DE60003171T2

DE60003171T2 - Methoden zur miniaturisierten zellenanordnung und auf zellen basierendes screening gerät

Info

Publication number: DE60003171T2
Application number: DE60003171T
Authority: DE
Inventors: Ravi Kapur; Terri Adams
Original assignee: Cellomics Inc
Current assignee: Cellomics Inc
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: CA2368773A1; IL145222A0; JP2002541458A; WO2000060356A1; DE60003171D1; AU4063700A; EP1166116B1; ATE242486T1; EP1166116A1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 60/127,339, eingereicht am 01. April 1999 und 60/138,119, eingereicht am 07. Juni 1999; ist eine teilweise Fortführung der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 09/401,212, eingereicht am 22. September 1999, die eine teilweise Fortführung der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/865,341, eingereicht am 29. Mai 1997, ist; und ist verwandt mit U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 09/468,673, eingereicht am 21.12.1999.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für zellbasiertes Screening (Durchmustern) mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Gehalt.
Hintergrund der Erfindung
In dem wachsenden Bereich der Arzneistofferkennung und kombinatorischen Chemie zur Erzeugung von Kandidatenverbindungen, würde es sehr nützlich sein, in der Lage zu sein, schnell eine große Anzahl von Substanzen auf ihre physiologische Wirkung auf Tiere und Menschen durch einen Screen mit hohem Durchsatz zu screenen. Bevor die Wirksamkeit eines "teilweise qualifizierten" Arzneistoffkandidaten in Tieren gemessen wird, könnte das Arzneimittel zunächst auf seine biologische Aktivität und potentielle Toxizität in lebenden Zellen gescreent werden. Die physiologische Antwort des Arzneistoffkandidaten könnte dann aus den Ergebnissen dieser Zellscreens (Zellmusterungen) vorhergesagt werden.
Herkömmlicherweise wurden "Leitverbindungen" schnell in aufwendige Tieruntersuchungen gebracht, die sowohl zeitraubend als auch teuer sind. Darüber hinaus wird ausgedehntes Arzneimitteltesten in Tieren zunehmend weniger kulturell akzeptabel. Das Screening von Arzneimittelkandidaten auf ihre Interaktion mit lebenden Zellen vor Tierversuchen kann die Anzahl der Tiere, die in den nachfolgenden Screeningverfahren benötigt werden, reduzieren durch Ausschließen einiger Arzneimittelkandidaten, bevor sie in die Tierversuche gehen. Allerdings ermöglicht die Manipulation und Analyse von Arzneimittel-Zellinteraktionen unter Verwendung der aktuellen Verfahren nicht sowohl Screens mit hohem Durchsatz als auch Screens mit hohem biologischen Gehalt, aufgrund der geringen Anzahl von Zellen und Verbindungen, die in einem gegebenen Zeitraum analysiert werden können, der schwerfälligen Verfahren, die für die Verbindungslieferung erforderlich sind und der großen Volumina von Verbindungen, die zum Testen erforderlich sind.
Screening mit hohem Durchsatz von Nukleinsäuren und Polypeptiden wurde unter Verwendung von DNA-Chiptechnologien erreicht. In typischen DNA-Analyseverfahren werden DNA-Sequenzen von 10 bis 14 Nukleotiden an definierte Orte (oder Spots) angeheftet, bis zu zehntausenden, auf einer kleinen Glasplatte (U.S.-PS Nr. 5,556,752). Dies erzeugt einen Array (Anordnung) von Spots (Orten) von DNA auf einer gegebenen Glasplatte. Der Ort eines Spots auf dem Array stellt eine Adresse für spätere Referenz zu jedem DNA-Spot zur Verfügung. Die DNA-Sequenzen werden dann mit komplementären DNA-Sequenzen, die mit fluoreszierenden Molekülen markiert sind, hybridisiert. Signale von jeder Adresse auf dem Array werden detektiert, wenn die fluoreszierenden Moleküle, die an die hybridisierenden Nukleinsäuresequenzen angeheftet sind, in Anwesenheit von Licht fluoreszieren. Diese Vorrichtungen wurden verwendet, um Screeningsysteme mit hohem Durchsatz füf DNA-Sequenzen in Bemühungen zur Arzneimittelentdeckung zur Verfügung zu stellen und in dem humanen Genom Sequenzierungsprojekt. In ähnlicher Weise wurden Proteinsequenzen von unterschiedlicher Aminosäurelänge in unterschiedlichen Spots als ein Array auf einer Glasplatte angeheftet (U.S.-PS Nr. 5,143,854).
Die Information, die durch einen Array von entweder Nukleinsäuren oder Aminosäuren die auf Glasplatten gebunden sind, zur Verfügung gestellt wird, ist eingeschränkt, gemäß der ihr zugrundeliegenden "Sprachen". Beispielsweise haben DNA-Sequenzen eine Sprache von nur vier Nukleinsäuren und Proteine haben eine Sprache von etwa 20 Aminosäuren. Im Gegensatz dazu hat eine lebende Zelle, die eine komplexe Organisation von biologischen Verbindungen umfasst, eine ausgedehnte "Sprache" mit einer begleitenden Vielzahl von potentiellen Interaktionen mit einer Vielzahl von Substanzen, wie DNA, RNA, Zelloberflächenproteinen, intrazellulären Proteinen und dergleichen. Da ein typisches Ziel für Arzneimittelwirkung mit und in den Zellen des Körpers ist, stellen Zellen selbst ein extrem nützliches Screeningwerkzeug in der Arzneistofferkennung zur Verfügung, wenn sie mit empfindlichen Nachweisreagenzien kombiniert werden. Es würde somit am Nützlichsten sein, eine Screeningvorrichtung mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt zu haben, um räumliche Informationen mit hohem Gehalt auf zellulärer und subzellulärer Ebene zur Verfügung zu stellen, genauso wie zeitliche Informationen über Veränderungen in physiologischen, biochemischen und molekularen Aktivitäten.
Mikroarrays von Zellen
Es wurden Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays eines Einzelzelltypus auf einem üblichen Substrat für andere Anwendungen beschrieben. Ein Beispiel eines solcher Verfahren ist die photochemische Fotolack-Fotolithografie (Resist Photolithography) (Mrksich und Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25: 55–78, 1996), in der eine Glasplatte gleichmäßig mit einem Fotolack beschichtet wird und eine Fotomaske über die Fotolackbeschichtung gebracht wird, um den "Array" (die Anordnung) zu definieren oder gewünschte Muster. Nach Aussetzen gegen Licht wird der Fotolack in den unmaskierten Bereichen entfernt. Die gesamte fotolithografisch definierte Oberfläche wird einheitlich mit einer hydrophoben Substanz, wie einem Organosilan, beschichtet, das sowohl an die Bereiche des exponierten Glases als auch an die Bereiche, die mit dem Fotolack beschichtet sind, bindet. Der Fotolack wird dann von der Glasoberfläche abgezogen, was einen Array von Orten von freigelegtem Glas freilegt. Die Glasplatte wird dann mit einem Organosilan gewaschen, dass terminale hydrophile Gruppen oder chemisch reaktive Gruppen, wie Aminogruppen, besitzt. Das hydrophile Organosilan bindet an die Orte des exponierten Glases mit dem Ergebnis, dass die Glasplatte einen Array von hydrophilen oder reaktiven Spots (lokalisiert in den Bereichen, auf denen ursprünglich Fotolack war) auf einer hydrophoben Oberfläche besitzt. Der Array von Spots von hydrophilen Gruppen stellt ein Substrat für unspezifische und nicht-kovalente Bindungen von bestimmten Zellen, einschließlich denen, die neuronalen Ursprungs sind, zur Verfügung (Kleinfeld et al., J. Neurosci. 8: 4090–4120, 1988).
In einem weiteren Verfahren, das auf spezifischen nicht-kovalenten Interaktionen basiert, wird Prägung verwendet, um eine Goldoberfläche, die mit Protein-adsorptivem Alkanthiol beschichtet ist herzustellen (U.S.-PS Nr. 5,776,748; Singhvi et al., Science 264: 696–698 (1994). Die bloße Goldoberfläche wird dann mit Polyethylenglykol-terminierten Alkanthiolen beschichtet, die Proteinabsorption widerstehen. Nachdem die ganze Oberfläche Laminin ausgesetzt wurde, wurde ein zellbindendes Protein in der extrazellulären Matrix gefunden, lebende Hepatozyten waren gleichmäßig angeheftet und wuchsen auf den Lamininbeschichteten Inseln (Singhvi et al. 1994). Eine Ausarbeitung, die starke, jedoch nicht-kovalente Metall-chelation einschließt, wurde verwendet, um Goldoberflächen mit Mustern von spezifischen Proteinen zu beschichten (Sigal et al., Anal. Chem. 68: 490–497, 1996). In diesem Fall ist die Goldoberfläche mit Alkanthiolen, die mit Nitrilessigsäure terminieren, ge mustert. Die bloßen Regionen des Goldes sind mit Tri(ethylenglykol) beschichtet, um die Proteinabsorption zu reduzieren. Nach Zusatz von Ni²⁺ war die spezifische Adsorption von fünf Histidin-markierten Proteinen kinetisch stabil.
Spezifischere Einzelzelltypbindung kann erreicht werden durch chemisches Crosslinking (Quervernetzen) von spezifischen Moleküle, wie Proteinen, an reaktive Stellen auf dem gemusterten Substrat (Aplin und Hughes, Analyt. Biochem. 113: 144–148, 1981). Eine weitere Ausarbeitung von Substratmusterung erzeugt optisch einen Array von reaktiven Spots. Eine Glasplatte wird mit einem Organosilan gewaschen, das chemisch an das Glas adsorbiert, um das Glas zu beschichten. Die Organosilanbeschichtung wird mit tiefem UV-Licht durch eine optische Maske bestrahlt, die Muster auf einem Array definiert. Die Bestrahlung spaltet die Si-C-Bindung, um reaktive Si-Radikale zu bilden. Die Reaktion mit Wasser setzt die Si-Radikale in polare Silanolgruppen um. Die polaren Silanolgruppen erzeugen Spots auf dem Array und sind weiterhin modifiziert, um andere reaktive Moleküle an die Spots zu koppeln, wie offenbart in U.S.-PS Nr. 5,324,591. Beispielsweise kann ein Silan, das eine biologisch funktionelle Gruppe, wie eine freie Aminogruppe enthält, mit den Silanolgruppen reagieren. Die freien Aminogruppen können verwendet werden als Stellen der kovalenten Anheftung für Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und Lipide. Die nichtgemusterte kovalente Anheftung eines Lektins, von dem bekannt ist, dass es mit der Oberfläche von Zellen interagiert, an ein Glassubstrat durch reaktive Aminogruppen wurde gezeigt (Aplin & Hughes, 1981). Das optische Verfahren der Bildung eines Mikroarrays des Einzelzelltyps auf einer Auflage (Support) erfordert weniger Schritte und ist schneller als das Fotolackverfahren (d. h. nur zwei Schritte), jedoch erfordert es die Verwendung von ultraviolettem Licht einer hohen Intensität von einer teuren Lichtquelle.
Das Ergebnis all dieser Verfahren ist ein Mikroarray eines Einzelzelltyps, da die biochemisch spezifischen Moleküle gleichmäßig an den mikrogemusterten chemischen Array gebunden werden. In dem Fotolackverfahren binden Zellen an einen Array hydrophiler Orte (Spots) und /oder spezifische Moleküle, die an diese Spots gebunden sind, binden wiederum Zellen. Somit binden Zellen an alle Spots in dem Array in der gleichen Weise. In dem optischen Verfahren binden Zellen an den Array von Spots freier Aminogruppen durch Adhäsion. Es gibt geringe oder keine Unterscheidung zwischen den Spots freier Aminogruppen. Noch mal, Zellen binden an alle Spots in der gleichen Weise und somit kann nur ein Einzelzelltyp der Zellinteraktion mit diesen Zellarrays untersucht werden, da jeder Spot auf dem Array im Wesentlichen der gleiche ist wie ein anderer. Solche Zellarrays sind unflexibel in ihrer Anwendbarkeit als Werkzeuge zur Untersuchung einer spezifischen Vielzahl von Zellen in einer Einzelprobe oder einer spezifischen Vielzahl von Zellinteraktionen. Somit besteht ein Bedarf an Arrays für multiple Zelltypen auf einem gewöhnlichen Substrat, um die Anzahl von Zelltypen und spezifischen Zellinteraktionen, die gleichzeitig analysiert werden können, zu steigern, genauso wie an Verfahren zur Herstellung dieser Mikroarrays multipler Zelltypen auf einem gewöhnlichen Substrat, um ein Screeningsystem von Zellen mit hohem Durchsatz und hohem biologischen Gehalt zur Verfügung zu stellen.
Optisches Lesen der Zellphysiologie
Die Durchführung eines Screens mit hohem Durchsatz von vielen tausenden von Verbindungen erfordert die parallele Handhabung und Prozessierung von vielen Verbindungen und Assay Verbindungsreagenzien. Standardscreens mit hohem Durchsatz verwenden homogene Gemische von Verbindungen und biologischen Reagenzien, zusammen mit einigen Indikatorverbindungen, die in einen Array von Vertiefungen in Standardmikroplatten mit 96 oder 384 Vertiefungen geladen werden (Kahl et al., J. Biol. Scr. 2: 33–40, 1997). Das Signal, das von jeder Vertiefung gemessen wird, entweder Fluoreszenzemission, optische Dichte oder Radioaktivität, integriert das Signal von dem Gesamtmaterial in der Vertiefung, was einen Gesamtpopulationsdurchschnitt von allen Molekülen in der Vertiefung ergibt. Dieser Assaytyp wird normalerweise als homogener Assay bezeichnet.
Die U.S.-PS Nr. 5,581,487 beschreibt ein Bildgebungs-Plattenlesegerät, das einen CCD-Detektor (ladungsgekoppelten optischen Detektor) verwendet, um den Gesamtbereich einer Platte mit 96 Vertiefungen abzubilden. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für homogene Assays zu berechnen.
Schroeder und Neagle beschreiben ein System, das Laserscanningbeleuchtung mit geringem Winkel verwendet und eine Maske, um selektiv Fluoreszenz in etwa 200 Mikrometern des Bodens der Vertiefung in Standardplatten mit 96 Vertiefungen anzuregen, um den Hintergrund zu reduzieren, wenn Zelleinzelschichten abgebildet werden (J. Biomol. Scr. 1: 75-80, 1996). Dieses System verwendet eine CCD-Kamera, um den Gesamtbereich des Plattenbodens abzubilden. Obwohl dieses System Signale misst, die von einer Zelleinzelschicht auf dem Boden der Vertiefung stammen, wird das gemessene Signal über den Bereich der Vertiefung gemittelt und wird deshalb immer noch als eine homogene Messung angesehen, da es eine durchschnittliche Antwort einer Population von Zellen ist. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für zellbasierte homogene Assays zu berechnen.
Proffitt et al. (Cytometry 24: 204–213, 1996) beschreibt ein halbautomatisiertes Fluoreszenzdigitales Bildgebungssystem zur Quantifizierung von relativen Zellzahlen in situ, wobei die Zellen mit Fluoreszeindiacetat (FDA) zuvor behandelt wurden. Das System verwendet eine Vielzahl von Gewebekultur-Plattenformaten, insbesondere Mikroplatten mit 96 Vertiefungen. Das System besteht aus einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop mit einer motorisierten Bühne, Videokamera, Bildintensivierer und einem Mikrocomputer mit einem PC-Vision-Digitalisierer. Turbopascal-Software kontrolliert die Bühne und scannt die Platte durch Aufnahme multipler Bilder pro Vertiefung. Die Software berechnet die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung, stellt eine tägliche Kalibrierung zur Verfügung und konfiguriert das System für eine Vielzahl von Gewebekultur Plattenformaten. Die Schwellenwertbildung digitaler Bilder und die Verwendung von Reagenzien, die nur fluoreszieren, wenn sie von lebenden Zellen aufgenommen werden, werden verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, ohne überschüssige Fluoreszenzreagenzien zu entfernen.
Eine Vielzahl von Verfahren wurden entwickelt, um fluoreszierende Zellen mit einem Mikroskop abzubilden und Informationen über die räumliche Verteilung und zeitlichen Veränderungen, die in diesen Zellen auftreten, zu extrahieren. Ein Artikel, der kürzlich erschien, beschreibt viele dieser Verfahren und ihre Anwendungen (Taylor et al., Am. Scientist 80: 322-335, 1992). Diese Verfahren wurden entworfen und optimiert für die Präparation einer geringen Zahl von Proben für Bildmessungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung der Verteilung, Menge und biochemischer Umgebung von fluoreszierenden Reportermolekülen in den Zellen.
Die Behandlung von Zellen mit Farbstoffen und fluoreszierenden Reagenzien, die Abbildung der Zellen und die Konstruktion von Zellen, die ein fluoreszierendes Reportermolekül erzeugen, wie ein modifiziertes grün fluoreszierendes Protein (GFP), sind nützliche Nachweisverfahren (Wang et al., In Methods in Cell Biology, New York, Alan R. Liss, 29: 1–12, 1989). Das grün fluoreszierende Protein (GFP) der Qualle Aequorea victoria hat ein Anregungsmaximum bei 395 nm, ein Emissionsmaximum bei 510 nm und benötigt keinen exogenen Faktor. Die Verwendungen von GFP zur Untersuchung der Genexpression und Proteinlokalisierung sind in Chalfie et al., Science 263: 802–805, 1994) diskutiert. Einige Eigenschaften von Wildtyp-GFP sind von Morise et al. (Biochemistry 13: 2656–2662, 1974) und Ward et al. (Photochem. Photobiol. 31: 611–615, 1980) offenbart. Ein Artikel von Rizzuto et al. (Nature 358: 325-327, 1992) diskutiert die Verwendung von Wildtyp-GFP als ein Werkzeug zur Visualisierung von subzellulären Organellen in Zellen. Kaether und Gerdes (FEBS Letters 369: 267–271, 1995) berichten die Visualisierung von Proteintransport über den Sekretionssignalweg unter Verwendung von Wildtyp-GFP. Die Expression von GFP in Pflanzenzellen wird von Hu und Cheng (FEBS Letters 369: 331–334, 1995) diskutiert, wohingegen GFP-Expression in Drosophila-Embryonen von Davis et al. (Dev. Biology 170: 726–729, 1995) beschrieben wird.
U.S.-PS Nr. 5,491,084 offenbart die Expression von GFP aus Aequorea victoria in Zellen als Reportermolekül, fusioniert an ein anderes Protein von Interesse. GFP-Mutanten wurden hergestellt und verwendet in verschiedenen biologischen Systemen (Hasselhoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2122–2127, 1997; Brejc et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2306–2311, 1997; Cheng et al., Nature Biotech. 14: 606–609, 1996; Heim und Tsien, Curr. Biol. 6: 178–192, 1996; Ehrig et al., FEBS Letters 367: 163–166, 1995).
Das ARRAYSCAN^TM-System, wie entwickelt von Cellomics, Inc. (U.S.-PS Nr. 5,989,835) und U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 09/031,271, eingereicht am 27. Februar 1998, ist ein optisches System zur Bestimmung der Verteilung, Umgebung oder Aktivität von lumineszierend markierten Reportermolekülen auf oder in Zellen zum Zwecke des Screenings einer großen Anzahl von Verbindungen auf spezifische biologische Aktivität. Das ARRAYSCAN^TM-System schließt die Zur-Verfügung-Stellung von Zellen, die lumineszierende Reportermoleküle in einem Array von Orten enthalten, und das Scannen einer Anzahl von Zellen an jedem Ort, die Konvertierung der optischen Information in digitale Daten ein und verwendet die digitalen Daten, um die Verteilung, die Umgebung oder Aktivität der lumineszierend markierten Reportermoleküle in den Zellen zu bestimmen. Das ARRAYSCAN^TM-System schließt eine Vorrichtung und ein computergestütztes Verfahren zur Prozessierung, Abbildung und Speicherung der Daten ein, was die Arzneimittelentdeckung vergrößert durch Zur-Verfügung-Stellen eines zellbasierten Screenings mit hohem Gehalt, genauso wie eines kombinierten zellbasierten Screenings mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt in einem großen Mikroplattenformat.
Mikroflüssigkeiten
Die effiziente Lieferung von Lösungen an einen Array von Zellen, die an ein festes Substrat geheftet sind, wird durch ein Mikroflüssigkeitssystem erleichtert. Verfahren und eine Vorrichtung wurden beschrieben zur präzisen Handhabung von kleinen Flüssigkeitsproben zur Ink (Tinten)-Lieferung (U.S.-PS Nr. 5,233,369; U.S.-PS Nr. 5,486,855; U.S.-PS Nr. 5,502,467), Bioprobenaspiration (U.S.-PS Nr. 4,982,739), Reagenzlagerung und -lieferung (U.S.-PS Nr. 5,031,797) und partitionierte Mikroelektronik und Flüssigkeitsvorrichtungsarray zur klinischen Diagnostik und chemischen Synthese (U.S.-PS Nr. 5,585,069). Zusätzlich wurden Verfahren und eine Vorrichtungen beschrieben zur Bildung von Mikrokanälen in festen Substraten, die verwendet werden können, um kleine flüssige Proben entlang einer Oberfläche zu steuern (U.S.-PS Nr. 5,571,410; U.S.-PS Nr. 5,500,071; U.S.-PS Nr. 4,344,816).
Für Zwecke des integrierten zellbasierten Screenings mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt, insbesondere für Abbildung von lebenden Zellen würde eine optimale Mikroflüssigkeits vorrichtung eine flüssige Architektur umfassen, die den nächstmöglichen Vertiefungsabstand ermöglicht (d. h.: höchstmögliche Vertiefungsdichte), wobei die Flüssigkeitsarchitektur in dem Zellarraysubstrat integriert ist, um effiziente Flüssigkeitslieferung zu den Zellen zu ermöglichen und die Notwendigkeit zur Pipettierung von Flüssigkeiten in und aus den Vertiefungen zu eliminieren. Solche optimalen Mikroflüssigkeitsvorrichtungen wären vorteilhaft für Zellarrays mit Sub-Millimeter-Abständen zwischen den Vertiefungen, da es unhandlich, wenn nicht unmöglich ist, Flüssigkeiten mit solch einem hohen Grad der räumlichen Auflösung und Genauigkeit zu pipettieren. Weiterhin könnten solche integrierten Vorrichtungen direkt für zellbasierte Screenings verwendet werden, ohne die Notwendigkeit, das Zellsubstrat von der Flüssigkeitsarchitektur zu entfernen, um die Zellen abzubilden.
Eine optimale Mikroflüssigkeitsvorrichtung für zellbasiertes Screening könnte weiterhin eine geschlossene Kammer umfassen, die die Umgebungskontrolle von Zellen ermöglicht und vorzugsweise würde sie die Zellen nicht direkt elektrokinetischen Kräften aussetzen, die die Physiologie der Zellen auf dem Substrat beeinflussen können. Beispielsweise ist elektrohydrodynamisches Pumpen weniger wirksam mit polaren Lösungsmitteln (Marc Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997, S. 433). Elektroosmose wird typischerweise von einem gewissen Maß elektrophoretischer Trennung von geladenen Mediumbestandteilen wie Proteinen begleitet.
U.S.-PS Nr. 5,603,351 ("das 351-Patent") beschreibt eine Mikroflüssigkeitsvorrichtung, die Multiebenen-Design verwendet, das aus zwei oberen Ebenen mit Kanälen und einer unteren Ebene mit Reaktionsvertiefungen besteht. Allerdings ist diese Vorrichtung nicht zur Verwendung in zellbasiertem Screening ausgelegt. Das '351-Patent offenbart kein Substrat das Zellen oder Zellbindestellen enthält. Das offenbarte Mikroflüssigkeitsnetzwerk ist dazu ausgelegt, es zwei oder mehreren Reagenzien zu ermöglichen, in einer Reaktionsvertiefung kombiniert zu werden, was es im Gegensatz zu einem optimalen Zellscreening Mikroflüssigkeitssystem lebenden Zellen, die auf dem Vertiefungsboden kultiviert werden, ermöglicht, in serienmäßiger Art zwei oder mehreren verschiedenen Flüssigkeiten ausgesetzt zu werden. Das '351-Patent offenbart eine Vorrichtung, bei der die Vertiefungen in das Substrat bei einer maximalen Vertiefungsdichte von 50 Vertiefungen/Inch² geätzt sind. Weiterhin muss das Substrat von dem Flüssigarray zur Inkubation und/oder Analyse gelöst werden. Schließlich offenbart das '351-Patent ein System elektrisch kontrollierter elektrohydrodynamischer Ventile in einer Matrix von Vertiefungen, die weniger wirksam mit wässrigen Medien sind, die in der Zellkultur verwendet werden, und die auch den Grad des geringen Abstands zwischen den Vertiefungen in dem Array von Vertiefungen begrenzen.
Die U.S.-PS Nr. 5,655,560 offenbart ein verstopfungsfreies Ventilsystem, das ein Flüssigkeitsverteilungssystem mit multiplen Eingängen und multiplen Ausgängen, die einen gekreuzten Array von Mikrokanälen, die vertikal an Kreuzungspunkten durch Teflonventile verbunden sind, beinhalten. Allerdings offenbart dieses Patent weder einen substratenthaltenden Zellarray, noch eine integrierte Flüssigkeitsvorrichtung in Kombination mit dem Substrat, noch eine Vertiefungsdichte, die optimal für zellbasiertes Screening ist.
Die U.S.-PS Nr. 5,900,130 (das „130"-Patent) beschreibt die aktive elektronische Kontrolle von Flüssigkeitsbewegung in einer verbundenen Kapillarstruktur. Dieses Patent lehrt nicht eine Flüssigkeitsarchitektur, die den Bereich des Zellsubstrats, der von Zellbindestellen besetzt werden kann, maximiert. Noch offenbart dieses Patent ein Substrat, das einen Zellarray enthält, noch eine integrierte Flüssigkeitsvorrichtung in Kombination mit dem Substrat. Weiterhin lehrt das Patent nur die Kontrolle von Flüssigkeitsfluss durch Anwendung eines elektrischen Feldes auf die Vorrichtung.
U.S.-PS Nr. 5,910,287 beschreibt Multivertiefungs-Plastikplatten für Fluoreszenzmessungen von biologischen und biochemischen Proben, einschließlich Zellen, beschränkt auf Platten mit mehr als 864 Vertiefungen. Dieses Patent beschreibt keine Mikroflüssigkeitsvorrichtung mit einer Flüssigkeitsarchitektur, integriert in das Zellarraysubstrat. Noch offenbart das Patent eine geschlossene Kammer, die Umgebungskontrolle von Zellen auf dem Substrat ermöglicht.
Somit stellt keine dieser älteren Mikroflüssigkeitsvorrichtungen eine Flüssigkeitsarchitektur zur Verfügung, die den geringsten möglichen Vertiefungsabstand ermöglicht (d. h.: höchstmögliche Vertiefungsdichte), wobei die Flüssigkeitsarchitektur integriert ist mit dem Zellarrey Substrat, um eine effiziente Flüssigkeitslieferung zu den Zellen zu ermöglichen und somit die Notwendigkeit des Pipettierens von Flüssigkeiten in und aus den Vertiefungen eliminiert. Weiterhin verwenden ältere Mikroflüssigkeitsvorrichtungen, die einen Array von Vertiefungen umfassen, elektrisch kontrollierte elektrohydrodynamische Ventile in der Matrix von Vertiefungen, die weniger effektiv sein würden, wenn sie mit einem Medium für Zellkultur verwendet würden und die die Vertiefungsdichte beschränken würden.
Während die vorstehenden Vorteile in dem Zellarray, der optischen Zellphysiologieablesung und Mikroflüssigkeitstechnologie unterstützende Technologien zur Verfügung stellen, die anwendet werden können, um zellbasierte Screenings mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt zu verbessern, bleibt ein Bedarf auf dem Fachgebiet an integrierten Vorrichtungen und Verfahren, die weiterhin die Menge der notwendigen Zeit für solche Screenings verrin gern, genauso wie für Vorrichtungen und Verfahren, die weiterhin die Fähigkeit, zellbasierte Screenings mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt durchzuführen, verbessern und die Fähigkeit, flexibel und schnell von einem zum anderen zu wechseln. Insbesondere wären Vorrichtungen und Verfahren, die die Vertiefungsdichte maximieren, wodurch die Anzahl von Vertiefungen, die zum gleichen Zeitpunkt abgebildet werden können, gesteigert wird und somit der Durchsatz eines Screens stark gesteigert wird, während eine angebrachte Auflösung des Bildes aufrechterhalten wird, sehr vorteilhaft.
Die Arzneimittel-Entdeckungsindustrie verwendet bereits Mikroplatten mit 96 und 384 Vertiefungen und befindet sich im Übergang zur Verwendung von Platten mit 1536 Vertiefungen. Allerdings sind weitere Steigerungen der Vertiefungsdichte unter Verwendung älterer Technologie unwahrscheinlich aufgrund der großen Schwierigkeit, Flüssigkeiten in und aus Vertiefungen mit einem sehr geringen Durchmesser zu pipettieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erfüllt den Bedarf auf dem Fachgebiet an Vorrichtungen und Verfahren, die die Zeit, die notwendig ist um zellbasierte Screenings durchzuführen verringert und die spezifisch die Fähigkeit, zellbasierte Screenings mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt durchzuführen kombiniert und um flexibel und schnell von einem zum anderen zu wechseln. Die Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren zur Verfügung zur Maximierung der Anzahl von Vertiefungen, die gleichzeitig abgebildet werden können, während noch eine angemessene Pixelauflösung in dem Bild erhalten wird. Dieses Ergebnis wurde erreicht durch die Verwendung von Flüssigkeitsarchitekturen, die die Vertiefungsdichte maximieren. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein miniaturisiertes Mikrotiterplattensystem zur Verfügung, mit geschlossenen Flüssigkeitsvolumina, die intern mit Flüssigkeitsaustausch versorgt werden und mit Vertiefungen, die einen geringen Abstand haben um schneller räumlich aufgelöste Eigenschaften von individuellen Zellen nachzuweisen. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur selektiven Zellmusterung zur Verfügung und die Substrate selbst, wobei das Verfahren In-Kontakt-Bringen von reaktiven Hydroxylgruppen auf der Oberfläche eines Substrats mit einem Hydroxyl-reaktiven bifunktionalen Molekül umfasst, um eine Einzelschicht zu bilden und die Verwendung von Schablonen, um zellabstoßende oder zelladhäsive Gruppen auf dem Substrat zu hinterlegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Hydroxyl-reaktive bifunktionale Molekül ein Aminosilan und die zellabstoßende Gruppe umfasst Tresylaktiviertes Polyethylenglykol.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A ist eine Draufsicht auf einen kleinen Substrat-mikrogemusterten chemischen Array.
1B ist eine Draufsicht auf einen großen Substrat-mikrogemusterten chemischen Array.
2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines mikrogemusterten chemischen Arrays auf einem Substrat.
3A ist eine Fotografie, die Fibroblastenzellwachstum auf einem Chip mit gemusterter Oberfläche, verbunden mit einem mikrogemusterten chemischen Array und markiert mit zwei Fluoreszenzsonden, zeigt.
3B ist eine Fotografie, die Fibroblastenzellwachstum in gepunkteten Mustern, verbunden mit einem mikrogemusterten chemischen Array und markiert mit zwei fluoreszierenden Sonden, zeigt.
4 ist eine Darstellung einer Kassette, die die Kombination des Mikroarrays mit multiplen Zelltypen oben und Kammer unten ist.
5 ist eine Darstellung einer Kammer, die im Nano-Maßstab hergestellte Eingangskanäle hat, die "Vertiefungen" in dem nichtgleichmäßigen mikrogemusterten Array von Zellen ansteuern.
6 ist eine Darstellung einer Kammer ohne Kanäle.
7A ist Aufsicht Darstellung einer Kammer mit Mikroflüssigkeitskanälen, die auf das Substrat geätzt sind.
7B ist eine Seitenansicht einer Kammer mit Mikroflüssigkeitskanälen, die auf das Substrat geätzt sind.
8A ist eine Aufsicht Darstellung einer Kammer, in der Mikroflüssigkeitskanäle und Vertiefungen aus einer erhöhten Matrix eines Materials, das auf die Flüssigkeitslieferungskammer geprägt ist, gebildet sind.
8B ist eine Seitenansicht einer Kammer, in der Mikroflüssigkeitskanäle und Vertiefungen aus einer erhöhten Matrix eines Materials, das auf die Flüssigkeitslieferungskammer geprägt ist, gebildet sind.
9 ist eine Darstellung einer Kammer, in der jede Vertiefung von einem Kanal angesteuert wird, der von einer Seite der Kammer stammt.
10 ist eine Darstellung einer Kammer, in der jede Vertiefung von Kanälen angesteuert wird, der von zwei Seiten der Kammer stammen.
11 ist eine Darstellung einer Kammer, in der die Umschaltungen der Mikrofülussigkeiten durch Licht, Hitze oder mechanische Mittel kontrolliert werden.
12 ist eine Darstellung eines Lumineszenzleseinstruments.
13 ist eine Darstellung einer Ausführungsform des optischen Systems mit Lumineszenzleseinstrument.
14A ist ein Flussdiagramm, das einen Überblick über das Zellscreeningverfahren zur Verfügung stellt.
14B ist ein Makro (Modus (Betriebsart) mit hohem Durchsatz)-Prozessierungs-Flussdiagramm.
14C ist ein Mikro (Modus mit hohem Gehalt)-Prozessierungsflussdiagramm.
15 ist eine Darstellung eines integrierten Zellscreeningsystems.
16 ist eine Fotografie des Benutzerinterface des Lumineszenzleseinstruments.
17A ist eine Fotografie, die lymphoide Zellen zeigt, die unspezifisch an ein unmodifiziertes Substrat geheftet sind.
17B ist eine Fotografie, die lymphoide Zellen zeigt, die unspezifisch an IgM-beschichtetes Substrat geheftet sind.
17C ist eine Fotografie, die lymphoide Zellen zeigt, die spezifisch an ein Gesamtantiserum – beschichtetes Substrat gebunden sind.
18A ist ein fotografisches Bild eines Modus mit hohem Durchsatz eines Lumineszenzleseinstruments, das "Treffer" identifiziert.
18B ist eine Serie fotografischer Bilder, die den Modus mit hohem Gehalt zeigen, der biologische Informationen mit hohem Gehalt identifiziert.
19 ist ein fotografisches Bild, das die Zelldaten, die von dem Modus mit hohem Gehalt erhalten wurden, darstellt.
20 bildet die Optimierung von Zellabbildung durch gleichzeitige Abbildung von einem Unterarray von Zellbindungsorten des gesamten Arrays ab. Es besteht eine Eins-zu-Eins-Übereinstimmung zwischen dem Array der Zellbindungsorte auf dem Substrat, dem Array der Flüssigkeitsorte auf der Kammer und dem Array der Vertiefungen, die durch die Verbindung der beiden gebildet wird.
21 zeigt ein Beispiel eines 8 × 8-Arrays (64 Vertiefungen, 128 Kanäle) der Mikroflüssigkeitsvorrichtung, wobei jeder Flüssigkeitsort mit einem getrennten Eingangs- und Ausgangskanal versorgt ist, was 2n²-Kanäle für einen n × n-Array ergibt.
22 bildet die Mikroflüssigkeitsvorrichtung aus 21 ab, wobei m + n² Ventile oder Pumpen verwendet werden, um den Fluss von m Flüssigkeit oder Dampfgemischen zu einem 8 × 8-Array zu kontrollieren.
23 bildet eine Ausführungsform einer Mikroflüssigkeitsvorrichtung ab, wobei das Flüssigkeitslieferungssystem aus einem überkreuzten, nichtunterbrochenen Array von Eingangs- und Ausgangskanälen besteht und horizontal Kanäle verbindet, die mehrere Ebenen verwenden und wobei die zwei Schichten in der gleichen Ebene der Vertiefungsschicht liegen.
24 bildet eine Endansicht und Seitenansicht der Ausführungsform aus 23 ab.
25 bildet eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung ab, wobei das Flüssigkeitslieferungssystem aus einem überkreuzten, nicht unterbrochenen Array von Eingangs- und Ausgangskanälen besteht und vertikal verbundenen Kanälen, die mehrere Ebenen verwenden und wobei die zwei Schichten auf einer Ebene oberhalb der Vertiefungsschicht liegen.
26 bildet eine Endansicht und Seitenansicht der Ausführungsform aus 25 ab.
27 zeigt eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung, wobei Verbindungen an einem einzigen Flüssigkeitsort gebündelt sind durch Verwendung von m positiven Druckquellenreservoirs oder Pumpen, einem Ventil-freien Sammelrohr und einen Ventil-freien Abfall-Reservoir bei Atmosphären Druck.
28 zeigt eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung, wobei die Verbindungen an einem einzigen Flüssigkeitsort gebündelt sind durch Verwendung von m positiven Druckquellreservoirs oder Pumpen, einem Sammelrohr mit Ventilen oder einem negativen Druckabfallreservoir oder einer Pumpe mit m Ventilen, verbunden mit m Quellenreservoirs bei Atmosphärendruck und ventilfreiem Abfallreservoir bei Atmosphärendruck.
29 zeigt eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung, wobei der Array von m positiven Druckquellenreservoirs oder Pumpen mit einem n × n-gekreuzten Kanalarray von Flüssigkeitsorten gebündelt ist durch Mittel von 1 × n-Eingangs- und n × 1-Ausgangsventil-Sammelrohren.
30 zeigt eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung mit m Reservoirs bei Atmosphärendruck und einem Negativdruckabfallreservoir durch Mittel von 1 × n-Eingangs- und n × 1-Ausgangsventil-Sammelrohren, wobei das negative Druckreservoir entweder mechanisch oder thermodynamisch gepumpt werden kann.
31 zeigt eine Ausführungsform eines Zweipumpensystems, in dem nur ein abfallnegatives Druckreservoir vorliegt, das in koordinierter Weise in Gang gesetzt werden kann mit der Ingangsetzung von jedem positiven Druckquellenreservoir. Dieses negative Druckreservoir kann entweder durch mechanische oder thermodynamische (z. B. eine Kapillarpumpe) Mittel funktionieren. Der "Antrieb" der Kapillarpumpe wird durch Ventile erreicht.
32 zeigt, wie das Pump- und Ventilschema aus 29 unter Verwendung von positiven Druckquellenreservoirs ausgedehnt werden kann, um mit einem überkreuzten Array von n Zeilenkanälen und 2n-Spaltenkanäle (n normale Spaltenkanäle plus n Spülspaltenkanäle) zu arbeiten. Dies erfordert ein 2n × 1-Ausgangsventil-Sammelrohr. Ähnlich kann das Schema aus 30 unter Ver wendung eines negativen Druckabfallreservoirs ausgedehnt werden, um mit einem Array, der Spülkanäle enthält, zu arbeiten.
33 beschreibt eine Ausführungsform einer Mikroflüssigkeitsvorrichtung, wobei jeder Säulenkanal k einen assoziierten parallelen Spülkanal k* hat.
34 stellt eine Ausführungsform der Mikroflüssigkeitsvorrichtung dar, wobei das Flüssigkeitslieferungssystem aus einem überkreuzten, nichtunterbrochenen Array von Eingangs- und Ausgangskanälen mit vertikalen Verbindungskanälen besteht, multiple Level verwendet, wobei die zwei Schichten in einer Ebene oberhalb der Vertiefungsschicht liegen und jeder Säulenkanal k einen assoziierten parallelen Spülkanal k* hat.
35 zeigt im Fall von Flüssigkeitsfluss durch Vertiefung (j, k) ein Beispiel eines Verfahrens, um ein Segment der Flüssigkeit oder des Dampfes von dem Reihenkanal j in den Spülkanal k* zu spülen, wobei k* direkt angrenzend an den Säulenkanal k ist.
36 stellt ein Verfahren der Diffusionskontrolle unter Verwendung von "normal geschlossenen" Kontrollventilen dar, umfassend ein Ventilelement und einen Ventilsitz zwischen jedem Paar von angrenzenden Bohrungen, die die Kanäle mit den Flüssigkeitsorten verbinden.
37 stellt eine Ausführungsform dar, wobei ein extern angelegter Magnetfeldgradient eine Rückstellkraft auf Ventilelemente und den Ventilsitz induziert, die ein magnetisches Material beinhalten.
38 zeigt eine Ausführungsform eines geformten Ventilsitzes, wobei die Diffusion entlang der Kugel gestoppt wird, wenn die extern angelegte Rückstellkraft die Kugel nach links in eine runde Öffnung in dem Ventilsitz drückt.
39 zeigt eine Ausführungsform, die es einem einzelnen Magnetfeldgradienten, der auf die gesamte Mikroflüssigkeitsvorrichtung angewendet wird, ermöglicht, sowohl Kraft auf einen Satz von Kugelventilen der Eingangskanäle als auch auf einen Satz von Kugelventilen der Ausgangskanäle zu induzieren.
40 zeigt eine Ausführungsform der Pump- und Ventilpläne, wie sie erscheinen würden mit all den Pumpen und Ventilen auf (on-board) der Kassette.
41 zeigt eine Ausführungsform, wobei die Pumpen on-board angebracht sind und elektrisch betriebenen Fluss verwenden, wobei die elektrischen Felder auf Regionen extern der Matrix des Arrays von Vertiefungen beschränkt sind und minimale oder keine elektrischen Feldgradienten über eine der Vertiefungen, in denen lebende Zellen vorliegen, angewendet wird.
42(a) Die Standardstruktur von Tresyl-PEG, wobei "n" jede Anzahl sein kann. (b) Die Struktur von Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin.
43(a) Ein Beispiel eines Amin-PG-Oberflächenprodukts. (b) Ein Beispiel eines Oberflächenamins.
44 ist eine am meisten bevorzugte Ausführungsform, um selektive Positionierung von zelladhäsiven Molekülen und zellabstoßenden Gruppen zu erreichen.
45 ist ein experimentelles Flussdiagramm zur selektiven Unterscheidung von Stammzellen auf einem Substrat, um sowohl gewebespezifische als auch organspezifische Zellsubstrate zu erzeugen.
LEITFADEN ZU DEN FIGUREN
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie hier verwendet, ist der Ausdruck "Vertiefung" definiert als der Volumenraum, der durch die Verbindung eines Flüssigkeitsorts der Kammer mit einem Zellbindeort auf dem Substrat erzeugt wird. Der Volumenraum kann erzeugt werden durch eine Vertiefung auf der Kammer, die mit dem Flüssigkeitsort korrespondiert, durch eine Vertiefung auf dem Substrat, die mit dem Zellbindeort korrespondiert, durch eine Abstandhalterstütze, die die Kammer und das Substrat trennt (wobei keine Notwendigkeit für eine Vertiefung in dem Substrat der Kammer besteht), eine Kombination irgendwelcher von diesen, oder jedes andere geeignete Verfahren zur Erzeugung eines Volumenraums zwischen dem Flüssigkeitsort und dem Zellbindeort.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Zellbindeort" auf einen bestimmten Ort auf dem Substrat, der eine Vielzahl von Bindestellen umfasst, die in der Lage sind, Zellen zu binden. Das Substrat kann derivatisiert sein, um Zellbindestellen zu erzeugen oder die Zellbindestellen können natürlich auf dem Substrat vorliegen. Die Vielzahl von Zellbindestellen in einem individuellen Zellbindeort können in der Lage sein, nur einen einzelnen Zelltyp zu binden oder können in der Lage sein, mehr als einen Zelltyp zu binden. Verschiedene Zellbindeorte auf dem gleichen Substrat können identisch sein oder sich hinsichtlich des Typs von Zellen, den sie binden können, unterscheiden.
Der Ausdruck "Flüssigkeitsort" wie hier verwendet bezieht sich auf einen bestimmten Ort auf der Kammer, der die Stelle der Flüssigkeitslieferung zu und/oder Entfernung von dem Zellbindeort ist. Der Flüssigkeitsort kann eine Vertiefung umfassen, wie einen geätzten Bereich, ein erhobenes Reservoir oder jeder andere Typ von Vertiefung. Alternativ kann der Flüssigkeitsort flach sein, so wie die Endstelle eines Eingangs- und/oder Ausgangskanals oder die Endstelle einer Bohrung, die in Flüssigkeitskontakt mit einem Eingangs- und/oder Ausgangskanal ist.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Kassette" die Kombination des Substrats und der Kammer. Die Kombination kann entweder modular (mehr als ein Stück) sein, was eine wiederverwertbare Kammer und ein verfügbares Substrat zur Verfügung stellt, oder nichtmodular (Einzelstück), um jegliches Auslaufpotential zwischen den Vertiefungen zu beschränken.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "an Bord" (on-board) eingebaut in die Kassette.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "integrierte Flüssigkeiten" eine Mikroflüssigkeitsvorrichtung, die sowohl eine Substratoberfläche zur Zellbindung als auch eine Kammer umfasst.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Kammer" ein Flüssigkeitsliefersystem, das Mikroflüssigkeitskanäle und Flüssigkeitsorte umfasst, die als eine spezialisierte Substratbeschichtung dient.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "umschaltbare Pumpe" auf eine Pumpe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eine Spritzenpumpe, ein druckkontrolliertes Gefäß mit einem Ventil oder eine elektrokinetische Pumpe, die extern eingesetzt ist (mit der optionalen Verwendung einer elektrischen Abschirmung) im Hinblick auf die Matrix des Arrays von Vertiefungen, so dass keine schädlichen elektrischen Feldwirkungen von den Zellen wahrgenommen werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Subarray" jeden zusammenhängenden Unterabschnitt von Vertiefungen in dem Gesamtarray von Vertiefungen, typischerweise in einem Format, das mit der Form eines Bildgebungsdetektorarrays, wie einem CCD (ladungsgekoppelten Vorrichtungsdetektor) korrespondiert.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Matrix des Zellarrays" den Raum, der durch die imaginäre Parallelleitung definiert wird (d. h. typischerweise ein kubischer oder rechteckiger Behälter), der in den gesamten Satz von Vertiefungen in dem Array der Kassette passen würde.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Assaybestandteile" auf jeden Bestandteil, der einem Zellscreeningassay zugesetzt werden würde, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Reagenzien, Zellen, Testverbindungen, Medien, Antikörper, Lumineszenz und Reporter.
Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck "Lumineszenz" jeden Typ von Lichtemission ein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Lumineszenz, Fluoreszenz und Chemilumineszenz.
In einem Aspekt lehrt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroarrays von multiplen Zelltypen auf einem herkömmlichen Substrat. Wie hier definiert, bezieht sich ein Mikroarray multipler Zelltypen auf einen Array von Zellen auf einem Substrat, die nicht einer einzelnen einheitlichen Beschichtung auf der Stützungsoberfläche verteilt sind, sondern eher in einer nichteinheitlichen Art, so dass jeder "Zellbindeort" oder Gruppen von Zellbindeorten auf dem Substrat einzigartig in seiner Zellbindeselektivität sein kann.
