JP2010540415A - ウルフベリー及び炎症 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般に、炎症の分野に関する。特に本発明は、炎症を治療又は予防する製品の調製のための天然化合物の使用に関する。例えば、ウルフベリーの抽出物は抗炎症性を有すること示した。本発明の一つの実施形態は、炎症を治療又は予防する製品の調製のために、ウルフベリー又はその一部を含む一次組成物の使用に関する。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、一般に炎症の分野に関する。特に本発明は、炎症を治療する製品の調製のための天然化合物の使用に関する。例えば、ウルフベリーの抽出物は抗炎症性を有することが示された。

炎症は、病原体、損傷細胞又は刺激物などの、有害な刺激に対する組織の複雑な生物反応である。炎症は一般に、障害性刺激を除去し、かつ組織の治癒過程を開始する生体の防衛的な試みである。しかし、十分に制御されない炎症は、患者の年齢に関係なく種々の疾患につながる可能性がある。

加齢は、進展した体液性免疫機能不全（例えば、ワクチンに対する反応性低下）に付随する細胞性免疫応答の顕著な低下などの、免疫系の調節不全と関連している。その上に、加齢は、軽度の炎症状態に関連することが多い。したがって、とりわけ多くの高齢患者は、疾病率と死亡率に寄与する感染疾患及び非感染疾患リスクの増加にさらされている。

ウルフベリーは、その複合栄養素（例えば、ゼアキサンチン、ビタミン類、及びナガバクコの多糖体）の組成にもとづく多数の健康効果が、すでに知られている。

しかし、当技術分野には、抗炎症性を有する利用可能な天然化合物を手に入れる必要が依然としてある。

例えば、ｎ−３ＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）などによる栄養学的介入は、炎症細胞の機能を低下させたが、宿主防御に関して潜在的な有害作用に至ることがある、細胞性免疫応答（例えば、リンパ球増殖やＮＫ活性）もまた低下させた。

したがって、抗炎症性を有し、対象の免疫防御に関して有害作用が全くない、代替的な天然化合物を当技術分野に提供することが、本発明の目的であった。

本発明者らは、ウルフベリーの抽出物が抗炎症性を有することを見出して驚いた。その結果、炎症を治療及び／又は予防する製品を調製するために、ウルフベリーの抽出物の使用を当技術に提供することによって、本発明の目的を達成した。また、免疫反応も維持されることが分かった。

したがって、本発明の一つの実施形態は、炎症を治療及び／又は予防する製品を調製するために、ウルフベリー又はその一部、並びに場合により乳、又は乳タンパク質含有担体を含む一次組成物の使用となる。

製品は、経口投与用又は局所投与用を対象としてもよい。

乳及び乳タンパク質は、動物若しくは植物由来のもの、又はそれらの混合物から得ることができる。好ましくは、乳は、牛乳、ラマの乳、水牛の乳、山羊乳、羊の乳、植物性の乳（特に豆乳）、又はそれらの混合物である。乳タンパク質は、上に挙げた１つ又は複数の乳の種類のものから得ることが可能なタンパク質分画と理解されるべきである。

好ましくは、一次組成物は、混和性の組成物である。

有利なことに、特に一次組成物が乳、又は乳タンパク質含有担体を含む場合、その組成物は、全ウルフベリーの必須活性成分と近似したプロフィルを有し、水溶液系において、安定性、混和性及び／又は分散性が良好である。

さらに、特に乳、又は乳タンパク質含有担体を含む場合、一次組成物は、生物学的利用能及び安定性がよりすぐれた形状で、栄養的価値が高くなっている。この一次組成物は、舌触りのよい味覚と色彩を有しており、直接、濃縮、又は数回にわけて適用するために粉末に乾燥させて、日常的に摂取される食品中又は他の栄養利用へ使用してもよい。

これら全ての特徴は、一次組成物を、ウルフベリーの親油性及び／又は親水性の必須生物活性成分を送達する一次組成物を調製するための方法によって調製する場合に、達成してもよい。この方法は、ｉ）乳、又は乳タンパク質含有液状媒体中で、ウルフベリー材料を混合し粉砕するステップ、ｉｉ）任意に不溶性繊維を分別し、水性懸濁液を得るステップ、ｉｉｉ）得られた懸濁液を任意に低温殺菌するステップ、ｉｖ）加工中に合成又は天然の生物活性成分を任意に加えるステップ、ｖ）及び、さらに懸濁液を任意に乾燥させ、粉末を得るステップを含む。

したがって、本発明の一つの実施形態では、一次組成物は、ｉ）乳、又は乳タンパク質含有液状媒体中で、ウルフベリー材料を混合し粉砕するステップ、ｉｉ）任意に不溶性繊維を分別し、水性懸濁液を得るステップ、ｉｉｉ）得られた懸濁液を任意に低温殺菌するステップ、ｉｖ）加工中に合成又は天然の生物活性成分を任意に加えるステップ、ｖ）及び、さらに懸濁液を任意に乾燥させ、粉末を得るステップを含む方法により得られる。

この方法は、自然で、費用効率が高いという大きな利点を有し、天然組成物中の安定化した水溶性及び脂溶性化合物を組み合わせた形態の、複合栄養素の送達を有機溶媒残渣を含まずに改善することを可能にする。

