JP2010273655A - 細胞保持方法、細胞試験方法及び細胞処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】バイオアッセイに必要な数の細胞を迅速に且つばらつきが少なく、個別に配列させて保持する方法を提供すること。
【解決手段】 本発明が提供するのは、貫通した空孔が複数配置されているシートを用意するシート用意工程と、用意された細胞を担持させた粒子の懸濁液体を前記シートに接触させる接触工程とを含む細胞保持方法であって、前記空孔が液体とともに前記粒子の１つのみをその孔内に保持する大きさであることを特徴とする細胞保持方法である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞を配置して効率よく試験、分取など操作するために有用な細胞の保持方法、細胞の試験方法及び細胞の処理装置に関する。

医薬品開発分野や病気の診断分野においては、大量でかつ迅速にバイオアッセイを行い、化学物質や生物活性物質等が細胞に与える影響をハイスループットに確実に評価していくシステムが求められている。
バイオアッセイシステムで大量・迅速な処理を行うためには、検出手法に適した数の細胞集団を決められた位置に配列させ、細胞集団に対して所定の物質の投与、液体交換、計測や分別など所定の操作を、効率よく行わなければならない。
従来、バイオアッセイおいて細胞集団を取り扱うために、また、バイオアッセイをハイスループットに行うために、３８４個又は１５３６個の高密度マイクロウェルプレートが開発され市販されている。

ところで細胞はその性状により、浮遊性細胞、付着性細胞、スフェロイド（凝集塊細胞）に分類することが出来る。付着性細胞を対象とするバイオアッセイを、マイクロウェルプレートを用いて行う場合、付着性細胞は一旦トリプシンなどによる処理で浮遊性とされた後、適当な数の細胞を含む懸濁液を各ウェルに分注する。その後所定の環境条件下に静置することにより、バイオアッセイの検出条件に適した細胞数に達するまで培養される。

しかしながら、高密度マイクロウェルプレートを用いて付着性細胞のバイオアッセイを行うためには、トリプシン処理により浮遊性とした細胞懸濁液を、各ウェルにばらつきが少なくなるように分注することが課題となる。１５３６個のウェルからなるプレートを用いる場合、各ウェルの容量は２〜１０マイクロリットルと少量である。一方、トリプシン処理により浮遊性とした付着性細胞は、培養によりコンフルエントにならない程度に培養して増殖させる必要があるため、最初から高密度の細胞懸濁液を分注することは出来ない。すなわち、高密度マイクロウェルプレートを用いる場合、各ウェルに少数の付着性細胞の懸濁液をばらつきが少なくなるように分注しなければならないという課題がある。

また血球などの浮遊性細胞や、スフェロイドを対象とするバイオアッセイを、マイクロウェルプレートを用いて行う場合、ウェル中の液体を交換するためには、一旦遠心分離操作により細胞集団を沈降させた後、上清の液体を交換する操作を行う必要がある。このため、マイクロウェルプレートを用いたバイオアッセイのスループットを下げる要因になっている。
こうしたマイクロプレートを用いたバイオアッセイのスループットを向上させる方法として、ウェルプレートの替わりに、フィルターを用いるものや、マイクロ流体流路を用いるものが知られている。特許文献１には、細胞のサイズよりも小さいフィルター孔を用いた細胞の保持方法が例示され、細胞は孔の内部ではなく、フィルター孔の表面に保持される。特許文献２には、テーパー付けした貫通孔アレイに細胞を保持する例が開示されている。

しかしながら、特許文献１に記載のフィルターを用いる細胞の保持方法では、フィルター上の細胞は孔内に収納されておらず、孔間の細胞のコンタミネーションが課題となる。また細胞と貫通孔が同程度のサイズであるため、各貫通孔上に保持される細胞数が少ないという課題がある。
また、特許文献２に記載のテーパー付けした貫通孔アレイに細胞を保持する方法では、細胞と貫通孔とが同程度のサイズであるため、各貫通孔に保持される細胞数が後のアッセイに要する細胞数よりも少ないという課題がある。

特表２００８−５３８５０９号公報 特表２００４−５１０９９６号公報

したがって、バイオアッセイに必要な数の細胞を迅速に且つばらつきが少なく、個別に配列させて保持する方法の提供が課題である。

本発明の細胞保持方法は、貫通した空孔が複数配置されているシートを用意するシート用意工程と、細胞を担持させた粒子の懸濁液体を前記シートに接触させる接触工程とを含む細胞保持方法であって、前記空孔が液体とともに前記粒子の１つのみをその孔内に保持する大きさであることを特徴とする。

また、本発明の細胞処理装置は、貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段と、以下の手段（Ａ）から手段（Ｇ）の少なくとも１つの手段とを有することを特徴とする。
（Ａ）前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を配置させるための配置手段、
（Ｂ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御するための制御手段、
（Ｃ）前記シートの空孔に液滴を付与するための付与手段、
（Ｄ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段、
（Ｅ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段、
（Ｆ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段、
（Ｇ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段。

