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JP2010189400A - キメラ免疫調節化合物とその使用方法 - Google Patents

キメラ免疫調節化合物とその使用方法 Download PDF

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JP2010189400A
JP2010189400A JP2010068564A JP2010068564A JP2010189400A JP 2010189400 A JP2010189400 A JP 2010189400A JP 2010068564 A JP2010068564 A JP 2010068564A JP 2010068564 A JP2010068564 A JP 2010068564A JP 2010189400 A JP2010189400 A JP 2010189400A
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Karen L Fearon
エル． フィアロン，カレン
Dino Dina
ダイナ，ディノ
Stephen F Tuck
エフ． タック，スティーブン
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Dynavax Technologies Corp
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Abstract

【課題】本発明は免疫調節化合物及び該免疫調節化合物の使用により個体の免疫調節を実現する方法を提供する。
【解決手段】2以上の核酸部分と1以上の非核酸スペーサー部分とを含むキメラ免疫調節化合物(CIC)であって、
少なくとも1つの非核酸スペーサー部分が2つの核酸部分と共有結合し、
該スペーサーがポリヌクレオチドではなく、
少なくとも1つの核酸部分が配列5’-CG-3’を含み、かつ
該CICが免疫調節活性をもつ
ことを特徴とするCIC。
【選択図】なし

Description

関連出願へのクロス・リファレンス
[0001] 本願は2001年6月21日提出の仮出願第60/299,883号及び2002年4月23日提出の仮出願第60/375,253号の利益を主張するものであり、前記両仮出願の内容はその全体が参照指示により本書に組み込まれる。
[0002] 本発明は核酸部分と非核酸部分とを含むキメラ免疫調節化合物(CIC)に、また免疫反応の調節へのそうした化合物の使用に関連する。本発明の用途は生物医学及び免疫学の分野にある。
[0003] 本節における刊行物への言及は、該刊行物が本発明の先行技術であることを示唆するものではない。
[0004] 感染又は他の抗原暴露により惹起される免疫反応のタイプは一般に、免疫反応に関与するヘルパーT細胞(Th細胞)のサブセットにより識別することができる。Th1サブセットは古典的な細胞性機能たとえば細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の遅延型過敏反応や活性化などを引き起こし、またTh2サブセットはB細胞活性化のヘルパーとしてより効果的に機能する。ある抗原に対する免疫反応の型は一般に、その抗原に反応する細胞が産生するサイトカイン類による影響を受ける。Th1及びTh2細胞が分泌するサイトカイン類の違いは両サブセットの生物学的機能の違いを反映すると考えられる。たとえばRomagnani (2000), Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18を参照。
[0005] Th1サブセットは、CTLを活性化するIL-2やINF-γを分泌するので、ウイルス感染、細胞内病原体及び腫瘍細胞への反応に特に適しているであろう。Th2サブセットは自由生活菌や寄生虫への反応により適し、またアレルギー反応を媒介するであろう。というのはIL-4及びIL-5はそれぞれIgEの産生及び好酸球の活性化を誘発することが知られているからである。一般にTh1及びTh2細胞のサイトカイン分泌パターンは識別可能であり、従ってある型の反応は他の型の反応の活性を加減することができる。Th1/Th2バランスのシフトはたとえばアレルギー反応を、あるいは逆にCTL反応の増進を、招く可能性がある。
[0006] 哺乳動物ではある種の免疫調節ポリヌクレオチドの投与によりTh1型の免疫反応を誘発しうることがかねてから認識されてきた。この免疫調節ポリヌクレオチドは免疫刺激配列(ISS)と称する配列を含み、しばしばCGジヌクレオチドを含む。たとえばPCT国際公開WO98/55495号、WO97/28259号、米国特許第6,194,388号及び第6,207,646号明細書、それにKrieg et al. (1995) Nature 374:546-49を参照。Th2型の反応は結核やマラリアなど数多くの感染症の感染防護にはほとんど役立たない。タンパク質系ワクチン類は一般に中和抗体の高力価を特徴とするTh2型免疫反応を誘発するが、有効な細胞性免疫をもたらすことはない。さらに、ある型の抗体反応は適応症によっては、特にIgE抗体反応がアナフィラキシー・ショックを招きかねないようなアレルギーには、不向きである。
[0007] 改良型の免疫治療方法が求められおり、免疫反応の調節に有用な化合物を同定する必要がある。
[0008] 本発明は一態様では、免疫調節活性をもつキメラ化合物に関連する。そのキメラ免疫調節化合物(CIC)は一般に1以上の核酸部分と1以上の非核酸部分とを含む。2以上の核酸部分をもつCIC中の核酸部分は同じでも異なってもよい。2以上の非核酸部分をもつCIC中の非核酸部分は同じでも異なってもよい。従って一実施態様ではCICは2以上の核酸部分と1以上の非核酸スペーサー部分とを含み、少なくとも1つの非核酸スペーサー部分が2個の核酸部分と共有結合している。一実施態様では少なくとも1つの核酸部分は配列5’-CG-3’を含む。一実施態様では少なくとも1つの核酸部分は配列5’-TCG-3’を含む。
[0009] 本発明は一態様では、式N1-S1-N2 (式中N1とN2は核酸部分であり、S1は非核酸スペーサー部分である)で示されるコア構造をもち免疫調節活性を示すCICを提供する。一実施態様ではコア構造はN1-S1-N2-S2-N3である(式中N3は核酸部分であり、S2は非核酸スペーサー部分である)。一実施態様ではCICはコア構造N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]Aをもつ(ただしAは1〜100の整数であり、また[Nv-Sv]Aは核酸部分と非核酸部分の結合がさらにA回繰り返され、SとNは[Nv-Sv]の繰り返しのたびに独立に選択されることを示す)。一実施態様ではAは2以上であり、またCIC中の4以上の核酸部分が異なる配列をもつ。
[0010] 一態様では、CICは式N1-S1-N2又はN1-S1-N2-S2-N3で示されるコア構造を含む(式中N1、N2及びN3は核酸部分であり、S1とS2は非核酸スペーサー部分であり、またS1とS2は厳密に2個の核酸部分と共有結合している)。そうしたCICの例は式(5’-N1-3’)-S1-N2で示されるコア構造をもつCICである。一実施態様では、N1は配列5’-TCGAX-3’をもつが、ただしXは0〜20個のヌクレオチド塩基である(SEQ ID NO:1)。一実施態様ではXは0〜3個のヌクレオチド塩基である。一実施態様ではXはCGTである。別の実施態様ではN1は配列5’-TCGTCGA-3’をもつ。一実施態様ではCICは構造N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]Aをもつ(ただしAは1〜100の整数であり、また[Nv-Sv]Aは核酸部分と非核酸部分の結合がさらにA回繰り返され、SとNは[Nv-Sv]の繰り返しのたびに独立に選択されることを示す)。一実施態様ではAは1〜3である。
[0011] 本発明は他態様では、式[Nv]A---Spで示されるコア構造をもち免疫調節活性を示すCICを提供する(式中Spは、A個の独立に選択される核酸部分Nvに共有結合した多価スペーサーであり、Aは3以上である)。一実施態様では、CICはコア配列[Sv-Nv]A---Spをもつ(式中Spは、A個の独立に選択されるエレメント[Sv-Nv]に共有結合した多価スペーサーであり、独立に選択されるエレメント[Sv-Nv]は核酸部分に共有結合したスペーサー部分を含み、またAは3以上である)。一実施態様ではAは3〜50である。別の実施態様ではAは50を超える。一実施態様ではCIC中の2以上、3以上又は4以上の核酸部分が異なる配列をもつ。
[0012] 一態様では、CICは式[Nv]A-Sp又は[Sv-Nv]A-Spで示されるコア構造を含む(式中Spは、A個の独立に選択される核酸部分Nv又は独立に選択されるエレメント[Sv-Nv]に共有結合した多価スペーサーであり、独立に選択される各エレメント[Sv-Nv]は核酸部分に共有結合したスペーサー部分を含み、Aは3以上である)。実施態様によっては、Aは3〜約50又は約50〜約500である。一実施態様ではSpはデンドリマーを含む。一実施態様ではCICの核酸部分は
Figure 2010189400
 (ただしXは任意のヌクレオチドである。)
より選択される配列をもつ。
[0013] 他態様では、本発明は式N1-S1(式中N1は核酸部分であり、S1は非核酸部分である)で示されるコア構造をもち免疫調節活性を示すCICを提供する。
[0014] CICは非ヌクレオチド・スペーサー部分を含んでもよい。該スペーサー部分は、たとえばトリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ホスホジエステル及び/又はホスホロチオアート結合したオリゴエチレングリコール部分を含むポリマー、C2-C10アルキル(たとえばプロピル、ブチル、ヘキシルなど)、グリセロール又は修飾グリセロール(たとえば1、2又は3-OH位で誘導体化したグリセロール; たとえば3-レブリニル-グリセロール)、ペンタエリトリトール又は修飾ペンタエリトリトール(任意の-OH位で修飾したペンタエリトリトールたとえば「トレブラー」)、2-(ヒドロキシメチル)エチル、1,3-ジアミノ-2-プロパノール、塩基欠失ヌクレオチド(abasic nucleotide)、多糖(たとえば架橋型多糖)、デンドリマー及び/又は本書で開示した他スペーサー部分成分を種々の組み合わせで含む。
[0015] 前述のCICは種々の実施態様で、次の特徴を1以上もつ: (i)CICは鎖長7ヌクレオチド以下又は6ヌクレオチド以下の核酸部分を少なくとも1つ含む; (ii)CICの核酸部分はすべて鎖長7ヌクレオチド以下又は6ヌクレオチド以下である; (iii)CICは配列5’-CG-3’を含む核酸部分(たとえば5’-TCG-3’)を少なくとも1つ含む; (iv)CICは異なる配列をもつ核酸部分を少なくとも2つ含む; (v)CICの核酸部分はすべて同じ配列をもつ; (vi)CICは非核酸スペーサー部分を少なくとも1つ含むが、そのスペーサー部分はトリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、プロピル、ブチル、ヘキシル、グリセロール又は修飾グリセロール(たとえば1、2又は3-OH位で誘導体化したグリセロール; たとえば3-レブリニル-グリセロール)、ペンタエリトリトール又は修飾ペンタエリトリトール(任意の-OH位で修飾したペンタエリトリトールたとえば「トレブラー」)、2-(ヒドロキシメチル)エチル、1,3-ジアミノ-2-プロパノール、塩基欠失ヌクレオチド、多糖(たとえば架橋型多糖)又はデンドリマーであるか、又はそれらを含む。実施態様によっては、スペーサー部分はポリペプチドではない。
[0016] 開示のCICは種々の実施態様で、次の特徴を1以上もつ: (vii)CICは「単独免疫調節活性」をもたない核酸部分を少なくとも1つ含む; (viii)CICは「単独免疫調節活性」をもつ核酸部分をまったく含まない; (ix)CICは「低単独免疫調節活性」をもつ核酸部分を少なくとも1つ含む。「単独免疫調節活性」と「低単独免疫活性」についは後述する。開示のCICは種々の実施態様で、二本鎖又は部分的二本鎖の核酸部分を少なくとも1つ含む。CICは、二本鎖の形成が可能であるように自己相補的な核酸部分を用いて設計することができる。たとえばC-84、C-85及びC-87を参照。
[0017] 従って本発明は種々の態様で、2以上の核酸部分と1以上の非核酸スペーサー部分とを含み免疫調節活性を示すCICであって、少なくとも1つのスペーサー部分が2個の核酸部分に共有結合し、また少なくとも1つの核酸部分が配列5’-CG-3’を含むことを特徴とするCICを提供する。該CICは少なくとも3つの核酸部分を含み、各核酸部分が少なくとも1つの非核酸スペーサー部分に共有結合するものでもよい。該CICは少なくとも1つの免疫調節活性たとえば(a)ヒト末梢血単核細胞によるINF-γ産生を刺激する能力; (b) ヒト末梢血単核細胞によるINF-α産生を刺激する能力; 及び/又は(c)ヒトB細胞の増殖を刺激する能力などをもってもよい。
[0018] CICの1以上の核酸部分は配列5’-TCGA-3’、5’-TCGACGT-3’、5’-TCGTCGA-3’及び5’-ACGTTCG-3’などを含むことができる。一実施態様では、CICの1以上の核酸部分は配列5’-X1X2CGX3X4-3’をもつことができる(ただしX1は0〜10個のヌクレオチドであり、X2は無であるか又はA、T又はUであり、X3は無であるか又はAであり、またX4は0〜10個のヌクレオチドであって、該核酸部分はスペーサー部分に、たとえば3’末端で結合している)。一実施態様では、X1、X2、X3及びX4のヌクレオチドの総和は7以下、6以下、5以下、4以下又は3以下とすることができる。実施態様によっては、CICの1以上の核酸部分は
Figure 2010189400
 (ただしXは任意のヌクレオチドである。)
などの核酸配列をもつことができる。
[0019] 一実施態様では、1以上の核酸部分は3〜7塩基を含む。一実施態様では、該核酸部分は3〜7塩基を含み、かつ配列5’-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3’又は5’-TCG[(X)2-4]-3’又は5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’又は5’-TCG(A/T)CG(A/T)-3’又は5’-TCGACGT-3’又は5’-TCGTCGA-3’をもつ(ただし各Xは独立に選択されるヌクレオチドである)。実施態様によっては、CICは前記の配列をもつ核酸部分を3以上、10以上、30以上又は100以上含む。
[0020] CICは鎖長7ヌクレオチド以下の核酸部分を少なくとも1つ含むことができる。随意に、CIC中の核酸部分はすべて鎖長7ヌクレオチド以下である。実施態様によっては、配列5’-CG-3’を含むCIC中の核酸部分はすべて鎖長7ヌクレオチド以下である。CICは異なる配列をもつ少なくとも2つの核酸部分を含むことができる。CICは配列5’-CG-3’を含まない核酸部分を少なくとも1つ含むことができる。CICは単独免疫調節活性をもたない又は低単独免疫調節活性をもつ核酸部分を少なくとも1つ含んでもよい。随意に、CIC中の核酸部分はどれも単独免疫調節活性をもたない。核酸部分のヌクレオチド間の結合はホスホジエステル、ホスホロチオアートエステル、ホスホロジチオアートエステル又は他の共有結合、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。同様に、核酸部分とスペーサー部分との、又はスペーサー部分間の結合はホスホジエステル、ホスホロチオアートエステル、ホスホロジチオアートエステル又は他の結合、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。
[0021] 一実施態様では、CICは反応性結合基(たとえば反応性チオ基)を含む。CICはポリペプチドたとえばポリペプチド抗原に結合又は非共有的に会合させてもよい。
[0022] 本発明はまた、CICと共に製薬上許容しうる賦形剤及び/又は抗原及び/又は陽イオン性マイクロキャリアー(乳酸とグリコール酸とのポリマーなど)を含む組成物を提供する。該組成物は本質的に無内毒素とすることができる。
[0023] 本発明は一態様では、開示のCICと製薬上許容しうる賦形剤、抗原(たとえばそれに対して免疫反応が求められる抗原)又はその両方を含む組成物を提供する。一実施態様では、該組成物はGMP基準に則って製造する。一実施態様では、該組成物は組成物の内毒素検査を含む工程によって製造する。一実施態様では、該組成物は本質的に無内毒素である。一実施態様では、該組成物はリポソームを含まない。
[0024] 本発明は一態様では、開示のCICの製薬への使用方法を提供する。
[0025] 本発明は一態様では、個体の免疫反応を調節するに足る量の開示のCIC又は組成物を投与することにより個体の免疫反応を調節するという方法を提供する。一実施態様では、該個体はTh2型の免疫反応に関連する疾患たとえばアレルギー又はアレルギー性喘息の患者である。一実施態様では、該個体は感染症患者である。
[0026] 本発明は一態様では、個体のインターフェロン-ガンマ(INF-γ)を増加させるに足る量の開示のCIC又は組成物を投与することにより個体のINF-γを増加させるという方法を提供する。一実施態様では、該個体は炎症性疾患の患者である。一実施態様では、該個体は突発性肺線維症の患者である。
[0027] 本発明は一態様では、個体のインターフェロン-アルファ(INF-α)を増加させるに足る量の開示のCIC又は組成物を投与することにより個体のINF-αを増加させるという方法を提供する。一実施態様では、該個体はウイルス感染者である。
[0028] 本発明は一態様では、有効量すなわち個体の感染症症状を緩和するに足る量の開示のCIC又は組成物を個体に投与することにより個体の感染症症状を緩和するという方法を提供する。
[0029] 本発明は一態様では、有効量すなわちIgE関連疾患を患う個体にIgE関連疾患を緩和するに足る量の開示のCIC又は組成物を投与することにより個体のIgE関連疾患を緩和するという方法を提供する。一実施態様では、該IgE関連疾患はアレルギー又はアレルギー関連疾患である。
[0030] 本発明はさらに、個体の免疫反応を調節するに足る量のCICを個体に投与することにより該個体の免疫反応を調節するという方法を提供する。実施態様によっては、該個体はがん患者及び/又はTh2型免疫反応に関連する疾患(たとえばアレルギー又はアレルギー性喘息)の患者及び/又は感染症の患者である。
[0031] 図1はCICの非核酸スペーサー部分の合成に有用な特定試薬の構造を示す。図に示すのは、HEG、プロピル、TEG、HME、ブチル及び塩基欠失スペーサー部分用のジメトキシトリチル保護ホスホロアミダイト・スペーサー部分前駆体である。 [0032] 図2は、CICの対称又は非対称非核酸スペーサー部分の合成に有用な特定試薬の構造を示す。図に示すのは、グリセロール[2](対称分岐型)、レブリニル-グリセロール[3](非対称分岐型)、「トレブラー」[9]及び「対称ダブラー」[10]スペーサー部分用のジメトキシトリチル保護ホスホロアミダイト・スペーサー部分前駆体である。 [0033] 図3A及び3Bは分岐CICの合成の図解である。 [0033] 図3A及び3Bは分岐CICの合成の図解である。 [0034] 図4はC-105の合成スキームを示す。 [0035] 図5はマウス肺での、CIC鼻腔内投与後の免疫関連遺伝子の発現誘導を示す。 [0036] 図6A-CはIL-12 p40(図6A)、IL-6(図6B)及びTNF-α(図6C)レベルに対するCICの効果を示す。 [0036] 図6A-CはIL-12 p40(図6A)、IL-6(図6B)及びTNF-α(図6C)レベルに対するCICの効果を示す。 [0036] 図6A-CはIL-12 p40(図6A)、IL-6(図6B)及びTNF-α(図6C)レベルに対するCICの効果を示す。 [0037] 図7A-BはC-8(図7A)とC-101(図7B)の構造を示す。 [0037] 図7A-BはC-8(図7A)とC-101(図7B)の構造を示す。
I. 一般的方法
[0038] 本発明の実施では特に断らない限り、分子生物学(遺伝子組換えを含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学及び免疫学の通常の手法、すなわちいずれも技術上周知の手法を使用することになろう。そうした手法は以下の文献で詳しく説明されている: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Sambrook and Russel, 2001) (以下、一括して、また個別に “Sambrook”という); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987. 2001年までの補遺を含む); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academia Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH, 1993); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (以下、一括して、また個別に、“Harlow and Lane”という); Beaucage et al., eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press Inc., New Jersey, 1993).
II. 用語の意味
[0039] 本書で使用する単数形の特定、不特定の名詞は特に断らない限り又は文脈から明らかである場合を除き、複数形を包含する。たとえば文脈から自明であろうが、キメラ免疫調節化合物(CIC)は単数又は複数のCICを包含することがある。同様にCICの成分エレメント(すなわち核酸部分又は非核酸スペーサー部分)は複数のエレメントを包含することがある。たとえばCIC中の「核酸部分」という表現はCIC中の複数の「核酸部分」を包含することもある。
[0040] 本書で互換的に使用する用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は一本鎖DNA(ssDNA)及び二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)及び二本鎖RNA(dsRNA)、修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はそれらの組み合わせを包含する。核酸は線状又は環状構造でもよいし、又はオリゴヌクレオチドは線状、環状の両断片を含んでもよい。核酸は、たとえばホスホジエステル結合又は代替結合たとえばホスホロチオアートエステル結合を介して連結されたヌクレオシドのポリマーである。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン塩基[アデニン(A)又はグアニン(G)、又はそれらの誘導体]又はピリミジン塩基[チミン(T)、シトシン(C)又はウラシル(U)、又はそれらの誘導体]からなる。DNA中の4つのヌクレオシド単位(又は塩基)はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン及びデオキシシチジンという。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。
[0041] 用語「3’」は一般に、あるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の3’末端側すなわち同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の別の領域又は位置に対して下流側の領域又は位置を指す。
[0042] 用語「5’」は一般に、あるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の5’末端側すなわち同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の別の領域又は位置に対して上流側の領域又は位置を指す。
[0043] エレメントたとえば領域、一部分、非核酸スペーサー部分、核酸部分又は配列は、別のエレメントたとえば領域、一部分、非核酸スペーサー部分、核酸部分又は配列と直接境を接するとき、その領域、一部分、スペーサー又は配列に「隣接」しているという。
[0044] 用語「CIC-抗原コンジュゲート」はCICと抗原が結合した複合体をいう。そうしたコンジュゲート結合には共有及び/又は非共有結合が含まれる。
[0045] 用語「抗原」は抗体又はT細胞抗原受容体が特異的に認識し結合する物質をいう。抗原の例はペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質及びリン脂質;それらの部分及び組み合わせなどである。抗原は天然物でも合成物でもよい。CICとの併用投与に適する抗原の例はB細胞又はT細胞の抗原特異的反応を誘発しうる任意の分子などである。抗原は抗体の抗原特異的反応を誘発するものが好ましい。ハプテンは「抗原」に包含される。ハプテンは、それ自体では免疫原性をもたないが、抗原決定基を含む免疫原分子と結合すると免疫原性をおびる低分子化合物である。低分子は免疫原性をおびさせるためにハプテン化する必要があろう。好ましくは、本発明の抗原はペプチド、脂質(たとえばステロール、脂肪酸、リン脂質など)、インフルエンザ・ワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質などを包含する。
[0046] 「アジュバント」は、抗原などのような免疫原物質に加えてその混合物に暴露した受容宿主の該抗原に対する免疫反応を非特異的に増進又は増強させる物質をいう。
[0047] 用語「ペプチド」は生物学的反応たとえば抗体産生又はサイトカイン活性をもたらすに足る鎖長及び組成のポリペプチドであり、ハプテンであるかどうかを問わない。一般に、そうしたペプチドは鎖長が6アミノ酸残基以上である。用語「ペプチド」は(天然物又は非天然物の)修飾アミノ酸を包含し、そうした修飾の非限定的な例はリン酸化、グリコシル化、PEG化、脂質化及びメチル化などである。
[0048] 「抗原ペプチド」の例は、精製した天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗製ペプチド抽出物又は半精製又は未精製の活性状態のペプチド(弱毒化又は不活化したウイルス、細胞、微生物の一部であるペプチドなど)、又はそうしたペプチドの断片などである。従って「抗原ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、1以上の抗原特性を示すポリペプチドの全体又は部分を意味する。従ってたとえば「Amb a 1抗原ポリペプチド」又は「Amb a 1ポリペプチド抗原」は抗原特性(すなわち抗体又はT細胞受容体に特異的に結合する性質)を示すAmb a 1由来のアミノ酸配列であって、全配列か、全配列の一部か、及び/又は全配列の修飾体かは問わない。
[0049] 「送達分子」又は「送達担体」は、CIC、CIC-抗原混合物又はCIC-抗原コンジュゲートの特定部位への及び/又は特定のタイミングでの送達を容易にする、可能にする、及び/又は増進する化学構造部分である。送達担体は免疫反応を追加的に刺激しても、刺激しなくてもよい。
[0050] 「抗原に対するアレルギー反応」は、好酸球の(通常は肺での)及び/又は抗原特異的IgEの生成及びそれらの結果としての効果を一般的な特徴とする免疫反応を意味する。周知のように、IgEは肥満細胞及び好塩基球上のIgE受容体に結合する。IgE認識抗原への暴露が後に起こると、該抗原は肥満細胞及び好塩基球の表面でIgEと架橋結合して、これらの細胞の脱顆粒を、ヒスタミン放出などを非限定的に含めて、引き起こす。言うまでもなく、用語「抗原に対するアレルギー反応」、「アレルギー」及び「アレルギー症状」は本発明のいくつかの方法の適用に等しく好適であるし、また本発明の方法はアレルギー反応の予防と現症としてのアレルギー症状の治療に等しく好適である。
[0051] 用語「アレルゲン」は本書では、被験者への暴露に伴いアレルギー反応を誘発するような抗原又は分子(通常はタンパク質)の抗原性部分を意味する。一般に該被験者は、たとえば膨疹・紅斑テストや技術上周知の任意の検査法によって示されるように該アレルゲンに対してアレルギー性である。ある分子は、被験者のごく小さな部分集合が該分子への暴露に伴いアレルギー性(たとえばIgE)免疫反応を示すだけで、アレルゲンとされる。多数の単離アレルゲンが周知であり、その非限定的な例を本書のTable 1に示す。
[0052] 用語「脱感作」は被験者がそれに対してすでに過敏反応を示しているアレルゲンを逓増用量投与することをいう。脱感作に使用するアレルゲン用量の例は技術上周知であり、Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127などを参照。
[0053] 「抗原特異的免疫療法」は抗原を使用して免疫反応の抗原特異的調節を実現する任意の免疫療法をいう。アレルギーとの関連では抗原特異的免疫療法の非限定的な例は脱感作療法などである。
[0054] 用語「マイクロキャリアー」は、粒径が約150、120又は100μm未満、もっと一般的には約50〜60μm未満である、また約10μm未満又はさらに小さく約5μm未満でもよい、水不溶性の粒子状組成物をいう。マイクロキャリアーは「ナノキャリアー」を包含するが、これは粒径が約1μm未満、好ましくは約500nm未満のマイクロキャリアーである。マイクロキャリアーは固相粒子たとえば生体適合性の天然ポリマー、合成ポリマー又は合成コポリマーから形成される粒子を包含するが、アガロース又は架橋アガロースや他の周知の生物分解性材料から形成されるマイクロキャリアーは本書のマイクロキャリアーの定義に含めても含めなくてもよい。固相マイクロキャリアーは哺乳動物の生理的条件下で非浸食性及び/又は非分解性であるポリマー又は他材料たとえばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ヒドロキシアパタイト、強磁性体及び常磁性体などで形成される。生物分解性の固相マイクロキャリアーを、哺乳動物の生理的条件下で分解性であるポリマーたとえばポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、及びそれらのコポリマーたとえばポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)から、又は浸食性であるポリマーたとえばポリ(オルトエステル)たとえば3,9-ジエチリデン-2,4,8,10-テトラオキサスピロ[5.5]ウンデカン(DETOSU)など又はポリ(無水物)たとえばポリ(セバシン酸無水物)などから形成してもよい。また、マイクロキャリアーは液相(たとえば油性又は脂質性)でもよい。たとえばリポソーム、抗原を欠くISCOM(免疫刺激性複合体すなわちコレステロール、リン脂質及びアジュバント-活性サポニンの安定複合体)、又は水中油又は油中水エマルジョン中に見られる液滴又はミセルなどである。生物分解性の液相マイクロキャリアーは一般に、生物分解性油(多数の例が周知である)たとえばスクアレン及び植物油などを含む。マイクロキャリアーは一般に球形であるが、非球形(たとえば楕円体、棒状など)のマイクロキャリアーでもよい。固相マイクロキャリアーは水不溶性であるため、水や水溶液から(たとえば0.2μmフィルターを使用して)ろ取することができる。
[0055] 用語「非生物分解性(の)」は本書では、哺乳動物の通常の生理的条件下で分解又は浸食されないマイクロキャリアーの性質をいう。一般にマイクロキャリアーは、通常のヒト血清中、37℃、72時間のインキュベーション後に分解していない(すなわちその質量又は平均ポリマー鎖長の損失が5%未満である)ならば、非生物分解性であるとみなされる。
[0056] マイクロキャリアーは、哺乳動物の通常の生理的条件下で分解又は浸食されれば「生物分解性」であるとみなされる。一般にマイクロキャリアーは、通常のヒト血清中、37℃、72時間のインキュベーション後に分解している(すなわちその質量又は平均ポリマー鎖長の損失が5%以上である)ならば、生物分解性であるとみなされる。
[0057] 用語「CIC/マイクロキャリアー複合体」又は「CIC/MC複合体」はCICとマイクロキャリアーとの複合体をいう。該複合体の成分の結合は共有結合でも非共有結合でもよい。非共有結合は任意の非共有結合力たとえば疎水性相互作用、イオン(静電)結合、水素結合及び/又はvan der Waals力を介するものでよい。疎水性結合の場合には、該結合は一般にCICに共有結合した疎水性部分(たとえばコレステロール)を介するものである。
[0058] 「個体」又は「被験者」は脊椎動物たとえばトリ、好ましくは哺乳動物たとえばヒトなどである。哺乳動物の非限定的な例はヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、競技・狩猟用動物、実験動物、げっ歯類動物(マウス、ラットなど)及びペットなどである。
[0059] 物質の「有効量」又は「十分量」は所望の生物学的効果たとえば臨床結果などを含む有益な結果をもたらすに足る量であり、また従って「有効量」はその適用環境に左右される。併用投与抗原に対する免疫反応を調節する組成物の投与との関連では、CIC+抗原の有効量は、抗原を単独投与した場合の免疫反応との比較でそうした調節を実現するに足る量である。有効量は単回又は頻回投与で投与することができる。
[0060] 用語「併用投与」は本書では、免疫反応を調節するに足る短い時間差での2種類以上の物質の投与をいう。好ましくは、併用投与は2種類以上の物質の同時投与をいう。
[0061] 免疫反応たとえばTh1反応の「刺激」は反応の増大を意味し、それは反応の誘発及び/又は増進に由来しうる。同様に、サイトカイン又は細胞型(CLTなど)の「刺激」はサイトカイン又は細胞型の量又はレベルの増大を意味する。
[0062] 「IgE関連疾患」は、持続的でも非持続的でもよいIgEレベルの上昇などを特徴とする生理状態である。IgE関連疾患の非限定的な例はアレルギー及びアレルギー反応、アレルギー関連疾患(後述)、喘息、鼻炎、結膜炎、じん麻疹、ショック、虫(膜翅目)刺されアレルギー、薬物アレルギー及び寄生虫病などである。この用語はこれらの疾患の発現を包含する。一般に、そうした疾患ではIgEは抗原特異的である。
[0063] 「アレルギー関連疾患」は抗原特異的IgE免疫反応の影響に由来する疾患を意味する。そうした影響の非限定的な例は低血圧症及びショックなどである。アナフィラキシーはアレルギー関連疾患の例であり、その間は血液循環中に放出されるヒスタミンが血管拡張や毛細血管の透過性増大を引き起こし、その結果として血液循環に由来する血清が著しく失われる。アナフィラキシーは関連の影響が全身に及ぶ全身性の場合もあれば、反応が特定の標的組織又は器官に限定される局所性の場合もある。
[0064] 用語「ウイルス病」は本書ではウイルスを病因とする疾患をいう。ウイルス病の例はB型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(AIDS)及び帯状疱疹などである。
[0065] 「治療」は本書では、また当業者も十分理解しているように、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための取り組みである。本発明では、有益な又は所望の結果は1以上の症状の緩和又は改善、疾患の程度の逓減、病態の安定化(すなわち非悪化)、疾患の蔓延防止、疾患の進行遅延又は減速、及び(部分的又は完全)寛解を、検出可能か不能かを問わず、非限定的に包含する。「治療」はまた、治療を受けない場合の期待余命との比較で見た延命を意味する。
[0066] 疾病又は疾患の「一時的緩和」は、その治療を施さなかった場合と比較して、疾患又は病態の程度及び/又は不都合な臨床的発現が軽減される、及び/又は進行の時間的経過が遅くなる又は長くなることを意味する。特にアレルギーとの関連では、当業者も十分理解しているように、一時的緩和はアレルゲンに対する免疫反応の調節により起こるであろう。さらに、苦痛緩和は単回投与で起こるとは限らず、しばしば頻回投与によって起こる。従って反応又は疾患の一時的緩和を引き起こすに足る量の投与は単回投与でも頻回投与でもよい。
[0067] CIC+抗原によって「誘発」される「抗体力価」又は「抗体量」はCIC+抗原を投与した後の時点での、特定抗原の実測量をいう。
[0068] 「Th1関連抗体」は、その産生及び/又は増加がTh1免疫反応に関連する抗体をいう。たとえばIgG2aはマウスのTh1関連抗体である。本発明では、Th1関連抗体の測定は1以上のそうした抗体の測定となる。たとえばヒトではTh1関連抗体の測定はIgG1及び/又はIgG3の測定を伴う可能性がある。
[0069] 「Th2関連抗体」は、その産生及び/又は増加がTh2免疫反応に関連する抗体をいう。たとえばIgG1はマウスのTh2関連抗体である。本発明では、Th2関連抗体の測定は1以上のそうした抗体の測定となる。たとえばヒトではTh2関連抗体の測定はIgG2及び/又はIgG4の測定を伴う可能性がある。
[0070] ある機能又は活性たとえばサイトカイン産生、抗体産生又はヒスタミン放出の「抑制」又は「阻害」は、着目している条件又はパラメーターを除いてまったく同じ条件と比較したときの、あるいは別の条件と比較したときの、該機能又は活性の一段の低減である。たとえば、CICとヒスタミン放出を抑制する抗原とを含む組成物は抗原単独の場合と比較してヒスタミン放出を一段と低減する。また、CICと抗体産生を抑制する抗原とを含む組成物は抗原単独の場合と比較して抗体の程度及び/又はレベルを一段と低減する。
[0071] 本書では、製剤組成物について「GMP規格に則って」製造又は調製したというとき、該組成物は滅菌した、実質的に等張の組成物として、米食品医薬品局の医薬品製造管理・品質管理(GMP)基準に完全に準拠して製造されることを意味する。
[0072] 用語「免疫原(の)」は本書では、通常の技術的な意味をもち、人間又は動物に注射すると適応免疫反応を誘発する作用物質(ポリペプチドなど)を形容する。該免疫反応はB細胞(体液性)反応及び/又はT細胞(細胞性)反応であろう。
[0073] 数値範囲はすべて限界値を含むものとする。たとえば2ないし7又は2と7の間を意味する「2〜7」ヌクレオチドからなるポリマーは、2ヌクレオチドのポリマーと7ヌクレオチドのポリマーを含む。下限値と独立に選択される上限値とが記載されるとき、上限値が下限値を上回ることは言うまでもない。
III . キメラ免疫調節化合物
[0074] 本発明は、個体たとえば人間を含む哺乳動物の免疫反応を調節するうえで特に有用なキメラ免疫化合物(CIC)を提供する。本発明は、一つには、非核酸スペーサー部分に共有結合した核酸部分を含むある種のキメラ分子が特にヒト細胞中で免疫調節活性をもつという発見に基づく。この活性は意外にも、該核酸部分が単独のポリヌクレオチドとして存在すれば有意の免疫調節活性を示さないような配列をもつ場合でも、明白である。
[0075] 従って本発明は、免疫反応を調節するための新しい試薬及び方法を、ヒト又は他動物の疾患の治療及び予防法を含めて、提供する。
[0076] 以下の項では本発明のCICの構造と特性、及びCICの構成成分たる核酸部分及び非核酸部分の構造と特性を説明する。
1. CICのコア構造
[0077] 本発明のCICは1以上の核酸部分と1以上の非核酸スペーサー部分とを含む。多様な構造をもつCICが見込まれる。たとえば例示的なCICは後掲の式Ｉ〜VII に示すようなコア構造をもつ。式Ｉ〜III は「線状CIC」のコア配列を、式IV〜VIは「分岐CIC」のコア配列を、また式VII は「単一スペーサーCIC」のコア構造を示す。
[0078] 後掲の各式では、Nは核酸部分(向きは5’→3’方向又は3’→5’方向)を示し、Sは非核酸スペーサー部分を示す。ダッシュ(-)は核酸部分と非核酸スペーサーの間の共有結合を示す。ダブルダッシュ(--)は非核酸スペーサー部分と2以上の核酸部分の間の共有結合を示す。トリプルダッシュ(---)は非核酸スペーサー部分と多数(3以上)の核酸部分の共有結合を示す。添え字は核酸部分又は非核酸スペーサー部分の位置の違いを示すために使用する。しかし、異なる核酸部分の識別を目的とした添え字の使用は、それらの部分が異なる構造をもつことを意味するとは限らない。同様に、異なるスペーサー部分の識別を目的とした添え字の使用は、それらの部分が異なる構造をもつことを意味するとは限らない。たとえば後掲式IIの核酸部分N1及びN2は構造が同じでも異なってもよいし、またスペーサー部分S1及びS2も構造が同じでも異なってもよい。
