡｂ＃３のＫＤ値を決定するための細胞結合アッセイは、下記のように行った。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞は、室温で５分間、２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ＋２ｍｌのＲＭＰＩ＋５ｍＭのＥＤＴＡを用いて脱着された。完全なＲＰＭＩ（１０ｍｌ）をトリプシン処理された細胞に即座に加えられ、穏やかに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ机上遠心分離機で１１００ｒｐｍ、５分で遠沈した。細胞を２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、ＢＤ染色バッファー（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清＋０．１％アジ化ナトリウム、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に再懸濁させ、５０ｕｌ（１×１０５細胞）アリコートを９６ウェルタイタープレートに置いた。
ＢＤ染色バッファーに含まれる２００ｎＭ抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６またはＡｂ＃３）の１５０μｌ溶液は、エッペンドルフチューブに調製され、７５μｌのＢＤ染色バッファーに連続的に２倍に希釈された。希釈された抗体の濃度は、２００ｎＭ〜０．４ｎＭの範囲であった。次に、異なるタンパク質希釈物の５０μｌのアリコートは、抗体の最終濃度が１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２ｎＭ、６ｎＭ、３ｎＭ、１．５ｎＭ、０．８ｎＭ、０．４ｎＭおよび０．２ｎＭである５０μｌの細胞懸濁液に直接添加された。
９６ウェルプレートに分注された細胞は、プラットフォームシェーカー上で３０分間、室温でタンパク質希釈物とともにインキュベートされ、３００μｌのＢＤ染色バッファーを用いて３回洗浄された。次に、細胞は、低温室のプラットフォームシェーカー上で、４５分間、ＢＤ染色バッファーで１：７５０希釈したＡｌｅｘａ６４７標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧの１００μｌとともにインキュベートされた。最後に、細胞を２回洗浄し、ペレットにし、２５０μｌのＢＤ染色バッファー＋０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムに再懸濁した。１０，０００個の細胞の分析は、ＦＬ４チャネルを用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで行った。抗ＥｒｂＢ３抗体のＭＦＩ値および対応する濃度をそれぞれｙ軸およびｘ軸にプロットした。分子のＫＤ値は、非線形回帰曲線についての１部位結合モデルを用いたＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって決定された。
ＫＤ値は、式Ｙ＝Ｂｍａｘ＊ Ｘ／ＫＤ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和の蛍光。Ｘ＝抗体濃度。Ｙ＝結合程度。）に基づいて計算された。図２Ｃおよび２Ｄに示されるように、Ａｂ＃６およびＡｂ＃３は、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いた細胞結合アッセイでは、ＫＤ値は、それぞれ約４ｎＭおよび１．３ｎＭであった。
（実施例４）
ＥｒｂＢ３についての結合特異性／エピトープ結合
ＥｒｂＢ３に対するＡｂ＃６のＩｇＧ２アイソタイプの結合特異性は、下記のようのＥＬＩＳＡを用いてアッセイされた。Ａｂ＃６によって結合されたエピトープの同定も分析した。
具体的には、９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートは、５０μｌの５μｇ／ｍｌタンパク質（組換えヒトＥｒｂＢ３、組換えヒトＥＧＦＲまたは無関係なタンパク質（ＢＳＡ））を用いて被覆し、一晩、室温でインキュベートされた。翌朝、プレートは、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄された。ＰＢＳに含まれる２％ＢＳＡを用いて１時間、室温でウェルをブロックした。プレートは、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄された。約５０μＬのＡｂ＃６は、２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴによるいくつかの希釈（１μＭ、および連続的な２倍希釈）で添加された。全ての試料は、２点測定で行い、プレートシェーカー上で２時間、４℃でインキュベートされた。プレートは、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄された。５０μｌのヒトＩｇＧ検出抗体（ＨＲＰ結合（Ｂｅｔｈｙｌ Ｉｎｃ；２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴによる１：７５０００希釈）を添加し、プレートを１時間、室温でインキュベートした。プレートは、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄された。５０μＬのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ ＥＬＩＳＡ基質を添加し、プレートをＦｕｓｉｏｎプレートリーダー上で読んだ。データはＥＸＣＥＬプログラムを用いて分析された。２点測定の試料は平均された、およびエラーバーは、２つの複製物間での標準偏差を表す。
図３に示されるように、Ａｂ＃６はＥＬＩＳＡでは組換えＥｒｂＢ３に結合したが、ＥＧＦＲ、ＢＳＡまたはＴＧＦ−αにはいずれの感知できる結合を示さなかった。
ＥｒｂＢ３のアミノ酸残基２０−２０２に対応する断片（切断変異体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ））は、ＮｈｅとＢｓｉＷＩ制限部位との間で酵母ディスプレイベクターｐＹＤ２（Ｈｉｓタグの前で操作された終始コドンを有するｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の改変バージョン）にクローニングされた。酵母菌株ＥＢＹ１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプラスミドを形質転換し、このプラスミドを含むクローンをＴｒｐ−選択培地で選択した。グルコースを含む培地で一晩、３０℃でクローンを増殖させ、ＥｒｂＢ３切断変異体の発現は、２日間、１８℃でガラクトースを含む培地に移すことによって誘導された。ＥｒｂＢ３切断変異体を示す酵母は、５０ｎＭのＡｂ＃６を用い、その後、Ａｌｅｘａ色素−６４７で標識されたヤギ抗ヒト抗体を用いて染色された。別の試料は、二次抗体の酵母に対する非特異的な結合がないことを示すためにヤギ抗ヒト抗体のみで染色された。分析は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるフローサイトメトリーにて行った。
図３０に示されるように、Ａｂ＃６は切断変異体、即ち、ＥｒｂＢ３のアミノ酸残基２０〜２０２に結合した。
（実施例５）
腫瘍細胞の全ＥｒｂＢ３のダウンレギュレーション
腫瘍細胞におけるインビトロおよびインビボの両方でのＥｒｂＢ３発現をダウンレギュレートするＡｂ＃６の能力を下記のように試験した。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、５％二酸化炭素で増殖した。次に、１ｕＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、６１ｐＭおよび１５ｐＭの濃度の抗体を含む場合と含まない場合の抗生物質、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にスイッチした。細胞は、２４時間、３７℃、５％二酸化炭素で増殖され、冷却ＰＢＳで洗浄し、次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｕＭ ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、５０ｕＭフェナラルシン（ｐｈｅｎａｌａｒｓｉｎｅ）、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１４）を含む哺乳動物タンパク質抽出（ＭＰＥＲ）溶解（Ｐｉｅｒｃｅ、７８５０５）バッファーを用いて回収された。０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水に含まれる４％ウシ血清アルブミンを用いて細胞溶解物を２倍に希釈し、次に、マウス抗ヒトＥｒｂＢ３捕捉抗体およびビオチニル化されたマウス抗ヒトＥｒｂＢ３二次検出抗体を用いたＥＬＩＳＡによって分析した。シグナルは、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応される西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンより生じた。ＥＬＩＳＡは、ルミノメーターを用いて視覚化された。
図４に示されるように、Ａｂ＃６は、ＥＬＩＳＡによって測定すると、インビトロでＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞において約４６．９％まで全ＥｒｂＢ３レベルを減少させた。血清および抗体を含まない培地を対照として用いた。