本発明の方法によれば、バイオアッセイに必要な数の細胞を迅速に且つばらつきが少なく、個別に配列させて保持し、効率よく培養、試験することができる。また、本発明の装置では、細胞を個別に配置し、効率よく分析、分取することができる。

貫通した空孔が複数配置されている本発明のシート（粒子保持用シート）を例示する図である。 各空孔が複数配置されている本発明のシートに粒子が保持されている様子を模式的に表した断面図と平面図である。 本発明において、粒子を保持した空孔に生理活性物質の溶液を均一になるようにインクジェット部から液滴を吐出した様子を模式的に示した平面図である。 液体交換部位を設けた本発明の粒子保持用シートの部分拡大図である。 液体交換部位を設けた本発明の粒子保持用シートの平面寸法図である。 実施例で使用した粒子保持用シートの平面図である。 実施例１で撮影した粒子保持用シートの画像である。 実施例１で撮影した粒子上の細胞の画像である。 実施例で使用した処理装置のシステム構成の概略図である。

以下、図面に基づいて本発明の実施形態について説明する。なお、個々に開示する実施形態は、本発明である細胞保持方法、細胞試験方法及び細胞処理装置の例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。

（第一実施形態）
本発明の細胞保持方法は、貫通した空孔２が複数配置されているシートを用意するシート用意工程と、用意された、細胞を担持させた粒子３の懸濁液体を前記シートに接触させる接触工程とを含み、空孔２が１つの粒子３のみを保持することを特徴とする。

本発明で取り扱う細胞とは、付着依存性細胞、浮遊性細胞、スフェロイド（凝集塊細胞）等をいう。また、その具体的な例として、ヒト子宮頸癌細胞系の細胞、神経細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、幹細胞、中胚葉系幹細胞、胚性幹細胞、グリア細胞、胎性幹細胞、造血幹細胞、肥満細胞、脂肪細胞、神経幹細胞、血球細胞が挙げられる。また、本発明は、主にバイオアッセイに用いる細胞に対して保持、試験及び処理を目的とするため、シート毎に一種類の細胞を粒子３に担持させることが好ましい。これにより、バイオアッセイに必要な数の単一種類の細胞を迅速に且つばらつきが少なく、個別に配列させて保持し、効率よく培養、試験することができる。
ただし、本発明は、１つシートに２種類以上の細胞を担持させることを制限するものではない。また、異なる種類の細胞を１つのシートに担持させる場合には、シートの保持領域を区分し、区分された各領域に、それぞれ異なる種類の細胞を担持する粒子を配置するとよい。また、領域ごとに区分せずにランダムに粒子を配置する場合は、各粒子に標識（着色等）処理を施し、該標識によって担持される細胞を判別してもよい。また、同一粒子に２種以上の細胞を担持させてもよい。

本発明で取り扱う粒子３は、前記細胞を担持しうるものであれば制限されない。粒子３の材質としては、例えば有機高分子物質、無機物質等が挙げられる。有機高分子物質としては、例えばアクリル酸重合体、スチレン重合体、メタクリル酸重合体、アルギン酸ハイドロゲル、コラーゲン由来ペプチドハイドロゲル、アガロースゲル等が挙げられる。無機物質としては、シリカ、アルミナ、ハイドロキシアパタイト、磁性酸化鉄等が挙げられる。
また、粒子３の素材は、顕微鏡観察には光の透過性に優れた素材、さらに蛍光顕微鏡観察などを行う場合は自家蛍光のない素材が好ましい。

本発明では、前記細胞を担持させた粒子３を用いることにより、迅速な細胞の配置が可能になる。前記細胞を担持させる粒子３は、以下の方法で調製されることができる。粒子３の存在下に付着性の細胞を培養する方法、浮遊性細胞の培養液中に前記浮遊性細胞に吸着性を有する粒子３を添加する方法、浮遊性細胞やスフェロイドの培養液中に重合性物質のモノマーを添加し粒子を粒子状に重合させることで包括固定化する方法等である。

本発明で用いられる、貫通した空孔２が複数配置されているシート（以下「粒子保持用シート」ともいう）の一例を図１に示す。前記シートは、ベース（基体）１に、粒子３と液体４と（図２を参照）が保持可能に設計されている、複数の貫通した空孔（開口部）２を有する。また、空孔２の大きさは、１つの粒子３のみを保持可能であり、２つの粒子３は保持できない大きさである。液体４は前記シートの空孔２の内壁に対して液体の相互作用力（付着力）によって保持され、さらに粒子３は液体４に包み込まれる状態で液体の表面張力により保持されると推測される。

その１例として、空孔２の開口部が円形である場合にほぼ球体である粒子３が空孔２内に液体４と共に保持される様子を模式化した断面図と平面図を図２に示す。

ベース１の材質は、空孔２を形成できる材料であれば如何なるものでも使用できる。例えば、鉄、銅、アルミニウムなどの金属類、またはそれらを含む合金類、またガラスやアルミナ、シリコン、などのセラミックス類、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアセタール、シリコンゴム、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ナイロンなどのプラスチック樹脂、またはそれらの複合材料が使用できる。但し、ベース１の材質は、基本的に水に溶解したり、その成分が溶出したりしないものが好ましい。また、シートの空孔２の内壁は液体４が保持しやすいように、親水化処理を施したり粗面化したりしても良い。前記シート部材表面の素材の色は特にこだわらないが、顕微鏡観察には光の反射を抑える素材、さらに蛍光顕微鏡観察などを行う場合は自家蛍光のない素材が好ましい。

