JP2009532364A - 腫瘍および疾患の治療におけるイノシトール−トリピロリン酸の使用 - Google Patents

Abstract

イノシトール−トリピロリン酸は、赤血球のヘモグロビンの酸素親和性を低下させることによって赤血球の細胞膜を通って酸素を固形腫瘍へ到達させるその能力のために、ヘモグロビンのアロステリックエフェクターである。本発明は、循環赤血球中のヘモグロビンの酸素親和性を低下させるためのイノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。本発明は、さらに、血管新生を阻害し、低酸素性腫瘍の放射線感受性を増強するためのイノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。本発明は、さらに、種々のタイプの癌、アルツハイマー病、脳卒中および骨粗鬆症の治療のためのイノシトール−トリピロリン酸の使用に関する。

Description

本発明は、イノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）を使用して赤血球による酸素到達を増強するための組成物および方法に関する。ＩＴＰＰは、赤血球の細胞膜を通って赤血球のヘモグロビンの酸素親和性を低下させる能力を有するヘモグロビンのアロステリックエフェクターである。本発明はさらに、血管新生を阻害し、低酸素性腫瘍の放射線感受性を増強するためのＩＴＰＰの使用に関する。本発明はさらに、アルツハイマー病を治療するためのＩＴＰＰの使用に関する。

成人の血管系において、血液は約５〜６リットルの容量を有する。この容量のおよそ半分は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、および血小板を含む細胞で占められる。赤血球は、血液の細胞成分の大部分を構成する。血液の液体部分である血漿は、およそ９０パーセントが水であり、１０パーセントが様々な溶質である。これらの溶質には、血漿タンパク質、有機代謝産物および老廃物、ならびに無機化合物が含まれる。

赤血球の主な機能は、酸素を肺から身体の組織へ輸送し、除去するために二酸化炭素を組織から肺へ輸送することである。酸素は水溶液中にあまり溶解しないので、酸素は血漿によりほとんど輸送されない。血液によって運ばれる酸素の大部分は、赤血球のヘモグロビンによって輸送される。哺乳類の赤血球は、核、ミトコンドリアまたは他の細胞内小器官を含まず、それ自身の代謝において酸素を使用しない。赤血球は約３５重量パーセントのヘモグロビンを含み、ヘモグロビンは、酸素を結合および輸送することに関与する。

ヘモグロビンは、約６４，５００ダルトンの分子量を有するタンパク質である。ヘモグロビンは、４本のポリペプチド鎖と、鉄原子が二価の状態で結合している４つのヘム補欠分子族を含む。ヘモグロビン分子のタンパク質部分である通常のグロビンは、２本のα鎖および２本のβ鎖からなる。４本の鎖のそれぞれは、鎖が折り畳まれた特徴的な三次構造を有する。４本のポリペプチド鎖はほぼ四面体配置に組み合わせられ、ヘモグロビンの特徴的な４次構造を構成する。各ポリペプチド鎖には１つのヘム基が結合されており、これは、１分子の分子酸素に可逆的に結合させることができる。ヘモグロビンが酸素と結合すると、オキシヘモグロビンが形成される。酸素が放出されると、オキシヘモグロビンはデオキシヘモグロビンに還元される。

腫瘍を含む組織への酸素の到達は、血流の容量、赤血球の数、赤血球中のヘモグロビン濃度、ヘモグロビンの酸素親和性、および特定の種においては、高いおよび低い酸素親和性を有する赤血球内ヘモグロビンのモル比を含む多数の因子に依存するが、これらに限定されない。さらにヘモグロビンの酸素親和性は、４つの因子、すなわち（１）酸素の分圧、（２）ｐＨ、（３）ヘモグロビン中の２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）の濃度、および（４）二酸化炭素の濃度に依存する。肺において、１００ｍｍＨｇの酸素分圧では、循環ヘモグロビンの約９８％が酸素で飽和されている。これは、血液の全酸素輸送能力を表す。完全に酸素化されると、１００ｍｌの哺乳類全血液は、約２１ｍｌの気体酸素を運ぶことができる。

ヘモグロビンの酸素結合能力に対する酸素分圧およびｐＨの効果は、ヘモグロビンの酸素飽和曲線の検討によって最もよく説明される。酸素飽和曲線は、ヘモグロビン分子の溶液が気相中の酸素の種々の分圧と平衡状態になる場合の、酸素分子によって占められるヘモグロビン分子の全酸素結合部位の割合をプロットする。

ヘモグロビンの酸素飽和曲線はＳ字形である。従って、最初の酸素分子の結合によって、残りのヘモグロビンの更なる酸素分子の結合のための親和性が増大される。酸素の分圧が増大されるとプラトーに近づき、ヘモグロビン分子のそれぞれは飽和されて、上限の４つの酸素分子を含む。

ヘモグロビンによる酸素の可逆的な結合は、以下の式に従ったプロトンの放出を伴う。

従って、ｐＨの増大は平衡を右側に引き寄せ、所与の分圧においてヘモグロビンをより多くの酸素と結合させる。ｐＨの低下は結合される酸素の量を低下させるであろう。

肺において、気腔中の酸素の分圧は約９０〜１００ｍｍＨｇであり、ｐＨも正常な血液のｐＨ（７．６まで）に対して高い。そのため、ヘモグロビンは肺の中ではほとんど最大限に酸素で飽和される傾向にあるであろう。この圧力およびｐＨにおいて、ヘモグロビンは約９８パーセント酸素で飽和されている。一方、末梢組織内部の毛細血管内では、酸素の分圧はわずか約２５〜４０ｍｍＨｇであり、ｐＨもほぼ中性である（約７．２〜７．３）。筋肉細胞は酸素を高い割合で使用し、それにより酸素の局所濃度を低下させるので、結合酸素の一部が組織へ放出されることが好ましい。血液は筋肉内の毛細血管を通過するので、酸素は赤血球中のほとんど飽和したヘモグロビンから血漿内へ、そしてそこから筋肉細胞内へ放出されるであろう。ヘモグロビンは筋肉毛細管を通過するときにその結合酸素の４番目を放出し得るので、筋肉を出て行くときには、約７５パーセントしか飽和されていないであろう。通常、組織を出て行く静脈血内のヘモグロビンは、肺と末梢組織の間の反復回路において、約６５パーセント〜９７パーセントの酸素飽和で循環する。従って、酸素分圧およびｐＨは、共にヘモグロビンによる酸素の放出に影響を与える働きをする。

ヘモグロビンの酸素化の度合いの制御における第３の重要な因子は、アロステリックエフェクターの２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）である。ＤＰＧは、哺乳類赤血球のヘモグロビンの通常の生理学的エフェクターである。ＤＰＧは、肺内の酸素分圧と関連して赤血球のヘモグロビンの酸素−結合親和性を制御する。細胞内のＤＰＧ濃度が高いほど、ヘモグロビンの酸素に対する親和性は低くなる。

組織への酸素の到達が慢性的に低下する場合、赤血球中のＤＰＧ濃度は正常な個体の場合よりも高くなる。例えば、高地では、酸素の分圧は著しく低い。対応して、組織中の酸素の分圧も低い。正常なヒト被験者が高地に移動して数時間以内に、赤血球中のＤＰＧレベルが増大し、より多くのＤＰＧを結合させて、ヘモグロビンの酸素親和性を低下させる。赤血球のＤＰＧレベルの増大は低酸素症を患っている患者でも起こる。この調整によって、ヘモグロビンはより容易にその結合酸素を組織に放出し、肺内のヘモグロビンの酸素化の低下を補償することができる。人々が高地に順応して低地に降りた場合には、逆の変化が生じる。

