JP2010220894A - 蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行う。
【解決手段】蛍光観察装置１００と、該蛍光観察装置１００に接続され、標準試料３０と、該標準試料３０に対して蛍光観察装置１００の観察距離Ｄおよび観察角度θを変更可能に設定する観察状態設定機構３１，３２とを備える較正装置１０１と、設定された観察距離Ｄおよび観察角度θと蛍光観察装置１００により標準試料３０を撮影して取得された参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２とに基づいて、観察条件を調節する観察条件調節部１０とを備える蛍光観察システム１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光観察システム、蛍光観察装置および蛍光観察方法に関するものである。

従来、蛍光画像を反射光画像で除算して、観察距離や角度による蛍光画像の明るさの変動を補正する方法が知られている（例えば、特許文献１〜特許文献３参照。）。

特開昭６２−２４７２３２号公報 特公平３−５８７２９号公報 特開２００６−１７５０５２号公報

しかしながら、蛍光と反射光とでは、撮像される明るさの観察距離に対する依存性および観察角度に対する依存性が異なるため、単に蛍光画像を反射光画像で除算したのでは、距離および角度の影響を補正しきれないという問題がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができる蛍光観察装置、蛍光観察システムおよび蛍光観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、該較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、指数ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システムを提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。

本発明によれば、蛍光観察に先立って、蛍光観察装置を較正装置にかけることで、標準試料を使用して撮影した画像に基づいて、観察条件調節部の作動により、蛍光観察装置における、より正確な指数ａ〜ｄを算出し、かつ、εが閾値ε_ｍａｘ以下となるような観察条件を設定することができる。これにより、蛍光観察装置に存在する個体差や、着脱部品が存在する場合にはその個体差にかかわらず、観察距離や観察角度に対する依存性を十分に低減した適正な指数ｘ、ｙを設定できる。

すなわち、蛍光観察に際しては、照明部から被写体に励起光が照射されると、被写体内に存在する蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光は蛍光撮像部によって撮影され蛍光画像が取得される。一方、照明部から被写体に照明光が照射されると、被写体の表面において反射等されて戻る戻り光が戻り光撮像部によって撮影され参照画像が取得される。取得された蛍光画像は、画像補正部において参照画像を用いて補正される。

ここで、取得された蛍光画像における各画素の輝度値ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}および参照画像の輝度値ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}は、それぞれ、ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｄ^ａｃｏｓ^ｂθ、ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｄ^ｃｃｏｓ^ｄθであり、距離および角度に対して別々の依存性を有している。そこで、輝度値ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} を、何らかの指数ｘで累乗し、輝度値ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} を何らかの指数ｙで累乗することで、これらの依存性を低減することを考えた場合に、上記において算出された指数ａ〜ｄおよび式（３）を満たす定数ｍ，ｎを用いて、式（１）、（２）により算出した指数ｘ，ｙを用いることで、観察条件に起因する変動を抑え、観察距離および観察角度による依存性を最大許容誤差率の範囲内に抑えた蛍光画像を得ることができ、定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

また、本発明は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と、前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて指数ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システムを提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値

本発明によれば、指数ｘで累乗することで依存度を低減する処理を施した後にさらに、指数１／ｘで累乗することで、最終的に得られる補正された蛍光画像の輝度値と被写体内に含まれる蛍光物質の濃度との比例関係を保ちつつ、距離および角度依存性を低減することができる。

上記発明においては、ｍ＝０であることにしてもよい。
このようにすることで、影響の大きな観察距離に対する依存性をなくし、観察角度に対する依存性を許容誤差の範囲内に納めることができ、さらに定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

また、本発明は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力手段と、前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、前記画像補正部が、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置を提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。

また、本発明は、照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力手段と、前記識別情報と、指数ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、前記画像補正部が、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている指数ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置を提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値

本発明によれば、着脱部品を着脱して観察条件を変更し、着脱部品に付された識別情報が識別情報入力部から入力されると、記憶部に識別情報と対応づけて記憶されている観察条件および指数ｘ，ｙを設定することができる。着脱部品としては、例えば、内視鏡装置におけるスコープ等を挙げることができる。その場合に着脱部品の着脱によって変更される観察条件としては、対物光学系のＮＡや瞳径、観察可能な蛍光の波長等を挙げることができ、観察条件調節部により調節される観察条件としては、εが閾値ε_ｍａｘ以下となるような照明光の波長や対物光学系の絞り値あるいは照明部における絞り値を挙げることができる。例えば、スコープの交換によって対物光学系のＮＡや瞳径が変更された場合に、観察条件調節部によって、照明光の波長が調節され、変更された観察条件および調節された観察条件に対して最も距離依存性および角度依存性を低減する指数ｘ，ｙを設定でき、観察条件が変動した場合においても定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

上記発明においては、ｍ＝０であることにしてもよい。
このようにすることで、影響の大きな観察距離に対する依存性をなくし、観察角度に対する依存性を許容誤差の範囲内に納めることができ、さらに定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

また、上記発明においては、前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節手段であってもよい。
また、上記発明においては、前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りであってもよい。
また、上記発明においては、前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りであってもよい。

照明光の波長、対物光学系の開口径、照明光および励起光の光速径を変化させることによっても被写体における光の散乱や経路が変化するので、観察距離や観察角度の依存性を表す指数ａ〜ｄが変動し、これを補正するための指数ｘ，ｙが変化する。したがって、観察距離や観察角度の依存性を十分に抑えた補正蛍光画像を得るための指数ｘ，ｙを観察条件の調節によって得ることができ、これによって、より定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

また、本発明は、標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、照明光および励起光を被写体に照射し、被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法を提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。

また、本発明は、標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、指数ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、照明光および励起光を被写体に照射し、被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法を提供する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
ここで、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた指数
ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた指数
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値