別の態様では、本発明は、上記の方法を用いて、特に、乳若しくは乳タンパク質、豆乳又は植物由来の乳様タンパク質を、ウルフベリーの機能性成分の複合栄養素を抽出し、送達するために使用することにより、ウルフベリー材料の生物活性化合物の、水溶液系における混和性又は分散性、安定性及び生物学的利用能を高める方法を提供する。

上記の一次組成物は、生物学的利用能、混和性及び安定性が向上したウルフベリーの複合栄養素の機能性成分を送達するために、使用してもよい。

用語、生物活性化合物は、経口的又は経皮的に使用した場合、生物活性又は健康への影響を示す分子又は成分を意味すると理解されたい。

ウルフベリーは、例えば、果実及び植物の他の部分の形で使用してもよい。果実は、生、濃縮、又は、乾燥材料、例えば、空気乾燥若しくは凍結乾燥材料の形で使用してもよい。しかし、乾燥した完熟果実を使用するのが好ましい。

本発明の好ましい実施形態では、一次組成物は、ウルフベリーの親油性及び／又は親水性の必須生物活性成分の少なくとも一部を含んでいる。

親油性及び／又は親水性の必須生物活性成分は、好ましくは、脂質、アルカロイド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、カロテノイド、若しくはフラボノイド、ビタミン、ミネラルなどのポリフェノール化合物、又はそれらの混合物から成る群から選択される。

カロテノイドは、リコペン、カロテン、フィトフルエン、フィトエン、カンタキサンチン、βクリプトキサンチン、カプサンシン、ルテイン、ゼアキサンチンなどのカロテン類及びキサントフィル類、若しくはそれらの脂肪酸エステル形態のもの、又はそれらの混合物から成る群から選択してもよい。

糖タンパク質は、好ましくは、アラビノガラクタンタンパク質、特にナガバクコ（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ）の多糖体、及びβグルコシルヤリブ試薬で検出してもよい高分子から成る群から選択される。

フラボノイドは、好ましくは、アピゲニン、ルテオリン若しくはジオスメチンなどのフラボン類、ケルセチン、ミリセチン、ケンペロールなどのフラボノール類、フラバノン類、ペラルゴニジン、マルビジンなどのアントシアニジン類、又はゲニステイン、ダイゼインなどのイソフラボン類、或いはそれらの混合物から成る群から選択される。

本発明の一次組成物は、乳、又は乳タンパク質含有担体中で、不溶性繊維を除いたウルフベリーの必須生物活性成分、又は少なくともその一部を含有してもよい。乳担体は、動物又は植物由来（例えば、豆乳、豆汁又はココナッツミルクなど）の脱脂乳又は全乳の形としてもよい。より好ましい実施形態では、所望する一次組成物に応じて、牛乳又は豆乳が使用される。乳含有担体は、例えば、カゼイン又は乳漿タンパク質などの乳タンパク質を含有するいずれの食用液体でもよい。

植物油を任意に液状媒体に加えることができる。

ウルフベリー材料は、前記乳、又は乳タンパク質含有液状媒体中で、約１：１〜１：１０００、好ましくは、１：５〜１：５０のそれぞれの比で混合及び粉砕してもよい。混合及び粉砕ステップは、１〜９５℃、好ましくは、約２０〜８０℃、より好ましくは、４０〜８０℃の温度で行うことができる。次に、不溶性繊維を少なくとも部分的に除去し、水性の懸濁液を得ることができる。

これは、あらゆる従来法で行うことができる。得られた一次組成物は、当技術分野で知られている技術により、さらに低温殺菌及び／又は乾燥して粉末にしてもよい。得られた一次組成物は、液状又はゲル状とすることもできる。

したがって、本発明は、果実全体と同様な重要栄養素のプロフィルを有する一次組成物を提供し、この組成物は、良好な安定性、混和性及び生物学的利用能を有している。粉末形態を選択した場合、これらの組成物は、水溶液系において分散性を高くしてもよい。この場合、粉末は、例えば冷水又は温水に分散できる。同様に良好に、それを乳中に加えることもできる。

本組成物には、さらに１種又は複数種の乳化剤、安定剤、酸化防止剤及び他の添加剤を含めることができる。好ましくは、例えば、レシチンなどのリン資質、ポリオキシエチレン、ソルビタンのモノもしくはトリステアレート、モノラウレート、モノパルミテート、モノもしくはトリオレエート、モノ又はジグリセリドなどの、食物中に適合できる乳化剤が使用される。

食物、化粧品又は医薬品中で使用可能であると知られている、あらゆるタイプの安定剤も、また使用してもよい。

食物、化粧品又は医薬品中で使用可能であると知られている、あらゆるタイプの酸化防止剤を、使用してもよい。

さらに、食物、化粧品又は医薬品中で使用できることが知られている、添加剤、香味料、着色料を使用してもよい。

乳化剤、安定剤、酸化防止剤及び添加剤は、一次組成物の最終使用目的に従って添加してもよい。

本組成物は、さらに、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、カロテノイド、ポリフェノールなどの、合成又は天然の生物活性成分を含有することができ、この成分は、好ましくは、低温殺菌及び／又は乾燥前に、乾式混合又は湿式混合のいずれかにより、該組成物に添加してもよい。