血液から正常に単離されると、ヘモグロビンはかなりの量のＤＰＧを含む。ヘモグロビンがそのＤＰＧを「取り除かれる」際、酸素に対してはるかに高い親和性が示される。ＤＰＧが増加すると、ヘモグロビンの酸素結合親和性は低下する。従って、ＤＰＧなどの生理学的アロステリックエフェクターは、組織内のヘモグロビンからの酸素の正常な放出のために必須である。

ＤＰＧは哺乳類赤血球のヘモグロビンの正常な生理学的エフェクターであるが、リン酸化イノシトールは、いくつかの鳥類および爬虫類の赤血球において同じ役割を果たすことが分かっている。イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）は哺乳類赤血球膜を通過することができないが、ＤＰＧの結合部位で哺乳類赤血球のヘモグロビンと結合してヘモグロビンのアロステリック構造を修飾することができ、その効果は、ヘモグロビンの酸素に対する親和性を低減することである。例えば、ヘモグロビンの酸素親和性の低減においてＤＰＧよりもはるかに強力であるＩＨＰでＤＰＧを置換することができる。ＩＨＰは、ＤＰＧよりも１０００倍高いヘモグロビンへの親和性を有し（Ｒ．Ｅ．Ｂｅｎｅｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１６巻、２５９４−２５９７頁（１９７７年））、ｐＨ７．４および３７℃においてヘモグロビンのＰ_５０を９６．４ｍｍ，Ｈｇの値まで上昇させる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５０巻、７０９３−７０９８頁（１９７５年））。

ヘモグロビンの特定のアロステリックエフェクターを赤血球内に導入し、それによりヘモグロビンの酸素に対する親和性を低下させることによって、および血液の酸素経済を改善することによって、哺乳類赤血球の酸素放出能力を増強することができる。この現象は、肺または循環系の不適切な機能のためにその組織の酸素化が低下している個体を治療するための種々の医療用途を示唆する。

これらの修飾赤血球の使用から達成される潜在的な医学的な利点によって、赤血球のヘモグロビンのアロステリックエフェクターの被包を可能にするために当該技術分野において種々の技術が開発されている。従って、被包手順を補助または単純化するための多数のデバイスが設計されている。当該技術分野において知られている被包方法としては、細胞の浸透圧パルス（膨潤）および再構成、制御された溶解および再封入、リポソームの取込み、ならびにエレクトロポレーションがある。エレクトロポレーションの現在の方法は、商業的な使用に適した規模ではこの手順を商業的に非実用的なものとする。

以下の参考文献は、ＩＨＰが負荷されたリポソームの相互作用による赤血球内へのポリリン酸の取込みについて記載している：Ｇｅｒｓｏｎｄｅら、「インタクトな赤血球へのポリリン酸の取込みによる細胞内ヘモグロビンの酸素親和性の改変および毛細血管系内の増強されたＯ２放出（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｂｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｏ２ Ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＿ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｂｉｂｌｔｈｃａ．Ｈａｅｍａｔ、第４６号、８１−９２頁（１９８０年）、Ｇｅｒｓｏｎｄｅら、「エフェクター含有脂質小胞との融合によるイノシトール六リン酸の取込み後のヒト赤血球のＯ_２放出能力およびボーア効果の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｏ_２ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｏｈｒ−Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｏｓｉｔｏｌ Ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｙ Ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）」、Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、（１９８２年）、ならびにＷｅｉｎｅｒ、「リポソーム技術による生存赤血球におけるＨｂ−Ｏ_２解離の右方移動（Ｒｉｇｈｔ Ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｏｆ ＨＤ−Ｏ_２ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉａｂｌｅ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第４７巻、（１９８３年）。

さらに、米国特許第４，１９２，８６９号明細書、米国特許第４，３２１，２５９号明細書、および米国特許第４，４７３，５６３号明細書（Ｎｉｃｏｌａｕら）は、流体が充填された脂質小胞を赤血球膜と融合させてその内容物を赤血球内に入れる方法について記載している。この方法では、ＩＨＰなどのアロステリックエフェクターを赤血球内に輸送することが可能であり、その非常に高い結合定数のために、ＩＨＰはヘモグロビン内のその結合部位でＤＰＧを置換する。

リポソーム技術によると、ＩＨＰは溶液が飽和されるまでリン酸緩衝液中に溶解され、および脂質小胞の混合物が溶液中に懸濁される。次に懸濁液は、超音波処理または注入処理を受けてから遠心分離される。上方の懸濁液は、ＩＨＰを含む小さい脂質小胞を含み、次にこれを回収する。回収した懸濁液に赤血球が添加されてインキュベートされ、この間に、ＩＨＰを含む脂質小胞は赤血球の細胞膜と融合し、これによってその内容物が赤血球の内部に入る。修飾された赤血球は次に洗浄され、血漿に添加されて、製品が完成される。

リポソーム技術に関する欠点としては、赤血球に取り込まれるＩＨＰ濃度の再現性が低いことと、処理後の赤血球の溶血が著しいことを含む。さらに、手順が冗長かつ複雑であるために商業化が実際的ではない。

リポソーム技術に関する欠点を解決するための試みにおいて、赤血球を溶解および再封入する方法が開発された。この方法は、以下の刊行物に記載されている：Ｎｉｃｏｌａｕら、「赤血球中のヘモグロビンのアロステリックエフェクターの取込み。生理学的効果（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ｂｉｂｌｔｈｃａ．Ｈａｅｍａｔ．第５１号、９２−１０７頁、（１９８５年）。関連の米国特許第４，７５２，５８６号明細書および米国特許第４，６５２，４４９号明細書（Ｒｏｐａｒｓら）も、赤血球−リポソーム相互作用を回避する赤血球の制御された溶解および再封入によってヒトまたは動物の赤血球中に生物活性を有する物質を被包する手順について記載している。

この技術は、浸透圧パルス技術と同様の形で機能する連続流透析システムとして最もよく特徴付けられる。具体的には、少なくとも１つの透析要素の第１のコンパートメントには赤血球の水性懸濁液が連続的に供給されるが、透析要素の第２のコンパートメントは、赤血球の懸濁液に関して低張性である水溶液を含む。低張性溶液は赤血球を溶解させる。赤血球溶解物は次に生物活性物質と接触されて、赤血球内に取り込まれる。赤血球の膜を再封入するために、赤血球溶解物の浸透圧および／または膠質浸透圧が上昇されて、再封入された赤血球の懸濁液が回収される。

関連の米国特許第４，８７４，６９０号明細書および米国特許第５，０４３，２６１号明細書（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら）では、赤血球の凍結乾燥および再構成を含む関連技術が開示されている。赤血球を再構成する方法の一部として、ＩＨＰを含む様々なポリアニオンの添加が記載されている。開示された方法に従った赤血球の処理は、活性が影響を受けていない細胞をもたらす。おそらく、ＩＨＰは再構成の過程で細胞内に取り込まれ、それによって、ヘモグロビンの活性が保持される。