本発明においては、空孔２は、粒子３のサイズに対して適当な開口面積、かつ適当な厚みを有しなければならない。つまり、液体４と共に１つの粒子３のみを空孔２に効率よく安定に保持させるには、空孔２の大きさ（開口面積と厚み）が大きく影響する。
また、空孔２の形状は、図１で例示された円形以外、四角形等の多角形、楕円形、星型等いずれかの形状でも良い。

各空孔２の開口面積は、それぞれの保持対象となる粒子３の最大断面積の１．０５倍から２．６３倍の範囲内であることが好ましい。また、粒子３を１つずつ空孔２に保持する確率をより高め安定的に保持させるには、より好ましくは１つの空孔２の開口面積は、粒子３の最大断面積の１．２〜２．２５倍の範囲内である。粒子３の最大断面積は、球及び略球体であれば、球の重心を通る切断面が該当する。また、前記シートは、粒子３を保持する際は通常、水平に保たれることが好ましい。

また、２つ以上の物体が保持できない大きさとは、少なくとも空孔２に対して２つの物体の最大断面を幾何学的に配置できない大きさを示す。空孔２の開口面積が物体の最大断面積の１．０５倍未満であれば空孔２に物体が配置されにくく、また２．６３倍を超えると複数個配置する場合が多くなる。また、同一のべース１に異なる複数面積の空孔２が設けられていてもよい。

ベース１の厚みは特に均一である必要はない。しかしながら、空孔２の近傍の厚みは、粒子３を一つだけ配列させる目的では、それぞれ対象となる粒子の最大径の０．２倍から１．９倍の厚みであることが好ましい。粒子３の最大径は、球及び略球体であれば、最大の断面積の直径を指す。粒子３の最大径（球体の場合は直径）の０．２倍未満であれば個体に対して液体の保持量が少ないために安定に粒子を保持できない。その結果、配列の際に脱落する割合が増える。また、粒子３の最大径（球体の場合は直径）の１．９倍を超えると複数の粒子３が保持される割合が増えてしまう。

また、前記シートは、ベース１に複数の貫通した空孔２を有する。その配置は、ベース１のいかなる領域でもよいが、規則的に配列される方が後述する物体に対する試験や物体に対する処理の自動化にとって好ましい。また、１つのベース１に設けられる空孔２の個数や配置密度について何ら制限はない。操作上の観点からは、空孔２の直径がおよそ１ｍｍ程度であれば、配置密度が１０個／ｃｍ^２〜１００個／ｃｍ^２の範囲にあることが好ましい。すなわち１０個／ｃｍ^２未満であれば、空孔以外の面積が広く、その領域に水滴が孤立しやすくなる。従って該水滴と共に空孔２以外の領域に物体が配置され、配列の効率が低下する。また、１００個／ｃｍ^２を超えると、空孔２の間の距離が十分取れないために、その後の取り扱いで粒子３を保持する液体４が隣の空孔２で粒子３保持する液体と交じり合う等コンタミネーションしやすくなる不具合が起こりやすい。すなわち、前記シートの面積と空孔２の面積の比（開口率）は、７．９％〜７８．５％の範囲に入ることが好ましい。

また、本発明は、必ずしもすべての空孔２内に粒子３を保持していなくても良い。但し、粒子３を保持させる空孔２の割合が極端に低下すると、後で細胞を試験する際に、効率が低下する。

(粒子を保持させる方法)
貫通した空孔２が複数配置されているシートを用いれば、前記細胞を担持した粒子３を簡便に配置することができる。具体的には前記細胞を担持した粒子３を分散した液体（懸濁液体）を前記シート上に接触させることで、液体と共に簡単に空孔２に前記細胞を担持した粒子３を１つずつ配置することができる。 本発明の大きな特徴は、貫通した空孔２において１つの粒子３と共に液体４を保持することである。貫通した空孔２内にその空孔の一部の断面が粒子サイズより小さくなるように突起部分を形成したり、底板を組み合わせて形状で粒子を支えたりする公知の従来技術とは明確に差別される。

前記シートに粒子３を含有する液体４（以下「含有液体」ともいう）を接触させる方法として、前記シートに含有液体４を上方から注ぐ方法や含有液体４の中に前記シートを浸漬する方法から選択することができる。含有液体４を上方から注ぐ方法の一つとして、公知のスリット型塗布機を利用すれば、スリットダイから含有液体４を前記シート全面に均一に載せることができる。また接触後の過剰の液体４を排除するには、前記シートを傾けたり、その背面をブレードでふき取ったり、エアーを吹きつけたりすることで簡単に出来る。但し、エアーを吹き付ける場合は、空孔２に保持された粒子３を吹き飛ばさないように、風圧や吹き付け角度を制御する必要がある。また、余剰の液体４が複数の空孔２の液体４を繋げるように存在すると空孔２の間でコンタミネーションを起こしやすくなる。また空孔２以外に粒子３が保持されやすくなる。そのため空孔２以外の部位には、できるだけ液滴を残さないようにすることが好ましい。液体４としては、多数の粒子３が中に懸濁している細胞培養液等が挙げられる。