A. 線状CIC
[0079] 一実施態様では、CICはコア構造
N1-S1-N2(Ｉ)
を含む。
[0080] 一実施態様では、CICはコア構造
N1-S1-N2-S2-N3 (II)
を含む。
[0081] 一実施態様では、CICはコア構造
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A (III )
を含む。ただしAは1〜約100の整数であり、非核酸スペーサー部分に結合した核酸部分からなる単位[Nv-Sv]がA回繰り返されることを示す。添え字のvは、N及びSが[Nv-Sv]の繰り返しのたびに独立に選択されることを示す。Aはときには1〜約10であり、ときには1〜3であり、ときには厳密に1、2、3、4又は5である。実施態様によっては、Aは下限値を1、2、3、4又は5とし上限値を10、20、50又は100とする範囲(たとえば3〜10)内の整数である。
[0082] 実施態様次第でCICは式Ｉ、II又はIII の構造をもつ。しかし本発明のいくつかの実施態様では、線状CICは式Ｉ〜III に示される構造を、非限定的に含む。すなわち式Ｉ、II及びIII は、非核酸スペーサー部分がわずか2個の核酸部分に共有結合しているコア構造を規定するものである。しかし、数多くの実施態様ではコア構造の末端に追加の化学構造部分(たとえばリン酸、モノヌクレオチド、追加の核酸部分、アルキル基、アミノ基、チオ基又はジスルフィド基又は結合基、及び/又はスペーサー部分)が共有結合するものと見込まれる。たとえば、CIC中のすべての核酸部分が5’-TCGTCGA-3’であり、またスペーサー部分がヘキサエチレングリコール(HEG)、ホスホロチオアート結合したHEGマルチマー、及びグリセロールより選択されるとすれば、式Ｉのコア構造をもつCICは次の各式を包含する:
Figure 2010189400
Figure 2010189400
[0083] すぐ分かるように、式Ｉのコア構造を含むCIC群は式II又はIII のコア構造を含むCIC群を包含する。
[0084] 実施態様によっては、1以上のスペーサー部分は互いに結合したもっと小さな単位(HEG、TEG、グリセロール、C3アルキルなど)を含む。一実施態様では、その場合の結合はエステル結合(ホスホジエステル又はホスホロチオアートエステル結合など)又は他の結合(後述)である。
[0085] 実施態様によっては、CICの末端構造が共有結合し(たとえば核酸部分-核酸部分; スペーサー部分-スペーサー部分; 又は核酸部分-スペーサー部分)、結果的に環状構造を生み出す。
B. 分岐CIC
[0086] 一実施態様では、CICはコア構造
Figure 2010189400
 を含む。ただしSpは、独立に選択されるA個の核酸部分Nvに共有結合した多価スペーサー部分であり、またAは3以上たとえば厳密に3、4、5、6又は7であるか又は8以上である。多様な実施態様では、Aは3〜100の整数である。実施態様によっては、Aは下限値を約3、5、10、50又は100とし、独立に選択される上限値を約5、7、10、50、100、150、200、250又は500とする範囲の整数である。また実施態様次第で、Aは約500を超えると見込まれる。
[0087] 関連実施態様では、CICはコア構造
Figure 2010189400
 を含む。ただしSpは、独立に選択されるA個のエレメントNv-Svすなわち核酸部分に共有結合したスペーサー部分を含むエレメントに共有結合した多価スペーサー部分であり、Aは3以上である。多様な実施態様では、Aは3〜100の整数である。実施態様によっては、Aは下限値を5、10、50又は100とし、独立に選択される上限値を10、50、100、150、200、250又は500とする範囲の整数である。また実施態様次第で、Aは約500を超えると見込まれる。関連実施態様では、CICはコア構造
Figure 2010189400
 を含む。ただしSpは、独立に選択されるA個の核酸部分Nvに共有結合した多価スペーサー部分であり、少なくとも1つの核酸部分N1がスペーサー部分S1に結合しており、またAは2以上である。一実施態様では、Aは2である。多様な実施態様では、Aは3、4、5であり、又は3〜100の整数である。実施態様によっては、Aは下限値を5、10、50又は100とし、独立に選択される上限値を10、50、100、150、200、250又は500とする範囲の整数である。また実施態様によっては、Aは約500を超えると見込まれる。実施態様によっては、CICは式Ｉ、II又はIII の構造をもつ。しかし、本発明によれば分岐CICは式IV、Ｖ又はVIで示される構造を非限定的に含む。すなわち式IV、Ｖ又はVIは多価スペーサー部分(Sp)が少なくとも3つの核酸部分に共有結合しているコア構造を規定する。実施態様によっては、コア構造の末端に追加の化学構造部分(たとえばリン酸、モノヌクレオチド、追加の核酸部分、及び/又はスペーサー部分)が共有結合するものと見込まれる。たとえば、CIC中のすべての核酸部分が5’TCGTCGA3’であり、またスペーサー部分がすべてグリセロール又はHEGであるとすれば、式IVのコア構造をもつCICは次の各式を包含する:
Figure 2010189400
[0088] すぐ分かるように、たとえば式IVのコア構造を含むCIC群は式Ｖ又はVIのコア構造を含むCIC群を包含する。本発明の好ましい実施態様では、該CICは少なくとも2つの異なる(すなわち配列の異なる)核酸部分を含む。
[0089] 実施態様によっては、1以上のスペーサー部分は互いに結合したもっと小さな単位(HEG、TEG、グリセロール、C3アルキルなど)を含む。一実施態様では、その結合はエステル(ホスホジエステル又はホスホロチオアートエステルなど)結合である。
C. 単一スペーサーCIC
[0090] 本発明の別の態様では、CICは単一核酸部分が単一スペーサー部分に共有結合した構造すなわち
Figure 2010189400
 を含む。
[0091] 本発明の一実施態様では、S1はたとえば後述のように、一般にエステル(ホスホジエステル又はホスホロチオアートエステルなど)結合によって結び付いたもっと小さい単位(HEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボース、C2アルキル〜C12アルキルの基本単位など)を含むマルチマー構造をもつ。たとえば後掲の式VII aを参照。該マルチマーはヘテロマーでもホモマーでもよい。一実施態様では、該スペーサーはエステル(ホスホジエステル又はホスホロチオアートエステルなど)結合によって結び付いたモノマー単位(HEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボース、C2アルキル〜C12アルキルのリンカーなど)のヘテロマーである。たとえば後掲式VII bを参照。
[0092] たとえば、核酸部分が5’TCGTCGA3’であり、またスペーサー部分がホスホロチオアート結合したHEGのマルチマー(HEG)15であるとすれば、式VII のコア構造をもつCICは次の式を包含する:
Figure 2010189400
[0093] 同様にたとえば、核酸部分が5’TCGTCGA3’であり、またスペーサー部分がHEGとプロピルの交互配置基本単位のホスホロチオアート結合マルチマーであるとすれば、式VIのコア構造をもつCICは次の式を包含する:
Figure 2010189400
2. CICの免疫調節活性
[0094] 本発明のCICは免疫調節活性をもつ。「免疫調節(の)」、「免疫調節活性」又は「免疫反応を調節する」という用語は本書では免疫刺激効果と免疫抑制効果の両方にわたる。本発明に従って免疫調節される免疫反応は一般に「Th2型」免疫反応ではなく「Th1型」免疫反応の側にシフトする。Th1型反応は一般に、細胞性免疫系(たとえば細胞傷害性リンパ球)の反応と考えられ、またTh2型反応は一般に「体液性」又は抗体依存性である。Th1型免疫反応は通常、抗原に対する「遅延型過敏」反応を特徴とする。Th1型反応は生化学レベルで、Th1関連サイトカインたとえばIFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12及びIFN-β、それにIL-6などのレベルの上昇によって検出することができる。ただしIL-6はTh2型反応にも関連する可能性がある。Th2型免疫反応は一般にIgE産生を含む抗体産生レベルの上昇、CTL産生の欠如又は最小化、それにTh2関連サイトカインたとえばIL-4及びIL-5の発現などに関連する。
[0095] 本発明に基づく免疫調節はin vitro、in vivo及び/又はex vivo測定(検定)によって認定されよう。免疫調節活性を指し示す測定可能な免疫反応の非限定的な例は抗原特異的抗体産生、サイトカイン分泌、リンパ球(NK細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、Bリンパ球など)個体群の活性化又は増大などである。たとえば次の文献を参照: 国際公開WO 97/28259号; WO 98/16247号; WO 99/11275号; Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-1845; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158: 3635-3639; Sato et al. (1996) Science 273:352-354; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423; Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997) Nat Med. 3:849-54; Lipford et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344; 国際公開WO 98/55459号; WO 00/61151号; Pichyangkul et al. (2001) J. Imm. Methods 247: 83-94。また後の実施例も参照。以下、特定の有用な検定法を説明するが、その目的は限定ではなく説明にある。
[0096] 検定は一般に、試験試料(たとえばCIC、ポリヌクレオチド及び/又は他の作用物質を含有する試料)を細胞、組織、動物等に投与するか又は接触させ、反応を測定することによって行う。CIC又はポリヌクレオチドを含有する試験試料は、検定タイプにふさわしいと当業者がみなす多様な形態又は濃度とすることができる。たとえば細胞ベースの検定なら、CIC又はポリヌクレオチドはしばしば20μg/ml又は10μg/ml又は2μg/mlの濃度で使用する。一般に検定では、濃度は260nmでの吸光度を測定し、0.5 OD260/ml=20μg/mlの換算式を使用して求める。この方法は試験試料中の全核酸の量を標準化するので、たとえばスペーサー部分が260nmで有意の吸光度を示さないときなどに使用されよう。あるいは、技術上周知の他の方法で濃度又は重量を求めてもよい。必要なら、260nmでの吸光度を測定し、CICの重量をCICの分子式から計算して核酸部分の量を求めることもできる。この方法は、CIC中のスペーサー部分重量の核酸部分重量に対する比が高い(すなわち1を超える)ときなどに使用する。
[0097] 免疫調節活性の検定では陽性及び陰性対照が有用であることも同様に自明であろう。免疫調節活性の検定に好適な陽性対照は配列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO:2)をもつ免疫調節ホスホロチオアートDNAである。もちろん当業者には免疫調節活性をもつ他の好適な陽性対照も明白であろう。好適な陰性対照の一例は無試験物質(すなわち賦形剤又は溶媒単独。ある種のin vitro検定では「細胞単独」ともいう)である。あるいは実施態様によっては、配列5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)をもつホスホロチオアートDNAを陰性対照として使用する。当業者は本書の開示と通常の検定方案を手引きとしながら他の陰性対照を設計することもできる。
[0098] 有用な検定法の一種は「サイトカイン反応検定」である。例示的な免疫調節活性検定法ではヒト末梢血単核細胞(PBMC)のサイトカイン反応を測定する[たとえばBohle et al. (1999), Eur. J. Immunol. 29:2344-53; Verthelyi et al. (2001) J. Immunol. 166: 2372-77に記載の検定法]。この検定法の一実施態様では、1人以上の健常な有志ドナーから末梢血を採取し、PBMCを抽出する。一般に血液はヘパリン加注射器を用いて静脈穿刺法で採取し、Ficoll(登録商標; Amersham Pharmacia Biotech.)比重液上に重層し、遠心分離する。次いでPBMCをFicoll境界相から回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗う。細胞を再懸濁させ、(48穴又は96穴プレートなどを使用して)RPMI 1640培地[熱不活化ヒトAB血清10%、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、グルタミン300μg/ml、ピルビン酸ナトリウム1mM、及び1×MEM非必須アミノ酸(NEAA)を添加]中、2×106細胞/mlを試験試料又は対照の存在及び不存在下に24時間培養する。
[0099] 各ウェルから無細胞培地を回収し、IFN-γ及び/又はINF-α濃度を検定する。免疫活性は、試験化合物に接触させたPBMCのIFN-γ分泌量が試験化合物の不存在下での、又は実施態様によっては不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)]の存在下でのPBMCによる分泌量を有意に上回る(たとえば約3倍以上、通常は約5倍以上である)ときに、検出される。逆に、試験化合物に接触させたPBMCのIFN-γ分泌量が試験化合物の不存在下での、又は不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)]の存在下でのPBMCによる分泌量を有意に上回らなければ(たとえば約2倍未満であれば)、試験化合物は免疫活性をもたない。
[0100] INF-α濃度の検定では、試験化合物に接触させたPBMCのIFN-α分泌量は試験化合物の不存在下での、又は実施態様によっては不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)]の存在下でのPBMCによる分泌量をしばしば有意に(たとえば場合により約2倍以上、又は約3倍以上)上回る。実施態様によっては、対照と比較した場合の有意のINF-αレベル差は約5倍以上、約10倍以上、さらには約20倍以上である。逆に、試験化合物に接触させたPBMCのIFN-α分泌量が試験化合物の不存在下での、又は不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACC TTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)]の存在下でのPBMCによる分泌量を有意に上回らなければ(たとえば約2倍未満であれば)、試験化合物は免疫活性をもたない。
[0101] 後の実施例で説明するように、CICには、その投与がINF-γ、INF-α両方の分泌に著しい効果をもたらすものもあれば、逆にINF-α又はINF-γの分泌にあまり効果を及ぼさないものもある。たとえば実施例49を参照。
[0102] 細胞増殖検定たとえばB細胞増殖検定もまた有用な検定法の一種である。B細胞増殖に対する作用物質(たとえばCIC)の効果は、技術上周知の多様な検定法のうち任意のものを用いて検定することができる。実施例41で例示的なB細胞増殖検定法を示す。
[0103] たとえば細胞ベースの検定(サイトカインや及び増殖検定など)ではドナーによるバラツキへの対策として、複数の異なるドナーに由来する細胞(PBMCなど)を使用するのが好ましい。ドナー数は通常2以上(たとえば2)、好ましくは4以上(たとえば4)、ときに10以上(たとえば10)である。免疫調節活性は試験化合物の存在下でのIFN-γ分泌量が(健常被験ドナーの半数以上で、好ましくは75%以上で、最も好ましくは85%以上で)試験化合物の不存在下での又は実施態様によっては前述のような不活性対照化合物の存在下での分泌量の約3倍以上又は約5倍以上であるときに、検出される。
[0104] in vitro検定もたま、たとえば後の実施例42で説明するようにマウス細胞を使用して、又は他の哺乳動物細胞を使用して、行うことができる。
[0105] 実施例43、44及び46(マウス)、それに実施例45(非ヒト霊長類)で、例示的なin vitro検定法を説明する。
[0106] 特に断らない限り、又は明白である場合を除き、後の実施例で説明するサイトカイン検定はヒトPBMCを使用して、実施例28で説明するプロトコールにほぼ沿って行う。マルチウェルプレート又は他のマルチチャンバー器材などを使用すれば、多数の試験化合物を同時に検定することができる。必要なら、技術上周知のコンピュータ制御ロボット機構を使用して検定を行うこともできる。
3. 核酸部分
[0107] 本発明のCICは1以上の核酸部分を含む。本書では、用語「核酸部分」はヌクレチオドのモノマー(モノヌクレオチド)又はポリマー(2以上の連続したヌクレオチドを含むポリマー)をいう。ヌクレオチドは本書では、(1)リン酸基にエステル結合している糖に結合したプリン又はピリミジン塩基、又は(2)該塩基及び/又は糖及び/又はリン酸エステルがたとえば後述のような類似体に置き換わった類似体、を含む。2以上の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は同じでも異なってもよい。
[0108] 以下の三節では、核酸部分の特徴たとえば鎖長、配列又は配列モチーフの存在及び位置について説明し、併せて核酸部分とそうした核酸部分を含むCICの特性と構造について説明する。
A. 鎖長
[0109] 通常、核酸部分は鎖長が1〜100ヌクレオチドである。ただし実施態様次第でもっと長い鎖長も可能である。実施態様次第でCIC中の核酸部分の鎖長は7ヌクレオチド以下(すなわち1、2、3、4、5、6又は7ヌクレオチド)である。多様な実施態様では、核酸部分は(たとえば鎖長が7ヌクレオチド以下の核酸部分のように)鎖長が少なくとも2ヌクレオチド、しばしば少なくとも3、4、5、6、又は7ヌクレオチドである。別の実施態様では、核酸部分は鎖長が少なくとも10、20又は30ヌクレオチドである。
[0110] 後の実施例で示すように、7mer、6mer、5mer、4mer及び3merの核酸部分を含むCICは免疫刺激検定では活性であった(実施例36及び37を参照)。従って実施態様によっては、CICは鎖長7ヌクレオチド以下の核酸部分を少なくとも1つ含むことが見込まれる。実施態様によっては、CIC中のすべての核酸部分が鎖長7ヌクレオチド以下であろう(たとえばポリヌクレオチド数で示される鎖長は下限値を2、3、4、5又は6とし、独立に選択される上限値を5、6又は7とする範囲内であろう。ただし上限値は常に下限値を上回るものとする)。たとえば一実施態様では、CIC中の規定核酸部分は(該CIC中のすべての核酸部分を含めて)鎖長が6又は7ヌクレオチドであろう。一実施態様では、CICは2つのスペーサー部分と鎖長7塩基以下(たとえば5、6又は7塩基)の介在核酸部分とを含む。
[0111] 複数の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は同じ場合も異なる場合もあると見込まれる。一実施態様では、CIC中の1以上又は大部分の(たとえば約2以上の、約4以上の、又は約25%以上の、約50%以上の、約75%以上の)、又はすべての核酸部分が鎖長7ヌクレオチド以下であり、実施態様次第で7ヌクレオチド未満、6ヌクレオチド未満、2〜6ヌクレオチド、2〜7ヌクレオチド、3〜7ヌクレオチド、4〜7ヌクレオチド、5〜7ヌクレオチド、また6〜7ヌクレオチドである。
[0112] 後で詳述するように、しばしばCIC中の少なくとも1つの核酸部分は配列CGを含む(たとえばTCGを含む)か又は本書で開示する含CGモチーフを含む。一実施態様では、少なくとも1つの核酸部分は含CG核酸モチーフを含み、また鎖長が7ヌクレオチド以下である(たとえば前記のような7ヌクレオチド以下の規定鎖長をもつ)。関連実施態様では、CIC中の鎖長8ヌクレオチドを超える核酸部分はどれも配列CGを、又は随意に配列TCG又はACGを含まない(すなわち配列CGを含むCIC中の核酸部分はすべて鎖長が7ヌクレオチド以下である)。一実施態様では、CIC中の1以上の核酸部分はCG配列を含まない。
B. 配列とモチーフ
[0113] 前述のように、特定の核酸部分は多様な鎖長をもちうる。一実施態様では、該核酸部分は鎖長が7ヌクレオチド以下である。一実施態様では、該核酸部分は鎖長が8ヌクレオチド以上である。多様な実施態様では、本発明のCIC中の少なくとも1つの核酸部分は後に開示する配列を含む。
[0114] 以下の式では、すべての配列が5’→3’方向であり、また次の略語を使用する: B=5-ブロモシトシン; bU=5-ブロモウラシル; a-A=2-アミノ-アデニン; g=6-チオ-グアニン; t=4-チオ-チミン; H=5位にハロゲンなどの電子吸引性置換基を含む修飾シトシン。多様な実施態様では、後掲配列中のシトシン(C)がN4-エチルシトシン又はN4-メチルシトシン又は5-ヒドロキシシトシンで置き換わる。多様な実施態様では、式中のグアノシン(G)は7-デアザグアノシンに置き換わる。
[0115] これまでに試験したCICでは、CGの存在はサイトカイン誘導活性と相関する。従って一実施態様では、CICの少なくとも1つの核酸部分は少なくとも1つの5’-CG-3’(5’-シトシン,グアニン-3’)配列を含む。該シトシンはC-5位でメチル化されていないし、また好ましくはどの位置でもメチル化されていない。
[0116] 一実施態様では、1以上の核酸部分が3〜7塩基を含む。一実施態様では、該核酸部分は3〜7塩基を含み、また配列
Figure 2010189400
 をもつ。ただし各Xは独立に選択されるヌクレオチドである。実施態様によっては、CICは前記の配列をもつ核酸部分を3以上、10以上、30以上又は100以上含む。
[0117] 一実施態様では、核酸部分は配列5’-TCG-3’(5’-チミジン,シトシン,グアニン-3’)を含み、非限定的な例として 3merのTCG、4merのTCGX(TCGAなど)、5merのTCGXX(TCGTC及びTCGATなど)、6merのTCGXXX、XTCGXX及びTCGTCG、それに7merのTCGXXXX、XTCGXXX、XXTCGXX及びTCGTCGXを含む(ただしXは任意の塩基である)。しばしば、少なくとも1つの核酸部分は配列5’-TCGA-3’(5’-チミジン,シトシン,グアニン,アデノシン-3’)を含み、たとえば配列5’-TCGACGT-3’を含む。
[0118] 実施態様によっては、核酸部分は配列
Figure 2010189400
 を含む(ただしXは任意のヌクレオチドである)。
[0119] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-X1X2CGX3X4-3’を含む(ただしX1は0〜10ヌクレオチドであり、X2は無又はA、T又はUであり、X3は無又はAであり、またX4は0〜10ヌクレオチドである)。一実施態様では、該核酸部分は3’末端でスペーサー部分と結合している。実施態様によっては、X1は0〜5ヌクレオチド又は0〜2ヌクレオチドであり、またX4は0〜5ヌクレオチド又は0〜2ヌクレオチドである。
[0120] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-プリン,プリン,C, G,ピリミジン,ピリミジン-3’; 5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン,C,G-3’; 又は5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン, C,C -3’を、たとえば(いずれも5’→3’)
Figure 2010189400
 を含む。実施態様によっては、核酸部分は配列5’-プリン,プリン,シトシン,グアニン,ピリミジン,ピリミジン,シトシン,シトシン-3’又は5’-プリン,プリン,シトシン,グアニン,ピリミジン,ピリミジン,シトシン,グアニン-3’を含む。
[0121] 実施態様によっては、核酸部分は配列AACGTTCG; AACGTTCC; AACGUTCG; AABGTTCG; AABGUTCG及び/又はAABGTTBGを含む(いずれも5’→3’)。
[0122] 多様な実施態様では、核酸部分は5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:4)モチーフを含む。ただしX1はT、G、C又はBであり、X2はT、G、A又はUであり、X3はT、A又はCであり、X4はT、G又はUであり、また該配列は5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:5)でも5’-GGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO:6)でもない。例は下記の配列である(いずれも5’→3’):
Figure 2010189400
Figure 2010189400
[0123] 多様な配列では、核酸部分は配列
Figure 2010189400
Figure 2010189400
 を含む。
[0124] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む: 5’-X1X2AX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:53) (式中X1はT、G、C又はBであり、X2はT、G、A又はUであり、X3はT、A又はCであり、X4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該核酸部分は5’-TGAABGTTCG-3’(SEQ ID NO:54)ではない。例は下記の配列である(いずれも5’-3’):
Figure 2010189400
[0125] 実施態様によっては、核酸部分は配列
Figure 2010189400
 を含む。
[0126] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む: 5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:75) (式中X1はT、C又はBであり、X2はT、G、A又はUであり、X3はT、A又はCであり、X4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該式は5’-TGAACG TTCG-3’(SEQ ID NO:5)ではない。
[0127] 他の実施態様では、該核酸部分は配列
Figure 2010189400
Figure 2010189400
 を含む。
[0128] 実施態様によっては、前掲のうち任意の配列に関して、核酸部分はさらに、1個、2個、3個の、又は4個以上のTCG及び/又はTBG及び/又はTHG配列を、好ましくは前掲規定配列の5’側に含む。該TCG及び/又はTBGは前掲配列に隣接してもしなくてもよい。たとえば、実施態様によっては、核酸部分は次のうち任意の配列を含む:
Figure 2010189400
 実施態様によっては、該追加TCG及び/又はTBG配列は基準(reference)配列のすぐ5’側にあり、かつ基準配列に隣接する。他の実施態様では、1又は2塩基の間隔が存在する。
[0129] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-(TCG)wNyAX3 CGX4TCG-3’ (SEQ ID NO:102)をもつ(式中wは1〜2であり、yは0〜2であり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。
[0130] 実施態様によっては、該核酸部分は次のうち任意の配列を含む:
Figure 2010189400
[0131] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-(TBG)zNyAX3 CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:115)を含む(式中zは1〜2であり、yは0〜2であり、Bは5-ブロモシトシンであり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。
[0132] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む:
Figure 2010189400
[0133] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-TCGTBGNyAX3 CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:121)を含む(式中yは0〜2であり、Bは5-ブロモシトシンであり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該核酸部分は次のうち任意の配列を含む:
Figure 2010189400
[0134] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-(TCG)wNyAX3BG X4TCG-3’(SEQ ID NO:125)を含む(式中wは1〜2であり、yは0〜2であり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該核酸部分は次のうち任意の配列を含む: TCGGAAABGTTCG (SEQ ID NO:126)又はTCGAABGTTCG (SEQ ID NO:127)。
[0135] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-(TBG)zNyAX3BG X4TCG-3’(SEQ ID NO:128)を含む(式中zは1〜2であり、yは0〜2であり、Bは5-ブロモシトシンであり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該核酸部分は次のうち任意の配列を含む: TBGAABGUTCG (SEQ ID NO:129)又はTBGAABGTTCG (SEQ ID NO:130)。
[0136] 実施態様によっては、核酸部分は配列5’-TCGTBGNyAX3 BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:131)を含む(式中yは0〜2であり、Bは5-ブロモシトシンであり、Nは任意の塩基であり、X3はT、A又はCであり、またX4はT、G又はUである)。実施態様によっては、該核酸部分は次のうち任意の配列を含む: TCGTBGAABGUTCG (SEQ ID NO:132)又はTCGTBGAABGTTCG (SEQ ID NO:133)。
[0137] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む: AACGTTCC、AACGTTCG、GACGTTCC、GACGTTCG。
[0138] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む:
Figure 2010189400
[0139] 実施態様によっては、核酸部分は次の配列を含む:
Figure 2010189400
[0140] 実施態様によっては、核酸部分は配列AACGUUCC、AACGUUCG、GACGUUCC及びGACGUUCGのRNAを含む。
[0141] 実施態様によっては、核酸部分は同時係属、共同譲受の米国特許出願第09/802,685号(米国出願公開第20020028784A1号として2002年3月7日に、またWO 01/68077号として2001年9月20日に、それぞれ公開)及び同時係属の米国出願第10/033,243号で、又はPCT公開WO 97/28259号; WO 98/16247号; WO 98/55495号; WO 99/11275号; WO 99/62923号; 及びWO 01/35991号で開示されている「配列又は配列モチーフ」を含む配列をもつ。核酸部分はまた、鎖長8ヌクレオチドを上回る(しばしば著しく上回る)ポリヌクレオチドとして投与すると免疫刺激活性に関連することが、たとえば以下の文献などですでに報告されている配列のうちいずれか又はいくつかを含む配列をもってもよい:
Figure 2010189400
Figure 2010189400
Figure 2010189400
一実施態様では、CICの少なくとも1つの核酸部分はPCT公開WO 01/22972号で開示されているように、TG配列又はピリミジン・リッチ(たとえばTリッチ又はCリッチ)配列を含む。[0142] 実施態様によっては、該核酸部分は次の1以上の6mer以外である:
Figure 2010189400
[0143] 実施態様によっては、CICは前記の配列をもつ核酸部分を3以上、10以上、30以上又は100以上含む。
C. 核酸部分の配列: 異質性及び位置の効果
[0144] 複数の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は同じ場合も異なる場合もあると見込まれる。
[0145] 一実施態様では、CIC中のすべての核酸部分が同じ配列をもつ。一実施態様では、CIC中の2以上、3以上、4以上、5以上又は6以上の、又はもっと多くの核酸部分が異なる配列をもつ。一実施態様では、CICは10未満の異なる核酸部分を含む。一実施態様では、CIC中の各核酸部分が異なる配列をもつ。
[0146] 実施態様によっては、単一核酸部分が§(3)Bに記載の1配列モチーフの、又は2以上の異なる配列モチーフの、2回以上の繰り返しを含む。単一核酸部分内の複数のモチーフは隣接する、重複する、又は該核酸部分内の追加ヌクレオチド塩基によって隔てられる場合もある。一実施態様では、核酸部分は1以上のパリンドローム領域を含む。一本鎖オリゴヌクレオチドの場合、用語「パリンドローム(の)」は、該オリゴヌクレオチドが相補配列と複合して二本鎖分子を形成するとしたらパリンドロームになると見られる配列を形容する。別の実施態様では、1つの核酸部分がCIC中の第2の核酸部分に対してパリンドローム又は部分的パリンドロームの関係にある配列を含む。本発明の一実施態様では、CIC中の1以上の核酸部分の配列はパリンドロームではない。本発明の一実施態様では、CIC中の1以上の核酸部分の配列は鎖長が5塩基以上の、随意に6塩基以上のパリンドローム配列を含まない。
[0147] 後述のように多様な実施態様では、CIC中の1以上の(たとえばすべての)核酸部分は5’-CG-3’配列を、あるいは5’-TCG-3’配列を含む。一実施態様では、核酸部分は鎖長が5、6又は7塩基である。一実施態様では、核酸部分は式5’-TCG[(X)2-4]-3’又は5’-TCG(A/T)[(X)1-3]又は5’-TCG(A/T)CG(A/T)-3’又は5’-TCGACGT-3’をもつ(式中Xは独立に選択されるヌクレオチドである)。一実施態様では、前記の核酸部分は5’部分である。
[0148] 一実施態様では、核酸部分は配列5’-TCGTCGA-3’を含む。一実施態様では、核酸部分は次の群(いずれも5’→3’)より選択される配列を含む:
Figure 2010189400
 TCGXX、TCGAX、TCGAT、TCGTT、TCGTC; TCGA、TCGT及びTCGX (式中XはA、T、G又はCであり、Uは2’-デオキシウリジンであり、またBは5-ブロモ-2’-デオキシシチジンである)。
[0149] 一実施態様では、該核酸部分は配列
Figure 2010189400
 をもつ7merであるか、又は配列TCGXXX、TCGAXX、TCGTCG、AACGTT、ATCGAT、GTCGTT又はGACGTTをもつ6merであるか、又は配列TCGXX、TCGAX、TCGAT、TCGTT又はTCGTCをもつ5merであるか、又は配列TCGA、TCGT又はTCGXをもつ4merであるか、又は配列TCGをもつ3merである(ただしXはA、T、G又はCである)。
[0150] 一実施態様では、CIC中の約50%以上又は約75%以上の、またときにはすべての核酸部分が前記配列を少なくとも1つ含む。一実施態様では、少なくとも1つの核酸部分はCGモチーフを含まない。別の実施態様では、CIC中の約25%以上の、ときに約50%以上の、またときに約75%以上の核酸部分がCGモチーフを、あるいはTCGモチーフをもたない核酸部分である。
[0151] 後の実施例で説明するように、CIC中の配列又は配列モチーフの位置は該CICの免疫調節活性に影響を及ぼす場合がある。CICの核酸部分中の配列モチーフの位置を指示するには、次の用語が役立つ: (1)複数の核酸部分を含むCICでは、遊離5’末端をもつ部分を「5’部分」と呼ぶ。単一CICが複数の5’部分をもつ場合もあるのは言うまでもない。(2)任意の特定核酸部分内では、該部分の基準配列の5’側にヌクレオチド塩基が存在しないとき、配列又はモチーフは該部分の「5’位置」に存在すると言う。従って配列5’-TCGACGT-3’をもつ部分では、配列T、TC、TCG及びTCGAは「5’位置」に存在するが、配列GACはそうではない。因みに、CICは核酸部分の5’位置に配列TCGを含むと、TCGモチーフを異なる位置にもつが他の点では類似するCICよりも、高活性となる場合がある。CICは、5’部分内の、たとえば5’部分の5’位置にTCG配列をもつと、特に高活性となる場合がある。たとえば実施例38を参照。遊離5’末端をもつ核酸部分は該核酸部分の塩基配列に対応する式の左側に記号5’Fを使用して表わすことができる(たとえば5’F-TCG-3’)。用語「遊離5’末端」は核酸部分との関連では、通常の意味をもち、核酸部分の5’末端がブロック基又は非核酸スペーサー部分に結合していないことを意味する。
[0152] 免疫刺激活性は核酸部分内の(たとえば5’部分内の)CGモチーフの位置によっても影響を受ける場合がある。たとえば有用な一実施態様では、CICは配列5’-X-CG-Y-3’(式中Xは鎖長が0、1又は2ヌクレオチドであり、Yは鎖長が3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15の、又はもっと多くのヌクレオチドである)をもつ核酸部分を少なくとも1つ含む。一実施態様では、5’-X-CG-Y-3’配列は該CICの5’部分内に、たとえばCICの5’位置に存在する。一実施態様では、CICは式5’-X-CG-Y-3’の配列をもつ核酸部分を2つ、3つ又はもっと多く含む。たとえば、一実施態様ではCICのすべての核酸部分が式5’-X-CG-Y-3’の配列をもつ。
[0153] 同様に、核酸部分に配列TCG(たとえばTCGACGTを含む配列)を含むCICは免疫調節活性をもち、INF-αの誘発に有効である。5’部分内の、たとえば5’部分の5’位置のTCGA(たとえばTCGACGTを含む配列)は、CICを特に活性にする。実施例38及び49を参照。従って一実施態様では、CICは式(5’-N1-3’)-S1-N2 (Ia)で示されるコア構造を含む(式中N1は配列5’-TCGAX-3’をもち、Xは0〜20ヌクレオチド塩基、しばしば0〜3塩基である)。一実施態様では、XはCGTである。配列TCGTCGAもまたINF-αの誘発に特に有効である。
[0154] さらに、遊離(非結合)核酸5’末端の存在も免疫刺激活性に影響を及ぼす場合がある。たとえば実施例39を参照。多様な実施態様では、本発明のCICは1以上、2以上、3以上、4以上又は5以上の遊離5’末端を含む。実施態様によっては、遊離5’末端の数は1〜10、2〜6、3〜5又は4〜5である。一実施態様では、遊離5’末端の数は約50以上又は約100以上である。
D. 「単独免疫調節活性」
[0155] 核酸部分の一特性は該核酸部分のヌクレオチド配列に関連する「単独免疫調節活性」である。前述のように、CICは意外にもCICのどの核酸部分も単独のポリヌクレオチドとしては相応の免疫調節活性を示すような配列をもたないときでも、免疫調節活性を示すことが判明した。
