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JP2009229468A - デジタルアッセイ - Google Patents

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JP2009229468A
JP2009229468A JP2009124765A JP2009124765A JP2009229468A JP 2009229468 A JP2009229468 A JP 2009229468A JP 2009124765 A JP2009124765 A JP 2009124765A JP 2009124765 A JP2009124765 A JP 2009124765A JP 2009229468 A JP2009229468 A JP 2009229468A
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Kai Qin Lao
チン ラオ カイ
Mark Reed
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Abstract

【課題】本発明の目的は、サンプル中の標的の検出のための方法および組成物を提供することである。
【解決手段】本発明は、標的を定量するための方法であって、該方法は、以下：該標的をおそらく含むサンプル；コード化可能標識；１つ以上の標的特異的プローブ；および分離部分、を含む反応混合物を形成する工程であって、ここで、各標的特異的プローブは、選択的結合条件下で該標的に特異的に結合する、工程；該標的が存在する場合に検出可能な複合体が生じるような反応条件下で該反応混合物を処理する工程であって、該検出可能な複合体は、該コード化可能標識、該標的特異的プローブおよび該分離部分を含む、工程；ならびにコード化可能標識の数を計数することによって、該標的を定量する工程、を包含する。本発明により、上記課題が解決される。
【選択図】なし

Description

（優先日）
本願は、米国仮出願番号６０／３３２，５１９（２００１年１１月２１日出願）、および米国仮出願番号６０／３８４，７３１（２００２年５月３１日出願）の優先権の利益を主張する。出願番号６０／３３２，５１９および出願番号６０／３８４，７３１は、任意の目的についてそれらの全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、サンプル中の標的の検出のための方法および組成物に関する。
（背景）
１つ以上の標的配列を含むサンプル中の１つ以上の標的配列の存在または非存在の検出は、一般に実施されている。例えば、癌および多くの感染性の疾患（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎）の検出は、診断特徴的な核酸配列の存在または非存在について、生物学的サンプルをスクリーニングする工程を通常包含する。また、核酸配列の存在または非存在の検出は、法医学、親子鑑定、遺伝学カウンセリング、および臓器移植において、しばしば用いられる。
（発明の要旨）
ある実施形態において、標的を定量する方法が提供される。ある実施形態において、この方法は、以下：標的をおそらく含むサンプル；コード化可能標識；各々の標的特異的プローブが、選択的結合条件下で標的に特異的に結合する、１つ以上の標的特異的プローブ；および分離部分、を含む反応混合物を形成する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、標的が存在する場合は、検出可能な複合体が生成され、そして標的が存在しない場合は、検出可能な複合体が生成されないような反応条件下で、この反応混合物を処理する工程をさらに包含し、ここで、検出可能な複合体は、コード化可能標識、標的特異的プローブ、および分離部分を含む。ある実施形態において、この方法は、検出可能な複合体をコード化可能標識（検出可能な複合体に含まれない）から分離する工程、およびコード化可能標識の数を数えることによって標的を定量する工程を、さらに包含する。
ある実施形態において、少なくとも２つの異なる特定の標的を定量する方法が、提供される。ある実施形態において、これらの方法は、以下：２つ以上の異なる特定の標的をおそらく含むサンプル；各々の異なる特定の標的に対して特異的な、異なるコード化可能標識；各々の異なる特定の標的に対して特異的な選択的結合条件下で特異的に標的に結合する、１つ以上の異なる標的特異的プローブ；および分離部分を含む反応混合物、を形成する工程を包含する。ある実施形態において、この方法は、特定の標的が存在する場合は、検出可能な複合体が生成され、そして特定の標的が存在しない場合は、検出可能な複合体が生成されないような反応条件下で、反応混合物（特定の標的に対して特異的なコード化可能標識、特定の標的に対して特異的な標的特異的プローブ、および分離部分を含む）を処理する工程をさらに包含する。ある実施形態において、この方法は、検出可能な複合体中に含まれないコード化可能標識から、生成された任意の検出可能な複合体を分離する工程、および異なる特定の標的の各々に対して特異的なコード化可能標識の数を数えることによって、異なる特定の標的の各々を定量する工程をさらに包含する。
ある実施形態において、サンプル中の少なくとも２つの異なる標的核酸配列を定量する方法が提供される。ある実施形態において、この方法は、サンプルを、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々に対して特異的な異なるプローブセットと合わせて、連結反応混合物を形成する工程を包含する。ある実施形態において、各々のプローブセットは、（ａ）磁性粒子および第１標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの分離ビーズ、ならびに（ｂ）コード化可能標識、および第２標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの検出ビーズ、を含み；ここで、各セットの標的特異的プローブは、相補的な標的配列上で相互に隣接してハイブリダイズされる場合、共に連結するのに適切である。ある実施形態において、この方法は、連結反応混合物を連結反応に供する工程をさらに包含し、ここで、隣接してハイブリダイズしている相補的な標的特異的プローブは、相互に連結され、分離ビーズおよび検出ビーズを含む連結産物を形成する。ある実施形態において、この方法は、連結されていない分離ビーズおよび検出ビーズから、任意の連結産物を分離する工程を、さらに包含する。ある実施形態において、この方法は、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々を、コード化可能標識の数を数えることによって定量する工程を、さらに包含する。
ある実施形態において、サンプル中の標的核酸配列を検出するためのキットが提供される。ある実施形態において、このキットは、標的核酸配列の各々に特異的な異なるビーズセットを含む。ある実施形態において、各々の異なるビーズセットは、（ａ）磁性粒子、２以上の標識を含む第１コード化可能標識、および第１標的特異的プローブを含み、ここで、この第１コード化可能標識は、この第１標的特異的プローブに特異的である、少なくとも１つの分離ビーズ、ならびに（ｂ）２以上の標識のセットを含む第２コード化可能標識、および第２標的特異的プローブを含み、ここで、この第２コード化可能標識は、この第２標的特異的プローブに特異的である、少なくとも１つの検出ビーズ、を含み；そしてここで、第１コード化可能標識は、第２コード化可能標識とは検出可能に異なる。ある実施形態において、各々のセット中の標的特異的プローブは、相補的標的配列上で相互に隣接してハイブリダイズする場合、相互に連結するのに適切である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
標的を定量するための方法であって、該方法は、以下：
該標的をおそらく含むサンプル；コード化可能標識；１つ以上の標的特異的プローブ；および分離部分、を含む反応混合物を形成する工程であって、ここで、各標的特異的プローブは、選択的結合条件下で該標的に特異的に結合する、工程；
該標的が存在する場合に検出可能な複合体が生じるような反応条件下で該反応混合物を処理する工程であって、該検出可能な複合体は、該コード化可能標識、該標的特異的プローブおよび該分離部分を含む、工程；ならびに
コード化可能標識の数を計数することによって、該標的を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記反応混合物を処理する工程の後、かつ前記標的を定量する工程の前に、前記検出可能な複合体内に含まれないコード化可能標識から、該検出可能な複合体を分離する工程をさらに包含する、方法。
（項目３）
少なくとも２つの異なる特定の標的を定量するための方法であって、該方法は、以下の工程：
２つ以上の異なる特定の標的をおそらく含むサンプル；各異なる特定の標的に対して特異的な、異なるコード化可能標識；選択的結合条件下で、該標的に特異的に結合する、各異なる特定の標的に対して特異的な、１つ以上の異なる標的特異的プローブ；および分離部分、を含む反応混合物を形成する工程；
特定の標的が存在する場合に検出可能な複合体が生じるような反応条件下で該反応混合物を処理する工程であって、該検出可能な複合体は、該特定の標的に対して特異的なコード化可能標識、該特定の標的に対して特異的な標的特異的プローブおよび該分離部分を含む、工程；ならびに
該異なる特定の標的の各々に対して特異的なコード化可能標識の数を計数することによって、該異なる特定の標的の各々を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目４）
項目３に記載の方法であって、前記反応混合物を処理する工程の後、かつ前記異なる特定の標的の各々を定量する工程の前に、前記検出可能な複合体内に含まれないコード化可能標識から、生成された任意の検出可能な複合体を分離する工程をさらに包含する、方法。
（項目５）
サンプル中の、少なくとも２つの異なる標的核酸配列を定量するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルを、該少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々に対して特異的な異なるプローブセットと合わせて、連結反応混合物を形成する工程であって、各プローブセットは、（ａ）磁性粒子および第一の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの分離ビーズ、ならびに（ｂ）コード化可能標識および第二の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの検出ビーズ、を含み、ここで、各セット中の該標的特異的プローブは、相補的標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒に連結するのに適切である、工程；