米国特許第４，４７８，８２４号明細書および米国特許第４，９３１，２７６号明細書（Ｆｒａｎｃｏら）には、細胞を有効に溶解および再封入することによってＩＨＰを含む非イオン剤を哺乳類赤血球内に有効に導入するための第２の関連方法および装置が記載されている。この手順は、「浸透圧パルス技術」として記載されている。浸透圧パルス技術の実施において、濃縮赤血球の供給物は、細胞内へそして細胞から外へ容易に拡散する化合物を含む溶液中に懸濁されてインキュベートされる。化合物の濃度は細胞内への拡散を引き起こすのに十分な濃度であり、その結果、細胞の内容物は高張性になる。次に、導入すべき少なくとも１種の所望の薬剤の存在下で、高張性の細胞を含む溶液を本質的に等張性の水性媒体で希釈することによって膜貫イオン勾配が形成され、それにより、水の細胞内への拡散が引き起こされ、その結果膨潤が起こり、細胞の外膜の透過性が増大する。この「浸透圧パルス」は水の細胞内への拡散を引き起こし、その結果得られる細胞の膨潤は所望の薬剤に対する細胞外膜の透過性を増大させる。膜の透過性の増大は、少なくとも１種の薬剤の細胞内への輸送と、化合物の細胞から外への拡散を可能にするのに十分なだけの時間保持される。

浸透圧パルス技術の実施において使用することができるポリアニオンとしては、水溶性であると共に赤血球の外側脂質二重膜に対して破壊的でない、ピロリン酸、トリポリリン酸、リン酸化イノシトール、２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸、ヘパリン、およびポリカルボン酸を含む。

浸透圧パルス技術は、低い被包収率、不完全な再封入、細胞内容物の損失、そしてそれに対応する細胞寿命の低下を含むいくつかの欠点を有する。この技術は冗長で複雑であり、そして自動化に適さない。これらの理由から、浸透圧パルス技術は商業的にほとんど成功を収めていない。

様々な生物活性物質を赤血球中に被包するためのもう１つの方法はエレクトロポレーションである。エレクトロポレーションは、Ｍｏｕｎｅｉｍｎｅらの、「エレクトロポレーションを用いる赤血球中のイノシトール六リン酸の被包によって誘発されるオキシヘモグロビン解離曲線の安定な右方移動（Ｓｔａｂｌｅ ｒｉｇｈｔｗａｒｄ ｓｈｉｆｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」、ＦＥＢＳ、第２７５巻、第１、２号、１１７−１２０頁（１９９０年）に記載されるように、赤血球中のＩＨＰを含む様々な細胞タイプの外来性分子の被包のために使用されている。米国特許第５，６１２，２０７号明細書も参照されたい。

血管新生は組織または器官への新しい血管の生成であり、組織内の酸素分圧に関連する。正常な生理的条件下では、ヒトおよび動物は、非常に特定の限られた状況でだけ血管新生を起こす。例えば、血管新生は、通常、創傷治癒、胎児および胚の発生、ならびに黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。

血管新生は、血管新生作用薬および阻害剤との高度に調節された系によって制御される。血管新生の制御は特定の病状では変化し、多くの場合、疾患に関連する病理的損傷は、制御されない血管新生に関係する。制御された血管新生および制御されない血管新生はいずれも同様の方法で進行すると考えられる。基底膜によって包囲される内皮細胞および周皮細胞は毛細血管を形成する。血管新生は、内皮細胞および白血球により放出される酵素による基底膜の侵食から始まる。次に、血管の内腔を覆う内皮細胞は、基底膜を通って突出する。血管新生作用薬は内皮細胞を誘発して、侵食された基底膜を通って遊走させる。遊走細胞は親血管からの「出芽」を形成し、そこで、内皮細胞は有糸分裂および増殖を起こす。内皮の出芽は互いに併合して毛細血管ループを形成し、新しい血管が形成される。

持続性の調節されない血管新生は、多くの病状、腫瘍転移、および内皮細胞による異常成長において起こる。調節されない血管新生が存在する多様な病理的病状は、血管新生依存性疾患または血管新生関連疾患として同じグループにされている。

腫瘍成長が血管新生に依存するという仮説は１９７１年に最初に報告された（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ、２８５：１１８２−８６頁（１９７１年））。この仮説は、その最も簡単な表現では、「腫瘍の「取得」がいったん生じたら、腫瘍細胞集団の全ての増大の前に、腫瘍に集中する新しい毛細血管が増大するはずである」と記載される。腫瘍の「取得」とは、現在では、数立方ミリメートルの容積を占める数百万個以下の細胞の腫瘍細胞の集団が現存の宿主の微小血管上で生存できる、腫瘍成長の前血管相を示すと理解される。この相を越えて腫瘍容積が増大するには、新しい毛細血管の誘発が必要とされる。例えば、マウスの初期前血管相における肺の微小転移は、組織切片における高性能顕微鏡によってでなければ検出不可能であろう。

血管新生は、固形腫瘍および血液由来の腫瘍を含む多数の異なるタイプの癌に関連している。血管新生が関連している固形腫瘍には、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、および骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。血管新生は、通常は貧血、血液凝固障害、ならびにリンパ節、肝臓および脾臓の肥大を伴って、白血球の無制限の増殖が生じる、白血病、種々の急性または慢性の骨髄の新生物性疾患のいずれかの血液由来の腫瘍にも関連している。血管新生は、白血病腫瘍および多発性骨髄腫疾患を引き起こす骨髄の異常の一因になると考えられる。

小児期の最も頻繁な血管新生疾患の１つは、血管腫である。血管腫は、新たに形成された血管を含む腫瘍である。ほとんどの場合腫瘍は良性であり、介入なしでも消失する。より重症の場合には、腫瘍は大きな海綿状および浸潤性の形態まで進行し、臨床的合併症を生じる。血管腫の全身性形態の血管腫症は、高い死亡率を有する。現在使用されている治療法では治療することができない治療抵抗性の血管腫が存在する。

別の血管新生関連疾患は関節リュウマチである。関節の滑膜表層内の血管が血管新生を起こす。新しい血管網の形成に加えて、内皮細胞は、パンヌス成長および軟骨破壊を導く因子および活性酸素種を放出する。血管新生は、変形性関節症の一因にもなり得る。血管新生関連因子による軟骨細胞の活性化は、関節の破壊の原因となる。後期には、血管新生因子は、新しい骨の成長を促進する。軟骨破壊を防止する治療的介入は疾患の進行を停止させ、関節炎を患っている人の症状を軽減し得る。

慢性炎症も病理的血管新生に関連すると思われる。潰瘍性大腸炎およびクローン病などの疾患は、炎症組織への新しい血管の内方成長と共に、組織学的変化を示す。南米で発見された細菌感染であるバルトネラ症は、血管内皮細胞の増殖によって特徴付けられる慢性期をもたらし得る。血管新生に関連する別の病理学的な役割は、アテローム硬化症において見出される。血管の内腔内に形成される斑は、血管新生刺激活性を有することが示されている。

上記のように、いくつかの系列の証拠によって、血管新生は、固形腫瘍の成長および持続ならびにその転移に必須であることが示される。血管新生が刺激されたら、腫瘍は、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）および血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）を含む様々な血管新生因子の産生を上方制御する［２、３］。