除算した画像に残存する距離と角度に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察システムを示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムの較正装置を示す図である。 図１の蛍光観察システムの依存定数決定部による指数ｘ，ｙの設定方法を示すフローチャートである。 図３のフローチャートにおける指数ａ〜ｄの算出サブルーチンを説明するフローチャートである。 図１の蛍光観察システムの第１の変形例を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムの第２の変形例を示す全体構成図である。 開口が有限の大きさを有するときの被写体上の照射面への照度と距離との関係を説明する図である。 図７において開口径を変えたときの所定の条件下で得られた照度の観察距離特性を累乗近似したグラフを示す図である。 図１の蛍光観察システムの第３の変形例を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察システムにおける距離依存性および角度依存性の測定を説明する図である。 図１０の測定結果に基づく観察距離特性および観察角度特性とそれに基づく累乗近似曲線のグラフを示す図である。 本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。

以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察システム１について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る蛍光観察システム１は、図１に示されるように、内視鏡装置からなる蛍光観察装置１００と、該蛍光観察装置１００に組み合わせられる較正装置１０１とを備えている。

蛍光観察装置１００は、体内に挿入される細長い挿入部２と、光源（照明部）３と、該光源３からの照明光および励起光を挿入部２の先端から被写体Ｘに向けて照射する照明ユニット（照明部）４と、挿入部２の先端に設けられ、被写体Ｘである生体組織の画像情報を取得する撮像ユニット５と、挿入部２の基端側に配置され、撮像ユニット５により取得された画像情報を処理する画像処理部６と、該画像処理部６により処理された画像Ｇを表示するモニタ７とを備えている。

光源３は、２つのキセノンランプ８と、一方のキセノンランプ８から発せられた照明光から、励起光（例えば、長帯域６５０〜７４０ｎｍ）を切り出す励起フィルタ９と、他方のキセノンランプ８から発せられた照明光から切り出す波長を変更可能なフィルタターレット（波長調節手段：観察条件調節部）１０と、フィルタ９およびフィルタターレット１０により切り出された励起光および照明光を集光するカップリングレンズ１１と、該カップリングレンズ１１により集光された励起光および照明光を同一光路に合波するダイクロイックミラー１２とを備えている。図中符号１３はミラーである。

照明ユニット４は、挿入部２の長手方向のほぼ全長にわたって配置され、カップリングレンズ１１によって集光された励起光および照明光を導光するライトガイドファイバ１４と、挿入部２の先端に設けられ、ライトガイドファイバ１４によって導光されてきた励起光および照明光を拡散させて、挿入部２の先端面２ａに対向する被写体Ｘに照射する照明光学系１５とを備えている。

撮像ユニット５は、被写体Ｘの所定の観察範囲から戻る取り光を集光する対物レンズ１６と、該対物レンズ１６によって集光された戻り光の内、励起波長以上の光（励起光および蛍光）を反射し、励起波長より短い波長の照明光を透過するダイクロイックミラー１７と、ダイクロイックミラー１７を透過した照明光およびダイクロイックミラー１７により反射された蛍光をそれぞれ集光する２つの集光レンズ（撮像光学系）１８と、集光レンズ１８によって集光された蛍光および照明光を撮像するＣＣＤのような２個の撮像素子１９，２０とを備えている。図中、符号２１は、ダイクロイックミラー１７によって反射された光から励起光を遮断する励起光カットフィルタである。

画像処理部６は、撮像素子１９により取得された参照画像情報Ｓ_１から参照画像Ｇ_１を生成する参照画像生成部２２と、撮像素子２０により取得された蛍光画像情報Ｓ_２から蛍光画像Ｇ_２を生成する蛍光画像生成部２３と、これら参照画像生成部２２および蛍光画像生成部２３により生成された参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２に基づいて補正された蛍光画像Ｇ_３を生成する画像補正部２４と、該画像補正部２４において生成された補正された蛍光画像Ｇ_３と参照画像生成部２２において生成された参照画像Ｇ_１とを合成して画像Ｇを生成する画像合成部２５とを備えている。

ここで、蛍光画像Ｇ_２としては、例えば、蛍光色素Ｃｙ７からの蛍光画像とすればよい。特に、腫瘍特異的な蛍光薬剤、例えば、癌特異的分子ＣＥＡに対する抗体（Ａｎｔｉ−ＣＥＡ抗体）とＣｙ７とを結合させた蛍光薬剤を予め被写体Ｘに投与しておけば、腫瘍特異的な蛍光画像Ｇ_２を得ることができる。また、参照画像Ｇ_１としては、例えば、照明光が被写体Ｘの表面で反射した戻り光および被写体Ｘの内部での散乱による戻り光に基づく画像を用いればよい。

画像処理部６は、さらに、後述する較正装置１０１から送られてくる距離および角度情報と、参照画像生成部２２から送られてくる参照画像Ｇ_１および蛍光画像生成部２３から送られてくる蛍光画像Ｇ_２とに基づいて、後述する指数ｘ，ｙを算出する依存定数決定部２６を備えている。

依存定数決定部２６は、フィルタターレット１０を作動させて切り出す照明光の波長を切り替えるとともに、較正装置１０１に起動信号Ｓ_３を出力し、各照明光の波長において後述する指数ａ〜ｄを算出するようになっている。そして、依存定数決定部２６は、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が最小となる照明光の波長を求めて、その波長のフィルタ１０ａが光路上に配置されるようにフィルタターレット１０を設定し、かつ、そのときの指数ａ〜ｄに基づいて指数ｘ，ｙを選択するようになっている。依存定数決定部２６およびフィルタターレット１０は観察条件調節部を構成している。