該連結反応混合物を連結反応に供する工程であって、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的な標的特異的プローブが、互いに連結して、該分離ビーズおよび該検出ビーズを含む連結産物を形成する、工程；ならびに
各異なる標的核酸配列に対するコード化可能標識の数を計数することによって、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、前記反応混合物を処理する工程の後、かつ前記少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々を定量する工程の前に、未連結の分離ビーズおよび検出ビーズから、任意の連結産物を分離する、方法。
（項目７）
項目６に記載の方法であって、未連結の検出ビーズおよび分離ビーズから、前記連結産物を分離することが、以下の工程：
前記標的核酸配列から該連結産物を分離する工程；および
前記サンプルから該連結産物を分離する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
サンプル中の、少なくとも２つの異なる標的核酸配列を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルを、該少なくとも２つの異なる標的核酸配列の各々に対して特異的な異なるビーズセットと合わせて、連結反応混合物を形成する工程であって、各ビーズセットは、（ａ）磁性粒子、少なくとも２つの標識を含むコード化可能標識、および第一の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの分離ビーズ、ならびに（ｂ）少なくとも２つの標識を含む第二のコード化可能標識、および第二の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの検出ビーズ、を含み、ここで、該第一のコード化可能標識は、該第一標的特異的プローブに特異的にハイブリダイズし、該第二のコード化可能標識は、該第二標的特異的プローブに特異的であり、ここで、該第一のコード化可能標識は、該第二のコード化可能標識とは、検出可能に異なり；ここで、各セット中の該標的特異的プローブは、相補的標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒に連結するのに適切である、工程；
該連結反応混合物を連結反応に供する工程であって、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的な標的特異的プローブが、互いに連結して、該分離ビーズおよび該検出ビーズを含む連結産物を形成する、工程；ならびに
該検出可能な複合体を定量することによって、該サンプル中の、該少なくとも２つの異なる標的核酸配列を定量する工程、
を包含する、方法。
（項目９）
項目６〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記標的核酸配列から前記連結産物を分離することが、熱変性を含む、方法。
（項目１０）
項目９に記載の方法であって、前記標的核酸配列を定量する工程の前に、連結産物中に存在しない任意の分離ビーズを除去する工程をさらに包含する、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、前記連結産物中に存在しない任意の分離ビーズを除去する工程が、以下：
任意の分離ビーズおよび連結産物を、密度勾配に置く工程であって、該分離ビーズおよび連結産物が、異なる密度である、工程；ならびに
連結産物中に存在しない任意の分離ビーズを除去する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
項目５〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記コード化可能標識は、前記第二の標的特異的プローブに対して特異的な強度レベルを有する、方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、前記分離ビーズは、第二のコード化可能標識をさらに含み、ここで、該第二のコード化可能標識は、前記第一の標的特異的プローブに対して特異的な強度レベルを有する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、標的核酸配列に対して特異的な、前記少なくとも２つのプローブセットの各々が、同じ発光スペクトルを有するコード化可能標識を含む、方法。
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記コード化可能標識は、１つ以上の量子ドットである、方法。
（項目１６）
項目５〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記コード化可能標識が１つ以上の量子ドットであり、そして各プローブセットの前記検出ビーズが、少なくとも１，０００量子ドットを含み、ここで、該量子ドットは、該検出ビーズを異なる検出ビーズから識別可能にする所定の波長を有する、方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記分離ビーズが、少なくとも１，０００量子ドットをさらに含み、該粒子ドットは、該分離ビーズを異なる分離ビーズから識別可能にする所定の波長を有する、方法。
（項目１８）
項目５〜１４、１６および１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記サンプル中の前記少なくとも２つの標的核酸配列を定量する前記工程が、検出容器中で実施され、該検出容器は、磁気供給源の近傍の該検出容器の１つの表面上に溝を含み、ここで、前記分離ビーズは、該溝にはまり、前記検出ビーズは、該溝にはまらず、そして該磁気供給源に誘引された前記連結産物が整列される、方法。
（項目１９）
項目５〜１４および１６〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記連結反応混合物が、連結剤をさらに含む、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記連結剤がリガーゼである、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、前記連結剤が熱安定性リガーゼである、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、ＴａｑリガーゼおよびＰｆｕリガーゼのうち少なくとも１つから選択される、方法。
（項目２３）
項目５〜１４および１６〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、各分離ビーズは、各検出ビーズとは密度が異なり、その結果、連結産物中に含まれない任意の分離ビーズと連結産物との間の距離は、磁気デバイスへの該連結産物の誘引を可能にし、そして該磁気デバイスへの、連結産物中に含まれない該分離ビーズの誘引を可能にしない、方法。
（項目２４）
項目２３に記載の方法であって、前記連結産物を定量する前記工程が、前記サンプルの存在下で生じる、方法。
（項目２５）
項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記コード化可能標識が、少なくとも２つの蛍光体を含む、方法。
（項目２６）
項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記コード化可能標識が、少なくとも２つの蛍光分子を含む、方法。
（項目２７）
項目８に記載の方法であって、前記連結反応の後、かつ前記少なくとも２つの異なる標的核酸配列を定量する工程の前に、未連結の検出ビーズおよび分離ビーズから、前記検出可能な複合体を分離する工程をさらに包含する、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、未連結の検出ビーズおよび分離ビーズから、前記検出可能な複合体を分離する前記工程が、以下：
少なくとも２つの異なる標的核酸配列から、該検出可能な複合体を分離すること、および
前記サンプルから該検出可能な複合体を分離すること、
を包含する、方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記少なくとも２つの異なる標的核酸配列からの、前記検出可能な複合体の分離が、熱変性を含む、方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、前記少なくとも２つの異なる標的核酸配列を定量する前記工程の前に、検出可能な複合体中に含まれない任意の分離ビーズを除去する工程をさらに包含する、方法。
（項目３１）
項目３０に記載の方法であって、前記検出可能な複合体中に含まれない任意の分離ビーズを除去する工程が、以下：
任意の分離ビーズおよび検出可能な複合体を、密度勾配に置く工程であって、該分離ビーズおよび検出可能な複合体が、異なる密度である、工程；ならびに
検出可能な複合体中に存在しない任意の分離ビーズを除去する工程、
を包含する、方法。
（項目３２）
項目５〜１４および１６〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、前記検出ビーズが、磁性粒子をさらに含む、方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、前記サンプル中の前記少なくとも２つの標的核酸配列を定量する前記工程が、検出容器中で実施され、該検出容器は、磁気供給源の近傍の該検出容器の１つの表面上に溝を含み、ここで、該溝は、第一端部および第二端部を備え、そして該検出可能な複合体中の前記第一のコード化可能標識および前記第二のコード化可能標識は、該磁気供給源を用いて、該溝内に整列され、その結果、該検出可能な複合体の該分離ビーズは、該検出可能な複合体の該検出ビーズよりも、該第一端部に近接して整列する、方法。
（項目３４）
サンプル中の標的核酸配列を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