本発明を用いることにより調製される製品は、食品サプリメント、医薬品として若しくは医薬品中で使用されるサプリメント、又はクリームとして若しくはクリーム中で使用されるサプリメントとしてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、製品は、ヒト又はペットへ使用する目的、及び／又はヒト又はペットに適用する目的のものである。

製品は、あらゆる年齢の患者に投与することができ、特に乳児、小児、青年、成人、及び／又は高齢者に投与してもよい。しかし、ウルフベリーの利点は、特に成人及び高齢者によく適したものであると思われる。

本発明の好ましい実施形態によると、本発明を用いることにより調製される製品は、食品中で又は食品としてヒトに消費されるようになされたものである。食品は、経腸的（本発明の目的では経口的を含める）、又は非経口的に摂取してもよい。

したがって、一次組成物は、栄養組成物、食品サプリメント、ペットフード製品などの経口投与用食物、化粧製剤又は医薬製剤などにおける添加物としてもよい。一次組成物は、化粧品又は医薬品などの局所塗布製品における添加物にもしてもよい。

したがって、本発明を用いることにより調製される製品は、栄養分完全配合物、乳製品、冷蔵又は貯蔵飲料、授乳中の母親のための製品、液体飲料、スープ、食品サプリメント、食事代用物、栄養バー、菓子類、ミルク若しくは発酵乳製品、ヨーグルト、粉ミルク、経腸栄養製剤、特殊調製粉乳、乳児用栄養製品、ピューレ、穀物製品若しくは発酵穀物性製品、アイスクリーム、キャンディー、甘味類、ビスケット、ケーキ、チョコレート、カプチーノ、コーヒー、マヨネーズやトマトピューレ若しくはサラダドレッシングなどの料理用製品、ペットフード、又はペット飲料としてもよい。好ましい実施形態では、ヒトが消費する食品組成物は、上記の一次組成物によって補充される。好ましくは粉末状である一次組成物は、前述の生物活性栄養分の中に日常摂取をするような量で、上記の食品又は飲料中に分散させることができ、この量は、所望の作用及び目標とする組織に応じて選択してもよい。薬効を得るために、個人によって摂取される一次組成物又は食品組成物の量は、また、そのサイズ、型及び年齢によっても決まる。

製品が、経口投与用の食品サプリメントである場合、カプセル、ゼラチンカプセル、軟カプセル、錠剤、糖衣錠、丸薬、ペースト剤又はトローチ、ガム類、飲用液剤又は乳剤、シロップ又はゲル剤として存在してもよい。一次組成物の用量は、当業者の用途により変更してもよいが、一般に、一次組成物の約０．１〜１００重量％の間となる。このようなサプリメントには、また、甘味料、安定剤、酸化防止剤、添加物、香味料及び／又は着色料を含めることもできる。化粧目的のサプリメントは、さらに、皮膚に関して活性な化合物を含むことができる。

別の実施形態では、本発明の製品が医薬品である場合、予防的及び／又は治療的処置のために投与してもよい。

治療的適用では、組成物は、疾患及びその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は阻止するために十分な量を投与する。このことを達成する適切な量は、「治療有効量」と定義する。この目的に有効な量は、当業者に知られる、患者の疾患の重症度、体重及び一般症状などの多くの因子によって決まるであろう。予防的適用では、本発明による組成物は、ある特定の疾患に罹りやすいか、さもなければそのリスクにさらされている患者に、疾患発症リスクを少なくとも部分的に低下させる十分な量を投与する。このような量は、「予防有効量」と定義する。この場合も、正確な量は、患者の健康状態及び体重などの患者の多くの個別の因子によって決まる。

医薬品として投与する場合の本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容される担体と共に投与し、担体の性質は、投与形態（例えば、経腸、経口及び局所（目薬を含む）経路）に応じて異なる。所望の剤形は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムを含む、様々な賦形剤を使用して作ることができる。

当業者は、自身の知識にもとづき、投与経路を考慮に入れながら、対象の組織、例えば、皮膚、結腸、胃、眼、腎臓又は肝臓に対する活性化合物に的を絞るために、適切な組成物及び生薬形を選択することを理解されたい。

本発明は、また、前述の一次組成物を含有する化粧品組成物にも関する。この組成物は、例えば、ローション、シャンプー、クリーム、日焼け止め、日焼け用アフタークリーム、老化防止クリーム及び／又は軟膏中に、配合してもよい。局所的に使用できるこの組成物は、例えば、ＣＴＦＡ（トイレ化粧品・香料工業協会（ワシントン））の研究である化粧品成分ハンドブックの中で言及しているような、化粧品に使用できる油脂又はオイルをさらに含む。他の美容的に活性な成分を加えることも、また可能である。本組成物は、さらに構造化剤及び乳化剤を含む。他の賦形剤、着色剤、香料又は乳白剤もまた、組成物に加えることができる。本化粧品は、当業者に既知の様々な成分の混合物を含有して、該物質の皮膚内への迅速な浸透を確保し、かつ貯蔵中の劣化を防ぐことを理解されたい。