Das Verfahren zur Herstellung eines Mikroarrays multipler Zelltypen umfasst die Herstellung eines mikrogemusterten chemischen Arrays (hier auch als ein chemisch modifizierter Array von Zellbindeorten bezeichnet), nichteinheitliche chemische Modifizierung des Arrays und Bindung von Zellen an den nichteinheitlichen chemischen Array.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein mikrogemusterter chemischer Array ein Substrat 4, das behandelt wird, um eine hydrophobe Oberfläche zu erzeugen, über die in regulären Intervallen hydrophile Spots oder "Zellbindeorte" verteilt sind. B. (1A–1B). Das Substrat kann eine Glas, Plastik oder Siliconscheibe sein, wie ein herkömmliches Lichtmikroskop-Deckgläschen, jedoch kann es auch aus jedem anderen geeigneten Material hergestellt sein, das geeignet ist, um ein Substrat zur Verfügung zu stellen. Wie vorstehend beschrieben, wird der Ausdruck "Zellbindeorte" verwendet, um einen spezifischen Ort (Spot) auf dem Substrat zu beschreiben und erfordert nicht eine bestimmte Tiefe. Die Oberfläche auf dem Substrat 4 ist vorzugsweise etwa 2 cm bis 3 cm, kann jedoch größer oder kleiner sein. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Zellbindeorte 8 auf dem mikrogemusterten chemischen Array reaktive funktionelle Gruppen, wie, jedoch nicht beschränkt auf, Aminohydroxyl-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen, die nichtspezifisch an Zellen binden können oder die weiter chemisch modifiziert sein können, um Moleküle zu binden, die zellenspezifisch binden.
Chemisch modifizierte Zellbindungsorte werden hergestellt durch spezifische chemische Modifikationen von den Zellbindeorten auf dem Substrat. Die Zellbindeorte können eine Vielzahl von verschiedenen Zellbindemolekülen umfassen, die die Anheftung und das Wachstum von verschiedenen Zelltypen in den Bindeorten ermöglichen oder sie können die Anheftung von nur einem einzelnen Zelltyp ermöglichen. Die hydrophoben Domänen, die die Zellbindeorte auf dem Substrat umgeben, unterstützen die Anheftung und das Wachstum von den Zellen nicht.
In einer Ausführungsform wird ein Mikroarray multipler Zelltypen hergestellt durch Beschichten einer Glasscheibe durch Chemisorbanz mit einer Schicht einer Substanz, die reaktive funktionelle Gruppen hat, wie Aminogruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Aminosilan, wie 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) oder N-(2-Aminoethyl-3-aminopropyl)trimethoxysilan (EDA) verwendet oder andere reaktive Substanzen können verwendet werden. Nach diesem ersten Schritt ist die gesamte Oberfläche der beschichteten Glasscheibe hydrophil aufgrund der Anwesenheit der reaktiven funktionellen Gruppen.
Zweitens wird eine Mikromusterungsreaktion durchgeführt, in der Tropfen, die eine Substanz enthalten, die fotospaltbare oder chemisch entfernbare Aminoschutzgruppen enthält, in einem Mikromuster auf bestimmte Orte auf der Aminosilan-beschichteten Glasscheibe gebracht werden. In einer Ausführungsform umfasst das Muster einen rechteckigen oder quadratischen Array, allerdings kann jedes geeignete getrennte Muster verwendet werden (wie, jedoch nicht beschränkt auf dreieckig oder kreisförmig). In einer Ausführungsform reichen die Tropfen im Volumen von 1 Nanoliter (nl) bis 1000 nl. In einer bevorzugten Ausführungsform reichen die Tropfen von 250–500 nl im Volumen. Geeignete fotochemisch entfernbare Aminoschutzsubstanzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf 4-Brommethyl-3-nitrobenzol, 1-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)-ethyl (DMNPE) und Butyloxycarbonyl. In einer Ausführungsform wird die Musterungsreaktion für 1 bis 100 Minuten, bei Temperaturen, die von Raumtemperatur bis 37°C reichen, ausgeführt, unter Verwendung von Reagenskonzentrationen zwischen 1 Mikromolar (μM) und 1000 μM. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktion bei 37°C für 60 Minuten durchgeführt unter Verwendung einer Reagenskonzentration von 500 μM.
Die Tropfen können auf die Aminosilan-beschichtete Glasscheibe durch herkömmliche Inkjet (Tintenstrahl)-Technologie gebracht werden (U.S.-PS Nr. 5,233,369; U.S.-PS Nr. 5,486,855). Alternativ wird ein Array von Nadeln, hier definiert als spitzzulaufende Stäbchen, die zwischen 1 nl und 1000 nl Flüssigkeit transferieren können, in ein Bad der Aminoschutzsubstanz getaucht, um Tropfen der schützenden Substanz an ihren Enden zu erzeugen. Die Nadeln werden dann mit der Glasscheibe in Kontakt gebracht, um die Tropfen auf diese zu transferieren. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Array von Kapillarröhrchen, die aus Glas oder Plastik hergestellt sind, wie beschrieben in U.S.-PS Nr. 5,567,294 und 5,527,673, der die Aminoschutzsubstanz enthält, in Kontakt gebracht mit der Glasscheibe, um die Tropfen auf die Oberfläche zu transferieren. Somit ist die Glasplatte mikrogemustert mit einem Array von Orten (Spots) oder Zellbindeorten, die geschützte Aminogruppen auf einer hydrophoben Oberfläche enthalten (2A–B).
Drittens wird eine hydrophobe Substanz, die mit ungeschützten Aminogruppen reaktiv ist, über die Glasplatte gespült. Die hydrophobe Substanz kann eine Fettsäure oder ein Alkyliodid sein oder jede andere geeignete Struktur. Bestimmte Bedingungen für solch eine Derivatisierung von Glas können gefunden werden in Prime und Whitesides, Science 252: 1164-1167, 1991, Lopez et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 5877–5878, 1993 und Mrksich und Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25: 55–78, 1996. Die Fettsäure oder das Alkyliodid reagiert mit den ungeschützten Aminogruppen und heftet sich kovalent an sie und die Aminogruppen sind nun hydrophob aufgrund der Fettsäure oder Alkyliodidgruppe. Der resultierte modifizierte Array von Zellbindeorten 9 umfasst eine Glasscheibe 4 mit einem Array von Zellbindeorten 8, die geschützte Aminogruppen auf einem hydrophoben Hintergrund enthält ( 2C).
Viertens wird ein nichtgleichmäßiger Array von Zellbindeorten hergestellt durch gleichmäßige Deprotektion der Aminogruppen in einem mikrogemusterten chemischen Array, der gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. In einer Ausführungsform kann chemische Spezifität hinzugefügt werden durch chemisches Quervernetzen (Crosslinking) spezifischer Moleküle an die Zellbindeorte. Es gibt eine Anzahl von gutbekannten homo- oder heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien, wie Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat), die mit den freien Aminogruppen in den Zellbindeorten reagieren werden und mit einem spezifischen Molekül quervernetzt werden. Reagenzien und Bedingungen für Quervernetzungs-freie Aminogruppen mit anderen Biomolekülen sind in dem Fachgebiet gutbekannt, wie beispielhaft erläutert durch die folgenden Referenzen: Grabarek und Gergely, Analyt. Biochem. 185: 131–135, 1990; McKenzie et al., J. Prot. Chem. 7: 581-592, 1988; Brinkley, Bioconjugate Chem. 3: 12–13; 1992; Fritsch et al., Bioconjugate Chem. 7: 180–186, 1996; und Aplin und Hughes, 1981.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein nichteinheitlicher Array von Zellbindeorten in kombinatorischer Weise produziert. Die resultierenden Zellbindeorte sind nichteinheitlich (d. h. jeder Zellbindeort oder Gruppe von Zellbindeorten kann einzigartig in seiner Zellbindeselektivität sein). Der Ausdruck kombinatorisch bedeutet, dass die Zellbindeorte variabel behandelt werden.
In einer Ausführungsform werden die geschützten Aminogruppen des modifizierten Arrays von Zellbindeorten aus Schritt 3 deprotektiert und dann werden spezifische Moleküle mit chemischen Quervernetzungs-Reagenzien in einem gewünschten Muster hinterlegt. Die spezifischen Quervernetzungs-Mittel können an die Aminogruppen binden und weiterhin eine Zellbindegruppe besitzen. In diesem Schritt kann der Typus der Zellbindegruppe von einem Zellbindeort zu einem anderen variiert werden oder von einer Gruppe von Zellbindeorten zu einer anderen, um ein nichteinheitliches Design des Arrays zu erzeugen.
In einer anderen Ausführungsform sind die Aminogruppen der chemisch modifizierten Zellbindeorte aus Schritt 3 einheitlich deprotektiert. Ein fotoaktivierbarer Crosslinker reagiert mit den deprotektierten Aminogruppen. Eine optische Maske eines gewünschten Musters wird über die Oberfläche der Zellbindeorte gebracht und die exponierten Zellbindeorte werden mit einer Lichtquelle beleuchtet. Die Position und die Anzahl der Zellbindeorte, die Licht erhalten, wird durch die Mikromusterung der optischen Maske kontrolliert. Geeignete fotoaktivierbare Crosslinker schließen Arylnitrene, fluorinierte Arylazide, Benzophenone und Diazopyruvate ein. Reagenzien und Bedingungen zur optischen Maskierung und zum Grosslinken werden in Prime und Whitesides, 1991; Sighvi et al., 1994, Sigal et al., 1996 und Mrksich und White sides, 1996, diskutiert. Der fotoaktivierbare Quervernetzer ist bifunktional, indem er chemisch an die Aminogruppe auf den Zellbindeorten bindet und wenn er Licht ausgesetzt wird, kovalent an Zellbindemoleküle, wie Antikörper, bindet. Reagenzien und Bedingungen zum fotoaktivierten Grosslinken werden diskutiert in Thevenin et al., Eur. J. Biochem. 206: 471–477, 1992 und Goldmacher et al., Bioconjugate Chem. 3: 104–107, 1992.
Wenn ein fotoaktivierbarer Quervernetzer verwendet wird, wird die Glasplatte mit Zellbindemolekülen, die an die Zellbindeorte gebunden werden sollen, überschwemmt. In einer Ausführungsform werden Zellbindemoleküle, wie Zelloberflächenantigen-reaktive Antikörper, extrazelluläre Matrixproteine (z. B. Fibronectin oder Collagen) oder geladene Polymere (z. B. poly-L-Lysin oder poly-L-Arginin) verwendet in Konzentrationen, die von etwa 0,1 bis etwa 1 mM reichen. Während die Zellbindemoleküle die Zellbindeorte überdecken, wird die Glasplatte von der Unterseite der Glasplatte bestrahlt, in einem Winkel unterhalb des kritischen Winkels für das Material der Glasplatte, was in einer internen Gesamtreflexion des Lichts resultiert (zur Diskussion von interner Gesamtreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, vergleiche Thompson et al., 1993). In einer Ausführungsform wird die Bestrahlung bei zwischen Raumtemperatur und 37°C für 0,1 bis 10 Sekunden mit Licht der Wellenlänge zwischen 300 Nanometern (nm) bis 1000 nm durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bestrahlung durchgeführt bei Raumtemperatur für 1 Sekunde unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge zwischen etwa 300 und 400 nm. Das optische Quervernetzen beschränkt das fotoaktivierbare Quervernetzen auf eine kurze Distanz in der Lösung oberhalb der Zellbindeorte und wird beschrieben in Bailey et al., Nature 366: 44–48, 1993; Farkas et al., Ann. Rev. Physiol. 55: 785–817, 1993; Taylor et al., Soc. Opt. Instr. Eng. 2678: 15–27; 1996; Thompson et al., in Mason, W.T. (Hrsg.), "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity", San Diego: Academic Press, S. 405–419, 1993).
Der fotoaktivierbare Quervernetzer bindet mit den Zellbindemolekülen, wie Antikörpern und Matrixproteinen, nur in den Zellbindeorten, in denen der Quervernetzer bestrahlt wurde. Beispielsweise kann eine einzelne Reihe eines Arrays der Zellbindeorte bestrahlt werden, um eine einzelne Reihe von Zellbindeorten mit Zellbindemolekülen, gebunden an den Quervernetzer, zu erzeugen. Nach einer Waschung des Arrays, um alle ungebundenen Zellbindemoleküle zu entfernen, kann eine zweite Reihe von Zellbindeorten an ein zweites Zellbindemolekül durch nachfolgende Überschwemmung der Glasscheibe mit einem zweiten Zellbindemolekül gebunden werden, während die zweite Reihe bestrahlt wird und die anderen Reihen optisch maskiert werden. Ungebundene Zellbindemoleküle werden durch Waschen des Arrays mit PBS oder jedem anderen geeigneten Puffer entfernt. Auf diese Weise können mehrere Reihen von Zellbindeorten oder Gruppen von Zellbindeorten nacheinander bestrahlt werden durch aufeinanderfolgende Maskierung in Anwesenheit eines bestimmten Zellbindemoleküls. Alternativ kann jeder Zellbindeort einzeln bestrahlt werden unter Verwendung von genau festgelegtem Aussetzen und optischer Maskierung. Auf diese Weise werden unterschiedliche Zellbindemoleküle an Reihen des Arrays oder an individuelle Zellbindeorte gebunden, was einen nichteinheitlichen Array von Zellen, die an Zellbindeorte jedes gewünschten Musters gebunden sind, erzeugt.
In einer weiteren Ausführungsform zur Herstellung chemisch modifizierter Arrays von Zellbindeorten wird zunächst ein chemisch modifizierter Array erzeugt, wobei die Aminogruppen der Zellbindeorte einheitlich mit fotospaltbaren Schutzgruppen geschützt werden. Zeilen, Spalten und/oder individuelle Zellbindeorte werden nachfolgend fotodeprotektiert, um die freien Aminogruppen zu exponieren durch Verwendung einer optischen Maske mit verschiedenen Mustern, um alle bis auf die Zellbindeorte, die deprotektiert werden sollen, zu überdecken. Die exponierten Zellbindeorte (d. h. diese, die nicht von der Maske bedeckt wurden) werden bestrahlt, was in der Entfernung der Schutzgruppen resultiert. Der Array wird mit einem bifunktionalen Quervernetzer überschwemmt, der chemisch an die deprotektierte Aminogruppe bindet und die Zellbindeorte aktiviert. Bedingungen für die Fotodeprotektion von Aminogruppen werden diskutiert in Padwa, A. (Hrsg.) "Organic Photochemistry", New York 9: 225–323, 1997, Ten et al., Makromol. Chem. 190: 69–82, 1989, Pillai, Synthesis 1980: 1–26, 1980, Self und Thompson, Nature Medicine 2: 817–820, 1996 und Senter et al., Photochem. Photobiol. 42: 231–237, 1985. Anschließend werden die Zellbindemoleküle auf den modifizierten chemischen Array gespült, worin sie mit der anderen Hälfte des Quervernetzers reagieren. Der Array wird dann gewaschen, um alle nichtgebundenen bifunktionalen Quervernetzer und Zellbindemoleküle zu entfernen. Ein anderer Zellbindeort oder ein Satz von Zellbindeorten kann deprotektiert werden unter Verwendung einer anderen optischen Maske und der Array kann dann mit einer zweiten Behandlung von einem bifunktionalen Quervernetzer überspült werden, gefolgt von einem bestimmten Zellbindemolekül, das an diesen zweiten Zellbindeort oder Satz von Zellbindeorten von deprotektierten Aminogruppen bindet. Der Array wird gewaschen, um die zweite Behandlung eines bifunktionalen Quervernetzers und Zellbindemolekülen zu entfernen. Ein nichteinheitlicher Array von Zellbindemolekülen kann somit erzeugt werden durch eine wiederholte Sequenz von Fotodeprotektion, chemischem Crosslinking von spezifischen Molekülen und Waschen unter einer Vielzahl von Masken. Alternativ können die Quervernetzungsreagenzien zu den deprotektierten Zellbindeorten zusammen mit den Zellbindemolekülen in einem Schritt geliefert werden. Konzentrationsgradienten von angehefteten Zellbindemolekülen können erzeugt werden durch Kontrollieren der Anzahl von deprotektierten Aminogruppen, die exponiert werden unter Verwendung einer optischen Maske oder durch Kontrollieren der Dosis der Bestrahlung der fotoaktivierbaren Crosslinker.
Der chemisch modifizierte Array von Zellbindeorten wird dann verwendet, um einen nichteinheitlichen Array von Zellen auf den Zellbindeorten zu erzeugen. In einer Ausführungsform wird der chemische Array "ausgesät" mit Zellen durch Einführen von gelösten Zellen in den Array, was die Bindung der Zellen an die Zellbindeorte ermöglicht und dann Spülen der Scheibe, um ungebundene und schwach gebundene Zellen zu entfernen. Die Zellen werden nur in den Zellbindeorten gebunden, da die spezifische chemische Umgebung in den Zellbindeorten in Verbindung mit der hydrophoben Umgebung, die jeden der Zellbindeorte umgibt, die selektive Bindung von Zellen nur an die Zellbindeorte ermöglicht. Weiterhin ermöglicht die Modifikation von Zellbindeorten mit spezifischen Zellbindemolekülen die selektive Bindung von Zellen an spezifische Zellbindeorte, was einen nichteinheitlichen Array von Zellen auf den Zellbindeorten erzeugt. Weiterhin können die Zelloberflächenmoleküle, die spezifisch an die Zellbindeorte binden, entweder natürlich anwesend oder genetisch konstruiert sein durch exprimieren von "zellbindeortspezifischen" Molekülen, die an zelluläre Transmembranmoleküle fusioniert wurden, so dass die Zellen mit modifizierten Zellbindeorten interagieren oder an diese spezifisch binden. Die Erzeugung eines Arrays von Zellbindeorten mit verschiedenen Zellerkennungsmolekülen ermöglicht es einem Zellbindeort, einer Gruppe von Zellbindeorten oder dem gesamten Array, spezifisch Zellen aus einer gemischten Population von Zellen zu "erkennen", wachsen zu lassen und zu screenen.
In einer Ausführungsform werden Zellen, die in Kulturmedium bei Konzentrationen im Bereich von etwa 10³ bis 10⁷ Zellen pro ml suspendiert sind, in Kontakt mit den Zellbindeorten für 1 bis 120 Minuten bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 37°C inkubiert. Ungebundene Zellen werden dann von den Zellbindeorten unter Verwendung von Kulturmedium oder einer Lösung hoher Dichte weggespült, um die ungebundenen Zellen von den gebundenen Zellen abzuheben (Channavajjala et al., J. Cell Sci. 110: 249–256, 1997). In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen, die in Kulturmedium bei Konzentrationen im Bereich von etwa 10⁵ bis etwa 10⁶ Zellen pro ml suspendiert sind, in Kontakt mit den Zellbindeorten bei 37°C für einen Zeitraum im Bereich von etwa 10 Minuten bis etwa 2 Stunden inkubiert.
Die Dichte der Zellen, die an die Zellbindeorte angeheftet sind, wird kontrolliert durch die Zelldichte in der Zellsuspension, die Zeit, in der Zellanheftung an die chemisch modifizierten Zellbindeorte ermöglicht wird und/oder die Dichte von Zellbindemolekülen in den Zellbindeorten. In einer Ausführungsform des Zellanheftungsverfahrens werden 10³ bis 10⁷ Zellen pro ml inkubiert bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 37°C für 1 Minute bis 120 Minuten mit Zellbindeorten, die zwischen 0,1 und 100 nMol pro cm² Zellbindemoleküle enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 10⁵ und 10⁶ Zellen pro ml für 10 Minuten bis 2 Stunden bei etwa 37°C inkubiert mit Zellbindeorten, die etwa 10 bis 100 nMol pro cm² Zellbindemoleküle enthalten.
In einer Ausführungsform können die Zellen chemisch an die Zellbindeorte fixiert sein, wie beschrieben durch Bell et al., J. Histochem. Cytochem 35: 1375–1380, 1987; Poot et al., Histochem. Cytochem 44: 1363–1372, 1996; Johnson, J. Elect. Micros. Tech. 2: 129–138, 1985 und dann für ein Screening zu einem späteren Zeitpunkt mit lumineszenzmarkierten Molekülen, wie Antikörpern, Nukleinsäurehybridisierungssonden oder anderen Liganden verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zellen modifiziert werden mit Luminszenzindikatoren von zellchemischen oder molekularen Eigenschaften, gesät werden auf einen nichteinheitlichen chemisch modifizierten Array von Zellbindeorten und analysiert werden im lebenden Status. Beispiele solcher Indikatoren werden zur Verfügung gestellt in Giuilano et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 405–434, 1995; Harootunian et al., Mol. Biol. Cell 4: 993–1002, 1993; Post et al., Mol. Biol. Cell 6: 1755–1768, 1995; Gonzalez und Tsien, Biophys. J. 69: 1272–1280, 1995; Swaminathan et al., Biophys. J. 72: 1900–1907, 1997 und Chalfie et al., Science 263: 802–805, 1994. Die Indikatoren können in die Zellen eingeführt werden vor oder nachdem sie auf den Array gesät werden durch jede oder eine Kombination von verschiedenen physikalischen Verfahren, wie, jedoch nicht beschränkt auf Diffusion über die Zellmembran (rezensiert in Haugland, Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 6. Ausg., Molecular Probes, Inc., Eugene, 1996), mechanische Zerstörung der Zellmembran (McNeil et al., J. Cell Biology 98: 1556–1564, 1984; Clarke und McNeil, J. Cell Science 102: 533–541, 1992; Clarke et al., BioTechniques 17: 1118–1125, 1994) oder genetische Konstruktion, so dass sie in Zellen unter vorbeschriebenen Bedingungen exprimiert werden (Chalfie et al., 1994). In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Zellen Lumineszenzreportergene, obwohl andere Zelltypen von Reportergenen, einschließlich denen, die Chemilumineszenzproteine kodieren, auch geeignet sind. Lebendzellstudien erlauben die Analyse des physiologischen Status von Zellen, wie berichtet, durch Lumineszenz während ihrem Lebenszyklus oder wenn sie mit einem Arzneimittel oder einer anders reaktiven Substanz in Kontakt gebracht werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein nichteinheitlicher Zellarray auf den Zellbindeorten zur Verfügung gestellt, wobei die Zellen nichteinheitlich an einen chemisch modifizierten Array von Zellbindeorten auf einem Substrat gebunden werden. Der Zellarray ist nichteinheitlich, da der zugrundeliegende nichteinheitlich chemisch modifizierte Array von Zellbindeorten eine Vielzahl von Zellbindestellen verschiedener Spezifität zur Verfügung stellt. Jeder Zelltyp kann in dem Array verwendet werden unter der Voraussetzung, dass ein Molekül in der Lage ist, spezifisch diesen Zelltyp, der in dem chemisch modifizierten Array von Zellbindeorten vorliegt, zu binden. Bevorzugte Zelltypen für den nichteinheitlichen Zellarray auf den Zellbindeorten schließen Lymphozyten, Krebszellen, Neuronen, Pilze, Bakterien und andere prokaryotische und eukaryotische Organismen ein. Beispielsweise zeigt 3A einen nicht einheitlichen Zellarray auf den Zellbindeorten die Fibroblastenzellen enthalten, die auf einer substratgemusterten Oberfläche gewachsen sind und mit zwei Fluoreszenzsonden markiert sind (Rhodamin, um Actin zu färben und Hoechst, um Kerne zu färben), wogegen 3B einen nicht einheitlichen Zellarray auf den Zellbindeorten, die Fibroblastenzellwachstum (L929- und 3T3-Zellen) in gepunkteten Mustern enthalten, markiert mit zwei Fluoreszenzsonden und sichtbar gemacht bei verschiedenen Vergrößerungen, zeigt.
Beispiele für Zellbindemoleküle, die in dem nicht einheitlichen Zellarray auf den Zellbindeorten verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Antikörper, Lektine und extrazelluläre Matrixproteine. Alternativ können genetisch veränderte Zellen, die spezifisch Zelloberflächenmarker exprimieren, selektiv direkt an die modifizierten Zellbindeorte binden. Der nicht einheitliche Zellarray auf den Zellbindeorten kann entweder fixierte oder lebende Zellen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der nicht einheitliche Zellarray auf den Zellbindeorten lebende Zellen wie, jedoch nicht beschränkt auf, Zellen, die mit Lumineszenzindikatoren der chemischen oder molekularen Zelleigenschaften „markiert" sind.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Analyse von Zellen zur Verfügung gestellt, umfassend Herstellung eines nicht einheitlichen Zellarrays auf den Zellbindeorten, wobei die Zellen wenigstens ein Lumineszenzreportermolekül enthalten, In-Kontakt-Bringen des nich einheitlichen Zellarrays auf den Zellbindeorten mit einem Flüssigkeitsliefersystem, um Reagenslieferung zu den Zellen zu ermöglichen, Durchführen eines Screens mit hohen Durchsatz durch Aufnahme eines Lumineszenzbilds des gesamten nicht einheitlichen Zellarrays bei geringer Vergrößerung, um Lumineszenzsignale von allen Zellbindeorten sofort aufzunehmen, um diejenigen zu identifizieren, die eine Antwort zeigen. Dies wird gefolgt von einem Nachweis mit hohem Gehalt in den antwortenden Zellbindeorten unter Verwendung eines Satzes von Lumineszenzreagenzien mit verschiedenen physiologischen und spektralen Eigenschaften, Scannen der ausgewählten Zellbindeorte, um Lumineszenzsignale von den Lumineszenzreportermolekülen in den Zellen zu erhalten, Konvertieren der Lumines zenzsignale in digitale Daten und Verwendung der digitalen Daten, um die Verteilung, die Umgebung oder Aktivität der Lumineszenzreportermoleküle in den Zellen zu bestimmen.
Bevorzugte Ausführungsformen des nichteinheitlichen Zellarrays auf den Zellbindeorten sind vorstehend offenbart. In einer bevorzugten Ausführungsform des Flüssigkeitsliefersystems ist eine Kammer mit dem Substrat enthaltenden nichteinheitlichen Zellarray verbunden. Die Kammer besteht vorzugsweise aus Glas, Plastik oder Silicon, aber jedes andere Material, das eine Kammer zur Verfügung stellen kann, ist geeignet. Eine Ausführungsform der Kammer 12, gezeigt in 4, besitzt einen Array von geätzten Bereichen 13, die zu den Zellbindeorten 8 auf dem Substrat 4 passen. Zusätzlich sind Eingangskanäle 14 geätzt, um Flüssigkeit zu den geätzten Domänen 13 zur Verfügung zu stellen. Eine Reihe von "Ausgangskanälen" 16 zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit von den geätzten Domänen 13 kann auch mit den Zellbindeorten verbunden sein. Die Kammer 12 und das Substrat 10 zusammen bilden eine Kassette 18. Während diese Ausführungsform geätzte Domänen verwendet, kann jeder andere Typ von Vertiefung 13, gebildet an dem Flüssigkeitsort 1 auch verwendet werden in dieser Ausführungsform. Alternativ kann der Flüssigkeitsort flach sein und die Zellbindeorte 8 können Vertiefungen umfassen, die zu den Flüssigkeitsorten 1 passen. In einer weiteren Alternative kann sowohl die Zellbindestelle 8 als auch der Flüssigkeitsort 1 flach sein und ein Volumenraum für die Vertiefung wird erzeugt durch die Verwendung einer Abstandhalterstütze 20 zwischen dem Substrat 4 und der Kammer 12.
Die Kammer 12 wird somit zur Lieferung von Flüssigkeit zu den Zellen, die auf den Zellbindeorten 10 angeordnet sind, verwendet. Die Flüssigkeit kann einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf eine Lösung eines bestimmten Arzneimittels, Proteins, Liganden oder einer anderen Substanz, die mit auf der Oberfläche exprimierten Gruppen von Zellen Bindung eingehen oder die von den Zellen aufgenommen werden. Die Flüssigkeit, die mit den Zellen, die auf den Zellbindeorten 10 angeordnet sind, interagieren sollen, können auch Liposomen, die ein Arzneimittel verkapseln, einschließen. In einer Ausführungsform wird solch ein Liposom aus einem fotochromatischen Material gebildet, das das Arzneimittel nach Aussetzen gegenüber Licht entlässt, wie ein fotoresponsives synthetisches Polymer (rezensiert in Willner und Rubin, Chem. Int. Ed. Engl. 35: 367–385, 1996). Das Arzneimittel kann aus den Liposomen in allen Kanälen 14 gleichzeitig entlassen werden oder individuelle Kanäle oder getrennte Zeilen von Kanälen können bestrahlt werden, um das Arzneimittel nachfolgend zu entlassen. Solch eine kontrollierte Entlassung des Arzneimittels kann verwendet werden in kinetischen Studien und Lebendzellstudien. Die Kontrolle der Flüssigkeitslieferung kann erreicht werden durch eine Kombination von Mikroventilen und Mikropumpen, die auf dem Ge biet der Kapillartechnologie gutbekannt sind (U.S.-PS Nr. 5,567,294; U.S.-PS Nr. 5,527,673; U.S.-PS Nr. 5,585,069).
Eine weitere Ausführungsform der Kammer 12, gezeigt in 5, besitzt einen Array von Eingangskanälen 14, die zu den geätzten Domänen 13 der Kammer passen, die leicht größer im Durchmesser sind als die Zellbindeorte 8 auf dem Substrat 4, so dass die Zellbindestellen in die geätzten Domänen 13 der Kammer 12 versinken. Abstandhalterstützen 20 werden zwischen die Kammer 12 und die Zellen, die auf den Zellbindeorten 12 entlang den Kontaktstellen angeordnet sind, gebracht. Das Substrat 4 und die Kammer 12 können zusammen verschlossen werden unter Verwendung eines Elastomers oder anderer klebriger Beschichtungen auf den erhöhten Regionen der Kammer. Jede geätzte Domäne 13 der Kammer 12 kann einzeln oder einheitlich mit einem Medium gefüllt werden, das das Wachstum und/oder die Gesundheit von den Zellen, die auf den Zellbindeorten 10 angeordnet sind, unterstützt. In einer weiteren Ausführungsform (6) enthält die Kammer keine Eingangskanäle zur Behandlung aller Zellen, die auf den Zellbindeorten 10 angeordnet sind mit der gleichen Lösung.
Die Lieferung von Arzneimitteln oder anderen Substanzen wird erreicht durch die Verwendung von verschiedenen Modifikationen der Kammer wie folgt. Eine Lösung eines Arzneimittels, das getestet werden soll auf Interaktion mit Zellen des Arrays, kann von einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einen Array von Mikrokapillarröhrchen 24 geladen werden (7). Der Array der Mikrokapillarröhrchen 24 stimmt eins zu eins mit den Eingangskanälen 14 der Kammer 12 überein, was es der Lösung ermöglicht, aus den Mikrokapillarröhrchen 24 in die Kanäle 14 zu fließen oder gepumpt zu werden. Die Kassette 18 ist invertiert, so dass die Zellbindeorte 8 in den geätzten Domänen 13, die mit der Flüssigkeit gefüllt sind, überspült werden (7B). Sobald die Interaktion zwischen der Flüssigkeit und den Zellen auftritt, können Lumineszenzsignale, die von den Zellen, die auf den Zellbindeorten 10 angeordnet sind, direkt gemessen werden oder alternativ kann das Substrat 4 von der Kammer abgehoben werden für Nachbehandlung, Fixierung und Markierung. Die Platzierung und das Entfernen des Arrays von Zellen kann über Roboter und/oder hydraulische Mechanismen erreicht werden (Schroeder und Neagle, 1996).
In einer Ausführung der Kammer 12, gezeigt in 7, sind die Kanäle und die passend geätzten Domänen 13 chemisch in die Kammer geätzt (Prime und Whitesides, 1991; Lopez et al., 1993; Mrksich und Whitesides, 1996). Die geätzten Domänen 13 sind im Durchmesser größer als die Zellbindeorte 8. Dies erlaubt es der Kammer 12, mit dem Substrat 4 kontaktverschlossen zu werden, was für Zellen und ein geringes Volumen von Flüssigkeit Raum lässt. Eingangskanäle 14 werden in jede Reihe von geätzten Domänen 13 der Kammer 12 geätzt. Jeder Eingangskanal 14 dehnt sich von zwei gegenüberliegenden Seiten der Kammer 12 aus und ist an jeder Seite offen. Die geätzten Domänen 13 einer Einzelreihe sind in Flüssigkeitsverbindung mit den Eingangskanälen 14 durch Platzierung eines Mikrokapillarröhrchens 24, das eine Lösung enthält, in Kontakt mit der Seite der Kammer 12. Jede Zeile von verbundenen Eingangskanälen 14 kann gleichzeitig oder nacheinander gefüllt werden. Während des Füllens der Inputkanäle 14 durch Ventile und Pumpen oder Kapillaraktivität füllt sich jeder der Kanäle der Kammer 12 und das Arzneimittel passiert, um jede geätzte Domäne 13 in der Reihe der geätzten Domänen 13, die mit dem Eingangskanal 14 verbunden sind, zu füllen.
In einer weiteren Ausführungsform der Kammer 12 können erhöhte Reservoirs 28 und Eingangskanäle 14 auf die Oberfläche der Kammer 12 gebracht werden, wie gezeigt in 8B. In einer bevorzugten Ausführungsform können die erhöhten Reservoirs 28 und Eingangskanäle 14 aus Polytetrafluorethylen oder elastomeren Material hergestellt sein, allerdings können sie aus jedem anderen klebrigen Material hergestellt sein, das die Anheftung an das Substrat 4 ermöglicht, wie Poly(dimethylsiloxan), hergestellt von Dow Corning unter dem Handelsnamen SYLGARD 184^TM. Die Wirkung ist die gleiche wie mit einer Kammer, die geätzte Kanäle und Kanäle hat und die Verwendungen sind ähnlich.
In einer weiteren Ausführungsform der Kammer, die in 8A gezeigt ist, dehnt sich ein erster Kanal 30 von einer Seite der Kammer 12 zu einer ersten geätzten Domäne 13 aus oder zu einem erhöhten Reservoir 28 und Kanälen. Ein zweiter Kanal 32 dehnt sich von der gegenüberliegenden Seite zu einer zweiten geätzten Domäne, die an die erste geätzte Domäne angrenzt, aus. Die ersten 30 und zweiten 32 Kanäle sind nicht in Flüssigkeitskontakt miteinander, sind jedoch dennoch in der gleichen Zeile von Eingangskanälen 14 oder erhöhten Reservoirs 28.
In einer weiteren Ausführungsform, wie gezeigt in 9 und 10, kann die Kammer 12 einen Eingangskanal 14 haben, der sich von jeder geätzten Domäne 13 oder jedem erhöhten Reservoir 28 zu der Seite der Kammer ausdehnt. Die Kanäle 14 können alle von einer Seite der Kammer 12 (9) stammen oder von beiden Seiten (10). Die Eingangskanäle 14 können auch auf beiden Seiten der geätzten Domänen 13 getrennt sein, um den Raum, der durch die Eingangskanäle 14 besetzt wird, zu minimieren. Getrennte Flüssigkeitskanäle ermöglichen die Durchführung von kinetischen Studien, in denen eine Reihe zu einem Zeitpunkt oder eine Vertiefung zu einem Zeitpunkt mit dem Arzneimittel geladen wird.
In einer weiteren Ausführungsform, dargestellt in 11, ist jede geätzte Domäne 13 in Flüssigkeitskontakt mit einem korrespondierenden Eingangskanal 14, der einen Stopfen 36 zwischen dem Ende des Kanals 14 und der geätzten Domäne 13 hat, der verhindert, dass die injizierte Lösung vor der gewünschten Zeit in die geätzte Domäne 13 fließt. Lösungen können in die Eingangskanäle 14 vorgeladen werden, um zu einem späteren Zeitpunkt verwendet zu werden. Ein Stopfen 36 kann ähnlich zwischen einer terminalgeätzten Domäne 13 in einem Satz von verbundenen geätzten Domänen 13 in Flüssigkeitskontakt mit einem Eingangskanal 14 angeordnet werden. Nach Freigabe des Stopfens 36 fließt die Substanz durch und füllt alle geätzten Domänen 13, die in Flüssigkeitskontakt mit dem Eingangskanal 14 sind.
In einer Ausführungsform sind die Stopfen 36 aus einem hydrophoben Polymer gebildet wie, jedoch nicht beschränkt auf Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide, die mit fotospaltbaren Quervernetzern vernetzt wurden, und das nach Bestrahlung hydrophil wird und mit dem Arzneimittel in die Vertiefung abläuft. Alternativ kann der Stopfen 36 aus einem quervernetzten Polymer gebildet werden, wie Proteinen, Kohlenhydraten oder Lipiden, die mit fotospaltbaren Quervernetzern vernetzt wurden, so dass er sich, wenn bestrahlt wird, zersetzt und in die geätzte Domäne 13 mit der Lösung abfließt.
Die Kassette 18, die das Substrat 4 und die Kammer 12 umfasst, wird in ein Lumineszenzleseinstrument gebracht. Das Lumineszenzleseinstrument ist eine optisch-mechanische Vorrichtung, die die Kassette handhabt, die Umgebung kontrolliert, die Lieferung von Lösungen zu Vertiefungen kontrolliert und die emittierte Lumineszenz von dem Array der Zellen analysiert, entweder eine Vertiefung zu einem Zeitpunkt oder den ganzen Array gleichzeitig. In einer bevorzugten Ausführungsform (12) umfasst das Lumineszenzleseinstrument 44 eine integrierte Kreisinspektionsstation unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops als Lesevorrichtung und Mikroroboter, um die Kassette zu handhaben. Die Lesevorrichtung kann jedes optische System umfassen, das dazu konstruiert ist, eine Lumineszenzprobe auf einem Detektor abzubilden. Ein Speicherkompartiment 48 hält die Kassetten 18, von wo sie von einem Roboterarm 50, der durch den Computer 56 kontrolliert wird, abgeholt werden. Der Roboterarm 50 inseriert die Kassette 18 in das Lumineszenzleseinstrument 44. Die Kassette 18 wird aus dem Lumineszenzlesegerät 44 durch einen anderen Roboterarm 52 entfernt, der die Kassette 18 in ein zweites Speicherkompartiment 54 bringt.
Das Lumineszenzleseinstrument 44 ist eine optisch-mechanische Vorrichtung, die konstruiert wurde als eine Modifikation von lichtoptisch basierten integrierten Kreisinspektionsstationen, die zum "Screenen" integrierter Kreis "Chips" auf Defekte verwendet werden. Systeme, die Umgebungskontrolle, Mikroroboter und optische Lesevorrichtungen integrieren, werden hergestellt von Firmen wie Carl Zeiss [Jena, GmbH]. Zusätzlich, um die Roboterhandhabung, Flüssigkeitslieferung und das schnelle und präzise Scannen zu erleichtern, werden zwei Lesebetriebsarten, Betriebsart mit hohem Gehalt und mit hohem Durchsatz, unterstützt. Die Ablesung mit hohem Gehalt ist im Wesentlichen die gleiche, die von dem ARRAYSCAN^TM-Lesegerät durchgeführt wird (U.S.-PS Nr. 5,989,835). In der Betriebsart (Modus) mit hohem Gehalt wird jeder Ort des Mikroarrays multipler Zelltypen mit einer Vergrößerung von 5-40X oder mehr abgebildet, was eine ausreichende Anzahl von Feldern aufzeichnet, um die gewünschte statistische Auflösung der Messungen) zu erreichen.
In der Betriebsart mit hohem Durchsatz bildet das Lumineszenzleseinstrument 44 den Mikroarray multipler Zelltypen bei einer wesentlich geringeren Vergrößerung von 0,2X- bis 1,0X-Vergrößerung ab, was eine verringerte Auflösung zur Verfügung stellt, es allerdings ermöglicht, alle Zellbindeorte auf dem Substrat in einem einzelnen Bild aufzunehmen. In einer Ausführungsform würde ein 20 mm × 30 mm Mikroarray mehrerer Zelltypen abgebildet bei 0,5X-Vergrößerung 1000 × 1500 Array von 10 μm Pixeln füllen, was eine 20 μm/Pixel-Auflösung erreichen würde, unzureichend, um intrazelluläre Lumineszenzverteilung zu definieren, allerdings ausreichend, um eine durchschnittliche Antwort in einer einzelnen Vertiefung aufzuzeichnen und die Anzahl eines bestimmten Zellsubtyps in einer Vertiefung zu zählen. Da typische Integrationszeiten in der Größenordnung von Sekunden liegen, ermöglicht die Lesetechnologie mit der Betriebsart des hohen Durchsatzes, gekoppelt mit der automatischen Beladung und Handhabung, das Screenen von Hunderten von Verbindungen in einer Minute.
In einer Ausführungsform, die in 13 gezeigt ist, umfasst das Lumineszenzlesegerät eine optisch-mechanische Konstruktion, die entweder ein aufrechtes oder invertiertes Fluoreszenzmikroskop 44 ist, das eine computerkontrolliert x,y,z-Bühne 64 umfasst, ein computerkontrolliertes rotierendes Mundstück 48, das ein Objektiv 70 (z. B. 0,5 ×) mit geringer Vergrößerung hält und ein oder mehrere Objektive 72 mit höherer Vergrößerung, eine weiße Lichtquelllampe 74 mit einem Anregungsfilterrad 76, einem dichromatischen Filtersystem 78 mit Emissionsfiltern 80 und einem Detektor 82 (z. B. gekühlte, ladungsgekoppelte Vorrichtung). Für die Betriebsart mit hohem Durchsatz wird das Objektiv 70 mit geringer Vergrößerung eingesetzt und ein oder mehrere Lumineszenzbilder des gesamten Zellarrays werden aufgenommen. Vertiefungen, die einige ausgewählte Lumineszenzantworten zeigen, werden identifiziert und weiterhin durch ein Screening mit hohem Gehalt analysiert, wobei das Mundstück 68 gedreht wird, um ein Objektiv 72 mit höherer Auflösung auszuwählen und die x,y,z-Bühne 64 wird eingestellt, um die "ausgewählte" Vertiefung zu zentrieren für sowohl zelluläres als auch subzelluläres Screening mit hohem Gehalt, wie beschrieben in U.S.-PS Nr. 5,989,835.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Lumineszenzleseinstrument 44 einen Abtastlaserstrahl in entweder konfokalem oder Standardbeleuchtungsmodus verwenden. Die Spektralauswahl basiert auf multiplen Laserlinien oder einer Gruppe von getrennten Laserdioden, wie hergestellt von Carl Zeiss (Jena, GmbH, Deutschland) oder wie diskutiert in Denk et al. (Science 248: 73, 1990).
In einer anderen Ausführungsform schließt die Betriebsart mit hohem Durchsatz die Verwendung eines Systems mit geringer Auflösung, bestehend aus einem Array (1 × 8, 1 × 12, usw.) von Lumineszenzerreger ein und Lumineszenzemissionsdetektoren, die Subsets (Untergruppen) von Vertiefungen auf einem nicht einheitlich mikrogemustertem Array von Zellen scannen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht dieses System aus gebündelten optischen Fibern, allerdings wird jedes System, das Lumineszenzanregungslicht steuert und Lumineszenzemissionslicht von der gleichen Vertiefung sammelt, ausreichen. Das Scannen des gesamten Mikroarray mehrerer Zelltypen mit diesem System erreicht die Gesamtlumineszenz aus jeder Vertiefung, sowohl von Zellen als auch von der Lösung, in der sie schwimmen. Diese Ausführungsform ermöglicht die Sammlung von Lumineszenzsignalen von zellfreien Systemen, sog. "homogenen" Assays.
14A zeigt ein Verfahren in Form eines Flussdiagramms, zur Analyse eines Mikroarrays multipler Zelltypen in sowohl der Betriebsart mit hohem Durchsatz als auch der Betriebsart mit hohem Gehalt unter Verwendung des Lumineszenzleseinstruments, das zunächst Detektion mit hohem Durchsatz verwendet, um eine Antwort von dem Gesamtarray "A" zu messen (14B). Jede Vertiefung, die oberhalb des voreingestellten Schwellenwerts antwortet, wird als Treffer angesehen und die Zellen in dieser Vertiefung werden durch ein Screening mit hohem Gehalt gemessen (14C). Die Betriebsart mit hohem Gehalt ("B") kann oder kann nicht die gleichen Zellparameter messen, die während der Betriebsart mit hohem Durchsatz ("A") gemessen wurden.
In einem weiteren Aspekt wird ein Zellscreeningsystem offenbart, wobei der Ausdruck "Screeningsystem" die Integration eines Lumineszenzleseinstruments, einer Kassette, die in das Lumineszenzleseinstrument eingeführt werden kann, die einen Mikroarray multipler Zelltypen umfasst, wobei die Zellen wenigstens ein Lumineszenzreportermolekül enthalten, und eine Kammer, die mit dem nicht einheitlichen mikrogemusterten Array von Zellen in Zusammenhang stehen, einen digitalen Detektor zum Empfang von Daten von dem Lumineszenz lesegerät und eine Computervorrichtung zum Empfang und zur Prozessierung digitaler Daten von dem digitalen Detektor, umfasst.
Bevorzugte Ausführungsformen des Lumineszenzleseinstruments und der Kassette, die den Mikroarray mehrerer Zelltypen und die Kammer umfassen, sind vorstehend offenbart. Eine bevorzugte Ausführungsform des digitalen Detektors ist in U.S.-PS Nr. 5,989,835 offenbart und umfasst eine digitale Kamera mit hoher Auflösung, die Lumineszenzdaten von dem Lumineszenzleseinstrument erhält und in digitale Daten konvertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Computervorrichtung ein digitales Kabel, das die digitalen Signale von dem digitalen Detektor zu dem Computer transportiert, ein Display für Benutzerinteraktion und ein Display für Assayergebnisse, eine Vorrichtung zur Prozessierung von Assayergebnissen und ein digitales Speichermedium für Datenspeicherung und Archivierung, wie beschrieben in U.S.-PS Nr. 5,989,835.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellscreeningsystem die Integration von bevorzugten Ausführungsformen der vorstehend offenbarten Elemente (15). Der Array mehrerer Zelltypen 10 umfasst Zellen, die an chemisch modifizierte Zellbindeorte 8 auf einem Substrat 4 gebunden sind. Die Kammer 12 dient als ein Mikroflüssigkeits-Liefersystem für den Zusatz von Verbindungen zu den Zellen 10 auf dem Substrat 4 und die Kombination von den beiden umfasst die Kassette 18. Die Kassette 18 wird in ein Lumineszenzleseinstrument 44 gebracht. Die digitalen Daten werden, wie vorstehend und in U.S.-PS Nr. 5,989,835 beschrieben, prozessiert. Die Daten können auf einem Computerbildschirm 86 abgebildet werden und zum Teil einer Bioinformatikdatenbank 90 gemacht werden, wie beschrieben in U.S.-PS Nr. 5,989,835. Diese Datenbank 90 erlaubt die Speicherung und Abfrage von Daten und erlaubt auch die Erlangung und Speicherung von Daten, die sich auf vorhergehende Experimente mit den Zellen beziehen. Ein Beispiel eines Computerbildschirmsist in 16 gezeigt.
Beispiel 1. Kopplung von Antikörpern an einen Mikroarray multipler Zelltypen zur Anheftung spezifischer lymphoider Zellen