[0156] 実施態様によっては、CICの核酸部分は以下述べるように「単独免疫調節活性」をもたないか、又は(CICと比較して)「低単独免疫調節活性」をもつ。
[0157] 核酸部分の「単独免疫調節活性」は、該核酸部分の塩基配列をもちまた同じ核酸骨格(たとえばホスホロチオアート、ホスホジエステル、キメラ)をもつ単離ポリヌクレオチドの免疫調節活性を測定して求める。たとえば配列構造5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’をもつCICは3つの核酸部分を含む。該CIC中の、たとえば第1核酸部分の単独免疫調節活性を求めるには、同じ配列(すなわち5’-TCGTCG-3’)と同じ骨格構造(たとえばホスホロチオアート)とをもつ試験ポリヌクレオチドを常法により合成し、その免疫調節活性を測定する。免疫調節活性は前の§2で述べたような免疫反応の多様な側面を明らかにする標準検定法を用いて測定することができる。好ましくは、§2で述べたヒトPBMC検定法を用いる。前述のように、ドナーによるバラツキへの対策として、一般に複数の異なるドナーに由来する細胞を使用する。試験化合物のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドに接触させたPBMCによるIFN-γ分泌量が該試験化合物の不存在下での、又は(実施態様によっては)不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:3)]の存在下での分泌量を過半数のドナーにおいて有意に上回らなければ(たとえば約2倍未満であれば)、免疫活性をもたない。
[0158] CICと単離ポリヌクレオチドの免疫調節活性を比較するには、好ましくは前の§2で述べたヒトPBMC検定法によって免疫調節活性を測定する。通常、2化合物の活性は両化合物を同じ条件下で、通常は約20μg/mlの濃度で並行検定して比較する。前述のように、濃度は一般に260nmでの吸光度を測定し、0.5 OD260/ml= 20μg/mlの換算式を使用して求める。この方法は試験試料中の全核酸の量を標準化する。あるいは、技術上周知の他の方法で濃度又は重量を求めてもよい。必要なら、260nmでの吸光度を測定して核酸部分の量を求め、CICの重量をCICの分子式から計算することもできる。この方法は、CIC中のスペーサー部分重量の核酸部分重量に対する比が高い(すなわち1を超える)ときなどに使用する。
[0159] あるいは、特に比較しようとする2試料の計算分子量に20%超の差があるときなどは、濃度3μMを使用してもよい。
[0160] CICの核酸部分は、試験ポリヌクレオチドが比較対象のCICより低活性のとき「低免疫調節活性」をもつという。好ましくは、試験ポリヌクレオチドの単独免疫調節活性はCIC活性のわずか約50%、より好ましくはわずか約20%、最も好ましくはCIC活性のわずか約10%、又は実施態様によっては10%未満である。
[0161] 複数の(たとえば複数の異なる)核酸部分をもつCICでは、該複数核酸部分に対応する試験ポリヌクレオチドの混合物の免疫調節活性を求めることもできる。検定は、使用CIC量に等しい(混合物中の)試験ポリヌクレオチド総量を使用して行う。あるいは、検定では混合物中の各試験ポリヌクレオチド又は異なる試験ポリヌクレオチド各々の量をCICの量と等しくしてもよい。第2節で述べたように、検定及び解析ではドナーによるバラツキへの対策として、複数のドナーに由来するPBMCを使用するのが好ましい。
[0162] 一実施態様では、CIC中の1以上(たとえば約2以上、約4以上、又は個別に又は組み合せて測定して約25%以上、約50%以上又はすべて)の核酸部分が単独免疫調節活性をもたない。一実施態様では、CIC中の1以上(たとえば約2以上、約4以上、又は個別に又は組み合せて測定して約25%以上、約50%以上又はすべて)の核酸部分がCICに比して低単独免疫調節活性をもつ。
[0163] 関連実施態様では、CICは単独免疫調節活性をもつ核酸部分を1以上含む。たとえば実施態様によって、核酸部分のすべて又はほぼすべて(たとえば90%以上、好ましくは95%以上)が単独免疫調節活性をもつ。たとえば多価スペーサーを含むCICは、単独免疫調節活性をもつ[たとえば配列5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A-3’(SEQ ID NO:2)をもつ]核酸部分を5以上、しばしば11以上、高い頻度で約20以上、約50以上、約100以上、約400以上又は約1000以上(たとえば約2500以上)含みうる。
[0164] 従って特定のCICでは、単独免疫調節活性をもつ核酸部分の数は0、1、2以上、3以上、2以下、4以上、3以下、5以上、4以下、10以上、約20以上、約50以上、約100以上、約400以上又は約1000以上、CICの核酸部分の全数、又は全数未満でありうる。
E. 核酸部分の構造
[0165] CICの核酸部分は天然核酸の構造修飾を含んでもよい。修飾は技術上周知の任意のポリヌクレオチド修飾、たとえば3’OH基又は5’OH基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖部分の修飾、リン酸基の修飾などを非限定的に含む。以下、そうした多様な修飾について説明する。
[0166] 核酸部分は一本鎖、二本鎖又は部分二本鎖のDNA、RNA又は混合DNA/RNAでもよいし、また他の修飾ポリヌクレオチドを含んでもよい。二本鎖の核酸部分とCICが見込まれるが、用語「塩基」又は「ヌクレオチド」は特に断らない限り、塩基対又は塩基対合ヌクレオチドを包含するものである。核酸部分は天然又は修飾非天然塩基を含んでもよいし、修飾体の糖、リン酸基又は末端を含んでもよい。たとえばリン酸基修飾は非限定的な例としてホスホン酸メチル、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート(架橋性又は非架橋性)、ホスホトリエステル及びホスホロジチオアートなどがあり、任意の組み合わせで使用してよい。他の非リン酸結合もまた使用してよい。好ましくは、本発明のCIC及び核酸部分はホスホロチオアート骨格を含む。技術上周知の糖修飾たとえば2’-アルコキシ-RNA類似体、2’-アミノRNA類似体、及び2’-アルコキシ又はアミノ-RNA/DNAキメラや本書で開示する他の修飾を行い、任意のリン酸基修飾と組み合せてもよい。塩基修飾(後述)の非限定的な例は電子吸引性部分の、シトシンC-5及び/又はC-6への付加(5-ブロモシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ヨードシトシンなど)及びウラシルC-5及び/又はC-6への付加(5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ヨードウラシルなど)である。たとえばPCT出願WO 99/62923号を参照。
[0167] 核酸部分はまた、リン酸基修飾ヌクレオチドを含む場合もある。修飾リン酸結合又は非リン酸結合を含む核酸の合成は技術上周知である。概論として、Matteucci (1997) “Oligonucleotide Analogs: an Overview”[Oligonucleotide as Therapeutic Agents (D.J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY所載]を参照。本発明の核酸部分内の糖又は糖類似体部分に結合させうるリン誘導体(又は修飾リン酸基)の例は一リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホン酸アルキル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミダートなどである。前記のリン酸類似体の合成、及びヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドへの組み込みはそれ自体技術上周知であり、本書で詳述するまでもない。Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; 及びSchultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973を参照。たとえばホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドの合成は、酸化ステップを硫化ステップで置き換える点を除けば、天然オリゴヌクレオチドに関する前記説明の合成とほぼ同じである。Zon (1993) “Oligonucleoside Phosphorothiates” [Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190所載]を参照。同様に、他のリン酸類似体たとえばホスホトリエステル[Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665]、非架橋性ホスホロアミダート[Jager et al. (1988) Biochem. 27-7247-7246]、N3’→P5’ホスホロアミダート[Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287]及びホスホロジチオアート(米国特許第5,453,496号明細書)の合成についてもすでに開示されている。他の非リン系修飾塩基もまた使用可能である[Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141]。ホスホロチオアート骨格をもつ核酸は、宿主への注射後の耐分解性がより大きいように見受けられる。Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; 及びLatimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064を参照。
[0168] 本発明に使用する核酸部分は(唯一の又は主要な糖部分としてリボースを含む)リボヌクレオチド及び/又は(主要な糖部分としてデオキシシリボースを含む)デオキシリボヌクレオチドを含む場合がある。この核酸部分には修飾糖又は糖類似体を組み込むことができる。従って、糖部分はリボースとデオキシリボースに加えて、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース及び糖「類似体」シクロペンチル基でもよい。糖はピラノース型でもフラノース型でもよい。糖部分は好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノース又は2’-0-アルキルリボースのフラノシドであり、また対応する複素環塩基にα又はβアノマー配置で結合させることができる。糖修飾の非限定的な例は2’-アルコキシ-RNA類似体、2’-アミノ-RNA類似体、及び2’-アルコキシ又はアミノ-RNA/DNAキメラなどである。たとえばCIC中の糖修飾の非限定的な例は2’-アミノ-2’-デオキシアデノシンである。これらの糖又は糖類自体の合成及びそうした糖又は類似体が複素環塩基(核酸塩基)と結合した形の対応する「ヌクレオシド」の合成はそれ自体公知であり、そうした合成が特定の実施例に関わる場合以外、本書で立ち入るまでもない。CICの合成では糖修飾を行い、任意のリン酸修飾と組み合せてもよい。
[0169] 核酸部分に組み込まれる複素環塩基すなわち核酸塩基は天然の主要プリン及びピリミジン塩基(すなわち前述のウラシル、チミン、シトシン、アデニン及びグアニン)でも、該主要塩基の天然型及び合成型修飾体でもよい。
[0170] 多様な複素環塩基と多様な糖部分(及び糖類似体)とを含む多数の「合成」非天然ヌクレオシドが技術的に得られること、及び本発明の他の要件基準が満たされる限り、核酸部分が天然核酸の構成成分たる5つの主要塩基とは異なる複素環塩基を1個又は数個含む場合もあることは、当業者には明らかであろう。しかし好ましくは、複素環塩基の非限定的な例はウラシル-5-イル、シトシン-5-イル、アデニン-7-イル、アデニン-8-イル、グアニン-7-イル、グアニン-8-イル、4-アミノピロロ[2.3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-5-イル、又は2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-3-イル基であり、その場合、プリン塩基は核酸部分の糖部分に9位で、ピリミジン塩基は1位で、ピロロピリミジン塩基は7位で、またピラゾロピリミジン塩基は1位で、それぞれ結合する。
[0171] 核酸部分は少なくとも1つの修飾塩基を含んでもよい。用語「修飾塩基」は本書では「塩基類似体」と同義であり、たとえば「修飾シトシン」は「シトシン類似体」と同義である。同様に「修飾」ヌクレオシド又はヌクレオチドは本書ではヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義である。塩基修飾の非限定的な例は、核酸部分のシトシンのC-5及び/又はC-6への電子吸引性部分の付加などであり、電子吸引性部分はハロゲンであるのが好ましい。こうした修飾シトシンの非限定的な例はアザシトシン、5-ブロモシトシン、5-クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5-フルオロシトシン、フルオロピリミジン、5,6-ジヒドロシトシン、5-ヨードシトシン、5-ニトロシトシン、及び任意の他ピリミジン類似体又は修飾ピリミジンなどである。他の塩基修飾の非限定的な例は核酸部分のウラシルのC-5及び/又はC-6への電子吸引性部分の付加などであり、電子吸引性部分はハロゲンであるのが好ましい。こうした修飾ウラシルの非限定的な例は5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ヨードウラシルなどである。またKandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13を参照。
[0172] 他の塩基修飾の例は塩基への1以上のチオール基の付加であり、6-チオ-グアニン、4-チオ-チミン及び4-チオ-ウラシルなどが非限定的に含まれる。
[0173] 塩基修飾ヌクレオシドの合成、及び該塩基修飾ヌクレオチドを前駆体として使用する修飾オリゴヌクレオチドの合成はたとえば米国特許第4,910,300号、4,948,882号及び5,093,232号明細書などですでに開示されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端又は内部位置に化学合成によって組み込めるよう設計されている。そうした塩基修飾ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの末端又は内部位置に存在すると、ペプチド又は他抗原の結合部位として役立ちうる。糖修飾ヌクレオシドも(米国特許第4,849,513号、5,015,733号、5,118,800号、5,118,802号明細書などで)すでに開示されており、同様に使用することができる。
4. 非核酸スペーサー部分
[0174] 本発明のCICは核酸部分に共有結合した1以上の非核酸スペーサー部分を含む。非核酸スペーサー部分は本書では便宜上、単に「スペーサー」又は「スペーサー部分」と呼ぶことがある。
[0175] スペーサーは一般に分子量が約50〜約500,000(たとえば約50〜約50,000)、ときには約75〜約5000、ときには約75〜約500であり、多様な実施態様では1個、2個、3個の、又は4個以上の核酸部分に共有結合している。核酸への結合には多様な物質が好適である。たとえば学術文献で「非核酸リンカー」、「非ヌクレオチド・リンカー」又は「原子価プラットホーム分子(valency platform molecules)」などと呼ばれている多様な化合物をCICのスペーサーとして使用してもよい。スペーサーが特定のスペーサー成分(たとえばヘキサエチレングリコール)を含むと言われるのは、スペーサーが該成分(又は置換誘導体)をスペーサーの基本単位又は一部分として含むときである。たとえば実施例49に示すスペーサーは、多糖成分、ヘキサエチレングリコール成分、及び誘導体化チオエーテル・リンカー成分を含むと言える。後述のように実施態様によっては、スペーサーは複数の共有結合基本単位を含むし、またホモポリマー又はヘテロポリマー構造をもってもよい。基本単位はしばしばリンカー、ホスホジエステル結合、及び/又はホスホロチオアートエステル結合を介して結び付く。後の実施例を参照。そうした複数の基本単位を含む又はそうした基本単位に由来するCIC中の非ヌクレオチド・スペーサーは「複合スペーサー」と呼べる。限定ではなく説明を目的とした一実施態様では、CICはホスホジエステル結合及び/又はホスホロチオアートエステル結合した以下の化合物を2以上(たとえば3以上、4以上又は5以上)含む: オリゴエチレングリコール単位(例: トリエチレングリコール・スペーサー、ヘキサエチレングリコール・スペーサー)、アルキル単位(例: プロピル・スペーサー、ブチル・スペーサー、ヘキシル・スペーサーなど)、分岐スペーサー[例: 2-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサー、グリセロール・スペーサー、トレブラー・スペーサー、対称ダブラー・スペーサー]。
[0176] モノヌクレオチド又はポリヌクレオチドが非核酸スペーサーの定義に含まれないのは自明であろう。そうでなければ、核酸部分と隣接の非核酸スペーサー部分は区別がつかなくなろう。
[0177] 本書では多様なスペーサーを開示するが、その目的は限定ではなく説明である。なお、スペーサー部分(又はスペーサー部分の構成成分)は、スペーサー部分又はその構成成分がそれに由来している化合物の化学名(たとえばヘキサエチレングリコール)で呼ぶこともある。そこには、CICは実際には核酸と該化合物とのコンジュゲートを含んでいるとの了解がある。当業者には自明であろう(し、また以下でも詳しく説明する)が、非核酸スペーサー部分は反応性基を含むスペーサー部分前駆体から形成することができる(し、通常はそうして形成する)。該スペーサー部分前駆体に複数の核酸(たとえばオリゴヌクレオチド)を結合させてCICを形成しうるようにするためである。従って、保護基を含む場合もある。スペーサー部分前駆体上の反応性基は同じでも異なってもよい。
[00100] 非核酸スペーサー部分の例は、オリゴエチレングリコール(たとえばトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールの各スペーサー、それに最大約10個、約20個、約40個、約50個、約100個又は約200個のエチレングリコール単位を含む他ポリマー); アルキル・スペーサー(たとえばプロピル、ブチル、ヘキシル、及び他のC2-C12アルキル・スペーサーたとえば通常はC2-C10アルキル、最もしばしばC2-C6アルキル); グリセロール、ペンタエリトリトール、1,3,5-トリヒドロキシシクロヘキサン又は1,3-ジアミノ-2-プロパノールから誘導した対称又は非対称スペーサー(たとえば本書で開示している対称ダブラー及びトレブラー・スペーサーなど)である。これらのスペーサー構成成分は置換体でもよい。当業者には自明であろうが、たとえばグリセロールと1,3-ジアミノ-2-プロパノールは1、2及び/又は3位で置換してもよい(たとえば炭素に結合した1以上の水素の、以下例示する置換基のうちの1置換基による置換)。同様に、ペンタエリトリトールは任意の又はすべてのメチレン位で以下の任意の置換基で置換してもよい。置換基の例はアルコール、アルコキシ(メトキシ、エトキシ、プロポキシなど)、線状又は分岐アルキル(C1-C12アルキルなど)、アミン、アミノアルキル(アミノC1-C12アルキルなど)、ホスホロアミダイト、リン酸、ホスホロアミダート、ホスホロジチオアート、チオリン酸、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン(F、Cl、Br、Iなど)、アミド、アルキルアミド(アミドC1-C12アルキルなど)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミダートエステル、イソシアン酸、イソチオシアン酸、ハロギ酸、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、NR1R2 [式中R1R2は-C(=O)CH=CHC(=O)である](マレイミド)、チオエーテル、シアノ、糖(マンノース、ガラクトース、グルコースなど)、α,β-不飽和カルボニル、アルキル水銀、α,β-不飽和スルホンなどである。
[0178] 一実施態様では、スペーサーは1以上の塩基欠失ヌクレオチド(すなわちヌクレオチド塩基を欠くが、糖とリン酸部分は残しているヌクレオチド)を含んでもよい。塩基欠失ヌクレオチドの例は、1’,2’-ジデオキシリボース、1’-デオキシリボース、1’-デオキシアラビノース、及びそれらのポリマーなどである。
[0179] スペーサーは本書で開示するスペーサー構成成分の(たとえばホスホジエステル又はホスホロチオアート結合で、あるいはアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホロアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオアート、ホスホン酸メチル又は他結合によって結び付いた)ヘテロマー又はホモマー型のオリゴマー及びポリマーを含む場合がある。たとえば一実施態様では、スペーサー部分は分岐スペーサー構成成分(たとえばグリセロール)がホスホジエステル又はホスホロチオアート結合を介してオリゴエチレングリコールたとえばHEGに結び付いたコンジュゲートを含む(たとえばC-94を参照)。別の例は、多価スペーサー構成成分がオリゴエチレングリコールたとえばHEGに結び付いたコンジュゲートを含む。
[0180] 他の好適なスペーサーは置換アルキル、置換ポリグリコール、随意置換ポリアミン、随意置換多価アルコール、随意置換ポリアミド、随意置換ポリエーテル、随意置換ポリイミン、随意置換ポリホスホジエステル[たとえばポリ(1-ホスホ-3-プロパノール)]などを含む。随意置換基の例はアルコール、アルコキシ(メトキシ、エトキシ、プロポキシなど)、線状又は分岐アルキル(C1-C12アルキルなど)、アミン、アミノアルキル(アミノC1-C12アルキルなど)、ホスホロアミダイト、リン酸、チオリン酸、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン(F、Cl、Br、Iなど)、アミド、アルキルアミド(アミドC1-C12アルキルなど)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミダートエステル、イソシアン酸、イソチオシアン酸、ハロギ酸、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、NR1R2[式中R1R2は-C(=O)CH=CHC(=O)である](マレイミド)、チオエーテル、シアノ、糖(マンノース、ガラクトース、グルコースなど)、α,β-不飽和カルボニル、アルキル水銀、α,β-不飽和スルホンなどである。
[0181] 他の好適なスペーサーは多環式分子たとえばフェニル環又はシクロヘキシル環を含む分子を含んでもよい。該スペーサーはポリエーテルたとえばポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、二官能性多環式分子たとえば二官能性ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、as-インダセン、s-インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアントレン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチインでも、それらの置換体又は修飾体、又はポリエーテルと多環式分子の組み合わせでもよい。多環式分子はC1-C5アルキル、C6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン又はハロアルキル基で置換又は多置換してもよい。窒素を含む多複素環分子(インドリジンなど)は一般に好適なスペーサーではない。スペーサーは多価アルコールたとえばグリセロール又はペンタエリトリトールなどでもよい。一実施態様では、スペーサーは(1-ホスホプロパン)3-リン酸又は(1-ホスホプロパン)4-リン酸(それぞれテトラホスホプロパンジオール、ペンタホスホプロパンジオールともいう)を含む。一実施態様では、スペーサーは誘導体化2,2’-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)を含む。
[0182] CICに有用な非核酸スペーサーの例として他に、Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Research (1993), 21:2589; Ma et al., Biochemistry (1993), 32:1751; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides (1991), 10:287; Jaschke et al., Tetrahedron Lett. (1993), 34:301; Ono et al., Biochemistry (1991), 30:9914; 及びArnold et al.国際公開WO 89/02439号及び欧州登録特許第0313219B1号明細書「ヌクレオチド・プローブ用の非核酸結合試薬」で開示されている「リンカー類」やSalunkhe et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114:8768; Nelson et al., Biochemistry 35:5339-5344 (1996); Bartley et al., Biochemistry 36:14502-511 (1997); Dagneaux et al., Nucleic Acids Research 24:4506-12 (1996); Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6335-59 (1990); Reynolds et al., Nucleic Acids Research, 24:760-65 (1996); Hendry et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1219:405-12 (1994); Altmann et al., Nucleic Acids Research, 23:4827-35 (1995); 及び米国特許第6,117,657号明細書(Usman et al.)で開示されているリンカー類がある。
[0183] 好適なスペーサー部分はCICに電荷及び/又は疎水性をもたらし、CICに有利な薬物動態特性(安定性の向上、血中滞留時間の延長など)をもたらし、及び/又は特定細胞又は器官へのCICの誘導を招くことができる。スペーサー部分を選定又は修飾してCICを調製すれば、所望の薬物動態特性、特定免疫反応の誘発又は所望の投与形態(たとえば経口投与)への適合を実現することができる。
[0184] 2以上のスペーサー部分を含むCICでは、スペーサーは同じでも異なってもよい。たとえば一実施態様では、CIC中のすべての非核酸スペーサー部分が同じ構造をもつ。一実施態様では、CICは2以上、3以上、4以上、5以上又は6以上の、又はもっと多くの異なる構造をもつ非核酸スペーサー部分を含む。
[0185] 見込まれる本発明の実施態様によっては、ある種の構造はCICのスペーサー部分の定義から除外される。たとえば実施態様によっては、スペーサーは塩基欠失ヌクレオチド又は塩基欠失ヌクレオチドのポリマー以外である。実施態様によっては、スペーサーはオリゴ(エチレングリコール)(HEG、TEGなど)又はポリ(エチレングリコール)以外である。実施態様によっては、スペーサーはC3アルキル以外である。実施態様によっては、スペーサーはアルキル又は置換アルキル以外である。実施態様によっては、スペーサーはポリペプチド以外である。たとえば実施態様によっては、免疫原分子たとえばタンパク質又はペプチドはスペーサー部分の構成成分として不適当である。しかし実施態様によっては(後述)、CICは「タンパク質性CIC」であり、スペーサー部分にポリペプチド(すなわちアミノ酸のオリゴマー又はポリマー)を含む。たとえば実施態様によっては(後述)、ポリペプチド抗原をプラットホーム(多価スペーサー)として使用し、それに複数の核酸部分を結合させることができる。しかし実施態様によっては、スペーサー部分はタンパク質性ではない、及び/又は抗原ではない(すなわちスペーサー部分はCICから単離された状態では、抗原ではない)。
[0186] 好適なスペーサー部分はそれを構成成分として含むCICを水溶液(たとえばpH7.0のPBS)中で不溶性にしない。従ってマイクロキャリアー又はナノキャリアーはスペーサーの定義から除外される。さらに、溶解度が低いスペーサー部分たとえばドデシル・スペーサー(二価アルコール前駆体の1,12-ジヒドロキシドデカンとして測定して溶解度<5mg/ml)は、CICの親水性及び活性を低下させかねないので好ましくない。スペーサー部分の溶解度は、たとえば二価アルコールとして測定して5mg/mlを大幅に上回る(たとえば約20mg/ml以上、約50mg/ml以上又は約100mg/ml以上である)のが好ましい。水溶解度の試験に使用するスペーサー部分の形態は一般に、それと最も関連が深い、活性化されず保護もされてないスペーサー前駆体分子である。たとえばC-19は、ドデシル基を含むスペーサー部分をもち、C-1及びC-12位でホスホロチオアートジエステル結合によってスペーサー部分を核酸部分に結び付けている。この場合は、ドデシル・スペーサーの二価アルコール前駆体の水溶解度を試験し、それが5mg/ml未満であることを突き止めた。二価アルコール前駆体として試験したときの水溶解度がもっと高いスペーサーは、CICの免疫刺激活性をより高くする結果となる。高水溶解度スペーサーの非限定的な例はプロパン-1,3-ジオール、グリセロール、ブタン-1,4-ジオール、ペンタン-1,5-ジオール、ヘキサン-1,6-ジオール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール及びHEGである。
A. 荷電及び複合単位スペーサー部分
[0187] CICに電荷をもたらすものは、核酸部分のリン酸基、チオリン酸基又は他の基であり、また非核酸スペーサー部分の基であろう。実施態様によっては、非核酸スペーサー部分は正味の電荷(たとえばpH 7で測定した場合の正味の正電荷又は正味の負電荷)を帯びる。有用な一実施態様では、CICは正味の負電荷をもつ。実施態様によっては、CIC中のスペーサー部分の負電荷は、本書で開示するスペーサー基本単位を誘導体化しその電荷を増大させることによって、増大させる。たとえばグリセロールを2つの核酸部分に共有結合させて、残りのアルコールを活性化ホスホロアミダイトと反応させ、次いで酸化又は硫化によりリン酸又はチオリン酸をそれぞれ形成させることができる。実施態様によっては、CIC中の非核酸スペーサー部分に負う負電荷(すなわち2以上のスペーサーが存在する場合の電荷の合計)はCIC中の核酸部分に負う負電荷よりも大きい。電荷は分子式を基に計算することが、又はたとえばキャピラリー電気泳動法によって実験的に求めることができる(Li, ed., 1992, Capillary Electrophoresis, Principles, Practice and Application, pp. 202-206, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands,)。
[0188] 前述のように、好適なスペーサーは、一般に非ヌクレオチド「リンカー」と呼ばれる、それ自体スペーサーとして有用であり本書で開示しているようなより小さな非核酸(たとえば非ヌクレオチド)化合物からなるポリマーでもよい。そうしたポリマー(複合スペーサー)はヘテロマーでもホモマーでよいし、またエステル(たとえばホスホジエステル又はホスホロチオアートエステル)結合で結び付いたモノマー単位(たとえばHEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボースなど)をしばしば含む。たとえば一実施態様では、スペーサーは非ヌクレオチド単位(たとえば2〜約100単位、又は2〜約50単位たとえば2〜約5単位、又は約5〜約50単位たとえば約5〜約20単位)のポリマー(たとえばヘテロマー)構造を含む。
[0189] 複合スペーサーを含むCICにはたとえば
Figure 2010189400
 などがある[式中(C3)15はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた15個のプロピル・リンカーを意味し、(glycerol)15はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた15個のグリセロールを意味し、(TEG)8はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた8個のトリエチレングリコールを意味し、また(HEG)4はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた4個のヘキサエチレングリコールを意味する。言うまでもなく、ある種の複合スペーサーは正味の負電荷をもち、その負電荷はたとえばエステル結合したモノマー単位の数を増すことによって増大させることができる。
B. 多価スペーサー部分
[0190] ある種の実施態様では、スペーサー部分は多価非核酸スペーサー部分(すなわち多価スペーサー)である。この場合、CICに含まれる多価スペーサーは3以上の核酸部分に結合している。多価スペーサーはときに「プラットホーム」分子とも呼ばれる。多価スペーサーはポリマーでもノンポリマーでもよい。好適な分子の例は、グリセロール又は置換グリセロール(2-ヒドロキシメチルグリセロール、レブリニルグリセロールなど)、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、1,3,5-トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリトリトール及びペンタエリトリトール誘導体、テトラアミノペンタエリトリトール、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン(Cyclen)、ポリエチレンイミン、1,3-ジアミノ-2-プロパノール及び置換誘導体(たとえば「対称ダブラー」)、[プロピルオキシメチル]エチル化合物(たとえば「トレブラー」)、ポリエチレングリコール誘導体たとえばいわゆる“Star PEG”及び“bPEG”(たとえばGnanou et al., 1988, Makromol. Chem. 189:2885; Rein et al., 1993, Acta Polymer 44:225; Merrill et al.米国特許第5,171,264号明細書; Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL)、デンドリマー及び多糖などである。
[0191] デンドリマーは技術上周知であり、化学的に規定された球状形態の分子であって、一般に分岐構造を得るための多価モノマーの段階的又は反復的反応により合成される(たとえばTomalia et al., 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75を参照)。たとえばアミンを末端部に導入したポリアミドアミン、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンのデンドリマーなど、多様なデンドリマーが知られている。本発明に有用なデンドリマーの例は米国特許第4,587,329号、第5,338,532号及び6,177,414号明細書で開示されている「高密度星形」ポリマー又は「星形」ポリマーなどであり、いわゆる「ポリ(アミドアミン)(PAMAM)デンドリマー」を含む。本発明の範囲内で使用に適したさらに他のマルチマー型スペーサー分子には米国特許第5,52,391号明細書やPCT出願PCT/US/00/15968号(WO 00/75105号として公開)、PCT/US96/09976号(WO 96/ 40197号として公開)、PCT/US97/10075号(WO 97/46251号として公開)、PCT/US94/10031号(WO 95/07073号として公開)及びPCT/ US99/29339号(WO 00/34231号として公開)の各明細書で開示されているような、化学的に規定された、非ポリマー原子価プラットホーム分子である。他にも多数の好適な原子価スペーサーが使用可能であり、当業者の知るところとなろう。
[0192] プラットホーム分子への核酸部分の結合にはいくつもの方法が可能であり、一般に1以上の架橋剤と核酸部分及びプラットホーム分子上の官能基とが関与する。プラットホームへの結合基の付加には標準化学合成手法を使用する。核酸部分への結合基の付加も標準合成手法で行うことができる。
[0193] 様々な原子価をもつ多価スペーサーは本発明の実施に有用であり、多様な実施態様ではCICの多価スペーサーを約3〜約400の核酸部分に、ときに約100〜約500、ときに約150〜約250、ときに3〜200、ときに3〜100、ときに3〜50、しばしば3〜10の、またときに401以上の核酸部分に結合させる。多様な実施態様では多価スペーサーを11以上、26以上、51以上、101以上又は501以上の(同じでも異なってもよい)核酸部分に結合させる。言うまでもなく、CICが多価スペーサーを含むある種の実施態様では、本発明は分子構造がやや異なる一群のCICを提供する。たとえば高原子価のデンドリマー、多糖又は他の多価スペーサーを使用してCICを合成すると、多価スペーサー部分に結合した核酸部分の数が(確定可能な範囲内で、又はほぼその範囲内で)異なる、やや不均一な分子混合物が産生される。デンドリマー、多糖などを多価スペーサーのエレメントとして使用するとき、核酸部分の該エレメント(たとえばデンドリマー)への結合は直接結合でも間接結合でもよい。たとえばCICは、オリゴエチレングリコール・エレメントを介してデンドリマーに結合した核酸部分を含んでもよい(その場合はデンドリマー+オリゴエチレングリコールがスペーサー部分を構成する)。前の§III (1)Bでも述べたように、核酸部分を2以上のスペーサー部分に結合してもよいのは言うまでもない。
[0194] 核酸部分への結合を可能にするよう誘導体化した多糖はCICに多価スペーサーとして使用することができる。好適な多糖は天然多糖でも合成多糖でもよい。多糖の例はデキストラン、マンナン(mannin)、キトサン、アガロース及びでんぷんなどである。マンナンを使用してもよいのは、たとえば免疫学的に関連する細胞型たとえば単球や肺胞マクロファージの表面にマンナン(マンノース)受容体が存在していて、該多糖スペーサー部分が特定細胞型のターゲッティングに使用される可能性がからである。一実施態様では、多糖は架橋型である。好適な一化合物はエピクロロヒドリン架橋スクロース[たとえばFicoll（登録商標）]である。Ficoll（登録商標）は、エピクロロヒドリンでスクロースを架橋し、高次分岐構造とすることにより合成される。たとえば実施例49に示すように、アミノエチルカルボキシメチル-フィコール(AECM-Ficoll)はInman, 1975, J. Imm. 114:705-709の方法により調製することができる。多糖を含むCIC中の核酸部分の数はCIC(たとえば多価CIC)に関する本書開示の任意の範囲でよい。たとえば一実施態様では、多糖は約150〜約250の核酸部分を含む。次いでAECM-Ficollをヘテロ二官能性架橋試薬たとえば6-マレイミドカプロン酸アシルN-ヒドロキシスクシンイミド=エステルなどと反応させ、次いでチオール誘導体化核酸部分へと結合することができる(Lee et al., 1980, Mol. Imm. 17:749-56を参照)。他の多糖も同様にして修飾してよい。
5. CICの合成