ここで、依存定数決定部２６における指数ａ〜ｄの算出方法について説明する。
すなわち、照明ユニット４から被写体Ｘまでの距離Ｄを変更しながら、照明ユニット４から被写体Ｘに対して励起光および照明光を照射して得られた蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１の予め定められた領域の輝度値の平均値を、距離Ｄに対してプロットする。このようにして、得られた距離特性を累乗近似、すなわち、累乗関数Ｄ^ａ，Ｄ^ｃに回帰することにより観察距離Ｄに対する依存性を示す指数ａ，ｃを得る。

同様にして、観察角度θに対する指数ｂ，ｄも、照明ユニット４の光軸と被写体Ｘとの角度θを変更しながら、照明ユニット４から被写体Ｘに対して励起光および照明光を照射して得られた蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１の予め定められた領域の輝度値の平均値を、角度の余弦値ｃｏｓθに対してプロットする。このようにして、得られた余弦特性を累乗近似、すなわち、累乗関数ｃｏｓ^ｂθ、ｃｏｓ^ｄθに回帰することにより観察角度θに対する依存性を示す指数ｂ，ｄを得る。

次に、依存定数決定部２６における指数ｘ，ｙの算出方法について説明する。
一般に、蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１は、観察距離Ｄと観察角度θに対して以下のような依存性を有している。
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｄ^ａｃｏｓ^ｂθ、ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｄ^ｃｃｏｓ^ｄθ
これをこのまま除算すると、
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}／ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｄ^ａ−ｃｃｏｓ^ｂ−ｄθ
となる。
ここで、観察距離Ｄは、例えば、挿入部２の先端から被写体Ｘ表面までの距離、観察角度θは、例えば、被写体Ｘの表面の法線と対物レンズ１６の光軸（または挿入部２の長軸方向）とのなす角度とすることができる。

そこで、指数ｘ，ｙをそれぞれ蛍光画像Ｇ_２、参照画像Ｇ_１の輝度値に累乗した場合には、
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ／ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ∝Ｄ^{ａｘ−ｃｙ}ｃｏｓ^{ｂｘ−ｄｙ}θ
となるので、ここで、ｍ＝ａｘ−ｃｙ、ｎ＝ｂｘ−ｄｙとして、ｍ，ｎが許容限度となるように指数ｘ，ｙを設定する。
すなわち、
ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
であり、分母ｂｃ−ａｄ＝０となる場合には、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるように指数ｘ，ｙを設定する。

想定される最大の観察距離Ｄ_ｍａｘ、最小の観察距離Ｄ_ｍｉｎ、想定される最大の観察角度θ_ｍａｘ、最小の観察角度θ_ｍｉｎ（０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）とすると、それぞれの比ｒ_Ｄ，ｒ_θは、
ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ，ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
となり、補正蛍光画像における最大許容誤差率ｅ_ｍａｘを用いて、
ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
となるｍ，ｎを選択する。

ここで、想定される観察距離Ｄの範囲は、例えば、対物レンズ１６の被写界深度から求めることができ、想定される観察角度θの範囲は、例えば、対物レンズ１６の視野角から求めることができる。
また、ｅ_ｍａｘは、
（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ＝１＋ｅ_ｍａｘ
により求められる。
したがって、まず、予め最大許容誤差率ｅ_ｍａｘを設定し、次に式（３）を満たすようなｍ、ｎを設定し、それに基づき式（１）および式（２）を満たすようなｘ、ｙを設定すればよい。

画像合成部２５は、例えば、参照画像Ｇ_１と補正された蛍光画像Ｇ_３とを並列に配置してモニタ７に同時に表示させるよう画像Ｇを合成し、モニタ７に出力するようになっている。
画像補正部２４は、参照画像生成部２２により生成された参照画像Ｇ_１および蛍光画像生成部２３により生成された蛍光画像Ｇ_２に前処理を施す前処理部２７と、該前処理部２７において前処理を施された蛍光画像Ｇ_２’を、前処理を施された参照画像Ｇ_１’で除算する除算処理部２８とを備えている。

前処理部２７は、以下の画像処理方法を実施するようになっている。
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ （５）
ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ （６）
ここで、
ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像Ｇ_２、参照画像Ｇ_１の輝度値
ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}，ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}：前処理された蛍光画像Ｇ_２’、参照画像Ｇ_１’の輝度値
Ａ，Ｂ：定数
である。

除算処理部２８においては、画素毎に上記において前処理された蛍光画像Ｇ_２’の輝度値ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}と、参照画像Ｇ_１’の輝度値ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}とを用いて、以下の除算演算を行い、補正された蛍光画像Ｇ_３の輝度値ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}を取得する。
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}

較正装置１０１は、図２に示されるように、挿入部２を固定するホルダ２９と、該ホルダ２９に固定された挿入部２の先端面２ａに対して観察距離をあけて対向させられる標準試料３０と、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０との間の観察距離Ｄを変更する直動ステージ３１と、対物レンズ１６の光軸に対する標準試料３０の表面の角度（観察角度）を変更するチルトステージ３２と、これらのステージ３１，３２を制御する制御部３３とを備えている。

ここで、依存定数決定部２６による指数ｘ，ｙの設定方法について図３および図４を参照して説明する。
依存定数決定部２６は、図３に示されるように、まず、フィルタターレット１０を作動させて光路上に配置するフィルタ１０ａを切り替える（ステップＳ１）。そして、依存定数決定部２６は、指数ａ〜ｄ算出ステップＳ２を実施する。

指数ａ〜ｄ算出ステップＳ２においては、図４に示されるように、依存定数決定部２６から制御部３３に対して起動信号Ｓ_３が出力され（ステップＳ２１）、制御部３３は、依存定数決定部２６からの起動信号Ｓ_３を受けて、各ステージ３１，３２を駆動する。