1. Die verwendete Zelllinie war eine Maus B-Zelllymphom-Zelllinie (A20), die nicht IgM auf ihrer Oberfläche exprimiert. Ein Mikroarray multipler Zelltypen wurde zur Derivatisierung vorbereitet durch Eintauchen über Nacht in 20% Schwefelsäure, Waschen 2–3 mal mit einem Überschuss destilliertem Wasser, Spülen in 0,1 M Natriumhydroxid und Trockenblotten. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde entweder sofort verwendet oder in ein sauberes Becherglas gebracht und mit Parafilm für zukünftige Verwendung verschlossen.
2. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde in eine 60 mm Petrischale gebracht und 3-Aminopropyltrimethoxysilan wurde auf den Mikroarray multipler Zelltypen geschichtet unter Sicherstellung einer vollständigen Bedeckung, ohne über die Kanten zu laufen (etwa 0,2 ml für einen 22 × 22 mm nichteinheitlichen mikrogemusterten Array von Zellen und etwa 0,5 ml für einen 22 × 40 mm nichteinheitlichen mikrogemusterten Array von Zellen). Nach 4 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Mikroarray multipler Zelltypen in deionisiertem Wasser gewaschen und Überschuss an Wasser wurde durch Blotten entfernt.
3. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde in saubere 60 mm Petrischalen gebracht und mit Glutaraldehyd (2,5% in PBS, etwa 2,5 ml) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei PBS-Waschungen. Überschüssiges PBS wurde durch Blotten entfernt.
4. Die Zellkerne in dem Mikroarray multipler Zelltypen wurden mit einem Lumineszenz-Hoechst-Farbstoff während des Blockierungsschrittes markiert. Die angemessene Anzahl lymphoider Zellen (vergleiche nachstehend) in C-DMEM wurden in ein konisches Röhrchen mit 15 ml transferiert und Hoechst-Farbstoff wurde in einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben. Die Zellen wurden für 10 bis 20 Minuten bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert und dann durch Zentrifugation bei 1000 x g für 7 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand, der ungebundenen Hoechst-Farbstoff enthielt, wurde entfernt und frisches Medium (C-DMEM) wurde zugefügt, um die Zellen wie folgt zu resuspendieren: Etwa 1,25-1,5 × 10⁵ Zellen in 0,2 ml pro 22 × 22 mm nichteinheitlich mikrogemustertem Array von Zellen und etwa 2,5 × 10⁵ Zellen in 0,75 ml für den 22 × 40 mm nichteinheitlich mikrogemustertem Array von Zellen.
5. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde kurz in PBS gewaschen und auf eine saubere, trockene 60 mm Petrischale transferiert, ohne die Seiten der Schale zu berühren. Die Zellen wurden vorsichtig auf die Oberfläche des Mikroarrays multipler Zelltypen pipettiert in der vorstehend beschriebenen Dichte. Die Schälchen wurden bei 37°C in 5% CO₂ für 1 Stunde inkubiert. Ungebundene Zellen wurden dann durch wiederholte PBS-Waschungen entfernt.
6. Antikörperlösungen (Ziegen-Anti-Maus-IgM oder Ziegen-Anti-Maus Gesamtserum) wurden auf Parafilm gespottet (50 μl für einen 22 × 22 mm nichteinheitlichen mikrogemusterten Array von Zellen, 100 μl für einen 22 × 40 mm nichteinheitlich mikrogemusterten Array von Zellen). Der Mikroarray von multiplen Zelltypen wurde auf die Spots invertiert, so dass das Antiserum die gesamte Oberfläche des behandelten Mikroarrays multipler Zelltypen bedeckte, ohne Erzeugen von Luftblasen. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde mit der Antikörperlösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Der Mikroarray multipler Zelltypen wurde vorsichtig von dem Parafilm gehoben, in eine saubere 60 mm Petrischale gebracht und dreimal mit PBS gewaschen. Nichtreagierte Stellen wurden dann durch Zusatz von 2,5 ml eines 10%-igen Serums (Kälber- oder fötales Kälberserum in DMEM oder Hanks Balancierte Salzlösung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert.
8. Beide Zelllinien sollten an das Anti-Maus-Gesamtserum binden, wohingegen nur die X16s an das Anti-Maus-IgM binden sollten. Die Bindung von spezifischen lymphoiden Zellstämmen an die chemisch modifizierte Oberfläche ist in 17 gezeigt. Die lymphoide Maus A20-Zelllinie, der Oberflächen IgM-Moleküle fehlen, die jedoch IgM-Moleküle zeigt, band viel stärker an die Oberfläche, die mit Gesamt-Ziegen-Anti-Maus-Serum beschichtet war (17C) als an die Oberfläche, die mit Ziegen-Anti-Maus-IgM (17B) modifiziert war oder an unbeschichtete Gläschen (17A).