該標的核酸配列の各々に対して特異的な異なるビーズセットを備え、該ビーズセットは、（ａ）磁性粒子、２つ以上の標識を含む第一コード化可能標識、および第一の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの分離ビーズであって、ここで、該第一のコード化可能標識は、該第一の標的特異的プローブに対して特異的である、少なくとも１つの分離ビーズ、ならびに（ｂ）２つ以上の標識のセットを含む第二のコード化可能標識、および第二の標的特異的プローブを含む、少なくとも１つの検出ビーズであって、ここで、該第二のコード化可能標識は、該第二の標的特異的プローブに対して特異的である、少なくとも１つの検出ビーズ、を含み；ここで、該第一のコード化可能標識は、該第二のコード化可能標識とは、検出可能に異なり；そしてここで、各セット中の該標的特異的プローブは、相補的標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒に連結するのに適切である、
キット。
（項目３５）
項目３４に記載のキットであって、連結剤をさらに備える、キット。
（項目３６）
項目３５に記載のキットであって、前記連結剤がリガーゼである、キット。
（項目３７）
項目３５に記載のキットであって、前記連結剤が熱安定性リガーゼである、キット。
（項目３８）
項目３７に記載のキットであって、前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、ＴａｑリガーゼおよびＰｆｕリガーゼのうち少なくとも１つから選択される、キット。
図１は、本発明のある実施形態に従うプローブセットを示す。 図２は、本発明のある実施形態を用いて標的座中の２つの潜在的な対立遺伝子間を区別する方法を示す。図２（Ａ）は以下：（ｉ）異なる第１標的特異的プローブＡおよびＢ（中心的相補体が異なり（Ａプローブ上のＴおよびＢプローブ上のＣ）を有し、そして同じ第２標的特異的プローブＺを有する、２つの異なるプローブセット）ならびに（ｉｉ）中心的ヌクレオチドＡを含む標的配列、を示す。図２（Ｂ）は、この標的にアニールした３つの標的特異的プローブを示す。プローブＡの配列特異的部分は、中心的ヌクレオチドを含む３’標的領域と完全に相補的である。プローブＢの中心的相補体は、３’標的領域と相補的ではない。従って、プローブＢの配列特異的部分は、３’末端に塩基対ミスマッチを含む。プローブＺの配列特異的部分は、５’標的領域に完全に相補的である。図２（Ｃ）は、連結産物Ａ−Ｚを形成するための標的特異的プローブＡおよびＺの連結を示す。プローブＢおよびＺは、プローブＢ上のミスマッチの中心的相補体に起因して、共に連結されて連結産物を形成しない。図２（ｄ）は、２本鎖分子を変性して、Ａ−Ｚ連結産物ならびに非連結プローブＢおよびＺを放出する工程を示す。 図３は、ある実施形態に従う２色の標識を用いた、ある潜在的な２元コードおよび３元コードを示す。 図４は、ある実施形態に従うプローブセットと共に２色２元コードを使用する場合における、標識（コード）のセットのある組み合わせを示す。図４はまた、２つの３元色、１０の２元色、または６つの３元色が使用される場合の、ある実施形態に従う潜在的プローブセットコードの数も示す。 図５は、例示的な選択的スプライシングを示す。 図６は、スプライス改変体を検出するための、ある実施形態を示す。 図７は、第１標的特異的プローブおよび第２標的特異的プローブが、サンプル中の標的分子に対するハイブリダイゼーションの後に連結される、ある例示的な実施形態を示す。 図８は、コード化可能標識および検出可能な複合体から分離部分が分離される、ある例示的な実施形態を示す。 図９は、サンプルから分離された検出可能な複合体を検出する、ある実施形態を示す。 図１０は、分離部分が、コード化可能標識および検出可能な複合体から分離される、特定の例示的な実施形態を示す。 図１１は、連結された検出可能な複合体が、連結していないコード化可能標識から分離される、特定の例示的な実施形態を示す。 図１２は、連結された検出可能な複合体が、サンプルおよび連結反応と同じ容器内で検出される、特定の例示的な実施形態を示す。 図１３は、検出のために連結された検出可能な複合体の整列を補助するために検出容器の内側の表面に溝が含まれる、特定の例示的な実施形態を示す。 図１４（ａ）は、本発明の特定の実施形態によるプローブセットを示す。図１４（ｂ）は、本発明の特定の実施形態による、２つのプローブセット、このプローブセットの連結およびプローブセットの検出を示す。図１４（ｃ）は、本発明の特定の実施形態によるプローブセットを示す。 図１４（ａ）は、本発明の特定の実施形態によるプローブセットを示す。図１４（ｂ）は、本発明の特定の実施形態による、２つのプローブセット、このプローブセットの連結およびプローブセットの検出を示す。図１４（ｃ）は、本発明の特定の実施形態によるプローブセットを示す。 図１５は、ビーズを含む連結された検出可能な複合体、およびビーズを含まない連結産物のＴａｑｍａｎＴＭ分析からの結果を示す。 図１６は、連結反応の後に得られる検出可能な複合体の写真を示す。 図１７は、異なる濃度の標的分子において生成される、連結された検出可能な複合体のＴａｑｍａｎ解析の結果を示す。 図１８は、連続的なフローによる、磁性ビーズおよび検出可能な複合体からの対になっていない非磁性ビーズの分離、ならびにそれに続く、フローサイトメトリーによる検出可能な複合体の計数の、特定の例示的な実施形態を示す。 図１９は、連続的なフローによる、磁性ビーズおよび検出可能な複合体からの対になっていない非磁性ビーズの分離、検出可能な複合体と、対になっていない磁性ビーズとの間の抵抗の相異による、対になっていない磁性ビーズの除去、ならびにそれに続く、フローサイトメトリーによる、検出可能な複合体の計数の、特定の例示的な実施形態を示す。 図２０は、連続的なフローによる、磁性ビーズおよび検出可能な複合体からの対になっていない非磁性ビーズの分離、サイズ濾過による、対になっていない磁性ビーズの分離、およびそれに続く、フローサイトメトリーによる、検出可能な複合体の計数の、特定の例示的な実施形態を示す。 図２１は、磁性ビーズおよびビオチン被覆ビーズを使用する分離方法の特定の例示的な実施形態を示す。 図２２は、アドレス可能な部分を含むプローブを使用する連結反応の特定の例示的な実施形態を示す。 図２３は、連結産物が、ヘアピン構造を使用するビーズに付着する、特定の例示的な実施形態を示す。 図２４は、連結産物が、連結オリゴヌクレオチドを使用してビーズに付着される、特定の例示的な実施形態を示す。 図２５は、ビオチン分子を用いるオリゴヌクレオチド連結（ＯＬＡ）アッセイの特定の例示的な実施形態を示す。 図２６は、連結産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに付着されるコード化可能標識の特定の例示的な実施形態を示す。 図２７は、検出可能な複合体内に存在しないコード化可能標識から、検出可能な複合体を分離する、特定の例示的な実施形態を示す。 図２８は、管内の管を使用して検出可能な複合体内に存在しないコード化可能標識から検出可能な複合体を分離する、特定の例示的な実施形態を示す。 図２９は、連結産物にハイブリダイズおよび連結するヘアピン構造に付着されるコード化可能標識の特定の例示的な実施形態を示す。
（例示的な実施形態の詳細な説明）
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なだけであって、特許請求されるようには、本発明を限定しないことが理解されるべきである。本願において、単数形の使用は、そうでないと具体的に述べない限り、複数形を含む。本願において、「または（ｏｒ）」の使用は、そうでないと述べない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定的でない。また、用語「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」の使用は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部または部分の全部を含み得る。
本明細書中で使用される節の見出しは、組織化のみの目的のためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本願中で引用される全ての文書または文書の一部としては、特許、特許出願、論文、文献、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されず、そして任意の目的のためにその全体が参考として本明細書によって明示的に援用される。
（定義および用語）
用語「ヌクレオチド塩基」とは、本明細書中で使用される場合、置換または非置換の芳香環を指す。特定の実施形態において、この芳香環は、少なくとも１個の窒素原子を含む。特定の実施形態において、このヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基とワトソン−クリック水素結合および／またはフーグスティーン水素結合を形成可能である。例示的ヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、天然に存在するヌクレオチド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号およびＰＣＴ公開出願ＷＯ ０１／３８５８４を参照のこと）、エテノアデニン）、インドール（例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール）およびピロール（例えば、ニトロピロール）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例示的ヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５−３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎおよびその中に引用された参考文献中に、見出され得る。
用語「ヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロースおよびピラノース）およびその糖アナログのＣ−１’炭素に結合したヌクレオチド塩基を含む化合物を指す。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチドアナログも包含する。糖は、置換されていても非置換であってもよい。置換リボース糖としては、その炭素原子のうちの１つ以上（例えば、２’−炭素原子）が１つ以上の同じかまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２もしくはハロゲン基で置換されており、各Ｒは独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである、リボースが挙げられるが、これらに限定されない。例示的リボースとしては、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’連結および３’−４’連結ならびに他の「ロック（ｌｏｃｋｅｄ）」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾（例えば、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９８／２２４８９、ＷＯ９８／３９３５２；およびＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド中にある例示的ＬＮＡ糖アナログとしては、構造：