更なる実験では、Ａｂ＃６のＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプを用いたＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３受容体のダウンレギュレーションは、ＦＡＣＳ分析を用いて試験された。ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞は、１５ｃｍディッシュからトリプシン処理され、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清を用いて１回洗浄された。細胞ペレットは、１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。２×１０５細胞の２つのアリコートを１２ウェル組織培養プレートに添加し、８００ｕｌ ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清の最終体積で再懸濁した。１つのウェルに対しては、Ａｂ＃６ＩｇＧ１またはＡｂ＃６ＩｇＧ２アイソタイプが、最終濃度１００ｎＭ（処理試料）に添加され、他のウェルに対しては、等量のＰＢＳ（未処理試料）を添加した。
翌日、処理および未処理細胞をトリプシン処理し、洗浄し、３０分間、氷上で、ＢＤ染色バッファーに含まれる１００ｎＭのＡｂ＃６とともにインキュベートした。１ｍｌのＢＤ染色バッファーを用いて細胞を２回洗浄し、４５分間、氷上で、１００ｕｌの１：５００希釈したＡｌｅｘａ６４７標識されたヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、３００ｕｌのＢＤ染色バッファー＋０．５ｕｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに再懸濁した。１０，０００個の細胞の分析は、ＦＬ４チャネルを用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで行った。
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、Ａｂ＃６のＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプの両方は、それぞれ約６２％及び約６６％までＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞のＥｒｂＢ３をダウンレギュレートした。
この減少がＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の表面のＥｒｂＢ３受容体の内在化に起因するかどうかを決定するために、抗体の存在下でＥｒｂＢ３の発現を経時的に測定した。具体的には、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞は、１５ｃｍディッシュからトリプシン処理され、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清を用いて１回洗浄された。細胞ペレットは、１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。２×１０５細胞の２つのアリコートを１２ウェル組織培養プレートに添加し、８００μｌ ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清の最終体積で再懸濁した。１つのウェルに対しては、抗ＥｒｂＢ３抗体が、最終濃度１００ｎＭ（処理試料）に添加され、他のウェルに対しては、等量のＰＢＳ（未処理試料）を添加した。翌日、処理および未処理細胞をトリプシン処理し、洗浄し、３０分間、氷上で、ＢＤ染色バッファーに含まれる１００ｎＭの抗ＥｒｂＢ３抗体とともにインキュベートした。１ｍｌのＢＤ染色バッファーを用いて細胞を２回洗浄し、４５分間、氷上で、１００μｌの１：５００希釈したＡｌｅｘａ６４７標識されたヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、３００μｌのＢＤ染色バッファー＋０．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに再懸濁した。１０，０００個の細胞の分析は、ＦＬ４チャネルを用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで行った。
図６に示されるように、Ａｂ＃６の存在下におけるＥｒｂＢ３のダウンレギュレーションを０時間（図６Ａ）、０．５時間（図６Ｂ）、２時間（図６Ｃ）および２４時間（図６Ｄ）で測定した。図６Ａ〜６Ｄに示されるように、約５０％の細胞表面ＥｒｂＢ３受容体が、約３０分後にダウンレギュレートし、約２４時間で、約９３％の細胞表面受容体がダウンレギュレートした。
また、メラノーマ細胞におけるインビボでのＥｒｂＢ３ダウンレギュレーションを引き起こすＡｂ＃６の能力は、下記のとおり調べた。
要約すると、Ｔ細胞欠損ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＩＨ起源の３〜４週齢の雌性マウス；異系交配；アルビノバックグラウンド）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。移植のためのＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞は、回収前に約８０％のコンフルエントまで培養（ＲＰＭＩ培地、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、３７℃、５％、ＣＯ２）して増殖された。移植するまで細胞を氷上で保持した。マウスは、右脇腹に１００μｌのＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を用いて皮下注射を介して移植され、初期の腫瘍増殖についてモニターされながら回復された。
デジタルカリパーによって腫瘍（長さ×幅）を測定し、静脈注射によってＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７７６９−５ＭＧ）をマウスに投薬した。マウスは、抗体ナンバー６の１５μｇまたは１００μｇのいずれかを用いて１日おきに腹腔内に投薬され、１週ごとに３回、腫瘍を測定し、マイクロソフトＥＸＣＥＬスプレッドシートに記録した。
最終の腫瘍測定（Ｌ×Ｗ）を行い、ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０℃で保存した（生化学分析用）。最終の腫瘍測定を分析し、例えば、Ｂｕｒｔｒｕｍら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：８９１２−８９２１に記載されるように、腫瘍面積と腫瘍体積によってグラフにした。また、データは、腫瘍体積と腫瘍面積の両方について「標準化」および「非標準化」された手法によって分析された。データの「標準化」については、測定の各時間点で、各群の各腫瘍は、カリパー測定によって測定された初期の腫瘍サイズによって割られた。
図７に示されるように、このアッセイで試験された種々の抗体のうち、Ａｂ＃６は、Ａｂ＃６のＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプのいずれかを用いて処理された腫瘍において注射して２４時間後すぐに全ＥｒｂＢ３のダウンレギュレーションを引き起こした）。ＰＢＳを対照として用いた
更なる実験では、インビボでのＡＤＲｒ異種移植におけるＥｒｂＢ３をダウンレギュレートするＡｂ＃６の能力を調べた。
要約すると、凍結粉砕機（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ）において試料を粉砕した。特別のバック（腫瘍を添加する前に予め計量される）に腫瘍を保存し、それらを操作しながら液体窒素に入れた。小さな腫瘍については、２００μＬのＬｙｓｉｓバッファーが、腫瘍を含むバックに初めに添加され、液体窒素中で凍結され、次に、バックからの腫瘍の回収を改善するために粉砕された。粉砕された腫瘍を２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、溶解されるまで液体窒素に置いた。プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターで補充されたＬｙｓｉｓバッファー中で腫瘍を溶解させた。６２．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度の腫瘍アリコートにＬｙｓｉｓバッファーを添加した。腫瘍試料は、３０秒間ボルテックスしてホモジナイズし、氷上で３０分間置いた。溶解物は、試料の更なる均質化のために、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒカラム中で約１０分間回転させた。澄明になった溶解物は新しいチューブに分注された。
ＢＣＡアッセイは、上掲の材料および方法のセクションに記載されるように行った。