制御部３３は、まず、標準試料３０の表面に対して挿入部２の先端面２ａが観察開始の距離となるように直動ステージ３１を駆動させ（ステップＳ２２）、そのときの観察距離Ｄを蛍光観察装置１００の依存定数決定部２６に出力する（ステップＳ２３）。この状態で、照明ユニット４から照明光および励起光を標準試料３０に対して照射し、戻り光および蛍光が撮影される（ステップＳ２４）。蛍光画像生成部２１において生成された蛍光画像Ｇ_２の輝度値および参照画像生成部２１において生成された参照画像Ｇ_１の輝度値は依存定数決定部２６に送られる（ステップＳ２５）。

そして、制御部３３は、上記ステップＳ２２〜Ｓ２５を予め定められた回数だけ、複数回にわたって繰り返す（ステップＳ２６）。これにより、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０の表面との距離が、複数点の観察距離Ｄとなるように標準試料３０を移動させ、その都度、観察距離Ｄを依存定数決定部２６に出力する。また、各観察距離Ｄにおいて得られた蛍光画像Ｇ_２の輝度値および参照画像Ｇ_１の輝度値が、蛍光画像生成部２３および参照画像生成部２２から依存定数決定部２６に送られる。

これにより、依存定数決定部２６においては、複数の観察距離Ｄとこれに対応づけられた蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１の輝度値のデータ群が記憶される。そして、予め定められた数のデータ群が集められたところで、上述したように、累乗関数に回帰し（ステップＳ２７）、観察距離Ｄに対する依存性を示す指数ａ，ｃを算出する（ステップＳ２８）。

制御部３３は、次いで、標準試料３０の表面に対して挿入部２の先端面２ａが観察開始の距離および角度となるように直動ステージ３１およびチルトステージ３２を駆動させ（ステップＳ２９）、そのときの観察角度θを蛍光観察装置１００の依存定数決定部２６に出力するようになっている（ステップＳ３０）。この状態で、照明ユニット４から照明光および励起光を標準試料３０に対して照射し、戻り光および蛍光を撮影する（ステップＳ３１）。蛍光画像生成部２３において生成された蛍光画像Ｇ_２の輝度値および参照画像生成部２２において生成された参照画像Ｇ_１の輝度値は依存定数決定部２６に送られる（ステップＳ３２）。

そして、制御部３３は、上記ステップＳ２９〜Ｓ３２を予め定められた回数だけ、複数回にわたって繰り返す（ステップＳ３３）。これにより、挿入部２の先端面２ａと標準試料３０の表面との角度が、複数点の観察角度θとなるように標準試料３０を移動させ、その都度、観察角度θを依存定数決定部２６に出力する。また、各観察角度θにおいて得られた蛍光画像Ｇ_２の輝度値および参照画像Ｇ_１の輝度値が、蛍光画像生成部２３および参照画像生成部２２から依存定数決定部２６に送られる。これにより、依存定数決定部２６においては、複数の観察角度θとこれに対応づけられた蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１の輝度値のデータ群が記憶され、予め定められた数のデータ群が集められたところで、上述したように、累乗関数に回帰し（ステップＳ３４）、観察角度θに対する依存性を示す指数ｂ，ｄを算出する（ステップＳ３５）。これにより、指数ａ〜ｄ算出ステップＳ２が終了する。

次に、依存定数決定部は、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜を算出し（ステップＳ３）、ε、ａ〜ｄおよび照明光の波長を対応づけて記憶し（ステップＳ４）、必要な全ての波長について指数ａ〜ｄが算出されたかを判定する（ステップＳ５）。必要な全ての波長について指数ａ〜ｄが算出されていないときには、ステップＳ１に戻って照明光の波長を切り替え、ステップＳ２〜ステップＳ５を繰り返す。一方、必要な全ての波長について指数ａ〜ｄが算出されているときには、εを比較して最小値となる照明光の波長と指数ａ〜ｄを決定する（ステップＳ６）。

そして、依存定数決定部２６は、決定された照明光の波長が照射されるようにフィルタターレット１０を設定する（ステップＳ７）。さらに、依存定数決定部２６は、上記により求められた指数ａ〜ｄおよび、予め設定されている許容誤差ｅ_ｍａｘに基づいて設定された定数ｍ，ｎを用いて、輝度の変動を補正するための指数ｘ，ｙを算出する（ステップＳ８）。

ここで、仮にｍ＝ｎ＝０と設定することができるならば、許容誤差ｅ_ｍａｘを限りなく０に近い値に設定することができる。つまり誤差を最小に抑えることができる。
一方で、通常は、ｍ＝ａｘ−ｃｙ、ｎ＝ｂｘ−ｄｙに対して、定数ｍ，ｎをｍ＝ｎ＝０と設定すると、ｘ＝ｙ＝０以外の解が存在しないため、このような設定をすることができない。ただし、｜ａｄ−ｂｃ｜＝εとして、ε＝０となるような観察距離Ｄに対する依存性または観察角度θに対する依存性が得られるように照明光の波長を設定することができれば、ｍ＝ａｘ−ｃｙ、ｎ＝ｂｘ−ｄｙに対して、定数ｍ，ｎをｍ＝ｎ＝０と設定しても、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるような指数ｘ，ｙを設定することができる。

したがって、照明光の波長が、ε＝０あるいは、できる限り０に近い値になるように設定されていることが好ましい。このようにすることで、補正後の蛍光画像Ｇ_３の観察距離Ｄと観察角度θに対する依存性を両方ともほぼ消去することができ、誤差をおおむねゼロにすることができ、蛍光画像Ｇ_３の定量性を最大限に向上させることができる。