[0195] 当業者は本明細書と技術的な知識を手引きとすれば、通常の方法を用いてCICを合成することが十分に可能である。核酸部分(たとえばオリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチド)の合成手法は周知である。核酸部分は酵素合成、化学合成及びそれらの組み合わせなどを非限定的に含む手法により合成することができる。たとえばホスホジエステル結合を含むDNA又はRNAは、好適なヌクレオシドホスホロアミダイトを、3’-末端で固相担体に結合させた伸長途上のオリゴヌクレオチドの5’-OH基に順次結合させた後、中間体の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルへと酸化させるという方法で化学合成することができる。DNA合成用の有用な固相担体はの例は細孔性ガラスビーズ(CPG) (Applied Biosystems, Foster City, CA)、ポリスチレンビーズ・マトリックスのPrimer Support (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)及びTentGel (Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)などである。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、該オリゴヌクレオチドを担体から切り離し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルとし、またアンモニア又は他塩基の水溶液を用いてヌクレオシド塩基を脱保護する。
[0196] ホスホジエステル結合を含むDNA又はRNAポリヌクレオチド(核酸部分)は一般に、たとえば次のステップの繰り返しにより合成する: a) 3’-固相担体結合ヌクレオシド又は核酸の5’-ヒドロキシル基からの保護基の除去、b)該5’-ヒドロキシル基への活性化ヌクレオシドホスホロアミダイトの結合、c)亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化、及びd)未反応5’-ヒドロキシル基のキャッピング。ホスホロチオアート結合を含むDNA又はRNAの合成も前記と同様にして、ただし酸化ステップを硫化ステップへと代えて、合成する。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、該オリゴヌクレオチドを担体から切り離し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルとし、またアンモニア又は他塩基の水溶液を用いてヌクレオシド塩基を脱保護する。たとえばBeaucage (1993) “Oligo-deoxyribonucleotide Synthesis” [Protocols for Oligonucleotide and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ所載]; Warner et al. (1984) DNA 3:401; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4:194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4:1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699及び米国特許第4,458,066号明細書を参照。指定配列の核酸部分を自動的に合成するプログラマブル合成機が広く使用されている。たとえばExpedite 8909自動DNA合成機(Perseptive Biosystem, Framington, MA); ABI 394 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA);及びOligoPilotII(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)などである。
[0197] ポリヌクレオチドは、たとえば酸不安定な5’-保護基と3’-ホスホロアミダイトとを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を使用して、3’→5’方向へと合成することができる。そうしたモノマーの例は5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-3’-O-(N,N-ジイソプロピルアミノ)2-シアノエチルホスホロアミダイトなどであり、また該保護ヌクレオシドの非限定的な例はN6-ベンゾイルアデノシン、N4-ベンゾイルシチジン、N2-イソブチリルグアノシン、チミジン及びウリジンなどである。この場合、使用固相担体は3’-結合した保護ヌクレオシドを含む。あるいは、ポリヌクレオチドは酸不安定な3’-保護基と5’-ホスホロアミダイトとを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を使用して、5’→3’方向へと合成することができる。そうしたモノマーの例は3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピルアミノ)2-シアノエチルホスホロアミダイトなどであり、また該保護ヌクレオチドの非限定的な例はN6-ベンゾイルアデノシン、N4-ベンゾイルシチジン、N2-イソブチリルグアノシン、チミジン及びウリジン(Glen Research, Sterling, VA)などである。この場合、使用固相担体は5’-結合した保護ヌクレオシドを含む。環状の核酸構成成分は単離、組換え手法による合成、又は化学合成が可能である。化学合成は文献記載の任意の方法で行なうことができる。たとえばGao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029及びWang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照。
[0198] 核酸部分とスペーサー部分の結合は、合成しようとする特定のCICに応じて、様々な方法で行うことができる。特定スペーサー部分の付加方法は技術上周知であり、前掲文献などに記載されている。Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990) などを参照。スペーサー部分と核酸部分の共有結合は数あるうちの任意のタイプたとえばホスホジエステル、ホスホロチオアート、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホロアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオアート、リン酸メチル結合などとしてよい。前述のように、スペーサー部分前駆体を随意に末端活性化基で修飾して、核酸へと結合できるようにしてもよい。活性化されたスペーサー部分の例を図1に示すが、それには自動合成に好適な保護基がすでに付加してある。他のスペーサー部分前駆体の非限定的な例は次のとおりである: (1) HOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OH (式中n=1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44又は45もしくは46以上); (2) HOCH2CHOHCH2OH; (3) HO(CH2)nOH (式中n= 1,2,3,4,5,6,7, 8, 9,10又は11)。
[0199] 一実施態様では、スペーサー部分前駆体であって、核酸部分との段階的結合を可能にするための第1及び第2反応性基を含み、該第1反応性基が伸長途上の核酸分子鎖の末端に効率的に結合しうる特性をもち、また該第2反応性基がCIC中の混合ヌクレオチド+非ヌクレオチド部分の伸長途上の分子鎖を段階的にさらに伸長させることができることを特徴とするスペーサー部分前駆体を使用する。スペーサー部分と核酸部分の結合には、該核酸部分の合成に使用したのと同じホスホロアミダイト法を使用するのがしばしば好都合であろう。本発明のCICはたとえば自動DNA合成機(たとえばExpedite 8909; Perseptive Biosystems, Framington, MA)によりホスホロアミダイト法(たとえば前掲Beaucage, 1993及び前掲Current Protocols in Nucleic Acid Chemistryを参照)を使用して幸便に合成することができる。しかし当業者には自明であろうが、もし望むなら自動DNA合成機の場合と同じ(又は同等の)合成ステップを手作業で行ってもよい。それによってもたらされる核酸とスペーサー前駆体の間の結合はホスホロチオアート結合でもホスホジエステル結合でもよい。その種の合成では、一般にスペーサー(又はマルチマー・スペーサーの場合にはスペーサー基本単位)の一方の末端は4,4’-ジメトキシトリチル基で保護され、他方の末端はホスホロアミダイト基を含む。
[0200] 有用な保護基と反応性基とを備えた多様なスペーサーが市販されている。その例は次のとおりである:
トリエチレングリコール・スペーサー又はTEGスペーサー: 9-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)トリエチレングリコール-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA);
ヘキサエチレングリコール・スペーサー又はHEGスペーサー: 18-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサエチレングリコール-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
プロピル・スペーサー: 3-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
ブチル・スペーサー: 4-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ブチルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, 200 Homer Ave, Ashland, MA);
ヘキシル・スペーサー: 6-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ヘキシルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Biosearch Technologies, Novoto, CA);
2-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサー又はHMEスペーサー: 1-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)-3-(レブリニルオキシ)-プロピルオキシ-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]; 別名「非対称分岐」スペーサー(図2参照) (Chem Genes Corporation, Ashland, MA);
塩基欠失ヌクレオチド・スペーサー又は塩基欠失スペーサー: 5-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-1,2-ジデオキシリボース-3-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
対称分岐スペーサー又はグリセロール・スペーサー(図2参照): 1,3-O,O-ビス(4,4’-ジメトキシトリチル)グリセロール-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Chem Genes, Ashland, MA);
トレブラー・スペーサー(図2参照): 2,2,2-O,O,O-トリス[3-O-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
対称ダブラー・スペーサー(図2参照): 1,3-O,O-ビス[5-O-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
ドデシル・スペーサー: 12-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA)。
[0201] これらや、他のきわめて多様な(たとえばDMTやホスホロアミダイト基保護基を含む)保護スペーサー部分前駆体は購入することもできるし、本書で開示するCICの合成に向いた通常の方法を用いて合成することもできる。合成機を使用する場合には、メーカーの説明書に従って、ヌクレオチド・モノマーとスペーサーを所望の順序で付加するように合成機をプログラムする。
[0202] DNA合成機で「in situ」合成されるCICは保護ヌクレオシドと保護スペーサー・モノマーとを必要とするが、共に反応性の又は活性化可能な官能基を含む。こうした形の反応性/保護スペーサー部分は「スペーサー前駆体成分」と呼べる。当業者には自明であろうが、スペーサー前駆体中の反応性基は結合後に安定結合を形成するし、またスペーサー前駆体上の保護基は得られるCIC中のスペーサー部分から除去される。保護基の除去は一般に、該部位での反応を可能にするようCICの段階的合成の際に行う。追加の反応性基に保護基が付いている場合には、該保護基(たとえばC-25の合成に使用される図2の構造3に示すスペーサー前駆体上のレブリニル基など)の除去はCICの段階的合成の後に行う。
[0203] 追加の官能基をもたないスペーサー前駆体の例は18-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサエチレングリコール-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]であり、これは保護基として4,4’-ジメトキシトリチル基を、反応性基として(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト基をそれぞれ含む。DND合成機でのホスホロアミダイト法によるCIC合成の際には、スペーサー前駆体中の(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト基は弱酸たとえば1H-テトラゾールなどで活性化し、塩基保護核酸部分の遊離5’-ヒドロキシル基と反応させて亜リン酸トリエステルを形成させる。次いで亜リン酸トリエステル基を酸化又は硫化して、それぞれ安定したホスホトリエステル基又はホスホロチオアートトリエステル基とする。得られるトリエステル基はCIC合成の残りの操作に対して安定であり、最終脱保護までその形態を維持する。スペーサー前駆体上の4,4’-ジメトキシトリチル基は除去し、次の核酸部分の一部となる別のスペーサー前駆体又は活性化ヌクレオシド・モノマーを結合できるようにする。この基もまた結合と酸化又は硫化の後には、それぞれ安定したホスホトリエステル基又はホスホロチオアートトリエステル基となる。ひとたび保護CICの合成が完了したら、該CICを固相担体から切り離し、ホスホトリエステル基又はホスホロチオアートトリエステル基上のシアノエチル基を除去し、また核酸塩基も脱保護する。この例では、CICは核酸部分との安定ホスホジエステル又はホスホロチオアートジエステル結合を含むスペーサー部分をもつ。スペーサー前駆体の反応性ホスホロアミダイト基と保護ヒドロキシル基は共に、スペーサー前駆体中の安定ホスホジエステル又はホスホロチオアートジエステル結合へと変換される。スペーサーの各末端の反応は独立していてもよいので、一方の結合をホスホジエステル結合とし他方の結合をホスホロチオアートジエステル結合としてもよいし、又はそれらを任意に組み合わせもよい。他のリン酸修飾体たとえばホスホロジチオアート、リン酸メチル、ホスホロアミダートなどを含むCICもまた同様に、好適な反応性基、適正な補助試薬及びその結合タイプにとって好ましいプロトコールを用いて合成してよい。それらのプロトコールは修飾リン酸結合をもつ核酸部分の合成に関するプロトコールと類似する。
[0204] ホスホロアミダイト法の使用はある種のCICの合成には好都合であるが、言うまでもなく本発明のCICは特定の合成又は製造方法によって合成される化合物に限らない。たとえばDNA合成及び脱保護条件になじまない基たとえば非限定的な例としてヒドラジン又はマレイミドなどを含む核酸部分は、アミノ・リンカーを含む核酸部分を適当なヘテロ二官能性架橋試薬たとえばSHNH(ヒドラジニウムニコチン酸スクシンイミジル)又はSulfo-SMCC (4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル)と反応させて合成することができる。
[0205] タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び小分子を様々な組み合わせで結合させる方法は文献に記載されており、また反応性結合基を含む核酸部分のスペーサー部分前駆体への結合を実現するように改変することができる。Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996などを参照。実施態様によっては、核酸部分を合成し、標準合成化学手法を用いて反応性結合基(アミノ、カルボキシラート、チオ、ジスルフィドなど)を付加する。反応性結合基(これは得られるスペーサー部分の一部分をなすと考えられる)は追加の非核酸化合物(非限定的な例は前の§4に記載の化合物)に結合させてスペーサー部分の一部とする。反応性結合基は核酸に、標準核酸合成法で技術上周知の多様な試薬を用いて付加する。たとえば、保護アミノ基、カルボキシラート基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ジオール基、ジエン基、ホスホロアミダイト基を含む試薬である。これらの化合物は、ひとたび活性化ホスホロアミダイト基を介して核酸に結合され、次いで脱保護を受けると、核酸にアミノ、カルボキシラート、アルデヒド、ジオール、ジエン又はチオールの反応性を付与する。反応性結合基を含む核酸部分の、反応性基を含むスペーサー部分前駆体への結合に適した反応性基の例は次に示すとおりである。
核酸の スペーサー部分前駆体の形成される
反応性基 反応性基 安定結合
チオール マレイミド、ハロアセチル チオエーテル
マレイミド チオール チオエーテル
チオール ピリジンジスルフィド ジスルフィド
ピリジンジスルフィド チオール ジスルフィド
アミン NHS又は他の活性エステル アミド
アミン カルボキシラート アミド
カルボキシラート アミン アミド
アルデヒド,ケトン ヒドラジン,ヒドラジド ヒドラゾン,ヒドラジド
ヒドラジン,ヒドラジド アルデヒド,ケトン ヒドラゾン,ヒドラジン
ジエン ジエンフィル 脂環式又は複素環式環
[0206] 反応性結合基とスペーサー前駆体は反応して安定結合を結成するが、2つ(又は3以上)の核酸部分の間の全原子団をスペーサー部分と定義する。たとえばホスホロチオアート基を介してメルカプトヘキシル基を核酸部分に結合させて合成した核酸部分と1つ(又は2以上)のマレイミド基を含むスペーサー前駆体とを反応させればチオエーテル結合を形成することができる。このCICのスペーサー部分は、核酸部分に由来するホスホロチオアート基とヘキシル基、新たなチオエーテル結合、及びスペーサー前駆体を構成していた残りのスペーサー部分を含む。
[0207] これらのコンジュゲート戦略を用いて線状CICを合成することも可能であるが、これら方法は最もしばしば分岐CICの合成に使用する。また、スペーサー前駆体分子はいくつかの直交反応性基を用いて、2種類以上の(たとえば配列モチーフの異なる)核酸部分を付加するように合成することもできる。
[0208] 一実施態様では、2種類以上の核酸部分に結合(conjugate複合)させた多価スペーサーをもつCICを合成する。たとえば(チオール基を含む多糖に対して反応性の)2個のマレイミド基と(アミノ基を含む核酸に対して反応性の)2個の活性化エステル基とを含むプラットホームがすでに開示されている(WO 95/07073号として公開されたPCT/US94/10031号明細書などを参照)。これら2つの活性化基は互いに独立に反応させることができる。この場合は各配列につき2個、合計4個の核酸部分を含むCICが合成されよう。
[0209] 2種類の核酸配列を含む多価スペーサーを備えたCICは、前述の対称分岐スペーサーと慣用のホスホロアミダイト法により(たとえば手作業式又は自動式で)合成することもできる。この対称分岐スペーサーはホスホロアミダイト基と2個の(同じであり、同時に除去される)保護基とを含む。たとえば1つのアプローチでは、第1の核酸を合成し対称分岐スペーサーに結合させ、該スペーサーから保護基を除去する。次いで2個の(同じ配列の)追加核酸を該スペーサー上で(単一核酸の合成に使用した量の2倍量の試薬を各ステップで使用して)合成する。この手順は実施例15で詳述する。
[0210] 同様の方法を用いて3種類の核酸部分(以下、核酸Ｉ、II、III と呼ぶ)を多価スペーサー(非対称分岐スペーサーなど)に結合することもできる。これは自動DNA合成機を使用して行うのが最も好都合である。一実施態様では、非対称分岐スペーサーはホスホロアミダイト基と同時除去が可能な2個の直交保護基とを含む。まず、核酸Ｉを合成し、次いで非対称分岐スペーサーを核酸Ｉに結合し、次いで一方の保護基を選択的に除去した後、核酸IIを付加する。核酸IIを脱保護し、キャップし、次いでスペーサー上の他方の保護基を除去する。最後に核酸III を合成する。この手順は実施例17で詳述する。
[0211] 可変長の親水性リンカーはたとえば核酸部分とプラットホーム分子の結合に有用である。種々の好適なリンカーが知られている。好適なリンカーの非限定的な例はエチレングリコールの線状オリゴマー又はポリマーなどである。その種のリンカーは、式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2 (式中n=0〜200、m=1又は2、R1=H又は保護基たとえばトリチル、R2=H又はアルキル又はアリールたとえば4-ニトロフェニルエステル)で示されるリンカーを包含する。これらのリンカーは、チオエーテル基を介してチオール反応性基たとえばハロアセイルやマレイミドなどを含む分子を、アミド結合を介してアミノ基を含む第2分子に、結合する際に有用である。この結合順序は変えることができる。すなわちチオエーテル結合の形成はアミド結合の形成の前でも後でもよい。有用なリンカーとしては他にSulfo-SMCC (4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22322); Sulfo-EMCS (N-[ε-マレイミドカプロイルオキシ] スルホスクシンイミド=エステル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22307); Sulfo-GMBS(N-[γ-マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミド=エステル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22324; (Pierce Chemical Company, Rockford, IL)、及び一般式をマレイミド-R-C(O)NHSエステル(式中Rはアルキル、環式アルキル、エチレングリコールポリマーなどである)とする類似化合物がある。
[0212] 核酸部分を多価スペーサーに共有結合させる特に有用な方法は前掲参考文献に記載されており、また実施例でも示す。
[0213] 従って一態様では、本発明は哺乳動物の免疫反応の調節に有用なCICを、単数又は複数のポリヌクレオチドを化合物に共有結合させて、核酸部分及びスペーサー部分領域を含み免疫調節活性を示すキメラ化合物とすることにより、合成する方法を提供する。多様な実施態様では、該核酸領域は本書で開示する任意の核酸部分の構造及び配列をもち、また該スペーサー領域は本書で開示する任意の構造をもつことができる。この方法にはしばしば、2以上の結合ステップが存在する。たとえば2個のポリヌクレオチドを1又は2個のスペーサーに共有結合させるには結合ステップを1回以上、しばしば2回又は3回以上繰り返す。この方法はさらに、CICを製薬上許容しうる賦形剤と混合して組成物を形成するステップを含む。一実施態様では、該組成物は無菌性であり、たとえば人間への投与に適し、たとえばGMP規格に従って製造又は調製する。一実施態様では、CICは本書で開示するようなマイクロキャリアー及び/又はナノキャリアーと組み合せる。実施態様によっては、本発明のCIC製剤には (i)コロイド分散系、(ii)リポソーム、(iii)マイクロキャリアー、(iv)ポリペプチド、(v)抗原及び(vi)内毒素が1以上混じらないことも見込まれる。
6. タンパク質性CIC
[0214] 実施態様によっては、タンパク質抗原又は抗原断片などのポリペプチドを、複数の核酸部分を直接又はリンカーを介して共有結合させるための多価スペーサー部分として使用し、「タンパク質性CIC」を形成する。ポリペプチドはそれに対して適応免疫反応が求められる抗原又は免疫原、もしくは担体(アルブミンなど)でもよい。一般にタンパク質性CICは少なくとも1つの、通常は数個又は多数の、核酸部分を含むが、該核酸部分は(a)鎖長が2〜7、よりしばしば4〜7ヌクレオチドであり、あるいは2〜6、2〜5、4〜6、又は4〜5ヌクレオチドである、及び/又は(b)低単独免疫調節活性をもつ、又は単独免疫調節活性をもたない。タンパク質性CICの合成方法は本発明の開示に触れた当業者には自明であろう。たとえばポリペプチド・スペーサー部分への核酸の共有結合には、技術上周知の方法たとえば核酸部分の3’又は5’末端(又は核酸部分の内部位置にある好適な修飾塩基)と好適な反応性基(たとえばシトシン残基のN4アミノ基と直接反応することができるN-ヒドロキシスクシンイミド=エステル)を備えたポリペプチドとの間の結合などを用いることができる。別の例として、ポリペプチドは核酸部分の遊離5’末端に、該核酸部分に予め導入しておいたアミン、チオール又はカルボキシル基を介して結合することができる。あるいは本書で開示している要領でポリペプチドをスペーサー部分に結合してもよい。さらに、保護アミン、チオール又はカルボキシル基を一端に含む結合基及びホスホロアミダイト基をポリヌクレオチドのヒドロキシル基に共有結合させ、脱保護後に、該官能基を使用してCICをペプチドに共有結合させることもできる。
7. 精製
[0215] 本発明のCICは高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、核酸アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなど任意慣用の手段で精製する。実施態様によっては、CICは実質的に純粋であり、たとえば純度が約80(重量) %以上、しばしば約90%以上、よりしばしば約95%以上、最もしばしば約85%以上である。
8. 組成物
[0216] 多様な実施態様では、本発明の組成物は1以上のCIC(たとえば単一CIC又は2以上のCICの組み合わせ)を、随意に別の免疫調節物質たとえばペプチド、抗原(後述)及び/又は追加アジュバントと共に含む。本発明の組成物はCICと製薬上許容しうる賦形剤とを含んでもよい。「製薬上許容しうる」は、担体、希釈剤又は賦形剤が他の製剤成分と適合しなければならず、その受容者に有害であってはならないことを意味する。製薬上許容しうる賦形剤は技術上周知であり、滅菌水、等張液たとえば生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水、及び技術上周知の他賦形剤などがその例である。たとえばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (19th edition, 1995, Gennavo, ed.)を参照。アジュバント(ミョウバンなど)は技術上周知である。CIC製剤には他の免疫治療薬たとえばサイトカインや抗体を含めてもよい。実施態様によっては、該組成物は等張性及び/又は滅菌性であり、たとえば人間への投与に適し、たとえばGMP規格に従って製造又は調製する。
A. CIC/MC複合体
[0217] CICはCIC/マイクロキャリアー(CIC/MC)複合体の形で投与してもよい。従って本発明はCIC/MC複合体を提供する。
[0218] CIC/MC複合体はCICをマイクロキャリアー表面に結合させて含み、また好ましくは各マイクロキャリアーに複数のCIC分子を結合させて含む。実施態様によっては、種々のCICの混合物をマイクロキャリアーと複合させ、マイクロキャリアーが複数のCIC種と結合するようにしてもよい。CICとMCの間の結合は共有結合でも非共有結合(たとえばイオン結合及び/又は疎水性相互作用)でもよい。当業者には自明であろうが、CICの修飾又は誘導体化やマイクロキャリアー組成物の選定及び/又は修飾は、CIC/MC複合体の形成にとって好ましい所望タイプの結合に適応するように行ってもよい。
[0219] 共有結合型CIC/MC複合体は任意の、技術上周知の共有結合型架橋技術を用いて結合してもよい。一般にCIC部分は追加の部分(たとえば遊離アミン、カルボキシル又はスルフヒドリル基)又は修飾(たとえばホスホロチオアート)ヌクレオチド塩基を組み込めるように修飾して、該CIC部分がマイクロキャリアーに結合するための部位を設けるようにする。該複合体のCIC部分とMC部分の間の結合はCIC部分の3’又は5’末端で、あるいはCICの内部位置にある好適な修飾塩基で、行われるようにする。マイクロキャリアーもまた一般に修飾して、それを介して共有結合が形成される部分を組み込めるようにする。もちろん、マイクロキャリアー表面に通常存在する官能基を利用してもよい。CIC/MCを形成させるには、共有結合型複合体の形成を可能にするような条件下で(たとえば架橋剤の存在下に、又はCICと共有結合を形成することになる活性化部分を含む活性化マイクロキャリアーの使用により)CICをマイクロキャリアーとインキュベートする。
[0220] アミノ、カルボキシル及びヒドロスルフリル基に対して反応性の架橋剤の使用など多様な架橋技術が周知である。当業者には自明であろうが、架橋剤と架橋プロトコールの選択はCICとマイクロキャリアーの立体配置並びに求められるCIC/MC複合体の最終的な立体配置に左右される。架橋剤はホモ二官能性でもヘテロ二官能性でもよい。ホモ二官能性架橋剤を使用するときは、該架橋剤はCIC及びMC上の同じ部分を利用する(たとえばCICとMCの両方が1以上の遊離アミンを含む場合はアルデヒド架橋剤を使用してCICとMCを共有結合させてもよい)。ヘテロ二官能性架橋剤はCIC及びMC上の異なる部分を利用する(たとえばマレイミド-N-ヒドロキシスクシンイミド=エステルを使用しCIC上の遊離スルフヒドリルとMC上の遊離アミンを共有結合させてもよい)し、またマイクロキャリアー間結合の形成を最小限に抑えるために選好される。ほとんどの場合、MC上に第2架橋部分が存在しないときにMC上の第1架橋部分とCIC上の第2架橋部分を介して架橋するのが好ましい。CIC/MC複合体を合成する好ましい一方法ではMCをヘテロ二官能性架橋剤とのインキュベーションにより「活性化」し、次いでCICと活性化MCを好適な反応条件下でインキュベートする。架橋剤は反応性部分の間に「スペーサー」アームを介在させてもよいし、架橋剤の2反応性部分が直接結合していてもよい。
[0221] 一実施態様では、CIC部分はマイクロキャリアーとの架橋結合用の、少なくとも1つの(5’-チオール修飾塩基又はリンカーによりもたらされる)遊離スルフヒドリル基を含み、またマイクロキャリアー部分は遊離アミン基を含む。これら2つの基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤(たとえばマレイミド基とNHS-エステルとを含む架橋剤)たとえば4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジルを使用すれば、MCを活性化し、次いでCICを共有結合的に架橋してCIC/MC複合体を形成することができる。
[0222] 非共有結合型CIC/MC複合体は任意の非共有結合又は相互作用により、たとえばイオン(静電)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又は結合対がCICとMCを結合する場合には通常そうであるように2種以上の相互作用の組み合わせにより結合されよう。
[0223] 好ましい非共有結合型CIC/MC複合体は一般に、疎水性相互作用又はイオン(静電)結合、又は両者の組み合わせにより(たとえばCICとMCに結合したポリヌクレオチドとの間の塩基対合により)形成する。ポリヌクレオチドの骨格は親水性であるため、複合体の形成を疎水性相互作用に依存するCIC/MC複合体は一般に、CIC部分を修飾して高疎水性部分を組み込めるようにする必要がある。好ましくは、該疎水性部分は生体適合性、非免疫原性であり、また組成物の投与対象の個体中に(たとえば哺乳動物体好ましく人体中に)天然に存在する。好ましい疎水性部分の例は脂質、ステロイド、ステロールたとえばコレステロール、及びテルペンなどである。疎水性部分をCICに結合する方法はもちろん、CICの立体配置と疎水性部分の種類に左右される。疎水性部分はICI中の任意幸便の部位に、好ましくは5’又は3’末端に付加する。コレステロール部分をCICに付加する場合には、CICの5’末端に通常の化学反応を利用して付加するのが好ましい[たとえばGodard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 404-410を参照]。好ましくは、疎水性相互作用型CIC/MC複合体に使用するマイクロキャリアーは疎水性物質たとえば油滴又は疎水性ポリマーなどから製造するが、疎水性部分を組み込めるように修飾した親水性物質を使用してもよい。マイクロキャリアーが内腔を含むリポソーム又は他の脂質相マイクロキャリアーである場合には、CIC/MC複合体は、MC調製時にMC中へのCICの被包を防ぐために、MCの調製後にCICとMCを混合して形成する。
[0224] イオン結合による非共有結合型CIC/MC複合体は一般に、ポリヌクレオチド骨格の高負電荷を利用する。従って、非共有結合型CIC/MC複合体に使用するマイクロキャリアーは一般に生理的pH条件(pH 6.8〜7.4程度)で正電荷を帯びる。該マイクロキャリアーは元来、正電荷を帯びていてもよいが、通常は正電荷を帯びていない化合物から製造し、誘導体化又は修飾して正電荷を帯びるようにしてもよい。たとえばマイクロキャリアーの製造に使用するポリマーを誘導体化して正荷電基たとえば第一級アミン基を付加するようにしてもよい。あるいはマイクロキャリアー製造時に正荷電化合物を配合してもよい[たとえばポリ(乳酸)/ポリ(グリコール酸)コポリマーの製造時に正荷電界面活性剤を使用して、得られるマイクロキャリアー粒子に正電荷を付与するようにしてもよい]。たとえば実施例28及び34を参照。
[0225] 核酸塩基の対合による非共有結合型CIC/MC複合体を、慣用の方法で製造してもよい。一般に塩基対合型CIC/MC複合体は、CICに対して少なくとも部分的に相補的である結合(好ましくは共有結合)ポリヌクレオチド(「キャプチャー・ポリヌクレオチド」)を使用して製造する。CICとキャプチャー・ヌクレオチドの間の相補性部分は好ましくは少なくとも6、8、10又は15連続塩基対であり、より好ましくは少なくとも20連続塩基対である。キャプチャー・ヌクレオチドは技術上周知の任意の方法でMCに結合させてよいが、好ましくはCICに5’又は3’末端で共有結合させる。
[0226] 他の実施態様では、結合対を使用してCICとMCを結合しCIC/MC複合体とする。結合対は受容体とリガンド、抗体と抗原(又はエピトープ)、又は高アフィニティー(たとえばKdが約10-8未満)の他結合対でもよい。好ましい結合対の1種は、きわめて緊密な複合体を形成するビオチンとストレプトアビジン、又はビオチンとアビジンである。CIC/MC複合体の形成に結合対を使用するときは、結合対の一方のメンバーにより(一般に共有結合で)CICを誘導体化し、結合対の他方のメンバーによりMCを誘導体化する。これら2つの誘導体化化合物を混合するとCIC/MC複合体が形成される結果となる。
[0227] 多数の実施態様では、CIC/MC複合体は抗原を含まず、また実施態様によってはCIC/MC複合体療法の対象疾病又は疾患に関連する抗原を排除する。さらなる実施態様では、CICもまた1以上の抗原分子に結合させる。抗原はCIC/MC複合体のCIC部分に多様な方法で、たとえば共有及び/又は非共有結合で結合させてよい。あるいは、抗原はマイクロキャリアーに結合させてもよい。CICに結合させた抗原を含むCIC/MC複合体では、本書で開示の、また技術上周知の手法で抗原とCICを結合させてよい。
B. 併用投与抗原
[0228] 実施態様によってはCICを抗原と併用投与する。任意の抗原をCICとの併用投与に、及び/又はCICと抗原とを含む組成物の調製に、使用してよい。
[0229] 実施態様によっては、抗原はアレルゲンである。Table 1は組換えアレルゲンの例である。多数のアレルゲン調製品が技術上周知であり、その非限定的な例はブタクサ花粉アレルゲンAntigen E (Amb aI) [Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236); 草アレルゲンLol p 1 [Tamborini et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894]; 主要チリダニ・アレルゲンDer pI及びDer pII[Chua et al. (1998) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129]; 家ネコ・アレルゲンFel dI [Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559-568]; シラカバ花粉アレルゲンBet v1 [Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935-1938); スギ花粉アレルゲンCry j 1及びCry j 2 [Kingetsu et al. (2000) Immunology 99:625-629]; 及び他の樹木花粉由来タンパク質抗原[Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31] などの調製品である。in vivo投与向けの草花粉由来タンパク質抗原の調製品もすでに報告されている。
[0230] 実施態様によっては、抗原は食物アレルゲンである。その非限定的な例は落花生アレルゲンたとえばAra h 1 [Stanley et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216]; クルミ・アレルゲンたとえばJug r I [Tueber et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 807-814]; ブラジルナッツ・アレルゲンたとえばアルブミン[Pastorello et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102: 1021-1027]; エビ・アレルゲンたとえばPen a I [Reese et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242]; 卵アレルゲンたとえばオボムコイド[Crooke et al. (1997) J. Immunol. 159:2026-2032]; 牛乳アレルゲンたとえばウシβ-ラクトグロビン[Selot et al. (1999) Clin. Exp. Allergy 29:1055-1063]; 魚アレルゲンたとえばパルブアルブミン[Van Do et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625; Galland et al. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706:63-71] などである。実施態様によっては、抗原はラテックス・アレルゲンであり、その非限定的な例はHev b 7 [Sowka et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255:213-219]などである。次のTable 1は使用可能アレルゲンの一覧である。