ＥｒｂＢ３の全レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡ試薬は、ＤｕｏｓｅｔキットとしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートは、５０μＬの各捕捉抗体を用いて被覆され、室温で一晩インキュベートされた。翌朝、プレートは、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いて３回洗浄し、その後、ＰＢＳに含まれる２％ＢＳＡを用いて、約１時間、室温でブロックした。次に、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄した。溶解物（５０μＬ）と標準物は、５０％Ｌｙｓｉｓバッファーおよび１％ＢＳＡで希釈された；全ての試料は２点測定で行われた。プレートは、プレートシェーカー上で２時間、４℃でインキュベートされ、次に、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いて３回洗浄した。２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴで希釈された５０マイクロリットルの検出抗体を添加し、１時間、室温でプレートをインキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを３回洗浄した。５０マイクロリットルのストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、３０分間、室温でプレートをインキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャーで１０００μｌ／ウェルを用いてプレートを再び３回洗浄した。５０マイクロリットルのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ ＥＬＩＳＡ基質を添加し、プレートをＦｕｓｉｏｎプレートリーダーで読んだ。データはＥＸＣＥＬを用いて分析された。２点測定の試料は、平均された、およびエラーバーは、２つの複製物間での標準偏差を表す。
この実験の結果を図８に示す。図８に示されるように、Ａｂ＃６は、インビボでのＡＤＲｒ異種移植においてＥｒｂＢ３をダウンレギュレートした。
（実施例６）
腫瘍細胞増殖の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖を阻害するＡｂ＃６の能力は、下記のとおり調べられた。
ＭＡＬＭＥ３Ｍ、ＡＣＨＮおよびＮＣＩ／ＡＤＲｒ細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種され、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖された。次に、培地は、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミンを含み、および１ｕＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭ、６１ｐＭおよび１５ｐＭ濃度で抗体を含む場合および含まない場合のＲＰＭＩ−１６４０培地にスイッチされた。細胞は、９６時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖され、次に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネッセント細胞生存アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７３）を用いて回収され、ルミノメーターで分析された。血清および抗体を含まない培地を対照として用いた。
図９、１０および１１に示されるように、Ａｂ＃６は、ＥｒｂＢ３を発現するＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（図９）、ＡＤＲｒ卵巣癌細胞（図１０）、およびＡＣＨＮ細胞（図１１）の増殖を阻害した。具体的には、Ａｂ＃６は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗアッセイを用いて測定すると、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞の増殖を約１９．６％まで阻害し、ＡＤＲｒ卵巣癌細胞の増殖を約３０．５％まで阻害した。また、図１１に示されるように、Ａｂ＃６は、ＡＣＨＮ細胞の増殖を約２５．４％まで阻害した。
（実施例７）
腫瘍細胞におけるＥｒｂＢ３リン酸化の阻害
インビボにおけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べた。
図８に関して、上掲の実施例５に記載された技術を用いて試料を粉砕した。ＢＣＡアッセイは、上掲の材料および方法のセクションに記載されるように行い、ＥＬＩＳＡアッセイは、図８に関して、上掲の実施例５に記載されるように行った。
この実験の結果を図１２に示す。図１２に示されるように、Ａｂ＃６は、ｎｇ／ｍｇ全タンパク質でリン酸化されたＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）の量によって測定すると、インビボでＡＤＲｒ卵巣異種移植においてＥｒｂＢ３リン酸化を有意に阻害した。
また、ベータセルリン（ＢＴＣ）またはヘレグリン（ＨＲＧ）誘導のＥｒｂＢ３リン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べた。
５０ｍＭのＢＴＣ、１０ｍＭのＨＲＧまたは３３３ｎＭのＴＧＦ−αで刺激する前に、卵巣ＡＤＲｒ細胞をＡｂ＃６とともに３０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、培地を取り除き、５０ｎＭのＢＴＣまたは３３３ｎＭのＴＧＦ−α（ＰＥ４９８に対して）を用いて、細胞を５分、３７℃、５％ＣＯ２で刺激した。ＨＲＧ対照（５分、５ｎＭ）、１０％血清および０％血清対照も用いた。細胞は、１×冷ＰＢＳで洗浄され、３０μｌの冷溶解バッファー（Ｍ−ＰＥＲバッファー＋バナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ４、Ｓｉｇｍａ）、２−グリセロリン酸エステル、フェニルアルシンオキシド、ＢｐＶおよびプロテアーゼインヒビター）において、氷上で３０分間インキュベートすることによって溶解させた。溶解物を−８０で一晩保存した。
図１３Ａ〜１３Ｃに示されるように、Ａｂ＃６は、ベータセルリンおよびヘレグリン媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を有意に阻害した。
更なる実験では、卵巣腫瘍細胞系統ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおりに調べた。
ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８細胞系統は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（「ＤＣＴＤ」）から得た。ＥＬＩＳＡは、上掲の材料および方法のセクションにおいて記載されるように行った。
この実験の結果を図１４Ａおよび１４Ｂに示す。図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、Ａｂ＃６は、ＯＶＣＡＲ５およびＯＶＣＡＲ８卵巣癌細胞系統の両方におけるＥｒｂＢ３リン酸化を阻害した。
上記で検討したように、Ａｂ＃６は、ベータセルリン媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する。ベータセルリン媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化がＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ３を介して起こるのかを調べるために、下記の実験を行った。
ＡＤＲｒ細胞またはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞（１×１０５）は、５０μｌのＢＤ染色バッファーに含まれる２５μＭの抗ＥｒｂＢ３ Ａｂ＃６または２５μＭのＥｒｂｉｔｕｘ（対照として）を用いて、３０分間、氷上でプレインキュベートされた。３０分後、５０μｌの４００ｎＭビオチニル化ＢＴＣを細胞に添加し、さらに３０分間、氷上でインキュベートした。これは、１２．５μＭ抗体および２００ｎＭのＢＴＣの最終濃度を与えた。次に、細胞を５００μｌのＢＤ染色バッファーを用いて２回洗浄し、ＢＤ染色バッファーに含まれる１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μｌとともに４５分間、インキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、３００μｌのＢＤ染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。陽性対照として、１×１０５のＡＤＲｒまたはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞は、２００ｎＭのＢＴＣとともに、３０分間、氷上でインキュベートされ、２回洗浄され、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートされた。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、細胞は、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥの１００μｌだけとともに４５分間インキュベートされた。
この実験の結果を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。図１５Ａに示されるように、ベータセルリン（ＢＴＣ）は、ＥｒｂＢ１陰性ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞へのいかなる感知できる結合も示さない。しかしながら、図１５Ｂおよび１５Ｃに示されるように、ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１陽性ＡＤＲｒ細胞への結合を示す。