血管新生の制御におけるＶＥＧＦの役割は熱心な研究の目的である［５〜１０］。ＶＥＧＦは生理的血管新生における重要な律速段階を表すが、腫瘍成長に関連するような病理的血管新生においても重要であると思われる［１１］。ＶＥＧＦは、血管漏出を誘発するその能力に基づいて、血管透過性因子としても知られている［１３］。いくつかの固形腫瘍は十分な量のＶＥＧＦを産生し、これが内皮細胞の増殖および遊走を刺激し、それにより新血管新生が誘発される［１２、１３］。ＶＥＧＦの発現は、様々な種類のヒトの癌の予後に著しい影響を与えることが示されている。腫瘍内の酸素分圧は、ＶＥＧＦ遺伝子の発現の制御において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現は、様々な病態生理学的環境下で低酸素分圧にさらされることによって誘発される［１３］。成長腫瘍はＶＥＧＦの発現を誘発する低酸素によって特徴付けられ、転移性疾患の発生の予測因子でもあり得る。

アルツハイマー病は、記憶、学習、言語、および推理に関与する脳の部分において置き違えられたタンパク質からなるアミロイド斑および神経原線維変化によって特徴付けられる、進行性の神経変性疾患である。年齢はアルツハイマー病の最も重要な危険因子であり、アルツハイマー病を患う人々の数は、６５歳を越えると５年ごとに２倍になる。疾患が進行するにつれて、脳のニューロン間の情報交換が破壊される。早期では、短期記憶が衰え始める。時間が経過すると、アルツハイマー病は、認知、人格および機能能力を破壊する。アルツハイマー病は、高齢者における最も一般的な認知症の原因である。認知症は、日常の機能を妨げるのに十分深刻な精神機能の損失である。

２つの基本型のアルツハイマー病が存在し、早期発症型アルツハイマー病は６５歳より下の人々を襲う傾向があり、家族内発症の可能性が高い。より一般的な型の遅発型アルツハイマー病は、通常、６５歳よりも上の人々が罹患する。アルツハイマー病の病理学的根拠はまだ分かっていないが、研究者によりいくらか前進している。示唆されている疾患のメカニズムには、脳低灌流、炎症、遺伝子多型性、および脳の分子病変が含まれる。血管内皮細胞は、アルツハイマー病の進行性の皮質ニューロン破壊において中心的な役割を果たすことが推測される。

アルツハイマー病において、脳の内皮は、β−アミロイド斑の前駆基質および皮質ニューロンを選択的に殺す神経毒性のあるペプチドを分泌する。内皮細胞の大部分は、脳低酸素症および炎症による血管新生によって活性化される。疫学的な研究の結果によって、非ステロイド系抗炎症薬、スタチン、ヒスタミンＨ２受容体遮断薬、またはカルシウムチャネル遮断薬の長期使用はアルツハイマー病に効果があることが示された。この効果は、大部分は、これらの薬剤の血管新生を阻害する能力によるものであろう。研究によって、アルツハイマー病は血管新生依存性障害であることが実証されている（Ｖａｇｎｕｃｃｉら、アルツハイマー病および血管新生、Ｌａｎｃｅｔ、３６１（９３５７）：６０５−６０８頁、２００３年２月１５日）。さらに、機能障害性大脳脈管構造の結果としての血管新生は、アルツハイマー病の過程の病因（ｅｔｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）に対する結果および寄与因子の両方であり得る（Ｐｏｇｕｅら、アルツハイマー病における血管新生シグナル伝達、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、１５（９）：１５０７−１５１０頁、２００４年６月２８日）。

従って、必要とされているのは、異常な血管新生を特徴とするアルツハイマー病および他の疾患の治療において有効な組成物および方法である。さらに、必要とされるのは、好ましくは経口的に簡単で容易に投与される、赤血球のＰ_５０値の著しい右方移動を引き起こすことができる組成物である。

本発明は、異常な血管新生を特徴とする疾患の治療において有効なイノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）を含む組成物を提供する。また本発明は、腫瘍を含む組織への酸素の制御された到達を増大するためのＩＴＰＰの使用方法も提供する。例えば、ヒトまたは動物の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の調節は、赤血球に入れられたＩＴＰＰを用いて作用させることができ、その結果、循環赤血球の酸素に対する親和性が低下される。ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現、タンパク質濃度、および腫瘍細胞増殖に対するＩＴＰＰの効果は、本発明によって可能である。また、インビトロおよびインビボの両方におけるＶＥＧＦ発現の制御方法も、ＩＴＰＰを用いて開発された。

本発明はさらに、赤血球中のＩＴＰＰを用いて酸素を固形腫瘍に到達し、血管新生を阻害し、低酸素性腫瘍の放射線感受性を増強するための組成物および方法を含む。本発明はさらに、低酸素性腫瘍においてＰＯ_２を増強するためのＩＴＰＰの使用に関する。ヘモグロビンのアロステリックエフェクターであるＩＴＰＰは、酸素に対するヘモグロビンの親和性を低下させることができ、ヘモグロビンによる酸素の放出を高める。細胞の要求があれば、ＩＴＰＰは、腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ発現を阻害し、その結果血管新生を阻害する。

本発明はさらに、赤血球中のＩＴＰＰを使用してアルツハイマー病を治療するための組成物および方法を含む。

本明細書において定義されるような望ましくない血管新生または望ましくない血管新生を特徴とする疾患には、内皮細胞の過剰または異常な刺激（例えば、アテローム硬化症）、血液由来の腫瘍、固形腫瘍および腫瘍転移、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍、例えばアルツハイマー病、異常創傷治癒、炎症性障害および免疫異常などの血管機能不全および障害、ベーチェット病、痛風または痛風関節炎、例えば未熟児網膜症（水晶体後線維増殖症）、黄斑変性症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障およびオスラーウェーバー症候群（オスラー−ウェーバー−ランデュ病）などの糖尿病性網膜症および他の眼血管新生疾患が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって治療することができる癌には、乳癌、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）癌、腎細胞癌、脳腫瘍、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、膵癌、胃癌、食道癌、皮膚黒色腫、肝癌、肺癌、精巣癌、腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、リンパ腫、副甲状腺癌、陰茎癌、直腸癌、小腸癌、甲状腺癌、子宮癌、ホジキンリンパ腫、口唇および口腔癌、皮膚癌、白血病または多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の目的は、癌ならびに他の血管新生の病状および状態を治療するための、組成物および方法を提供することである。

本発明の別の目的は、低酸素性腫瘍への酸素到達を増強するための、組成物および方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、血管新生を阻害するための、組成物および方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、低酸素性腫瘍の放射線感受性を増強するための、組成物および方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、低酸素性腫瘍および疾患を治療する組成物および方法を提供することである。

本発明の別の目的は、組織内、特に腫瘍内の酸素分圧を制御することができる、組成物および方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病を治療するための、組成物および方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、好ましくは経口的に簡単で容易に投与される、赤血球のＰ_５０値の著しい右方移動を引き起こすことができる組成物を提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示される実施形態の以下の詳細な説明の再検討の後に明らかになるであろう。