前記シートの少なくとも一方の表面が疎水性表面であることが好ましい。そうであれば、空孔２以外の領域で水性の液体４がはじかれるために容易に過剰の液体を取り除くことが出来る。その場合おおむね疎水性表面の液体４に対する接触角は９０度以上であればよい。
前記シートにおいて、液体４の表面張力で粒子３を保持するためには、おおむね２５ｍＮ／ｍ以上の表面張力を有することが好ましい。２５ｍＮ／ｍ未満であれば、粒子３が液体４と共に空孔２内に保持されにくくなり、わずかな振動で落下することも多くなる。粒子３と共に前記シートに保持させる液体４は、前記細胞を担持した粒子３と親和性が高くかつ空孔２の内壁に付着しやすい水性の液体４が好ましい。

水性の液体４としては、水、あるいは、アルコール、グリコール系溶媒もしくはグリセリンなどの水溶性の液体、ならびにこれらの水溶性の液体を含む水溶液などが挙げられるが、前記水溶液の場合は、特に水が５０％以上含まれていることが好ましい。さらに、前記シートから粒子３を保持する液体４の蒸発を防ぐ目的あるいは、粒子３の保持を安定化する目的のために、保湿剤、表面張力調整剤、増粘剤の少なくともいずれか１つを添加することができる。

保湿剤の例としては、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール及びソルビットなどの多価アルコール類、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸などのムコ多糖葵質、可溶性コラーゲン、ユラスチン及びケラチンなどの蛋白質加水分解物などを単独または複数混合して用いることができる。
表面張力調整剤の例としては、水溶性のアニオン性、カチオン性、両性もしくはノニオン性の界面活性剤を一種類または複数種を添加することが出来る。但し液体の表面張力が２５ｍＮ／ｍ以上の添加量が好ましい。

また、増粘剤の例としては、例えば酸化変性澱粉、酵素変性澱粉、熱化学変性澱粉、カチオン性澱粉、両性澱粉及びエステル化澱粉等の澱粉類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びエチルセルロース等のセルロース誘導体、カゼイン、ゼラチン及び大豆蛋白等の天然又は半合成高分子類、あるいは完全又は部分ケン化のポリビニルアルコール、アセトアセチル化ポリビニルアルコール、カルボキシ変性ポリビニルアルコール、オレフィン変性ポリビニルアルコール及びシリル変性ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール類、などの水溶性高分子化合物が挙げられ、これらの中から少なくとも１種の水溶性高分子化合物を適宜選択して使用することができる。

本発明において、使用される液体の好ましい粘度は、０．１Ｐａ・ｓ（パスカル秒）以上であり、必要に応じて上記の増粘剤を添加すれば良い。また、細胞に適した塩濃度やｐＨに制御することも必要であれば、塩化ナトリウムのような塩類や各種ｐＨ調整剤を、また、防腐剤や抗菌剤を適宜に添加することもできる。

（第二実施形態）
本発明の細胞試験方法は、前記細胞保持方法で細胞を保持する保持工程と、前記細胞に対する試験を行うために物質を投与する投与工程とを含むことを特徴とする。前記細胞試験方法は、貫通した空孔２が複数配置されているシートを使用するため従来の底のあるウェルと比較して、次のような利点があげられる。これは、ｉ）粒子３を配列することが容易である、ｉｉ）粒子３を取り出すことが容易である、ｉｉｉ）粒子３が底板に接触することはないので、細胞試験時に底板からの刺激等の影響を受けない、ｉｖ）空孔２内の液体４が外気と接触する面積が大きくガス交換が行われやすい、ｖ）観察工程において、底板がないため底板による反射光や自家蛍光などのノイズ要因がない等である。

（物質の投与）
前記細胞に対する試験を行うために、前記シートの空孔２に液体４と共に保持された粒子上の細胞に物質を投与する投与工程について詳細に説明する。
本実施形態で細胞に投与する物質としては、なんら限定されるものではないが、有機、無機の化学物質、金属及びその化合物、生体の構成物質、生体由来の生理活性物質やＤＮＡ、菌、ウイルスなど、またそれら化学物質との複合体や複数の化学物質の混合物などを包含する。前記物質の投与は、前記シートの空孔２に１種類の生理活性物質もしくは複数種類の生理活性物質を含む液滴を付与することが好ましい。