本発明の概念を、現在使用している薬物療法を援助する補助療法として、同様に適用できることを理解されたい。本発明の化合物は、食品材料と一緒に容易に投与してもよいので、該物質の高容量を含有した特別な医療食品を使用してもよい。

前述の食品、栄養サプリメント、化粧品又は医薬品の組成物を、ペット又はヒトに投与することで、特に少なくとも部分的に炎症を低減させることにより、健康の向上をもたらす。

本発明を用いることにより調製される製品を適用して治療してもよい炎症は、敗血症、感染症、火傷などの急性炎症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、壊死性小腸大腸炎などの慢性炎症、ＵＶ又は化学物質誘発皮膚炎などの皮膚炎、湿疹、反応性皮膚、乾癬、白斑、にきび、炎症性腸症候群、肝炎、アルコール性肝硬変、アレルギー、アトピー、骨の炎症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、グージェローシェーグレン症候群、ライター症候群、灰白髄炎、皮膚筋炎、甲状腺炎、バセドー病、橋本病、１型糖尿病、アジソン病、自己免疫性肝炎、セリアック病、ビールマー病、多発性硬化症、筋無力症、脳脊髄炎、目の炎症、肥満関連炎症、加齢に関連した軽度炎症、ブラウ症候群、アルツハイマー病、循環器疾患、アテローム性動脈硬化、メタボリック症候群、歯肉炎、及びパロンディティス（ｐａｒｏｎｄｉｔｉｓ）から成る群から選択してもよい。

本発明者らは、本発明の一次組成物の抗炎症作用の分子機構を研究した。理論に拘わることを望まないが、本発明者らは、本組成物は、マクロファージによる炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ媒介性産生（図１）、及びヒトの腸上皮細胞内のＴＮＦ−α又はＬＰＳにより誘発されたＮＦ−κＢの活性化（図２）の経路を抑制すると、現在確信している。前臨床試験では、本発明の一次組成物を有する食品サプリメントは、マウスの急性腸炎モデルにおいて、強力な抗炎症性を示した（図３〜１０）。加えて、本発明の一次組成物は、さらに、老齢マウスの肝臓において、ＴＮＦ−αなどの炎症誘発性サイトカインの発現を低下させることができた（図１１）。さらに、本発明の一次組成物を有する食品サプリメントは、老齢マウスにおいて、抗原特異的な体液性及び細胞介在性の免疫反応を促進した（それぞれ、図１２及び１３）。したがって、本発明の一次組成物は、炎症状態を低減させることに有益であることが分かった。同時に、本発明の一次組成物は、さらに免疫系を補助してもよい。

したがって、本発明の使用により調製される製品は、炎症状態を低減するために使用することができ、同時に、免疫系を追加免疫するために使用してもよい。

したがって、本発明の一次組成物は、障害した免疫及び炎症反応を恒常性の状態に戻す潜在力を有している。この二重の効果により、本発明の一次組成物は、例えば、高齢者、医療及びペットの食物用の製品において使用するのに適している。

特に、本発明の一次組成物は、加齢に関連する軽度炎症状態を低減させながら、加齢を重ねる間の免疫機能の維持に有益である。

また、本発明の一次組成物は、急性又は慢性炎症を管理するために、医療製品中に使用してもよい。

したがって、本発明の一つの実施形態では、本発明を使用することによって調製される製品は、障害を受けた免疫反応を改善するために使用される。また、本製品は、抗原特異性の体液性免疫反応の促進及び／又は細胞介在性免疫反応の促進のために使用することもできる。

さらに、本発明の一次組成物及び／又は製品は、酸化ストレスに関係する疾患を治療又は予防するためにも使用してもよい。本発明者らは、本発明の一次組成物及び／又は製品を適用すると、ＧＰＸ−１、ＣＡＴ１及びＳＯＤ２などの抗酸化遺伝子の激しい増加を誘発できることを示した（図９）。したがって、本発明の一次組成物及び／又は製品は、例えば、スーパーオキシドアニオン・Ｏ_２ ⁻、過酸化水素Ｈ_２Ｏ_２、ヒドロキシルラジカル・ＯＨ、有機ヒドロペルオキシドＲＯＯＨ、アルコキシラジカルＲＯ・、ペルオキシラジカルＲＯＯ・、次亜塩素酸ＨＯＣｌ、ペルオキシナイトライトＯＯＮＯ−、及び／又はＮＯ・などのフリーラジカルが原因の酸化ストレスに対する防御をもたらすことができる。

当初開示したように、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載した任意の特徴を自由に組合せることが可能であることは、当業者には明白である。