以上のことから、εが最小値となる、つまりできるだけ０に近い値になるように観察距離および観察角度に対する依存性が得られる照明光の波長を選択することによって、誤差を最小限に抑えることができる。つまり許容誤差ｅ_ｍａｘをできるだけ小さな値を設定してもそれを満たす、定数ｍ，ｎが存在し、定数ｍ，ｎをもとに指数ｘ，ｙを設定することができる。

例えば、蛍光観察装置１００として内視鏡に適用する場合には、硬性鏡や軟性鏡のような種類の違い、あるいは、上部消化器内視鏡や下部消化器内視鏡のような観察部位の違いなどがあったとしても、それぞれに対してεが最小となるような照明光の波長を設定することができるため、それぞれに対応した最適な補正用の指数ｘ，ｙを設定することができる。また、同一種類の蛍光観察装置１００であったとしても、個体差に拘わらず、個々の装置に対してεが最小となるような照明光の波長を設定することができ、それぞれに対応した最適な指数ｘ，ｙを設定することができる。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察システム１によれば、相互に異なる依存性をもって蛍光画像Ｇ_２および参照画像Ｇ_１内に含まれている観察距離Ｄおよび観察角度θの依存性を許容可能な範囲内において十分に低減することができる。したがって、定量性の高い補正後の蛍光画像Ｇ_３を得て、精度良く観察することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、撮像素子１９，２０によって取得された参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２には、撮像素子１９，２０の暗電流や読み出しに由来したノイズが含まれている。また、除算処理をする際に、参照画像Ｇ_１に輝度値ゼロの画素が存在すると、除算結果が無限大となって適正な補正を行うことができない。
そこで、前処理部２７において、蛍光画像Ｇ_２に対しては、暗電流や読み出しに由来するノイズ成分を除去するようなオフセットを与え、参照画像Ｇ_１には、暗電流や読み出しに由来するノイズ成分を除去する上に、全ての画素の輝度値がゼロとならないようなオフセットを与えることにしてもよい。

また、本実施形態においては、εが最小となる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することとしたが、これに代えて、所定の閾値ε_ｍａｘを設け、ε≦ε_ｍａｘとなる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することにしてもよい。
また、本実施形態における標準試料３０としては、観察しようとする生体と同様の散乱や吸収特性を有するファントムを用いてもよいし、ヒトや動物（ブタやマウス等）の切除組織を用いてもよい。

また、本実施形態においては、観察条件調節部として、波長調節手段であるフィルタターレット１０を例示したが、波長調節手段としては、スライド式の切替フィルタや音響光学素子等の他の任意の手段を採用してもよい。また、フィルタターレット１０に代えて、図５に示されるように、対物レンズ１６の後段に可変絞り３６を設け、対物レンズ１６の開口を調節することによっても、指数ａ〜ｄを最適化することができる。図中符号３７は照明光および励起光の波長帯域を透過させるフィルタである。

観察される光には被写体Ｘの表面における反射光だけではなく、被写体Ｘの内部で散乱されて戻ってきた光も多く含まれる。対物レンズ１６の開口が大きければ、多重散乱して光軸から大きく外れた所から伝播してきた光も多く取り込むことができる。つまり、開口が大きいほど被写体Ｘ内部から戻ってきた光の寄与が大きくなる。被写体Ｘの表面の反射と内部空の戻り光との比率と、観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性とが相関するため、開口を調整することにより指数ａ〜ｄを調節することができる。

また、図６に示されるように、照明ユニット４に可変絞り３８を設けることにしてもよい。例えば、開口が点である場合には被写体Ｘでの照度は距離の２乗に反比例するが、点ではない場合には２乗に反比例する関係から遠ざかる。
ここで、例として、照明光が光軸を中心にガウシアン分布を有し、開口が有限の大きさを有するときの被写体Ｘ上の照射面への照度と距離との関係を考える。図７に示されるように、照明光の光軸上にあり、照明光学系１５の開口から距離ｄ_１だけ離れた被写体Ｘ上の照射面における照度と距離の変化を考える。開口の半径ａ_１、距離ｄ_１とする。ここで、照明光光学系の開口平面上において光軸からａ_１’〜ａ_１’＋ｄａ_１’だけ離れ、角度θ〜θ＋ｄθの範囲から放出される光が照射面に到達するときの照度を表す。角度θは、図７の下側の図（照明光学系の開口を下方から見た図）のように定義される。２本の一点鎖線は照明光学系の光軸と交わり、互いに垂直な直線である。照明光の広がりに比例する定数α、照明光の総強度Ｅとして、照射面における照度は、以下の通りとなる。

ここで、βはガウシアンの半値幅に関連する定数（正の実数）である。（βが大きいほど半値幅は小さい。）。したがって、開口内の全ての点から発する光が照射面に到達するときの照度の合計である総照度は、以下の通りとなる。

ここで、指数関数の指数を４乗の項まで近似すると、総照度は以下の通りとなる。

これによれば、開口が大きくなるほど、距離ｄ_１の４乗に反比例する項の寄与が大きくなり、総照度が距離の２乗に反比例する性質から離れてくる。この場合には、単純な累乗関数とはならないが、最小自乗法などによる近似曲線を得ることによって、おおよその値を求めることができる。
例えば、Ｅ＝１０，α＝１，β＝１．５とし、観察距離２〜１５における回帰曲線をａ_１＝０．２，１，１．５としてそれぞれ算出すると、図８（ａ）〜（ｃ）に示されるように、距離の−１．９９７乗、−１．９３１乗および−１．８４９乗に比例する関数に近似することができる。
これにより、より定量性の高い蛍光観察を行うことができる。