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[0231] 実施態様によっては、抗原は原虫、細菌、菌類(単細胞性及び多細胞性)及びウイルスなどの病原体に由来する。好適なウイルス抗原の例は本書で開示しているし、技術上周知でもある。細菌の例はHemophilus influenza、Mycobacterium tuberculosis及びBordetella pertussisなどである。病原体原虫の例は、マラリア原虫、Leishmania属、Trypanosoma属及びSchistosoma属などである。菌類の例はCandida albicansなどである。
[0232] 実施態様によっては、抗原はウイルス抗原である。ウイルス・ポリペプチド抗原の非限定的な例はHIVタンパク質たとえばHIV gagタンパク質[非限定的な例は膜接着性の基質タンパク質(MA)、コアキャプシド(CA)タンパク質、及びヌクレオキャプシド(NC)タンパク質など]、HIVポリメラーゼ、インフルエンザウイルスの基質(M)タンパク質及びヌクレオキャプシド(NC)タンパク質、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎DNAポリメラーゼ、C型肝炎抗原などである。インフルエンザ・ワクチン接種を論じた文献としてはScherle and Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450; Scherle and Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff et al. (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova and Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8:595-599などがある。抗原ポリペプチドの例としては他に、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピロマウイルス、RSウイルス及びポックスウイルスなどを非限定的に含む多数の病原体に関して知られている群-又は亜群-特異抗原がある。
[0233] 多数の抗原ペプチド及びタンパク質が技術上周知であり、また入手も可能である。常法により同定しうるものもある。腫瘍形成に対する免疫又は既存腫瘍の治療に用いる免疫調節ペプチドの例には腫瘍細胞(生細胞又は照射細胞)、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原[たとえばHer-2/neu、Mart1、がん胎児性抗原(CEA)、ガングリオシド、人乳脂肪球(HMFG)、ムチン(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前立腺特異抗原(PSA)及びチロシナーゼ]のサブユニットを含めることができる。CICと併用投与される抗原に精子タンパク質を含めれば、生殖免疫に基づく避妊ワクチンを形成することができる。Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta. 1307:263。
[0234] 弱毒化又は不活化ウイルスは本発明への抗原としての使用に適する。そうしたウイルスの調製品は技術上周知であり、市販品も多い[たとえばPhysician’s Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, Inc.を参照]。たとえばポリオウイルスはIpol(登録商標; Pasteur Merieux Connaught)及びOrimune(登録商標; Lederle Laboratories)として、A型肝炎ウイルスはVaqta(登録商標; Merck)として、はしかウイルスはAttenuvax(登録商標; Merck)として、流行性耳下腺炎ウイルスはMumpsvax(登録商標; Merck)として、また風疹ウイルスはMeruvaxII(登録商標; Merck)として、それぞれ市販されている。さらに、HIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒト・パピロマウイルス、及びスロー脳ウイルス(slow brain viruses)などの弱毒化及び不活化ウイルスはペプチド抗原をもたらすことができる。
[0235] 実施態様によっては、抗原はワクシニア、アデノウイルス及びカナリアポックスなどのウイルスベクターを含む。
[0236] 抗原は技術上周知の精製手法を用いて単離してもよいし、より好都合には組換え手法を用いて産生させてもよい。
[0237] 抗原ペプチドの例は精製天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗製ペプチド抽出物、弱毒化又は不活化ウイルス、細胞、微生物、又はそれらの断片などである。免疫調節ペプチドは天然物でも、化学又は酵素合成物でもよい。技術上周知の任意の化学合成法が好適である。液相ペプチド合成は中サイズのペプチドの合成に用いることができる。また固相化学合成法を用いてもよい。Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839. タンパク質分解酵素を用いて、アミノ酸を結合しペプチドとしてもよい。Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. あるいは、細胞の生化学機構を利用して、又は生物資源からの単離によって、ペプチドを得ることもできる。組換えDNA手法を用いてペプチドを産生させてもよい。Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press. ペプチドはアフィニティークロマトグラフィーなどの標準手法を用いて単離することもできる。
[0238] 抗原はペプチド、脂質(たとえばコレステロールを除くステロール類、脂肪酸及びリン脂質など)、H. influenzaワクチンに使用されるような多糖類、ガングリオシド及び糖タンパク質などであるのが好ましい。これらは技術上周知の方法で、たとえば化学的、酵素的合成及び抽出などで得ることができる。多数のステロール、脂肪酸及びリン脂質などのように、分子の抗原部分が市販されていることもある。
[0239] 本発明の組成物及び該組成物を使用する方法に有用なウイルス抗原の非限定的な例はHIV抗原であり、その非限定的な例はHIV外被の糖タンパク質に由来する抗原たとえばgp160、gp120及びgp41などである。HIV遺伝子及び抗原に対応する多数の配列が知られている。たとえばロスアラモス国立研究所のHIV Sequence DatabaseはHIV関連のヌクレオチド及びアミノ酸配列を収集、管理、ラベル付けしている。このデータベースはインターネットで閲覧することができるし(http://hiv-web.lanl.gov/)、年次刊行物ともなっている。Human Retroviruses and AIDS Compendium (たとえば2000年版)を参照。
[0240] 病原体に由来する抗原は技術上周知の方法により、たとえば天然ウイルス又は細菌抽出物から、病原体に感染した細胞から、精製ポリペプチドから、組換え手法で産生させたポリペプチドから及び/又は合成ペプチドから得られる。
[0241] ICCは多様な方法で抗原と併用投与することができる。実施態様によっては、CICと抗原を互いに空間的に近接させて投与する。後述のように、空間的近接はコンジュゲート形成、被包、プラットホームへの付加、又は表面への吸着など様々な方法で実現することができる。一実施態様では、CICと抗原を混合物として(溶液などに溶かして)投与する。実施態様によっては、CICは免疫原又は抗原とコンジュゲートを形成しないことが明確に見込まれる。
[0242] 実施態様によっては、CICをポリペプチドたとえば抗原に結合する。コンジュゲートのCIC部分を抗原部分に結合するには様々な方法が可能であり、核酸又は非核酸スペーサー部分を介した共有及び/又は非共有結合はその一例である。実施態様によっては、結合に反応性基たとえばチオ、アミン、カルボキシラート、アルデヒド、ヒドラジン、ヒドリゾン、ジスルヒド基などを使用する。
[0243] 部分間の結合は核酸部分の3’又は5’末端で、又は核酸部分の内部位置内の好適な修飾塩基上で、行うことができる。たとえば抗原がペプチドであり、かつ好適な反応性基(たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド=エステル)を含む場合には、シトシン残基のN4アミノ基と直接反応させることができる。CIC中のシトシン残基の数と位置に応じて、1以上の残基上で特定の結合を実現することができる。
[0244] あるいは、修飾オリゴヌクレオチドたとえば技術上周知のものをCICのいずれかの末端に、又は中間位置に組み込むこともできる。これらのオリゴヌクレオチドはブロック官能基を含むことができるが、該官能基はブロックを解除されると、着目する抗原に存在しうる又は結合させうる多様な官能基に対して反応性になる。
[0245] 抗原がペプチドである場合には、コンジュゲートの抗原部分は固相法により核酸部分又はスペーサー部分に結合させることができる。たとえばCICの核酸部分は、予め担体上で合成しておいたポリペプチド部分に付加することができる。Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:493-499; 及びHaralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:501-505.
[0246] あるいは、核酸部分の3’末端から伸長する切断可能なリンカーを介して固相担体に結合させるようにCICを合成することもできる。CICを担体から化学的に切断すると、核酸部分の3’末端に末端チオール基又は末端アミノ基が残る(Zuckermann et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; Corey et al., 1987, Science 238: 1401-1403; Nelson et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:1781-1794)。ペプチドのアミノ基へのアミノ基修飾CICの結合はBenoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72に記載の要領で行うことができる。ペプチドのカルボキシル基へのチオール基修飾CICの結合はSinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Pressに記載の要領で行うことができる。ペプチドのシステイン残基チオール側鎖への、付加マレイミドを含む核酸部分又はスペーサーの結合についてもすでに開示されている。Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465.
[0247] コンジュゲートのペプチド部分は核酸部分の遊離5’末端に、核酸部分又はスペーサー(の遊離5’末端、3’末端、又は修飾塩基など)に予め組み込んでおいたアミン、チオール又はカルボキシル基を介して付加することができる。
[0248] 好都合にも、CICのヒドロキシル基には、一端に保護アミン、チオール又はカルボキシル基を含む結合基及びホスホロアミダイトを共有結合させることができる。Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; 及び米国特許第4,849,513号、5,015,733号、5,118,800号及び5,118,802号の各明細書。該アミン、チオール又はカルボキシル基は脱保護後、ペプチドへのCICの結合に使用することができる。Benoit et al (1987)及びSinah et al. (1991).
[0249] CIC-抗原コンジュゲートはまた、非共有相互作用たとえばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び/又はファンデルワールス力などによって形成することもできる。
[0250] 非共有結合型コンジュゲートはビオチン-ストレプトアビジン複合体などの非共有作用を含む場合がある。ビオチニル基はたとえばCICの修飾塩基に結合させることができる。Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. ストレプトアビジン部分をペプチド部分に組み込むと、ストレプトアビジン結合ペプチドとビオチニル化オリゴヌクレオチドの非共有結合型複合体の形成が可能になる。
[0251] 非共有結合はCICと抗原内残基たとえば荷電アミノ酸とが絡むイオン性相互作用を介して、又はオリゴヌクレオチドと抗原の両方と相互作用しうる荷電残基を含むリンカー部分の使用により、実現することもできる。たとえば非共有結合は概して負に荷電したCICと正に荷電したペプチド・アミノ酸残基たとえばポリリシン、ポリアルギニン及びポリヒスチジン残基との間で起こりうる。
[0252] CICと抗原の非共有結合は、天然リガンドとしてのDNAと相互作用する分子のDNA結合モチーフにより実現することもできる。そうしたDNA結合モチーフは転写因子や抗DNA抗体などに見ることができる。
[0253] 脂質へのCICの結合は標準方法で形成することができる。その非限定的な例はオリゴヌクレオチド-リン脂質コンジュゲート [Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192]、オリゴヌクレオチド-脂肪酸コンジュゲート[Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; 及びStaros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222]、及びオリゴヌクレオチド-ステロール・コンジュゲート[Boujrad et al. (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5728-5731]の合成などである。
[0254] オリゴ糖へのオリゴヌクレオチドの結合は周知の標準方法で形成することができる。その非限定的な例はオリゴヌクレオチド-オリゴ糖コンジュゲートの合成などであり、この場合のオリゴ糖は免疫グロブリンの一部分である。O’Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.
[0255] ペプチド又は他分子をオリゴヌクレオチドに結合する方法は米国特許第5,391,723号明細書; Kessler (1992) “Nonradioactive labeling methods for nucleic acids” [Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press所載]; 及びGeoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146などでも開示されている。
[0256] CICは他の方法で抗原に近似的に結合させてもよい。実施態様によってはCICと抗原を被包によって近似的に結合させる。別の実施態様ではCICと抗原をプラットホーム分子への結合により近似的に結合させる。「プラットホーム分子」(単にプラットホームともいう)はCICと抗原の結合用部位を含む分子である。他の実施態様では、ICIと抗原を表面好ましくはキャリアー粒子への吸着により近似的に結合させる。
[0257] 本発明の方法は実施態様によっては被包材を使用するが、該被包材はCICと第1抗原の近似的結合を、該複合体が標的(又は被包材を含む組成物)によって利用されるようになるまで維持することができる。好ましくは、CICと抗原と被包材とを含む組成物はアジュバント水中油型エマルジョン、微粒子及び/又はリポソームの形をとる。より好ましくは、CICを被包するアジュバント水中油型エマルジョン、微粒子及び/又はリポソームは粒子の形をとるが、その粒径は約0.04μm〜約100μmであり、より好ましくは次のうち任意の範囲である:約0.1μm〜約20μm、約0.15μm〜約10μm、約0.05μm〜約1.00μm、約0.05μm〜約0.5μm。
[0258] コロイド分散系たとえばミクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプセル、及び脂質分散系たとえば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームなどは、含CIC組成物の被包に有効である。
[0259] 被包組成物は多様な成分のうち任意のものをさらに含む。その非限定的な例はミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造(LMS)、ポリエチレングリコール(PEG)、及び他ポリマーたとえばポリペプチド、糖ペプチド及び多糖などである。
[0260] 被包成分として好適なポリペプチドは技術上周知の任意のものを含み、非限定的な例は脂肪酸結合性タンパク質などである。修飾ポリペプチドは多様な修飾のうち任意のものを含み、その非限定的な例はグリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化、ヒドロキシル化などである。本書でいう好適なポリペプチドは、含CIC組成物を保護してその免疫調節活性を保存するようなポリペプチドである。結合性タンパク質の非限定的な例はアルブミンたとえばウシ血清アルブミン(BSA)及びえんどう豆アルブミンである。
[0261] 他の好適なポリマーは製薬技術上周知の任意のポリマーであり、その非限定的な例は天然ポリマー(たとえばデキストラン、ヒドロキシエチルでんぷん及び多糖)及び合成ポリマーである。天然ポリマーの例はタンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン、脂質などである。追加ポリマーは合成ポリマーでもよい。本発明への使用に好適な合成ポリマーの非限定的な例はポリアルキルグリコール(PAG)たとえばPEG、ポリオキシエチル化ポリオール(POP)たとえばポリオキシエチル化グリセロール(POG)、ポリトリメチレングリコール(PTG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、メタクリル酸ポリヒドロキシエチル、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリアミノ酸、ポリウレタン及びポリホスファゼンなどである。合成ポリマーは、2種類以上の合成モノマーからなる線状の又は分岐した、置換又は非置換型のホモポリマー、コポリマー又はブロックコポリマーでもよい。
[0262] 本発明の被包組成物用のPEGは薬品メーカーから購入するか、又は技術上周知の方法を用いて合成する。
[0263] 用語「LMS」は本書では、極性脂質の極性「頭部」基が界面の水相に向き合うように配置されて膜構造を形成しているラメラ構造の脂質粒子を意味する。LMSの例はリポソーム、ミセル、コクリート(cochleates)(すなわち総じて円筒型のリポソーム)、マイクロエマルジョン、単層小胞、多層小胞などである。
[0264] CIC投与に有用な一コロイド分散系はリポソームである。リポソーム被包抗原で免疫したマウスでは、リポソームは抗原に対するTh1型免疫反応を増進するように見受けられた。Aramaki et al. (1995) Vaccine 13:1809-1814.「リポソーム」又は「脂質小胞」は本書では、少なくとも1つの、またおそらく2以上の脂質二層膜で閉ざされた小胞体である。リポソームはリン脂質、糖脂質、脂質、コレステロールなどのようなステロイド、関連分子、又はそれらの組み合わせから、技術上周知の任意の手法たとえば超音波処理、押し出し又は脂質-洗剤複合体からの洗剤の除去により人工的に形成する。リポソームはまた随意に、追加成分たとえば組織ターゲッティング成分などを含んでもよい。「脂質膜」又は「脂質二重膜」は脂質だけで構成される必要はなく、疎水性コアを挟む2つの親水性表面からなるシートという一般的な膜構造が維持される限り、他の任意好適な成分たとえば非限定的な例としてコレステロール及び他ステロイド類、脂溶性薬品、任意鎖長のタンパク質、及び他の両親媒性分子などを追加的に含んでもよい。膜構造の概説はThe Encyclopedia of Molecular Biology by J. Kendrew (1994)を参照。好適な脂質に関しては、たとえばLasic (1993) “Liposomes: from Physics to Applications” Elsevier, Amsterdamを参照。
[0265] 含CIC組成物を被包するリポソームの調製法は技術上周知である。脂質小胞は技術上周知の任意好適の方法で調製することができる。そうした方法の非限定的な例は微小カプセル化、微小流動化、LLC法、エタノール注入、フレオン注入、「バブル」法、洗剤透析、水和、超音波処理及び逆相蒸発などである。Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68:715-724の概説を参照。手法を組み合せて最も望ましい属性を備えた小胞が得られるようにしてもよい。
[0266] 本発明は組織又は細胞ターゲッティング成分を含むLMSの使用方法を包含する。そうしたターゲッティング成分は、LMSを無傷の動物、器官又は細胞培養に与えたときに、他の組織又は細胞部位に優先して特定組織又は細胞部位へのLMSの局在化を増進するようなLMS成分である。ターゲッティング成分は一般にリポソームの外側から接近可能であり、従って外表面に結合するか又は外側の脂質二層膜に挿入するのが好ましい。ターゲッティング成分は特にペプチド、より大きなペプチドの一領域、細胞表面分子又はマーカーに対して特異的な抗体又はその抗原結合断片、核酸、糖質、複合糖質の一領域、特殊脂質、又は以上いずれかの分子に結合させた小分子(薬剤、ホルモン又はハプテンなど)とすることができる。細胞型特異的な細胞表面マーカーに対する特異性をもつ抗体は技術上周知であり、また技術上周知の方法による調製も容易である。
[0267] LMSは治療的処置の対象となる任意の細胞型(たとえば免疫反応を調節する及び/又は免疫反応に関与する細胞型)をターゲットにすることができる。そうしたターゲット細胞又は器官の非限定的な例はAPCたとえばマクロファージ、樹状細胞及びリンパ球、リンパ構造たとえばリンパ節や脾臓、それに非リンパ構造特に樹状細胞が見られる組織などである。
[0268] 本発明のLMS成分は界面活性剤を追加的に含んでよい。界面活性剤は陽イオン性、陰イオン性、両親媒性、非イオン性のいずれでもよい。好ましい種類は非イオン性界面活性剤であり、特に水溶性のものが好ましい。
[0269] 実施態様によっては、CICと抗原はプラットホーム分子たとえばタンパク質性又は非タンパク質性(たとえば合成)原子価プラットホームへの結合によって近似的に結合させる。好適なプラットホームの例は、CICのスペーサー部分として使用される原子価プラットホームとの関連で前述したとおりである。原子価プラットホームへの抗原の結合は常法で行うことができる。たとえばアミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基などの官能基をもつアミノ酸分子鎖部分を含むポリペプチドでは、それらの官能基がポリペプチドをプラットホームに結合するための部位として役立つ。そうした官能基をまだ含んでいないポリペプチドには、そうした官能基をもつ残基を付加すればよい。そうした残基の組み込みには、いずれも技術上周知のペプチド合成手法である固相合成法又は組換え法を用いればよい。ポリペプチドが糖質側鎖をもつときは(又は抗原が糖質である場合には)、アミノ、スルフヒドリル及び/又はアルデヒド官能基を慣用の化学反応で該ポリペプチドに組み込めばよい。たとえば第一級アミノ基は水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下に酸化糖をエチレンジアミンと反応させて組み込むことができるし、スルフヒドリル基はシステアミン二塩酸塩の反応に次いで標準ジスルヒド還元剤による還元で導入することができるし、またアルデヒド基は過ヨウ素酸酸化で生成させることができる。同様にして、プラットホーム分子についても然るべき官能基をまだもってない場合に、誘導体化により官能基を導入することができる。
[0270] 別の実施態様では、CICと抗原は両者を表面たとえばナノ粒子又はマイクロキャリアーに吸着させて併用投与する。表面へのCIC及び/又は抗原の吸着は非共有相互作用たとえばイオン結合及び/又は疎水性相互作用となろう。細胞への吸着分子の送達を目的とした、表面へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの吸着は技術上周知である。たとえばDouglas et al. (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261; Hagiwara et al. (1987) In Vivo 1:241-252; Bousquet et al. (1990) Pharm. Res. 16:141-147; 及びKossovsky et al.米国特許第5,460,831号明細書を参照。吸着表面を含む材料は生物分解性であるのが好ましい。
[0271] 一般に、ナノ粒子の特性たとえば表面電荷、粒径及び分子量などは重合条件、モノマー濃度、及び重合反応時の安定剤の存在に左右される(前掲Douglas et al., 1987)。キャリアー粒子の表面はたとえば表面被覆などで改質し、CIC及び/又は抗原の吸着を強めるようにしてもよい。CIC及び/又は抗原を吸着させたキャリアー表面を他物質でさらに被覆してもよい。そうした他物質の追加は、本書で述べているように、たとえば個体への投与後の粒子の半減期を延長する、及び/又は特定の細胞型又は組織に粒子を局在させる可能性がある。
[0272] CIC及び抗原を吸着させる対象としてもよいノナ結晶表面についてはすでに開示されている(たとえば米国特許第5,460,831号明細書を参照)。ナノ結晶コア粒子(粒径1μm以下)は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び/又は他薬剤の吸着を促進する表面エネルギー改変層で被覆する。たとえば米国特許第5,460,831号明細書で開示されているように、オリゴヌクレオチドの吸収を促進するような表面でコア粒子を被覆し、次いで抗原調製品たとえば脂質-抗原混合物で被覆する。そうしたナノ粒子は、ナノメートルサイズ(一般的にはおよそ0.1μm)の粒子からなる自己集合性の複合体であり、CICの内層と抗原の外層を備える。
[0273] 他の吸着体表面はシアノアクリル酸アルキルの重合により調製されるナノ粒子である。シアノアクリル酸アルキルは酸性化水性溶媒中で陰イオン重合法により重合することができる。重合条件次第で、小粒子は20〜300nmの粒径範囲になる傾向があり、固有の表面特性と表面電荷をもつナノ粒子の調製が可能である(前掲Douglas et al., 1987)。たとえばオリゴヌクレオチドは、疎水性陽イオンたとえばテトラフェニルホスホニウム塩化物又は第四級アンモニウム塩(臭化アンモニウムセチルトリメチルなど)の存在下にポリシアノアクリル酸-イソブチル及び-イソヘキシルのナノ粒子に吸着させることができる。これらのナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの吸着は核酸分子鎖の負荷電リン酸基と疎水性陽イオンの間でのイオン対の形成が介在する模様である。たとえばLambert et al. (1998) Biochimie 80:969-976; Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11:1370 -1378; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9:441-449を参照。ポリペプチドもまたポリシアノアクリル酸アルキルのナノ粒子に吸着させることができる。たとえばDouglas et al., 1987; Schroeder et al. (1998 Peptides 19:777-780を参照。
[0274] 他の吸着体表面はマロン酸メチリデンの重合により調製されるナノ粒子である。たとえばBousquet et al., 1999に記載されているように、ポリ(マロン酸メチリデン2.1.2)ナノ粒子に吸着させたポリペプチドは、当初は静電力を通じて、次いで疎水力による安定化を通じて、吸着するように見受けられる。
C. 追加のアジュバント
[0275] CICはアジュバントとも併用投与することができる。抗原+CICをアジュバントと併用投与すると、該抗原に対する免疫反応の相乗作用を招き、従って免疫反応を抗原+CICだけを含む組成物に由来する免疫反応よりも増進する結果となる。アジュバントは技術上周知であり、その非限定的な例は水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン(アルミニウム塩)、リポソーム及び微小球(ポリスチレン、でんぷん、ポリホスファゼン及びポリラクチド及び/又はポリグリコシドなど)である。他の好適なアジュバントの非限定的な例はMF59、Detox（登録商標）(Ribi)、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミールペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製品、モノホスホリル脂質A、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、それにTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875が説明しているような免疫刺激複合体(ISCOM)、並びに脂質系アジュバントや本書で開示している他アジュバントなどである。動物用及び動物体内での抗体産生用には、フロインド(完全及び不完全)アジュバントのマイトジェン成分が使用可能である。
IV. 発明の方法
[0276] 本発明は、個体好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間の免疫反応を調節する方法であって、該個体に本発明のCICを投与するステップを含む方法を提供する。
[0277] 多数の個体が本発明のCICの受容に適する。個体は人間であるのが好ましいが、そうである必要はない。
[0278] 実施態様によっては、個体はTh2型免疫反応に関連する疾患たとえば(非限定的な例として)アレルギー、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性食道炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症などの患者である。CICの投与は免疫調節をもたらし、1以上のTh1型反応関連サイトカインのレベルを高めるが、それは結果的にアレルゲンに対する個体の反応に関連するTh2型反応機能を低下させる可能性がある。Th2型反応関連疾患をもつ個体の免疫調節は該疾患の1以上の症状を軽減又は改善する結果となる。疾患がアレルギー又はアレルギー性喘息である場合には、1以上の症状の改善には次のうち1以上の軽減が含まれる: 鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgE循環レベル、ヒスタミン循環レベル及び/又は「救急」吸入療法(計量式吸入器又はネブライザーによる吸入アルブテロール剤の投与)の必要性。
[0279] さらなる実施態様では、本発明の免疫調節療法が適用される個体はワクチン接種を受ける個体である。ワクチンは予防ワクチンでも治療ワクチンでもよい。予防ワクチンは、個体が危険にさらされている疾患に関連する1以上のエピトープ(たとえば結核予防ワクチンとしてのM. tuberculosis抗原)を含む。治療ワクチンは個体がかかっている特定疾患に関連する1以上のエピトープ[たとえば結核患者ではM. tuberculosis又はM. bovis表面抗原、アレルギー患者ではその患者にとってのアレルギー抗原(すなわち脱感作療法)、がん患者に由来する腫瘍細胞(米国特許第5,484,596号明細書で開示されているものなど)、又はがん患者の腫瘍関連抗原]を含む。CICはワクチンと共に(たとえば同じ注射で、又は同時個別注射で)投与してもよいし、切り離して(たとえばワクチン投与の少なくとも12時間前又は後に)投与してもよい。実施態様によっては、ワクチン抗原は共有又は非共有結合によりCICと一体化している。ワクチン投与を受ける個体にCIC療法を実施すると、該ワクチンに対する免疫反応はCICI不含ワクチンの投与を受ける個体と比較してTh1型反応の側にシフトする結果となる。Th1型反応の側へのシフトはワクチンに含まれる抗原に対する遅延型過敏(DTH)反応、INF-γ及び他のTh1型反応関連サイトカインの増加、ワクチン抗原に対して特異的なCTLの産生、ワクチン抗原に対して特異的なIgEレベルの低さ又は低下、ワクチン抗原に対して特異的なTh2関連抗体の減少、及び/又はワクチン抗原に対して特異的なTh1関連抗体の増加などから判定されよう。治療ワクチンの場合には、CICとワクチンの投与は該ワクチンの適用疾患の1以上の症状の改善も招く。当業者には自明であろうが、正確な症状や改善様式は適用疾患によって左右されよう。たとえば治療ワクチンが結核用である場合には、ワクチン併用CIC治療により咳、胸膜・胸壁痛、発熱、及び/又は技術上周知の他症状が緩和される結果となる。ワクチンがアレルギー脱感作療法に使用されるアレルゲンである場合には、治療によりアレルギー症状が緩和する(たとえば鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgE循環レベル及び/又はヒスタミン循環レベルが緩和・低下する)結果となる。
[0280] 本発明の他の実施例はがん又は感染症などの現病をもつ個体の免疫調節療法に関連する。がんは免疫調節のターゲットとして興味をそそる。というのは、ほとんどのがんは体内の他細胞には見られないがん関連及び/又はがん特異抗原を発現するからである。がん細胞に対するTh1型反応の刺激は免疫系によるがん細胞の直接及び/又はバイスタンダー殺傷という結果を招き、がん細胞の減少や症状の緩和につながる。がん患者へのCIC投与はがん細胞に対するTh1型免疫反応の刺激という結果を招く。そうした免疫反応は細胞性免疫系細胞(たとえばCTL)又は体液性免疫系成分の直接作用により、又はマクロファージやナチュラルキラー(NK)細胞などの免疫系の標的となる細胞の近接細胞に対するバイスタンダー効果により、がん細胞を殺傷する可能性がある。たとえばCho et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:509-514を参照。現病の治療では、ICIを他の免疫治療薬たとえばサイトカイン、アジュバント及び抗体などと共に投与してもよい。たとえばCICは、がん細胞が発現する抗原に結び付く結合性物質の投与を含む投薬計画の一環として投与してもよい。結合性物質の例はポリクローナル及びモノクローナル抗体である。ターゲット抗原の例はCD20、CD22、HER2及び技術上周知の、又は将来発見されることになる他の抗原などである。理論に縛られるつもりはないが、CICは結合性物質の結合相手であるがん細胞の殺傷を(たとえば抗体依存の細胞性細胞傷害性及び/又はエフェクター機能の増進により)増進すると考えられる。結合性物質は随意に、たとえばその結合相手である細胞に傷害を与える放射性同位体又は毒素で標識してもよい。CICは該物質と共に(たとえば同時に)、又は該物質の前又は後(たとえば該物質の投与前又は投与後24時間以内) に投与してもよい。たとえばがんの場合には、CICはがん治療に有用であると判明している又は推測される化学療法薬と共に投与することができる。別の例として、CIC投与は放射線治療、遺伝子治療などと併用することができる。CICは本書で開示している任意のものでよい。
[0281] 本発明の免疫調節療法は、感染症特に体液性免疫反応に対して抵抗性である感染症(たとえばマイコバクテリア感染症及び細胞内病原体に起因する疾患)を患う個体にも有用である。免疫調節療法は細胞性病原体(細菌又は原生生物など)又は亜細胞性病原体(ウイルスなど)に起因する感染症の治療に用いてもよい。CIC療法はマイコバクテリア感染症たとえば結核(M. tuberculosis及び/又はM. Bovis感染症など)、ハンセン病(すなわちM. leprae感染症)又はM. marinum又はM. ulcerans感染症などを患う個体に施してもよい。CIC療法はウイルス感染症たとえばインフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス特に単純ヘルペスウイルス、及びパピロマウイルスなどの感染症の治療にも有用である。細胞内寄生虫に起因する疾患たとえばマラリア(Plasmodium vivax、P. ovale、P. falciparum及び/又はP. malariaeなどによる感染症)、リーシュマニア症(Leishmania donovani、L. tropica、L. mexicana、L. braziliensis、L. peruviana、L. infantum、L. chagasi及び/又はL. aethiopicaなどによる感染症)、及びトキソプラズマ症(すなわちToxoplasmosis gondiiによる感染症)もまた、CIC療法が有用である。CIC療法は寄生虫病たとえば住血吸虫症(すなわちSchistosoma属住血吸虫たとえばS. haematobium、S. mansoni、S. japonicum、S. mekongiなどによる感染症)及び肝吸虫症(すなわちClonorchis sinensisによる感染症)の治療にも有用である。感染症を患う個体へのCIC投与は感染症症状の改善を招く。実施態様によっては、感染症はウイルス感染症ではない。
[0282] 本発明はさらに、個体の1以上のTh1関連サイトカインたとえばIL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ、IFN-αなどを増加させ又は刺激する方法を提供する。実施態様によっては、本発明は個体の、特にIFN-γレベルの増加を必要とする個体のIFN-γを増加させ又は刺激する方法であって、IFN-γを増加させるに足る有効量のCICを該個体に投与するステップを含む方法を提供する。IFN-γの増加を必要とする個体とはIFN-γ投与に反応する疾患をもつ個体である。その種の疾患には多数の炎症性疾患たとえば非限定的な例として潰瘍性大腸炎が含まれる。また、その種の疾患には多数の線維症たとえば非限定的な例として突発性肺線維症(IPF)、強皮症、放射線性皮膚線維症、肝線維症(住血吸虫性肝線維症など)、腎線維症、並びにIFN-γ投与により改善する可能性のある他の病状も含まれる。本発明に基づくCIC投与はIFN-γレベルの上昇を招き、またIFN-γに反応する疾患の1以上の症状の改善、1以上の症状の安定化、又は進行の防止(たとえば追加の病変又は症状の減少又は解消)を招く。本発明の方法は、該疾患の治療管理基準を構成する他の療法たとえばIPFの全身性コルチコステロイド(たとえばコルチゾン)療法などのような抗炎症薬の投与と組み合せて実行してもよい。
[0283] 実施態様によっては、本発明は個体の、特にIFN-αレベルの上昇を必要とする個体のIFN-αを増加させ又は刺激する方法であって、IFN-αを増加させるに足る有効量のCICを該個体に投与するステップを含む方法を提供する。IFN-αの増加を必要とする個体とは組換えIFN-αを含むIFN-αの投与に反応する疾患たとえばウイルス感染症及びがんを患う個体である。
[0284] 本発明に基づくCIC投与はINF-αレベルの上昇を招き、またIFN-αに反応する疾患の1以上の症状の改善、1以上の症状の安定化、又は進行の防止(たとえば追加の病変又は症状の減少又は解消)を招く。本発明の方法は、該疾患の治療管理基準を構成する他の療法たとえばウイルス感染症の場合の抗ウイルス薬の投与などと組み合せて実行してもよい。
[0285] 本明細書を検討すれば自明であろうが、CICのスペーサー成分はCIC投与により誘発される免疫反応に影響を及ぼす場合がある。試験したほぼすべてのスペーサーは(ドデシルを例外として)ヒトPBMCによるINF-γ分泌を効率的に誘発することができる。しかし、線状CICのスペーサー成分はINF-α誘発効果がまちまちまであった。たとえばHEG、TEG又はC6スペーサーなどを含むCICはC3、C4又は塩基欠失スペーサーを含むCICよりもPBMCに対するINF-α誘発(及びB細胞増殖)効果が傾向として強い(たとえば実施例34を参照)。