Figure 2009229468
 が挙げられるが、これらに限定されず、この構造において、Ｂは任意のヌクレオチド塩基である。
リボースの２’位または３’位での改変としては、水素、ヒドロキシ、メトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドとしては、天然Ｄ光学異性体ならびにＬ光学異性体形態が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９〜６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９〜７０を参照のこと）。ヌクレオチド塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖は、そのヌクレオチド塩基のＮ９位置に結合される。ヌクレオチド塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）である（プソイドウリジンである場合以外）場合、ペントース糖は、そのヌクレオチド塩基のＮ１位に結合され、そのペントース糖は、ウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位に結合される（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと）。
ヌクレオチドのペントース炭素のうちの１つ以上は、式：
Figure 2009229468
 を有するリン酸エステルで置換され得、この式において、αは、０〜４の整数である。特定の実施形態において、αは２であり、リン酸エステルは、ペントースの３’炭素または５’炭素に結合している。特定の実施形態において、そのヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基がプリン、７−デアザプリン、ピリミジン、またはそれらのアナログである、ヌクレオチドである。「ヌクレオチド５’三リン酸」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、時には、リボース糖の構造的特徴を特に示すために「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と示される。この三リン酸エステル基は、種々の酸素に代わるイオウ置換基（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’三リン酸）を含み得る。ヌクレオチド化学の概説について、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと。
用語「ヌクレオチドアナログ」とは、本明細書中で使用される場合、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオチドのリン酸エステルのうちの１つ以上が、その個々のアナログで置換され得る実施形態を指す。特定の実施形態において、例示的ペントース糖アナログは、上記のアナログである。特定の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上記のヌクレオチド塩基アナログである。特定の実施形態において、例示的リン酸エステルアナログとしては、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスホネートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そして関連対イオンを包含し得る。
「ヌクレオチドアナログ」の定義内にまた包含されるのは、ＤＮＡ／ＲＮＡホスホネートエステルおよび／または糖ホスホネートエステル骨格が異なる型のヌクレオチド間結合で置換されているポリヌクレオチドアナログへと重合され得る、ヌクレオチドアナログモノマーである。例示的なポリヌクレオチドアナログとしては、ポリヌクレオチドの糖リン酸骨格がペプチド骨格で置換されている、ペプチド核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、互換可能に使用され、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味し、このポリマーは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合またはヌクレオチド間アナログと、関連対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）とによって結合された、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を包含する。核酸は、デオキシリボヌクレオチドから全体が構成されても、リボヌクレオチドから全体が構成されても、またはそのキメラ混合物であってもよい。ヌクレオチドモノマー単位は、本明細書中に記載されるヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかを含み得る。核酸は、代表的には、サイズが２〜３モノマー単位（例えば、当該分野で時にオリゴヌクレオチドと呼ばれる場合には、５〜４０）から数千個のモノマーヌクレオチド単位までの範囲である。他のように示されない限り、核酸配列が示される場合はいつでも、そのヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であること、そして他のように示されない限りは、「Ａ」はデオキシアデノシンまたはそのアナログを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンまたはそのアナログを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンまたはそのアナログを示し、「Ｔ」はチミジンまたはそのアナログを示すことが、理解される。
核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片化核酸、小細胞器官（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）から得られる核酸、ならびに生物学的サンプル上またはサンプル中に存在し得る微生物またはＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られる核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸は、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合のように、１つの型の糖部分から構成されても、または例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合のように、異なる糖部分の混合物から構成されてもよい。特定の実施形態において、核酸は、以下の構造式：
Figure 2009229468
 に従うリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドであり、この式において、各Ｂは独立して、ヌクレオチドの塩基部分（例えば、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、またはアナログヌクレオチド）であり：各ｍは、個々の核酸の長さを規定し、そして０〜数千、数万、またはそれ以上の範囲であり得；各Ｒは、水素、ハロゲン、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、および−ＮＲ’’Ｒ’’を含む群より独立して選択され、ここで各Ｒ’’は独立して（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールであるか、あるいは２つの隣接するＲが一緒になって、リボース糖が２’，３’−ジデヒドロリボースであるような結合を形成し；各Ｒ’は、独立してヒドロキシルまたは
Figure 2009229468
 であり、ここでαは０、１、または２である。
上記のリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドの特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基Ｂは、上記のような糖部分のＣ１’炭素に共有結合している。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、核酸アナログ、ポリヌクレオチドアナログ、およびオリゴヌクレオチドアナログを包含し得る。用語「核酸アナログ」、「ポリヌクレオチドアナログ」、および「オリゴヌクレオチドアナログ」は互換可能に使用され、これらは本明細書中で使用される場合、少なくとも１つのヌクレオチドアナログおよび／または少なくとも１つのリン酸エステルアナログおよび／または少なくとも１つのペントース糖アナログを含む核酸を指す。