本発明に従って有用である組成物は、イノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）（図１）と、ＩＴＰＰのＮａ、Ｃａ、ＮＨ_４塩のようなＩＴＰＰの塩とを含み、これらは抗血管新生特性および抗腫瘍特性を示し、血管新生関連または増殖関連の事象、状態また物質の制御において有用である。本明細書において使用される場合、血管新生関連または増殖関連の事象、状態または物質の制御とは、血管新生または増殖に関連するかもしれないかあるいは関連すると考えられる任意の種類の因子、状態、活性、指標、化学物質または化学物質の組み合わせ、ｍＲＮＡ、受容体、マーカー、メディエータ、タンパク質、転写活性などにおける定性的または定量的な変化を指し、本発明の組成物の投与に起因する。当業者は、本発明が、記載される特徴を有する特許請求の範囲内の他の組成物または化合物にまで及ぶことを認識するであろう。これらの特徴は、下記および他に文献で詳述されるアッセイを用いて、それぞれの試験化合物について決定することができる。

その他のこのようなアッセイには、組織培養プレート内の細胞の計数、または代謝アッセイによる細胞数の評価、または標識（放射化学的に、例えば^３Ｈ−チミジン、または蛍光標識された）または免疫反応性（ＢｒｄＵ）ヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みが含まれる。さらに、抗血管新生活性は、ラット大動脈輪などのエキソビボモデルにおいて、内皮細胞遊走、内皮細胞細管形成、または血管成長により評価され得る。

経口投与される場合、ＩＴＰＰは抗腫瘍および抗増殖活性を示し、毒性はほとんどまたは全くない。Ｐ_５０値（ヘモグロビンの５０％飽和におけるＰ_５０）の移動として測定されるヘモグロビンのＯ_２−親和性の低下を誘発するその能力についてＩＴＰＰを試験した。マウスのヘモグロビンおよび全血について、ヘモグロビンでは２５０％まで、全血では４０％までのより高いＰＯ_２へのＰ_５０の移動が観察された。

マウスおよびブタにおいてＩＴＰＰで得られた結果は、血流障害の場合に赤血球による酸素到達を制御された方法で増強する能力により、治療法としての開発の可能性を強く示唆する。

ＩＴＰＰは、経口、静脈内、または腹腔内で投与されると、腫瘍の形成においてＰＯ_２を高めることによって、成長腫瘍の血管新生を阻害する。本発明はさらに、ヒトまたは動物に有効量のＩＴＰＰを投与することによって、ヒトまたは動物の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を制御する方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＬＬＣ細胞株のＶＥＧＦｍＲＮＡおよびタンパク質発現に対するＩＴＰＰの用量依存性の効果を提供する。腫瘍のあるＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＥＧＦ遺伝子発現を測定し、ＶＥＧＦのＩＴＰＰ誘発性の下方制御の効果を決定し、細胞増殖の調節と関連付けた。本発明は、ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現、タンパク質濃度、および腫瘍細胞増殖を制御する方法の開発をもたらす。これらの研究の結果によって、ＶＥＧＦの用量依存性のＩＴＰＰ誘発性下方制御と細胞増殖との間の強い相関関係が示され、ＶＥＧＦに仲介される腫瘍血管新生、および腫瘍細胞増殖速度をＩＴＰＰが低減できることが示唆される。従って、ＩＴＰＰによるＶＥＧＦの下方制御は、腫瘍細胞増殖を低減する。

より高いＯ_２分圧へのＰ_５０値の移動は、腫瘍内でＶＥＧＦをコードする低酸素遺伝子の発現を阻害する。ＶＥＧＦをコードする低酸素遺伝子の発現は、腫瘍内で血管新生が刺激されるために必要である。これが起こらないと、血管新生は著しく阻害され、新しい血管は腫瘍内に形成されない。

腫瘍内の酸素分圧の上昇はこの低酸素遺伝子の発現阻害の原因であるため、ＶＥＧＦ発現に関して得られた結果は、ＩＴＰＰを投与すると腫瘍内の酸素分圧が上昇することを示唆する。この観察は非常に重要な問題、すなわちこのＰＯ_２増強が癌細胞の強力な放射線増感剤として作用し得ないかどうかという問題を提起する。酸素は非常に強力な放射線増感剤であり、実際に腫瘍内のＰＯ_２がＩＴＰＰによって増強される場合、これは癌の放射線療法の効力を高める際に重要な結果をもたらし得る。

ＩＴＰＰは、一方では血管新生の阻害薬として、そして他方では放射線増感剤として、固形腫瘍の治療において潜在的に重要な補助剤である。

アルツハイマー病は、血管内皮細胞が進行性の皮質ニューロン破壊において中心的な役割を果たすという仮説の下で、血管新生と関連している。本発明は、ＩＴＰＰ誘発性の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および細胞増殖の下方制御を提供し、ＩＴＰＰがＶＥＧＦ仲介のアルツハイマー病を低減できることを示唆する。本発明は、ヒトまたは動物に有効量のＩＴＰＰを投与することによってヒトまたは動物においてＶＥＧＦを制御することを意図する。本発明は、ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現、タンパク質濃度、および内皮細胞増殖を制御するための方法の開発をもたらした。

軽度から中等度のアルツハイマー病の患者では、内側側頭部の酸素代謝が著しく影響を受けることが知られている。この尺度は、アルツハイマー病における内側側頭部領域の機能障害を立証した。また、アルツハイマー病であることが示されている患者では、内側側頭部ならびに頭頂部および側頭部皮質における平均酸素代謝が、アルツハイマー病を患っていない対照群よりも著しく低いことも知られている（参照によってその全体が本明細書に援用されるＩｓｈｉｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３７（７）：１１５９−６５頁、１９９６年７月を参照）。従って、アルツハイマー病であることが示されている患者を治療する１つの可能性のある手段は、血液脳関門を通る酸素を増大させることである。そのようにする１つの方法は、ＩＴＰＰによる治療などのヘモグロビンのアロステリックエフェクターを使用することであろう。

またＩＴＰＰの使用は、様々な形態の認知症に関連する様々な血管性疾患の治療にも役立ち得る。脳は、酸素を含む血液を脳にもたらす血管網に依存しているので、脳への酸素供給が不足すると脳細胞は死ぬ可能性があり、これによって血管性認知症の症候が生じ得る。これらの症候は、突然おこる卒中に続いて、あるいは一連の小さな卒中によって時間が経過してから起こり得る。従って、種々の形態の認知症に関連する血管性疾患を有する患者を治療する１つの可能性のある手段は、血液脳関門を通るような患部で利用可能な酸素を増大させることである。このようにする１つの方法は、ＩＴＰＰによる治療などのヘモグロビンのアロステリックエフェクターを使用することであろう。

さらに、ヘモグロビンのアロステリックエフェクターによる個体の治療は、脳卒中の犠牲者および骨粗鬆症の両方に有益な効果を与え得る。脳卒中および骨が弱くなる疾患である骨粗鬆症は通常２つの別個の健康上の問題として考えられるが、これらの間には関連があり得ることが分かった。脳卒中を乗り越えた患者は、骨折の危険性を高くする疾患である骨粗鬆症を患う可能性が非常に高い。多くの場合、脳卒中患者の骨折は、脳卒中で麻痺した体の側面で起こる。