[0286] IgE関連疾患をもつ個体のIgE(特に血清中)レベルを低下させる方法であって、有効量のCICを該個体に投与するステップを含む方法もまた提供される。そうした方法では、CICは単独で投与してもアレルゲンなどの抗原と併用投与してもよい。IgE関連疾患とはIgEレベルの低下によって改善される病状、疾患、又は症状群である。IgEの減少はIgE関連疾患の症状の改善を招く。そうした症状には鼻炎、結膜炎などのアレルギー症状が含まれ、その改善はアレルゲンに対する過敏性の緩和、アレルギーをもつ個体のアレルギー症状の減少、又はアレルギー反応の重篤度の低下などである。
[0287] 本発明の方法は、CICがCIC/MC複合体の形で投与される実施態様を含む。
[0288] 実施態様によっては、本発明は個体のCTL産生を刺激する方法であって、CTLの産生を増加させるに足る有効量のCICを該個体に投与するステップを含む方法を提供する。
[0289] 当業者には自明であろうが、本発明の方法はCIC投与に適した特定の適応症に対する他の療法と組み合せて実行してもよい。CIC療法はたとえば、マラリア患者用の抗マラリア薬たとえばクロロキンの投与と、リーシュマニア患者用の殺リーシュマニア薬たとえばペンタミジン及び/又はアロプリノールの投与と、又はアトピー性(アレルギー)患者用の脱感作療法と併せて実行してもよい。
A. 投与と免疫反応評価
[0290] CICは本書で開示するような医薬及び/又は免疫原物質及び/又は免疫刺激物質と組み合せて投与することができるし、また生理的に許容しうるその担体と組み合せることもできる。
[0291] たとえば本発明のCIC又は組成物は他の免疫治療薬たとえばサイトカイン、アジュバント及び抗体と共に投与することができる。CICはそうした薬剤と共に、たとえば同時に、又は前後に(該物質の投与の前又は後24時間以内に)投与してもよい。
[0292] 諸々の免疫調節組成物の場合と同様に、特定CIC製剤の免疫学的に有効な投与量及び投与方法は個体、治療対象の病状、及び当業者には自明の他因子に応じて変動しうる。検討対象の因子は併用投与抗原の有無、CICとアジュバント又は送達分子との併用投与又は共有結合の是非、投与経路、及び免疫用量の投与回数などである。そうした因子は技術上周知であり、また当業者は過度の実験にまつことなくそうした判断を十分に下すことができる。適切な投与量範囲は抗原に対する免疫反応に所望の調節をもたらすような範囲である。一般に、投与量はCIC総量ではなく患者へのCIC投与量で決める。CIC送達量で示される有用なおおよそのCIC投与量範囲はたとえば次のうちいずれかにしてもよい: 1〜500μg/kg、100〜400μg/kg、200〜300μg/kg、1〜100μg/kg、100〜200μg/kg、300〜400μg/kg、400〜500μg/kg。各患者に対する絶対投与量は薬理学的特性たとえばバイオアベイラビリティー、排泄速度及び投与経路などに左右される。
[0293] 特定CIC製剤の有効な投与量及び投与方法は個別患者、病期及び当業者には自明である他因子に応じて変動しうる。用途に応じた有用な投与経路は当業者には自明である。投与経路の非限定的な例は局所、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、注射、胃腸管、鼻咽腔及び肺(経気管支及び経肺胞を含む)である。適切な投与量範囲は、血中レベルで測定して約1〜10μMの組織濃度を達成するに足る含CIC組成物を供給するような範囲である。各患者に対する絶対投与量は薬理学的特性たとえばバイオアベイラビリティー、排泄速度及び投与経路などに左右される。
[0294] 前述のように、APCと高APC濃度組織はCICのターゲットとして好ましい。従って、APCが比較的高濃度に存在する哺乳動物の皮膚及び/粘膜へのCIC投与が好ましい。
[0295] 本発明は、生理的に許容しうるインプラント、軟膏、クリーム、リンス及びゲルなどを非限定的に含む局所適用に適したCIC製剤を提供する。局所投与は、たとえば送達系を内部に分散させたドレッシング剤又は包帯剤により、切創又は開放創への送達系の直接投与により、又は関心部位を対象にした経皮投与デバイスにより行う。内部にCICを分散させたクリーム、リンス、ゲル又は軟膏は局所用軟膏又は創傷充填薬として好適である。
[0296] 好ましい皮膚投与経路は侵襲性が最も低い経路である。中でも好ましいのは経皮透過、表皮投与及び皮下注射である。中でも好ましいのは皮内組織のAPC濃度がより高くなると期待される表皮投与である。
[0297] 経皮投与は、CICを皮膚に浸透させ血流中に入り込ませることができるクリーム、リンス、ゲルなどの塗布という形をとる。経皮投与に適した組成物の非限定的な例は、皮膚に直接塗布するか又は経皮デバイス(いわゆるパッチ)などの保護担体に含ませるタイプの製薬上許容しうる懸濁液、オイル、クリーム及び軟膏などである。好適なクリーム、軟膏などの例はたとえばPhysician’s Desk Referenceに求めることができる。
[0298] 経皮透過にはイオントフォレシス法が好適である。イオントフォレシスには、無傷の皮膚を経由して薬剤を数日間以上にわたり連続的に放出する市販のパッチを用いることができる。この方法は医薬組成物の比較的高濃度での制御放出を可能にし、複合薬の注入を可能にし、また吸収促進剤の同時併用を可能にする。
[0299] この方法に使用するパッチの例はLectro Patch商標の商品(General Medical Company, Los Angeles, CA)である。この商品はリザーバー電極を中性pHに電気的に維持するものであり、薬剤の濃度を加減しながら連続的及び/又は周期的に投与するよう適合させることができる。該パッチの製造及び使用はLectro Patch商品に添付されているメーカー説明書に従って行うのがよい。それらの説明書は参照指示により本明細書に組み込まれる。他の密封パッチシステムもまた好適である。
[0300] 経皮透過には低周波超音波送達法も好適である。Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. 低周波超音波(約1MHz)を使用すると、高分子組成物を含めた治療用組成物の一般的な制御放出が可能になる。
[0301] 表皮投与は基本的に、表皮の最外層を機械的又は化学的に刺激して該刺激に対する免疫反応を誘発するものである。特に該刺激は刺激部位にAPCを引き付けるに足ることが望ましい。
[0302] 機械的刺激手段の一例では複数のごく細く短い尖叉を使用するが、それらの尖叉は皮膚を刺激して刺激部位にAPCを引き付け、尖叉端から移ったCICを取り込ませるのに役立つ。たとえばPasteur Merieux (Lyon, France)製のMono-Vacc旧ツベルクリン検査キットは含CIC組成物の導入に好適な装置を含む。
[0303] 該装置(米国の販売元はConnaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA)は一端に注射器内筒を、他端に尖叉円板をそれぞれ備えたプラスチック容器からなる。該尖叉円板は、表皮細胞の最外層をかろうじて引っ掻く程度の長さの、細い複数の尖叉を支持している。Mono-Vaccキットの各尖叉は本来旧ツベルクリンで被覆されるが、本発明ではCIC製剤組成物で被覆される。該装置の使用はキット添付のメーカー説明書に従うのが好ましい。現在アレルギー検査に使用されている類似の装置もまた、この実施態様に使用することができる。
[0304] CICの表皮投与に対する別のアプローチは化学薬品を使用して、表皮の最外層を刺激し、その部位にAPCを引き付けるに足る免疫反応を起こさせるようにするものである。化学薬品の一例は角質分解物質たとえばNoxema Corporationの市販脱毛クリームNairに使用されているサリチル酸などである。このアプローチは粘膜上皮投与にも適用できる。化学的刺激は機械的刺激との併用も可能である(たとえばMono-Vaccタイプの尖叉が化学薬品でも被覆されるならば、両方の刺激が実現しよう)。CICは化学薬品を含む担体に懸濁させても、化学薬品と併用投与してもよい。
[0305] 注射投与経路の非限定的な例は、電気的注入(イオントフォレシス)及び直接的注入たとえば中心静脈への直接的注入、静脈内、筋内、腹腔内、皮内又は皮下注射などである。注射投与に好適なCIC製剤は一般にUSP水又は注射用蒸留水で調製するが、pH緩衝液、塩類、増量剤、防腐剤、及び他の製薬上許容しうる添加物をさらに含んでもよい。注射用CICの調製には製薬上許容しうる滅菌等張液たとえば注射用の生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水を使用してもよい。
[0306] 胃腸管投与経路の非限定的な例は経口や直腸などである。本発明は胃腸管投与に適したCIC製剤たとえば製薬上許容しうる経口用散剤、錠剤又は液剤、及び直腸用座剤などを包含する。当業者には自明であろうが、錠剤又は座剤は増量剤として製薬上許容しうる固形物たとえばでんぷんをさらに含む。
[0307] 鼻咽腔及び肺投与は吸入投与であり、鼻内、経気管支及び経肺胞などの経路を含む。本発明は、エアゾール形成用懸濁液やドライパウダー吸入器用微粉末などを非限定的に含む吸入投与に好適なCIC製剤を包含する。CIC製剤の吸入投与に好適な器具の非限定的な例は霧化器、気化器、ネブライザー、及びドライパウダー吸入器などである。
[0308] 投与経路の選択は、誘発される免疫反応の調節に利用することができる。たとえばIgE力価とCTL活性は、インフルエンザウイルスを筋内又は表皮経路(遺伝子銃)で投与した場合には同じであったが、粘膜接種は主にIgG2aを、また表皮経路は主にIgG1をそれぞれ産生させた。Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. 従って、当業者は本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの異なる投与経路が誘発する若干の差を活用することができる。
[0309] 前述の組成物と投与方法は本発明のCIC製剤の投与方法を説明するものであって、限定するものではない。多様な組成物及びデバイスを製造する方法は当業者には自明であり、本書では立ち入らない。
[0310] CICに対する免疫反応の(定性及び定量)分析には技術上周知の任意の方法を用いることができる。その非限定的な例は抗原特異抗体の産生量の測定(特異抗体+サブクラスの測定を含む)、特定リンパ球群たとえばCD4+T細胞、NK細胞又はCTLの活性化の測定、サイトカインたとえばINF-γ、INF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10又はIL-12の産生量及び/又はヒスタミン放出量の測定などである。特異的抗体反応の測定方法は酵素免疫法(ELISA)などであり、技術上周知である。特異型リンパ球たとえばCD4+T細胞の計数には蛍光活性化法(FACS)などがある。細胞傷害性及びCTLの検定はたとえばRaz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523及びCho et al. (2000)などに記載の要領で行うことができる。サイトカイン濃度はたとえばELISA法で測定することができる。免疫原に対する免疫反応を評価する方法は、これらや他の方法を含めて技術上周知である。たとえばSelected Methods in Cellular Immunology (1989) Mishell and Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co.を参照。
[0311] Th1型反応は、刺激する、すなわち誘発及び/又は増進するのが好ましい。本発明では、Th1型免疫反応の刺激は、CICで処理した細胞からのサイトカイン産生量をCIC処理しない対照細胞と比較測定することにより、in vitro又はex vivoで判定することができる。細胞のサイトカイン産生を判定する方法には本書で開示する方法や技術上周知の任意の方法などがある。CIC処理に反応して産生されるサイトカインの型は該細胞による免疫反応がTh1-型偏向かTh2型偏向かを指示する。本書では、用語「Th1型偏向」サイトカイン産生は、刺激物質の存在下でTh1型免疫反応に関連するサイトカイン産生の、刺激物質の不存在下でのそうしたサイトカイン産生と比較した場合の測定可能な増加をいう。Th1型偏向サイトカインの非限定的な例はIL-2、IL-12、IFN-γ及びINF-αである。反対に「Th2型偏向サイトカイン」はTh2型免疫反応に関連するサイトカインをいい、その非限定的な例はIL-4、IL-5及びIL-13である。CIC活性の判定に有用な細胞は免疫系細胞、宿主及び/又は細胞株から単離した初代細胞、好ましくはAPC及びリンパ球、さらに好ましくはマクロファージ及びT細胞などである。
[0312] CIC処理した宿主におけるTh1型免疫反応の刺激は、次のものを非限定的に含む技術上周知の任意の方法で判定することができる: (1)実測IL-4又はIL-5レベルの抗原暴露前後での低下; 又はCIC処理宿主における、抗原-初回免疫した又は初回免疫+暴露した無CIC処理対照と比較した場合のIL-4又はIL-5レベル低下(場合によっては0)の検出; (2)IL-12、IL-18及び/又はIFN(α、β、γ)レベルの抗原暴露前後での上昇; 又はCIC処理宿主における、抗原-初回免疫した又は初回免疫+暴露した無CIC処理対照と比較した場合のIL-12、IL-18及び/又はIFN(α、β、γ)レベル上昇の検出; (3) CIC処理宿主における無CIC処理対照と比較した場合の「Th1型偏向」抗体産生; 及び/又は(4) 抗原暴露前後での抗原特異的IgE実測レベルの低下; 又はCIC処理宿主における、抗原-初回免疫した又は初回免疫+暴露した無CIC処理対照と比較した場合の抗原特異的IgEレベル低下(場合によっては0)の検出。これらの多様な判定は、APC及び/又はリンパ球好ましくはマクロファージ及び/又はT細胞が産生するサイトカインを、in vitro又はex vivoで、本書で開示の(又は技術上周知の任意の)方法を用いて測定することにより下すことができる。
[0313] CIC処理に反応して産生される抗原特異的抗体のクラス及び/又はサブクラスは、細胞による免疫反応がTh1型偏向かTh2型偏向かを指示する。本書では、用語「Th1型偏向」抗体産生はTh1型免疫反応に関連する抗体(すなわちTh1関連抗体)産生の測定可能な増加をいう。1以上のTh1関連抗体を測定してよい。Th1型偏向抗体の非限定的な例はヒトIgG1及び/又はIgG3 [たとえばWidhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581及びde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164を参照]、それにマウスIgG2aである。反対に「Th2型偏向抗体」はTh2型免疫反応に関連する抗体をいい、その非限定的な例はヒトIgG2、IgG4及び/又はIgE [たとえばWidhe et al. (1998)及びde Martino et al. (1999)を参照]、それにマウスIgG1及び/又はIgEである。
[0314] CIC投与により誘発されるTh1型偏向サイトカイン産生は細胞性の免疫反応、たとえばNK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Th1ヘルパー細胞及び記憶細胞による免疫反応を増進する。これらの反応はウイルス、真菌、寄生性原虫、細菌、アレルギー性疾患及び喘息、それに腫瘍に対する予防又は治療ワクチン接種への使用に特に有益である。
[0315] 実施態様によっては、Th2反応を抑制する。Th2反応の抑制は、たとえばTh2関連サイトカインたとえばIL-4及びIL-5レベルの低下、並びにIgEの減少やアレルゲンへの反応によるヒスタミン放出の減少などによって判定してもよい。
V. 本発明のキット
[0316] 本発明はキットを提供する。実施態様によっては、本発明のキットは1以上のCIC入り容器を含む。該キットは、所期の処置(たとえば免疫調節、感染症の症状改善、INF-γレベル上昇、INF-αレベル上昇、又はIgE関連疾患の改善)に対応するCICの用法に関する適当な説明(一般に説明書)セットをさらに含んでもよい。
[0317] 該キットは任意好適な包装容器にパッケージしたCICを含んでもよい。たとえばCICが乾燥製剤(フリーズドライ製剤又はドライパウダーなど)であれば、弾性栓付きバイアルを通常は使用し、弾性栓を貫通して液体を注入するだけでCICを懸濁させるようにする。CIC液体製剤には、除去可能な非弾性隔壁(たとえばシールガラス)又は弾性栓を備えたアンプルを使用するのが最も好都合である。特定の器具たとえば吸入器、鼻腔内投与器具(霧化器など)又は輸液用器具(ミニポンプなど)との併用パッケージも見込まれる。
[0318] CICの用法に関する説明は一般に所期の処置に対応する用量、投薬スケジュール及び投与経路に関する情報が盛り込まれる。CIC容器は単回用、バルクパッケージ(たとえば頻回用)又は分数回用でもよい。本発明のキットに含める説明は一般にラベル又は添付紙片(たとえばキットに同梱される紙片)上の書面であるが、機械可読式説明(たとえば磁気又は光記憶媒体に収めた説明)でもよい。
[0319] 実施態様によっては、キットは1以上の抗原をさらに含むが、該抗原はCICと同じ容器(製剤)に収めても収めなくてもよい。抗原については本書ですでに開示している。
[0320] 実施態様によっては、本発明のキットはCICをCIC/マイクロキャリアー(CIC/MC)複合体の形で含み、また所期の処置(たとえば免疫調節、感染症の症状改善、INF-γレベル上昇、INF-αレベル上昇、又はIgE関連疾患の改善)へのCIC/MCの用法に関する適当な説明(一般に説明書)セットをさらに含んでもよい。
[0321] 実施態様によっては、本発明のキットはCIC/MC複合体の調製用原料を、一般にCICとMCを別々の容器に収めて含むが、ただし実施態様次第でMCではなくMC調製用原料を供給する。CICとMCは、供給状態のCICとMCを混合するだけでCIC/MC複合体が形成されるような形態で供給するのが好ましい。この形態が好ましいのは、CIC/MC複合体が非共有結合により形成される場合である。この形態はまた、CICとMCがヘテロ二官能性架橋剤を介して架橋結合する場合にも好ましいが、その場合にはCIC、MCのいずれかを「活性化された」形で(たとえばヘテロ二官能性架橋剤に結合させて、CICに対して反応性である部分が用意されるように)供給する。
[0322] 液相MCを含むCIC/MC複合体用キットは、液相MC調製用の原料を入れた1以上の容器を含むのが好ましい。たとえば水中油型エマルジョンMC用のCIC/MCキットは油相と水相を入れた1以上の容器を含んでもよい。該容器の内容物を乳化してMCとし、後はCICと、好ましくは疎水性部分を組み込めるよう予め修飾しておいたCICと混合すればよい。そうした原料の例は水中油型エマルジョン調製用の油と水であり、又は容器入りの凍結乾燥リポソーム成分(たとえばリン脂質、コレステロール、界面活性剤の混合物)、それに1以上の容器入りの水相(たとえば製薬上許容しうる水性緩衝液)である。
VI. 実施例
[0323] 以下の実施例は本発明の限定ではなく説明が目的である。
実施例1: ポリヌクレオチドとキメラ化合物の構造
[0324] Table 2は以下の実施例で参照するポリヌクレオチドとキメラ分子の構造を示す。HEGはヘキサ(エチレングリコール)スペーサー部分であり、TEGはトリエチレングリコールであり、C3はプロピル・スペーサー部分であり、C4はブチル・スペーサーであり、C6はヘキシル・スペーサーであり、C12はドデシル・スペーサーであり、HMEは2-ヒドロキシメチルエチルであり、abasic又はabは1’,2’-ジデオキシリボースである。他のスペーサーについては本明細書及び図面で開示している。
[0325] Table 2又は個別実施例で特に断らない限り、ヌクレオチドの結合及び核酸部分とスペーサー部分の結合はすべてホスホロチオアート=エステル結合である。たとえば複数のHEG又はC3単位をもつ複合(複数基本単位)スペーサー部分を含むCIC(たとえばC-13、C-14、C-15、C-16、C-91、C-92、C-36、C-37、C-38)では、C3又はHEG単位はホスホロチオアート・リンカーで結合される。同様に、表中の分岐CIC(たとえばC-93、C-94、C-95、C-96、C-97、C-98、C-100、C-101、C-103、C-104、C-121、C-122、C-123、C-124、C-125、C-126、C-127、C-129、C-130)はスペーサーの分岐基本単位と線状基本単位の間にホスホロチオアート・リンカーを含む。表中の他の分岐CIC(たとえばC-26、C-99、C-102、C-105、C-137)はコンジュゲート形成により調製しており、実施例で説明するような結合基をもつ。
[0326] Table 2には、CICを分岐スペーサー部分と結合させて分岐CICを創り出すうえで有用な末端結合基[たとえばHS(CH2)6-及びHO(CH2)6SS(CH2)6]をもつCIC(たとえばC-128、C-106〜C-113)も含まれる。たとえば実施例18を参照。これらの結合基はホスホロチオアート結合を介してCICと結び付く。
Figure 2010189400
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実施例2: HEGスペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0327] 下記の構造をもつC-10を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)である。
[0328] C-10: 5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’
[0329] C-10分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling, VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。(当業者には自明であろうが、本書では用語「ヌクレオシド・モノマー」又は「スペーサー部分」はときに、たとえばCICの合成との関連で、前駆体試薬を、すなわち本書で開示するような合成方法を使用して脱保護し他成分に結合させると、CICの核酸部分と非核酸部分とを生じるような前駆体試薬をいう。) HEGスペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとHEGスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. HEGスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. HEGスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0330] 合成サイクルは脱トリチル、カップリング(ホスホロアミダイト・モノマー+1H-テトラゾール)、キャッピング、0.05M 3H-1,2ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)の使用による硫化、及び最終キャッピングの各ステップからなった。集成が完了した時点で、「トリチル基off」化合物を担体の細孔性ガラスビーズ(CPG)から切り離し、塩基を濃アンモニア水により58℃で16時間脱保護した。化合物を分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で精製し、Sep-pak Plusカートリッジ(Waters, Milford, MA)で脱塩し、95%エタノール2.5容を添加した1M塩化ナトリウム水溶液から沈殿させた。化合物をMilli Q水に溶解し、260nmでの吸光度から収量を求めた。最後に、化合物を凍結乾燥させて粉末とした。化合物をキャピラリーゲル電気泳動法、エレクトロスプレー質量分析計、及びRP-HPLCで解析し、組成と純度を確認した。内毒素検定(LALアッセイ、Bio Whittaker)も実施した。結果は内毒素レベルが<5EU/mg-化合物(基本的に無内毒素)であった。
[0331] C-8、C-21、C-22、C-23、C-24、C-32及びM-1並びに他の線状HEG-CICも同様にして合成した。
実施例3: プロピル・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0332] 下記の構造をもつC-11を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したプロピル(C3)である。
[0333] C-11: 5’-TCGTCG-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-3’
[0334] C-11分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-プロピル-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。C3スペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとC3スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. C3スペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. C3スペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0335] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
[0336] C-9及び他の含C3 CICも同様にして合成した。
実施例4: ブチル・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0337] 下記の構造をもつC-17を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したブチル(C4)である。
[0338] C-17: 5’-TCGTCG-3’-C4-5’-ACGTTCG-3’-C4-5’-AGATGAT-3’
[0339] C-17分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ブチル-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(ChemGene, Ashland, MA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。C4スペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとC4スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. C4スペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. C4スペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0340] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例5: トリエチレングリコール・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0341] 下記の構造をもつC-18を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したトリエチレングリコール(TEG)である。
[0342] C-18: 5’-TCGTCG-3’-TEG-5’-ACGTTCG-3’-TEG-5’-AGATGAT-3’
[0343] C-18分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。TEGスペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとTEGスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. TEGスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. TEGスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0344] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例6: ドデシル・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0345] 下記の構造をもつC-19を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したドデシル(C12)である。
[0346] C-19: 5’-TCGTCG-3’-C12-5’-ACGTTCG-3’-C12-5’-AGATGAT-3’
[0347] C-19分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ドデシル-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。C12スペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとC12スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. C12スペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. C12スペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0348] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例7: abasicスペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0349] 下記の構造をもつC-20を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合した1’,2’-ジデオキシリボース(abasic)である。
[0350] C-20: 5’-TCGTCG-3’-abasic-5’-ACGTTCG-3’-abasic-5’-AGATGAT-3’
[0351] C-20分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-1’,2’-ジデオキシリボース-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。abasicスペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとabasicスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. abasicスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. abasicスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0352] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例8: ヘキサエチレングリコール及びトリエチレングリコール・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0353] 下記の構造をもつC-29を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)であり、また3’-末端基は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したトリエチレングリコール(TEG)である。
[0354] C-29: 5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-TEG
[0355] C-29分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。合成に固相担体として使用したトリエチレングリコール-CPGはGlen Research (Sterling, VA)から入手した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。HEGスペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとHEGスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. トリエチレングリコール-固相担体の使用
2. 5’-AGATGAT-3’部分の合成
3. HEGスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. HEGスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0356] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例9: ヘキサエチレングリコール及びトリエチレングリコール・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0357] 下記の構造をもつC-30を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分と5’-末端基は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)であり、また3’-末端基は核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したトリエチレングリコール(TEG)である。
[0358] C-30: HEG-5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-TEG
[0359] C-30分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。合成に固相担体として使用したトリエチレングリコール-CPGはGlen Research (Sterling, VA)から入手した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。HEGスペーサー前駆体は合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとHEGスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. トリエチレングリコール-固相担体の使用
2. 5’-AGATGAT-3’部分の合成
3. HEGスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. HEGスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
7. HEGスペーサーの付加
[0360] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。
実施例10: ヘキサエチレングリコール及びトリエチレングリコール・スペーサーとホスホジエステル結合とをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0361] 下記の構造をもつC-31を合成した。核酸部分はホスホジエステル結合をもつDNAであり、スペーサー部分と5’-末端基は該核酸部分にホスホジエステル結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)であり、また3’-末端基は核酸部分にホスホジエステル結合を介して結合したトリエチレングリコール(TEG)である。
[0362] C-31: HEG-5’-TCGTCG-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-TEG
[0363] C-31分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホジエステルDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。合成に固相担体として使用したトリエチレングリコール-CPGはGlen Research (Sterling, VA)から入手した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。HEGスペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとHEGスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. トリエチレングリコール-固相担体の使用
2. 5’-AGATGAT-3’部分の合成
3. HEGスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. HEGスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
7. HEGスペーサーの付加
[0364] 合成サイクルは脱トリチル、カップリング(ホスホロアミダイト・モノマー+1H-テトラゾール)、キャッピング、酸化及び最終キャッピングの各ステップからなった。集成が完了した時点で、「トリチル基off」化合物を担体のCPGから切り離し、塩基を濃アンモニア水により58℃で16時間脱保護した。化合物を分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で精製し、Sep-pak Plusカートリッジ(Waters, Milford, MA)で脱塩し、95%エタノール2.5容を添加した1M塩化ナトリウム水溶液から沈殿させた。化合物をMilli Q水に溶解し、260nmでの吸光度から収量を求めた。最後に化合物を凍結乾燥させて粉末とした。化合物をキャピラリーゲル電気泳動法、エレクトロスプレー質量分析計、及びRP-HPLCで解析し、組成と純度を確認した。内毒素検定(LALアッセイ、Bio Whittaker)も実施した。結果は内毒素レベルが<5EU/mg-化合物であった。
実施例11: 2-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサーをもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0365] 下記の構造をもつC-25を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合した2-(ヒドロキシメチル)エチル(HME)である。
[0366] C-25: 5’-TCGTCG-3’-HME-5’-ACGTTCG-3’-HME-5’-AGATGAT-3’
[0367] C-25分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体1-O-(4,4’-O-ジメトキシトリチル)-3-O-レブリニル-グリセロール-2-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(ChemGenes, Ashland, MA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。HMEスペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとHMEスペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. HMEスペーサーの付加
4. 5’-ACGTTCG-3’部分の合成
5. HMEスペーサーの付加
6. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0368] 合成、脱保護、ワークアップ、及び解析を実施例2に記載の要領で行った。レブリニル基はアンモニア処理時に除去する。
実施例12: 負荷電スペーサー部分をもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0369] 下記の構造をもつC-13を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したプロピル(C3)である。
[0370] C-13: 5’-TCGTCG-3’-(C3)15-5’-T-3’
[0371] C-13分子はPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-プロピル-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.1Mとした。C3スペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとC3スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 15×C3スペーサーの付加
3. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
[0372] 合成サイクルは脱トリチル、カップリング(ホスホロアミダイト・モノマー+1H-テトラゾール)、キャッピング、9:1アセトニトリル:ピリミジンに溶解した0.02M 3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(ADTT)の使用による硫化、及び最終キャッピングの各ステップからなった。集成が完了した時点で、「トリチル基on」化合物を担体のCPGから切り離し、塩基を濃アンモニア水により58℃で16時間脱保護した。化合物をHPLC (Hamilton PRR-1カラムと逓増グラジエントのアセトニトリル/0.1M酢酸トリエチルアンモニウムを使用)で精製した。精製化合物を濃縮乾固し、4,4’-ジメトキシトリチル基を80%酢酸水溶液により除去し、次いで95%エタノール2.5容を添加した1M塩化ナトリウム水溶液から化合物を2回沈殿させた。化合物をMilli Q水に溶解し、260nmでの吸光度から収量を求めた。最後に化合物を凍結乾燥させて粉末とした。
[0373] 化合物をキャピラリーゲル電気泳動法、エレクトロスプレー質量分析計、及びRP-HPLCで解析し、組成と純度を確認した。内毒素検定(LALアッセイ、Bio Whittaker)も実施した。結果は内毒素レベルが<5EU/mg-化合物であった。
[0374] C-14、C-15及びC-16を同様にして合成した。
実施例13: 負荷電スペーサー部分をもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0375] 下記の構造をもつC-38を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)である。
[0376] C-38: 5’-TCGTCGA-3’-(HEG)4-5’-TCGTCGA-3’
[0377] C-38分子は実施例2に記載の要領で合成した。スペーサー部分前駆体は4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)である。合成は次のステップからなる手順で行った:
1. 3’端A固相担体の使用
2. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
3. 4×HEGスペーサーの付加
4. 5’-TCGTCGA-3’部分の合成
[0378] 化合物は実施例2の要領でHPLCを用いて精製した。化合物の解析と内毒素検定も実施例2の要領で行った。
実施例14: 3’-末端を介して両核酸部分を結合させた負荷電スペーサー部分をもつ線状構造キメラ化合物の合成
[0379] 下記の構造をもつC-37を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分はホスホロチオアート結合を介して結合したヘキサエチレングリコール(HEG)である。
[0380] C-37: 5’-TCGTCGA-3’-(HEG)-3’-AGCTCGT-5’
[0381] C-37分子は実施例2に記載の要領で合成した。ただし、第1核酸部分の合成には5’端担体結合ヌクレオシドと3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を使用した。スペーサー部分前駆体は4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)である。合成は次のステップからなる手順で行った:
1. 5’端T固相担体の使用
2. 3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイトによる3’-AGCTGC-5’部分の合成(5’→3’合成)
3. 4×HEGスペーサーの付加
4. 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-3’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイトによる5’-TCGTCGA-3’部分の合成(3’→5’合成)
[0382] 化合物は実施例12の要領でHPLCを用いて精製した。化合物の解析と内毒素検定は実施例2の要領で行った。
実施例15: 分岐構造キメラ化合物の合成
[0383] 下記の構造をもつC-27を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したグリセロールである。
[0384] C-27: (5’-TCGTCGA-3’)2-グリセロール-5’-AACGTTC-3’
[0385] C-27分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体1-3-ジ-(4,4’-O-ジメトキシトリチル)-グリセロール-2-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(対称分岐ホスホロアミダイト; ChemGenes, Ashland, MA; 図2参照)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。グリセロール・スペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとグリセロール・スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端C固相担体の使用
2. 5’-AACGTT-3’部分の合成
3. グリセロール系対称分岐ホスホロアミダイトの付加
4. 2×5’-TCGTCGA-3’の同時合成
[0386] この分岐化合物は実施例2に記載の要領で合成したが、ただし合成サイクルのステップ4では2本の核酸分子鎖を同時に合成するため、各試薬の送給量を2倍にした。図2に示す対称分岐ホスホロアミダイトでは該ホスホロアミダイトの付加後に合成される両核酸配列は同じでなければならないが、その付加前に合成される核酸配列は該両核酸配列と同じでも異なってもよい。
[0387] 分岐化合物は実施例2に記載の要領で精製、解析した。
[0388] 同様にしてC-28を合成した。
実施例16: 3’末端を介してすべての核酸部分を結合した分岐構造キメラ化合物の合成
[0389] 下記の構造をもつC-95を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したグリセロールとHEGである。
[0390] C-95: (5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-グリセロール-HEG-3’-AGCTGCT-5’
[0391] C-95分子は実施例2に記載の要領で合成した。ただし、第1核酸部分の合成には5’端担体結合ヌクレオシドと3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を使用した。分岐スペーサー部分前駆体は1,3-ジ-(4,4’-O-ジメトキシトリチル) -グリセロール-2-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(対称分岐ホスホロアミダイト; ChemGenes, Ashland, MA; 図2参照)である。合成は次のステップからなる手順で行った:
1. 5’端T固相担体の使用
2. 3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイトによる3’-AGCTGC-5’部分の合成(5’→3’合成)
3. HEGスペーサーの付加
4. グリセロール系対称分岐ホスホロアミダイトの付加
5. 2×HEGスペーサーの同時付加
6. 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-3’-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイトによる2×5’-TCGTCGA-3’部分の合成(3’→5’合成)
[0392] この分岐化合物は実施例2に記載の要領で合成したが、ただし合成サイクルのステップ5及び6では2本の核酸分子鎖を同時に合成するため、各試薬の送給量を2倍にした。図2に示す対称分岐ホスホロアミダイトでは該ホスホロアミダイトの付加後に合成される両核酸配列は同じでなければならないが、その付加前に合成される核酸配列は該両核酸配列と同じでも異なってもよい。
[0393] 化合物は実施例12の要領でHPLCを用いて精製した。化合物の解析と内毒素検定は実施例2の要領で行った。
実施例17: 3つの異なる核酸部分を含む分岐構造キメラ化合物の合成
[0394] 下記の構造をもつC-35を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したグリセロールである。
Figure 2010189400
[0395] C-35分子は実施例2に記載の要領で合成する。ヌクレオシド・モノマー及びスペーサー部分前駆体1-(4,4’-O-ジメトキシトリチル)-O-レブリニル-グリセロール-2-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(非対称分岐ホスホロアミダイト; ChemGenes, Ashland, MA; 図2参照)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとする。グリセロール・スペーサーは合成機の補助モノマー部にセットする。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとグリセロール・スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムする。
1. 3’端T固相担体の使用
2. 5’-AGATGA-3’部分の合成
3. グリセロール系非対称分岐ホスホロアミダイトの付加
4. ジメトキシトリチル基末端での5’-AACGTTC-3’部分の合成
5. AACGTTC部分の脱トリチルとキャッピング
6. レブリニル保護基の除去
7. 5’-TCGTCGA-3’部分の合成
[0396] 合成は実施例2に記載の要領で行うが、ただしステップ4の後で5’-AACGTTC-3’部分を無水酢酸/N-メチルイミダゾールで脱トリチル及びキャッピングし、該核酸部分を成端させる。次いで、レブリニル保護基の除去を0.5Mヒドラジン水和物/3:2ピリミジン:酢酸(pH 5.1)で5分間行う。化合物を結合させたままの固相担体を無水アセトニトリルで十分に洗い、5’-TCGTCGA-3’部分を実施例2の要領で付加する。
[0397] この分岐化合物は実施例2の要領で精製、解析する。
実施例18: コンジュゲート形成による分岐構造キメラ化合物の合成
[0398] 図3の手順でC-36を合成する。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分はStarburst（登録商標）デンドリマーをベースにしている。核酸部分は5’-C6-ジスルフィド・スペーサー(チオール修飾剤C6 S-S; Glen Research, Sterling, VA; 商品番号10-1926-xx)を用いて合成するが、これは還元され、デンドリマー上のマレイミド基に対して反応性であるチオール基となる。
5’-C6-ジスルフィド-TCGTCGA (4)の合成:
[0399] 5’-C6-ジスルフィド-TCGTCGAはPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成する。ヌクレオシド・モノマーとチオール修飾剤C6 S-S (Glen Research, Sterling, VA)を無水アセトニトリルに溶解し最終濃度を0.1Mとする。チオール修飾剤は合成機の補助モノマー部にセットする。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとチオール修飾剤が所望の順序で付加されるように合成機をプログラムする。
1. 3’端A固相担体の使用
2. 5’-TCGTCG-3’部分の合成
3. チオール修飾剤前駆体(S-トリチル-6-メルカプトヘキシル)-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイトの付加
[0400] 合成サイクルは脱トリチル、カップリング(ホスホロアミダイト・モノマー+1H-テトラゾール)、キャッピング、9:1アセトニトリル:ピリミジンに溶解した0.02M 3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(ADTT)の使用による硫化、及び最終キャッピングの各ステップからなる。集成が完了した時点で、「トリチル基on」化合物を担体のCPGから切り離し、塩基を濃アンモニア水により58℃で16時間脱保護する。化合物をHPLC (Hamilton PRR-1カラムと逓増グラジエントのアセトニトリル/0.1M酢酸トリエチルアンモニウムを使用)で精製する。化合物を濃縮乾固し、4,4’-ジメトキシトリチル基を80%酢酸水溶液により除去し、次いで95%エタノール2.5容を添加した1M塩化ナトリウム水溶液から化合物を2回沈殿させる。化合物をMilli Q水に溶解し、260nmでの吸光度から収量を求める。最後に化合物を凍結乾燥させて粉末とする。
[0401] 化合物をキャピラリーゲル電気泳動法、エレクトロスプレー質量分析計、及びRP-HPLCで解析し、組成と純度を確認する。内毒素検定(LALアッセイ、Bio Whittaker)も実施する。結果は内毒素レベルが<5EU/mg-化合物であった。
5’-チオール-C6-TCGTCGA (5)の合成:
[0402] ジスルフィド修飾核酸(4)をトリス(2-カルボキシエチルホスフィン)塩酸塩(TCEP; Pierce, Rockford, IL)で還元してチオールとする。該核酸を緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム/0.15M塩化ナトリウム/pH 7.5)に溶解し、濃度を20mg/mlとする。別のバイアルでTCEPを0.1Mリン酸ナトリウム/0.15M塩化ナトリウム/pH 7.5に溶解し、濃度を0.17Mとする。5当量のTCEPを核酸溶液に加え、穏やかにかき混ぜる。この溶液を40℃で120分間インキュベートし、次いでサイズ排除クロマトグラフィー(Pharmacia P2カラム)で精製し、5’-チオール-C6-TCGTCGA (5)を得る。
マレイミド修飾Starburstデンドリマー(7)の合成:
[0403] Aldrich(Milwaukee, WI)から多様な数(4、8、16、32、64など)のアミンをもつStarburst（登録商標）デンドリマーが市販されている。4個のアミノ基をもつStarburstデンドリマー(6)をジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、濃度を0.2Mとする。次いでトリエチルアミン(10当量)と4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル(Sulfo-SMCC; Pierce,Rockford, IL) (8当量)を加え、溶液を2時間、又は薄層クロマトグラフィー(TLC; 10%メタノール/ジクロロメタン)で反応完了が確認されるまで、撹拌する。水を加えて反応液を30分間クエンチし、次いでDMFを減圧留去する。残渣をジクロロメタンに溶解し、2回、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液と水で順次洗う。MgSO4を用いて有機相を乾燥させ、ろ過し、減圧下に濃縮乾固する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、(7)とする。
Starburstデンドリマー-(5’-TCGTCGA-3’)4 (8)の合成:
[0404] マレイミド修飾Starburstデンドリマー(7)をDMSOに溶解(5mg/ml)し、次いで0.1Mリン酸ナトリウム/0.15M塩化ナトリウム/pH 7.5に溶解し濃度を10mg/mlとした精製5’-チオール-C6-TCGTCGA (5) (10当量)を滴下する。得られた混合物を40℃で一晩撹拌させる。形成されたコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィー(Sephadex G-25)で精製し、化合物(8)とする。
実施例19: 分岐構造キメラ化合物の合成
[0405] 下記の構造をもつC-94を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したグリセロールである。
[0406] C-94: (5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-グリセロール-HEG-5’-TCGTCGA-3’
[0407] C-94分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体[1-3-ジ-(4,4’-O-ジメトキシトリチル)-グリセロール-2-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(対称分岐ホスホロアミダイト; ChemGenes, Ashland, MA; 図2参照)及び4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling, VA; 図2参照)]を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。グリセロール・スペーサーとHEGスペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマー、HEGスペーサー及びグリセロール・スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端A固相担体の使用
2. 5’-TCGTCGA-3’部分の合成
3. 1×HEGスペーサーの付加
4. グリセロール系対称分岐ホスホロアミダイトの付加
5. 2×HEGスペーサーの同時付加
6. 2×5’-TCGTCGA-3’部分の同時合成
[0408] この分岐化合物は実施例2に記載の要領で合成したが、ただし合成サイクルのステップ5及び6では2本の核酸分子鎖を同時に合成するため、各試薬の送給量を2倍にした。図2に示す対称分岐ホスホロアミダイトでは該ホスホロアミダイトの付加後に合成される両核酸配列は同じでなければならないが、その付加前に合成される核酸配列は該両核酸配列と同じでも異なってもよい。
[0409] 分岐化合物は実施例12に記載の要領でHPLCにより精製し、実施例2に記載の要領で解析した。
[0410] 同様にしてC-96及びC-101を合成した。
[0411] C-103及びC-104も同じ方法で合成したが、ただしHEGスペーサーの代りにそれぞれTEGスペーサー又はプロピル・スペーサーを使用した。
実施例20: 分岐構造キメラ化合物の合成
[0412] 下記の構造をもつC-98を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホロチオアート結合を介して結合したグリセロールである。
[0413] C-98: (5’-TCGTCGA-3’-HEG)3-トレブラー-HEG-5’-AACGTTC-3’-HEG-5’-TCGA-3’
[0414] C-98分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体 [トレブラー・ホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling, VA)及び4,4’-O-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレングリコール-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling, VA)]を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。トレブラー・スペーサーとHEGスペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマー、HEGスペーサー及びトレブラー・スペーサーが所望の順序で付加されるように合成機をプログラムした。
1. 3’端A固相担体の使用
2. 5’-TCGA-3’部分の合成
3. 1×HEGスペーサーの付加
4. 5’-AACGTTC-3’部分の合成
5. 1×HEGスペーサーの付加
6. トレブラー・ホスホロアミダイトの付加(図2参照)
7. 3×HEGスペーサーの同時付加
8. 3×5’-TCGTCGA-3’部分の同時合成
[0415] この分岐化合物は実施例2に記載の要領で合成したが、ただし合成サイクルのステップ7及び8では3本の核酸分子鎖を同時に合成するため、各試薬の送給量を3倍にした。図2に示す対称トレブラー・ホスホロアミダイトでは該ホスホロアミダイトの付加後に合成される3核酸配列は同じでなければならないが、その付加前に合成される核酸配列は3核酸配列と同じでも異なってもよい。
[0416] 分岐化合物は実施例12に記載の要領でHPLCにより精製し、実施例2に記載の要領で解析した。
実施例21: ヘキサエチレングリコール・スペーサーと3’-チオール・リンカーとをもつ線状キメラ化合物の合成
[0417] 3’-チオール・リンカーを含むCICをまず合成し、そのジスルフィド誘導体として精製する。次にジスルフィド基を還元して反応性チオール基とする。たとえばC-116を合成するには、C-8を実施例2の要領で、ただしT固相担体の代りに3’-チオール修飾剤C3 S-S CPG (Glen Research, Sterling, VA)を用いて合成した。
[0418] C-116: 5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’-(CH2)3SS(CH2)3OH
[0419] C-116が[C-8]-3’-ジスルフィドとも呼べるのは自明であろう。このCICは実施例12の要領でHPLCにより精製し、また実施例2の要領で解析した。
[0420] トリス(2-カルボキシエチルホスフィン)塩酸塩(TCEP; Pierce, Rockford, IL)を用いてC-116をチオールへと還元した。C-116を100mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/1mM EDTA/pH 7.4緩衝液に溶解し、濃度を30.5mg/ml (0.8ml, 34.4mg; 3.14μmol)とした。別のバイアルで、TCEPを100mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/1mM EDTA/pH 7.4緩衝液に溶解し、濃度を0.167Mとした。このTCEPストック液5当量(100μl, 4.8mg, 17μmol)をCIC溶液に加えた。溶液を穏やかに撹拌し、40℃で120分間インキュベートし、Sephadex G-25カラム(5ml, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)で精製しC-117(13.2mg)を得た。C-117が[C-8]-3’-チオとも呼べるのは自明であろう。このCICは実施例12の要領でHPLCにより精製した。
[0421] 同様にしてC-115をC-114から合成した。
実施例22: プロピル・スペーサーと5’-チオール・リンカーとをもつ線状キメラ化合物の合成
[0422] 5’-チオール・リンカーを含むCICをまず合成し、そのジスルフィド誘導体として精製する。次にジスルフィド基を還元して反応性チオール基とする。下記のC-110が5’-ジスルフィド-C-11とも呼べるのは自明であろう。化合物C-111は5’-チオール-C-11とも呼べる。
[0423] C-110: HO(CH2)6SS(CH2)6-5’-TCGTCG-3’-C3-5’-ACGTTCG-3’-C3-5’-AGATGAT-3’-
[0424] C-110は実施例3に記載の要領で合成したが、ただし最終カップリングの相手はチオール修飾剤C6 S-S (Glen Research, Sterling, VA)であった。このCICは実施例12の要領でHPLCにより精製し、また実施例2の要領で解析した。C-110は実施例22に記載の要領でトリス(2-カルボキシエチルホスフィン)塩酸塩(TCEP; Pierce, Rockford, IL)を用いてチオールへと還元した。
[0425] C-107、C-113及びP-16も同様にして合成した。
実施例23: コンジュゲート形成による分岐構造キメラ化合物の合成
[0426] C-105を図4に示す要領で合成した。トリス(2-マレイミドエチル)アミン(TMEA; Pierce, Rockford, IL)をジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、濃度を4.3mg/mlとした。C-117を100mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/1mM EDTA/pH 7.4緩衝液に溶かした溶液(237μl, 4.0mg, 4.0当量)に前記TMEA溶液(12 μl, 52μg, 1.0当量)を加え、十分に撹拌した。この溶液を室温で一晩放置してから、Superdex 200カラム(24ml; Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)により10mMリン酸ナトリウム/141mM塩化ナトリウム/pH 7.0緩衝液で溶出、精製した。生成物を減圧乾燥し、Milli Q水0.4mlに溶解し、95%エタノール1.0mlで沈殿させた。混合物をマイナス20℃で1時間凍結させてから、遠心機にかけ(14 k rpmで2分間)、上清を注意深く除去した。ペレットをMilli Q水0.35mlに溶解し、C-105の濃度を測定した(0.4mg単離)。化合物を実施例2の要領で解析した。
[0427] C-99を同様にして合成した。
実施例24: コンジュゲート形成による分岐構造キメラ化合物の合成
A. マレイミド-Starburstデンドリマー（登録商標）第2世代の合成
[0428] Aldrich(Milwaukee, WI)から、16個のヒドロキシル基を含むStarburstデンドリマー（登録商標）第2世代を20%メタノール溶液として購入した。該デンドリマー(191μl, 38.2mg, 11.7μmol)を減圧乾燥させ、DMF 200μlに再溶解し、再び減圧乾燥させて、メタノールを完全に除去した。マレイミド-デンドリマーを調製するために別のバイアルでN-(p-マレイミドフェニル)イソシアナート(PMPI, 50mg, 233.5 μmol)をDMF 200μlに溶解し、次いで手早くデンドリマーに加えた。混合物をボルテックスしてデンドリマーを溶解させた。この溶液を室温で一晩回転ミキサーにかけた。溶液を減圧濃縮し、20%メタノール/ジクロロメタン(1ml)に溶解し、7.5gシリカゲルカラム(70〜230メッシュ、60A)で、20%メタノール/ジクロロメタンにより溶出、精製した。マレイミド-デンドリマー生成物は(残留DMFが存在したため)カラムから第1画分に溶出したが、PMPI副生物は含まれていなかった。生成物を濃縮して黄褐色固形物を得た(10mg、収率13%)。
B. Starburstデンドリマー-(5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A)x=3~16(SEQ ID NO:2) (C-102)の合成
[0429] マレイミド-デンドリマー(5.7mg)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し濃度2.5mg/mlのストック液とした。100mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/1mM EDTA/pH 7.4緩衝液(0.7ml)にC-107を溶かした溶液(9.1mg, 1.2μmol)に、マレイミド-デンドリマー・ストック液(100μl, 0.25mg, 0.0375μmol)を加えた。溶液を室温で一晩回転ミキサーにかけ、生成物をSuperdex 200カラム(24ml, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)で、10mMリン酸ナトリウム/141mM塩化ナトリウム/pH 7.0緩衝液により溶出、精製した。生成物が10.4分でボイド容量に溶出した(1.3mg)。この生成物は1.2%アガロースEゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)電気泳動で分析すると、デンドリマー上のポリヌクレオチド添加量の差に由来する高分子量化学種の混合物であることが判明した。C-102は1kb〜15kb超の生成物(二本鎖DNAマーカーに匹敵する有効サイズ)の混合物として振る舞った。
実施例25: プロピル・スペーサーと混合ホスホジエステル/ホスホロチオアート結合とをもつ線状キメラ化合物の合成
[0430] 下記の構造をもつC-84を合成した。核酸部分はホスホロチオアート結合(小文字のsで表記)をもつか又はホスホジエステル結合(それ以外のすべての結合)をもつDNAであり、スペーサー部分は該核酸部分にホスホジエステル結合を介して結合したプロピル(C3)である。
[0431] C-84: 5’-GsGs-3’-C3-5’-TGC-3’-C3-5’-ATCGAT-3’-C3-5’-GCA-3’-C3-5’-GGsGsGsGsG-3’
(ただし小文字のsはホスホロチオアート結合であり、それ以外の結合はホスホジエステル結合である。)
[0432] C-84分子はTriLink BioTechnologies (San Diego, CA)がPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機により、メーカーのホスホロチオアートDNA 1μmolスケール・プロトコールに従って合成した。ホスホロチオアート結合は塩基に対応する大文字を使用してプログラムし、またホスホジエステル結合は塩基及びC3スペーサー・ホスホロアミダイトを含む補助位置に対応する小文字を使用してプログラムした。ヌクレオシド・モノマーとスペーサー部分前駆体4,4’-O-ジメトキシトリチル-プロピル-O-(N,N-ジイソプロピル)2-シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research, Sterling,VA)を無水アセトニトリルに溶解し、最終濃度を0.05Mとした。C3スペーサーは合成機の補助モノマー部にセットした。合成機は、核酸部分の合成が3’→5’方向に進み、ヌクレオチド・モノマーとC3スペーサーが所望の順序で付加されるようにプログラムした。
1. 3’端G固相担体の使用
2. 5’-GGsGsGsGsG-3’部分の合成
3. C3スペーサーの付加
4. 5’-GCA-3’の合成
5. C3スペーサーの付加
6. 5’-ATCGAT-3’の合成
7. C3スペーサーの付加
8. 5’-TGC-3’の合成
9. C3スペーサーの付加
10. 5’-GsGs-3’の合成
[0433] 合成、脱保護、ワークアップ及び解析は実施例2に記載の要領で行った。
[0434] C-85とC-87を同様にして合成した。
実施例26: 7個以下のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成
[0435] 7個以下の塩基を含みかつホスホロチオアート結合を含むポリヌクレオチドをPerseptive Biosystems Expedite 8909自動DNA合成機で合成した。ポリヌクレオチドはRP-HPLC (Polymer Labs PLRP-Sカラム及び逓増グラジエントのアセトニトリル/0.1M酢酸トリエチルアンモニウムを使用)で精製した。精製ポリヌクレオチドは濃縮乾固し、4,4’-ジメトキシトリチル基を80%酢酸水溶液で除去し、次いでイソプロパノール3容を加えた0.6M酢酸ナトリウム水溶液/pH 5.0から2回沈殿させた。ポリヌクレオチドをMilli Q水に溶解し、260nmでの吸光度から収量を求めた。最後にポリヌクレオチドを凍結乾燥させて粉末とした。ポリヌクレオチドは実施例2に記載の要領で解析し、内毒素検定をした。
実施例27: 陽イオン性生物分解性マイクロキャリアーの合成
[0436] 陽イオン性ポリ(乳酸、グリコール酸)マイクロキャリアー(cPLGA)を次の要領で調製した。固有粘度0.41 dl/g (0.1%、クロロホルム、25℃)のポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド) 50:50ポリマー(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 0.875gを塩化メチレン7.875gに溶解して濃度を10%w/wとし、さらにDOTPを0.3g加えた。次いでラボラトリーミキサー(Silverson L4R; Silverson Instruments)による室温、30分間、4000rpmでのホモジナイズ処理で、透明有機相をPVA水溶液(0.35%w/v) 500ml中に乳化した。次いで撹拌槽のジャケットに温水を循環させて系温度を40℃に引き上げた。同時に、撹拌速度を1500rpmに落とし、これらの条件を2時間維持して塩化メチレンを留去した。冷循環水を用いてこのマイクロキャリアー懸濁液を室温まで冷却した。
[0437] マイクロキャリアーを遠心分離し(Beckman Instruments, 8000rpm, 10分間)、穏やかな浴超音波照射により脱イオン水に再懸濁した。遠心洗浄をさらに２回繰り返して粒子表面から過剰PVAを除去した。最終遠心ペレットを約10mlの水に懸濁し、一晩凍結乾燥させた。乾燥させた陽イオン性マイクロキャリアー粉末のサイズと表面電荷を調べると、平均粒径(加重平均、μm)= 1.4、ゼータ電位(mV)=32.4であった。
実施例28: CICによるヒト細胞の免疫調節
[0438] (1)スペーサー部分を含むキメラ分子と(2)ポリヌクレオチドの免疫調節活性を試験で評価した。
[0439] キメラ化合物とポリヌクレオチドの合成は前述の要領で、又は通常のホスホロチオアート法で合成した。ポリヌクレオチドP-6及びP-7はHybridon Specialty Products (Milford, MA)が合成した。免疫調節活性の評価は本書で開示の通常の検定法によった。
[0440] 末梢血を有志ドナーからヘパリン加注射器を使用して静脈穿刺法で採取した。血液をFicoll(登録商標; Amersham Pharmacia Biotech)比重液上に重層し、遠心分離した。次いでPBMCをFicoll境界相から回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗った。PBMCを再懸濁させ、2×106細胞/mlを48穴プレート(実施例29〜32)又は96穴プレート(実施例33〜40)のRPMI 1640培地[熱不活化ヒトAB血清10%、ペニシリン50単位/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、グルタミン300μg/ml、ピルビン酸ナトリウム1mM、及び1×MEM非必須アミノ酸(NEAA)を添加]中、37℃で培養した。
[0441] 細胞は試験試料の不存在下に、試験試料20μg/ml (0.5 OD/ml)の存在下に、又はcPLGA 100μg/mlと予め混合した(cPLGAを使用する場合)試験試料20μg/mlの存在下に、24時間培養した。次に各ウェルから無細胞培地を回収し、INF-γ及びINF-α濃度を調べた。陽性対照にはSAC (Pansorbin CalBiochem、1/5000希釈)を使用した。SACは黄色ブドウ球菌Staph. aureus (cowan)細胞物質である。
[0442] INF-γ及びINF-αの検定には、BioSource International, Inc.のCytoscreen（登録商標）Elisaキットを、メーカーの説明書に従って使用した。
[0443] ヒトPBMC検定ではINF-γのバックグラウンド・レベルがドナーによって、ときに大幅に変動する場合がある。INF-αのバックグラウンド・レベルは一般に、非刺激条件下では低い。
[0444] これらの検定結果の例は以下の実施例29〜40で示す。
[0445] 以下に示す各実験では、“media alone”及び“P-7”は陰性対照である。“P-7”は免疫刺激活性をもたないことが立証済みである。SACと“P-6”は陽性対照である。P-6は著しい免疫刺激活性をもつことが立証済みである。
実施例29: CICの免疫刺激活性
[0446] この実施例では、4種類のCICがINF-γ及びINF-α分泌刺激によって立証されるような著しい免疫調節活性をもつことを示す(Table 3)。P-7は予想どおり、活性をもたなかった。さらにTCGを含む7merであるP-1も活性をもたなかった。興味深いことに、HEGスペーサー及びプロピル・スペーサーをもつCICはINF-α分泌刺激の度合いに差があった。両タイプともINF-α分泌を刺激したが、効果はHEGを含むCICのほうが顕著であった。
Figure 2010189400
実施例30: ポリヌクレオチドの活性
[0447] この実施例ではP-1、P-2、P-3、P-4及びP-5が免疫調節活性をもたなかったことを示す(Table 4)。これらのポリヌクレオチドの核酸部分は、実施例29で免疫調節活性をもつことを示したC-10及びC-11の核酸部分と共通している。
Figure 2010189400
実施例31: ポリヌクレオチド混合物の活性
[0448] この実施例ではポリヌクレオチド混合物(P-1)+(P-3)又は(P-1)+(P-3)+(P-4)+(P-5)が免疫調節活性をもたなかったことを示す(Table 5)。これらのポリヌクレオチドの核酸部分は、確かに免疫調節活性をもっていたC-10及びC-11の核酸部分と共通している。混合物は各ポリヌクレオチドを等量含み、全体としてのポリヌクレオチド濃度は20μg/mlとした。
Figure 2010189400
実施例32: CICの免疫調節活性
[0449] この実施例では実施例29及び31とはドナーを異にする検定でのC-10及びC-11の免疫調節活性を示す(Table 6)。
Figure 2010189400
実施例33: CICの免疫調節活性
[0450] この実施例では実施例29とはドナーを異にする検定でのC-8及びC-9の免疫調節活性を示す(Table 7)。TCGを含む6merであるP-2は活性をもたなかった。
Figure 2010189400
 実施例34: CICの免疫調節活性
[0451] Table 8の検定結果は、本発明の数種のCIC(すなわち種々の短い核酸部分と種々のスペーサー部分とを特徴とするCIC)が免疫刺激活性をもつことを示す。Table 8はまた、混合HEG/核酸構造をもつが5’-C,G-3’配列を欠く化合物M-1(Table 2参照)が活性を示さないことを示している。CIC+cPLGA型製剤はINF-αの誘発を著しく増進した。INF-γレベルが上昇するケースもあった。5桁の数字28xxxは個別ドナーを表わす。
Figure 2010189400