本実施形態においては、前記細胞に投与した前記物質が作用するか否かを、作用する場合には投与量変化に対する作用や経時的な作用の変化を調べることができる。投与される前記物質を、水や有機溶剤などの溶媒中に溶解もしくは分散状態にして液体として投与する方法が好ましい。こうした液体を液滴化して吐出することで前記シートの空孔２に保持された前記細胞に直接投与することができる。前記液体を液滴化する装置としてマイクロピペット、マイクロディスペンサーやエネルギー発生素子を用いてノズルから液滴を吐出する装置、すなわちインクジェット法を用いた吐出装置が挙げられる。微少な液滴が吐出できる点でインクジェット法を用いた吐出装置を好適に用いることができる。さらにインクジェット法の中でも、サーマルインクジェット法とピエゾインクジェット法が好適に用いることができる。

本実施形態においては、液体１滴あたりの体積が１００ｐｌ（ピコリットル）以下の液滴で投与されることが好ましい。すなわち前記シートの空孔２に液体４と共に保持されている粒子３に対し、液滴が１００ｐｌより大きいと当該液滴の吐出圧力で粒子３が脱落するおそれがある。また、粒子３に対して局在的な投与を避けるために空孔２のエリア全面に分散して微小液滴を滴下することが好ましい。その場合、１つの空孔２に対して分散して１００滴以上で投与するのが好ましい。そうすることで、エリア内の前記細胞に対し物質を再現よく作用させることが出来る。好ましい投与の液滴位置を模式的に図３に示す。図３は、前記シートの模式平面図で図中に液滴の着弾位置５を表す。

本発明の細胞試験方法によって投与される前記物質と前記細胞との相関を試験することができる。具体的には、（１）細胞の形態変化の評価、（２）細胞内に取り込まれた物質の定量、（３）細胞内で合成された物質の定量、（４）細胞を染色して形態評価や物質の定量、（５）レポーター遺伝子によるシグナルの検出、（６）放射線量測定による物質の定量、（７）蛍光量測定による物質の定量、（８）発光量測定による物質の定量、（９）吸光度測定による物質の定量等がある。

（液体交換）
本実施形態においては、細胞に投与した物質の作用期間を制御する目的や細胞から分泌する物質を除去する目的で、細胞を担持した粒子３を保持した空孔２内の液体を交換することができる。その場合、空孔に保持された粒子３が、空孔２から脱落しないように円滑に液体交換を行うことが必要である。円滑に液体交換を行うためには、前記シートの粒子３を保持する空孔２に連通した液体交換部位を設けることが好ましい。

液体交換部位を設けたシートの一例を図４に示す。図４においては、１つの粒子３を保持可能な貫通した空孔６に連通した液体交換部位７が設けられている。また、液体交換をより効率的に行うために空孔に対して連通した複数の液体交換部位７、８を設けても良い。液体交換部位７は、粒子３を保持する空孔６より面積の小さい空孔が好ましい。すなわち、粒子３を保持する空孔６と同等もしくそれ以上の大きな面積であれば、液体交換部位に粒子が保持されて目的の液体交換が難しくなる。また、液体交換部位は貫通した空孔でなく、底のある窪み（ウェル）で構成されることが好ましい。

いずれにしても粒子３を保持可能な貫通した空孔２と液体交換部位は自由に液体が流れる必要がある。より円滑に液体交換する方法として、具体的な１例を挙げると、液体交換部位７に交換する目的の液体を滴下すると同時に液体交換部位８から液体を吸引すると液量に大きな変動を生じさせないで液体交換が円滑に行える。また液体交換部位８にチューブもしくは細線を接続して余剰の液体を下方に自然に排出することも可能である。

本実施形態において前記シートの空孔２内で、粒子３に担持された細胞を培養することが出来る。よって、本実施形態では、貫通孔を有するシート９（図９を参照）に細胞を担持した粒子３を保持した後に、貫通孔を有するシート９の空孔２内で細胞を培養させる細胞培養工程を有する複数細胞を用いた培養方法を含むことができる。また、細胞培養工程においては細胞増殖のために細胞の各々に対して物質（例えば、細胞の生存を維持するための栄養物質など）を投与することが好ましい。

また、細胞の培養時には、細胞を保持した空孔２を有するシートの近傍を所定の環境に制御することが重要である。すなわち、温度をそれぞれの細胞の増殖に適した温度にすることが好ましい。また、細胞の増殖には、前記シートの空孔２内の液体４の蒸発は、出来るだけ抑えることが重要である。従って空孔周辺の相対湿度は６０％以上に、より好ましくは８０％以上に保持する。また、細胞を維持増殖させる目的で、前記シートの空孔内に水などの生体維持材料を上記の投与手段で投与することもできる。また増殖途中過程において、蒸気・スプレー・ミスト・マイクロピペッティング・インクジェット吐出装置などの方法により、さらに化学物質・細胞増殖維持材料などを追加投与することができる。

（第三実施形態）
本発明の第三実施形態は、細胞処理装置で、少なくとも、貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段を有するうえ、（Ａ）前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を配置させるための配置手段と、（Ｂ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御するための制御手段と、（Ｃ）前記シートの空孔に液滴を付与するための付与手段と、（Ｄ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段と、（Ｅ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段と、（Ｆ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段と、及び（Ｇ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段と、から少なくとも１つの手段を有する。