また、図９に示されるように、除算処理部２８により得られた除算値をさらに指数１／ｘで累乗して蛍光画像Ｇ_３’を算出する後処理部３５を備えることにしてもよい。
蛍光画像Ｇ_２の蛍光強度は蛍光色素の濃度に比例する。具体的には、例えば、病変部等に集積した蛍光色素の濃度をＣ（ｍｏｌ／Ｌ）、試料の体積をＶ（ｃｍ^３）、病変部の上表面と平行な平面で切断したときの断面積をＳ（ｃｍ^２）とすると、病変部から発生する蛍光の輝度Ｅ（Ｗ／ｃｍ^２・ｓｒ）は、
Ｅ∝ＣＶ／Ｓ≒Ｃｔ
となる。

ただし、ｔ（ｃｍ）は病変部の厚さを表す。したがって、撮影された蛍光画像Ｇ_２の階調値ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}は、病変部に蓄積した蛍光色素の濃度と病変部の厚さに概ね比例したものとなる。つまり、おおむねＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}∝Ｃｔとなる。
しかしながら、上述のように、蛍光画像Ｇ_２の輝度値を指数ｘで累乗する前処理を施す場合には、補正された蛍光画像Ｇ_３の階調値ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}とＣｔは、
ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}∝（Ｃｔ） ^x
という関係となり、ｘ＝１以外の場合には、蛍光濃度をリニアに表した蛍光画像Ｇ_３とはならない。そこで、後処理部３５において指数１／ｘで累乗することにより、蛍光濃度をリニアに表した蛍光画像Ｇ_３ ‘を取得することができる。したがって、蛍光画像の定量性を高め、かつ蛍光濃度および蛍光色素が集積した病変部の厚さをより正確に反映したものとすることができる。

この場合、後処理部３５による後処理を含めて、観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性を除去することが好ましいので、上記実施例における、ｍ＝ａｘ−ｃｙ、ｎ＝ｂｘ−ｄｙとしたことに代えて、ｍ＝（ａｘ−ｃｙ）／ｘ、ｎ＝（ｂｘ−ｄｙ）／ｘとして、ｍ，ｎが許容限度となるように指数ｘ，ｙを設定することにしてもよい。
ここで、これらの式が、ｘ，ｙに関して、ｘ＝ｙ＝０以外の解を持つためには、
ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
を満たしていなければならない。したがって、式（４）および式（３）を満たすｍ、ｎを設定し、設定したｍ、ｎをもとに、式（４）からｘ，ｙを設定すればよい。

ここで、ｍ＝０とした場合、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜とすれば、式（４）より、ｎ＝（ｂｃ−ａｄ）／ｃ＝−ε／ｃ（ｂｃ−ａｄ＜０のとき）となる。したがって、上述したように、εが最小値となるように設定されるように、参照画像Ｇ_１や蛍光画像Ｇ_２の波長を調整することにより、式（３）を満たす範囲内で、さらにｎの値を最小にすることができ、補正後の蛍光画像Ｇ_３の観察距離Ｄおよび観察角度θに対する依存性を最小にすることができる。ここで、対物レンズ１６や照明ユニット４の開口の大きさを設定することにしてもよい。このような調整により、蛍光画像Ｇ_３の定量性をさらに最大限向上させることができる。

特に、ε＝０となるような観察距離Ｄに対する依存性または観察角度θに対する依存性が得られるように、照明光の波長、もしくは対物レンズ１３や照明ユニット４の開口の大きさを設定することができれば、式（４）より、ｍ＝ｎ＝０、かつｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂとなるようなｘ、ｙを設定することができるため、補正後の蛍光画像Ｇ_３の観察距離Ｄと観察角度θに対する依存性を両方とも消去することができ、誤差をほぼゼロにすることができる。

また、本実施形態においても、εが最小となる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することとしたが、これに代えて、所定の閾値ε_ｍａｘを設け、ε≦ε_ｍａｘとなる指数ｘ，ｙを設定できる照明光の波長を選択することにしてもよい。
例えば、一般に、距離依存性を表す指数ａ，ｃの絶対値の方が指数ｂ，ｄの絶対値よりも大きくなることを考慮して、ｍ＝０となるようなｘ，ｙを、例えば、ｘ＝ｃ、ｙ＝ａとするときを考える。すると、式（４）よりｎ＝（ｂｃ−ａｄ）／ｃ＝−ε／ｃ（ｂｃ−ａｄ＜０のとき）となる。

したがって、式（３）を満たすようなε_ｍａｘを設定すると、ε_ｍａｘは、
ε_ｍａｘ≦｜ｃ｜×ｌｏｇ（１＋ｅ_ｍａｘ）／ｌｏｇ（ｒ_θ）
を満たす必要がある。
ここで 例えば、後述する実験例により求められた指数ａ〜ｄ、
ａ＝−１．５１８、ｂ＝０．５１４、ｃ＝−１．６０５、ｄ＝０．６７５
を用いるとε＝｜ａｄ−ｂｃ｜≒０．２０となる。

また、一般に、消化器内視鏡の視野角は片側７５°程度である。したがって、θは最大でも７５°程度であると想定できる。また、許容誤差ｅ_ｍａｘは、この範囲内で２０％程度に抑えるとすると、
ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ＝ｃｏｓ０°／ｃｏｓ７５°＝３．８６
であるため、例えば、ε_ｍａｘは、
ε_ｍａｘ＝｜ｃ｜×ｌｏｇ（１＋ｅ_ｍａｘ）／ｌｏｇ（ｒ_θ）≒０．２１７
と設定することができる。

すると、この条件においては、εは、
ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜≒０．２０＜ε_ｍａｘ＝０．２１７
を満たしているといえる。これは同時に、許容誤差ｅ_ｍａｘの範囲内での定量性が得られていることを意味する。したがって、この実験条件において観察を行えば常に、
許容誤差ｅ_ｍａｘの範囲内での定量性を保った観察を行うことができる。