また核酸アナログの定義内に包含されるのは、リン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル結合が他の型の結合（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよび他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００；ＷＯ ９２／２０７０２；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）；モルホリノ（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号を参照のこと）；カルバメート（例えば、ＳｔｉｒｃｈａｋおよびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０５を参照のこと）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）；３’−チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）；スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）；２−アミノエチルグリシン（一般的にＰＮＡと呼ばれる）（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ，ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００を参照のこと）；および他のもの（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；ＦｒｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ １９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９およびその中に引用された参考文献を参照のこと）で置換されている、核酸である。リン酸エステルアナログとしては、（ｉ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート）；（ｉｉ）ホスホロアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、互換可能に使用され、そしてこれらは、二重鎖構造、三重鎖構造または他の高次構造の形成を生じる、１つの核酸と別の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。特定の実施形態において、その主要な相互作用は、ワトソン／クリック水素結合およびフーグスティーン型水素結合によって、塩基特異的（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）である。特定の実施形態において、塩基スタッキング相互作用および疎水性相互作用もまた、二重鎖の安定性に寄与し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」とは、限定されないが以下に挙げられるタンパク質の任意の改変をいう：アミノ酸配列の変化、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の欠失およびアミノ酸自身に対する改変。特定の実施形態において、変化は、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、例えば、類似の疎水性、親水性、荷電または芳香族性を有する別のアミノ酸と置き換えることを含み得る。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、類似のヒドロパシーインデックスに基づいてで行われ得る。ヒドロパシーインデックスは、アミノ酸の疎水性および荷電特性を考慮に入れ、そして特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換を選択するためのガイドとして使用され得る。ヒドロパシーインデックスは、例えば、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）に開示される。保存的アミノ酸置換は、上記特性のいずれかに基づいて行われ得ることが当該分野で理解される。
アミノ酸に対する改変としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：グリコシル化、メチル化、リン酸化、ビオチン化およびアミノ酸配列の変化を生じないタンパク質への任意の共有結合付加および非共有結合付加。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」は、酵素的または合成的のいずれかにより、ポリペプチドまたはタンパク質へと取り込まれ得る、天然または非天然の任意のアミノ酸をいう。
本明細書中で使用される場合、「アフィニティーセット」は、互いに特異的に結合する分子のセットである。アフィニティーセットは、以下に挙げられるがこれらに限定されない：ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、レセプターとリガンド、抗体とリガンド、抗体と抗原、およびポリペプチド配列とその相補体。特定の実施形態において、結合されているアフィニティーセットは、非結合であり得る。例えば、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド配列は変性され得、そしてストレプトアビジンに結合されたビオチンは、加熱され得、そして非結合になり得る。
「標的」とは、プローブによって区別され得る任意の物質をいう。標的は、天然に存在する分子および合成分子の両方を含み得る。
特定の実施形態において、標的は、核酸配列を含み得る。特定の実施形態において、標的核酸配列は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み得る。例示的なＲＮＡ標的配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ，ウイルス性ＲＮＡおよびＲＮＡの改変体（例えば、スプライシング改変体）。例示的なＤＮＡ標的配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、核小体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ。
特定の実施形態において、核酸配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｃＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、他の染色体外ＤＮＡおよび核酸アナログ。例示的な核酸アナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＰＰＧおよび以下に考察される他の核酸アナログ。
種々の方法が、本発明の組成物および方法との使用のための標的核酸配列を得るために利用可能である。核酸標的が、生物学的マトリックスからの単離によって得られる場合、特定の単離技術としては、以下が挙げられる：（１）例えば、フェノール／クロロホルムの有機試薬を使用する、有機抽出、次いでエタノール沈殿（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｉ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）））（好ましくは自動化ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販されるＭｏｄｅｌ ３４１ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を使用する）；（２）固定相吸着法（例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０（４）：５０６−５１３（１９９１））；および（３）塩誘導ＤＮＡ沈殿方法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（３）：９−１０（１９８８））（このような沈殿方法は、代表的に「塩析」方法と呼ばれる）。特定の実施形態において、上記の単離方法は、サンプルから所望でないタンパク質の除去を助ける酵素消化工程（例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテアーゼでの消化）の後に行われ得る。
特定の実施形態において、標的核酸配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：増幅産物、連結産物、転写産物、逆転写産物、プライマー伸長産物、メチル化ＤＮＡおよび切断産物。特定の実施形態において、標的核酸配列は、全体のゲノム増幅によって生産され得る。特定の実施形態において、標的核酸配列は、等温性増幅および／または連結によって生産され得る。
特定の実施形態において、サンプル中の核酸は、ＩｎｖａｄｅｒＴＭアッセイにおける切断手順のような切断手順に共せられ得る（例えば、米国特許第５，８４６，７１７号；同第５，９８５，５５７号；同第５，９９４，０６９号；同第６，００１，５６７号；および同第６，０９０，５４３号に例証されるように）。このような手順は、目的の核酸がサンプル中に存在する場合、切断産物を生産する。特定の実施形態において、標的は、このような切断産物であり得る。簡単に述べると、切断産物は、サンプル中の核酸に相補的であるように設計される２つの核酸オリゴヌクレオチドを使用し得る。第１のオリゴヌクレオチドは、サンプル中の核酸を相補しない５’部分を、サンプル中の核酸を相補する３’部分連続的に含む。第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドによって相補される領域の３’側であるサンプル中の核酸の領域におけるサンプル中の核酸と相補し、そして第１のオリゴヌクレオチドによって相補された領域とわずかにオーバーラップする相補的部位または非相補的部位を含む。サンプル中の核酸への２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、しばしば酵素の存在下で、第１のオリゴヌクレオチドの一部切断されるのを生じる。切断産物は、代表的に、サンプル中の核酸と相補しない第１のオリゴヌクレオチドの５’部分であり、そして相補的領域のその部分は第２のオリゴヌクレオチドとオーバーラップする。この切断産物は、公知の核酸配列を含む。特定の実施形態において、このような切断産物は、標的であり得る。
異なる標的核酸配列は、単一の連続した核酸の異なる部分であり得るか、または異なる核酸にあり得る。単一の連続した核酸の異なる部分は、オーバーラップし得る。
特定の実施形態において、標的核酸配列は、上流または５’領域、下流または３’領域および上流領域と下流領域との間に位置する「中心的（ｐｉｖｏｔａｌ）ヌクレオチド」を含む（例えば、図１を参照のこと）。中心的ヌクレオチドは、プローブセットによって検出されるヌクレオチドであり、そして例えば、限定されないが、多重対立遺伝子（ｍｕｌｔｉａｌｌｅｌｉｃ）標的遺伝子座中の単一多型ヌクレオチドを示し得る。
当業者は、標的核酸配列が、代表的に一本鎖分子として記載されるが、二本鎖分子の反対の鎖は、標的配列としてまた使用され得る相補的配列を含むことを認識する。