本実施形態の細胞処理装置の概略は、図９に示されている。本実施形態の配置手段は、可動性ホルダー１０によって構成される。細胞保持粒子３を保持した貫通孔アレイシート９は可動性ホルダー１０に固定される。可動性ホルダー１０は、貫通孔アレイシート９をＸ−Ｙの２軸方向に可動させることが出来る。ここで、Ｙ方向は、図９のＸ方向１１に対して垂直な方向（紙面に垂直な方向）を示す。

本実施形態の付与手段は、化学物質を細胞に作用させる手段として、８ｐｌの液滴を吐出する一軸方向（Ｘ軸）に可動性のインクジェット装置１４によって構成される。
本実施形態の観察手段は、照明部２２及びモニター１５等で構成され、細胞の状態及び変化を画像として捉える手段である。
具体的には、細胞の形状については、前記シートに保持されている細胞に対して、照明部２２から可視光（白色光：波長３００〜９００ｎｍ）を貫通孔アレイシート９に保持した粒子３に照射しながら貫通孔アレイシート９の下方に具備したＣＣＤカメラ（撮像部）２３などで明視野画像を撮影する。ＣＣＤカメラ（撮像部）２３は、貫通孔アレイシート９の上方、すなわち照明部２２と同じ側に設けることもできる。また、ＣＣＤカメラと細胞との間にレンズ系を備えて細胞を拡大してより細部を観察することもできる。

また、本実施形態では細胞から蛍光を観察する手段も含むことができる。前記シートに保持されている細胞に対して励起光光源から分光した波長４８０〜４９０ｎｍ励起光を照射してＣＣＤカメラ等で蛍光画像を撮影することもできる。撮影した画像は、モニター１５で確認して制御部１６に保存する。蛍光の撮像手段は、カメラやＣＣＤ以外にスキャナーなども使用することができる。このように細胞に励起光を照射することにより細胞の内部において発光させた状態で、細胞を撮像すれば発光部位を容易に検出することができる。また、可視光を照射して得られた明視野画像と、励起光を照射して得られた蛍光画像を画像処理手段で合わせることで、より詳細に細胞を観察することもできる。

本実施形態の移送手段は、貫通孔アレイシート９の特定の空孔２内から他の容器に粒子３を容易に移送する手段である。具体的な例としては、棒状のピンで直接押す方法や空気圧を利用してエアーを吹き付ける方法などを用いることが出来る。また、エアーの代わりに水圧を利用しても良い。粒子３に担持されている細胞に与えるダメージを少なくするには空気圧を利用する方法が好ましい。さらに貫通孔アレイシート９の下方に容器を配置することで特定の粒子を簡便に高速に特定の容器（例えば、収集容器２１）に移送することが可能になる。

本実施形態の認識手段はセンサー部１７により構成される。具体的に、制御部１６は、貫通孔アレイシート９の空孔２の位置を認識するセンサー部１７（認識手段（Ｆ））から位置情報を受け取り、可動性ホルダー１０を介して貫通孔アレイシートの空孔位置を制御する。
本実施形態の液体交換手段として、Ｚ軸方向２８に可動させることのできる液体交換装置２９を備えている。液体交換装置２９にはガラス製のキャピラリー２４（外径０．６８ｍｍ、内径０．２０ｍｍ）が２本取り付けてあり、送液ポンプ２５を介して、一方は供給液容器２６に、他方は廃液容器２７に接続されている。液体交換を行う場合には、液体交換装置をＺ軸方向に移動させて、キャピラリーの先端を貫通孔アレイシート９の液体交換部位に、接触させる。次に送液ポンプ２５を駆動して、供給液容器内の液体を供給すると同時に排出させて除く。交換する液体は、電磁バルブ３０を切り替えることにより種類を選択することができる。また。複数の貫通孔の液体交換を同時に行うために、液体交換装置に複数のキャピラリーを配置することもできる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

（実施例１）
（保持、観察）
厚さ０．９ｍｍの１００ｍｍ角のステンレスシートを加工して貫通した空孔２が複数配置されているシート１（貫通した空孔アレイシート）を以下の仕様で作成した。空孔２の形状は、図６に示すように円形の空孔２が等間隔になるように、空孔２の直径（Ｒ＝１．２ｍｍ）と、空孔２間の距離（Ｌ＝２．２５ｍｍ）とで２２３６個の空孔２を最密になるように調整した。対象となる細胞は、ヒト子宮頸癌細胞系ＨｅＬａ細胞（human cervix adenocarcinoma epithelial adherent ATCC CCL-2）を培養した細胞を用いた。粒子は、ガラスビーズ（ユニチカ社製ＳＰＬ‐１０００、平均粒径１０３０±３０μｍ、標準偏差２５以下、ソーダ石灰ガラス、真比重：２．５、屈折率：１．５）を用いた。