このようにεの値を適切に調整することによって、許容誤差ｅ_ｍａｘを下回るような条件での定量性を得ることができる。
また、εが十分に小さければ、ｍ＝０に対して、ｎ＝（ｂｃ−ａｄ）／ｃ＝―ε／ｃ（ｂｃ−ａｄ＜０のとき）も十分に小さくなる。したがって、仮に許容誤差ｅ_ｍａｘをできるだけ小さく設定したとしても、それを満たすｍ、ｎが存在することになり、定数ｍ，ｎに基づき指数ｘ，ｙを設定できる。

ここで、本実施形態に係る蛍光観察システム１を用いた実験例について図面を参照して以下に説明する。
照明光として白色光および蛍光薬剤の励起光を含む帯域（波長帯域４００〜７４０ｎｍ）の光を用い、参照画像Ｇ_１としては試料Ｙ表面において反射して戻る照明光の反射光画像を採用した。また蛍光画像Ｇ_２としては、試料Yの内部に注入された蛍光色素Ｃｙ７から発生する蛍光画像を採用した。試料Ｙとしては、ブタの摘出直腸を採用した。

図１０（ａ），（ｂ）に示されるように、挿入部２の先端面２ａを試料Ｙの表面に対向させた。
距離依存性の測定は、挿入部２の軸線が直動ステージ３１の載置面３４の法線と平行となる位置で、直動ステージ３１を下降させて観察距離Ｄを増大させつつ、複数の観察距離Ｄにおいて照明光および励起光を照射して参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を取得した。その結果、図１１（ａ），（ｃ）に示されるような観察距離特性を示すプロットが得られた。

また、角度依存性の測定は、挿入部２の軸線が載置面３４の法線と平行となる位置から、載置面３４上に配置される中心線回りに回転させつつ、複数の観察角度において照明光および励起光を照射して参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を取得した。その結果、図１１（ｂ），（ｄ）に示されるような観察角度特性を示すプロットが得られた。

そして、図中に実線で示すように、これらのプロットをＹ＝Ｐ・Ｘ^Ｑ（Ｘが横軸、Ｙが縦軸、Ｐは定数、Ｑは指数）の曲線に回帰させることにより、観察距離に関する指数ａ，ｃ、および観察角度に関する指数ｂ，ｄを算出すると、ａ＝−１．５１８、ｂ＝０．５１４、ｃ＝−１．６０５、ｄ＝０．６７５が得られた。

次に、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置４０について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した一実施形態に係る蛍光観察システム１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る蛍光観察装置４０は、図１２に示されるように、挿入部（着脱部品）２が光源３に着脱可能に設けられている。この場合には、挿入部２が着脱されて他の挿入部２に交換されることによって、対物レンズ１６を始め、挿入部２に含まれる種々の光学系が変更されるので、対物レンズ１６の開口数（ＮＡ）や瞳径等の変化、あるいは、検出する蛍光の波長、観察対象部位（胃組織や大腸組織など）等の変化によって、上記指数ａ〜ｄが変化する。

そこで、本実施形態においては、挿入部２に識別情報を記憶するＩＣチップ（識別情報入力手段）４１を備え、挿入部２が取り付けられる光源３側にＩＣチップ４１内の識別情報を読み取る読取装置４２と、識別情報、照明光の波長および各挿入部２に適した指数ｘ，ｙを対応づけて記憶する記憶部４３とを備えている。そして、前処理部２７が、記憶部４３から出力される挿入部２の識別情報に対応する指数ｘ，ｙを読取装置４２から受け取って、上記演算を行い、記憶部４３から出力された照明光の波長が達成されるようにフィルタターレット（観察条件調節部）１０が駆動される。

このようにすることで、光源３に対して挿入部２が交換されても、該挿入部２に応じてεを最小にするような照明光の波長が選択され、該挿入部２に応じて最適の指数ｘ，ｙが設定され、定量性の高い蛍光画像Ｇ_３を常に取得することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、識別情報入力手段としてＩＣチップ４１を例示したが、これに代えて、キーボードその他の手入力による任意の入力手段を採用してもよい。
また、本実施形態においては、観察条件調節部としてフィルタターレット１０を例示したが、これに代えて、対物光学系の可変絞り３６や、照明光学系の可変絞り３８を採用してもよい。

Ｘ 被写体
１ 蛍光観察システム
２ 挿入部（着脱部品）
３ 光源（照明部）
４ 照明ユニット（照明部）
１０ フィルタターレット（波長調節手段：観察条件調節部）
１５ 照明光学系
１６ 対物レンズ（対物光学系）
１９ 撮像素子（戻り光撮像部）
２０ 撮像素子（蛍光撮像部）
２４ 画像補正部
２６ 依存定数決定部（観察条件設定部）
３０ 標準試料
３１ 直動ステージ（観察状態設定機構）
３２ チルトステージ（観察状態設定機構）
３６，３８ 可変絞り（観察条件調節部）
４０，１００ 蛍光観察装置
４１ ＩＣチップ（識別情報入力手段）
４２ 読取装置（観察条件調節部）
４３ 記憶部
１０１ 較正装置

Claims (14)