Figure 2010189400
[0452] Table 8から明らかなように、ドナー28065はINF-γ検定で高バックグラウンドを示した。1000で示した値は測定値が検定感度の限界を超えたことを示す。
実施例42: CICによるマウス細胞の免疫調節
[0453] マウス脾細胞でポリヌクレオチド及びキメラ化合物の免疫刺激活性を検定した。免疫刺激は細胞培地へのサイトカイン分泌量の測定によって評価した。培地上清中のサイトカイン・レベルはElisa法で求めた。
[0454] 標準手法を用いて細胞を単離、調製した。8〜20週齢BALB/c系マウスの脾臓を摘出し、脾細胞をACK細胞溶解緩衝液(Bio Whittaker, Inc.)による標準解きほぐし及び処理で抽出した。この実験では4個の脾臓を使用した。抽出した細胞をRPMI-1640培養液[熱不活化ウシ胎仔血清(FCS) 2%、2-メルカプトエタノール50μM、ペニシリン-ストレプトマイシン1%及びL-グルタミン2mMを添加]で洗浄し、10%FCS/RPMI (RPMI-1640培地+熱不活化FCS 10%、2-メルカプトエタノール50μM、ペニシリン-ストレプトマイシン1%及びL-グルタミン2mM)に約7×105-細胞/mlの密度で再懸濁した。
[0455] 96穴フラットマイクロタイタープレートを使用して、10%FCS/RPMI 100μlに約7×105-細胞/ウェルをまいて細胞培養3組を準備し、細胞をまいた後少なくとも1時間静置した。表示の試験化合物を(表示の濃度で)24時間、37℃でインキュベートした。細胞上清を回収し、マイナス80℃で凍結させた。細胞のサイトカイン産生量をElisa法で測定した(Table 9)。
Figure 2010189400
実施例35: 3ヌクレオチド核酸部分を含むCICの活性とcPLGAによる活性の増進
[0456] この実施例では、ヒトPBMCを使用する検定で判明した、cPLGA不存在及び存在下での数種のCICの免疫刺激活性を示す。興味深いことに、C-30のホスホジエステル結合版(C-31)はCIC単独では不活性であったが、CIC+cPLGA型にすると十分な活性をもった。実は一般的な傾向として、ホスホジエステル結合だけを含むCIC (C-31、C-36及びC-93)はCIC単独では不活性なのに、cPLGA型になると著しく活性を強めた。
[0457] C-32(核酸部分がすべて3merであるCIC)は単独でも活性をもち、また+cPLGA型ではさらに活性を強めた。Table 10参照。
Figure 2010189400
Figure 2010189400
実施例36: 5’-TCGを含むCICの免疫刺激活性
[0458] この実施例では種々の核酸部分を含むCICの免疫調節活性を示す(Table 11)。一般に、5’-TCG-3’を含む配列(C-8、C-21、C-50、C-51など)又は5’-NTCG-3’(ただしNは任意のヌクレオチドである)を含む配列(C-46)はCGを含む他CIC (C-24、C-52)よりも高活性であった。また、ほとんどのCICが相当量のINF-γを誘発したが、INF-αについては誘発効果のバラツキが大きかった。これはINF-α誘発ではINF-γ誘発の場合よりもモチーフ条件がもっと厳しいことを示唆する。特に5’-TCGA-3’を含むCIC (C-50、C-51、C-45)は5’-TCGT-3’を含むCIC (C-41、C-42、C-52)よりもINF-α誘発量が多かった。
[0459] INF-α誘発効果が大きいCICは(モチーフ5’-TCGTCGA-3’を含む)C-8及びC-21を除けば、5’位にTCGAを含んでいた。
[0460] 核酸部分が6merだけのCIC (C-22)、5merだけのCIC (C-43)及び4merだけのCIC (C-44)は単独で用いてもINF-γを誘発した。加えて、これらのCICはそれぞれ、また核酸部分が3merだけのC-32も、+cPLGA型にすると大きなINF-γ及びINF-α誘発効果示した。2つの7mer核酸部分を含むCICであるC-39は単独で用いても活性であったが、6mer部分と4mer部分を1つずつ含むCICであるC-40はこの実験では不活性であった。どちらのCICも+cPLGA型にすると著しい活性を示した。
Figure 2010189400
実施例37: CICの免疫刺激活性
[0461] この実験では、追加の線状CIC [ホスホロチオアート(PS)結合とホスホジエステル(PO)結合の両方をもつCICを含む]及び分岐CICに関する免疫調節検定の結果を示す(Table 12及び13)。同じ核酸部分を含む分岐CIC (C-94)と線状CIC (C-21)の比較により分岐CICのINF-α誘発量は線状CICの4倍になると判明した。どちらのCICも+cPLGA型にすると、INF-γ及びINF-α誘発量が著しく増加した。C-94とC-93のホスホジエステル版は+cPLGA型のときだけ活性であった。C-87はINF-α誘発効果が大きかった。
Figure 2010189400
Figure 2010189400
実施例38: CIC中の配列モチーフ位置の効果
[0462] この実施例では、多数のCIC (前の実施例でドナーを異にする検定をすでに行っているものも含まれる)に関する免疫調節検定の結果を説明し、またCIC中の配列モチーフ位置の効果を示す。
[0463] 試験したのは、核酸部分に2つの異なる含CG核酸配列 (TCGTCGA及びACGTTCG)を含むCIC及び含CG配列を含まない核酸部分(AGATGAT)をもつCICなどである。CICは含CG核酸配列のうち、TCGTCGA配列を含むほうがACGTTCGだけを含むよりも高活性である。これら2つCICでは、TCGTCGAをもつCICのほうが高活性である。この実施例で使用したCICの一般構造N1-S1-N2-S2-N3は、CIC中の該モチーフの配置を説明するのに役立つ。最も高活性のモチーフであるTCGTCGAをN1位置に配置すると最も高活性のCIC (C-8、C-56)が得られたが、N2位置に配置しても活性が付与された。たとえばTCGTCGAをN2位置にもつC-57は、TCGTCGAをN3位置にもつC-58よりもやや高活性であった。ACGTTCG配列をN1位置にもつCICはTCGTCGAをもつ類似のCICよりも低活性であったが、AGATGAT配列をN1位置にもつCICよりは高活性であった(C-57及びC-58をC-59及びC-60と比較する)。この実験では、CGモチーフを含むがTCGモチーフは含まない核酸部分をもつC-61は、+cPLGA型にするとINF-γを誘発した。Table 14参照。
Figure 2010189400
[0464] この実験では、2種類の分岐CIC (分岐グリセロール成分と核酸部分の間にHEG部分をもつC-94と核酸部分がグリセロール・スペーサーに直接結合したC-28)の活性も比較した。Table 15参照。興味深いことに、どちらの分岐CICもINF-γ誘発効果は同程度であったが、INF-α誘発効果はHEGスペーサーを含むCICのほうが劇的に高かった。マレイミド活性化トリエチルアミン・スペーサーに5’末端を介して結合させた3つのP-6配列を含む分岐CIC (C-99)は+cPLGA型の場合に限りINF-γを誘発し、INF-αを誘発しなかった。一般に、CICは分岐構造を介して結合させ核酸部分をもち、複数の核酸部分5’末端を未結合又は「遊離」状態でもち、また立体配座面のフレキシビリティーと核酸部分間の距離とをもたらすスペーサーを含むとき、INF-α誘発量が最大となった。
Figure 2010189400
実施例39: 分岐CICの活性
[0465] この実験では、複数の遊離5’末端とHEGスペーサーによってもたらされる立体配座面のフレキシビリティーとをもつ分岐CICは、HEGスペーサーをもつ線状CICよりも(C-94をC-21と、またC-96をC-23と、それぞれ比較)、又は追加の(HEG)スペーサーをもたない分岐CICよりも(C-94をC-28と、またC-96をC-27と、それぞれ比較)、INF-α誘発効果が高かったことを示す。C-96にもう1つのHEGスペーサー及び4mer核酸部分を追加すると、INF-α誘発効果は低下した(C-96をC-97と比較する)。Table 16参照。
[0466] 3mer型の5’-TCG-3’モチーフを含む2種類のCIC (C-91とC-68)の免疫刺激活性を試験した。どちらのCICも単独では不活性であったが、C-91は+cPLGA型にすると著しい活性を示した。
[0467] 親水性ポリアミドを含むStarburstデンドリマーと複数P-6配列とのコンジュゲート(C-102)はP-6を(ストランドあたりP-6ストランドで)等量にしたP-6配列単独の場合よりもINF-α誘発活性がずっと高かった。この結果は、前記とは異なる組成及び合成プロトコールを使用して、NF-α誘発の著しい増強に対する、フレキシブル親水性コア上の含5’-CG-3’核酸部分のマルチマー送達の効用を確認するものとなっている。
Figure 2010189400
実施例40
[0468] この実験では、6mer核酸モチーフ5’-TCGTCG-3’と核酸部分の3’末端に結合させた複数スペーサーとを含む一連のCIC (C-13、C-14、C-15及びC-16)の活性を調べた。Table 17参照。いずれのCICも単独で使用すると不活性であったが、+cPLGA型にすると著しい活性をもった。
Figure 2010189400
実施例41: B細胞増殖検定でのCICの効果
[0469] 2人の健常被験者に由来するヘパリン加血液からヒトPBMCを単離した。一部のPBMCは予備として保存し、残りをCD19+MACSビーズ(Miltenyi Biotec)とインキュベートした。次にこのPBMCをマグネットに通して陽性選別によりCD19+B細胞を分離した。この細胞群はFACS分析では>98%CD+であった。次に96穴丸底プレートを使用してB細胞を1×105/200μl/ウェルの密度で培養した。場合によりPBMCも、ただし2×105/200μl/ウェルの密度で、培養した。培養細胞は3組に分けて2μg/mlのポリヌクレオチド又はCICで刺激した。培養は37℃で48時間行った。培養期間の終わりに、3H-チミジン1μCi/ウェルをプレートに添加し、さらに8時間インキュベートした。次いでプレートを標準液体シンチレーション法で測定し、データを計数毎分(cpm)単位で収集した。
[0470] 実験A: 実験Aの結果によれば(Table 18)、ポリヌクレオチド(P-6)と含5’-C,G-3’モチーフCIC (C-8、C-9、C-21、C-28)はB細胞を増殖させる。対照化合物のP-7とM-1、それに7merポリヌクレオチドのP-1はB細胞増殖効果がほとんど又はまったくなかった。分岐CICのC-28及びプロピル・スペーサーを含むCICのC-9はHEGスペーサーを含むCICのC-8及びC-21よりもB細胞増殖効果が大きかった。PBMCの増殖もB細胞の増殖と同様であった。
Figure 2010189400
[0471] 実験B: 実験BではB細胞の増殖に対するスペーサー組成及びCIC構造(線状対分岐)の効果を評価した(Table 19)。プロピル、ブチル、塩基欠失及びヒドロキシメチルエチルの各スペーサーを含む線状CICは、HEGスペーサーか又はTEGスペーサーを含む対応するCICよりもB細胞増殖を誘発する効果が傾向として大きかった(C-10、C-11、C-17、C-18、C-20、C-25を比較)。ドデシル・スペーサーはCICを不活性にした(C-19)。特に、B細胞増殖データは前記のサイトカイン・データを必ずしも反映せず、B細胞増殖とINF-α誘発の間には格別の違いが見られた。
Figure 2010189400
実施例43: CIC鼻腔内投与後のマウス肺での免疫関連遺伝子の誘導
[0472] C-9、C-23及びP-6(陽性対照)について、遺伝子75種のmRNAの発現に対する誘導能をマウス肺で調べた。対象遺伝子はサイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、転写因子、メタロプロテアーゼなどの分子をコードする遺伝子などである。この実験はNorthview Pacific Laboratories (Hercules, CA)で、Jackson Labs (Bar Harbor, ME)から提供された6〜8週齢BALB/c系雌性マウスを使用して行った。各群5頭のマウスを軽イソフロリン麻酔下にC-9、C-23、P-6(陽性対照)又はP-7(陰性対照) 20μg/50μL-生理食塩水の鼻腔内投与で処置した。過去の実験から、ほとんどの遺伝子の誘導は処置後6時間でピークに達することが判明していた。そこで、処置の6時間後に肺を摘出し、液体窒素で瞬間凍結し、マイナス80℃で保存し用時に備えた。RNeasyミニキット(Qiagen Inc., Valencia, CA)を使用して全RNAを抽出した。このRNA試料をDNAse (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)で処理し、SuperscriptIIRnase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen, Rockville, MD)を使用してScheerens et al., 2001, Eur. J. of Immunology 31:1465-74に記載の要領でcDNAへと変換した。このcDNA試料を群毎にプールし、プルーした各試料についてリアルタイム定量PCR法(ABI Prism 5700, Perkin Elmer Applied Biosystems)とSYBER Green (Qiagen)を用いて75遺伝子のmRNA発現を測定した。これらの遺伝子に加えて、ハウスキーピング遺伝子のmRNA発現も試料ごとに測定した(HPRT又はユビキチン)。各試料中のRNA量を補正するために、データはすべてハウスキーピング遺伝子の発現との比較で計算した。誘導効果が最も高い特定の遺伝子を図5に示すが、データは対照P-7で処理したマウスでの反応に対する倍数で表わしている。図のデータは、C-9、C-23及びP-6がIL-6、IL-12p40、INF-α、IP-10及びIL-10を含む多様な遺伝子の発現を強く誘導したことを示す。しかし、INF-αのmRNAの発現に対する誘導効果は、マウスのC-9処置がC-23又はP-6処置と比較してずっと高かった。
実施例44: CICのin vivo活性
[0473] 20μg (200μl容量)のP-6(陽性対照)、P-7(陰性対照)、C-9、C-23、P-1又はP-11をマウス(10頭/群)の首筋に皮下注射してin vivo実験を実施した。注射の2時間後に採血した。LPS陽性対照群では、200μl容量をマウスに腹腔内注射し、1.5時間後(すなわちLPS誘発TNF-α活性のピーク時)に採血した。血液を凝固させ、血清を分離し、マイナス80℃で保存して検定に備えた。血清サイトカイン検定ではTNF-αにBiosource社Cytoscreenキットを、mIL-6及びmIL-12にPharmingen抗体ペアを、それぞれ使用した。試料の検定はすべて2組実施した。
[0474] P-6及び2種類のCICすなわちC-9とC-23は各々、IL-12p40、IL-6及びTNF-αを誘発したが、対照オリゴヌクレオチドP-7は不活性であった(図6A-C)。この検定ではCIC C-23がC-9及びP-6よりも強力であった。6mer (P-11: 5’-AACGTT)と7mer (P-1: 5’-TCGTCGA)は予想どおり不活性であった。
実施例45: 抗原とCICに対する霊長類の免疫反応
[0475] CIC存在下でのB型肝炎表面抗原(HBsAg)投与に対する免疫反応をヒヒで調べた。[0476] HBsAgは酵母で産生させた組換えHBsAgであった。ヒヒ群(8頭/群)は実験開始時体重8〜31kg(群平均13〜16kg)の雄性及び雌性ヒヒからなった。
[0477] ヒヒを20μg-HBsAg/1ml容量の筋肉内注射(IM)で2回、2か月間隔で(第0月と第2月に)免疫した。後述のように、群によってはHBsAgと共にCIC(C-8又はC-9)又は陽性対照(P-6)の投与も行った。
[0478] 免疫前と免疫2週間後に全頭から採血した。抗HBsAg IgG力価を次の要領で測定した。ヒヒ血清試料をAUSAB EIA市販キット(Abbott Labs Cat.#9006-24及び1459-05)により、ヒト血漿由来HBsAg被覆ビーズを使用して分析した。試料は、濃度範囲0〜150mIU/mlの一群のヒト血漿由来HBsAg陽性及び陰性標準液と共に試験した。ビオチン結合HBsAg及びウサギ抗ビオチン-HRP結合抗体を検出用の二次抗体複合体として使用した。発色にはo-フェニレンジアミンを用い、その492nmでの吸光度値を600nmでのバックグラウンドを除去して求めた(QuantumII分光光度計; Abbott Labs)。この試料吸光度値を使用して、メーカー確定のパラメーターに基づく標準曲線から抗HBsAg抗体の対応濃度を求め、ミリ国際単位パー・ミリリットル(mIU/ml)単位で表記する。希釈試料は、0〜150mIU/mlの値をもたらす結果となった試料吸光度値を基に定量を行い、それに希釈係数を乗じて最終濃度とした。
[0479] 統計的分析は、対数変換データを対象にOne-Way ANOVA Planned Comparison(α=0.05)使用の分散分析(NCSS97 Statistical Software Program; Kaysville, UT)で行った。p≦0.05を有意とみなした。
被験動物群は次のように免疫処理した:
群1 20μg HBsAg;
群2 20μg HBsAg + 1000μg P-6;
群3 20μg HBsAg + 1000μg C-8;
群4 20μg HBsAg + 1000μg C-9
[0480] 実験結果は次のTable 20に示すとおりである。HBsAgと共にCIC又は陽性対照P-6を投与すると、HBsAg単独投与の場合と比較して抗HBsAg抗体の力価が上昇する結果となった。2つ一組の比較では、群2、3及び4で検出された免疫反応は群1で検出された免疫反応とは有意に異なった(第2回免疫後で群2はp<0.05であり、群3及び4はP<0.005であった)。群2、3及び4の間には統計的差異が見られなかった。
Figure 2010189400
実施例46: CIC-抗原コンジュゲートが生起させたin vivo反応
[0481] この実施例ではマウスへのCIC-抗原コンジュゲートの投与による抗体依存性免疫反応の誘発を示す。
[0482] 後述のように、各群10頭のマウスを、後述の要領で合成したC11/Amb a 1コンジュゲート(1μg又は10μg)、P-6/Amb a 1 (1μg)又はAmb a 1 (1μg)の皮内注射により2回、2週間隔で免疫した。抗Amb a 1特異IgG1及びIgG2aの力価を各注射の2週間後に採取した血清から求めた。第2回免疫の6週間後に脾臓細胞を用いてin vitro再刺激を行い、Amb a 1特異的IFN-γ及びIL-5反応を評価した。
[0483] C11/Amb a 1コンジュゲートで免疫したマウスはP-6/Amb a 1基準物質で見られる特徴的な免疫反応パターン特にAmb a 1特異的免疫反応のTh2型からTh1型へのシフトを示した。C-11コンジュゲート又はP-6コンジュゲートのいずれかで免疫したマウスは強いIgG2a反応とIgG1反応の低下とを示した。コンジュゲート処理群はまた、IL-5反応の停止とIFN-γ反応の増進とを示した。さらにC11/Amb a 1コンジュゲートに対する免疫反応は、1μg及び10μg用量群の比較からうかがえるように、用量依存的に増進するように見受けられる。C11/Amb a 1コンジュゲートはP-6/Amb a 1で見られるものと質的に似た免疫反応を誘発する。
[0484] 結果はTable 21〜23に示すとおりである。
一般手順
[0485] 動物実験はNorthview Pacific Laboratories (Hercules, CA)で、Charles River Laboratories (Hollister, CA)から提供された8〜12週齢BALB/c系雌性マウスを使用して行った。各群10頭のマウスを次のうち1物質の尻尾への皮内注射(ID)により2回、2週間隔で免疫した: C11/Amb a 1コンジュゲート(1μg)、C11/Amb a 1コンジュゲート(10μg)、P-6/Amb a 1 (1μg)又はAmb a 1 (1μg)。各注射の2週間後に後眼窩静脈叢から採血し、抗体検定用に血清を調製した。第2回注射の6週間後に脾臓を摘出し、in vitro再刺激検定でIFN-γ及びIL-5サイトカイン反応を評価した。脾臓の検定は個別に実施した。Amb a 1を25μg/ml及び5 μg/mlを使用して5×105細胞/ウェルに対する再刺激を行い、4日目に上清を回収してマイナス80℃で保存し検定に備えた。このin vitro検定に使用した対照にはSAC (0.01%)及びPMA/IO(10ng/ml及び1μM)をそれぞれ含めた。
マウス抗Amb a 1 IgG1及びIgG2a検定
[0486] 50μl/ウェルのAmb a 1抗原(濃度1μg/ml)をコートした96穴丸底プレートを使用して、マウス血清試料をELISA法で分析した。二次抗体にはヤギ抗マウスIgG1(又はIgG2a)ビオチン結合抗体を使用した。検出にはストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを使用し、発色にはTMBを用いた。450nmでの吸光度値を650nmでのバックグラウンドを除去して求めた(Emax精密マイクロプレートリーダー; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。力価は、4パラメーター解析(Softmax Pro97; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で0.5 ODのELISA吸光度を与える血清希釈率の逆数と定義した。試料はすべて別々のプレート上の2組のウェルで検定し、2計算値の平均値を力価とした。
マウスIL-5及びIFN-γ検定
[0487] 抗サイトカイン・モノクローナル抗体でコートしたプレートを用いて上清のIL-5及びIFN-γレベルをキャプチャーELISA法で測定した。二次抗体にはビオチニル化抗サイトカインMAbを使用した。検出にはストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを使用し、発色にはTMBを使用した。各プレートで作成した標準曲線から濃度を計算した。450nmでの吸光度値を650nmでのバックグラウンドを除去して求めた(Emax精密マイクロプレートリーダー; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。試料はすべて別々のプレート上の2組のウェルで検定し、2計算値の平均値を濃度とした。
[0488] 統計的分析は、対数変換データを対象にNCSS97プログラム(NCSS97 Statistical Software Program; Kaysville, UT)でOne-Way Planned Comparisons(α=0.05)を使用して行った。以下の実験結果ではp≦0.05を統計的に有意とみなす。
C-11/Amb a 1コンジュゲートの合成
活性化C-11 (C-111)の合成:[0489] 5’-ジスルフィド-C-11 (C-110)を活性化緩衝液(100mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/pH 7.5)に溶解し、TCEPによる還元で活性化した。この活性化CIC (C-111)を、5ml Sephadex G25カラム(Pharmacia)で同じ活性化緩衝液を移動相として使用して精製した。画分はベースライン上昇時から0.5分刻みで手作業により回収した。精製後、種々の画分の濃度をA260及び吸光係数25.6 OD/mgから求めた。
活性化Amb a 1の合成:
[0490] Amb a 1をまずその遊離スルフヒドリル基をブロックし、次にヘテロ官能性架橋剤を加えることにより活性化した。過剰試薬をHiTrap G-25脱塩カラム(Pharmacia Cat.#17-1408-01)で脱塩して除去した。得られた活性化Amb a 1はタンパク質あたり平均9.3部位を活性化させていた。
C-11/Amb a 1コンジュゲートの合成
[0491] 活性化C-11 (C-111)と活性化Amb a 1を結合させ、得られたC-11/Amb a 1コンジュゲートをSuperdex 200サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Pharmacia Cat.#17-1088-01; 1cm×30cm)で分画した。移動相には調製用緩衝液(10mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/pH 7.2)を使用した。画分はベースラインの上昇開始時から1分刻みで回収した。
[0492] コンジュゲート試料を、4〜12%NuPAGEゲル(Invitrogen, Cat.#NP0322)+MOPS緩衝液(Invitrogen, Cat.# NP0001)使用のSDS-PAGE法で、またBioSep SEC-S3000カラム(Phenomenex, Cat.#00H-2146-E0)使用のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)で分析した。SDS-PAGE後、タンパク質をCoomasieブルー色素(GelCode; Pierce Cat.#24596)で染色した。CICの存在はDNA銀染色法(Pharmacia, Cat.#17-6000-30)で確認した。プーリング判定基準の確定と得られたプールの解析にはSDS-PAGEとSEC-HPLCの両方を使用した。タンパク質濃度はビシンコニン酸(bicinchoninic acid)検定法(BCA; Sigma Cat.#BCA-1)で測定した。
Figure 2010189400
Figure 2010189400
Figure 2010189400
実施例47: CIC活性に対するスペーサー部分の効果
[0493] この実施例ではINF-α誘発に対する種々のスペーサー部分の効果を示す。C-90(C3 CIC)とC-51(HEG CIC)の比較から、INF-α誘発効果はC-51がC-90の8倍も大きいが、INF-γ誘発量はどちらもほぼ同じであると判明した。同様に、種々のリンカーを含む分岐CICの比較から、INF-α誘発効果はHEG (C-94) > TEG(C-130) > C3 (C-104) = 無リンカー(C-28)の順である判明した。
Figure 2010189400
実施例48: CIC核酸部分に対応する配列をもつポリヌクレオチドの単独免疫調節活性の評価
[0494] この実施例では、単独免疫調節活性をもたない核酸部分を含むCICの免疫調節活性についてさらに説明する。CIC核酸部分に対応する配列をもつポリヌクレオチドについて、単独での又は遊離スペーサーと結合した場合の活性を測定し、同じ量の核酸及びスペーサーを含むCICの活性と比較した。たとえば3μMのCIC C-101は9μMのP-14と、又は9μMのP-14と9μMのHEGと3μMのグリセロールとの混合物と、比較した(C-101は3当量のP-14、3当量のHEG及び1当量のグリセロールを含むからである)。いずれの場合にもCICは活性であったが、短いポリヌクレオチドは単独でもスペーサーと結合しても不活性であった。Table 25参照。スペーサー単独の活性は濃度9μMで測定したが、どれも完全に不活性であった。
Figure 2010189400
実施例49: (5’-TCGACGT-3’-HEG)ave=185-Ficoll400 (C-137)の調製
A. マレイミド-Ficoll400の調製
[0495] アミノエチルカルボキシメチル(AECM)180-Ficoll400をInman (J. Immunology, 1975, 114:704-709)の方法で調製した。Ficoll(MW= 400,000Da) 1molあたりのアミノエチル基数は平均180であった。DMSO 300μlに溶解した4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル27.6mg (62.6 μmol)を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.66)1.0mlに溶解したAECM180- Ficoll400 23.2mg(0.058μmol)に、たえずボルテックスしながら滴下した。この反応混合物を2時間シェーカーで振とうし、次いでSephadex G25カラムで脱塩し20mgのマレイミド-Ficoll400を得た。Ficoll 1molあたりのマレイミド基数は平均165程度であった。
B. 5’-TCGACGT-3’-HEG-(CH2)3-SH (C-136)の調製
[0496] 5’-TCGACGT-3’-HEG-(CH2)3-SS-(CH2)3-OH (C-135)をC-116と同様にして合成した。0.1Mリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム/pH 7.5緩衝液に溶解したC-135 10mg(3.57μmol)に、同じ緩衝液0.7mlに溶解したTCEP 5.7mg(20μmol)を加えた。混合物を十分にボルテックスし、40℃の水浴中に2時間置いた。生成したチオール(C-136)をRP-HPLC(Polymer Labs PLRP-Sカラム)で、逓増グラジエントのアセトニトリル/酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)/pH 7.0緩衝液を使用して精製し、直ちに次の反応に使用した。
C. (5’-TCGACGT-3’-HEG)x-Ficoll400 (C-137)の調製
[0497] 0.7mlの0.1Mリン酸ナトリウム/pH 6.66に溶解した5.5mg(0.014μmol)のマレイミド-Ficoll400に、約30%アセトニトリル/酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)/pH 7.0緩衝液3.45mlに溶解した6.8mg(2.5μmol)のC-136を加えた。この混合物をシェーカーにより室温で一晩振とうし、生成物をSuperdex 200カラム(Pharmacia)で精製した。単離生成物の全重量と260nmでの吸光度値を用いて計算すると、生成物はFicoll 1molあたり平均約185個のオリゴヌクレオチドを含むと判明した。Ficoll 1molあたりオリゴヌクレオチド数がもっと少ない第2画分も得られた。
D. C-137の活性
[0498] Table 26に示すように、多糖系CICはサイトカイン反応検定で顕著な活性を示し、特に著しいINF-α刺激効果を示した。
Figure 2010189400
[0499] 以上、明快な理解を期す意味で本発明を実例や実施例をもつてやや詳しく説明したが、当業者には自明のとおり、ある種の変更や修正を加えることも可能である。従って、以上の説明や実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、そうした範囲の限定は添付の特許請求の範囲によるものとする。
[0500] 本書で引用した特許、特許出願、及び刊行物など諸々の文献は参照指示により本書にその全体が組み込まれる。その効果は、各文献について個別にその旨を断ったに等しいものとする。

Claims (49)

  1. 2以上の核酸部分と1以上の非核酸スペーサー部分とを含むキメラ免疫調節化合物(CIC)であって、
    少なくとも1つの非核酸スペーサー部分が2つの核酸部分と共有結合し、
    該スペーサーがポリヌクレオチドではなく、
    少なくとも1つの核酸部分が配列5’-CG-3’を含み、かつ
    該CICが免疫調節活性をもつ
    ことを特徴とするCIC。
  2. 少なくとも1つの核酸部分が配列5’-TCG-3’を含む請求項1に記載のCIC。
  3. CICが
    (a)ヒト末梢血単核細胞によるINF-γ産生を刺激する能力;
    (b)ヒト末梢血単核細胞によるINF-α産生を刺激する能力;
    (c)B細胞の増殖を刺激する能力
    からなる群より選択される少なくとも1つの免疫調節活性をもつことを特徴とする請求項1に記載のCIC。
  4. 式
    N1-S1-N2又はN1-S1-N2-S2-N3
    (式中N1、N2及びN3は核酸部分であり、S1とS2は非核酸スペーサー部分であり、またS1とS2は厳密に2個の核酸部分と共有結合している。)
    で示されるコア構造を含む請求項1〜3に記載のCIC。
  5. 式[Nv]x-Sp (式中SpはX個の独立に選択される核酸部分Nvに共有結合した多価スペーサーであり、またXは少なくとも3である)で示されるコア構造を含む請求項1又は2に記載のCIC。
  6. Xが3〜約50である請求項5に記載のCIC。
  7. Xが約50〜約500である請求項6に記載のCIC。
  8. Spがデンドリマー又は多糖を含む請求項5に記載のCIC。
  9. Spが架橋型多糖を含む請求項8に記載のCIC。
  10. 少なくとも3つの核酸部分を含み、各核酸が少なくとも1つの非核酸スペーサー部分に共有結合していることを特徴とする請求項1〜3又は請求項2に記載のCIC。
  11. 非ヌクレオチド・スペーサー部分を含む任意の先行請求項に記載CICであって、該ヌクレオチド・スペーサー部分がオリゴエチレングリコール、グリセロール、C2〜C10アルキル、塩基欠失ヌクレオチド、ペンタエリトリトール、1,3-ジアミノ-2-プロパノール、2-(ヒドロキシメチル)エチル、多糖又はデンドリマーを含むことを特徴とする任意の先行請求項に記載CIC。
  12. 複合非ヌクレオチド・スペーサー部分を含む任意の先行請求項に記載CIC。
  13. 非ヌクレオチド・スペーサー部分がHEG基本単位を含む任意の先行請求項に記載のCIC。
  14. 非ヌクレオチド・スペーサー部分が、ホスホジエステル結合した及び/又はホスホロチオアート結合したオリゴエチレングリコール部分を含む任意の先行請求項に記載のCIC。
  15. デンドリマー、多糖、グリセロール、ペンタエリトリトール又は2-(ヒドロキシメチル)エチルを含む第1スペーサー基本単位を含み、また少なくとも1つのHEG基本単位をさらに含む請求項5に記載のCICであって、該HEG基本単位が第1スペーサー部分と核酸部分とに共有結合していることを特徴とするCIC。
  16. HEG基本単位と第1スペーサー・エレメントの間の結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオアートエステル結合であり、HEG基本単位と核酸部分の間の結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオアートエステル結合である請求項15に記載のCIC。
  17. 少なくとも1つの核酸部分が配列5’-TCGA-3’を含む任意の先行請求項に記載のCIC。
  18. 少なくとも1つの核酸部分が配列5’-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3’(式中各Xは独立に選択されるヌクレオチドである)を含む請求項1〜15の任意の請求項に記載のCIC。
  19. 少なくとも1つの核酸部分が配列5’-TCG[(X)2-4]-3’、 5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’又は5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’(式中各Xは独立に選択されるヌクレオチドである)をもつ請求項15に記載のCIC。
  20. 少なくとも1つの核酸部分が配列5’-TCGACGT-3’又は5’-TCGTCGA-3’をもつ請求項19に記載のCIC。
  21. CIC中のすべての核酸部分が配列5’-TCG[(X)2-4]-3’、 5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’又は5’-TCG(A/T)[(X)1-3]-3’(式中各Xは独立に選択されるヌクレオチドである)をもつ任意の先行請求項に記載のCIC。
  22. 配列5’-CG-3’を含む少なくとも1つの核酸部分が鎖長7ヌクレオチド以下である請求項1〜18の任意の請求項に記載のCIC。
  23. 配列5’-CG-3’を含むすべての核酸部分が鎖長7ヌクレオチド以下である任意の先行請求項に記載のCIC。
  24. すべての核酸部分が同じである任意の先行請求項に記載のCIC。
  25. CICの少なくとも1つの核酸部分が(i)単独免疫調節活性をもたない又は(ii)低単独免疫調節活性をもつことを特徴とする任意の先行請求項に記載のCIC。
  26. CICのいかなる核酸部分も単独免疫調節活性をもたない請求項25に記載のCIC。
  27. 次の式：
    Figure 2010189400
    Figure 2010189400
    Figure 2010189400
     からなる群より選択される式で示される請求項14に記載のCIC。
  28. 核酸部分のヌクレオチド間の結合がホスホジエステル結合とホスホロチオエートエステル結合より選択される任意の先行請求項に記載のCIC。
  29. 核酸部分のヌクレオチド、核酸部分及びスペーサー部分の間の結合、及びスペーサー部分の基本単位間の結合がホスホジエステル結合及び/又はホスホロチオエートエステル結合である任意の先行請求項に記載のCIC。
  30. スペーサー部分がデンドリマーを含む請求項1に記載のCIC。
  31. スペーサー部分が多糖を含む請求項1に記載のCIC。
  32. 任意の先行請求項に記載のCICと製薬上許容しうる賦形剤とを含む組成物。
  33. 組成物が本質的に無内毒素である請求項29に記載の組成物。
  34. さらに抗原を含む請求項29又は30に記載の組成物。
  35. さらに陽イオン性微小球を含む請求項29又は30に記載の組成物。
  36. 微小球が乳酸とグリコール酸とのポリマーを含む請求項32に記載の組成物。
  37. 個体の免疫反応を調節する方法であって、個体の免疫反応を調節するに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を該個体に投与するステップを含む方法。
  38. 個体がTh2型の免疫反応に関連する疾患の患者であることを特徴とする請求項37に記載の方法。
  39. Th2型の免疫反応に関連する疾患がアレルギー又はアレルギー性喘息であることを特徴とする請求項38に記載の方法。
  40. 個体が感染症の患者であることを特徴とする請求項37に記載の方法。
  41. 個体のインターフェロン-ガンマ(INF-γ)を増加させる方法であって、個体のINF-γを増加させるに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を該個体に投与するステップを含む方法。
  42. 個体が突発性肺線維症の患者であることを特徴とする請求項41に記載の方法。
  43. 個体のインターフェロン-アルファ(INF-α)を増加させる方法であって、個体のINF-γを増加させるに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を該個体に投与するステップを含む方法。
  44. 個体がウイルス感染者であることを特徴とする請求項43に記載の方法。
  45. 個体の感染症の症状を緩和する方法であって、有効量すなわち該感染症の症状を緩和するに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を該個体に投与するステップを含む方法。
  46. 個体のIgE関連疾患を緩和する方法であって、有効量すなわち該IgE関連疾患の症状を緩和するに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を、IgE関連疾患を患う個体に投与するステップを含む方法。
  47. IgE関連疾患がアレルギーであることを特徴とする請求項46に記載の方法。
  48. IgE関連疾患がアレルギー関連疾患であることを特徴とする請求項46に記載の方法。
  49. がん治療の方法であって、有効量すなわちがんの症状を緩和するに足る量の請求項1〜31に記載のCIC又は請求項32〜36に記載の組成物を、治療を必要とする個体に投与するステップを含む方法。
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