直径１０ｃｍのシャーレにガラスビーズを敷き詰め、１０％ウシ胎児血清含有DMEM培地を１２ｍＬ加えた。このシャーレにＨｅＬａ細胞を播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下に培養しすることによって、ガラスビーズ上にＨｅＬａ細胞を付着させた。
Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液を添加することで生細胞を蛍光染色した。
ＨｅＬａ細胞が表面に付着されたガラスビーズの懸濁液１００ｍｌ（２０個／ｍｌ）を前記シートに上部から静かに注ぎ、接触させた後、前記シートから余剰の液体を除去することで、前記空孔中に存在する液体とともに前記シートの空孔の各々に前記ガラスビーズを保持させた。前記シート上の余剰の液体はシートを傾けて落とし、開口部以外の場所に水滴が残らないようにした。
上記の方法で得られたガラスビーズを配置した前記シートの各開口部（空孔）を実体顕微鏡（ライカ社製、Ｓ８ＡＰ０）で観察して各空孔内のガラスビーズの保持状態を観察した。図７に示す様に、ガラスビーズが配置されていることを明瞭に観察することができた。また、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製 Ｐａｓｃａｌ Ｅｘｃｉｔｅｒ）を用いてガラスビーズ上のＨｅＬａ細胞を観察した。図８に示す様にガラスビーズ上の細胞の形態を明瞭に観察することができた。

（実施例２）
（処理・試験 診断装置）
ポリスチレン系粒子径標準粒子（モリテックス社製、４４００Ａ、保証平均粒子径１００４±２０μｍ、粒子密度１．０５ｇ／ｃｍ^３）を１級アミノシランカップリング剤により処理し、アミノ基を導入した。洗浄後、４５℃の乾燥器中で乾燥させた。コラーゲン濃度を０．０１５％に調製したコラーゲン酸性溶液を分注し、水酸化ナトリウムと炭酸ナトリウムの混合アルカリ溶液を加えて中和し、一時間放置した。純水により洗浄し、純水を吸引除去し、３７℃の乾燥器中で乾燥することにより、コラーゲンコートポリスチレン粒子を調製した。

下記３種類のヒト乳癌細胞系を個別に培養（１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％二酸化炭素）した。それは、ＳＫ‐ＢＲ‐３(human breast adenocarcinoma epithelial adherent、ATCC HTB-30)と、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３(human breast
adenocarcinoma epithelial adherent、ATCC HTB-131) と、ＢＴ‐２０(1+/0, human breast adenocarcinoma、ATCC
HTB-19)であった。

各３種類の細胞の１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ懸濁液を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収した。各懸濁液をそれぞれ異なる容器で前記コラーゲンコートポリスチレン粒子と混合し、攪拌しながら培養（３２ｒｐｍ、３７℃、５％二酸化炭素）した。
図５に示す寸法の液体交換部位を設けたシート（貫通孔アレイシート）を使用し、前記コラーゲンポリスチレン粒子を含む懸濁液を前記シート上へ静かに注ぎ、接触させた後、前記シートから余剰の液体を除去することで、前記空孔中に存在する液体と共に前記シートの各空孔に前記コラーゲンポリスチレン粒子を保持させた。前記シート上の余剰の液体はシートを傾けて落とし、開口部以外の場所に水滴が残らないようにした。この操作を各３種類の細胞に対してそれぞれ別のシートを用いて行った。

次に下記試薬を調製し、インクジェット装置のインクタンクに充填した。
（１）１次抗体溶液：ウサギ抗ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology社製）を、抗体希釈バッファー（１ｘＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ＢＳＡ）に、１：１０００で希釈して調製した。
（２）ブロッキングバッファー（１ｘＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ｗ／ｖ脱脂粉乳）
（３）２次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology社製）を、抗体希釈バッファー（１ｘＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ＢＳＡ）に、１：１０００で希釈して調製した。
（４）ＨＲＰの化学発光基質（ＥＣＬシステム、ＧＥヘルスケア社製）
（５）Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液：１μｇ／ｍＬ水溶液
また洗浄バッファー（１ｘＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）と培養メディウム（１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地）とを供給液容器２６に充填した。

（生細胞数パラメータの計測）
Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液を各細胞系のシリーズに滴下した。培養メディウムに液体交換後、４９４ｎｍの波長の光を照射し、５１７ｎｍの蛍光量をＣＣＤカメラにて検出した。

（ＨＥＲ２発現量パラメータの計測）
ブロッキングバッファーへの置換、洗浄、１次抗体溶液滴下、洗浄、２次抗体溶液滴下、洗浄、ＨＲＰの化学発光基質の滴下操作を順次行い、発光量をＣＣＤカメラにて検出した。前記生細胞数パラメータで規格化したＨＥＲ２発現量パラメータの値はＢＴ−２０＜ＭＤＡ−ＭＢ−４５３＜ＳＫ−ＢＲ−３となり、細胞で発現しているタンパク質（ＨＥＲ２発現量）を評価定量する試験を行うことができた。上記試薬を滴下せずに、培養メディウムのみで保持した粒子に対して、圧縮空気供給装置１８から電磁バルブ１９を経由してガス噴射ノズル２０（移送手段（Ｅ））から空気を噴射して、下部に設置された個々の収集容器２１に粒子を落下させた。容器には、培養メディウムが入っていて、回収した細胞をさらに増殖させることができた。