また、図１５Ｂおよび１５Ｃに示されるように、この結合は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体であるＥｒｂｉｔｕｘによってブロックされ、ＥＧＦ様リガンドがＥＧＦＲに結合することを示すための対照として含められた。これは、例えば、Ａｄａｍｓら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１４７−１１５７に記載されている。
（実施例８）
腫瘍細胞におけるヘレグリン媒介のシグナル伝達の阻害
ヘレグリン媒介の腫瘍細胞のシグナル伝達を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べた。
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、抗生物質、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で増殖した。細胞は、抗生物質および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で２４時間、３７℃、および５％二酸化炭素で血清を枯渇させた。細胞は、１μＭ、２５０ｎＭ、６３ｎＭ、１６ｎＭ、４．０ｎＭ、１．０ｎＭ、２４０ｐＭおよび６１ｐＭの濃度の抗ＥｒｂＢ３抗体（Ａｂ＃６のＩｇＧ２アイソタイプ）を含む場合と含まない場合で３０分間前処理され、次に、ＨＲＧ１−ベータ１−ＥＣＤを用いて、１０分間、３７℃、および５％二酸化炭素で刺激された。細胞は、冷ＰＢＳで洗浄され、次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｕＭ ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、５０μＭフェナラルシン、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１４）を含む哺乳動物タンパク質抽出（ＭＰＥＲ）溶解（Ｐｉｅｒｃｅ、７８５０５）バッファーを用いて回収された。０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水に含まれる４％ウシ血清アルブミンを用いて細胞溶解物を２倍に希釈し、次に、ＡＫＴ（ＥｒｂＢ３の下流エフェクター）およびＥｒｂＢ３リン酸化についてＥＬＩＳＡによって分析された。
ＡＫＴリン酸化について試験するために、溶解物は、ＡＫＴに特異的な捕捉抗体およびＡＫＴのセリン４７３のリン酸化部位に特異的なビオチニル化された検出抗体を用いてＥＬＩＳＡプレートで行われた。シグナルは、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応される西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンより生じた。ＥｒｂＢ３リン酸化を評価するために、溶解物は、ＥｒｂＢ３に特異的な捕捉抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン検出抗体を用いてＥＬＩＳＡプレートで行われた。次に、これは、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ、３７０７０）と反応させた。ＥＬＩＳＡは、ルミノメーターを用いて視覚化された。
図１６Ａおよび１６Ｂに示されるように、Ａｂ＃６は、ＥｒｂＢ３（図１６Ａ）およびＡＫＴ（図１６Ｂ）のリン酸化の減少によって測定すると、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞においてヘレグリン媒介のシグナル伝達の強力な阻害剤であった。顕著には、Ａｂ＃６は、ＡＫＴのリン酸化をほぼ１００％阻害した。
（実施例９）
卵巣、前立腺、および膵臓の腫瘍増殖の阻害
インビボでのＡｂ＃６の有効性を評価するために、ヒト癌のいくつかの異種移植モデルをヌードマウスで構築し、腫瘍増殖の阻害を複数回投薬で評価した。例えば、Ｔ細胞欠損ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＩＨ起源の３〜４週齢の雌性マウス；異系交配；アルビノバックグラウンド）は、異種移植研究のために、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入された。移植のためのＡＤＲｒ細胞は、回収前に約８５％のコンフルエントに培養（ＲＰＭＩ培地、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質、３７℃、５％ＣＯ２）して増殖された。移植するまで細胞を氷上で保持した。マウスは、右脇腹に１００μｌのＡＤＲｒ細胞を用いて皮下注射を介して移植され、初期の腫瘍増殖についてモニターされながら回復された。
デジタルカリパーによって腫瘍（長さ×幅）を測定し、静脈注射によってＩｇＧ２ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７７６９−５ＭＧ）をマウスに投薬した。マウスは、Ａｂ＃６の３０μｇまたは３００μｇのいずれかを用いて３日ごとに腹腔内に投薬され、１週ごとに３回、腫瘍を測定し、マイクロソフトＥＸＣＥＬスプレッドシートに記録した。
最終の腫瘍測定（Ｌ×Ｗ）を行い、ＣＯ２窒息によってマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０℃で保存した（生化学分析用）。最終の腫瘍測定を分析し、Ｂｕｒｔｒｕｍら、上掲、に記載されるように、腫瘍面積と腫瘍体積によってグラフにした。また、データは、腫瘍体積と腫瘍面積の両方について「標準化」および「非標準化」された手法によって分析された。データの「標準化」については、測定の各時間点で、各群の各腫瘍は、カリパー測定によって測定された初期の腫瘍サイズによって割られた。
ヒト腫瘍細胞系統であるＡＤＲｒ（卵巣）、Ｄｕ１４５（前立腺）およびＯｖＣＡＲ８（卵巣）から得られる３種の異なるモデルからのデータを図１７Ａ〜Ｃに示し、Ｃｏｌｏ３５７異種移植研究を図１７Ｄに示す。これらの試験からデータは、３日ごとに（Ｑ３ｄ）の３００ｕｇ用量のＡｂ＃６が腫瘍増殖の有意な阻害をもたらすことを示した（研究中の複数の時間点についてｐ＜０．０５）。加えて、Ａｂ＃６の阻害効果は、投薬量が、Ｄｕ１４５前立腺癌モデル、並びに腎臓および膵臓癌腫異種移植モデル（ＡＣＨＮおよびＣＯＬＯ３５７）において、Ｑ３ｄで６００ｕｇまで増加した場合にさらに上昇した。しかしながら、Ｑ３ｄで１５００ｕｇまで用量をさらに増加させることは、有効性の増加をもたらさなかった（ＯｖＣＡＲ８−図１７；ＣＯＬＯ３５７）。これは、６００ｕｇが、腫瘍増殖阻害に関して飽和していることを示唆する。これらの研究から動物の血清の薬物動態（ＰＫ）解析は、Ａｂ＃６の血清保持における投薬量に依存した増加を示す。同様に、これらの異なる研究からのＡｂ＃６の腫瘍内レベルの生化学的分析は、０〜約６ｐｇ ＭＭ１２１／ｕｇ全腫瘍溶解物の投薬量に依存した範囲を示した（データ示さず）。
（実施例１０）
腫瘍細胞のＥｒｂＢ３へのＥｒｂＢ３リガンドの結合の阻害
更なる実験では、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ様リガンドではなく、ＥｒｂＢ３に対するＥｒｂＢ３リガンドの結合を阻害する本発明の抗体の特異性を下記のとおり調べた。
一態様では、ＥｒｂＢ３に対するＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリンおよびエピレグリン）の結合を阻害するＡｂ＃６およびＡｂ＃３のＦａｂバージョン（Ａｂ／Ｆａｂ＃３）の特異性を調べた。
ＥｒｂＢ３に対するヘレグリンの結合を阻害するＡｂ＃６およびＡｂ／Ｆａｂ＃３の能力を調べるために、下記の実験を行った。
ＡＤＲｒ細胞（１×１０５）は、５０μｌのＢＤ染色バッファーに含まれる１０μＭの抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、Ａｂ＃６またはＡｂ／Ｆａｂ＃３）とともに３０分間、氷上でインキュベートされた。３０分後、５０μｌの４０ｎＭビオチニル化されたヘレグリンＥＧＦを細胞に添加し、さらに１０分間、氷上でインキュベートした。これは、５μＭ抗体および２０ｎＭのヘレグリンＥＧＦの最終濃度を与えた。次に、細胞を５００μｌのＢＤ染色バッファーを用いて２回洗浄し、ＢＤ染色バッファーに含まれる１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μｌとともに４５分間、インキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、３００μｌのＢＤ染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。陽性対照として、１×１０５のＡＤＲｒ細胞は、２０ｎＭのヘレグリンＥＧＦとともに、１０分間、氷上でインキュベートされ、２回洗浄され、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートされた。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、１×１０５個のＡＤＲｒ細胞は、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥの１００μｌだけとともに４５分間インキュベートされた。
この実験の結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、Ａｂ＃６およびＡｂ／Ｆａｂ＃３の両方は、ＥｒｂＢ３に対するヘレグリン結合を阻害することができた。