1. 照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、
   被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、
   被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、
   該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
   該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、
   該較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、
   観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、
   該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて、累乗値ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、
   前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システム。
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
   ここで、
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
   ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
   ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
   ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
   Ａ，Ｂ：定数
   ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
   ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
   ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
   ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
   ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
   Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
   Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
   θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
   θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
   ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
   ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
   ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
2. 照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、該蛍光観察装置に接続され、標準試料と、該標準試料に対して前記蛍光観察装置の観察距離および観察角度を変更可能に設定する観察状態設定機構とを備える較正装置と、観察条件を調節する観察条件調節部とを備え、
   該観察条件調節部が、前記較正装置により設定された観察距離および観察角度と、前記蛍光観察装置により前記標準試料を撮影して取得された蛍光画像および参照画像とに基づいて累乗値ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように前記観察条件を調節し、
   前記画像補正部が、以下の処理を行う蛍光観察システム。
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
   ここで、
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
   ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
   ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
   ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
   Ａ，Ｂ：定数
   ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
   ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
   ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
   ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
   Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
   Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
   θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
   θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
   ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
   ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
3. ｍ＝０である請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
4. 前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節手段である請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
5. 前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、
   前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
6. 前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察システム。
7. 照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
   観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、
   該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力手段と、
   前記識別情報と、累乗値ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、
   前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、
   前記画像補正部が、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている累乗値ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置。
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
   ここで、
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
   ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
   ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
   ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
   Ａ，Ｂ：定数
   ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
   ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
   ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
   ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
   ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
   Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
   Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
   θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
   θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
   ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
   ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
   ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
8. 照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備える蛍光観察装置と、
   観察条件を変更するために着脱される着脱部品と、
   該着脱部品に付された識別情報を入力する識別情報入力手段と、
   前記識別情報と、累乗値ｘ，ｙと、前記観察条件とを対応づけて記憶する記憶部と、
   前記着脱部品が取り付けられたときに、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている観察条件に設定する観察条件調節部とを備え、
   前記画像補正部が、前記識別情報入力手段により入力された前記識別情報に対応づけて前記記憶部に記憶されている累乗値ｘ，ｙを用いて以下の処理を行う蛍光観察装置。
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
   ここで、
   ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
   ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
   ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
   ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
   Ａ，Ｂ：定数
   ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
   ａ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｂ：所定の強度の励起光を前記被写体に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｃ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｄ：所定の強度の照明光を前記被写体に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記被写体までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
   ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
   ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
   ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
   Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
   Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
   θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
   θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
   ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
   ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
   （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
9. ｍ＝０である請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
10. 前記観察条件調節部が、前記照明光の波長を調節する波長調節手段である請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
11. 前記被写体から戻る蛍光および戻り光を集光する対物光学系を備え、
    前記観察条件調節部が、前記対物光学系に備えられた可変絞りである請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
12. 前記観察条件調節部が、前記照明光および前記励起光の光束径を調節する可変絞りである請求項７または請求項８に記載の蛍光観察装置。
13. 標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、累乗値ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、
    照明光および励起光を被写体に照射し、
    被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法。
    ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}
    ここで、
    ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
    ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
    ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
    ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    Ａ，Ｂ：定数
    ｘ＝（ｃｎ−ｄｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （１）
    ｙ＝（ａｎ−ｂｍ）／（ｂｃ−ａｄ） （２）
    ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
    ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
    ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
    Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
    Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
    θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
    ｍ，ｎ：式（３）を満たす任意の定数
    ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
    （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値
    ただし、ｂｃ−ａｄ＝０の場合には、ｘ，ｙは、ｘ：ｙ＝ｃ：ａ＝ｄ：ｂを満たす任意の実数から設定される。
14. 標準試料に対して照明光および励起光を観察距離および観察角度を変更しながら照射し、前記標準試料において発生した蛍光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の蛍光画像を取得し、前記標準試料から戻る戻り光を撮影して観察距離および／または観察角度の異なる複数の参照画像を取得し、取得された複数の蛍光画像および参照画像に基づいて、累乗値ａ〜ｄを算出し、ε＝｜ａｄ−ｂｃ｜が所定の閾値ε_ｍａｘ以下となるように観察条件を調節しておき、
    照明光および励起光を被写体に照射し、
    被写体において発生した蛍光を撮影して取得した蛍光画像を、被写体から戻る戻り光を撮影して取得した参照画像を用いて、以下の補正処理を行う蛍光観察方法。
    ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}＝（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）^1/ｘ
    ここで、
    ＦＬ_{ｒｅｖｉｃｅ}：補正後の蛍光画像の輝度値
    ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ａ×ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｘ
    ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}＝Ｂ×ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ} ^ｙ
    ＦＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}，ＲＬ_{ｂｅｆｏｒｅ}：取得された蛍光画像、参照画像の輝度値
    Ａ，Ｂ：定数
    ｘ：ｙ＝ｃ：（ａ−ｍ）＝ｄ：（ｂ−ｎ） （４）
    ａ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｂ：所定の強度の励起光を前記標準試料に向けて照射したときに前記蛍光撮像部により得られる前記蛍光画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｃ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの距離特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｄ：所定の強度の照明光を前記標準試料に向けて照射したときに前記戻り光撮像部により得られる前記参照画像の輝度の前記照明部から前記標準試料までの余弦特性を累乗近似して得られた累乗値
    ｒ_Ｄ ^｜ｍ｜・ｒ_θ ^｜ｎ｜≦１＋ｅ_ｍａｘ （３）
    ｒ_Ｄ＝Ｄ_ｍａｘ／Ｄ_ｍｉｎ
    ｒ_θ＝ｃｏｓθ_ｍｉｎ／ｃｏｓθ_ｍａｘ
    Ｄ_ｍａｘ：想定される最大の観察距離
    Ｄ_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離
    θ_ｍａｘ：想定される最大の観察角度
    θ_ｍｉｎ：想定される最小の観察角度（ただし、０°≦θ_ｍｉｎ＜θ_ｍａｘ≦９０°）
    ｍ，ｎ：式（３）および式（４）を満たす任意の定数
    ｅ_ｍａｘ：（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ÷（ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ−１
    （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍａｘ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最大値
    （ＦＬ_{ａｆｔｅｒ}／ＲＬ_{ａｆｔｅｒ}）_ｍｉｎ：想定される最小の観察距離から最大の観察距離の範囲かつ最小の観察角度から最大の観察角度の範囲内における最小値

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