Beispiel 2. Screen mit hohem Gehalt und hohem Durchsatz.
Die Insulin-abhängige Stimulation von Glukoseaufnahme in Zellen wie Adipozyten und Myozyten erfordert eine komplexe Instrumentation von zytoplasmatischen Prozessen, die in der Translokation von GLUT4-Glucosetransportern von einem intrazellulären Kompartiment in die Plasmamembran resultiert. Eine Anzahl von molekularen Ereignissen wird durch die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor getriggert, einschließlich direkter Signaltransduktionsereignisse und indirekter Prozesse, wie der Zytoskelettreorganisation, die für den Translokationsprozess erforderlich ist. Da das Actinzytoskelett eine wichtige Rolle in der Zytoplasmaorganisation spielt, werden intrazelluläre Signalionen und Moleküle, die dieses lebende Gel regulieren, auch als Intermediate von GLUT4-Translokation angesehen.
Ein Screen auf zwei Ebenen auf Insulinmimetika ist wie folgt eingeschlossen. Zellen, die eine stabile Chimäre von GLUT4 mit einem blaufluoreszierenden Protein (BFP) tragen, sind auf einem Mikroarray multipler Zelltyparrays angeordnet und werden dann mit der Acetoxy methylesterform von Fluo-3, einem Calciumindikator (grüne Fluoreszenz) beladen. Der Array der Orte wird dann gleichzeitig mit einem Array von Verbindungen behandelt unter Verwendung eines Mikroflüssigkeits-Liefersystems und eine kurze Sequenz von Fluo-3-Bildern des gesamten Mikroarrays multipler Zelltypen wird analysiert auf Vertiefungen, die eine Calciumantwort in der Betriebsart mit hohem Durchsatz zeigen. Die Vertiefungen, die Verbindungen enthalten, die eine Antwort induzieren, werden dann auf einer Zelle für Zelle Basis auf Hinweise von GLUT4-Translokation zur Plasmamembran analysiert (d. h. die Betriebsart mit hohem Gehalt) unter Verwendung von blauer Fluoreszenz, die in Zeit und Raum nachgewiesen wird.
18 zeigt sequentielle Bilder des gesamten Mikroarrays multipler Zelltypen in der Betriebsart mit hohem Durchsatz (18A) und in der Betriebsart mit hohem Gehalt ( 18B). 19 zeigt die Zelldaten von der Betriebsart mit hohem Gehalt.
Beispiel 3. Verbesserte Kassetten und gesteigerte Vertiefungsdichte
Vorrichtungen und Verfahren zur Maximierung des zellplattierten Bereichs und der Anzahl von Vertiefungen, die in einem Subarray abgebildet werden können, während immer noch geeignete Pixelauflösungen in dem Bild erreicht werden. Dieses Ergebnis wurde erreicht durch die Verwendung von Flüssigarchitektur, die die Distanz und den Bereich zwischen den Vertiefungen minimiert und somit die Vertiefungsdichte maximiert.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts wird eine Kassette zur Verfügung gestellt zum Zellscreening, umfassend ein Substrat, das eine Oberfläche hat, wobei die Oberfläche eine Vielzahl von Zellbindeorten enthält; ein Flüssigkeitslieferungssystem zur Lieferung von Reagenzien zu der Vielzahl von Zellbindeorten, wobei das Flüssigkeitsliefersystem eine Kammer mit multiplen Ebenen umfasst, die mit dem Substrat in Verbindung steht, wobei die Kammer mit multiplen Ebenen umfasst

i. einen gekreuzten Array von Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen und -Ausgangskanälen, wobei jede Vertiefung in Flüssigkeitskontakt ist mit einem oder mehreren Eingangskanälen und einem oder mehreren Ausgangskanälen;
ii. eine Vielzahl von Flüssigkeitsorten in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen und -Ausgangskanälen;
iii. ein oder mehrere Eingangssammelrohre in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen;
iv. ein oder mehrere Ausgangssammelrohre in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen;
v. wenigstens ein Quellengefäß in Flüssigkeitskontakt mit einem oder mehreren Eingangssammelrohren; und
vi. wenigstens einen Abfallbehälter in Flüssigkeitskontakt mit einem oder mehreren Ausgangssammelrohren; und eine Vielzahl von Vertiefungen, wobei eine individuelle Vertiefung den Raum umfasst, der durch die Verbindung von einem Zellbindeort und einem Flüssigkeitsort definiert wird.

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Kassette weiterhin eine Pumpe zur Kontrolle des Flüssigkeitsflusses in der Mikroflüssigkeitsvorrichtung; eine Substrattemperatur-Kontrolleinheit und/oder ein Kontrollgerät, um Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxid-Partialdrücke in der Vorrichtung zu regulieren.
Das Substrat der vorliegenden Erfindung ist chemisch modifiziert, so dass Zellen selektiv an Zellwachstumssubstrat anheften und in kleinen Bereichen, hier als "Zellbindeorte", enthalten sind, die eine Größe unterhalb eines Millimeters bis wenige Millimeter haben. Die Kombination eines Zellbindeorts auf dem Substrat und eines Flüssigkeitsorts auf der Kammer definiert einen Raum, der als "Vertiefung" bezeichnet wird. Das Substrat kann vornehmlich flach sein und die Zellbindeorte können zu den Flüssigkeitsort-Vertiefungen auf einer Substratbeschichtung passen, so dass einige Tiefe in dem Bereich der Vertiefungen gebildet wird, wenn die beiden Teile zusammengebaut werden. Umgekehrt kann der Flüssigkeitsort, der mit Substrat bedeckt ist flach sein und das Substrat kann an den Zellbindeorten Vertiefungen enthalten, so dass einige Tiefe in dem Bereich der Vertiefungen gebildet wird, wenn die zwei Teile zusammengebaut werden. Flüssigkeiten und Testverbindungen werden durch eine Kammer zu den Vertiefungen gebracht, die die Substrate kombiniert, um eine Kassette zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform wirkt die Kammer als Substratbedeckung und enthält Flüssigkeitsorte in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeitskanälen der Vorrichtung, wobei die Flüssigkeitsorte Vertiefungen umfassen, die zu den Zellbindeorten auf dem Substrat passen, so dass das Volumen in jeder Vertiefung in die Kammer geätzt wird.
Es gibt Verschlussregionen auf der Oberfläche des Substrat, die zwischen und um die Zellbindeorte liegen und es gibt korrespondierende Verschlussregionen auf dem Boden der Kammer, die zwischen und um die Flüssigkeitsorte liegen. Wenn das Substrat und die Kammer in Verbindung gebracht werden, treffen sich die Verschlussregionen beider Bestandteile, wodurch ein Verschluss gebildet wird, der den Fluss von Flüssigkeiten über die Verschlussregionen zwischen den Vertiefungen verhindert. Diese Verschlussregionen beider Bestandteile können physikalisch und/oder chemisch modifiziert sein, um den Verschluss zu verstärken. In einem ersten Beispiel wird eine hydrophobe Silanbeschichtung von Octadecyltrichlorsilan auf die Verschlussregionen geschichtet. In einem zweiten Beispiel sind durch Licht aushärtbare Adhäsive und Cyanoacrylate, die USP-Klasse IV-verträglich sind, wie die, die erhältlich sind von Dymax Corporation, wünschenswert zur Verwendung mit biomedizinischen Vorrichtungen, hergestellt aus Keramik, Glas, Plastik oder Metall. In einem dritten Beispiel ist ein biokompatibles Bandmaterial mit Präzisionsaussparungen, die zu den Vertiefungen des Arrays passen, erhältlich von Avery Dennison Speciality Type Division. Ähnlich können biomedizinische Acryladhäsive von Bändern auf Oberflächen transferiert werden, wie die, die erhältlich sind von Tyco Corporation, zur Anbringung einer adhäsiven Beschichtung präzise auf diese Verschlussregionen. In einem vierten Beispiel kann ein durch Licht aushärtbares Siliconelastomer verwendet werden zur Bindung und zum Verschluss zwischen den Verschlussregionen des Substrats und der Kammer, wie die, die erhältlich sind von Master Bond, Inc.
Die Mikroflüssigkeitskassette besitzt Vorteile gegenüber Zellarray-Mikroflüssigkeitsvorrichtungen des Stands der Technik, die in Screeningsystemen mit hohem Gehalt verwendet wurden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf:

1) schnellere Abbildung eines statistisch relevanten Satzes von Zellen (basierend auf der Abbildung eines Satzes von Zellbindeorten (d. h.: "Sub-arrays") gleichzeitig; vgl. 20)
2) mehrere Vertiefungen pro Platte und weniger physikalischer Raum, der pro Platte besetzt wird (d. h.: höhere Vertiefungsdichte),
3) effizientere Verwendung von wertvollen Testverbindungen und
4) effizientere Verwendung von Zellen im Vergleich zu Mikroplatten, in denen nicht der Gesamtvertiefungsbereich abgebildet wird.

Wie vorstehend diskutiert, kann auf früheren Mikrovertiefungsplatten der Austausch für jede Vertiefung nur mit Hilfe einer Pipette erreicht werden, die in die Vertiefung inseriert wird und durch entweder jeweils Entlassen oder Ansaugen von Flüssigkeit in oder aus der Vertiefung. Automatisierte Flüssigkeitshandhabung in früheren Mikrovertiefungsplatten wird erreicht durch Verwendung von Roboter-Pipettoren, die eine Pipette in jede Vertiefung für jeden Flüssigkeitstransferschritt in einem Verfahren inserieren. Diese Pipette wird typischerweise auch benötigt, um zu oder von einer anderen Mikroplattenvertiefung zur Quelle oder Bestimmung der Flüssigkeit, die mit der Mikrovertiefungsplatte von Interesse ausgetauscht wird, zu bewegen.
Integrierte Flüssigkeit ist vorteilhaft für Arrays mit sub- Millimeter Abständen zwischen den Vertiefungen, da es unhandlich, wenn nicht unmöglich ist, Flüssigkeiten mit einem akzeptablen Grad der räumlichen Auflösung und Genauigkeit zu pipettieren. Ein angemessener Grad der Genauigkeit erfordert, dass der Messfehler nicht 2% übersteigen sollte. Somit ist für 100 Mikroliter (μl)-Volumen in der Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ein Messfehler von 2 μl akzeptabel. Für 100 Nanoliter (nl)-Volumen würde ein 2 nl-Messfehler erforderlich sein. Dieser Grad der Genauigkeit ist nicht zuverlässig mit früheren automatischen Pipettoren über ein Spektrum von Zusammensetzungen und Viskositäten zu erreichen.
Die Minimierung der Abstände zwischen den Vertiefungen ermöglicht das schnelle parallele Lesen von Subarrays von Vertiefungen. Wenn die integrierte Flüssigkeit in zu großer Menge vorliegt (d. h. keinen geringen Abstand von Vertiefungen erlaubt), dann geht solch eine schnelle parallele Lesefähigkeit verloren. Eine gekreuzte Kanalarchitektur wird verwendet, die weniger Kanäle, Ventile und Pumpen ermöglicht und somit weiterhin den Raum reduziert, der von Kanälen auf der erfindungsgemäßen Kassette eingenommen wird. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die Kanäle auf einer Ebene oberhalb der der Vertiefungen angebracht, was einen geringstmöglichen Abstand zwischen den Vertiefungen erlaubt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die Verwendung eines durchlässigen Mediums als eine Abfluss-„Pumpe" eine einfachere Konstruktion und Fabrikation des Systems. Die Kanäle können von jeder Größe sein, die die hier definierte Flüssigkeitsarchitektur erlauben. In einer bevorzugten Ausführungsform reicht der Bereich der Größe von etwa 0,025 mm bis etwa 0,5 mm im Durchschnitt für quadratische Querschnittskanäle oder im Durchmesser für kreisförmige Durchschnittskanäle.
Die Flüssigkeitsarchitektur der vorliegenden Mikroflüssigkeitskassette ermöglicht es, die Kontrollelemente (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Pumpen, Sammelrohre, Kon trolldruckgefäße und/oder Ventile) außerhalb der Matrix des Zellarrays zu lokalisieren. 40 zeigt eine Ausführungsform der Pump- und Ventilschemata, wie sie erscheinen würde mit allen Pumpen und Ventilen on board der Kassette. Alle Variationen der Pump- und Ventilschemata, die in verschiedenen Figuren gezeigt sind (und andere, die für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein würden) können auf diesem Weg eingeschlossen werden, entweder mit on board aktiven Vorrichtungen außerhalb der Matrix der Vertiefung, mit off-board aktiven Vorrichtungen oder mit einigen Vorrichtungen an Bord und einigen Vorrichtungen off Board. Als ein Ergebnis können die Kontrollelemente entweder in der Kassette (on-board) oder extern zur Kassette (off board) sein. In beiden Fällen sind keine aktiven Bestandteile in der Matrix des Arrays von Vertiefungen, die den geringen Abstand von Kanälen und Vertiefungen beschränken könnten. Da diese Kassette insbesondere zur Kultur und Analyse von lebenden Zellen konstruiert ist, sind die Flüssigkeitsarchitektur und alle ihre Unterbestandteile und funktionellen Teile kompatibel mit, unterstützen und ermöglichen die Kultur von lebenden Zellen. Die besonderen Aspekte dieser Unterbestandteile und funktionellen Teile, die für lebende Zellkultur konstruiert sind, sind nachstehend identifiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kassette eine Off-Board-Pumpe, um den druckgetriebenen Fluss, der auch kontrolliert, welche Vertiefung von dem Fluss angesteuert wird, zur Verfügung zu stellen. Diese Konstruktionseigenschaft stellt sicher, dass das Pumpverfahren nicht, wie viele Verfahren des Standes der Technik, ineffektiv oder schädlich ist, wenn es mit Zellkulturmediumverwendet wird, das flüssig ist, polar ist und Proteine und Salze enthält. Beispielsweise ist elektrohydrodynamisches Pumpen ineffektiv mit polaren Lösungsmitteln (Marc Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997, S. 433). Elektroosmose wird typischerweise von einem gewissen Grad elektrophoretischer Trennung von geladenen Medienbestandteilen, wie Proteinen, begleitet. Außerdem erfordert Elektroosmose typischerweise die Verwendung von elektrischen Feldstärken im Bereich von 100 V/cm bis 1000 V/cm, die die Physiologie von lebenden Zellen in der Vorrichtung beeinflussen können. Das Flüssigkeitskontrollsystem der vorliegenden Vorrichtung leidet nicht an den Nachteilen der elektrisch induzierten Verfahren, wenn biologische Flüssigkeiten verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Pumpe on board und kann elektrisch betriebenen Fluss verwenden, allerdings sind die elektrischen Felder auf Regionen extern der Matrix des Arrays der Vertiefungen beschränkt und keine elektrischen Feldgradienten werden über eine der Vertiefungen, in denen lebende Zellen vorliegen, angewendet. Diese Ausführungsform ist in 41 gezeigt, wo zwei Elektroden verwendet werden, um elektrische Potentialunterschiede entlang eines Segments von Flüssigkeitskanälen, korrespondierend zu verschie denen On Board-Quellreservoiren anzulegen (730). Jedes Kanalsegment mit seinem Elektrodenpaar bildet eine elektrokinetische Pumpe (740). Diese Quellenreservoirs (730) können mit Medium und/oder Verbindungen über Füllzugänge (700) in der Kassettenoberfläche versorgt werden. Ventile (720) zwischen den Reservoirs und den Pumpen sind geschlossen, wenn die korrespondierende elektrokinetische Pumpe aus ist, und sind offen, wenn die korrespondierende elektrokinetische Pumpe an ist, um jeweils Gegendruck aufrecht zu erhalten und die Aufnahme von Luft oder Flüssigkeit zu ermöglichen. Die Kontrolle der elektrischen Spannung, die auf Elektrode 1 (760) angelegt wird, wird verwendet, um den elektrokinetischen Fluss der Flüssigkeit in dem korrespondierenden Kanalsegment zu induzieren. Elektrode 2 (780) (am nächsten zu der Matrix von Vertiefungen) wird auf einem Grundpotential gehalten, wie die Matrix der Vertiefungen, um sicherzustellen, dass sich nur ein minimaler oder kein Potentialunterschied und/oder elektrisches Feld in der Nachbarschaft der Zellen entwickelt, da bekannt ist, dass elektrische Felder Zellphysiologie beeinflussen. Alternativ kann die elektrokinetische Pumpe stromabwärts des Arrays lokalisiert sein, um als eine Negativdruckpumpe zu dienen. In dieser Ausführungsform würde die Elektrophorese des Mediums durch Pumpwirkung, falls vorhanden, nur das Medium beeinflussen, nachdem es bereits durch die Zellen verwendet wurde und es auf seinem Weg zu dem Abfallreservoir ist.
In allen Ausführungsformen eliminiert die Verwendung von On-Board- oder Off-Board-Pumpen, die extern zu der Matrix von Vertiefungen sind, um Flüssigkeitsfluss zu kontrollieren, die Notwendigkeit für aktive Pumpen in der Matrix von Vertiefungen und eliminiert somit das Problem der Belegung von Raum in der Matrix, was den geringen Abstand von Vertiefungen verhindern könnte.
Die Kontrolle des Flüssigkeitswegs durch Mittel der Druckkontrolle ermöglicht auch die optionale Verwendung verschiedener Diffusionskontrollmittel, die kompatibel sind und wirksam mit Zellmedium sind, das wässrig ist, polar ist und Proteine und Salze enthält. Diese Mittel erfordern auch minimalen Raum auf der Vorrichtung und verhindern somit nicht den geringen Abstand der Vertiefungen.
U.S.-PS Nr. 5,603,351 beschreibt eine Mikroflüssigkeitsvorrichtung, die gekreuzte Kanäle einschließt, allerdings ist das Kanalnetzwerk nicht so definiert, dass es zwei oder mehreren Reagenzien ermöglicht, in einer Reaktionsvertiefung kombiniert zu werden, sondern eher, um es Reagenzien zu ermöglichen, in eine Vertiefung in serieller Art gegeben zu werden. Der Zweck der vorliegenden Kassette ist es nicht, zwei oder mehrere verschiedene Flüssigkeiten gegeneinander auszusetzen, sondern die lebenden Zellen, die auf dem Vertiefungs boden in serieller Art kultiviert wurden, zwei oder mehreren verschiedenen Flüssigkeiten auszusetzen.
Die Flüssigkeitskanäle der Kassette stellen den Transport von Flüssigkeit und Verbindungen von Quellbehältern zu jeder Vertiefung zur Verfügung und von jeder Vertiefung zu einem oder mehreren Abfallbehältern. Jede Vertiefung könnte mit einem getrennten Eingangs- und Ausgangskanal (21) versorgt werden, was 2n² Kanäle (100, 120) für einen n × n Array (040) ergeben würde. Um den Fluss von m Flüssigkeit oder Dampfgemischen zu einem n × n Array zu kontrollieren, sind m + n² Ventile oder Pumpen erforderlich (22). Allerdings wird die Anzahl der Kanäle, Pumpen und Ventile für diesen Typ von Architektur für einen großen Array unhandlich. Eine Pumpe, die einen variablen oder umstellbaren Druck (z. B. eine Spritzenpumpe) hat, ist funktionelle gleichwertig zu einem unter Druck stehenden Reservoir mit einem Ventil. Deshalb sollte die folgende Diskussion von Pumpen, Reservoirs und Ventilen so verstanden werden, dass diese Bestandteile ersetzt werden können.
Bauweise mit gekreuzten Kanälen und mehreren Ebenen
Eine bevorzugte Ausführungsform der Architektur (Bauweise) der Kassette, bestehend aus einem gekreuzten nichtunterbrochenen Array von Eingangs- (100) und Ausgangs- (120)-Kanälen und die Verwendung multipler Ebenen ist offenbart. Spezifische Ausführungsformen in dieser Klasse der Architektur sind in 23–26 und 33 und 34 gegeben.
Da die Bauweise in dieser Klasse weniger unabhängige Kanäle pro Vertiefung benötigt, im Vergleich zu der Klasse der Bauweise mit getrennten Eingangs- und Ausgangskanälen für jede Vertiefung, minimieren diese gekreuzten Kanalarchitektur auch den lateralen Raum (140), der zwischen den Vertiefungen erforderlich ist, um dem Weg für die Kanäle entgegenzukommen.
Die Bauweise mit gekreuztem Kanal und multiplen Ebenen erfordern es nur 2n Kanäle, um n² Vertiefungen anzusteuern. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zeilen- und Spaltenkanäle selbst in zwei unterschiedlichen Schichten gebildet, so dass sie Sich nicht überkreuzen. Die Zeilenkanäle liegen oberhalb der Spaltenkanäle und umgekehrt. Die zwei Schichten liegen entweder in der gleichen Ebene der Vertiefungsschicht (23 und 24) oder liegen in einer Ebene oberhalb der Vertiefungsschicht (25–26 und 33–34). In anderen Ausführungsformen sind Strukturen mit mehr als zwei Ebenen eingeschlossen.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Kanäle oberhalb der Ebene der Vertiefungen angebracht, so dass der minimale Abstand zwischen den Vertiefungen (140) nur von optischen und physikalischen Erfordernissen für eine bestimmte Wanddicke, die jede Vertiefung trennt, erzwungen wird. Der Vorteil der Platzierung der Kanäle in Ebenen oberhalb der Vertiefungen wird von den folgenden Beispielen gezeigt. Vertiefungen, die 0,4 mm × 0,4 mm sind, können auf einem 0,5 mm Abstandgitter angebracht werden, was 0,1 mm Wände zwischen den Vertiefungen ermöglicht, was einen 5 mm × 5 mm Bereich für einen 10 × 10 Vertiefungsarray ergibt. Reihen und Spaltenkanäle von 0,2 mm Durchmesser können leicht in oberen Ebenen der Vorrichtung mit hinreichender Distanz zwischen den Kanälen gebildet werden. Wenn 0,2 mm Kanäle mit 0,1 mm Wänden in der Ebene der Vertiefungen erforderlich sind (und Zeilen- und Spaltenkanalschichten sind in zwei getrennten Ebenen in der Ebene der Vertiefungen gebildet) steigert sich im Gegensatz dazu der Vertiefungsabstand auf 0,8 mm. Dies ergibt einen 8 mm × 8 mm Bereich für einen Array mit 10 × 10 Vertiefungen. In diesem Beispiel steigert die Platzierung von Kanälen zwischen den Vertiefungen den Bereich, der für den Array erforderlich ist, um den Faktor 2,6. Für verschiedene Kanalbauweisen mit getrennten Eingangs- und Ausgangskanälen für jede Vertiefung ist der zusätzliche Raum, der zwischen den Vertiefungen erforderlich ist, wesentlich größer.
Entweder von Kanälen oberhalb oder in der Ebene der Vertiefungen werden horizontal (160) oder vertikal (180) verbindende Kanäle oder Ventile von jeder Vertiefung (j, k) zu ihrem korrespondierenden Reihenkanal j und Säulenkanal k gebildet. Die Herstellung solcher Strukturen aus Glas-, Halbleiter- oder Plastikmaterialien ist auf dem Fachgebiet gutbekannt. In einem solchen Verfahren wird Silicondioxid (SiO₂) lithografisch in Siliconnitrid (Si₃N₄)-Schichten gebildet unter Verwendung eines Mehrschritt-Schicht-für-Schicht-Verfahrens (Turner und Craighead, Proc. SPIE 3528: 114–117 (1998)). Das Aussetzen der Struktur gegenüber einem flüssigen Ätzmittel entfernt das SiO₂, um ein Kanalnetzwerk in dem Si₃N₄ zu bilden, das nicht geätzt ist.
Kontrolle des Flusses in der Bauweise mit gekreuzten Kanälen
In einem gekreuzten Array von Zeilen (A, B, C, usw.) und Spalten (1, 2, 3, usw.) wird der Fluss von Flüssigkeit zu und von Vertiefung (j, k) erzeugt, wenn beispielsweise positiver Druck auf die Zeile j ausgeübt und das Ventil des Ausgangskanals k wird geöffnet, wobei sich j und k auf zum Beispiel jeweils Zeile D und Spalte 7 beziehen. Fluss zu allen Vertiefungen einer Gesamtzeile j wird erzeugt, wenn beispielsweise positiver Druck auf Zeile j ausgeübt wird und die Ventile aller Ausgangskanäle (1, 2, 3, usw.) geöffnet werden. Ein ähnliches Verfahren würde den Fluss zu allen Vertiefungen einer Säule erreichen.
Die Drücke, die hier diskutiert werden, sind in Wirklichkeit Druckunterschiede im Verhältnis zu Umgebungsatmosphärendruck, ansonsten bekannt als "Anzeigendruck". Somit ist der Wert des positiven Drucks die Menge, durch die ein zugefügter Druck größer ist als Atmosphärendruck; der Wert des negativen Drucks ist die Menge, durch die ein ausgeübter Druck geringer ist als Atmosphärendruck. Diese Drücke werden jeweils als positiver und negativer Anzeigendruck bezeichnet.
Der Ausdruck "Flüssigkeitsweg", wie hier verwendet, zeigt den bestimmten Satz von Vertiefungen {(j, k), (j, n), (m, k), (m, n) ... usw.}, der dem Flüssigkeitsfluss unterworfen wird, durch Ermöglichung der Flusskontrollvorrichtungen der Reihen j und m, usw. und Säulen k und n, usw. Es ist zu beachten, dass die Ermöglichung der Flusskontrollvorrichtungen von zwei Reihen von zwei Säulen einen Flüssigkeitsweg durch vier Vertiefungen erreicht. Dies wird hier als Einzelflussweg, der vier Vertiefungen einschließt, definiert, im Gegensatz zu vier Signalwegen, die Einzelvertiefungen einschließen.
Reduktion der Anzahl von aktiven Ventilen oder Pumpen
Verschiedene Kombinationen von aktiv kontrollierten Flusskontrollvorrichtungen (Pumpen oder unter Druck stehende Reservoirs mit Ventilen) werden verwendet, um den Fluss durch eine gewünschte Vertiefung (010) oder Flüssigkeitsweg zu erzeugen. Beispielsweise können m Verbindungen zu einer Einzelvertiefung gebündelt werden durch Verwendung von m positiven Druckquellreservoirs oder Pumpen (200), einem ventillosen Sammelrohr (240) und eines ventilfreien Abfallreservoirs bei Atmosphärendruck (300) (27). Dieses ventillose Sammelrohr (240) kann ersetzt werden durch ein Sammelrohr mit Ventil [z. B. (260) aus 28] zur besseren Kontrolle der Diffusion von Flüssigkeiten zwischen m Quellen. Alternativ kann die gleiche Funktionalität erreicht werden durch Verwendung eines negativen Druckabfallreservoirs oder einer Pumpe (320) mit m Ventilen (260), verbunden mit m Quellreservoirs bei Atmosphärendruck (220) (28). Die Verwendung von Quellenreservoirs bei Atmosphärendruck ermöglicht das geeignete Blubbern von Gasen durch die Quellreservoire, um ein gewünschtes Niveau gelöstes CO₂ und O₂ in dem Medium zu etablieren und aufrecht zu erhalten.
In einer anderen Ausführungsform ist ein Abfallreservoir mit einem durchlässigen Medium gefüllt, das als eine Kapillaraktionspumpe (320) dient und einen negativen Druck (28) zur Verfügung stellt. Die Thermodynamik des Anfeuchtens erzeugt einen Druck über ein Flüssigkeits-Dampf-Interface, beschränkt durch eine Fest-Flüssig-Dampf-Kontaktlinie. Der Druck der Kapillaraktion kann verwendet werden, um eine Flüssigkeitssäule von jedem Mikrokanalweg in den hohen Oberflächenbereich des porösen Mediums zu ziehen. Eine Reihe solcher negativer Druckreservoirs können verbunden werden zu einem Array über ein ein bündelndes Ventilsammelrohr zur Kontrolle des Flusses oder ein Einzelreservoir kann gleichzeitig an die Ausgangskanäle aller Vertiefungen eng gekoppelt werden. Eine Anzahl von durchlässigen Medien sind auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Silicagel-Technologie, durchlässige Keramikmaterialien wie Zeolit, ein Pad hydrophiler (synthetischer oder natürlicher) Fasern und teilweise hydratisierte oder lyophilisierte Hydrogele wie Alginate, Poly(vinyl)alkoholgele, Agarose, Zucker-Polyacrylgele und Polyacrylamidgele. In einer bevorzugten Ausführungsform basiert das durchlässige Medium auf Silicagel-Technologie. Eine dünne Membran oder ein Filterblatt kann verwendet werden, um das poröse Medium von dem Mikrokanalarray zu trennen. Dieses Verfahren kann Druck zum Pumpen zur Verfügung stellen, bis der interne Oberflächenbereich des porösen Mediums weitestgehend durch die Flüssigkeit angefeuchtet ist. Durch geeignete Auswahl des durchlässigen Mediums und des Aufbaus dieses Verfahrens können angemessen große Mengen der Flüssigkeit gepumpt werden, um eine ausgewählte Messung mit dem Arraysystem durchzuführen.
In einer anderen Ausführungsform ist der Array von m positiven Druckquellreservoirs oder Pumpen (200), gezeigt in 27 mit einem n × n überkreuzten Kanalarray von Vertiefungen (040) durch Mittel von 1 × n Eingangs- (400) und n × 1 Ausgangs- (410)-Ventilsammelrohren gebündelt (29). Dies erinnert an Bauweisen mit getrennten Eingangs- und Ausgangskanälen für jede Vertiefung (22), m + n² Ventile oder Pumpen sind in dieser Situation erforderlich. Noch mal, das ventillose Sammelrohr (240) kann durch ein Sammelrohr mit Ventil [z. B. (260) aus 28] ersetzt werden, um die Diffusion von Flüssigkeiten zwischen den m Quellen besser zu kontrollieren. Der Fluss durch die Vertiefung (j, k) wird bewirkt, wenn das Eingangsventil j und das Ausgangsventil k geöffnet sind. Alternativ kann die gleiche Funktionalität erreicht werden mit m Reservoirs bei Atmosphärendruck (220) und einem negativen Druckabfallreservoirs (entweder 320 oder 340), wie in 28 durch Mittel von 1 × n Eingangs- (400) und n × 1 Ausgangsventil-(410)-Sammelrohren (30).
Spülkanäle
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein n × n Mikrovertiefungsarray durch einen zusätzlichen Säulenkanal k* oder einen Satz von Spaltenkanälen {k*} angereichert, die das Passieren eines Segments von Flüssigkeit oder Dampf von einer gegebenen Reihe j zu ei nem Abfallreservoir ermöglichen, ohne durch die Vertiefungen {(j, k)} oder den Säulenkanal {k} zu gehen. Diese zusätzlichen Spaltenkanäle {k*} werden als Spülkanäle (130) bezeichnet, da sie das Spülen der Zeilenkanäle ermöglichen, ohne den Fluss durch die Vertiefungen zu erfordern.
Generell kann ein Spülkanal k* (130) angrenzend und parallel zu Säulenkanal k (016) lokalisiert sein, allerdings verbunden durch eine Bohrung mit Reihenkanal j (014) an dem Punkt, an dem sie sich überkreuzen [und nicht direkt verbunden mit der korrespondierenden Vertiefung (j, k)]. In einer Ausführungsform hat jeder Säulenkanal k einen assoziierten parallelen Spülkanal k* (33 und 34). In anderen Ausführungsformen gibt es nur einen Spülkanal, um Spülen für den gesamten Satz von Zeilenkanälen {j} zur Verfügung zu stellen, oder es gibt jede Kombination von Spülkanälen {k*}, eingefügt in den Array von Spaltenkanälen {k}. Wenn es nur einen Spülkanal gibt, kann es bevorzugt sein ihn direkt angrenzend an den letzten Säulenkanal des Arrays zu lokalisieren, wo k = n.
35 zeigt im Fall von Flüssigkeitsfluss durch Vertiefung (j, k) ein Beispiel eines Verfahrens, um ein Segment von Flüssigkeit oder Dampf von Reihenkanal j zu spülen und in Spülkanal k* wo k* direkt angrenzend an Säulenkanal k ist. Dieses Verfahren und die Bauweise ermöglichen es diesem Flüssigkeitssegment, zu dem Abfallreservoir befördert zu werden, ohne die Vertiefungen zu passieren {(j, k + 1), (j, k + 2), usw.}, die stromabwärts entlang des Reihenkanals j sind. Dies ist wünschenswert, um die Diffusion einer gegebenen Verbindung aus einer Vertiefung (j, k) zu anderen Vertiefungen stromabwärts {(j, k + 1), (j, k + 2), usw.}, wo die Verbindung nicht erforderlich sein könnte, zu beschränken. Zusätzlich, wie nachstehend beschrieben, kann Diffusion durch Einführen von Dampfsegmenten in den Mikrokanal-Mikrovertiefungsarray kontrolliert werden.
32 zeigt, wie das Pump- und Ventilschema von 29, die positive Druckquellenreservoirs einsetzt, ausgedient werden kann, um mit einem gekreuzten Array von n Zeilenkanälen und 2n Spaltenkanälen (n normale Spaltenkanäle plus n Spülspaltenkanäle) zu arbeiten. Dies erfordert ein 2n × 1 Ausgangsventil-Sammelrohr (420). Generell wird für jeden zusätzlichen Spülkanal k*, der zugefügt wird, ein zusätzliches Ventil zu dem Ventilsammelrohr, das mit den Spaltenkanälen verbunden ist, zugefügt. Ähnlich kann das Schema aus 30, das ein negatives Druckabfallreservoir verwendet, ausgedehnt werden, um mit einem Array zu arbeiten, der Spülkanäle besitzt (130).
Doppelt gepumpte Konstruktionen
Der Fluss durch einen Flüssigkeitsweg {(j, k), (j, n), (m, k), (m, n) ... usw.}, oder genereller durch jede Länge einer Röhre, wird durch einen kontinuierlichen Druckgradienten erzeugt, der entlang der Länge des Wegs oder der Röhre besteht. Die Kontrolle dieses Druckgradienten durch Mittel von Drücken, die an den Eingängen und Ausgängen der Flüssigkeitswege angelegt werden, erfordert, dass kein Leck des Flusses über die Wände des Wegs besteht. Ein Leck stört auch die angemessene Dosierung von Verbindungen in den Vertiefungen für Arzneimittelscreening. Der Verschluss der Wände des Wegs muss angemessen sein für die angezeigten Drücke, die wahrscheinlich angewendet werden sollen. Für Flüssigkeitsflussraten von annähernd einigen Millimetern pro Minute, Pfadlängen nicht größer als wenige Zentimeter und Kanalkreuzungen in der Größenordnung von 100 mm × 100 mm sagt das Hagen-Poiseuille-Gesetz, dass der erforderliche End-zu-End-Druckunterschied ΔP geringer als 1 Atmosphäre (1 Atm. ≈ 14 Pfund pro Quadratinch) ist. Nichtsdestotrotz, unter Einbeziehung der verschiedenen Materialien und Strukturen, die in dem Fachgebiet bekannt sind, die eingesetzt werden können für die Vorrichtung, wird die Möglichkeit des Leckens zwischen benachbarten Vertiefungen durch Reduktion des Anzeigendrucks, der über die Wände des Systems angewendet wird, minimiert. Gegen Ende kann die vorliegende Vorrichtung positive Druckquellreservoirs mit einem negativen Druckabfallreservoir (d. h. ein "doppelt gepumptes" System) verwenden, um im Wesentlichen die Hälfte der maximalen Anzeigendrücke zu halbieren, die angewendet werden müssen, um ein gegebenes Gesamt End-zu-End Druckdifferential zu erreichen.
Für ein "einzeln gepumptes" System, d. h. ein System, das offen gegenüber Atmosphärendruck an einem Ende ist und das an dem anderen Ende gepumpt wird (entweder zu einem positiven oder einem negativen Anzeigendruck, ±ΔP), ist der Druckunterschied, der über die Wände des Systems angelegt wird, maximal an dem Ort des gepumpten Reservoirs, d. h. (200) aus 27 und 29; oder (320, 340) aus 28 und 30. Das Auftreten eines Lecks ist am wahrscheinlichsten an diesen Punkten des maximalen Anzeigendrucks, mit einem positiven Druck, der dazu tendiert, Flüssigkeit aus dem Weg zu drängen und einem negativen Druck, der dazu tendiert, die Flüssigkeit in den Weg aus einer benachbarten Vertiefung oder Kanal zu ziehen. (Dies setzt voraus, dass die benachbarten Kanäle und Vertiefungen bei einem Null-Anzeigendruck gehalten werden, wenn sie dem Fluss nicht unterworfen sind. Ein anderes Verfahren zur Kontrolle der Druckunterschiede über die Systemwände ist, passende Drücke auf die benachbarten Wege auszuüben, während sie nicht unter Fluss stehen).
An Zwischenpunkten entlang des Flüssigkeitswegs haben die Druckdifferentiale über die Systemwände Werte zwischen ±ΔP und Null für sowohl positiv als auch negativ gepumpte Systeme.
Das gleiche End-zu-End Druckdifferential ΔP wird über den Weg angelegt durch Etablierung von Drücken von ±ΔP/2 an jeweils den Eingangs- und Ausgangsreservoirs. In diesem Fall sind die maximalen Anzeigewerte, die über die Wände des Systems angelegt werden ±ΔP/2 und treten an den korrespondierenden Endpunkten des Systems auf. Darüber hinaus ist der angelegte Anzeigendruck in der Vorrichtung nahe Null, wenn die Vertiefungen etwa in der Mitte zwischen den Eingangs- und Ausgangsreservoirs entlang der Länge des Wegs sind. An den Endpunkten des Wegs werden die maximalen Druckunterschiede ±ΔP/2 leichter gehalten ohne Leck in den Plastikrohren oder Silicakapillaren. Der Nachweis eines Lecks wird erleichtert, da es wahrscheinlich nur an den Systemendpunkten auftritt.
In einer Ausführungsform haben die zwei Spritzen eines dualen Pumpsystems den gleichen Durchmesser und das gleiche Volumen und da sie mit dem gleichen Aktuator in einer Gegentaktanordnung verbunden sind, wird jede Spritze um die gleiche lineare Distanz bewegt und identische Volumina werden für jeden Zuwachs der Bewegung ausgetauscht. Wie jede bestimmte Quellverbindung in den Array gedrückt wird, wird ein gleiches Volumen von Abfallflüssigkeit herausgezogen. Somit enthält der Array von m Quellspritzen auch einen Array von m negativen Druckabfallreservoirs. Dieser Array der negativen Druckabfallreservoirs ist mit den Spaltenkanälen durch ein 1 × m ventilloses Sammelrohr gebündelt, genauso wie der Array von Quellreservoirs mit den Zeilensäulen gebündelt ist.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Quell- und Abfallspritzen von unterschiedlichem Durchmesser und die Spritzen müssen durch zwei getrennte Mitnehmer, die jede Spritze in einer unterschiedlichen linearen Rate bewegen, kontrolliert werden, die jedoch die gleichen Volumenaustausche in jeder Spritze erreichen. Beispielsweise könnte eine Spritze mit geringerem Durchmesser für eine Verbindung verwendet werden, während eine Spritze mit größerem Durchmesser als Abfallbehälter verwendet werden könnte. Wenn der Durchmesserwert ein Faktor 2 ist, wenn der Mitnehmer der kleinen Spritze eine lineare Einheit bewegt, um Flüssigkeit auszutauschen, bewegt sich der Mitnehmer der großen Spritze nur um ein Viertel der linearen Einheit, um die Flüssigkeit zu verwerten, allerdings sind die ausgetauschten Volumina identisch. 31 zeigt einen bestimmten Fall dieser Ausführungsform eines "zweifach gepumpten" Systems, in dem nur eine Abfallspritzenpumpe vorliegt, die in koordinierter Weise angetrieben werden muss (z. B. durch Mittel der Computerkontrolle) mit der Antreibung jeder spezifischen Quellspritzenpumpe. Alternativ kann die negative Druckpumpe eine Kapillarpumpe sein, ebenfalls in 31 gezeigt. Bei der Kapillarpumpe wird die "Betreibung" der Pumpe durch Ventile erreicht.
Zusammenfassend besitzt das doppelt gepumpte System die folgenden Vorteile:

1) Reduktion des maximal angewendeten Anzeigedrucks,
2) der angewendete Anzeigendruck ist nahe der Mitte des Weges gering und
3) ein Lecken kann leicht nachgewiesen werden und tritt am wahrscheinlichsten an den Systemendpunkten auf.

Bündelung auf höherer Ebene
Die Verwendung von Flusssammelröhren mit mehreren Öffnungen (Multiport) zwischen den gepumpten Reservoirs und den gekreuztem Kanalarray ermöglicht es m verschiedenen Pumpen (200) oder Reservoirs (220) in diesen verschiedenen Ausführungsformen mit m verschiedenen Flüssigkeits- oder Dampfgemischen selektiv und nacheinander Fluss in jede Vertiefung (j k) des n × n Vertiefungsarrays (002) zu erzeugen. Generell kann ein Satz von Vertiefungen, der einen einzelnen Flüssigkeitsweg {(j, k), (j, n), (m, k), (m, n) ... usw.} definiert, durch dieses System definiert werden. Der Fluss von nur einer Flüssigkeit oder einem Dampfgemisch kann durch nur einen Flüssigkeitsweg zu einem Zeitpunkt erfolgen. Bündelung auf einer höheren Ebene, die den gleichzeitigen Fluss von verschiedenen Flüssigkeits- oder Dampfgemischen durch verschiedene Wege ermöglicht, ist möglich mit einem komplexen System von Flusssammelrohren. Solch ein System kann leicht als eine Generalisierung der vorliegenden Konstruktion konstruiert werden.
Kontrolle der Diffusion
Das Prinzip dieser Ausführungsform ist, dass das Ventilelement (250) und der Ventilsitz (540) so geformt sind, dass sie Fluss in eine Richtung ermöglichen und Diffusion unterdrücken, wenn der Fluss gestoppt wird.
Weiterhin werden die Rückstellkräfte auf alle Ventile "passiv" und konstant angewendet. Es wird kein detailliertes Kontrollsystem zur Überprüfung der Ventile benötigt, da die Kontrolle des Flüssigkeitsdruckgradienten das Mittel ist, durch das einzelne Ventile geöffnet werden.
Die Verwendung von gekreuzten Mikrokanälen mit einer großen Anzahl offener Wege zwischen zum Beispiel den 2n Mikrokanälen und den n² Vertiefungen können in einigen Ausfüh rungsformen angereichert werden durch zusätzliche Verfahren zur Kontrolle der Diffusion von Verbindungen zwischen den Vertiefungen und Mikrokanälen. Im Gegensatz zu früheren Systemen benötigt das Mikroflüssigkeitssystem kein detailliertes Kontrollsystem in der Vorrichtung zur Kontrolle von Vertiefung-zu-Vertiefung Diffusion. Zwei exemplarische Mittel zur Kontrolle der Zwischenvertiefungsdiftusion sind offenbart, die nicht die aktive Kontrolle von On-Board Ventilen erfordern. Beide dieser Verfahren blockieren die Diffusion zwischen Vertiefungen durch Mittel der Flüssigkeitsflusskontrolle von Ventilen, Pumpen und Sammelrohren, die extern zu dem Array von Vertiefungen sind und entsprechen somit den Gesamtkonstruktionsprinzipien der Erfindung: Die optimale Abbildung von Subarrays von Vertiefungen in einer Klasse von Flüssigkeitsarchitekturen, die weniger Kanäle benötigt und geringere Abstände zwischen den Vertiefungen ermöglicht.
Das erste Verfahren verwendet die Insertion von Luftsegmenten zwischen verschiedenen Flüssigkeitssegmenten. Die positiven und/oder negativen Druckverfahren, die in den vorstehenden Ausführungen gegeben sind, werden eingesetzt, um diese Luftsegmente zu inserieren. Generell kann die Anwendung von unterschiedlichem Druck in geeigneten Sequenzen über bestimmte Zeilen {j} und Spalten {k} oder {k*} eine Anzahl von getrennten Luftsegmenten in die Eingangskanäle {j} zwischen einer Anzahl von verschiedenen Flüssigkeiten platzieren. Insbesondere kann eine angemessene Abfolge ein Flüssigkeitssegment zu einer Vertiefung (j, k) steuern und ein anderes Flüssigkeitssegment zu einer anderen Vertiefung (j, k – 1) steuern, während auch ein Luftsegment in Zeile j zwischen diesen zwei Vertiefungen inseriert und aufrecht erhalten wird. Nachfolgend kann das Luftsegment aus dem System entlassen werden durch eine ungenutzte Vertiefung oder durch einen Spülkanal k* (130) ( 35).
Das zweite Verfahren der Diffusionskontrolle verwendet "normal geschlossene" Kontrollventile (500) zwischen jedem Paar angrenzender Bohrungen (Bohrung k und Bohrung k + 1) (180), die die Kanäle j mit den Vertiefungen (j, k) und (j, k + 1) (36) verbinden. Ähnlich können Kontrollventile in Bauweisen verwendet werden, die Spülspaltenkanäle {k*} einbauen. In anderen Ausführungsformen können Kontrollventile in die Bohrungen (160, 180) gebracht werden, die Vertiefungen mit Mikrokanälen oder Zeilenkanälen verbinden, um Spaltenkanäle zu spülen. Diese Ventile sind geschlossen, bis ein Druckgradient über einen Flüssigkeitsweg des Arrays angelegt wird. Dann werden nur diese Ventile, die entlang des ausgewählten Flüssigkeitswegs verteilt sind, offengedrückt. Wenn der Fluss gestoppt wird und die Ventile in die geschlossene Position zurückkehren, unterdrücken die Ventile Diffusion von Verbindungen zwischen den Vertiefungen und Mikrokanälen oder Zeilenkanälen und Spülkanälen. Die Rückstellkraft, die jedes Ventilelement (520) in seinem korrespondierenden Ventilsitz (540) schließt, kann durch jede Anzahl von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zur Verfügung gestellt werden. Die Stärke der Rückstellkraft muss es ermöglichen, die Ventile nach Anwendung von Druckgradienten, die angemessene Flussraten (typischerweise weniger als 1 cm/Min.) erreichen, zu öffnen. Verfahren zur Anwendung von Rückstellkräften schließen mechanische Kräfte durch die Deformation von metallischen, Halbleiter- oder organischen Materialien; pneumatischen Druck; elektrostatische Kraft, magnetische Kraft und die Schwerkraft ein.
In einer weiteren Ausführungsform induziert ein extern angelegter Magnetfeldgradient (620) eine Rückstellkraft auf Ventilelemente (520), die ein magnetisches Material beinhalten. Dies schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf die Verwendung von paramagnetischen Kügelchen (600) (z. B. geliefert von Dynal Corp.), wie gezeigt in 37. Diese paramagnetischen Kügelchen (600) dienen als Kugeln in Mikrokugelventilen, die in und entlang jedes Zeilen- und Säulenkanals eingebaut sind. U.S.-PS Nr. 5,643,738 und U.S.-PS Nr. 5,681,484 beschreiben ein magnetisch gesteuertes Mikrokugel-Kontrollventil. Allerdings beschreiben diese Patente insbesondere ein aktiv kontrolliertes Ventil, das das Schließen des Kugelventils auf "Anforderung" erlauben würde und hat seinen Zweck in dem Stoppen des Flusses, der durch externen Druck ausgeübt wird. In dem vorliegenden Fall ist der besondere Vorteil des Mikroflüssigkeitsarchitektursystems, dass eine sanfte Rückstellkraft gleichzeitig auf eine große Anordnung von Kugelventilen über den gesamten Array ausgeübt wird und keine aktive Kontrolle erforderlich ist. Die Bewegung von ausgewählten Kugeln (wann immer es gewünscht ist, die Ventile zu öffnen) entlang eines Flüssigkeitswegs wird dadurch erreicht, dass die Flüssigkeit selbst fließt. Das Kugelventil wird durch den Fluss der Flüssigkeit kontrolliert, nicht der Fluss der Flüssigkeit wird durch das Kugelventil kontrolliert. In dieser Ausführungsform ist der Ventilsitz darüber hinaus besonders konstruiert, so dass ein Verschluss in einer Richtung nicht erreicht wird, im Gegensatz zu der anderen Richtung, in der ein sanfter Verschluss ausreichend ist, um ein Stoppen der Diffusion zu erreichen.
In einer Ausführungsform ist ein Mikrokugelventil zwischen jedem Paar angrenzender Bohrungen (Bohrung k und Bohrung k + 1) lokalisiert, die die Kanäle j mit den Vertiefungen (j, k) und (j, k + 1) verbinden. Jedes Mikrokugelventil öffnet sich nur, wenn ein Druckgradient über einen Weg angelegt wird, der das Ventil einschließt. Die Konstruktion des Ventilsitzes (540) auf einer Seite ist geformt (z. B. mit Fugen), so dass der Fluss nicht gestoppt wird, wenn der Flüssigkeitsdruck die Kugel in Richtung des Flusses bewegt. Wird kein Druckgradient angelegt (und fließt keine Flüssigkeit) an der Stelle eines bestimmten Kugelventils, presst eine magnetische Rückstellkraft die paramagnetische Kugel zurück gegen die andere Seite des Ventilsitzes (540) (wo der Sitz so geformt ist, um zu der Kugel zu passen), um Diffusion von Verbindungen über einen Teil des Mikrokanals zu unterdrücken. Die Rückstellkraft wird durch einen Magnetfeldgradienten induziert, der auf den gesamten Array angewendet wird, so dass alle Ventile normalerweise geschlossen sind.
In einer anderen Ausführungsform induziert ein extern angelegter Magnetfeldgradient (620) eine Rückstellkraft auf Ventilelemente (520), die ein eisenmagnetisches Material enthalten. Beispielsweise sind Präzisions-Chromstahlkugeln erhältlich von Glenn Mills, Inc., Clifton, NJ in einem Bereich von weniger als einem mm bis wenigen mm Durchmesser.
38 zeigt eine Ausführungsform eines geformten Ventilsitzes, der dieses Konstruktionsprinzip exemplarisch darstellt. Insbesondere wird Diffusion entlang der Kugel gestoppt, wenn die extern angelegte Rückstellkraft den Ball nach links in eine runde Öffnung in dem Ventilsitz drückt. Wenn Fluss durch extern angelegte Drücke betrieben wird, wird die Kugel nach rechts gedrückt, allerdings stoppt die Kugel nicht den Fluss, da die rechte Seite des Ventilsitzes oval geformt ist und eine fugenähnliche Deformation entlang einer Seite einschließt, was einen Weg für Flüssigkeit bildet, um die Kugel in dieser offenen Position des Ventils zu passieren.
39 zeigt eine Ausführungsform, die es einem einzelnen magnetischen Feldgradienten, der auf die gesamte Kassette angewendet wird, ermöglicht, Kraft sowohl auf einen Satz von Kugelventilen der Eingangskanäle als auch auf einen Satz von Kugelventilen der Ausgangskanäle auszuüben.
In einer Ausführungsform ist die Richtung des Magnetfeldgradienten parallel zu der Ebene des Arrays, allerdings bezogen auf 45° zu sowohl den Zeilen- als auch Spaltenkanälen. Somit erlebt jede Kugel einen Bestandteil der Kraft in der Richtung der "geschlossenen" Seite seines korrespondierenden Ventilsitzes (540). In anderen Ausführungsformen wird der Magnetfeldgradient senkrecht zu der Ebene des Arrays angelegt und die Kugelventile arbeiten in vertikaler Richtung in den horizontalen Mikrokanälen oder in den vertikalen Bohrungen. In dem letzten Fall (vertikal betriebene Kugelventile in vertikalen Bohrungen) muss die Bohrungsarchitektur wiederum jeder Kugel erlauben, einem Teil der magnetischen Kraft in der Richtung der "geschlossenen" Seite seines korrespondierenden Ventilsitzes (540) unterworfen zu werden.
Ein Beispiel eines eisenmagnetischen oder paramagnetischen Ventilelements (520) von kugelförmiger Form wurde gegeben, allerdings können andere Formen und andere Rückstellkräfte generell verwendet werden, die auf die gleiche Weise funktionieren.
Vertiefungsmaße und -eigenschaften
Eine andere Ausführungsform stellt eine Kassette zum Zellscreening zur Verfügung, umfassend ein Substrat, das eine Oberfläche hat, wobei die Oberfläche eine Vielzahl von Zellbindeorten enthält; ein Flüssigkeitsliefersystem zur Lieferung von Reagenzien zu der Vielzahl von Zellbindeorten, wobei das Flüssigkeitsliefersystem eine Kammer mit mehreren Ebenen umfasst, die mit dem Substrat in Verbindung stehen, wobei die Kammer mit mehreren Ebenen einen gekreuzten Array von Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen und Ausgangskanälen und eine Vielzahl von Flüssigkeitsorten in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen und -Ausgangskanälen umfasst; und eine Vielzahl von Vertiefungen, wobei eine individuelle Vertiefung einen Raum umfasst, der durch die Verbindung von einem Zellbindeort und einem Flüssigkeitsort definiert wird und wobei die Vertiefungen in einer Dichte von wenigstens etwa 20 Vertiefungen pro Quadratzentimeter vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Vertiefungsdichte zwischen etwa 20 Vertiefungen pro Quadratzentimeter und etwa 6400 Vertiefungen pro Quadratzentimeter.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kassette dieser Ausführungsform weiterhin einen oder mehrere Eingangssammelrohre in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Eingangskanälen einen oder mehrere Ausgangssammelrohre in Flüssigkeitskontakt mit den Mikroflüssigkeits-Ausgangskanälen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kassette dieser Ausführungsform weiterhin wenigstens ein Quellgefäß in Flüssigkeitskontakt mit einem oder mehreren Eingangssammelrohren und wenigstens ein Abfallgefäß in Flüssigkeitskontakt mit einem oder mehreren Ausgangssammelrohren. Die verschiedenen Kontrollvorrichtungen in diesen Ausführungsformen sind vorstehend beschrieben.
Es gibt für die Vertiefungsformgeometrie der vorliegenden Erfindung keine Beschränkung, genauso wie die Form in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sich unterscheiden kann. Während eine rechteckige Vertiefungsform den minimalen Abstand und minimalen Bereich zwischen den Vertiefungen in dem Array ermöglicht, hat diese Form den Nachteil potentieller Unterschiede in der Zellkultur oder den Flüssigkeitseigenschaften in Eckenbereichen der Vertiefungen. Deshalb wird eine Vertiefungsform, die kreisförmig ist oder die rechteckig mit abgerundeten Ecken ist, in einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendet.
Das Arraysystem der vorliegenden Erfindung ist konstruiert für die Abbildung von individuellen Zellen in einem Feld von Zellen in einem Arzneimittelscreening Assaysystem. Screening mit abbildenden Assays, die die Messung von jeder individuellen Zelle in einem Feld von Zellen parallel einschließen, werden als Screenings mit hohem Gehalt (HCS) bezeichnet, da detaillierte Informationen über intrazelluläre Prozesse in dem Bild einer Einzelzelle enthalten sind. Screenings mit geringerer Auflösungsabbildung oder mit Detektoren, die ein Signal über eine Population von Zellen integrieren, werden als Screenings mit hohem Durchsatz (HTS) bezeichnet, da sie schneller sind. In HCS werden die Zellen üblicherweise durch Abbilden der Kerne der Zellen identifiziert, die kreisförmig oder ellipsoid in der Form sind mit einer Langachsenlänge, die typischerweise von 5 μm bis 15 μm reicht. Der Zellarray, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, optimiert die Rate von HCS durch Verwendung eines Formats mit höherer Dichte und mehreren Vertiefungen, im Vergleich zu herkömmlichen Platten mit 96 Vertiefungen.
In dem HCS variiert die Anzahl von Zellen, die eine statistisch relevante Probe zur Verfügung stellen, genauso wie die Anzahl von Zellen, die pro Einheit Oberflächenbereich erforderlich sind, abhängig von dem Typ des Assays und dem Typ der Zellen, die kultiviert werden. Somit ist die minimale Größe der Vertiefung, die erforderlich ist für statistische Kriterien in jedem Assay unterschiedlich. Nichtsdestotrotz, ungeachtet was die minimale oder optimale Vertiefungsgröße ist, die Rate, bei der Vertiefungen mit geeigneter Bildauflösung gelesen werden können, um individuelle Zellkerne aufzulösen, wird durch die vorliegende Vorrichtung optimiert, die es ermöglicht verschiedene Vertiefungen zum gleichen Zeitpunkt parallel abzubilden. Dies wird am effizientesten durchgeführt, wenn der verschwendete Raum zwischen den Vertiefungen minimal ist und der zellplattierte Bereich in dem Gesamtbild deshalb maximiert ist.
Darüber hinaus optimiert das vorliegende Arraysystem die flexible Implementation von HTS als auch HCS auf dem gleichen optischen bildgebenden zellbasierten Screeningsystem. Die erforderliche Pixeldichte (Pixel pro Mikrometer) ist geringer für HTS (beispielsweise 0,001 bis 0,1 Pixel pro Mikrometer) und höher für HCS (0,1 bis 4,0 mehr Pixel pro Mikrometer). Das vorliegende System stellt nahtlos die kombinierte Verwendung von HTS und HCS zur Verfügung, worin ein "Treffer", der in HTS identifiziert wurde, auch in der Betriebsart für HCS für detailliertere Analysen gelesen wird. Tatsächlich vergrößert die Erhältlichkeit von HCS auf der gleichen Plattform und mit der gleichen Probe stark die Information, die mit "Treffern", die in der HTS-Betriebsart identifiziert wurden, verbunden ist. Dennoch ist die schnellstmögliche Rate von HCS vorteilhaft, um einen maximalen Gesamtscreeningdurchsatz zu ermöglichen, wann immer HCS verwendet wird. Die minimale Pixeldichte, die für HCS erforderlich ist in Kombination mit der maximalen Vertiefungsdichte des Arrays sind die zwei entscheidenden Parameter, die die maximale Rate, bei der Vertiefungen in der HCS-Betriebsart gelesen werden können, definieren. Diese Erfindung beschreibt, wie die Konstruktion des vorliegenden Arraysystems diese HCS-Rate genauso wie die HTS-Rate maximieren kann.
Ein herkömmliches Mikroskop-Abbildungssystem kann in Verwendung mit Mikroplatten mit 96 Vertiefungen quadratische Felder, die 0,1 mm bis 10 mm breit, zentriert auf jeder 7 mm Durchmesser-Vertiefung sind, abbilden. Die Vertiefungen werden in Serie abgebildet oder "gelesen". In jeder Position auf der Bühne wird typischerweise nur ein Bereich einer Vertiefung gelesen. Um den Gesamtarray (entweder in der HTS oder HCS Betriebsart) der Probenbühne zu lesen, muss die Mikroplatte wenigstens 96 mal bewegt werden.
Wir definieren ein neues Zellscreeningverfahren, in dem viele Vertiefungen gleichzeitig gelesen werden. Da der vorliegende Array Vertiefungsquerschnitte und Abstände zwischen den Vertiefungen hat, die etwa 10-fach geringer als in der Mikroplatte mit 96 Vertiefungen sind (Vertiefungen, die kleiner als 1 mm im Durchmesser sind und Gesamtplattenmaße von eher verschiedenen Millimetern als verschiedene Zentimeter Breite), kann ein Zellscreeningsystem viele Vertiefungen gleichzeitig abbilden. Somit wird die Probenbühne weniger pro Platte bewegt und verschiedene Vertiefungen werden parallel gelesen (39).
Dies schließt im Wesentlichen die serielle Abbildung von "Subarrays" (020) des gesamten Mikrovertiefungsarrays (040) ein, während Daten von allen Vertiefungen von jedem Subarray parallel erhalten werden. Beispielsweise erfordert die Abbildung von 3 × 3 Vertiefungs-Subarrays 9-fach weniger Bewegungen der Probenbühne und ermöglicht etwa eine 9-fach schnellere Rate der Datengewinnung.
Bei einem gegebenen CCD-Detektor Array (080) bestimmt die Vergrößerung des optischen Systems (060) den Bereich des Subarrays (020), der auf den Detektor projiziert wird. Beispielsweise wird eine Bildpixeldichte von 1 Pixel pro Mikrometer für einen 1000 μm × 1000 μm Subarray von Vertiefungen erreicht durch Verwendung einer 10× optischen Vergrößerung und einem 1000 × 1000 Pixel CCD-Array von 10 μm × 10 μm Elementen. In einem zweiten Beispiel kann ein 2000 μm × 2000 μm Subarray von Vertiefungen abgebildet werden auf einem 2000 × 2000 Pixel CCD-Array bei der gleichen Vergrößerung, um die gleiche Bildpixeldichte zu erreichen. In einem dritten Beispiel wird eine Bildpixeldichte von 0,1 Pixel pro Mikrometer erreicht für einen 10 mm × 10 mm Subarray von Vertiefungen durch Verwendung von 1,0 × optischer Vergrößerung und einem 1000 × 1000 Pixel CCD-Array von 10 μm × 10 μm Elementen. In einem vierten Beispiel kann ein 10 mm × 10 mm Subarray von Vertiefungen auf einem 2000 × 2000 Pixel CCD-Array abgebildet werden bei 2,0× Vergrößerung, um die gleiche Pixeldichte zu erreichen.
Nachstehend geben wir Ausführungsformen von bestimmten Ausführungsformen der Vertiefungsgrößen und der Abstände gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Abbildung von Subarrays optimiert. Diese Vertiefungsgrößen müssen groß genug sein, um eine gewünschte Anzahl von Zellen, gebunden an eine gewünschte Anzahl von Zellbindestellen in jedem Ort auf dem Array zu enthalten. Aufgrund des beachtlichen Bereichs der gewünschten Zelldichten, die auf den Zellbindestellen kultiviert werden sollen (d. h.: Kulturen von Zellen mit sehr weitem Abstand oder konfluente Einzelschichten können gewünscht sein) kann die gewünschte Vertiefungsdichte, von der, die nur eine Zelle oder sehr kleine Zellbindestellen von etwa 10 μm im Durchmesser (d. h.: eine Vertiefungsgröße von 20 bis 50 Mikrometern) bis zu der reichen, die entweder eine große Zellbindestelle oder einen Array vieler Zellbindestellen enthält (d. h.: eine Vertiefungsgröße von 1 bis 2 mm), umfassend einen Einzelort auf dem Array. Der erste Fall führt zu einer höheren Vertiefungsdichte und der zweite zu einer geringeren Vertiefungsdichte.
Die Klasse von Mikroflüssigkeitsarchitekturen erlaubt für sowohl hohe als auch geringe Vertiefungsdichten und für Vertiefungen, die eine oder viele Zellbindestellen enthalten, den optimalen Abstand von Vertiefungen, den minimal verschwendeten Raum zwischen den Vertiefungen und die maximale Anzahl von Vertiefungen, die gleichzeitig in einem Subarray abgebildet werden können und ermöglicht noch die Erlangung von angemessener Pixelauflösung in dem Bild.
Wir verwenden jetzt vier Beispiele der optischen Auflösung, die vorstehend gegeben wurden, um zu illustrieren, wie für einen bevorzugten Bereich von Subarraygrößen, optischen Vergrößerungen und Pixelauflösungen und basierend auf den Vorteilen der Mikroflüssigkeitsarchitektur, hier beschrieben sind, die vorliegende Vorrichtung Vertiefungsgrößen und Abstände unterstützt, die große Steigerung in der Geschwindigkeit, in der die Vertiefungen abgebildet oder gelesen werden können, ermöglicht. Zusätzliche Subarraygrößen, optische Vergrößerungen und Pixelauflösungen werden durch die Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung unterstützt. Der Rahmen der Erfindung ist nicht auf den augenblicklichen Stand der Technik in der Anzahl der erhältlichen Pixel beschränkt und auch nicht in den Pixelgrößen in elektronischen Bildgebungssystemen.