同様に、ＥｒｂＢ３に対する別のＥｒｂＢ３リガンドであるエピレグリンの結合を阻害するＡｂ＃６の能力を下記のとおり調べた。
ＡＤＲｒ細胞（１×１０５）は、５０μｌのＢＤ染色バッファーに含まれる２５μＭのＡｂ＃６または２５μＭのＥｒｂｉｔｕｘ（対照として）を用いて、３０分間、氷上でプレインキュベートされた。３０分後、５０μｌの２μＭビオチニル化Ｅｐｉを細胞に添加し、さらに３０分間、氷上でインキュベートした。これは、１２．５μＭ抗体および１μＭのＥｐｉの最終濃度を与えた。次に、細胞を５００μｌのＢＤ染色バッファーを用いて２回洗浄し、ＢＤ染色バッファーに含まれる１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μｌとともに４５分間、インキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、３００μｌのＢＤ染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。陽性対照として、１×１０５のＡＤＲｒ細胞は、１μＭのＥｐｉとともに、３０分間、氷上でインキュベートされ、２回洗浄され、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートされた。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、細胞は、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥの１００μｌだけとともに４５分間インキュベートされた。
この実験の結果を図１９Ａおよび１９Ｂに示す。図１９Ａに示されるように、エピレグリンは、ＥｒｂＢ３陽性ＡＤＲｒ細胞に結合する。さらに、図１９Ｂに示されるように、この結合は、ＥｒｂｉｔｕｘとＡｂ＃６の両方によって阻害され、これは、エピレグリンがＥＧＦＲとＥｒｂＢ３の両方に結合し得ることを示唆している。
更なる実験は、Ａｂ＃６が、腫瘍細胞に対するＥＧＦ様リガンド（例えば、ＨＢ−ＥＧＦ）の結合を阻害することができるかを調べるために行った。
ＡＤＲｒ細胞（１×１０５）は、５０μｌのＢＤ染色バッファーに含まれる２５μＭのＡｂ＃６または２５μＭのＥｒｂｉｔｕｘ（対照として）を用いて、３０分間、氷上でプレインキュベートされた。３０分後、５０μｌの４００ｎＭビオチニル化ＨＢ−ＥＧＦを細胞に添加し、さらに３０分間、氷上でインキュベートした。これは、１２．５μＭ抗体および２００ｎＭのＨＢ−ＥＧＦの最終濃度を与えた。次に、細胞を５００μｌのＢＤ染色バッファーを用いて２回洗浄し、ＢＤ染色バッファーに含まれる１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＰＥ（ＰＥ＝フィコエリトリン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１００μｌとともに４５分間、インキュベートした。最後に、細胞を２回洗浄し、３００μｌのＢＤ染色バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。陽性対照として、１×１０５のＡＤＲｒ細胞は、２００ｎＭのＨＢ−ＥＧＦとともに、３０分間、氷上でインキュベートされ、２回洗浄され、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥとともに４５分間、インキュベートされた。ストレプトアビジン−ＰＥ結合体からのバックグラウンド染色を評価するために、細胞は、１：２００に希釈されたストレプトアビジン−ＰＥの１００μｌだけとともに４５分間インキュベートされた。
図２０Ａおよび２０Ｂに示されるように、ＨＢ−ＥＧＦは、ＡＤＲｒ細胞のＥｒｂＢに結合し、Ａｂ＃６は、この結合を阻害しない。これは、Ａｂ＃６が、ＥｒｂＢ３に対するＥｒｂＢ３リガンド（例えば、ヘレグリンおよびエピレグリン）の結合の阻害に特異的であることを証明している。
（実施例１１）
腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ分泌の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、癌細胞）のＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力は、ＶＥＧＦ分泌アッセイ（ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ．＃ＤＹ２９３Ｂから利用可能である）を用いて試験された。最初に、未処理、並びにＨＲＧ−ベータ１処理されたＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、およびＣＯＬＯ−３５７細胞におけるＶＥＧＦ分泌を阻害するＡｂ＃６の能力を分析した。これらの研究は、ＣＯＬＯ−３５７が培地中に最大量のＶＥＧＦを分泌したことを示した。また、これらの細胞は非常に高いＨＲＧレベルを有するので（データ示さず）、培地へのＨＲＧの添加は、ＶＥＧＦ分泌をさらに誘導することができなかった（図２４Ａ）。対照的に、ＨＲＧは、ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ細胞におけるＶＥＧＦ分泌を誘導することができた。
Ａｂ＃６は、３つの全ての細胞系統において高いレベルで強力な阻害効果を示し、最大はＣＯＬＯ−３５７においてであった（図２４Ａ）。また、Ａｂ＃６は、３種の異なる異種移植においてＶＥＧＦ分泌を阻害することによって、インビボで同様の効果を示し、最大はＣＯＬＯ−３５７異種移植においてであった（図２４Ｂ）。ＶＥＧＦの阻害は、ＥｒｂＢ３のリン酸化の阻害と相関している（図２４Ｃ）。また、ＶＥＧＦ分泌の阻害は、腫瘍細胞の新脈管形成の阻害と相関している。特に、骨髄腫細胞分泌因子、例えばＶＥＧＦおよびｂＦＧＦは、新脈管形成を誘発することは特定されている（例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（４９３５）：１３０６−９；Ｙｅｎら（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（３１）：３４６０−９を参照されたい）。
（実施例１２）
細胞移動の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞（例えば、ＭＣＦ−７細胞）の移動を阻害するＡｂ＃６の能力は、トランスウェルアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，Ｃａｔ ＃ＥＣＭ５５２）を用いて試験された。最初に、ＭＣＦ−７細胞は、一晩、血清を枯渇され、次に、Ａｂ＃６（最終濃度８ｕＭ）の存在および欠如下、１５分間、室温でインキュベートされた。その後、細胞が移動できるＩ型コラーゲンを被覆したメンブレンによって下段チャンバーと分離されている上段チャンバーに細胞を移した。１０％ＦＢＳは、Ａｂ＃６の存在および欠如下で、化学誘引物質として作用するように下段チャンバーの培地に添加された。チャンバーを３７℃で１６時間インキュベートし、次に、メンブレンを通過して移動した細胞は、脱着バッファーを用いて取り除かれ、細胞結合蛍光色素とともにインキュベートされた。蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を定量した。平均の蛍光±ＳＥＭ（ｎ＝２）を図２５に示す。
図２５に示されるように、１０％ＦＢＳは、未処置の対照（レーン１）と比較して、細胞移動（レーン３）を刺激し、８ｕＭのＡｂ＃６は、ＦＢＳ誘導の細胞移動を阻害する（レーン４）。
（実施例１３）
スフェロイド増殖の阻害
ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖を阻害するＡｂ＃６の能力は、発達している腫瘍増殖の状態を近似するアッセイ（Ｈｅｒｍａｎら（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）を用いて調べた。ＡｄｒＲおよびＤＵ１４５スフェロイドは、ハンギングドロップ法（Ｈｅｒｒｍａｎら、２００８）を用いて、９６ウェルプレートのウェルあたり１個のスフェロイドの頻度で開始された。次に、個々のスフェロイドは、指示されるようなＡｂ＃６（最終濃度８ｕＭ）、ヘレグリン−β１ＥＧＦドメイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ ＃３９６−ＨＢ、最終濃度３．４ｎＭ）、または両方の組み合わせのいずれかで処理された。スフェロイドの直径は、第１日から第１３日で光学顕微鏡（１０×対物）を用いて測定された。
Ａｂ＃６は、ＡｄｒＲ細胞におけるスフェロイド増殖を阻害する（図２６Ａ）。さらに、３．４ｎＭのＨＲＧは、スフェロイド増殖を刺激し、Ａｂ＃６は、ＨＲＧ効果を阻害する（図２６Ｂ）。ＤＵ１４５から得られるスフェロイドは、実験の１３日間、大きさが増加しなかった；しかしながら、増殖は、ＨＲＧ１−ベータ１によって有意に刺激された。これらの細胞において、８ｕＭのＡｂ＃６はＨＲＧ誘導のスフェロイド増殖を阻害する（図２６Ｃ）。
（実施例１４）
シグナル伝達の阻害
異なるリガンドによって誘導されるシグナル伝達を阻害するＡｂ＃６の能力を調べた。例えば、ＥｒｂＢ３受容体を発現しているＡｄｒＲ細胞に対するＨＲＧおよびＢＴＣ結合におけるＡｂ＃６の効果を試験した。図２７ＡおよびＢに示されるように、ＦＡＣＳ分析を用いて、Ａｂ＃６は、ＡｄｒＲ細胞への結合に対してＢＴＣではなくＨＲＧと競合する。したがって、ＥｒｂＢ３に対するＨＲＧ結合のＡｂ＃６のブロックは、ＨＲＧによって誘導されるシグナル伝達を妨げることになる。