他の標的としては、ペプチド配列が挙げられるが、これに限定されない。ペプチド配列としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質、タンパク質のフラグメントおよびアミノ酸の他のセグメント。特定の実施形態において、ペプチド標的配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：異なるペプチド対立遺伝子（異なるアミノ酸を有する類似のタンパク質）および異なるペプチドコンホメーション（異なる二次構造および三次構造を有する類似のタンパク質）。他の天然に存在する標的としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホルモンおよび他のシグナル分子（例えば、ホルモンおよび他のステロイド型分子）。
特定の実施形態において、標的としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：合成ペプチド、医薬および他の有機低分子。
（プローブ）
用語「プローブ」または「標的特異的プローブ」は、標的を特異的に結合し得る部分を含む任意の一部分をいう。プローブとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：サンプル中の標的に特異的に結合し得る核酸、ペプチドおよび他の分子。このような特異的な結合としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸分子間のハイブリダイゼーション、抗体−抗原相互作用、リガンドとレセプターとの間の相互作用、およびアプトマーとタンパク質との間の相互作用。
特定の実施形態において、プローブは、選択された標的核酸配列上の相補的な領域と配列特異的様式でハイブリダイズするように設計された核酸配列特異的部分を含む。特定の実施形態において、プローブの配列特異的部分は、特定の配列に対して特異的であり得るか、あるいは、縮重（例えば、配列のセットに対する特異的であり得る。標的ペプチドのプローブとしては、非限定的な例として、抗体が挙げられ得る。
特定の実施形態において、プローブは、特定のペプチド配列に特異的に結合する核酸であるアプトマーを含む。特定の実施形態において、プローブは、ペプチドを含む。このようなペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびレセプター分子。特定の実施形態において、プローブは、特異的な標的ペプチド抗原に指向される抗体を含む。
特定の実施形態において、プローブは、独特の結合対（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン結合対）の他のメンバーおよび例えば、米国特許第５，８３１，０４６号；同第５，８５２，１７８号；同第５，８５９，２１０号；同第５，８７２，２２４号；同第５，８７７，２９７号；同第６，００８，４０６号；同第６，０１３，７８３号；同第６，０３１，１７号；および同第６，０７５，１２６号によって例証されるようなＰｒｏｌｉｎｘＴＭ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）から市販される親和性結合化学物質を含み得る。
本発明による「プローブセット」は、少なくとも１つの標的を検出するように設計された２つ以上のプローブの群である。非限定的な例として、プローブセットは、標的にハイブリダイズするように設計された２つの核酸プローブを含み得、その結果、その２つのプローブは互いに隣接する標的にハイブリダイズされる場合、これらは共に連結に適切である。
本発明の文脈に使用される場合、「連結に適切な」とは、少なくとも１つの第１の標的特異的プローブおよび少なくとも１つの第２の標的特異的プローブをいい、各々は、適切な反応基を含む。例示的な反応基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：第１のプローブの３’末端上の遊離のヒドロキシル基および第２のプローブの５’末端上の遊離のリン酸基、ホスホロチオエートならびにトシレートまたはヨウ化物、エステルおよびヒドラジド、ＲＣ（Ｏ）Ｓ−、ハロアルキル、ＲＣＨ２Ｓおよびα−ハロアシル、チオホスホリルおよびブロモアセトアミド基、およびＳ−ピバロイルオキシメチル−４−チオチミジン。さらに、特定の実施形態において、第１および第２の標的特異的プローブは、標的配列にハイブリダイズされ、その結果、第１の標的特異的プローブの３’末端および第２の標的特異的プローブの５’末端は、連結可能なように直ちに隣接する。
（コード化可能標識）
用語「標識」とは、検出可能なシグナルを提供し得るかまたは第２の分子または分子のセットの他のメンバーと相互作用して、検出可能なシグナルを提供する（第１の分子によって提供されるか、または第２の分子によって提供されるかのいずれか）（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）任意の分子または分子のセットをいう。標識の使用は、公知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件ならびに分析方法および精製方法を使用する、多くの公知の技術のうちのいずれか１つを使用して達成され得る。標識としては、検出可能な蛍光シグナル、化学発光シグナルまたは生物発光シグナルを生じるかまたはクエンチする光放射化合物または光吸収化合物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．ｉｎ Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．３−２８を参照のこと）。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；および同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；および同第６，１９１，２７８号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、エネルギー転移蛍光色素（ドナーおよびアクセプターの対を含む）（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照のこと）およびシアニン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ，ＷＯ ９７／４５５３９を参照のこと）ならびに検出可能なシグナルを生産し得る任意の他の蛍光部分。フルオレセイン色素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン。
他の例示的な標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：光を放出する発光分子および発光反応（例えば、非限定的な例として、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応）に関与し得る分子。標識としてはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない：化学発光ならびに電子発光の分子および反応。非限定的な例として、化学発光標識は、フィルムに曝光され得る。フィルムの発色は、標的がサンプル中に存在するかどうか、またはサンプル中の標的の量を示す。
他の例示的な標識としては、ドナー−アクセプター相互作用が挙げられるがこれに限定されない。ここで、ドナー分子は、アクセプター分子によって検出されるエネルギーを放射する。次いで、このアクセプター分子は、検出可能なシグナルを放射する。
他の例示的な標識としては、赤外線光子放出に関与する分子が挙げられるがこれに限定されない。
標識としてはまた、量子ドットが挙げられるがこれに限定されない。「量子ドット」とは、第一エネルギーへの曝露に応答して第二エネルギーを放射する能力を有する半導体ナノ結晶性化合物をいう。代表的には、単一の量子ドットによって放射されるエネルギーは、常に、同じ予測可能な波長を有する。例示的な半導体ナノ結晶性化合物としては、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳの結晶が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態に従う適切な量子ドットは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２号Ｂ１、ならびに「Ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ−ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：６３１−６３５（２００１）。
本発明の標識としてはまた、蛍光体および放射性同位体が挙げられる。放射性同位体は、直接検出され得るか、または次いで検出される光の波長を放射する発光蛍団を励起し得る。蛍光体粒子は、赤外線（約９８０ｎｍ近辺）によって励起され得るが、可視スペクトル内のシグナルを放出し、従ってバックグラウンド光を有意に低下させるかまたは排除する。
特定の例示的な標識の他の例としては、コード化された情報（例えば、バーコード）を有する粒子が挙げられ、米国特許第４，０５３，４３３号に記載されるマイクロ粒子タグもまた挙げられる。特定の他の非放射活性標識の方法、技術、および試薬は、以下に総説される：Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。
特定のクラスの標識は、特異的捕捉または非特異的捕捉によって、分子の分離または固定化をもたらす。これらの標識としては、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、および他のヘプタンが挙げられる（例えば、Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４）。
「コード化可能標識」とは、特定の部分に特異的である１種以上の標識をいう。特定の実施形態において、この部分は、標的および／またはプローブである。コード化可能標識が１より多い標識を含む実施形態において、この標識は、同じであっても異なっていてもよい。所定のコード化可能標識の検出は、このコード化可能標識が特異的である部分の存在を示す。所定のコード化可能標識の非存在は、このコード化可能標識が特異的である部分の非存在を示す。
コード化可能標識は、「検出可能に異なる」として記載され得、これは、少なくとも１つの検出方法によって、これらのコード化可能標識が相互に識別可能であることを意味する。異なるコード化可能標識としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：異なる波長の光を放射する１種以上の標識、異なる強度の光を放射する１種以上の標識、異なるシグナル数および／またはシグナルパターンを発する標識、異なる蛍光デコイ寿命を有する１種以上の標識、異なるスペクトルシグニチャーを有する１種以上の標識、異なる放射活性デコイ特性を有する１種以上の標識、異なる電荷の１種以上の標識、ならびに異なるサイズの１種以上の標識。