本発明の、さらなる利点及び特徴は、以下の実施例及び図から明らかになる。

マウスのマクロファージ細胞系（ＲＡＷ細胞）における、ＬＰＳ媒介ＩＬ６産生のＬＷＢによる阻害を示す図である。 ヒトの腸上皮細胞系（ＮＦ−κＢレポーター遺伝子を安定に形質移入されたＨＴ−２９）における、ＬＰＳ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＬＷＢによる阻害を示す図である。 ＴＮＢＳ投与後の体重減少（平均値±標準誤差）を示す図である。 肉眼的点数評価を示す図である。右パネル：（平均値±標準誤差）。左パネル：個々の値及び中央値。 組織学的点数評価を示す図である。右パネル：（平均値±標準誤差）。左パネル：個々の値及び中央値。 基準タンパク質（アクチン）に対するＣＯＸ−２の比を示す図である。右パネル：（平均値±標準誤差）。左パネル：個々の値及び中央値。 ｐＳＴＡＴ３発現を示す図である。右パネル：（平均値±標準誤差）。左パネル：個々の値及び中央値。 ＬＷＢの補給を行わなかった場合及び行った場合のマウスの急性腸炎モデルにおける、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１βなどの炎症誘発性遺伝子、並びにＫＣなどのタンパク質の発現を示す図である。 ＬＷＢの補給を行わなかったマウスの急性腸炎モデル及び補給を行ったマウスの急性腸炎モデルにおける、ＧＰＸ−１、ＣＡＴ１及びＳＯＤ２などの抗酸化遺伝子の発現を示す図である。 抗酸化能力を示す図である。右パネル：（平均値±標準誤差）。左パネル：個々の値及び中央値。 健常な老齢マウス（Ｈ２０）及び成体マウス（ＣＴＲＬ）の肝臓で観察されたレベルと比較した、ＬＷＢを補充した高齢マウスの肝臓における、ＴＮＦ−αをコードする遺伝子の発現を示す図である。 老齢マウスにおける、抗原（ＫＬＨ）特異的抗体反応を示す図である。 老齢マウスにおける、細胞性免疫の遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を示す図である。

［実施例１］
ウルフベリー及び乳を含む一次組成物（ＬＷＢ、ラクト−ウルフベリー）の調製
乾燥ウルフベリー果実（４０ｇ）と全乳（３００ｇ）を１リットルの容器に入れた。混合物を１０分間静置し、ポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡによる分散及び混合技術、ＰＴ３０００）を用いて、窒素雰囲気下で、２６０００ｒｐｍ、１５分間処理した。ポリトロン処理の間、混合物の温度を、水浴で８０〜８５℃に維持し、その後、室温に冷却した。次に、結果として生じる混合物を、２０００Ｇで１０分間遠心分離した。固形残渣を廃棄する。液相（３０６ｇの橙黄色の乳）を凍結乾燥した。乾燥した生成物は、最終的に粉砕し、５４ｇの橙黄色粉末が得られるが、この粉末は、ウルフベリー果実粉末に比べて、非常に良好な水分散性と向上したゼアキサンチン安定性を示した。

［実施例２］
試薬
ＮＲＣ（ネスレリサーチセンター、ローザンヌ）で製造されたパイロットバッチ、Ｎ°ＷＢ０３Ａ１５０６Ｈ由来の前述のラクト−ウルフベリー粉末（ＬＷＢ）、及びウルフベリー抽出物粉末（バッチＮ°ＷＢ０３Ａ１５０６Ｈ）は、Ｊ．Ｗａｎｇ（ＦＳ、Ｌｉｐｉｄｓ＆Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ）によって提供された。Ｅ．ｃｏｌｉ血清型０５５：Ｂ５由来のリポ多糖体（ＬＰＳ）は、シグマ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ヒトの母乳（ＨＭ）は、倫理委員会の承認を経た後、分娩後２０日目の別々の健康なドナーから採取した。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、シグマから購入した。

細胞培養
マウスの単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）由来のＴＩＢ−７１）は、１０％の熱不活化ＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロゲン、ペーズリー、英国）を追加したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ａｍｉｍｅｄ、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、アルシュビル、スイス）中で、５％ＣＯ_２／空気のインキュベーター内、３７℃に維持した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を使用して継代培養した。ヒトの結腸腺癌の細胞株ＨＴ−２９クローン３４細胞（すなわち、ＮＦ− Ｂレポーター遺伝子を安定に形質移入したＨＴ−２９細胞）は、１％の安定Ｌ−グルタミンを含有し、熱不活化（５６℃で１時間）１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロゲン）、及び１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（インビトロゲン）を補完した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、アルシュビル、スイス）中で、５％ＣＯ_２／空気のインキュベーター内、３７℃で保持した。培地は、細胞単層が９０％の集密に達するまで、２日おきに交換した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（シグマ）を使用して継代培養した。

ＬＰＳ媒介ＩＬ−６発現の定量
ＲＡＷ２６４．７細胞は、５％ＣＯ_２／空気のインキュベーター内、３７℃で、普通培地に、平底の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ロスキレ、デンマーク）中１０^４細胞／ウェルの割合で播種した。培養３日後（すなわち、細胞が約８０％の集密に達している）に細胞を、ＬＷＢサンプル（最終濃度０．１〜１％）の存在又は非存在の下で、普通培地において、０．５μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（０５５：Ｂ５、シグマ）で２４時間刺激した又はしなかった。次に、細胞培養上清を採取し、ＩＬ−６の産生量を定量するために使用した。細胞培養上清中のインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度は、製造業者の取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（Ｍｕｒｉｎｅ ＩＬ−６ Ｅｌｉ−ｐａｉｒ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ブザンソン、フランス）により測定した。