（実施例３）
（各空孔２に保持された細胞数のばらつき）
実施例２と同様にして、コラーゲンコートポリスチレン粒子に３種類のヒト乳癌細胞（ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＳＫ−ＢＲ−３）を個別に担持させ培養した。図６に示す２２３６個の空孔２が最密に形成されたシート（貫通孔アレイシート）に、コラーゲンコートポリスチレン粒子の懸濁液１００ｍｌ（２０個／ｍｌ）を上部から静かに注ぎ、接触させた後、余剰の液体を除去することで、貫通孔アレイシートの空孔の各々に細胞担持ビーズを保持させた。

実施例２に例示した処理装置でＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液を細胞に添加した。生細胞数パラメータ（５１７ｎｍの蛍光量）を各貫通孔について計測し、各貫通孔内に保持された細胞数のばらつきσ_１を次のようにして計算した。
すなわち各貫通孔の蛍光量計測値をｆ_ｉとすると、下記数１で算出した平均蛍光量（ただしｎは計測した貫通孔の数であり、n=2236である）を用いて、下記数２で計算した。

（比較例１）
一方比較例として、次の操作によりマルチウェルプレートに細胞を保持した系を調整した。前記トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収した各細胞系の、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ懸濁液を、粒子に細胞を固定することなく１５３６ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製）に各ウェルあたり約２５００個の細胞が入るように分注した。各ウェルの液量は１０μLであり、２５０個／μLの細胞懸濁液を１０μLずつ分注した。３７℃、５％二酸化炭素の条件下培養した後、生細胞数パラメータ（５１７ｎｍの蛍光量）を各ウェルについて計測し、各ウェル内に保持された細胞数のばらつきσ_２を次のようにして計算した。
すなわち各ウェルの蛍光量計測値をｆ_ｉ’とすると、下記数３で算出した平均蛍光量（ただしｎ=1536である）を用いて、下記数４で計算した。

異なる細胞保持系で計測・計算されたσ_１及びσ_２を比較すると、BT-20、MDA-MB-453、及びSK-ＢＲ-３の全ての細胞株について、σ_２＞σ_１であることがわかった。これはマルチウェルプレートへの細胞保持系では播種の際のばらつきが各ウェルで固定されるのに対して、コラーゲンコートポリスチレン粒子との混合培養系では攪拌工程の際に、各粒子に担持される細胞数のばらつきが減少されるためと推察される。
またマルチウェルプレートを用いる系では各ウェルへの分注作業に時間を要し、この間に細胞の懸濁状態が変化してしまうため、ばらつきが大きくなってしまうものと推察される。すなわち本発明の細胞保持方法によれば、２２００個以上のアドレス可能な貫通孔に迅速にばらつき少なく細胞を保持することが可能となる。

本発明の方法は、薬剤候補化合物の薬理活性試験、化学物質の毒性試験、バイオプシーにより採取された初代腫瘍細胞に対する抗がん剤選択試験などに用いられることができる。

１： ベース（基体）
２： 貫通した空孔
３： 粒子
４： 液体
５： 化学物質の着弾位置
６： 粒子保持部位
７、８： 液体交換部位
９： 貫通孔アレイシート
１０： 可動性ホルダー
１１： Ｘ軸方向
１２： チャンバー
１３： 温湿度制御装置
１４： インクジェット装置
１５： モニター
１６： 制御部
１７： センサー部
１８： 圧縮空気供給装置
１９： 電磁バルブ
２０： ガス噴射ノズル
２１： 収集容器
２２： 照明部
２３： CCDカメラ
２４： キャピラリー
２５： 送液ポンプ
２６： 供給液容器
２７： 廃液容器
２８： Ｚ軸方向
２９： 液体交換装置
３０： 電磁バルブ

Claims (5)

1. 貫通した空孔が複数配置されているシートを用意するシート用意工程と、
   用意された細胞を担持させた粒子の懸濁液体を前記シートに接触させる接触工程とを含む細胞保持方法であり、前記空孔が液体とともに前記粒子の１つのみをその孔内に保持する大きさであることを特徴とする細胞保持方法。
2. 前記空孔が、対象となる１個の試料を保持可能であり、且つ２個以上の前記試料は保持できない大きさであることを特徴とする請求項１細胞保持方法。
3. 前記空孔の開口面積が前記粒子の最大断面積の１．０５倍から２．６３倍の範囲内であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞保持方法。
4. 請求項１に記載の細胞保持方法で細胞を保持する保持工程と、
   前記細胞に対する試験を行うために前記細胞に物質を投与する投与工程とを含む細胞試験方法。
5. 貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段と、
   以下の手段（Ａ）から手段（Ｇ）の少なくとも１つの手段とを有する細胞処理装置。
   （Ａ）前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を配置させるための配置手段、
   （Ｂ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御ための制御手段、
   （Ｃ）前記シートの空孔に液滴を付与するための付与手段、
   （Ｄ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段、
   （Ｅ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段、
   （Ｆ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段、
   （Ｇ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段。