特定の実施形態において、コード化可能標識の数が計数される。この計数は、個々のコード化可能標識の実際の計数をいう。コード化可能標識の数の計数は、アナログシグナル検出と識別可能であり、ここで、複数の標識からのシグナルの総計レベルが検出される。アナログシグナル検出は、代表的に、同じ型の複数の標識からのシグナルの積分を使用して、サンプル中に存在するこのような標識の数を決定する。例えば、アナログ検出は、代表的に、試験サンプル中のシグナルの輝度または強度レベルを、既知量の所定の標識を含むコントロール中のシグナルの輝度または強度レベルと比較することによって、所定の型の標識の数の推定値を与える。
対照的に、計数は、個々のコード化可能標識の数が実際に計数される、デジタル検出システムである。従って、特定の実施形態において、２００の同じコード化可能標識がサンプル中に存在する場合、これらの標識の各々が、実際に計数される。特定の実施形態において、計数される標識の数は、サンプル中の実際の数の２０％以内であり得る。特定の実施形態において、計数される標識の数は、サンプル中の実際の数の１０％以内であり得る。特定の実施形態において、計数される標識の数は、サンプル中の実際の数の５０％以内であり得る。特定の実施形態において、サンプル中に存在するこれらの標識のそれぞれの部分が計数され、そしてこのサンプル中の標識の総数が、これらそれぞれの部分において計数された標識の数によって決定される。対照的に、サンプル中の標識の数をアナログ検出を用いて決定するために、２００の標識からの総計シグナルが測定され、そして既知量の標識からの総計シグナルと比較される。
特定の実施形態において、反応におけるコード化可能標識およびプローブは、利用可能な標識中で十分に過剰であり、計数されたコード化可能標識の数が存在する標識の数を表す。このような実施形態において、代表的に、各コード化可能標識に結合される１つ以下の標識が存在する。
特定の実施形態において、コード化可能標識の実際の計数を含む場合、デジタル検出は、アナログ検出における総計シグナルの一部として解釈され得る、バックグラウンドの「ノイズ」によっても偶発的な光によってもほとんど影響され得ない。
特定の実施形態において、コード化可能標識の数を計数することによって、種々のサンプル中の種々のコード化可能標識の数の間の厳密な相違を決定し得る。対照的に、特定の例において、アナログ検出（これは、種々のサンプル中の標識の数におけるわずかな相違がわかりにくくあり得る）における複数の標識からの総計シグナルは、種々のサンプル中のバックグラウンドシグナルの種々の量によってもたらされ得る。
２つ以上の検出可能に異なるコード化可能標識がサンプル中で検出される特定の実施形態において、検出可能に異なるコード化可能標識からのシグナルの重複に起因した潜在的な不正確さは、これらの検出可能に異なるコード化可能標識の各々を計数することによって最小にされ得る。特定のアナログ検出方法において、１つの標識からのシグナルの一部は、別の異なる標識からのシグナルとして検出され得、これは、不正確な読み出しを生じ得る。これは、特に、異なる標識からのシグナルが重複した放射範囲を有する場合であり得る。特定の実施形態において、個々のコード化可能標識を計数することによって、しばしば生じ得る不正確さは、異なる標識からの総計シグナル強度を測定するアナログ検出によって最小にされ得る。
特定の実施形態において、「コード化可能標識」は、種々のセットの量子ドットであり、これは、種々の標的特異的プローブ（この種々のプローブは、異なる標的配列に特異的である）に特異的であり、そして量子ドットの種々のセットは、互いに検出可能に異なる。
コード化可能標識は、プローブに直接的に結合されても、他の分子に間接的に結合され、次いでプローブに結合されてもよい。特定の実施形態において、コード化可能標識は、サンプルに添加される前にプローブに結合されても、検出可能な複合体を形成する反応過程の間にプローブに結合されてもよい。特定の実施形態において、コード化可能標識は、プローブに直接結合されても、連結分子（例えば、化学連結基）または連結対（例えば、ストレプトアビジン対）を介して結合されてもよい。
特定の実施形態において、標識は、ビーズに組み込まれ、次いでプローブに結合され得る。「ビーズ」とは、プローブが結合され得る任意の物質をいう。ビーズは、任意の形状（例えば、球形、ロッド、立方体、および棒が挙げられるがこれらに限定されない）のものであり得る。ビーズは、任意の物質（例えば、シリカガラスおよびポリマーが挙げられるがこれらに限定されない）から製造され得る。ビーズは、任意のサイズであり得る。ビーズの特定の非限定的な例としては、例えば、以下において記載されるビーズが挙げられる：米国特許第４，４９９，０５２号（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）；同第４，７１７，６５５号（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ）；同第３，９５７，７４１号（Ｒｅｍｂａｕｍ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第４，０３５，３１６号（Ｒｅｍｂａｕｍ，ＣａｌＴｅｃｈ）；４，１０５，５９８号（Ｒｅｍｂａｕｍ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第４，２２４，１９８号（Ｒｅｍｂａｕｍ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第４，３２６，００８号（Ｒｅｍｂａｕｍ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第３，８５３，９８７号（Ｄｒｅｙｅｒ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第４，１０８，９７２号（Ｄｒｅｙｅｒ，ＣａｌＴｅｃｈ）；同第５，０９３，２３４号（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）；同第６，２６８，２２２号（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；同第５，３２６，６９２号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；同第５，５７３，９０９号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；同第５，７２３，２１８号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；同第５，７８６，２１９号（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；同第５，０２８，５４５号（Ｓｏｉｎｉ）；および同第５，１３２，２４２号（Ｓａｕ Ｃｈｅｕｎｇ）；ならびに国際出願公開番号ＷＯ ０１／１３１１９（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ０１／１４５８９（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ９７／１４０２８（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ９９／１９５１５（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ９９／３７８１４（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ９９／５２７０８（Ｌｕｍｉｎｅｘ）；ＷＯ ００／５５３６３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ＷＯ ０１／０１１４１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ＷＯ ９９／６４８６７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；およびＷＯ ９４／１１７３５（Ｓｏｉｎｉ）。
特定の実施形態において、このビーズは、少なくとも１種の磁性物質、常磁性物質、シリカガラス、ポリアクリルアミド、多糖類、プラスチック、ラテックス、ポリスチレン、および他のポリマー物質を含有する、コーティングされた粒子またはコーティングされていない粒子を含む。
ビーズは、コード化可能標識（例えば、特定実施形態に従う量子ドットのセット）を含み得る。当業者は、量子ドット含むビーズを獲得する適切な方法を認識している。例えば、以下を参照のこと：Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：６３１−６３５（２００１）、および米国特許第６，２０７，３９２号（Ｓｈｕｍｉｎｇ Ｎｉｅ）；同第６，１１４，０３８号（Ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌ）；同第６，２６１，７７９号（Ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌ）；同第６，２０７，２２９号（Ｂａｗｅｎｄｉ）；同第６，２５１，３０３号（Ｂａｗｅｎｄｉ）；同第６，２７４，３２３号（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ）；同第５，９９０，４７９号（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ）；同第６，２０７，３９２号（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ）；国際出願公開番号ＷＯ ００／２９６１７（Ｓｈｕｍｉｎｇ Ｎｉｅ）；ＷＯ ００／２７３６５（Ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌ）；ＷＯ ００／２８０８９（Ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌ）；ＷＯ ０１／８９５８５（Ｂｉｏｃｒｙｓｔａｌ）；ＷＯ ００／１７６４２（Ｂａｗｅｎｄｉ）；ＷＯ ００／１７６５６（Ｂａｗｅｎｄｉ）；ＷＯ ９９／２６２９９（Ｂａｗｅｎｄｉ）；ＷＯ ００／６８６９２（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ）；ＷＯ ００／５５６３１（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ）；ならびに欧州特許出願番号０ ９９０ ９０３ Ａ１（Ｂａｗｅｎｄｉ）。これらの量子ドットまたは他の標識は、ビーズ内に包埋され得る。