ＮＦ−κＢ活性
ＨＴ−２９クローン３４細胞は、平底の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内の維持培地に、１０^４細胞／ウェルの割合で播種した。培養３〜４日後（すなわち、細胞が８０％の集密に達している）、細胞を、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）（シグマ）中で洗浄し、次に、ＤＭＥＭ含有１％ペニシリン／ストレプトマイシン中のＬＷＢサンプルの非存在又は存在下で、２４時間かけて、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ＋５％母乳）又は組換えＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステムズ、オックスフォード、英国）で刺激した又はしなかった。次に細胞培養上清を採取し、ＮＦ−κＢ活性の分析まで＋４℃のＯ／Ｎ中で保存した。ＮＦ−κＢ活性化に続いて、ＨＴ−２９クローン３４細胞が、培地の上清にアルカリホスフォターゼを分泌する（ＳＥＡＰ）。ＳＥＡＰ放出は、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ベッドフォード、米国）の取扱説明書に従って、蛍光検出法（ホスファ−ライト（Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ）（商標）システム）を用いて測定した。手短に言うと、細胞培養上清を、平底の白色９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）内で、ホスファ−ライト（商標）システムから得た反応バッファーで２０分間培養し、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓスペクトロメーター（Ｔｅｃａｎ ８６３４、ホムブレヒティコン、スイス）を使用してルミネセンスを測定した。結果は、相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）で表す。

ＴＮＢＳ誘発結腸炎モデル
ＴＮＢＳ結腸炎モデルは、化学品のトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）により、１５０ｍｇ／ｋｇ用量で誘発した急性炎症モデルである。１群当たり１０匹のマウスを、結腸炎を誘発させる７日前から犠牲死するまで、１％のＬＷＢ（５０ｍｇ）を含有する飼料で飼育した。ＴＮＢＳ投与後の第１日〜第４日まで、急性腸炎に付随する飼料摂取の低下を補うため、５０ｍｇのＬＷＢを経管栄養により与えた。各動物の体重減少、肉眼的点数、組織学的点数、ＣＯＸ−２、ｐＳＴＡＴ３，炎症誘発性及び抗酸化遺伝子の発現、並びに酸化防止力を評価した。肉眼的点数及び組織学的点数は、Ｗａｌｌａｃｅ（Ｗａｌｌａｃｅら、１９８９）及びＡｍｅｈｏ（Ａｍｅｈｏら、１９９７）の採点基準に従って行った。誘導型シクロオキシゲナーゼであるＣＯＸ−２は、７２ｋダルトンのタンパク質で、急性炎症状態下のプロスタグランジンの誘導型生合成を担っている。Ｓｔａｔ３は、多くのサイトカイン、特に炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−６の重要なシグナル伝達分子である。

老齢マウスにおける免疫調節を評価するための試験デザイン
特定病原体未感染の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（フランス）から購入した。マウスを通常の環境（１２時間明暗サイクル、温度２２℃、湿度５６％）のもとに収容し、水及び準合成飼料Ｋｌｉｂａ ３４３４を自由に摂取させた。５ヶ月齢まで、マウスをケージ当たり５匹に維持し、次に個別にケージに入れた。環境全般及び動物の取扱いは、スイス連邦獣医アドバイザーの取り決めに関して、ネスレ及び州の倫理委員会により承認を受けた。２１ヶ月齢時点のマウスを、１０匹の２群にランダムに振り分けた。ＬＷＢを補給しない対照マウス（Ｈ２０、月齢群当たりｎ＝１０）及び補給したマウス（ＬＷＢ、月齢群当たりｎ＝１０）に、準合成飼料（ＡＩＮ−９３）を与えた。ＬＷＢは、新たに調製して１日おきに交換した、飲料水中の０．５％（ｗ／ｖ）溶液として与えた。試験中（４４日間）、全てのマウスを自由に飲食させた。同様な試験デザインを２回行い、８ヶ月齢マウスでも行った（群当たりｎ＝８）。Ｔ細胞依存性の体液性応答（抗原特異的抗体産生）のｉｎ ｖｉｖｏ試験のために、老齢マウスを、試験第１５日目に、無菌抗原Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ、シグマ）を、１％Ａｌｕｍ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、フリズリクソン、デンマーク）中１００μｇで皮下注射（１００μｌ）して免疫した。ＤＴＨ応答を細胞性免疫のｉｎ ｖｉｖｏの尺度として用いた。ＤＴＨ応答を起こす能力の測定を可能にするために、耳の厚さ（耳介腫脹）の測定を、誘発前、及び誘発後２４時間から８日間行った。手短に言えば、マウスをＫＬＨで免疫した７日後（すなわち、試験第２２日目）に、各マウスの右耳にリコール抗原ＫＬＨ（０．５μｇ／ｍｌの１０μｌ）を注射することによりＤＴＨ応答を誘発した。左耳は、溶媒（生理食塩水＝ＰＢＳ）のみで注射し、各動物の内部対照とした。誘発後の２４時間時点、及び続く７日間にわたり、誘発しなかった耳（左耳）及び誘発した耳（右耳）の両方を計測した。ＤＴＨ応答（ＫＬＨ−ＰＢＳ）は、耳介腫脹の大きさ、すなわち、次の式を用いた耳の厚さ変化として表した。耳の厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）のΔ−［誘発した耳（右、ＫＬＨ）耳の病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）−誘発しなかった（左、ＰＢＳ）耳の病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）］。ここで、耳の厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）のΔ＝［誘発後−誘発前の耳の厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）］である。血液サンプルは、第０日、第１５日、第２９日に尾静脈から、また第４４日に心穿刺を介して採取した。マウスは試験の第４４日目に犠牲死した。解剖時に、肝臓を摘出し、一部を直ちに液体窒素で氷結した。サンプルは、次の分析まで＋８０℃で保存した。