さらに、ＥｒｂＢ３リン酸化の誘導について種々のリガンドを試験した。３つのリガンドであるＨＲＧ、ＢＴＣ、およびＨＧＦは、ＡｄｒＲ細胞におけるＥｒｂＢ３誘導のリン酸化を刺激することができ、ＥＧＦはできなかった。図２８に示されるように、Ａｂ＃６は、ＡｄｒＲ細胞におけるＨＧＦ誘導のｐＥｒｂＢ３リン酸化を阻害する（図２８）。さらに、当該技術分野において知られているように（例えば、Ｗａｌｌｅｎｉｕｓら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５６（３）：８２１−９ １０７０２３９８を参照されたい）、増大したＨＧＦシグナル伝達は、種々の上皮および非上皮腫瘍に見いだされた。
ＥｒｂＢ３／ｃＭＥＴ相互作用、並びにこの相互作用の調節におけるＡｂ＃６の役割
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）における活性化変異を担持する非小細胞肺癌は、ＭＥＴおよびＨＥＲ３を補充することによって、即ち、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ細胞生存経路を活性化することによってチロシンキナーゼインヒビターに耐性を発現することが知られている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１０３９−１０４３；Ｇｏｕ（２００７）ＰＮＡＳ：１０５（２）：６９２−６９７）。活性化ＥＧＦＲ変異を担持する細胞系統におけるＥＧＦＲとｃ−ＭＥＴとの間の関連性は、同時免疫沈降によって十分に確かめられている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら、２００７；Ｇｏｕ，２００７）。Ｇｕｏらは、最近、ｃ−ＭＥＴおよびＥｒｂＢ３も、同時免疫沈降を用いて、増幅したｃ−ＭＥＴに依存することが知られている胃の細胞系統ＭＫＮ４５において複合体で存在することを示した。
また、このｃ−ＭＥＴ−ｅｒｂＢ３相互作用は、野生型ＥＧＦＲを担持しているＡｄｒＲ細胞に起こり、増幅したｃ−ＭＥＴに依存しない。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）は、図２８に示されるように、投薬量に依存した様式でＡｄｒＲ細胞においてＥｒｂＢ３リン酸化を誘導する。さらに、Ａｂ＃６は、ＨＧＦ誘導のｅｒｂＢ３のリン酸化を阻害する。
また、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両者のリン酸化に対するＨＲＧおよびＢＴＣの効果が調べられ、ＨＲＧおよびＢＴＣは、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両方のリン酸化を誘導することが見いだされた。ＨＲＧは、ＥｒｂＢ３のリン酸化のより強力な誘導物質であることが見いだされ、ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１のリン酸化の強力な誘導物質であった（図２９）。このリン酸化は、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間の複合体によって駆動される可能性がある。要約すると、ＥｒｂＢ３へのＨＲＧ結合は、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間の複合体形成を誘導し、両方の受容体の活性化をもたらす。同じ現象は、ＢＴＣについてもありそうであり、この場合、ＥｒｂＢ１に対するＢＴＣ結合は、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ３との間の複合体形成を刺激し、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３の両方のリン酸化をもたらす。
リガンド（ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、およびＨＧＦ）刺激ＥｒｂＢ３リン酸化の抗体阻害
リガンド（ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、およびＨＧＦ）誘導のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するＡｂ＃６の能力は、下記の方法に基づいて調べられた：
１．１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に３０，０００細胞／ウェル／１００μＬの密度で９６ウェルプレートにＡｄｒＲ細胞を播種し、一晩増殖させた；
２．翌日、培地をＦＢＳを含まない培地に変えることによって細胞を血清枯渇にし、一晩増殖させた；
３．異なる濃度のＡｂ＃６（０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ）、またはバッファー（対照）を用いて２時間、細胞を前処理した；
４．次に、細胞を１０ｎＭ ＨＲＧおよびＨＧＦで１０分間、または１０ｎＭ ＢＴＣおよびＥＧＦで５分間刺激した；
５．培地を除去することによって反応を停止させ、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄した；
６．その後、１×プロテアーゼインヒビターおよび１×ホスファターゼインヒビターを含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＋７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％ｖ／ｖグリセロールに細胞を溶解させ；そして、
７．ＥｒｂＢ３リン酸化は、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥｒｂＢ３ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ．ＤＹＣ１７６９）を用いて、製造業者の指図書に従って、細胞溶解物において測定された。
ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３タンパク質複合体形成の抗体阻害
ＡｄｒＲ細胞は、バッファー（対照）、または２５０ｎＭ Ａｂ＃６とともに６０分間、室温でプレインキュベートされ、次に１０ｎＭ ＨＲＧもしくは１０ｎＭ ＢＴＣまたは対照バッファーを用いて１０分間処理された。０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、５０ｍＴＵ／ｍＬアプロチニン、および１００ｕＭロイペプチンを含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＋７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．０％ ＣＨＡＰＳ、１０％ｖ／ｖグリセロールに細胞を溶解し、粗製溶解物を簡単に遠心して、不溶性物質を除去した。上清は、新しいエッペンドルフチューブに移され、そして抗ＥｒｂＢ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２８５）を１：５００希釈で添加した。上清は、穏やかに振とうしながら、４Ｃで一晩インキュベートされた。６０ｕｌのＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ＃２０４２１）は、初めに１×ＰＢＳで洗浄された。細胞溶解物−抗体混合物をＰＢＳ洗浄したビーズに添加し、穏やかに振とうしながら４℃で２時間インキュベートした。次に、免疫沈降物を氷冷した溶解バッファーを用いて３回洗浄し、３０ｕｌの２×ＳＤＳ試料バッファーに再懸濁させ、９５℃で７分間熱変性し、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で移動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１０％ＭｅＯＨを含むＴｒｉ−グリシンバッファー中でＰＶＤＦメンブレンに電気的に移した。１０ｍｌのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，Ｃａｔ＃９２７−４００００）中でメンブレンを１時間ブロッキングし、次に、１０ｍｌのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃９２７−４００００）に含まれる１：１０００での抗ＥｒｂＢ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，Ｃａｔ＃２９Ｄ８）とともにインキュベートした。シグナルは、１０ｍｌのブロッキングバッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃９２７−４００００）に含まれる１：５０００（２μｌ）でのヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００を用いて検出された。
また、Ａｂ＃６は、ＨＲＧによって刺激されたＥｒｂＢ２／３複合体形成を完全に阻害することが示された（図２９Ｂ）。
均等物
当業者は、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の特定の態様の多くの均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。従属クレームに開示されている態様のいずれかの組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図される。
参照による援用
本明細書に言及されている全ての刊行物、特許、係属している特許出願は、全体として参照により本明細書に援用される。

Claims (54)