脳卒中は、血液および酸素の脳への供給が停止または大幅に減少した場合に起こることが知られている。脳の一部に栄養物が豊富な血液および酸素の供給がなければ、脳のその部分によって制御される身体機能（視覚、言語、歩行など）が損なわれる。米国では毎年５００，０００人以上の人々が脳卒中を患い、このうち１５０，０００人が結果として死亡する。脳への酸素流量を増大させる１つの手段は、ＩＴＰＰによる治療などのヘモグロビンのアロステリックエフェクターの使用による。従って、脳卒中または骨粗鬆症を潜在的に患う可能性のある個人の潜在的な治療方法は、例えばＩＴＰＰを用いる個人の治療である。

また、ＩＴＰＰの化合物または薬剤またはそのプロドラッグで構成される埋込錠または他のデバイス（ここで、薬剤またはプロドラッグは、持続放出のために生分解性または非生分解性ポリマー中に処方される）も本発明によって意図される。非生分解性ポリマーは、ポリマー自体が分解することなく物理的または機械的な処理を通して制御された形で薬剤を放出する。生分解性ポリマーは体内の自然の過程で徐々に加水分解または可溶化されるように設計され、混合薬剤またはプロドラッグを徐々に放出することが可能になる。薬剤またはプロドラッグは、ポリマーに化学的に結合させることもでき、あるいは混合によってポリマー内に取り込ませることもできる。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーの両方、ならびに薬剤が制御放出のためにポリマー内に取り込まれる過程は当業者によく知られている。このようなポリマーの例は、Ｂｒｅｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７４：４４１−４４６頁（１９９１年）などの多くの参考文献において見出すことができる。これらの埋込錠またはデバイスは、到達が所望されるところの近く、例えば腫瘍部位に埋め込むことができる。

本発明の化合物に加えて、本発明の医薬組成物は、上記で言及した１つまたは複数の病状の治療において、１つまたは複数の価値のある薬剤も含む、あるいは同時投与する（同時に、または順次）ことができる。

当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１７版などの標準テキストを参照することによって、製剤がどのようにして製造され、これらがどのようにして投与され得るかを決定できるであろう。

本発明のさらなる態様では、血管新生もしくは加速された細胞分裂または炎症に関連する状態の、予防または治療のための薬剤を調製するための、本発明に係るＩＴＰＰの化合物またはそのプロドラッグの使用が提供される。

別の実施形態では、本発明の組成物は、有効量のＩＴＰＰの到達によって、アルツハイマー病、脳卒中、および／または骨粗鬆症のいずれかを治療するために使用することができる。

本発明のさらなる態様では、医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と一緒に、本発明に係るＩＴＰＰの化合物またはそのプロドラッグを含む医薬組成物が提供される。

この医薬組成物は、血管新生もしくは加速された細胞分裂または炎症に関連する状態の、予防または治療のために使用され得る。

また本発明のさらなる態様では、血管新生、あるいは細胞分裂肥大性成長または炎症の加速または増大された量に関連する状態の予防または治療方法が提供され、前記方法は、このような予防または治療を必要としている患者に、本明細書中に記載されるような本発明に係る有効量のＩＴＰＰの化合物またはそのプロドラッグを投与することを含む。前記状態の予防または治療が前記状態の改善を含むことは理解されるべきである。

「有効量」とは、治療的または予防的に有効な量を意味する。このような量は、治療すべき状態、投与経路および他の関連因子を考慮して、適切な当業者によって容易に決定することができる。このような人は、投与の適切な用量、モードおよび頻度を容易に決定することができるであろう。

上記で記載された組成物は、既知の技術を用いて生理学的に許容可能な製剤として提供することができ、これらの製剤は標準経路によって投与することができる。通常、局所、経口、直腸、腹腔内または非経口（例えば、静脈内、皮下または筋肉内）経路によって、組み合わせを投与することができる。加えて、組み合わせをポリマー内に取り込んで持続放出を可能にすることができ、このポリマーは、到達が所望されるところの近く、例えば腫瘍部位に埋め込まれている。組成物の投与量は、治療される状態、使用される特定の誘導体、ならびに患者の体重および状態や化合物の投与経路などの他の臨床的因子に依存し得る。しかしながら、経口投与の場合、推奨される投与量は０．１〜５．０ｇ／ｋｇ／日の範囲である。経口投与の好ましい投与量は、０．５〜２．０ｇ／ｋｇ／日の範囲である。経口投与の特に好ましい投与量は、０．８０〜１．０ｇ／ｋｇ／日の範囲である。

本発明に係る製剤は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス投与、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与することができる。

製剤には、経口、直腸、経鼻、吸入、局所（皮膚、経皮、口腔および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、眼内、気管内、および硬膜外を含む）または吸入による投与に適したものが含まれる。製剤は、都合よく単位剤形で与えることができ、そして従来の製薬技術によって調製することができる。このような技術は、活性成分および医薬品キャリアまたは賦形剤とを調合するステップを含む。通常、製剤は、活性成分と、液体キャリアまたは微粉化した固体キャリアもしくは両方とを均一および密接に調合し、次に必要に応じて、製品を成形することによって調製される。

経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤または錠剤などの所定量の活性成分をそれぞれが含む個別の単位として、粉末または顆粒として、水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンなどとして与えることができる。

錠剤は、任意で１つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と任意で混合された粉末または顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤に浸した粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意で、被覆されたり刻み目がつけられたりしてもよく、その中の活性成分の遅延または制御放出を提供するように処方され得る。

口腔内の局所投与に適した製剤には、フレーバーベースの成分、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジと、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性ベースの活性成分を含む香錠と、適切な液体キャリア中で投与される成分を含む口腔洗浄薬とが含まれる。

皮膚への局所投与に適した製剤は、医薬的に許容可能なキャリア中に投与すべき成分を含む軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストとして与えることができる。好ましい局所到達系は、投与すべき成分を含む経皮パッチである。

直腸投与のための製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチレートを含む適切な基剤を有する坐薬として与えることができる。

キャリアが固体である経鼻投与に適した製剤は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み、これは、嗅ぎ薬が摂取されるような方法、すなわち鼻に接近して保持された粉末の容器から鼻腔を通る急速な吸入によって投与される。例えば経鼻スプレーまたは経鼻ドロップとして投与するためのキャリアが液体である適切な製剤は、活性成分の水性または油性溶液を含む。

膣内投与に適した製剤は、活性成分に加えて当該技術分野において適切であることが分かっているキャリアなどの成分を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として与えることができる。

吸入に適した製剤は、活性成分に加えて当該技術分野において適切であることが分かっているキャリアなどの成分を含むミスト、ダスト、粉末またはスプレー製剤として与えることができる。

非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および意図されるレシピエントの血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液と、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液とが含まれる。製剤は単位用量また多用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供され、使用の直前に注射のための無菌液体キャリア、例えば水の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即座の注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。

好ましい単位投与量の製剤は、本明細書において上記で記載されるような、投与成分の１日の用量または単位、１日の副用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適切な画分を含むものである。

成分、特に上記の成分に加えて、本発明の製剤が、問題の製剤の種類を考慮して当該技術分野における従来の他の薬剤も含み得ることは理解されるべきであり、例えば、経口投与に適した製剤は香味料を含んでもよい。