ＫＬＨ−特異的ＩｇＧ２ａ抗体濃度の定量
血清中のＫＬＨ−特異的ＩｇＧ２ａ抗体の量は、ＥＬＩＳＡにより測定した。手短に言うと、マイクロタイタープレートをＫＬＨ（１００ｎｇ／ｍｌで５０μｌ／ウェル）で塗布し、３７℃で３時間培養した。遊離結合部位は、ＥＬＩＳＡバッファーで、３７℃、１時間ブロックした。次にサンプルを加え、＋４℃で一晩培養した。結合抗体をＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（バーミンガム、米国）から取り寄せたビオチン共役の抗ヤギ−マウスＩｇＧ２ａ（γ２ａ鎖特異的）と振盪しながら、３７℃で１時間反応させた。プレートは、ＫＰＬから取り寄せたＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加えた後、４５０ｎｍで読み取った。抗ＫＬＨ ＩｇＧ２ａ抗体の濃度は、ＯＤ_{４５０ｎｍ}値の平均値として表した。

遺伝子発現
肝臓サンプルを、１ｍｌのＲＮＡ溶解バッファー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、デューレン、ドイツ）中に移し、Ｒｉｂｏｌｙｚｅｒ（Ｈｙｂａｉｄ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いて次の設定でホモジナイズした：出力６で２０秒。ＲＮＡの抽出は、市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ Ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、デューレン、ドイツ）を用いて行った。ＲＮＡの定量は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州、米国）を用いて達成し、ＲＮＡの性質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、パロアルト、米国）を用いて分析した。全ＲＮＡ（２μｇ）は、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｋｒｅｕｔｚ、スイス）の取扱説明書に従って、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素を用いて逆転写した。ＴａｑＭａｎプロ−ブ４８個付きの特別注文の低密度アレイ（ＬＤＡ）（搭載能力：テクニカルモノプリケート（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｍｏｎｏｐｌｉｃａｔｅｓ）中のカード当たり８サンプル）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、米国）から購入し、製造業者の取扱説明書に従って使用した。遺伝子発現は、ＳＤＳ２．２．２ソフトウェアを用いた相対定量法、ΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて計算した。得られた繰り返し閾値（Ｃｔ）を、次の分析のためにＭＳ Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト、米国）にエクスポートした。手短に言うと、初めにΔＣｔ値（すなわち、標的遺伝子のＣｔ値−ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子のＣｔ値）を計算し、次に以下の式を用いて相対ｍＲＮＡ発現を決定した：２^−ΔＣｔ×１０^６。

一般統計分析
データは、平均値＋／−標準誤差又は標準偏差で解析し、適切な場合、スチューデントのＴ検定（対応のない）又は二元配置ＡＮＯＶＡで解析した。５％未満の確率値を有意であると考えた。

結果
Ａ）ラクト−ウルフベリーの抗炎症性を実証する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ラクト−ウルフベリー（ＬＷＢ）溶液は、マウスのマクロファージ細胞系による、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６のＬＰＳ媒介放出（図１）、及びヒトの腸上皮細胞における、ＮＦ−κＢのＬＰＳ媒介活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制した（図２）。
Ｂ）ラクト−ウルフベリーの抗炎症作用及び免疫促進作用を実証する、ｉｎ ｖｉｖｏ試験

ａ．病理的急性炎症
ＬＷＢの食餌補給によって、マウスの急性腸炎モデルにおいて強い抗炎症性が実証された。１％のＬＷＢの経口投与により、体重減少の改善（図３）、肉眼的及び組織学的病変の改善（図４及び図５）、ＣＯＸ−２及びｐＳＴＡＴ３発現レベルの有意な減少（図６及び図７）という結果が得られた。さらに、結腸におけるＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１β、並びにＫＣなどのタンパク質の炎症誘発性遺伝子の発現が、対照群と比較して減少した（図８）。同時に、ＬＷＢにより、結腸においてＧＰＸ−１、ＣＡＴ１及びＳＯＤ２などの抗酸化遺伝子の活発な増加が誘発され（図９）、血漿中の抗酸化防御性が増大した（図１０）。

ｂ．生理的な加齢性軽度炎症
ＬＷＢの食餌補給（飲料水中０．５％）によって、老齢マウスの肝臓における炎症関連遺伝子の発現の、成体マウスで観察されたレベルまでの減少が誘発された（図１１：例として、ＴＮＦ−αをコードする遺伝子）。

ｃ．老齢マウスにおける免疫促進作用
ＬＷＢの食餌補給（飲料水中０．５％）によって、老齢マウスにおける体液性（図１２）及び細胞性免疫応答（図１３）のいずれも向上した。

Claims (15)