  1. ＥｒｂＢ３に結合し、ＥＧＦ様リガンド媒介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  2. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分は、下記の特性：
    （ｉ）ＥｒｂＢ３を介したヘレグリン、エピレグリン、ベータセルリン、エピゲンもしくはビレグリン（ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）媒介のシグナル伝達の阻害；
    （ｉｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の増殖の阻害；
    （ｉｉｉ）細胞表面上のＥｒｂＢ３レベルを減少させる能力；
    （ｉｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のＶＥＧＦ分泌の阻害：
    （ｖ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞の移動の阻害；
    （ｖｉ）ＥｒｂＢ３を発現している細胞のスフェロイド増殖の阻害；および／または
    （ｖｉｉ）ＥｒｂＢ３のドメインＩに位置したエピトープへの結合
    の１以上を示す単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  3. 請求項１および請求項２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分がＥｒｂＢ３に結合し、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定すると、ＫＤが少なくとも約８ｎＭまたはそれよりも良好である、抗体またはその抗原結合部分。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、前記ＥＧＦ様リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、アンフィレグリンおよびビレグリンからなる群から選択される、抗体またはその抗原結合部分。
  5. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３５、または配列番号３７に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  6. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３６、または配列番号３８に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  7. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号３５、または配列番号３７に記載される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  8. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３６、または配列番号３８に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  9. 請求項７に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３６、または配列番号３８に記載される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、抗体またはその抗原結合部分。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体によって結合されるエピトープと同じであるかまたは該エピトープと重複しているエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分。
  11. ＥｒｂＢ３のアミノ酸配列の残基２０−２０２に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
  12. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、
    ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；および
    ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域
    を含み、ここで、該重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号９、１５、２１、４１、４７、およびその保存されたアミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  13. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号１２、１８、２４、４４、５０およびその保存されたされた配列改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  14. 前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号８、１４、２０、４０、４６およびその保存された配列改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２または１３に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  15. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号１１、１７、２３、４３、４９、およびその保存された配列改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  16. 前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号７、１３、１９、３９、４５、およびその保存された配列改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  17. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号１０、１６、２２、４２、４８、およびその保存された配列改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
  18. ＥｒｂＢ３に結合し、
    （ａ）配列番号７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号１１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および
    それらの組み合わせ；
    （ｂ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および
    それらの組み合わせ；
    （ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および
    （ｄ）配列番号３９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号４０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号４１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；および
    （ｅ）配列番号４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号４６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号４７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  19. ＥｒｂＢ３に結合し、
    配列番号７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    配列番号９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    配列番号１０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    配列番号１１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
    配列番号１２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
    を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  20. ＥｒｂＢ３に結合し、
    ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；および
    ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域
    を含み、ここで、該重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号９、１５および２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  21. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号１２、１８および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の抗体。