1. Für das erste Beispiel vorstehend wird ein 1000 μm × 1000 μm Subarray von Vertiefungen auf einer 1000 × 1000 Pixel CCD-Kamera (mit einer Bildauflösung von 1 Pixel pro Mikrometer) abgebildet. Wir geben jetzt vier Beispiele von Vertiefungsgrößen und – dichten, die durch diese Erfindung unterstützt werden. (a) Erstens, ein 2 × 2 Subarray von 300 μm × 300 μm Vertiefungen mit 200 μm dicken Wänden und einer Vertiefungsdichte von 400 Vertiefungen pro cm². Die Abbildung dieser Vertiefungen in Gruppen von 4 erreicht eine 4-fache Beschleunigung, verglichen mit Lesen einer Vertiefung der Platte zu einem Zeitpunkt. (b) Zweitens, ein 3 × 3 Subarray von 200 μm × 200 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden erreicht einen 9-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 1111 Vertiefungen pro cm². Die Anzahl der Vertiefungen pro Einheitsbereich ist um einen Faktor 80 größer als der, der durch die augenblicklich höchste Dichte einer kommerziellen Mikroplatte (die 1536 Vertiefungsplatte) zur Verfügung gestellt wird. (c) Drittens, ein 5 × 5 Subarray von 100 μm × 100 μm Vertiefungen und 100 μm Wänden erreicht einen 25-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Dichte von 2500 Vertiefungen pro cm². (d) Viertens, für eine noch höhere Dichte von Vertiefungen und einen größeren Geschwindigkeitsvorteil kann die Vertiefung 25 μm × 25 μm mit 100 μm Wänden sein, was einen 8 × 8 Subarray, einen 64-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 6400 Zellen pro cm² ergibt.
2. Für einen 2000 μm × 2000 μm Subarray von Vertiefungen, abgebildet auf einer 2000 × 2000 Pixel CCD-Kamera (mit einer Bildauflösung von 1 Pixel pro Mikrometer) wird ein zusätzliches Beispiel der Vertiefungsdichte, zusätzlich zu den vier vorstehend in Betracht gezogenen Beispielen in Betracht gezogen. (a) Erstens, ein 2 × 2 Subarray von 800 μm × 800 μm Vertiefungen mit 200 μm dicken Wänden ergibt einen 4-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 100 Vertiefungen pro cm². Die Anzahl von Vertiefungen pro Einheitsbereich ist um einen Faktor 5 größer als der, der durch die augenblicklich höchste Dichte einer kommerziellen Mikroplatte (die 1536 Vertiefungsplatte) zur Verfügung gestellt wird. (b) Zweitens, ein 4 × 4 Subarray von 300 μm × 300 μm Vertiefungen mit 200 μm dicken Wänden ergibt einen 16-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 400 Vertiefungen pro cm². (c) Drittens, ein 6 × 6 Subarray von 200 μm × 200 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt eine 36-fache Steigerung in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 900 Vertiefungen pro cm². (d) Viertens, ein 10 × 10 Subarray von 100 μm × 100 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt einen 100-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 2500 Vertiefungen pro cm². (e) Fünftens, ein 16 × 16 Subarray von 25 μm × 25 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt einen 256-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 6400 Vertiefungen pro cm².
3. Für einen 10 mm × 10 mm Subarray von Vertiefungen, abgebildet auf einer 1000 × 1000 Pixel CCD-Kamera (mit einer Bildauflösung von 0,1 Pixel pro Mikrometer) beschreiben wir wieder die vier Fälle von Vertiefungsgrößen und -dichten, die in Beispiel 1 vorstehend beschrieben sind. (a) Erstens, ein 20 × 20 Subarray von 300 μm × 300 μm Vertiefungen mit 200 μm dicken Wänden ergibt einen 400-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Dichte von 400 Vertiefungen pro cm². (b) Zweitens, ein 30 × 30 Subarray von 200 μm × 200 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt einen 900-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 1111 Vertiefungen pro cm². Wie zuvor, unterstützt dieser Fall eine Vertiefungsdichte, die 80-fach größer ist als die, die durch die augenblicklich höchste Dichte einer kommerziellen Mikroplatte zur Verfügung gestellt wird. (c) Drittens, ein 50 × 50 Subarray von 100 μm × 100 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt einen 2500-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Vertiefungsdichte von 2500 Vertiefungen pro cm². (d) Viertens, ein 80 × 80 Subarray von 25 μm × 25 μm Vertiefungen mit 100 μm Wänden ergibt einen 6400-fachen Anstieg in der Geschwindigkeit und eine Dichte von 6400 Vertiefungen pro cm². Für eine noch höhere Dichte der Vertiefungen und einen größeren (2500-fachen) Vorteil in der Geschwindigkeit können die Vertiefungen 100 μm × 100 μm sein mit Wänden, die die Vertiefungen trennen, die 100 μm breit sind, was 2500 Vertiefungen pro Subarray ergibt und 2500 Vertiefungen pro cm².
4. Für einen 10 mm × 10 mm Subarray von Vertiefungen, abgebildet auf einer 2000 × 2000 Pixel CCD-Kamera (mit einer Bildauflösung von 0,1 Pixel pro Mikrometer) treffen die Fälle von Beispiel 2 vorstehend von 100, 400, 1111, 2500 und 6400 Vertiefungen pro cm² wieder zu, ergeben jedoch einen 100-fach größeren Anstieg in der Geschwindigkeit, da die Subarrays 10-fach breiter sind an jeder Seite. Somit sind die Anstiege in der Geschwindigkeit für Vertiefungsdichten von 100, 400, 1111, 2500 und 6400 Vertiefungen/cm² jeweils 400X, 1600X, 3600X, 10000X und 25600X in dem 10 mm × 10 mm Array.

Die folgende Tabelle vergleicht Vertiefungsabstände für verschiedene andere Vorrichtungen:
All diese bestimmten Aspekte der vorliegenden Mikroflüssigkeitsvorrichtung – der gekreuzte Kanal, Multiebenen-Architekturen, die hohe Vertiefungsdichte, die Flüssigkeitsflusskontrolle in diesen Architekturen, die Anordnung von Vertiefungen in räumlich optimierte Subarrays von Vertiefungen und die optionalen Mittel der Kontrolle von Diffusion von Verbindungen zwischen den Vertiefungen – sind speziell ausgewählt und konstruiert, um ein integriertes System zu bilden, das kompatibel mit der Verwendung von Zellkulturmedium (eine polare, wässrige Lösung, die biologische Makromoleküle und Salze enthält), mit der Aufrechterhaltung von gewünschten physiologischen Niveaus von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxidgasen in dem Medium, und mit der Aufrechterhaltung der gewünschten physiologischen Temperatur (typischerweise 37°C, jedoch andere Temperaturen in etwa dem Bereich von 15°C bis 40°C können für bestimmte Zelltypen gewünscht sein) ist.
Insbesondere kann das Zellkulturmedium in Off-Board Gefäßen auf das gewünschte Niveau der Temperatur und des gelösten Kohlenstoffdioxids und Sauerstoffs äquilibriert werden. Dann wird das Medium unter Verwendung von Off-Board Gefäßen und Ventilen durch die Mikrokanäle zu den Vertiefungen bewegt. Der Verschluss dieser Mikrokanäle und Vertiefungen vor der Atmosphäre ermöglicht es, die Partialdrücke von Gasen zu kontrollieren durch Mittel der Äquilibrierung von den externen Gefäßen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Niveau des Kohlendioxids in dem Medium in den Vertiefungen etabliert und aufrecht erhalten werden durch Äquilibrierung des Mediums vor seinem Fluss in die Vorrichtung und/oder durch Ermöglichen eines Austausches eines Gemisches von Kohlendioxid und Luft mit dem Medium, wenn es in der Vertiefung ist. Es existiert eine Anzahl verschiedener Umgebungskontrollkammern für lebende Zellkultur (U.S.-PS Nr. 5,552,321 und 4,974,952; Payne et al., J. Microscopy 147: 329–335 (1987); Boltz et al., Cytometry 17: 128–134 (1994); Moores et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 443–446 (1996); Nature Biotech. 14: 3621–362 (1996)).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur des gesamten Substrats kontrolliert durch in Kontakt sein mit oder eingebaut sein in eine Heizvorrichtung und mit einem Temperatursensor. Ein elektronisches Temperaturkontrollsystem reguliert die Heizvorrichtung, um einen gewählten Temperatursollwert zu erreichen. Somit kann die Konstruktion des in dieser Erfindung beschriebenen Mikroflüssigkeits-Arraysystems leicht auf einem Weg verwendet werden, der lebende Zellkultur ohne ein externes Inkubatorsystem unterstützt. 12 zeigt das automatisierte Lesen von Kassetten. Die Kassetten werden unter Umgebungskontrollbedingungen in zwei Speicherkompartimenten (48 und 54) vor und nach Lesen in dem Lumineszenzleseinstrument 44 gehalten. Während von dem Lumineszenzleseinstrument gelesen wird, hält das System die geeignete Temperatur und die Zusammensetzung gelöster Gase in den Zellkulturmedien in den Vertiefungen der Kassette aufrecht. Temperaturkontrolle in den Vertiefungen wird durch Heizvorrichtungen) und Temperatursensoren) in der Kassette des Lumineszenzleseinstruments zur Verfügung gestellt. Die Kontrolle von gelösten Gaszusammensetzungen in den Vertiefungen wird durch Äquilibrierung des Mediums mit einer Quelle vorgemischter Luft und Kohlenstoffdioxid (kommerziell erhältlich) vor dem Fluss des Mediums in die Vertiefungen der Kassette zur Verfügung gestellt. Jeder Typ von Regler zur Regulation von Gaspartialdrücken kann mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das System einen Gasregler, umfassend eine vorgemischte Gasquelle, verbunden mit einem Reservoir oder Reservoirs, die Zellkulturmedium und/oder Testverbindungen enthalten. Ein Gasdruckregulator und ein Flusskontrollventil kontrollieren die Rate des Flusses von diesem Gasgemisch und seinen Druck in dem (den) verbundenen Flüssigkeitsreservoir(s). Diese Äquilibrierung von Gasgemischen mit den Flüssigkeiten kann durchgeführt werden in Reservoirs, entweder on board oder off board der Kassette, jedoch in jedem Fall außerhalb der Matrix von Vertiefungen.
Die vorliegende Erfindung erfüllt einen Bedarf auf dem Fachgebiet für Vorrichtungen und Verfahren, die die notwendige Zeit, um zellbasierte Screenings mit hohem Durchsatz und/oder hohem Gehalt durchzuführen, verringern. Die Vorrichtungen der Erfindung sind auch ideal geeignet als Zellunterstützungssystem für tragbare diagnostische Vorrichtungen (d. h.: ein miniaturisiertes bildgebendes zellbasiertes Assaysystem). Die Arzneimittel-Entdeckungsindustrie verwendet bereits Mikroplatten mit 96 Vertiefungen und ist im Übergang zur Verwendung von Platten mit 384 Vertiefungen. Platten mit bis zu 1536 Vertiefungen sind vorgesehen. Somit besteht ein großer Vorteil in sowohl dem Durchsatz als auch der Ökonomie aus der Verwendung von Platten mit einer noch höheren Dichte, wie die der vorliegenden Erfindung.
Die verschlossene Eingrenzung von den Zellen in den Zellarray werden ein stabiles System zur Verfügung stellen, das tragbar ist und in jeder Orientierung verwendbar. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung werden für militärische und zivile Toxinuntersuchungen zwei primäre Vorteile zur Verfügung stellen. Erstens, Toxinuntersuchung, basierend auf zellulärer Funktion, ist vorteilhaft, verglichen mit Toxinuntersuchung, basierend auf molekularer Struktur (z. B. Massenspektrometrie oder optische Spektroskopien), da es die endgültige Wirkung von der Verbindung auf Gewebe eher untersucht als eine im Zusammenhang stehende Eigenschaft der Verbindung, deren Verbindung zur Toxizität unbekannt sein kann oder abhängig von anderen Bedingungen. Zweitens, ein automatisiertes, miniaturisiertes, stabiles und portables Format für einen Sensor der auf zellulären Funktionen basiert würde vorteilhaft sein, vergleichen mit dem augenblicklichen Stand der Technik, der große Mikroplatten um fasst, die von großen Roboter-Pipettiersystemen gefüllt werden und von großen Mikroskoplesegeräten gelesen werden.
Zusätzlich können andere Assayeigenschaften in die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung integriert werden, die in den Vorrichtungen des Standes der Technik nicht möglich sind, wie einfache Plastikmikroplatten. Beispielsweise kann eine Massenspektrometrie oder kapillarelektrophoretisch analytische Vorrichtung oder Systeme für DNA- und/oder Proteinanalyse in die vorliegende Vorrichtung integriert werden, um chemische und strukturelle Parameter der Testverbindungen zu messen. Diese Integration würde Informationen zur Verfügung stellen, die komplementär zu zellbasierten funktionellen Parametern, die durch ein HCS- oder HTS-System gemessen sind, sind. Bei herkömmlichen Mikroplatten sind solche zusätzlichen Assayfunktionen extern der Platte und erfordern deshalb extensive zusätzliche Ausrüstung für sowohl den Transfer von Proben von der Mikroplatte als auch für die analytische Ausstattung selbst. In dem miniaturisierten Format mit integrierten Flüssigkeiten wird die Probe intern zu einem mikroanalytischen System auf dem Chip oder auf einem intern verbundenen zweiten Chip gepumpt. Diese mikroanalytischen Chips werden die Kosten reduzieren und die Geschwindigkeit von zellbasierter Analyse dramatisch steigern. In diesem Zusammenhang wird erwartet, dass die Verbindung eines Lebendzell-analytischen Systems im Mikromaßstab mit einem chemisch-analytischen System im Mikromaßstab große Verbesserungen gegenüber existierenden Verfahren und Vorrichtungen zur Verfügung stellen werden.
Beispiel 4. Zellmusterung
Polymere und Glasoberflächen wurden in ihrer natürlichen Struktur als zelluläre Wachstumssubstrate für Jahrzehnte verwendet. Unterschiedliche Techniken wurden verwendet, um die Oberflächenchemie dieser Materialien einzustellen, um sie attraktiver für Zelladhäsion zu machen, einschließlich der Adsorption von Zelladhäsionsmolekülen; Sulfonisierung des Materials (europäische Patentanmeldung 576184); Co-Polymergemische von extrazellulären Matrixproteinfragmenten, wie RGD (U.S.-PS Nr. 5,733,538); und chemische Oxidation (unter Verwendung von Lösungschemie) der Oberfläche für weitere chemische Modifikation (unter Verwendung von Lösungschemie) (U.S.-PS Nr. 5,330,911), wie Silanen (U.S.-PS Nr. 5,077,085) oder Thiolen (U.S.-PS Nr. 5,776,748).
Zusätzlich zur Einstellung der Oberfläche dieser Substrate, um sie attraktiver für zelluläre Adhäsion zu machen, wurden Techniken entwickelt, um die Oberflächen abstoßend für zelluläre Adhäsion zu machen. Zellabstoßende Oberflächen wurden erreicht durch Verwendung von extrem hydrophoben Oberflächen (Kontaktwinkel >90°), die Zellabstoßung für mehrere Tage zeigen. (Dulcey et al., Science 252: 551 (1991)). Ein weiter verbreitet verwendetes Verfahren verwendet extrem hydrophile Oberflächen (Kontaktwinkel etwa 0°) durch Immobilisierung von Zuckern und sauerstoffreichen Gruppen auf der Oberfläche durch herkömmliche Verbindungschemie. Diese Oberflächen zeigen längere Perioden der Zellabstoßung vor dem Abbau und ermöglichen Zelladhäsion. Das am meisten verwendete Molekül zur Zellabstoßung ist das sauerstoffreiche Poly(ethylenglycol) (PEG). PEG kann an Polymere und Glassubstrate geheftet werden durch Verfahren einschließlich chemischer Aktivierung der Substrate, um mit einem Poly(ethylenimid)-PEG-Molekül zu reagieren (Brink, Colloids and Surfaces, 1992. 66: S. 149–156), Aminieren einer aktivierten Oberfläche und Reaktion dieser Oberfläche mit bifunktionalen elektrophilen Molekülen, wie PEG-Epoxid (Bergstrom, K., Journal of Biomedical Materials Research, 1992. 26: S. 779–790; WO 98/32466, EP0576184, Nilsson, D., in Methods in Enzymology, 1984, 104: S. 56–69; Sofia, S., Macromolecules, 1998. 31: S. 5059–5070) und fotochemisch durch fotolabile PEG-Konjugate, wie PEG-Benzophenon und PEG-Styrol Co-Polymergemischen (Becker, Makromolecular Chemistry, 1982. 3: S. 217–223; U.S.-PS Nr. 5,502,107).
Die bisher erwähnten Techniken führen zu Homo-Einzelschichten, die eine der zellanziehenden oder zellabstoßenden Gruppen enthalten. Eine Kombination der vorstehenden Technologien kann zu der Erzeugung von Hetero-Einzelschichten führen. Wenn die Positionierung dieser zelladhäsiven und zellabstoßenden Signalstoffe zu einem hohen Maße kontrolliert werden kann, können die Zellen auf einem Substrat der Wahl gemustert werden. Zellmusterung wurde erreicht auf Glas und metallisierten Glassubstraten unter Verwendung von Silanen (U.S.-PS Nr. 5,077,085), Thiolen (U.S.-PS Nr. 5,776,748) und Azidos (U.S.-PS Nr. 5,593,814). Diese Verfahren stellen selektive Lokalisierung von Zellen zur Verfügung unter Verwendung eines Vielschritt-, ausstattungsintensiven Verfahrens und/oder nichtreproduzierbaren Techniken, wie tiefe Ultraviolettabtragung von Molekülen und/oder Drucken durch mechanische Prägung und/oder Erforderung einer Polymerschicht von Dutzenden Nanometern (nm) in der Dicke, was die optische Qualität des Substrats verändert.
Somit besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf für erschwingliche, leichte, ausstattungsunempfindliche reproduzierbare Verfahren zur Zellmusterung auf dauerhaften Substraten, wie Glas und Plastik, das nicht die optische Qualität des Substrats verringert, genauso wie an Zellmusterungssubstraten selbst. Die meisten Oberflächenmodifikationsverfahren für Glas und Siliconscheiben sind nicht anwendbar auf Plastik aufgrund der Natur der starken verwendeten Lösungsmittel. Thiole sind ungeeignet zur Beschichtung von Plastik, da sie ein geprägtes Metall zur Bildung einer koordinierten Bindung mit dem Substrat erfordern. Obwohl Silane zugänglich zur Beschichtung auf Plastik sind, erfordern sie eine hydroxylierte Oberfläche, wie sie von Glas und Silicon gezeigt wird, um eine kovalente Brücke mit dem Substrat zu bilden.
Somit stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung neue Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur selektiven Zellmusterung zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren

a) Zur-Verfügung-Stellung eines Substrats mit einer Oberfläche, wobei die Oberfläche reaktive Hydroxylgruppen enthält;
b) In-Kontakt-Bringen der Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats mit einem bifunktionalen Molekül, das eine Hydroxy-reaktive Gruppe und eine nukleophile Gruppe umfasst, um eine Einzelschicht zu bilden;
c) Anbringen einer Schablone auf das Substrat;
d) Anbringen einer elektrophilen zellabstoßenden Gruppe auf exponierte Bereichen auf der Einzelschicht, um eine kovalente Bindung zwischen der zellabstoßenden Gruppe und dem bifunktionalen Nukleophil, das in Schritt b) hinterlegt wurde, zu bilden, um zellabstoßende Orte zu bilden;
e) Entfernen der Schablone; und
f) Anbringen zelladhäsiver Moleküle an das Substrat, um Zellbindeorte zu erzeugen, wobei die Zellbindemoleküle das Substrat nur an Orten bindet, die mit der Schablone in Kontakt waren.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren

a) Zur-Verfügung-Stellung eines Substrats mit einer Oberfläche, wobei die Oberfläche reaktive Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats umfasst;
b) In-Kontakt-Bringen der Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats mit einem bifunktionalen Molekül, das eine Hydroxy-reaktive Gruppe und eine nukleophile Gruppe umfasst, um eine Einzelschicht zu bilden;
c) Anbringen einer Schablone auf das Substrat;
d) Anbringen zelladhäsiver Moleküle auf exponierte Regionen auf der Einzelschicht, um Zellbindeorte zu erzeugen;
e) Entfernen der Schablone; und
f) Anbringen einer elektrophilen zellabstoßenden Gruppe an das Substrat, um zellabstoßende Orte zu erzeugen, wobei die zellabstoßende Gruppe eine kovalente Verbindung mit dem bifunktionalen Nukleophil bildet, das in Schritt b) nur an Orten hinterlegt wurde, die durch die Schablone kontaktiert waren.

Die oberflächenreaktiven Hydroxylgruppen können entweder natürlich vorkommen oder sie können durch jede Technik, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, eingeführt werden. Beispielsweise können Polymer oder Glas oxidiert werden, so dass sie Oberflächen-Hydroxylgruppen zeigen, die mit Organosilanen reagieren, um kovalente Si-O-Substrat (Siloxan)-Verbindungen zu erzeugen (U.S.-PS Nr. 5,077,085).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Oxidation durchgeführt durch Sauerstoffplasmabehandlung, die erreicht werden kann unter Verwendung von Sauerstoff-dotierter Hochfrequenz-Glimmentladung (oxygen doped radio frequency glow discharge). Diese Entladung wird durchgeführt mit einem Instrument, das geladene Partikel (Elektronen und positive Ionen) erzeugen kann, die mit dem Hintergrundgas (Sauerstoff) interagieren, um freie Radikale unter dem zeitlich variierenden elektrischen Feld der Hochfrequenz zu erzeugen. Die Probe wird in einen zylindrischen Reaktor gebracht, eine minimale Menge Sauerstoffgas wird eingeführt und geladene Partikel entwickeln sich zwischen den parallel angebrachten Elektroden, was in der Spaltung der O₂-Bindung resultiert. Nach dieser Spaltung können Freie Radikale hoher Energie sich selbst in das Polymerrückgrat inserieren, was in der Bildung von verschiedenen Sauerstoffgruppen, unter denen Hydroxylgruppen sind, resultiert (U.S.-PS Nr. 5,357,005; U.S.-PS Nr. 5,132,108).
Wie hier verwendet, umfasst das bifunktionale Molekül

(a) ein Hydroxyl-reaktives Elektrophil, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Silane, Carboxymethylgruppen, Succimide, Succimidylsuccinate, Benzotriazolcarbonate, Glycidylether (oder -epoxide), Oxycarbonylimidazole, p-Nitrophenylcarbonate, Aldehyde, Isocyanate und Tresylate; und
(b) ein Nukleophil (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Sulfhydrylgruppen, Amingruppen, Hydroxylgruppen oder Proteine oder Fragmente davon, Peptide und synthetische Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, wobei das Nucleophil an andere Moleküle und/oder Zellen binden kann.

In einer Ausführungsform umfasst das bifunktionale Molekül ein Organosilan, wobei das Silan das Elektrophil ist und das Nukleophil einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf Sulfhydrylgruppen, Amingruppen, Hydroxylgruppen oder Proteine, Peptide und synthetische Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, wobei das Nukleophil an andere Moleküle und/oder Zellen binden kann. Wie hier verwendet, fallen Organosilane in eine größere Klasse von Molekülen, die die Fähigkeit besitzen, selbstbildende (SA) Filme zu bilden. Die allgemeine Form dieser Moleküle umfasst R_nSiX_4–n, wobei n = 1, 2 oder 3; X = Cl, OCH₃ oder OC₂H_S und R das Nucleophil wie vorstehend beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das bifunktionale Molekül ein Aminosilan, wobei das Silan das Elektrophil ist, das an die Oberflächen-Hydroxylgruppen anheftet und eine Amingruppe ist das Nukleophil, das an andere Moleküle und/oder Zellen binden kann.
In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Aminosilan ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methoxy- oder Ethoxysilanen, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin, Trimethoxysilylethylendiamin, Aminopropyltriethoxysilan, Trimethoxyaminopropylsilan oder Chlorsilane, wie Trichlorsilylethylendiamin, Aminopropyltrichlorsilan. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Aminosilan Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin.
Wie hier verwendet, schließt ein zelladhäsives Molekül Verbindungen ein, die: (1) Ladungen einführen; und/oder (2) polar sind; und/oder (3) Schwefel und/oder Amine enthalten; und/oder (4) in der Lage sind, Zellen oder andere Zellbindegruppen zu verbinden, wie Proteine, Peptide und synthetische Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, wodurch ein Zellbindeort gebildet wird.
Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck zellabstoßende Gruppe Verbindungen ein, die in der Lage sind, direkt Zellbindung zu inhibieren, oder die an andere Gruppen binden, die Zellbindung an den Ort inhibieren, einschließlich Polyethylenglycol (PEG) und andere, sauerstoffreiche Verbindungen, Zucker, Hydrogele, extrem hydrophile Oberflächen oder extrem hydrophobe Oberflächen.
In all diesen Ausführungsformen können zelladhäsive Moleküle und/oder zellabstoßende Gruppen angewendet werden auf das Substrat durch Lösung oder Dampfphasenhinterlegung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Dampfhinterlegung des zelladhäsiven Moleküls und/oder der zellabstoßenden Gruppe verwendet. Dampfphasenhinterlegung von verschiedenen Silanen wurde beispielsweise gezeigt. (Tripp et al., Langmuir 8: 1120–1126 (1992); Moses et al., Analytical Chemistry 20: 4 1978). In den meisten Fällen wird eher eine hydroxylierte Oberfläche in Anwesenheit von verdampftem Silan gebracht (erhältlich durch herkömmliche Vakuumtechniken) als dass die Probe einer Lösung aus Silan zugegeben wird. Die Reaktion findet an der Oberfläche statt und resultiert in dem Selbstzusammenbau von Einzelschichten, ähnlich der Silanlösungshinterlegung.
Ein weiter Bereich zelladhäsiver Moleküle und zellabstoßender Gruppen kann verwendet werden mit Gasphasenhinterlegung, da kein Lösungsmittel benötigt wird. Viele Silanlösungsmittel würden beispielsweise das polymere Substrat lösen und seine optische Qualität zerstören. In dieser Ausführungsform umgeht das Verfahren die Verwendung von Lösungsmitteln insgesamt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die zellabstoßende Gruppe eine Amin-reaktive Gruppe, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid)-aktiviertes Polyethylenglycol (PEG), Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol oder jede andere Amin-reaktive extrem hydrophile Verbindung wie Zucker (Mannitol) oder PEG, in denen der Amin-reaktive Teil einschließen kann, jedoch nicht beschränkt ist auf Carboxymethylgruppen, Succinimide, Succinimidylsuccinate, Benzotriazolcarbonate, Glycidylether (oder -epoxide), Oxycarbonylimidazole, p-Nitrophenylcarbonate, Aldehyde, Isocyanate und Tresylate; oder jede Amin-reaktive extrem hydrophobe Verbindung, wie Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctylgruppen (13f), in denen der Amin-reaktive Teil einschließen kann, jedoch nicht beschränkt ist auf Carboxymethylgruppen, Succinimide, Succinimidylsuccinate, Benzotriazolcarbonate, Glycidylether (oder -epoxide), Oxycarbonylimidazole, p-Nitrophenylcarbonate, Aldehyde, Isocyanate und Tresylate. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amin-reaktive zellabstoßende Gruppe Tresylchlorid-aktiviertes Polyethylenglycol ("Tresylchlorid-aktiviertes PEG").
Die Chemie des Tresyl-aktivierten PEGs kann verwendet werden, um Oberflächen-Hydroxyl-Amin- oder Sulfhydrylgruppen zu regulieren. Tresylchlorid wird es ermöglichen, eine stabile Bindung zwischen dem Nucleophil und dem ursprünglichen Hydroxyl-, Amin- oder dem Sulfhydrylgruppen tragenden Kohlenstoff zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist PEG an eine Tresylgruppe zur Reaktion mit Oberflächen-Aminosilangruppen angeheftet.
In diesen bevorzugten Ausführungsformen können zelladhäsive Signalstoffe durch die Verwendung einer Schablone, die keine Größenbeschränkung besitzt, definiert werden. Zellabstoßende Signalstoffe, die auch definiert werden können durch die Schablone, werden an eine Aminosilaneinzelschicht gebunden. Die Zellbindeorte können optional mit zelladhäsiven Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden überschichtet werden und mit Zellen besät werden, was in einem gemusterten Array von Zellen resultiert.
Dieses hydroxylierte Substrat wird in Kontakt gebracht mit einem bifunktionalen Molekül, das ein Elektrophil und ein Nucleophil umfasst. Dieses modifizierte Substrat wird in Kontakt gebracht mit einem texturierten elastomeren Substrat (hier bezeichnet als "Schablone"), wie Gummi, Polyurethane und Poly(dimethyl)siloxane ("PDMS"), um einen hermetischen Verschluss zwischen definierten Regionen der Schablone und dem modifizierten Substrat zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Schablone PDMS. Diese Materialien sind gut erschwinglich, stellen einen signifikanten Nutzen gegenüber herkömmlicher UV-Fotolithografieverfahren, die eine teure Hochenergielaservorrichtung verwenden, zur Verfügung (U.S.-PS Nr. 5,077,085).
Die Schablone umfasst eine physikalische Maske, die physikalischen Schutz ermöglicht von definierten Regionen des darunter liegenden Substrats vor einer nachfolgenden Lösung oder einer Dampfphasenhinterlegung von der zellabstoßenden oder zelladhäsiven Gruppe. Das offenbarte Verfahren zur Verwendung einer "physikalischen Maske" unterscheidet sich selbst von dem existierenden Fachwissen, das auf der Verwendung einer "optischen Maske" beruht (Dulcey et al., Science 252: 551 (1991) und U.S.-PS Nr. 5,965,305 und 5,391,463) oder "Kontaktprägung" (U.S.-PS Nr. 5,512, 131 und 5,776,748). Die Verwendung von optischen Masken zum Schutz oder zur Deprotektion definierter Regionen eines Substrats ist auf die Verwendung von fotoaktivierbaren Chemikalien und/oder fotolabilen Molekülen beschränkt. Die Verwendung von "Kontaktprägung" ist beschränkt auf den Lösoungsphasentransfer von Materialien auf eine Oberfläche, während kein "Schutz" oder keine "Deprotektion" von definierten Regionen auf der Oberfläche ermöglicht wird. Weiterhin ermöglicht Kontaktprägung nicht den reproduzierbaren Transfer von kontrollierten Mengen des Materials auf die Oberfläche. Die Verwendung einer "Schablone", wie in dieser Erfindung offenbart, ermöglicht den Schutz einer Region des Substrats, um Modifikation von ungeschützten Regionen mit Lösung oder Gasphasenchemie, nicht beschränkt auf fotoreaktive/fotolabile Moleküle, zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen bestimmten Typ von Substrat beschränkt. Die Verbindungschemie der primären Einzelschicht oder das Organosilan ist so, dass es mit O- berflächenhydroxylgruppen reagiert. Diese Hydroxylgruppen können in die Oberfläche von annähernd jedem Plastik und Glas durch Plasmabehandlung bei geringer Temperatur eingeführt werden. Die sekundäre Verbindungschemie, Tresylchemie, kann reagieren mit Oberflächenaminen, Hydroxyl und Sulfhydrylen, was es ermöglicht, an einen breiteren Array von Oberflächenchemie anzuheften. Die gewünschte Wirkung ist auch erreichbar mit Oberflächenhydroxylgruppen in hoher Dichte (was jede Silanbehandlung eliminieren kann). (Dust, Macromolecules, 1990. 23: 3742–3746; U.S.-PS Nr. 5,330,911). All diese Vorzüge machen das offenbarte Verfahren zur Musterung auf Glas und Plastik erschwinglich, leicht und genau.
Die gutartige Natur der verwendeten Chemie macht es attraktiv für biologische Anwendungen, was es ermöglicht, den Array auf Glas und jedem Thermoplasten und Duroplasten der Wahl herzustellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Poly(styrol), Poly(olefin), Poly(dimethyl)siloxan (PDMS), Poly(carbonat), Poly(vinyl)chlorid, Poly(ethylen), Poly(ethylen)teraphthalat, Teflon und fluoriniertes Ethylenco-poly(propylen) (FEP). Die vorliegenden Verfahren haben die Bequemlichkeit und Flexibilität, auf Polymere und Glassubstrate angewendet zu werden unter Verwendung des gleichen Verfahrens. Plastik, wie Poly(styrol), Acryle und Poly(olefin) haben Vorzüge gegenüber Glas, Keramik und Metall aufgrund ihrer Erschwinglichkeit, Flexibilität der Form und Größe, der Bequemlichkeit des Einbaus, der Beständigkeit, der geringen Kosten und der Kontrolle über ihre optische Qualität. Diese Plastikarten sind leicht erhältlich bei minimalen Kosten, können in fast jede denkbare Form gepresst werden und sind dauerhaft.
Die vorliegenden Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur selektiven Zellmusterung sind reproduzierbarer als Verfahren, die Kontaktdrucken verwenden, da es weniger Möglichkeiten für Benutzerfehler gibt. Es besteht eine Benutzerabhängigkeit beim Kontaktdrucken aufgrund der Subjektivität der Anwendung des Stempels auf das Substrat (Kraft, durch die der Stempel herabgedrückt wird, Menge der Lösung auf dem Stempel) und somit werden die Resultate variieren (U.S.-PS Nr. 5,776,748). Das vorliegende Verfahren zur Verwendung einer Schablone zur Maskierung während Lösungs- oder Dampfphasenhinterlegung der zelladhäsiven Moleküle und/oder der zellabstoßenden Gruppen unabhängig durchgeführt wird ist Benutzer unabhängig, somit wird ein skalierbares und herstellbares Verfahren zur Verfügung gestellt.
Das hier offenbarte Verfahren der Zellmusterung besitzt bemerkenswerte Vorteile gegenüber früherer Thiolchemie. Die frühere Technologie des Kontaktdruckens mit Thiolen führt nicht nur Benutzerfehler ein, sondern erfordert auch eine dünne Schicht von Gold, die auf der O berfläche des Zellkultursubstrats aufgedampft wird. Aufgrund der hohen Temperaturen, die mit der Goldverdampfung verbunden sind, können die meisten Plastikarten nicht verwendet werden. Die optische Qualität ist begrenzt und Fluoreszenzlicht wird aufgrund der zusätzlichen Goldschicht absorbiert, was die Qualität der Information, die erhalten wird, wenn zellbasiertes Screening durchgeführt wird, reduziert. Zusätzlich zu einer geringeren optischen Qualität sind hohe Kosten mit der Goldbeschichtung verbunden. Weiterhin sind Silanverbindungen kovalent und sind nicht Gegenstand der Degradation, wie es Thiole auf Gold sind, die über die Zeit aufgrund von Unreinheiten und aufgrund der Tatsache, dass eine Thiolbindung koordiniert ist und nicht kovalent ist, degradieren. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen Zellmusterung auf einem optisch klaren Substrat und geben die zusätzliche Möglichkeit der Kontrolle über das Substrat, so dass man die Freiheit hat, das am überlegendste erhältliche Plastik oder Glas für optische Qualität zu wählen.
In einer bestimmten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird Sauerstoffplasma verwendet, um die Oberfläche im Fall von Poly(styrol) und Poly(olefin) zu aktivieren und Säurewaschung wird verwendet, um die Oberfläche im Fall von Glas zu aktivieren. Beide Oberflächen können weiterhin mit einer milden sauren alkoholischen Lösung aus Aminosilan inkubiert werden, das ein primäres Amin am terminierenden Ende des gebundenen Moleküls aufweist. Nach Silanbehandlung wird eine Schablone auf das Substrat gebracht. Eine wässrige Lösung aus Tresylchlorid-aktiviertem PEG wird zugesetzt zu dem Substrat, um die Schablone, was in Bereichen exponierter Amine und Regionen von PEG in vorsichtig kontrollierter Nähe zueinander resultiert. Nach der Oberflächenmodifikation kann die Oberfläche mit zelladhäsiven Proteinen, Proteinfragmenten oder Peptiden geprimt werden, um den Zelladhäsionsprozess zu beschleunigen (U.S.-PS Nr. 5,874,219).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue gemusterte Substrate zur Zellkultur zur Verfügung. In einem Aspekt stellt die Erfindung Zellmusterungssubstrate zur Verfügung, umfassend:

1. wenigstens einen ersten Teil, der eine reaktive Oberfläche besitzt, an die eine Vielzahl von zelladhäsiven Molekülen gekoppelt ist;
2. und wenigstens einen zweiten Teil, der eine exponierte Oberfläche besitzt, an die eine Vielzahl von zellabstoßenden Gruppen gekoppelt ist; wobei die zelladhäsiven Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Silanen, und wobei die zellabstoßenden Gruppen Tresylchlorid-aktiviertes Poly(ethylen)glycolumfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Silan R_nSiX_4–n wobei n = 1, 2 oder 3; X = Cl, OCH₃ oder OC₂H₅ ist; R = ein Nucleophil ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Sulfhydrylgruppen, Amingruppen, Hydroxylgruppen, geladene Gruppen, polare Gruppen oder Proteine, Proteinfragmente, Peptide und synthetische Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, wobei das Nucleophil an andere Moleküle und/oder Zellen binden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Silan ein Aminosilan. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Aminosilan ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methoxy- oder Ethoxysilanen, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin, Trimethoxysilylethylendiamin, Aminopropyltriethoxysilan, Trimethoxyaminopropyl-silan oder Chlorsilane, wie Trichlorsilylethylendiamin, Aminopropyltrichlorsilan. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Substrat weiterhin zelladhäsive Proteine, Proteinfragmente oder Peptide, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Fibronectin, Laminin, Collagen, Vitronectin, Osteopontin, RGD-Peptide, RGDS-Peptide, YIGSR-Peptide. Die Stärke der Zelladhäsion an Zelladhäsionspromotoren kann modifiziert werden durch Variieren der Zusammensetzung der zelladhäsiven Proteine, Proteinfragmente oder Peptide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Substrat weiterhin Zellen, die an die Zellbindeorte gebunden sind, entweder direkt oder indirekt über zelladhäsive Proteine, Proteinfragmente oder Peptide. Jeder Zelltyp kann verwendet werden, einschließlich prokaryotischer, eukaryotischer und archäbakterieller Zellen.
Die Zellbindeorte gemäß den verschiedenen Verfahren und Substraten der Erfindung können so klein sein wie der Durchmesser einer Einzelzelle und so groß sein wie verschiedene hundert Zelldurchmesser. Der Abstand zwischen Zellbindeorten (d. h. die zellabstoßenden Orte) ist zellgrößenabhängig, ist jedoch ausreichend groß, so dass eine Zelle nicht den Abstand zwischen Zellbindeorten überbrücken kann (d. h. einen Zelldurchmesser), wenn nicht eine bestimmte Anwendung Interaktion von Zellen in verschiedenen Zellbindeorten erfordert.
In einer weiteren Ausführungsform werden die verschiedenen Zellmusterungssubstrate mit einem Flüssigkeitslieferungssystem in Verbindung gebracht, um Flüssigkeit und/oder Reagensfluss zu dem Zellbindeort zur Verfügung zu stellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Flüssigkeitsliefersystem das hier beschriebene.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Zellmusterungssubstrat ein Zellmusterungssubstrat, hergestellt durch die erfindungsgemäßen Verfahren, wie vorstehend offenbart.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung kann besser verstanden werden mit Bezugnahme auf die begleitenden bevorzugten Ausführungsformen, die nur zu illustrativen Zwecken gedacht sind und nicht ausgelegt werden sollten, um den Rahmen der Erfindung, wie durch die hier angehängten Ansprüche definiert, zu beschränken.
Materialien und Verfahren:
Reagenzien und Ausstattung, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf 60 und 35 mm Petrischalen, Mikroplatten, Thermoplasten, Poly(olefin), Plasmareiniger/-Sterilisator, digitale Konvektionsanzeiger, Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin und 2,2,2-Trifluorethansylphonylpoly(ethylen)₅₀₀₀-glycol.
Poly(styrol), Poly(olefin) oder andere Thermoplastsubstrate wie Poly(ester) und Poly(ether) werden Sauerstoffplasma-behandelt innerhalb eines Plasmareinigers unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Die Substrate werden in die Glasröhrchenkammer gebracht und die Kammer wird evakuiert zu einem Druck von ∼200 mTorr (1 Torr = 133,3 Pa), wie angezeigt durch eine Konvektionsanzeige. Sauerstoff wird durch ein Regulationsventil gepulst und die Kammer wird wieder evakuiert bis auf einen Druck von ∼200 mTorr. Der vorstehende Sauerstoffpuls wird 2 weitere Male wiederholt. Nach dem letzten Sauerstoffpuls wird es dem Gas ermöglicht, konstant aus der Kammer zu entweichen und der endgültige Äquilibrierungsdruck (mit dem Sauerstoffentlassungsventil an und der aktivierten Vakuumpumpe) sollte ∼300 mTorr sein. Nachdem der geeignete Druck erreicht wird, wird der Spannungsschalter bis auf HI (100 W) geschaltet und die Substrate werden für 25 Minuten behandelt.
Glasoberflächen werden aktiviert unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Eine 1 M KOH-Lösung wird hergestellt in doppelt destilliertem/deionisiertem (DI)-Wasser. Die Glasoberflächen werden inkubiert für 10 Minuten in 1 M KOH. Nach 10 Minuten werden die Substrate 3 mal in doppeltem DI-Wasser gespült. Deckgläschen werden in HCl : MeOH (1 : 1) für 30 Minuten getaucht. Nach der Inkubation werden die Deckgläschen in doppeltem DI-Wasser gespült und in ein konzentriertes Bad Schwefelsäure für 30 Minuten transferiert, gefolgt von 3 Spülungen mit doppeltem DI-Wasser. Die Deckgläschen werden dann in destilliertem Wasser für 15 Minuten gekocht und die Oberflächen werden mit einer Stickstoffpistole trockengeblasen.
Die Aminosilanbehandlung ist die gleiche für Glas, Poly(styrol) und Poly(olefin). Eine 1%-ige Lösung von Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin wird hergestellt in mildsaurem Methanol (94% Methanol, 5% Wasser und 0,004% Eisessigsäure) und inkubiert mit den Substraten für 15 Minuten. Nach der Silanbehandlung werden die Substrate gespült mit Methanol und in einem 80°C-Ofen für 30 Minuten gebacken.
Die PDMS-Schablone wird aufgelegt auf das aminierte Glas oder Poly(styrol) (diese Ausführungsform schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf 50, 100, 200 Mikrometer und 500 Mikrometer Orten). Druck wird angelegt, bis die Schablone einen festen Verschluss herstellt.
Die Tresyl-PEG-Behandlung ist die gleiche für Glas und Poly(styrol). Nach Aufbringung der Schablone wird eine 0,12 M Natriumbicarbonatlösung in Wasser hergestellt. Eine 25%-ige Lösung von Tresyl-PEG (nach Gewicht) wird in dem Bicarbonat hergestellt. Die Lösung wird aufgebracht um die Schablone und es wird ihr ermöglicht, sich um die PDMS zu sammeln, was darin resultiert, dass die Flüssigkeit nur exponierte aminierte Oberflächenbereiche berührt. Die Substrate werden für 4 Stunden inkubiert.
Nach PEG-Behandlung werden die Oberflächen mit 0,12 M Natriumbicarbonatlösung gespült. Den Substraten wird es ermöglicht, für 2 Stunden zu inkubieren und dann werden sie unter einem Strom PBS gespült. Die Substrate ("teilweise aktiv") können für mehr als 30 Tage in einer trockenen Schachtel gelagert werden vor Proteinbeschichtung und Zellinkubation.
Wie hier verwendet, sind die "teilweise aktiven" Substrate Glas- oder Plastiksubstrate, die chemisch und/oder strukturell modifiziert sind, um einen gemusterten Array von Proteinbindeorten, getrennt durch zytophobe Bereiche, zu erhalten.
Proteinbeschichtung

1. Die teilweise aktiven Substrate werden inkubiert in einer Protein-, Proteinfragment- oder Peptidlösung, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Fibronectin, Laminin, Collagen, Vitronectin, Osteopontin oder Fragmenten davon, genauso wie RGD-Peptiden, RGDS-Peptiden, YIGSR-Peptiden bei Konzentrationen im Bereich von 1 μg/ml bis 25 μg/ml für 1–2 Stunden.
2. Nach der Inkubation werden die Substrate in einem Strom PBS gespült.
3. Die Protein/Peptid-beschichteten Substrate werden lyophylisiert, um die Protein/Peptidstruktur zu konservieren. Diese "quasiaktiven" Substrate können in einer trockenen Schachtel für mehr als 30 Tage gelagert werden. Die Silanverbindungen sind kovalent und keiner Degradation unterworfen, wie es die Thiole auf Gold sind, die über die Zeit aufgrund von Unreinheiten und der Tatsache, dass Thiolbindungen koordiniert sind und nicht kovalent sind, degradieren. Wie hier verwendet, sind "quasiaktive" Substrate Glas- oder Plastiksubstrate, die chemisch und/oder strukturell modifiziert sind, um einen gemusterten Array von Proteinen oder proteinreichen Bereichen, getrennt durch zytophobe Bereiche, zu erreichen.

Zellaussaat

1. Zellen werden hergestellt zum Aussäen durch Standardtechniken.
2. Teilweise aktive oder quasiaktive Substrate werden re-hydriert in Zellkulturmedium für 5 Minuten.
3. Die Zellen werden inkubiert bei jeder gewünschten Saatdichte mit dem teilweise oder quasiaktiven Substrat für 30 Minuten bis 2 Stunden (abhängig von dem Zelltyp) in Voll-Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO₂.
4. Die "vollaktiven" Substrate, die mit Zellen angeordnet sind, können dann verwendet werden für Zellscreeningassays. Nach Kryopräservation oder Raumtemperaturtrocknung können die vollaktiven Substrate für lange Zeit gelagert werden. Wie hier verwendet, sind "vollaktive Substrate" Glas- oder Plastiksubstrate, die chemisch und/oder strukturell modifiziert sind, um einen gemusterten Array von Zellen, getrennt durch zytophobe Bereiche, zu erhalten. Sie können abgeleitet sein von entweder teilweise oder quasiaktiven Substraten, obwohl die Verwendung von quasiaktiven Substraten bevorzugt ist.

Beispiel 5. Gemusterte Stammzelle und differenzierte Zellsubstrate
Stammzellen besitzen die intrinsische Eigenschaft: (1) Zellerneuerung zu durchlaufen oder (2) differenzierte Nachkommen zu erzeugen. Extrinsische Faktoren (Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, physikochemische Signalstoffe von umgebendem zellulären Milieu) vermitteln das entwicklungsgemäße Schicksal von Stammzellen. Gewebespezifische Stammzellen, auch determinierte Stammzellen genannt, zeigen auch Pluripotenz, jedoch keine Totipotenz. Determinierte Stammzellen besitzen die Fähigkeit, eine primäre, teilweise festgelegte Zelle anzusteuern, die entweder zur Selbstreplikation in Kultur gebracht werden kann oder selektiv in eine Vielzahl von gewebespezifischen Nachkommen differenziert werden kann, die in vitro nah, genotypisch und phänotypisch zu dem Gesamtorganismus sind, im Gegensatz zu immortalisierten Zellen, die sowohl genotypisch als auch phänotypisch weit entfernt von ihren Vorläuferzellen in dem Organismus sind.
Die pharmakologische Relevanz der Verwendung von Stammzell-abgeleiteten gewebespezifischen Nachkommen oder immortalisierten Zellen resultiert aus dem genotypischen und phänotypischen Passen, das von den ersten gefordert wird. Wenn eine neue chemische Verbindung als "aktiv" in einem primären Arzneimittelscreen identifiziert wurde, muss sie zahlreiche Tests durchlaufen, die dazu ausgelegt sind, ihr pharmakologisches Profil zu bestimmen. Anzeichen der Biorelevanz, wie Zytotoxizität, Bioverfügbarkeit und Spezifität werden zusammen ausgewertet mit der Potenz, dieses Profil zu erzeugen und erfordern die Verwendung von Zellen, die genotypisch und phänotypisch zu dem Organismus passen. Dies steigert die Wahrscheinlichkeit, dass die Verbindung therapeutisch bedeutsam sein wird, wenn es in die Klinik geht, nach dem Stadium der Tierversuche. Die Verwendung von primären Zellen (Hepatozyten, Neuronen, Chondrozyten, Myozyten, Adipozyten) ist gut dokumentiert in sekundären und tertiären Tests. Allerdings bleibt die Schwierigkeit in der Erhaltung der geeigneten Zellen (Zugang und Menge) und der Kultivierung von ihnen in ausreichender Qualität, um die Kapazität von Assays abzudecken, ein Hauptproblem. Die Verwendung von Stammzell-abgeleiteten primären Zellen kann eine Lösung sowohl für höhere Relevanz als auch als Quelle von primären Zellen bieten.
Unsere Arbeit hat sich auf die Produktion von räumlich orientierten neo-vaskulären Kapillaren von endothelialen Zellen konzentriert, die an Zelladhäsionspromotoren gebunden sind, die auf einem Substrat gemustert sind (Rudolph et al., U.S.-PS Nr. 5,721,131). Allerdings erhielt das resultierende Substrat nur einen einzelnen Typ differenzierter Zellen, da dieses Verfahren nicht die individuelle Ansteuerung von Zellbindeorten mit differenzierenden Reagenzien erlaubt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung gemusterter Zellsubstrate zur Verfügung, umfassend eine Vielzahl von ausdifferenzierten Zellen von einem geordneten Array von Stammzellen, genauso wie die Substrate selbst. Die Verwendung von diesen gemusterten Zellsubstraten für Arzneimittelentdeckung steigert das Niveau der Zuverlässigkeit und Relevanz von in vitro pharmakologischen Screeningdaten zur Extrapolation in in vivo Studien.
Die Verfahren und Substrate der vorliegenden Erfindung ahmen Ereignisse in der Entwicklungsbiologie nach: Bildung von festgelegter Reife oder ausdifferenzierten Zellen von Stammzellen unter Verwendung von kontrollierter Lieferung von Differenzierungsfaktoren (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf extrazelluläre Matrix (ECM), derivatisierte Substrate, autokrine/parakrine/endokrine Faktoren, usw.). Frühere Technologie lehrt die Induktion von zellulärer Heterogenität durch "Pfefferung" (peppering) einer Zellsubstratoberfläche mit einer Vielzahl von zelladhäsiven Bereichen, die selektive Adhäsion von einem oder mehreren immortalisierten, genotypisch und phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen einer Lösung ermöglichen. Die begrenzte Anzahl von "zellspezifischen zelladhäsiven Gruppen" beschränkt die Anzahl von verschiedener Zelltypen, die auf einem einzelnen Substrat erreicht werden können. Die frühere Technologie zieht keinen Nutzen aus der intrinsischen Fähigkeit von Stammzellen, in eine Vielzahl von differenzierten Nachkommen zu differenzieren.
Im Gegensatz dazu lehrt die vorliegende Erfindung die Induktion von zellulärer Heterogenität auf jedem Substrat der Wahl (Keramiken, Metalle, Polymere, Zusammensetzungen, usw.) durch die kontrollierte Differenzierung von Populationen) von Stammzellen in eine Vielzahl von differenzierten Zellen. Die kontrollierte Differenzierung ermöglicht die Erzeugung von "Mustern gemischter Zelltypen" in jeder Anzahl von Variationen und Geometrie. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Erzeugung von organspezifischen und gewebespezifischen Zellsubstraten, die nahe in genotypischer und phänotypischer Relevanz zu dem Organismus der Wahl sind, genauso wie Substrate, die in vivo Interaktionen zwischen gewebespezifischen und/oder organspezifischen Zellen modellieren. Dies ermöglicht die Erzeugung einer zellbasierten Screeningplattform, die in der Lage ist, Information mit größerer Relevanz für den Organismus oder die systemische Ebene zur Verfügung zu stellen.
Die Herstellung von Zellsubstrat der vorliegenden Erfindung erfordert die Zur-Verfügung-Stellung eines gemusterten Stammzellsubstrats, umfassend:

(a) eine Substratoberfläche;
(b) eine Vielzahl von Zellbindeorten auf der Oberfläche, wobei ein Zellbindeort umfasst:
(1) ein oder mehrere zelladhäsive Moleküle; und
(2) eine Vielzahl von Stammzellen, gebunden an die zelladhäsiven Moleküle; und
(c) eine Vielzahl von zellabstoßenden Orten auf der Oberfläche, wobei die zellabstoßenden Orte eine zellabstoßende Gruppe umfassen, wobei individuelle Zellbindeorte getrennt sind durch zellabstoßende Orte.

Ein Einzeltyp oder multiple Typen von Stammzellen sind an die Zellbindeorte in einem gemusterten Array gebunden. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "gemustertes Stammzellsubstrat", dass die Stammzellen auf dem Substrat in einem kontrollierten Muster angeordnet sind. Die Stammzellen können eine Einzelklasse von Stammzellen umfassen oder können multiple Stammzelltypen umfassen, in diesem Fall ist die Positionierung der verschiedenen Stammzelltypen auch kontrolliert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Stammzellen" auf jeden Zelltyp, der die Fähigkeit besitzt, wenigstens einen Typ differenzierter Nachkommen zu erzeugen. An sich schließen Stammzellen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Zellen, die in der Lage sind in jeden Zelltyp zu differenzieren und sich selbst zu erneuern (pluripotente Zellen); Zellen, die in der Lage sind, in jeden Zelltyp zu differenzieren, die sich jedoch nicht selbst erneuern (totipotente Zellen); Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und in viele Zelltypen zu differenzieren (breites Potential; multipotente Stammzellen); Zellen, die in der Lage sind, sich eingeschränkt selbst zu erneuern und in eingeschränkte Typen von Zellen zu differenzieren (Vorläuferzellen); und Zellen, die begonnen haben, sich in einen spezifischen Zelltyp zu differenzieren, jedoch noch nicht vollständig differenziert sind (festgelegte Vorläuferzellen) (Vergleiche zum Beispiel Gage et al., Science 287;1433.1438 (2000). In verschiedenen Ausführungsformen sind die Stammzellen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus neuralen Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen, glialen Vorläuferzellen, mesenchymalen Stammzellen, hämatopoetischen Stammzellen, epithelialen Stammzellen, hepatischen Stammzellen, embryonalen Stammzellen oder Kombinationen davon. Literaturstellen für spezifische Klassen von Stammzellen werden nachstehend zur Verfügung gestellt:
Hepatische Stammzellen sind rezensiert in Thorgeirsson, FASEB J. 10: 1249 (1996). Beispiele hepatischer Stammzellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf SEC-Zellen, ovale Zellen genauso wie kultivierte WB-F344-Zellen, L2039-Zellen und RLEΦ13-Zellen (Coleman et al., Am. J. Pathol. 151: 353 (1997); Omori et al., Hepatology 26: 720 (1997); Fiorino et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34: 247–258 (1998); Agelli et al., Histochem. J. 29: 205–217 (1997); Brill et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 261–269 (1993)).
Neurale Stamm- und Vorläuferzellen: Beispiele neuraler Stamm- und Vorläuferzellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf NT-2-Zellen (Pleasure et al., J. Neuroscience 12: 1802–1815 (1992)) und die, die in Gage, Science 287: 1433–1438 (2000); Gritti et al., J. of Neuroscience 16: 1091–1100 (1996); Frederiksen et al., Neuron 1: 439 (1988); Reynolds and Weiss, Science 255: 1707 (1992); Davis und Temple, Nature 372: 263 (1994); MeKay, Science 276: 66–71 (1997); Vicario-Abejon et al., Neuron 15: 105 (1995); Johe et al., Genes and Develop. 10: 3129–3142 (1996); und U.S.-PS Nr. 5,824,489; 6,001,654; 6,033,906) beschrieben sind.
Gliale Vorläuferzellen: Beispiele glialer Vorläuferzellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf SNB-19-Zellen und Oligodendrocyten, die in vitro differenziert werden können (Raible et al., J. Neurosci. Res. 34: 287–294 (1993); (Welch et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 31: 610–616 (1995).
Mesenchymale Stammzellen sind pluripotente Vorläuferzellen, die die Fähigkeit besitzen, in eine Vielzahl von mesenchymalen Geweben zu differenzieren, einschließlich Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskel, Knochenmarkstroma, Fett und Haut. Diese Stammzellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf C2C12-Zellen (Teboul et al., J. Biol. Chem. 270: 28183–28187 (1995); Nishimura et al., J. Biol. Chem. 273: 1872–1879 (1998); und Zellen, wie diejenigen, die beschrieben sind in U.S.-PS Nr. 5,486,359; 5,827,740; 5,942,225; 6,022,540.
Hämatopoetische Stammzellen beziehen sich alle hämatopoetischen pluripotenten Vorläuferzellen, die in der Lage sind, eine Vielzahl von differenzierten hämatopoetischen Zelltypen zur Folge zu haben. Zelltypen nach dieser Definition schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf CD34⁺ mononukleare Knochenmark-Zellen (BMMC) (Berardi et al., Blood 86: 2123–2129, 1995), PBSC (Fritsch et al., Bone Marrow Transplantation 17: 169–178, 1996), Pflastersteinbereich-bildende Zellen (CAFC) (Lemieux et al., Blood 86: 1339–1347 (1995) und 5-FU BM-Zellen (Alcorn und Holyoake, Blood Reviews 10: 167–176, 1996); U.S.-PS Nr. 5,807,744).
Epitheliale Stammzellen bezieht sich auf Zellen, die langlebend sind, relativ undifferenziert und ein großes Potenzial zur Zellteilung besitzen und die letztendlich verantwortlich sind für die Homeostase von Epithelium. Zellen dieses Typs schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die, die in U.S.-PS Nr. 5,556,783; U.S.-PS Nr. 5,423,778; Rochat et al., Cell 76: 1063 (1994); Jones et al. Cell 73: 713 (1993); Jones et al., Cell 80: 83 (1995) und Slack, Science 287: 1431–1433 (2000) beschrieben sind.
Die zelladhäsiven Moleküle dieses Aspekts der Erfindung können jede Verbindung umfassen, die in der Lage ist, Stammzelladhäsion an das Substrat zu unterstützen, wie die vorstehend beschriebenen, einschließlich Zelladhäsionsmolekülen, Co-Polymergemischen von extrazellulären Matrixproteinen oder Proteinfragmenten, wie RGD enthaltende Peptide, Silane oder Thiole. In einer Ausführungsform werden Aminosilane, wie Methoxy- oder Ethoxysilane wie vorstehend beschrieben verwendet.
Die zellabstoßenden Gruppen umfassen Gruppen, die in der Lage sind, direkt Zellbindung zu inhibieren oder die an andere Gruppen binden, die Zellbindung an die zellabstoßenden Orte inhibieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Polyethylenglycol (PEG) und andere sauerstoffreiche Verbindungen, Zucker, Hydrogele, extrem hydrophile Oberflächen oder extrem hydrophobe Oberflächen, wie vorstehend beschrieben.
Die zellbindenden Orte können auch Inhibitoren der unkontrollierten Differenzierung von Stammzellen umfassen, die jede Verbindung umfassen können, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, um unkontrollierte Stammzelldifferenzierung zu verhindern. Solche Verbindungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf selbstzusammenbauende Einzelschichten von Thiolen oder Silanen, gekoppelt an zelladhäsive Liganden, die verwendet werden, um die Erzeugung von Zellbindeorten zu ermöglichen, während ihre unkontrollierte Differenzierung verhindert wird.
Ein weiteres Beispiel ist der Zusatz von Proteasethrombin zu Kulturen von Neuro2A-Neuroblastomzelllinie, was die Differenzierung von Zellen in Neuriten-enthaltende neuronale Zellen inhibiert. (Gurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci 85: 3440–3444 (1988). Somit kann der Zellbindepromotor auch als ein Inhibitor unkontrollierter Differenzierung dienen. Alternativ werden die Zellbindeorte mit einer Feederschicht von Zellen bedeckt, um unkontrollierte Stammzelldifferenzierung zu inhibieren.
Das Substrat dieses erfindungsgemäßen Aspekts kann hergestellt werden aus jedem Material, das im Fachgebiet bekannt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Plastik, Glas, Keramiken und Metalle. Vorzugsweise werden solche gemusterten Substrate auf kommerziell erhältlichen Plastiksubstraten, wie Polystyrol oder Poly(olefin) hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die Substrate 100 μm – 500 μm Durchmesser kreisförmige Zellbindeorte, getrennt durch einen Abstand von Kante zu Kante im Bereich von 25 μm bis 125 μm. Die Gesamtbasisfläche der Substrate wird zu den Mikroplattenformaten von 96, 384 und 1536 Vertiefungen passen und kann etwa 150-fach kleiner im Oberflächenbereich sein, verglichen mit 1536 (32 Zeilen × 48 Spalten), 384 (16 Zeilen × 24 Spalten) und 96 Vertiefungen (8 Zeilen × 12 Spalten) Mikroplatten sein.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein gemustertes differenziertes Zellsubstrat zur Verfügung, umfassend:

(a) eine Substratoberfläche;
(b) eine erste Vielzahl von Zellbindeorten auf der Oberfläche, umfassend:
(i) ein oder mehrere zelladhäsive Moleküle; und
(ii) einen ersten differenzierten Zelltyp;
(c) eine zweite Vielzahl von Zellbindeorten auf der Oberfläche, umfassend:
(i) ein oder mehrere zelladhäsive Moleküle;
(ii) einen zweiten differenzierten Zelltyp; wobei die ersten und zweiten differenzierte Zelltypen auf dem Substrat in einem kontrollierten Muster angeordnet ist; und
(d) eine Vielzahl von zellabstoßenden Orten auf der Oberfläche, wobei die zellabstoßenden Orte eine zellabstoßende Gruppe umfassen, wobei individuelle Zellbindeorte durch zellabstoßende Orte getrennt sind.

Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "gemustertes differenziertes Zellsubstrat", dass die differenzierten Zellen auf dem Substrat in einer kontrollierten Weise angeordnet sind, wobei die Enddifferenzierung durch Nachmusterung erreicht wird.
In einer Ausführungsform sind die differenzierten Zellen abgeleitet von Stammzellen, die selektiv auf dem Substrat differenziert wurden. In dieser Ausführungsform ist der Stammzelltyp ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus neuralen Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen, glialen Vorläuferzellen, mesenchymalen Stammzellen, hämatopoetischen Stammzellen, epithelialen Stammzellen, hepatischen Stammzellen, embryonalen Stammzellen, oder Kombinationen davon. Alternativ kann die Differenzierung vor der Plattierung der Zellen auf das Substrat initiiert werden (festgelegte Vorläuferzellen). Der Fachmann auf dem Gebiet ist in der Lage, sich viele Veränderungen dieser Ausführungsform auszumalen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden:

1. Selektive Differenzierung eines einzelnen Stammzelltyps in zwei oder mehrere differenzierte Zelltypen in vorbestimmten Orten auf einem Einzelsubstrat.
2. Selektive Differenzierung von zwei oder mehr Stammzelltypen, die auf einem Einzelsubstrat angeordnet sind, um zwei oder mehr differenzierte Zelltypen zu erzeugen.
3. Sequentielle, selektive Differenzierung eines einzelnen oder multipler Stammzelltyps, wobei ein einzeln differenzierter Zelltyp zunächst produziert wird, gefolgt von selektiver Differenzierung des (der) Stammzelltyp(en) in anderen Zellbindeorten.