1. 炎症を治療及び／又は予防するための製品の調製を目的とする、ウルフベリー又はその一部を含む一次組成物の使用。
2. 前記一次組成物が、さらに乳、又は乳タンパク質含有担体を含む、請求項１に記載の使用。
3. 前記一次組成物及び／又は前記製品から、不溶性繊維取り除かれている、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記製品が、経口、局所、経腸及び／又は非経口投与を対象とし、及び／又は前記製品が、食品サプリメント、医薬品として若しくは医薬品中で使用されるサプリメント、又はクリームとして若しくはクリーム中で使用されるサプリメントであり、及び／又は前記製品が、ヒト又はペットに使用される及び／又は適用されることを意図した製品である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記製品が、食料品中で又は食料品として、例えば、栄養分完全配合物、乳製品、冷蔵若しくは貯蔵飲料、授乳中の母親のための製品、液体飲料、スープ、栄養補助食品、食事代用物、栄養バー、菓子類、ミルク若しくは発酵乳製品、ヨーグルト、粉ミルク、経腸栄養製品、特殊調製粉乳、乳児用栄養製品、ピューレ、穀物製品若しくは発酵穀物性製品、アイスクリーム、キャンディー、甘味類、ビスケット、ケーキ、チョコレート、カプチーノ、コーヒー、マヨネーズやトマトピューレ若しくはサラダドレッシングなどの料理用製品としてヒトが摂取することを意図したもの、ペットフード又はペット飲料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記製品が、錠剤、カプセル、丸薬、溶液、懸濁液、シロップ、粉末、ゲル、クリーム、乾燥経口サプリメント、湿潤経口サプリメント、ボディソープ、練り歯磨き、シャンプー、口内洗浄液、口紅、又は個人的衛生製品である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記一次組成物が、ウルフベリーの親油性及び／又は親水性生物活性成分の少なくとも一部を含んでおり、親油性及び／又は親水性生物活性成分が、好ましくは、脂質、アルカロイド、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、カロテノイド、フラボノイドなどのポリフェノール化合物、ビタミン、ミネラル、又はそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記糖タンパク質が、アラビノガラクタンタンパク質、特にナガバクコの多糖体、及びβグルコシルヤリブ試薬で検出できる高分子、又はそれらの混合物から成る群から選択され、及び／又は前記フラボノイドが、アピゲニン、ルテオリン若しくはジオスメチンなどのフラボン類、ケルセチン、ミリセチン若しくはケンペロールなどのフラボノール類、フラバノン類、ペラルゴニジン若しくはマルビジンなどのアントシアニジン類、又はゲニステイン若しくはダイゼインなどのイソフラボン類、又はそれらの混合物から成る群から選択され、及び／又は前記カロテノイドが、リコペン、カロテン、フィトフルエン、フィトエン、カンタキサンチン、βクリプトキサンチン、カプサンシン、ルテイン、ゼアキサンチンなどのカロテン類及びキサントフィル類、又はそれらの脂肪酸エステル形のもの、又はそれらの混合物から成る群から選択される、請求項７に記載の使用。
9. 前記乳が、動物若しくは植物源、又はそれらの混合物由来であり、好ましくは、前記乳が、牛乳、ラマの乳、水牛の乳、山羊乳、羊の乳、植物性の乳（特に豆乳）又はそれらの混合物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記一次組成物は、ｉ）乳、又は乳タンパク質含有液状媒体中でウルフベリー材料を混合し粉砕するステップ、ｉｉ）場合により不溶性繊維を分別し、水性懸濁液を得るステップ、ｉｉｉ）得られた懸濁液を場合により低温殺菌するステップ、ｉｖ）加工中に合成又は天然の生物活性成分を場合により加えるステップ、ｖ）及び、さらに懸濁液を場合により乾燥させ、粉末を得るステップ、を含む方法により得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記炎症は、敗血症、感染症及び火傷などの急性炎症並びに炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎及び壊死性小腸大腸炎などの慢性炎症、ＵＶ又は化学物質誘発皮膚炎、湿疹、反応性皮膚、乾癬、白斑、にきびなどの皮膚炎、炎症性腸症候群、肝炎、アルコール性肝硬変、アレルギー、アトピー、骨の炎症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、グージェローシェーグレン症候群、ライター症候群、灰白髄炎、皮膚筋炎、甲状腺炎、バセドー氏病、橋本病、１型糖尿病、アジソン病、自己免疫性肝炎、セリアック病、ビールマー病、多発性硬化症、筋無力症、脳脊髄炎、目の炎症、肥満関連炎症、加齢に関連した軽度炎症、ブラウ症候群、アルツハイマー病、循環器疾患、アテローム性動脈硬化、メタボリック症候群、歯肉炎、及びパロンディティス（ｐａｒｏｎｄｉｔｉｓ）から成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記製品が、免疫系を同時に追加免疫することにより、障害した免疫反応を改善し、抗原特異的体液性免疫反応を促進し、及び／又は細胞性免疫応答を促進する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
13. 前記製品が、乳児、小児、青年、成人及び／又は高齢者による使用を対象とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 前記製品が、免疫機能の維持及び／又は炎症状態の緩和を対象とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. 酸化的ストレスに関連する疾患を治療又は予防するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。

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