インビトロの実験では、ＩＴＰＰを脱イオン水中に溶解し、ｐＨをｐＨ７に調整し、全血とのインキュベーションのために、ＩＴＰＰ溶液の重量オスモル濃度をグルコースにより２７０〜２９７ｍＯｓＭに調整した。ＨＥＭＯＸアナライザー（ＰＤ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ、ロンドン）を用いて、ヘモグロビンとＩＴＰＰとの混合物を直ちに測定した。赤血球をＩＴＰＰと共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−緩衝液（ＰＨ＝７．０）で３回洗浄してから、Ｐ_５０測定のために使用した。

ＩＴＰＰを経口投与するインビボで行われた実験では、循環ＲＢＣのＰ_５０値の著しい移動が観察された。ＩＴＰＰを２０ｇ／Ｌの濃度（＝２７ｍＭ、ｐＨ約７．０）で飲料水中に溶解し、随意に飲用のために提供した。

以下の実施例は本発明を説明するが限定はしない。従って、変更が行われることもあり、それらも本発明の趣旨の範囲内であるという理解と共に実施例は提供される。

実施例１：マウス（経口投与）において誘発されたＯ_２−ヘモグロビン解離曲線（ＯＤＣ）の右方移動
１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＴＰＰ−溶液（２０ｇ／Ｌ濃度＝２７ｍＭ、ｐＨ約７．０）を４日間与えた（２４時間あたり２５ｍｌまで）。３匹の対照マウスには純水を飲ませ、４匹の対照マウスにはｍｙｏ−イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）の溶液を与えた（ＩＴＰＰと同じ濃度およびｐＨ）。０日目（処置の開始前）、そして１、２、４、６、７、８、１０、１１および１２日目（処置の開始後）に、Ｐ_５０値を測定するために全てのマウスから血液を採取した。

結果
ＩＴＰＰはマウスによって拒絶されず、動物に対して有害ではなかった。

ＩＴＰＰの経口適用は、マウスにおいてＰ_５０の著しい右方移動を引き起こした（３１％まで）。

ＩＴＰＰは、２７ｍＭの濃度で経口投与されると、マウスの循環赤血球においてＰ_５０値の右方移動を引き起こす（図２）。最大移動に達する前に約４８時間の時間差がある。最大のＰ_５０移動は、ＩＴＰＰの経口投与の開始後２日目〜４日目の間に達成される。１２日後には、Ｐ_５０値は、４日目に摂取を止めたときの対照値まで戻る。赤血球の数に対してＩＴＰＰ摂取の著しい効果がある。理論に束縛されることを望まないが、赤血球の数に対するＩＴＰＰ摂取の効果（赤血球新生の下方制御）は、増大したＰ_５０によるものであると考えられる。赤血球の溶解はインビトロでは決して生じないので、溶血は除外することができる。マウスにおけるＩＴＰＰの経口適用後、ナトリウムおよびカリウムおよびカルシウムなどのイオンのレベルは正常であった（図３）。図３は、ＩＴＰＰ（４マウス）、ＩＨＰ（３マウス）または水（３マウス）を飲ませ始めてから０、７および１１日目に得られたナトリウム、カリウムおよびカルシウムの血清濃度の平均値およびＳＤを含む。

０、７および１１日目に全てのマウスから血球数を測定した。ＩＴＰＰを摂取したマウスの赤血球の数は低下した。異なるグループのマウスからの血液中の白血球（例えば、顆粒球、マクロファージなど）の数にはあまり差はなかった。図４は、対照と比較してＯＤＣが移動したマウスのＲＢＣ数を示す。図４はさらに、ＩＴＰＰを与えたマウスにおいて、赤血球の数／ｍｍ^３に対するＰ_５０の移動［％］の関係を示す。予備データに基づいて、赤血球の数とそのＰ_５０値の移動との間には反比例の関係が存在すると思われる。ＩＴＰＰの摂取の１２日後にΔＰ_５０が０％になったら、赤血球数の基底値が回復される。

実施例２：マウス（腹腔内注射）において誘発されるＯＤＣの右方移動
ＩＴＰＰ（ｐＨ７、２００μｌ）をマウスの腹腔内に注射すると、循環赤血球のＰ_５０値は、２３％まで移動した。図５は、１５０ｍＭの濃度までマウスがＩＴＰＰに十分に耐容性を示したことを実証する。腹腔内注射後のナトリウム、カリウムおよびカルシウムなどのイオンレベルは正常であった。６匹のマウスのそれぞれに、４５〜１５０ｍＭ（＝０．１７〜０．８８ｇ／ｋｇ体重）のＩＴＰＰを腹腔内注射した。％移動の平均および標準偏差は図５に示される。

ＩＴＰＰによって誘発されるＰ_５０移動の濃度依存性は、この化合物が赤血球の細胞膜を通るという付加的な表示である。

実施例３：子ブタ（静脈内注射）において誘発されるＯＣＤの右方移動
子ブタにもＩＴＰＰを静脈内（ＩＶ）注射した。体重１ｋｇあたり１ｇの用量で化合物を注入したときのＰ_５０の右方移動を観察した。

ＩＴＰＰの可能性のある副作用を調査するために、注射した子ブタの血清中のカルシウムのレベルを決定した。動物の血液中のＣａ^２＋濃度の大きな低下は、注入の直後に、３つの解離したリン酸基を有するＩＴＰＰはＣａ^２＋と結合し、従って血液中の自由イオンとしてのその有効性を低減するという可能性を示した。注入の翌日、子ブタの血液中のＣａ^２＋の濃度は正常値まで回復した。結果は、表１に示される。

この観察に基づいて、ＩＴＰＰ溶液と共にＣａＣｌ_２（ＩＴＰＰと等モル）溶液を注射した結果、ＩＴＰＰの解離したリン酸基は飽和した。以前に観察された副作用はどれも生じなかった。カルシウムレベルは一定のままであり、この場合も、Ｐ_５０移動は基底値の約２０％であった。他のイオンのナトリウムおよびカリウムのレベルは、子ブタのＩＴＰＰの静脈内注射の後も変わらなかった。

実施例４:ＩＴＰＰによるヘモグロビンのＯ_２親和性のインビボでの低下が、腫瘍内ＰＯ_２、血管新生およびＶＥＧＦｍＲＮＡの発現に与える効果
ＩＴＰＰは、経口、静脈内、または腹腔内に投与すると、形成中の腫瘍のＰＯ_２を高めることによって腫瘍の成長における血管新生を阻害する。Ｐ_５０値が対照値よりも上に少なくとも２０％の移動を示すまで、３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに２０ｇ／ＬのＩＴＰＰを経口的に与えた。次に、全ての動物に、背側腔に注射された１×１０^６ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を与えた。異なる時点で、両方のグループのマウスにおいて成長する腫瘍のＲＴ−ＰＣＲによってＶＥＧＦｍＲＮＡをアッセイした。

ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１％のＮｏｎｉｄｅｔ ｐ−４０洗剤、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）中で腫瘍組織サンプルを粉砕し、プロテアーゼ阻害薬混合物（Ｒｏｃｈｅ、スイス国ライナハ）を補充した。遠心分離（１０分、４℃および１２，０００ｇ）の後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従って、組織抽出物のタンパク質濃度を決定した。洗剤溶解性のタンパク質サンプル（１０ｍｇ）を１０％アクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサイズで分離し、ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ ＢＡ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、独国ダッセル）に移した。０．１％のＴｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の１０％スキムミルクにおいて膜を室温で３時間遮断した後、ヒト、マウスおよびラット血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ Ａ−２０、ｓｃ−１５２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）を認識するウサギポリクローナル抗体と共に、１：２００の希釈で、４℃で一晩インキュベーションを行った。次に、抗ウサギ（１：１６，０００）ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ’Ｉｓｌｅ ｄ’Ａｂｅａｕ Ｃｈｅｓｎｅｓ、仏国）により、一次抗体について膜を室温で６０分間プローブした。得られた複合体を、増強化学発光オートラジオグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、仏国オルセー）によって可視化した。

両方のグループにおいてＶＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡのレベルに差があった。図６は、対照動物およびＩＴＰＰを飲んだ動物からの腫瘍内のＶＥＧＦｍＲＮＡ濃度を示すアガロースゲルを示す。腫瘍組織からのＶＥＧＦｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアガロースゲルアッセイは、ＬＬＣ細胞の接種の１５日後（トラック１：対照、トラック２：ＩＴＰＰ処置動物）および接種の３０日後（トラック３：対照動物、トラック４：ＩＴＰＰ処置動物）にそれぞれ２匹のマウスから取った。図７は、対照およびＩＴＰＰ処置ＬＬＣ腫瘍含有動物の腫瘍内で発現したＶＥＧＦのウエスタンブロットアッセイを示す。

ゲルアッセイの定量化は、９日目にＩＴＰＰを与えた動物の腫瘍において検出されたＶＥＧＦｍＲＮＡの量の１０，０００倍の低下を示し、その後、処置動物と非処置動物の間に差は残るが、これらは低下する傾向にある。これによって、循環赤血球によって取り込まれるＩＴＰＰは腫瘍ＰＯ_２を大幅に増大させることが示される。

特定の組成物、検出方法、および活性源、ならびに有効性の提案などを参照して本発明を説明したが、このような例示的な実施形態または機構による本発明の限定が意図されないこと、そして特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく変更が成され得ることは当業者には明らかであろう。このような明らかな変更および変化が全て、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。特許請求の範囲は、文脈上特に矛盾を示さない限りは、そこで意図される目的を満たすのに有効である任意の順序の特許請求された成分およびステップに及ぶことを意味する。

参考文献

イノシトール−トリピロリン酸（ＩＴＰＰ）の化学構造を示す。 対照動物において著しいＰ_５０移動がないことと共に、ＩＴＰＰを４日間摂取しているマウスにおいて誘発されたＯ_２−ヘモグロビン解離曲線（ＯＤＣ）の右方移動の経時変化を示す。 ナトリウムおよびカリウムおよびカルシウムなどのイオンのレベルが、マウスにおけるＩＴＰＰの経口適用後に正常であったことを示す。 ＩＴＰＰを与えたマウスにおける赤血球の数／ｍｍ^３に対するＰ_５０移動［％］の関係を示す。 ２００μｌの４５〜１２０ｍＭのＩＴＰＰ溶液（＝０．１７〜０．８８ｇのＩＴＰＰ／ｋｇ体重）が腹腔内注射されたマウスにおけるＩＴＰＰの用量効果曲線を示す。 対照動物およびＩＴＰＰを飲んだ動物からの腫瘍内のＶＥＧＦｍＲＮＡ濃度を示すアガロースゲルを示す。 対照およびＩＴＰＰ処置したルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍含有動物からの腫瘍内の発現ＶＥＧＦのウエスタンブロットアッセイを示す。

Claims (30)

1. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物の癌の治療方法。
2. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、血管新生の効果を阻害するために、１日の用量、１日の副用量、またはその適切な画分でヒトまたは動物に対して行われる請求項１に記載の方法。
3. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、口腔、直腸、膣、経鼻または吸入である請求項１に記載の方法。
4. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、液体キャリア、溶質、懸濁剤、増粘剤、香味料、ゼラチン、グリセリン、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物中で投与される請求項１に記載の方法。
5. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス投与、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１に記載の方法。
6. 前記血管新生が、血管新生依存性癌に関連する請求項１に記載の方法。
7. 前記癌が、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌、脳腫瘍、卵巣癌、結腸癌、膀胱癌、膵癌、胃癌、食道癌、皮膚黒色腫、肝癌、肺癌、精巣癌、腎癌、膀胱癌、子宮頸癌、リンパ腫、副甲状腺癌、陰茎癌、直腸癌、小腸癌、甲状腺癌、子宮癌、ホジキンリンパ腫、口唇および口腔癌、皮膚癌、白血病または多発性骨髄腫から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、低酸素性腫瘍への酸素到達の増強方法。
9. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、１日の用量、１日の副用量、またはその適切な画分で前記ヒトまたは動物に対して行われる請求項８に記載の方法。
10. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、口腔、直腸、膣、経鼻または吸入である請求項８に記載の方法。
11. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、液体キャリア、溶質、懸濁剤、増粘剤、香味料、ゼラチン、グリセリン、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物中で投与される請求項８に記載の方法。
12. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス投与、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項８に記載の方法。
13. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、腫瘍もしくは前記ヒトまたは動物内の腫瘍の放射線感受性の増強方法。
14. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、血管新生の効果を阻害するために、１日の用量、１日の副用量、またはその適切な画分で前記ヒトまたは動物に対して行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、口腔、直腸、膣、経鼻または吸入である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、液体キャリア、溶質、懸濁剤、増粘剤、香味料、ゼラチン、グリセリン、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物中で投与される、請求項１３に記載の方法。
17. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス投与、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１３に記載の方法。
18. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、低酸素性腫瘍内のＰＯ_２の増強方法。
19. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、１日の用量、１日の副用量、またはその適切な画分で前記ヒトまたは動物に対して行われる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、口腔、直腸、膣、経鼻または吸入である、請求項１８に記載の方法。
21. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、液体キャリア、溶質、懸濁剤、増粘剤、香味料、ゼラチン、グリセリン、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物中で投与される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス投与、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与される、請求項１８に記載の方法。
23. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、前記ヒトまたは動物の赤血球中の酸素に対するヘモグロビンの親和性を低下させる方法。
24. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、１日の用量、１日の副用量、またはその適切な画分で前記ヒトまたは動物に対して行われる、請求項２３に記載の方法。
25. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸の投与が、経口、非経口、経皮、局所、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、点眼、硬膜外、気管内、舌下、口腔、直腸、膣、経鼻または吸入である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、液体キャリア、溶質、懸濁剤、増粘剤、香味料、ゼラチン、グリセリン、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤、生分解性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせから選択される添加剤を含む組成物中で投与される請求項２３に記載の方法。
27. 前記有効量のイノシトール−トリピロリン酸が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、ペッサリー、顆粒、ボーラス、口腔洗浄薬、または経皮パッチの形態で投与される請求項２３に記載の方法。
28. イノシトール−トリピロリン酸と、医薬的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む医薬品。
29. 有効量のイノシトール−トリピロリン酸をヒトまたは動物に投与することを含む、前記ヒトまたは動物のアルツハイマー病の治療方法。
30. 有効量のイノシトールトリピロリン酸を個体に投与することを含む、脳卒中または骨粗鬆症の治療方法。

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