Somit resultiert die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform in einem Substrat mit multiplen Typen von differenzierten Zelltypen, angeordnet in einer vorbestimmten Weise. Die Anzahl von differenzierten Zelltypen, die angeordnet werden können, ist nur durch das Differenzierungspotential der Stammzelle begrenzt, da die verschiedenen Zellbindeorte individuell mit differenzierenden Agenzien angesteuert werden können, unter Verwendung von Vorrichtungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Microspotter (Cartesian Technologies^TM, Hewlett Packard^TM, Genetic MicroSystems^TM) und ein Flüssigkeitslieferungssystemen wie die hier offenbarten, jedoch nicht auf diese beschränkt, und die in U.S.-PS Nr. 5,858,188; und 6,007,690 offenbarten. Die selektive Ansteuerung von den Stammzellen mit differenzierenden Agenzien ermöglicht die kontrollierte Differenzierung in die Nachkommen der Wahl. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Flüssigkeitslieferungssystem kombiniert mit dem gemusterten Zellsubstrat, um eine Mikroflüssigkeitskassette zu erzeugen, die differenzierende Verbindungen zu den gemusterten undifferenzierten Stammzellen liefern kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ersten und zweiten differenzierten Zelltypen Zelltypen, die in einem Einzelgewebe gefunden werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Gehirn, Vaskulargewebe, Haut, Pankreas, Niere, Leber, Lunge, Herz, Darm und Magen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ersten und zweiten differenzierten Zelltypen Zelltypen, die in verschiedenen Geweben gefunden werden, die in vivo interagieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf periphere glatte Nerven und/oder Skelettmuskeln; glatte Epithelialgewebe Muskeln; glatte Vaskularendothelium Muskeln; gliale Zellen – endotheliale Zellen von Blutkapillaren; Fettzellen-Axone von peripheren Nervenzellen und/ oder Schwannschen-Zellen; und Pankreas B-Zellen – Pankreas A-Zellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die ersten und zweiten differenzierten Zelltypen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus glialen Zellen, Neuronen, Adipozyten, glatten Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, Osteoblasten, Chondrozyten, Stromazellen und Myozyten.
In verschiedenen am stärksten bevorzugten Ausführungsformen ist, (a) der erste abgeleitete differenzierte Zelltyp ist eine Gliazelle und der zweite differenzierte Zelltyp eine neuronale Zelle, was ein Zellsubstratmodell für das Gehirn erzeugt; (b) der erste differenzierte Zelltyp ist ein Adipozyt und der zweite differenzierte Zelltyp eine Muskelzelle; (c) der erste differenzierte Zelltyp eine neuronale Zelle und der zweite differenzierte Zelltyp eine Muskelzelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das gemusterte Stammzellsubstrat oder das gemusterte Zellsubstrat mit einer Flüssigkeitslieferungskammer verbunden, um eine Kassette zu bilden, wobei das Flüssigkeitslieferungssystem Reagenzien zu den Stammzellen oder differenzierten Zellen liefert und umfasst:

(i) eine Vielzahl von Domänen, die zu den Zellbindeorten auf der Oberfläche des Substrats passen; und
(ii) Mikroflüssigkeitskanäle, die Reagenzien zu den Zellbindeorten bringen.

Wie hier verwendet, schließen "Reagenzien" differenzierende Mittel ein, genauso wie Zellkulturmedium und jeden Zellkulturzusatz für Zellkultur und Testverbindungen zum Screenen auf die Wirkungen von Arzneimittelverbindungsbibliotheken und Toxinen auf Zellen.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform bringt ein einzelner Mikroflüssigkeitskanal Flüssigkeit zu einem einzelnen Zellbindeort auf dem Substrat, um getrennten Flüssigkeitsfluss zu jedem Zellbindeort zu ermöglichen, wodurch die selektive Differenzierung von den Stammzellen und/oder selektive Behandlung von den Stammzellen oder differenzierten Zellen in ein oder mehreren Zellbindeorten mit einem Testmittel der Wahl ermöglicht wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein gemustertes differenziertes Zellsubstrat zur Verfügung, hergestellt durch ein Verfahren der selektiven Differenzierung von gemusterten Stammzellen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Zur-Verfügung-Stellung eines gemusterten Stammzellsubstrats, umfassend
(1) eine Substratoberfläche;
(2) eine erste Vielzahl von Zellbindeorten auf der Oberfläche, umfassend
(i) ein oder mehrere zelladhäsive Moleküle;
(ii) einen ersten differenzierten Zelltyp;
(3) eine zweite Vielzahl von Zellbindeorten auf der Oberfläche, umfassend:
(i) ein oder mehrere zelladhäsive Moleküle;
(ii) einen zweiten differenzierten Zelltyp, wobei der erste und zweite differenzierte Zelltyp auf dem Substrat in einem kontrollierten Muster angeordnet sind;
(b) selektives In-Kontakt-Bringen der Zellbindeorte mit differenzierenden Mitteln, um kontrollierte Differenzierung von Stammzellen in einen Nachkommen der Wahl zur Verfügung zu stellen, wobei das selektive In-Kontakt-Bringen ein gemustertes differenziertes Zellsubstrat erzeugt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das gemusterte Zellsubstrat mit einem Flüssigkeitslieferungssystem, wie vorstehend beschrieben, verbunden. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorstehenden Aspekte besitzen die Stammzellen und die resultierenden differenzierten Zellen wenigstens ein lumineszierendes Reportermolekül zur Verwendung in Zellscreeningassays, um die Verteilung, die Umgebung oder Aktivität der lumineszierenden Reportermoleküle auf oder in den Zellen oder in oder zwischen subzellulären Kompartimenten der Zellen in Antwort auf ein Testmittel der Wahl zu bestimmen. Eine Vielzahl solcher lumineszierenden Reportermoleküle kann in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben sind in U.S.-PS Nr. 5,989,835; anhängige U.S.-Patentanmeldungen Nr. 09/031,271 (eingereicht am 27. Februar 1998); 09/352,171 (eingereicht am 12. Juli 1999); 09/293,209 (eingereicht am 16. April 1999); 09/293,209 (eingereicht am 16. April 1999); 09/398,965 (eingereicht am 17. September 1999); 09/430,656 (eingereicht am 29. Oktober 1999); 09/513,783 (eingereicht am 24. Februar 2000); Giuliano et al., Ann. Rev., Biophys. Biomol. Struct. 24: 405–434 (1995); und Giuliano et al., Trends in Biotech. 16: 135–140 (1998).
Die lumineszierenden Sonden können kleine Moleküle sein, markierte Makromoleküle oder genetisch veränderte Proteine, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf grün fluoreszierende Proteinchimären. Wie hier verwendet, schließen "lumineszierende" Sonden fluoreszierende, lumineszierende und chemilumineszierende Sonden ein.
In einer weiteren Ausführungsform besitzt nur einer der differenzierten Zelltypen ein lumineszierendes Reportermolekül und wenn zwischen den ersten und zweiten differenzierten Zell typen Interaktion auftritt, berichtet nur einer der Zelltypen die Interaktion durch das Lumineszenzreportermolekül.
Die lumineszierend markierten Reportermoleküle können von den Zellen exprimiert werden oder diesen zugesetzt werden, entweder vor, zusammen mit oder nach In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einer Testverbindung. Beispielsweise kann das Reportermolekül als eine lumineszierend markierte Proteinchimäre von transfizierten Stammzellen exprimiert werden. Alternativ kann das lumineszierend markierte Reportermolekül exprimiert werden, isoliert oder gesamtgeladen werden in Stammzellen oder das Reportermolekül kann lumineszierend markiert werden nach der Isolierung. Als eine weitere Alternative können die Reportermoleküle von der Stammzelle exprimiert werden, die nachfolgend mit einer lumineszierenden Markierung in Kontakt gebracht wird, wie mit einem markierten Antikörper, der das Reportermolekül nachweist.
Vorzugsweise sind die lumineszierenden Reportermoleküle in dem ersten differenzierten Zelltyp spektral unterscheidbar von den lumineszierenden Reportermolekülen in dem zweiten differenzierten Zelltyp.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur selektiven Stammzelldifferenzierung zur Verfügung, umfassend, Zur-Verfügung-Stellen eines gemusterten Stammzellsubstrats, wie vorstehend offenbart, und selektives In-Kontakt-Bringen der Zellbindeorte mit differenzierenden Mitteln, um kontrollierte Differenzierung von Stammzellen in die Nachkommen der Wahl zu ermöglichen, wobei das selektive In-Kontakt-Bringen ein gemustertes differenziertes Zellsubstrat erzeugt. Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in differenzierte Zellen kann verwendet werden. Literaturhinweise, die Bedingungen zur Differenzierung von verschiedenen Stammzellen in differenzierte Nachkommen ermöglichen, können gefunden werden beispielsweise in den folgenden Referenzen:
Mesenchymale Stammzellen: U.S.-PS Nr. 5,827,740 (adipogene Differenzierung); U.S.-PS Nr. 6,022,540 (osteogene Differenzierung); U.S.-PS Nr. 5,942,225 (osteogene, chondrogene, tendenogene, Knochenmarkstromazellen- und myogene Differenzierung); Cuenda et al., J. Biol. Chem. 274: 4341–4346 (1999) (C2C12 myogene Differenzierung); Nishimura et al., J. Biol. Chem. 273: 1872–1879 (1998) (C2C12 Osteoblastendifferenzierung); Teboul et al., J. Biol. Chem. 270: 28183–28187 (1995) (C2C12 adipogene Differenzierung).
Neurale Stamm- und Vorläuferzellen: U.S.-PS Nr. 5,824,489 (Neurone und Glia); U.S.-PS Nr. 6,001,654 (Neurone und glatte Muskelzellen); U.S.-PS Nr. 6,033,906 (Gliazellen); Pleasure et al., J. Neurosci. 12: 1802–1815 (1992) (NTera2-Differenzierung in Neurone);
Gliale und neurale Stamm- und Vorläuferzellen: Welch et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 31: 610–616 (1995) (SNB-19-Gliadifterenzierung); U.S.-PS Nr. 5,824,489 (Neurone und Glia).
Hämatopoetische Stammzellen: Lawman et al., J. Hematother. 1: 251–259 (1992); Huss, Stem Cells 18: 1–9 (2000); Zhang et al., Blood 95: 138–146 (2000); Zhang et al., Blood 92: 118-128 (1998).
Hepatische Stammzellen: Brill et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 261–269 (1993); Brill et al., Dig. Dis. Sci., 44: 364–371 (1999); Fiorino et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34: 247–258 (1998).
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat in Kontakt mit einem Flüssigkeitsliefersystem, wie vorstehend offenbart, und die Stammzellen besitzen wenigstens ein lumineszierendes Reportermolekül, das dazu dient, den Phänotyp von den Nachkommen der Wahl zu identifizieren.
In diesen Ausführungsformen werden die Stammzellen mit differenzierenden Mitteln in Kontakt gebracht, um Differenzierung von transfizierten gemusterten Zellen in differenzierte Nachkommen zu bewirken, unter Verwendung der geeigneten differenzierenden Mittel, die entweder homogen zu dem Substrat verabreicht werden (für Einzelnachkommen) oder selektiv zu spezifischen Zellbindeorten (multiple Nachkommen). Differenzierung von einem einzelnen Stammzelltyp in verschiedene Nachkommen oder von verschiedenen Stammzellen in verschiedene Nachkommen erlaubt die Bildung von Substraten mit Zellbindeorten, die verschiedene Zelltypen in jeder gewünschten Nebeneinanderstellung hervorbringen. Auf diesem Weg werden einfache bis gemäßigt komplexe Modelle der zellulären Differenzierung verwendet, um multizelluläre gewebespezifische oder organspezifische Zellsubstrate zur Verwendung in der zellbasierten Analyse der Arzneimittelentdeckung und Biowissenschaften herzustellen.
In einem Modellsystem werden neuronale und gliale Stammzellen konstruiert, um fluoreszierende Proteinreportermoleküle zu exprimieren, um die Dynamik ihrer Zytoskelettproteine zu messen. Das Cytoskelett wurde gut charakterisiert und ein zuverlässiges Arzneimittelentde ckungsziel, für das wahrscheinlich viele Leitverbindungen in der Arzneimittelentdeckungspipeline zu jedem Zeitpunkt vorliegen. Jede der Stammzelllinien exprimiert spektral unterschiedliche Reportermoleküle, so dass sie in getrennten Orten in einem Zellarray gemustert werden können, genauso wie sie zusammen in dem gleichen Ort gemustert werden können (co-kultiviert). Alternativ können die unterschiedlichen Stammzellen in getrennten Orten gemustert werden, wobei die Orte nahe genug zueinander sind, um Interaktion zwischen den Zellen in den verschiedenen Orten zu ermöglichen. Die letzten beiden Aspekte ermöglichen die gleichzeitige Messung von Arzneimittelantworten von den zwei Zelltypen in einem organgemäßen Kontext, worin es den Zellen ermöglicht wird zu interagieren, als wären sie in dem Gehirngewebe eines lebenden Tieres. Da die Reportermoleküle, die in jedem Zelltyp enthalten sind, spektral unterschiedlich sind, weist die Plattform jeden Zelltyp in der Co-kultur nach und ordnet jedem Zelltyp eine Funktion zu.
In einem zweiten Modellsystem wird eine pluripotente Zelllinie, die Maus C2C12-Zellen, mit einem lumineszierenden Reportermolekül konstruiert, in Mikroarrays gemustert und differenziert in zwei Zelltypen, Skelettmuskelmyozyten und Adipozyten. In diesem Fall werden die Stammzellen konstruiert, um ein Lumineszenzreportermolekül des Kohlenhydrat – metabolischen Flusses zu exprimieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Reporter des Phosphorylierungsstatus von PFK-1 und PFK-2, der Messung von zellulären ATP-Spiegeln (Energieladung), dem Verhältnis von Oxidations – Reduktions Co-Faktoren, wie NAD⁺/NADH, und der Konzentration von dem Second Messenger cAMP, die sowohl in Zeit als auch in Raum in jedem Zelltyp gemessen werden. Der Kohlenhydratmetabolismus spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der physiologischen Funktion von jedem Zelltyp für Muskel- und Fettzellen, Kontraktion und Relaxion von Muskelzellen und Fettspeicherung und Mobilisierung von Adipozyten. Deshalb ermöglicht dieses Modellsystem die Messung der Wirkung von Leitverbindungen auf dem gleichen molekularen Signalweg in zwei Gewebetypen. Darüber hinaus erlaubt diese multiple Gewebetyp-Screeningplattform die effiziente Ansteuerung von Leitverbindungswirksamkeit, Spezifität und Toxikologie.
Ein drittes, komplexeres Modellsystem schließt die Co-Kultivierung von neuronalen und Skelettmuskelstammzellen ein, wobei beide Typen konstruiert sind, um spektral unterschiedliche lumineszierende Reportermoleküle zu exprimieren. Die Zellen werden gemustert und differenziert auf dem Substrat. Die Wirkung von Leitverbindungen auf die komplexe Interaktion von Neuronen und Skelettmuskelzellen wird gemessen unter Verwendung der lumineszierenden Reportermoleküle, die in jeden Zelltyp eingebracht wurden. Die Co-Kultivierung von differenzierten neuronalen und Muskelzellen erlaubt die direkte Messung von Anre gungskontraktions-Kopplungsereignissen und der Wirkung, die Leitverbindungen auf diese Ereignisse haben.
Diese Ansätze können verallgemeinert werden auf Interaktionen zwischen anderen Gewebetypen und Interaktionen zwischen multiplen Zelltypen in einem Organ, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf glatten peripheren Nerven oder Skelettmuskel; glatten Epithelialgewebe Muskel; glatten vaskulären Endothelium Muskel; gliale Zellen – endotheliale Zellen der Blutkapillaren; Fettzelt-Axone der peripheren Nervenzellen und Schwannschen-Zellen; und Pankreas B-Zellen – Pankreas A-Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum zellbasierten Screening zur Verfügung, wobei die Stammzellen und/oder differenzierten Zellen wenigstens ein lumineszierendes Reportermolekül besitzen zur Verwendung in Zellscreeningassays, um die Verteilung, die Umgebung oder Aktivität der lumineszierenden Reportermoleküle auf oder in den Zellen oder in oder zwischen subzellulären Kompartimenten der Zellen zu bestimmen, in Antwort auf ein Testmittel der Wahl. Eine Vielzahl solcher lumineszierenden Reportermoleküle kann verwendet werden in diesem Aspekt der Erfindung, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die, die beschrieben sind in U.S.-PS Nr. 5,989,835; anhängige U.S.-Patentanmeldungen Nr. 09/031,271 (eingereicht am 27. Februar 1998); 09/352,171 (eingereicht am 12. Juli 1999); 09/293,209 (eingereicht am 16. April 1999); 09/293,209 (eingereicht am 16. April 1999); 09/398,965 (eingereicht am 17. September 1999); 09/430,656 (eingereicht am 29. Oktober 1999); 09/513,783 (eingereicht am 24. Februar 2000); Giuliano of al., Ann. Rev., Biophys. Biomol. Struct. 24: 405–434 (1995); und Giuliano et al., Trends in Biotech. 16: 135–140 (1998).
In dieser Ausführungsform dieses Verfahrens werden die gemusterte Stammzellarrays und gemusterte differenzierte Zellarrays verwendet, um Veränderungen in der Verteilung, der Umgebung oder Aktivität von lumineszierenden Reportermolekülen auf oder in Zellen oder in oder zwischen subzellulären Kompartimenten von den Zellen in Antwort auf eine Testverbindung zu analysieren. Die Zellen werden abgebildet und/oder gescannt unter Verwendung von einem Zellscreeningsystem, umfassend ein optisches System mit einer Bühne, die angepasst ist zum Halten von Zellen, die ein Substrat enthalten, einer Nachweisvorrichtung, die in der Lage ist, ein digitales Bild zu erzeugen, einer Vorrichtung zur Steuerung von Fluoreszenz oder Lumineszenz, die von den Zellen zu der Nachweisvorrichtung emittiert werden und einen Computer zum Erhalten und zum Prozessieren von Daten von der Nachweisvorrichtung. Eine bevorzugte Ausführungsform einer solchen Vorrichtung ist offenbart in U.S.-PS Nr. 5,989,835; und in der anhängigen U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/031,271 (eingereicht am 27. Februar 1998). Unter Verwendung des Zellscreeningsystems werden Lumineszenzsignale von den Reportermolekülen in digitale Daten konvertiert; und die digitalen Daten werden verwendet, um Veränderungen in der Verteilung, der Umgebung oder Aktivität von den Reportermolekülen in Antwort auf das Testmittel zu bestimmen.
Solche digitalen Daten können verwendet werden, um die Wirkung einer Testverbindung auf die Verteilung von den Reportermolekülen zwischen: Zytoplasma – Kern, Zellmembran – Zytoplasma, endoplasmatisches Retikulum – Golgi-Apparat zu berichten, genauso wie Apoptose; Rezeptorinternalisierung; Transkriptionsfaktoraktivierung; Proteinkinaseaktivierung; Proteaseaktivität; Organellenstruktur, Verteilung und Funktion; Makromolekülverteilung; Genexpression; Mikrotubuli-Zytoskelettstruktur; Aktin-Zytoskelettstruktur; Kernform; Kernbereich; Kerngröße; Kerndurchmesser; mitochondriales Potential; Zellform; Zellbeweglichkeit; Zellgröße; und Zelldurchmesser zu berichten (vergleiche z.B. U.S.-PS Nr. 5,989,835; anhängige U.S.-Patentanmeldungen Nr. 09/031,271 (eingereicht am 27. Februar 1998); 09/352,171 (eingereicht am 12. Juli 1999); 09/293,209 (eingereicht am 16. April 1999); 09/398,965 (eingereicht am 17. September 1999); 09/430,656 (eingereicht am 29. Oktober 1999); und 09/513,783 (eingereicht am 24. Februar 2000).
Die Verwendung eines Flüssigkeitslieferungssystems in dem Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf das vorstehend Diskutierte, oder die Verwendung von automatisierten Präzisionsinstrumenten, wie Microspottern (Cartesian Technologies, Hewlett Packard^TM, Genetic MicroSystems^TM) erlaubt die Lieferung eines differenzierenden Mittels der Wahl an spezifische Zellbindeorte.
Beispiele
Modellsysteme der organgemäßen Differenzierung
Gliale Differenzierung. Es wurde gezeigt, dass Zellen, die auch aus einem hochaggressiven humanen Glioblastomtumor entnommen wurden, unbegrenzt in Kultur wachsen und veränderte morphologische und Wachstumseigenschaften in Anwendung eines Differenzierungsmittels zeigen. Diese Zellen, SNB-19 genannt (Welch of al., 1995) werden konstruiert, um ein lumineszierendes Reportermolekül (siehe nachstehend) zu exprimieren und auf Zellsubstrate gemustert, entweder allein oder in Kombination mit neuralen Stammzellen. Um Differenzierung zu induzieren, wird ein Gemisch von 1 mM Dibutyl-cAMP und 1 mM Isobutylmethylxanthin (ein Phosphodiesteraseinhibitor) zugegeben zur Kultur und den Zellen wird es ermöglicht, für 12–24 Stunden zu inkubieren. Diese Mittel induzieren in den Zellen multiple Ver fahren, die häufig mit anderen Glia in der gleichen Zellkultur interagieren (Welch et al., 1995), genauso wie sie die Zellen dazu veranlassen, sich nicht mehr zu teilen.
Die glialen Stammzellen werden transfiziert, um eine grünfluoreszierendes Protein (GFP) – gliales – fibrilläres saures Protein (GFAP) – Chimäre zu exprimieren. GFAP ist eine Verbindung des intermediären Filamentzytoskeletts und ist ein Hauptzytoskelettprotein, das in glialen Stammzellen und differenzierten Glia gefunden wird.
Neuronale Differenzierung: Verschiedene neuronale Stammzelllinien existieren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. NT2-Zellen einer humanen Teratocarcinomzelllinie (Pleasure et al., 1992) sind insofern einzigartig, dass sie induziert werden können, um in stabile, postmethodische humane Neuronen zu differenzieren und es wurde gezeigt, dass sie ein Vehikel für die Expression von verschiedenen Genprodukten sein können (Pleasure et al., 1992). NT2-Zellen werden konstruiert, um eine blaufluoreszierendes Protein (BFP) – (3-Tubulin-Chimäre zu exprimieren. β-Tubulin ist ein Hauptbestandteil des Cytoskeletts. Die Zellen werden dann auf Zellsubstraten gemustert, entweder allein oder in Kombination mit glialen Stammzellen. Um Differenzierung zu induzieren, treten NT2-Zellen ursprünglich in ein Programm der Differenzierung ein, das mit einer zweiwöchigen Behandlung mit Retinsäure (10^–5 Mol), mitotischen Inhibitoren und einer spezialisierten extrazellulären Matrix beginnt. Die teilweise differenzierten Zellen werden auf die Substrate transferiert, wo sie die endgültigen Stadien der Differenzierung erreichen durch Durchführung von Verfahren, die Axone und Dendriten bilden. Die Zellen werden post-mitotisch, behalten jedoch die Fähigkeit, funktionelle Proteine, wie das lumineszierende Proteinreportermolekül, zu exprimieren.
Gemischte gliale – neuronale Differenzierung: NT2-Stammzellen in dem Endstadium der Differenzierung werden mit SNB-19-Zellen dem gleichen Substrat zugegeben. Nachdem beide Zelltypen angeheftet sind, werden die Co-Kulturen mit 1 mM Dibutyryl-cAMP und 1 mM Isobutylmethylxanthin behandelt. Es wird den zwei Zelltypen ermöglicht zu interagieren, wie sie differenzieren. Da die NT2-Zellen auf Differenzierung beschränkt sind, hat das Dibutyryl-cAMP geringe oder keine Wirkung auf neurale Zelldifferenzierung und kann sie sogar noch steigern, da cAMP dafür bekannt ist, die Differenzierung von verschiedenen Zelltypen zu induzieren.
Fett- und Skelettmuskelgewebe einer herkömmlichen Stammzelle: Die Maus C2C12-Zelllinie ist pluripotent und es wurde gezeigt, dass sie in der Lage ist, in Skelettmuskel (Cuenda und Cohen, 1999), Adipozyten (Teboul et al., 1995) und Osteoblasten (Nishimura et al., 1998) zu differenzieren. Die C2C12-Zellen werden zunächst konstruiert, um ein lumineszierendes Re portermolekül des Kohlenhydratmetabolismus zu exprimieren (siehe nachstehend). Die Zellen werden auf Substraten gemustert, in denen das Wachstumsmedium <1% Kälberserum enthält. Diese starke Verringerung der Serumkonzentration (10% ursprünglich) induziert die C2C12-Zellen über einen Zeitraum von 24–48 Stunden die Teilung zu stoppen, in verlängerte, Multikernzellen zu fusionieren und kontraktile Myotuben zu bilden. Um Adipozytendifferenzierung zu induzieren, werden die Zellen mit einem Gemisch aus 5 μM Thiazolidindion und 100 μM Fettsäure behandelt (Teboul et al., 1995). Die Differenzierung tritt nach 24–48 Stunden auf und wird begleitet von einer Verlangsamung des Zellwachstums und der Aufnahme von Fettsäuren durch die Zellen und ihre Inkorporation in Lipidtröpfchen.
Die C2C12-Zellen werden transfiziert mit einem Reportermolekül, umfassend 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFK-2), die eine Schlüsselrolle in dem Gleichgewicht zellulärer Energiebereitstellung und Speicherung spielt. Die Aktivität dieses bifunktionalen Enzyms kann bewirken, dass eine Zelle zwischen Kohlenhydratoxidation (Energieerhalt) und Kohlenhydratsynthese (Energieerforderung) wechselt. Der Phosphorylierungsstatus von PFK-2 bestimmt, ob das Enzym den zellulären Kohlehydratabbau oder die Synthese stimuliert. (Kurland und Pilkis, Protein Science 4: 1023–1037 (1995). Die Aminosäuresequenz, die die PFK-2-Phosphorylierungsstelle enthält, wird in eine bestimmte Stelle in der kodierenden Sequenz von GFP inseriert, die Insertionen toleriert (Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 11241–11246 (1999)), wodurch die Fluoreszenzeigenschaften von GFP nach Phosphorylierung von PFK-2 verändert sind.
Nerven- und Muskelgewebeinferaktion: Zelluläre Bestandteile von anderen Modellsystemen werden kombiniert, um Gewebe-Gewebeinteraktionen zu modellieren. Neuronale NT2-Zellen werden mit C2C12-Zellen kombiniert, um ihre Interaktion während der Differenzierung zu ermöglichen, ähnlich Geweben, die während der normalen Entwicklung interagieren. Drei Szenarien werden getestet:

1. NT2- und C2C12-Zellen werden zusammen angeordnet und es wird ihnen ermöglicht, zusammen zu differenzieren;
2. NT2-Zellen werden angeordnet auf dem Substrat und differenziert, gefolgt von einem Zusatz und Differenzierung von C2C12-Zellen;
3. C2C12-Muskelstammzellen werden angeordnet auf dem Substrat und differenziert, gefolgt von Zusatz und Differenzierung von neuronalen NT2-Stammzellen.

Andere Beispiele
Stammzellen der Neuralleiste können mit poly-D-Lysin und Fibronectin behandelt werden, um periphere Neurone und Glia zu erzeugen, wie diskutiert in U.S.-PS Nr. 6,033,906. Die gleichen Stammzellen produzieren nur gliale Zellen, jedoch keine Neurone, wenn sie mit Fibronectin alleine behandelt werden.
Mesenchymale Stammzellen werden mit 100 nM Dexamethason + 10 mM (3-Glycerophosphat induziert, um Osteogenese zu durchleben (U.S.-PS Nr. 5,942,225). Die gleichen mit 5 ng/ml BMP behandelten Stammzellen werden induziert, um Chondrogenese zu durchlaufen; wenn sie mit 5-Azacytidin behandelt werden, werden sie induziert, um Myogenese zu durchlaufen: Letztlich werden die gleichen Stammzellen mit 10 μ/ml IL-1α behandelt, um in Stromazellen zu differenzieren.
U.S.-PS Nr. 5,827,740 lehrt die Behandlung von mesenchymalen Stammzellen mit Glucocorticoiden und mit Phosphodiesteraseinhibitor um Adipogenese zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die zuvor erwähnten bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beschränkt. Der Fachmann weiß, dass verschiedene Modifikationen der offenbarten bevorzugten Ausführungsformen durchgeführt werden können, ohne von dem Konzept der Erfindung abzuweichen. All diese Modifikationen sind dazu gedacht, im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu liegen.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines Substrats (4) für selektive Zellmusterung, umfassend: a) Bereitstellung eines Substrats (4) mit einer Oberfläche, wobei die Oberfläche reaktive Hydroxylgruppen enthält; b) In-Kontakt-bringen der Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) mit einem bifunktionellen Molekül, umfassend einen Hydroxy-reaktiven Teil und einen nukleophilen Teil zur Bildung einer monomolekularen Schicht („monolayer") c) Auflegen einer Schablone auf das Substrat (4); d) Aufbringen eines elektrophilen zellabstoßenden Teils auf exponierte Bereiche der monomolekularen – Schicht zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem zellabstoßenden Teil und dem bifunktionellen Nukleophil, das in Schritt b abgelegt wurde, zur Erzeugung zelltabstoßender Stellen; e) Entfernung der Schablone; und f) Aufbringen von Zell-Adhäsionsmolekülen auf das Substrat (4) zur Erzeugung zellbindender Stellen (8), wobei die Zell-Adhäsionsmoleküle nur an den Stellen an das Substrat binden, die mit der Schablone in Kontakt gebracht wurden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Substrates (4) für selektive Zellmusterung, umfassend: a) Bereitstellung eines Substrates (4) mit einer Oberfläche, wobei die Oberfläche reaktive Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) umfasst; b) In-Kontakt-bringen der Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) mit einem bifunktionellen Molekül, umfassend einen Hjrdroxy-reaktiven Teil und einen nukleophilen Teil zur Bildung einer monomolekularen Schicht c) Auflegen einer Schablone auf das Substrat (4); d) Aufbringen von Zell-Adhäsionsmolekülen auf exponierte Bereiche auf der monomolekularen Schicht zur Erzeugung von Zell-Bindungsstellen (8); e) Entfernung der Schablone; und f) Aufbringen eines elektrophilen zellabstoßenden Teils auf das Substrat (4) zur Erzeugung zellabstoßender Stellen, wobei der zellabstoßende Teil eine kovalente Bindung mit dem in Schritt b abgelegten bifunktionellen Nukleophil nur an Stellen bildet, die mit der Schablone in Kontakt gebracht wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Substrat (4) behandelt wird, um die reaktiven Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) bereitzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 3; wobei das Substrat (4) mit Sauerstoff-Plasma behandelt wird, um die reaktiven Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) bereitzustellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, wobei das bifunktionelle Molekül ein Organosilan umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, wobei das bifunktionelle Molekül ein Aminosilan umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, wobei der reaktive zellabstoßende Teil eine durch Tresyl-Chlorid aktivierte-Poly(ethylen)glykol-Verbindung enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, wobei Dampfphasenablagerung dazu verwendet wird, die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Substrats (4) mit einem bifunktionellen Molekül in Kontakt zu bringen.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, weiter umfassend das in-Kontakt-bringen der zellbindenden Stellen (8) mit einem zellbindenden Protein oder Peptid unter Bedingungen, die die Bindung des zellbindenden Proteins oder Peptids an die zellbindende Stelle (8) erlauben.
Verfahren gemäß Anspruch 1–2, weiter umfassend das in-Kontakt-bringen der zellbindenden Stellen (8) mit Zellen unter Bedingungen, die die Bindung der Zellen an die zellbindenden Stellen (8) ermöglichen.
Verfahren gemäß Anspruch 9, weiter umfassend das in-Kontakt-bringen des zellbindenden Proteins oder Peptids auf den zellbindenden Stellen (8) mit Zellen unter Bedingungen, die die Bindung der Zellen an das zellbindende Protein oder Peptid erlauben.
Verfahren gemäß Anspruch 9, weiterumfassend die Lyophilisierung des Substrats (4).
Verfahren gemäß Anspruch 10, weiter umfassend die Kryokonservierung oder die Trocknung des Substrats (4).
Verfahren gemäß Anspruch 11, weiter umfassend die Kryokonservierung oder die Trocknung des Substrats (4).
Ein Zellmusterungssubstrat (4), umfassend wenigstens einen ersten Teil mit einer reaktiven Oberfläche, an die eine erste Vielzahl von Zelladhäsionsmolekülen gekoppelt ist, und wenigstens einen zweiten Teil mit einer exponierten Oberfläche, an die eine zweite Vielzahl von zellabstoßenden Teilen gekoppelt ist, wobei die Zelladhäsionsmoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminosilanen, und wobei die zellabstoßenden Teile Tresylchlorid-aktiviertes Poly(ethylen)glykol umfassen.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 15, wobei das Aminosilan ausgewählt ist aus der, Gruppe bestehend aus Methoxy- oder Ethoxy-Silanen, die Trimethoxypropyldiethylentriamin, Trimethoxysilylethylendiamin, Aminopropyltriethoxysilan, Trimethoxyaminopropylsilan oder Chlorsilane wie Trichlorsilylethylendiamin, Aminopropyltrichlorosilan einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 15, wobei das Aminosilan Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin ist.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 15, weiter umfassend zellbindende Proteine oder Peptide, die an die Vielzahl von Zelladhäsionsmolekülen gebunden sind.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 18, wobei das Substrat lyophilisiert ist.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 15, weiter umfassend Zellen, die an die Vielzahl der Zelladhäsionspromotoren gebunden sind.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 18, weiter umfassend Zellen, die an die zellbindenden Proteine oder Peptide gebunden sind.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 20, wobei das Substrat kryokonserviert oder der Trocknung unterzogen wird.
Zellmusterungssubstrat (4) gemäß Anspruch 21, wobei das Substrat kryokonserviert oder der Trocknung unterzogen wird.
Ein Zellmusterungssubstrat (4), hergestellt nach den Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–2.