  22. 前記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号８、１４および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の抗体。
  23. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号１１、１７および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２２に記載の抗体。
  24. 前記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号７、１３および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２３に記載の抗体。
  25. 前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号１０、１６および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２４に記載の抗体。
  26. ＥｒｂＢ３に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、ヒトＶＨ３生殖細胞系列遺伝子由来である重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
  27. 請求項２６に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、さらにヒトＶＬ２生殖細胞系列遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合部分。
  28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体およびキメラ抗体からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合部分。
  29. 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体またはその抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、およびドメイン抗体からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合部分。
  30. 請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、該抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合部分。
  31. 薬学的に許容される担体に含まれる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む組成物。
  32. 請求項１〜３１のいずれか１項に記載の２以上の抗体を含む組成物であって、該抗体がＥｒｂＢ３の異なるエピトープに結合する、組成物。
  33. 配列番号２５の重鎖可変領域、配列番号２６の軽鎖可変領域、配列番号２７の重鎖可変領域、配列番号２８の軽鎖可変領域、配列番号２９の重鎖可変領域、配列番号３０の軽鎖可変領域、またはそれらの組み合わせと少なくとも９０％同一である配列を含む、ＥｒｂＢ３に結合するヒト抗体の可変領域をコードする単離された核酸。
  34. 高ストリンジェントな条件下で、配列番号２５の重鎖可変領域、配列番号２６の軽鎖可変領域、配列番号２７の重鎖可変領域、配列番号２８の軽鎖可変領域、配列番号２９の重鎖可変領域、または配列番号３０の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列を含む、ＥｒｂＢ３に結合するヒト抗体の可変領域をコードする単離された核酸。
  35. 請求項３３または３４に記載の核酸を含む発現ベクター。
  36. 請求項３５に記載の核酸を含む宿主細胞。
  37. 請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合部分と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  38. 請求項１〜３７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合部分と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニック植物。
  39. 請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分を産生するハイブリドーマ。
  40. ＥｒｂＢ３に結合するヒト抗体を産生するハイブリドーマであって、該抗体が、
    （ａ）配列番号２５に記載の重鎖可変領域ヌクレオチド配列と配列番号２６に記載の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、およびそれらの保存された配列改変体；
    （ｂ）配列番号２７に記載の重鎖可変領域ヌクレオチド配列と配列番号２８に記載の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、およびそれらの保存された配列改変体；または
    （ｃ）配列番号２９に記載の重鎖可変領域ヌクレオチド配列と配列番号３０に記載の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、およびそれらの保存された配列改変体
    によってコードされる、ハイブリドーマ。
  41. 請求項１〜４０のいずれか１項に記載の１以上の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含み、場合により、ＥｒｂＢ３依存性シグナル伝達と関連した疾患の処置または診断における使用のための指図書を含むキット。
  42. 前記疾患が癌である、請求項４１に記載のキット。
  43. 被験体においてＥＧＦ様リガンドが媒介するＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する方法であって、ＥＧＦ様が媒介するＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するのに十分な量で、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与する工程を含む、方法。
  44. 請求項１〜４３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含む、該被験体における癌を処置する方法。
  45. 前記癌が、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、腎臓癌腫、胃腸／結腸癌、肺癌、明細胞肉腫、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記被験体がヒトである、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記抗体またはその抗原結合部分が、前記被験体に静脈内、筋肉内、または皮下に投与される、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記抗体またはその抗原結合部分が第２の治療用薬物と併用して投与される、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記第２の薬物が第２の抗体またはその抗原結合部分である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記第２の薬物が抗癌剤である、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記抗癌剤が、抗体、小分子、代謝拮抗物質、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的化剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、免疫治療剤、ホルモンまたはその類似体、ソマトスタチン類似体、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｏｃｏｉｄ）、アロマトース（ａｒｏｍａｔｏｓｅ）阻害剤、およびｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記抗体が、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、または抗ｃｍｅｔ抗体である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記小分子が、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、またはｃｍｅｔに結合する、請求項５１に記載の方法。
  54. （ａ）前記被験体から得られるエクスビボまたはインビボの細胞と、請求項１〜３０のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分とを接触させる工程と、（ｂ）該細胞上のＥｒｂＢ３への結合レベルを測定する工程とを含み、ここで、異常に高いレベルのＥｒｂＢ３への結合は、該被験体がＥｒｂＢ３と関連した癌を有することを示す、該被験体におけるＥｒｂＢ３と関連した癌を診断する方法。
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