特定の実施形態において、非限定的な例として、量子ドットは、架橋ポリマービーズに組み込まれ得る。特定の実施形態において、ポリスチレンビーズは、スチレン（９８％容量／容量）、ジビニルベンゼン（１％容量／容量）、およびアクリル酸（１％容量／容量）のエマルジョンを７０℃にて使用して、合成され得る。特定の実施形態において、次いでこのビーズは、５％（容量／容量）のクロロホルムおよび９５％（容量／容量）のプロパノールまたはブタノールを含有する溶媒混合物中で膨潤される。特定の実施形態において、ＺｎＳでキャップされたＣｄＳｅ量子ドットの制御量が、この混合物に加えられる。室温でのインキュベーション後、この包埋プロセスが完了する。特定の実施形態において、ビーズのサイズは、合成において使用される安定剤（例えば、ポリビニルピロリドン）の量によって制御され得る。特定の実施形態において、２〜４ｎｍ直径である量子ドットを含有する球形ビーズ（２μｍ直径）は、数万個の量子ドットを含み得る。
上で議論されるビーズを製造する方法は、量子ドットの数が変更されたビーズを生じ得る。また、１色より多い量子ドットを使用する場合、異なる色の数が変更されたビーズが得られ得る。特定の実施形態において、このようなビーズの調製後、得られたビーズは、所定のビーズにおける各色の量子ドットの相対数によって選別され、種々のコード化可能標識を有する、同様に標識されるビーズの群が得られる。特定の実施形態において、この選別は、機械（例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ））または種々のコード化可能標識間を識別し得る他のフローサイトメトリ型検出方法によって、自動化され得る。
当業者は、プローブを含むビーズを獲得する多数の方法が存在していることを理解する。このような方法は、共有結合を用いてプローブをビーズに結合する工程、ＵＶ架橋する工程、およびアフィニティーセットを介して連結する工程を包含するがこれらに限定されない。非限定的な例として、ストレプトアビジン分子は、ビーズ表面上のカルボン酸基に共有結合され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチン化され、次いでストレプトアビジン分子を介して、このビーズに連結され得る。
特定の実施形態において、ビーズは、内部参照標識を含む。特定の実施形態において、この内部参照標識は、コード化可能標識と検出可能に異なっている。特定の実施形態において、内部参照標識を使用して、コード化可能標識を含むビーズの数を確認し得る。例えば、特定の実施形態において、種々のコード化可能標識を含むビーズは、同じ内部参照標識を各々含む。この内部参照標識を使用して、単一ビーズの存在を同定し得る。特定の実施形態において、第一のビーズのコード化可能標識の強度と類似の組み合わせ強度を有するコード化可能標識を含む２種類のビーズから、コード化可能標識を含む単一の第一のビーズを識別するために、各ビーズ中に単一の内部参照標識が含まれ得る。特定の実施形態において、２種の内部参照標識の検出は、２種のビーズの存在を示し、一方、単一の参照標識の検出は、単一のビーズの存在を示す。従って、特定の実施形態において、内部参照標識は、コード化可能標識単独の検出が曖昧な結果を与え得る場合、実際に存在するビーズの数の正確な決定を補助する。
例えば、ビーズが発蛍光団、色素、またはナノ粒子を含むコード化エレメントを含む特定の実施形態では、内部参照標識は、各ビーズにおいて単一の量子ドットであり得る。単一の量子ドットの存在は、単一のビーズの存在を示すために使用され得る。２つの量子ドットの存在は、２つのビーズの存在を示し、以下同様である。
別の非限定的な例として、特定の実施形態では、内部参照標識は、コード化可能標識のシグナルとは検出可能に異なる色シグナルを提供し得る。特定の実施形態では、各ビーズについての内部参照標識からのシグナルは、単一のビーズの存在を同定するために使用され得る強度を有する。例えば、特定の実施形態では、各ビーズについての内部参照シグナルは、約１単位の強度を有する赤シグナルを提供する。このような特定の実施形態では、２つの異なる標的を検出するために、２つの異なるビーズにおいて、２つの異なるコード化可能標識を用い得る。例えば、特定の実施形態では、第一の標的についての第一のコード化可能標識は、１単位の強度を有する緑シグナルを提供し、そして第二の標的についての第二のコード化可能標識は、２単位の強度を有する緑シグナルを提供する。内部参照標識がなければ、特定の実施形態では、２単位の強度を有する緑シグナルが、第一の標的についての２つのビーズの存在を示すのか、または第二の標的についての１つのビーズの存在を示すのか決定するのに困難性を伴い得る。赤の内部参照標識を用いる特定の実施形態では、１単位の強度を有する赤シグナルの検出は、第二の標的についての１つのビーズの存在を示し、２単位の強度を有する赤シグナルの検出は、第一の標的についての２つのビーズの存在を示す。
種々のサイズのビーズを使用する場合、このようなビーズに取り込まれた標識（例えば、非限定的な例としての蛍光色素）の量は、ビーズのサイズに従って変動し得る。特定の実施形態では、ビーズ中に内部参照標識を含ませることは、ビーズのサイズにおける変動により引き起こされるコード化可能標識シグナルにおける変動を標準化するために使用され得る。
内部参照標識を使用しない特定の実施形態では、ビーズのサイズにおける差異に起因した、同じコード化可能標識からのシグナルにおける差異を避けるよう試みるために、かなり均一なサイズのビーズを使用することを試みる。特定の実施形態では、ビーズにおける内部参照標識は、種々のサイズのビーズを使用することを可能にし得る。このような特定の実施形態では、２つの異なる標的を検出するために、２つの異なるビーズにおいて、２つの異なるコード化可能標識を用い得る。例えば、このビーズがＸの直径を有する場合、第一の標的についての第一のコード化可能標識は、１単位の強度を有する緑シグナルを提供し、そして第二の標的についての第二のコード化可能標識は、２単位の強度を有する緑シグナルを提供する。内部参照標識がなければ、種々のサイズのビーズを用いる特定の実施形態では、２単位の強度を有する緑シグナルを提供するビーズが、Ｘより大きい直径を有する第一の標的についてのビーズの存在を示すのか、または直径Ｘを有する第二の標的についてのビーズの存在を示すのか決定するのに困難性を伴い得る。
このような特定の実施形態では、コード化可能標識とは検出可能に異なる内部参照標識を含むビーズを用い得る。特定の実施形態では、ビーズがＸの直径を有する場合、１単位の強度を有する赤シグナルを提供する内部参照標識を用い得る。従って、ビーズのサイズが、Ｘの直径から変動すると、内部参照標識は、１単位よりも異なる強度を提供する。このような特定の実施形態では、２単位の緑シグナルを有するビーズの検出は、赤シグナルが１単位である場合、第二の標的の存在を示し、そして赤シグナルが２単位である場合、第一の標的の存在を示す。
特定の実施形態では、内部参照標識の使用は、内部参照標識を使用しない場合に実施するよりも小さなサイズのビーズを生成することが可能になり得る。特定の実施形態では、ビーズは、直径２μｍ未満であり得る。特定の実施形態では、内部参照標識を用いると、ビーズサイズにおいて非常に小さい差異を区別し得る。
特定の実施形態では、内部参照標識の使用は、ステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）によりまたはフローサイトメトリーによりビーズを計数する場合に使用され得る。特定の実施形態では、内部参照標識を用いるビーズは、アレイで使用され得る。この場合、分析物がアレイの特定領域に結合される。特定の実施形態では、内部参照標識を有するビーズを有するアレイは、画像化され得る。特定の実施形態では、デジタル化画像において内部参照標識を使用してシグナルを標準化するために、ソフトウェアが使用され得る。
特定の実施形態では、ビーズの大きさは、コード化エレメントとして使用され得る。非限定的な例として、ビーズは、二色を使用する１００の異なるコードを有する。特定の実施形態では、異なるサイズにしたビーズが、コードの一部として使用され得る。なぜなら、異なるサイズにしたビーズは、異なる強度を提供するからである。例えば、特定の実施形態では、二色を使用する１００のコードは、４つの異なるサイズにしたビーズを用いることにより４００のコードに増大され得る。
（検出可能な複合体）
本発明の用語「検出可能な複合体」は、コード化可能標識を含む複合体である。特定の実施形態では、検出可能な複合体は、少なくとも１つのプローブをさらに含む。
特定の実施形態によれば、検出可能な複合体は、標的が存在する場合に生成され、そして標的が存在しない場合に生成されない。特定の実施形態では、標的およびプローブが互いに特異的に結合する場合、検出可能な複合体が形成される。
特定の実施形態では、この検出可能な複合体は、連結反応において生成される。連結方法としては、酵素的連結および化学的連結の両方が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による連結反応は、テンプレートに隣接してハイブリダイズされる核酸配列の反対側の末端の間でヌクレオチド間連結が形成される任意の酵素的プロセスまたは化学的プロセスを含む。さらに、アニールした核酸配列の反対側の末端は、代表的には、連結に適切である（連結に対する適切さは、使用された連結法の関数である）。ヌクレオチド間連結としては、ホスホジエステル結合形成が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような結合形成としては、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼ（例えば、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）リガーゼ、またはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼ）により酵素的に作製された結合が挙げられ得るが、これらに限定されない。他のヌクレオチド間連結としては、適切な反応基の間での共有結合形成（例えば、チオホスホリルアセチルアミノ基を形成するα−ハロアシル基とホスホチオエート基との間、５’−ホスホロチオエステル結合、およびピロホスフェート結合を形成するホスホロチオエート基とトシレート基またはヨーダイド基との間）が挙げられるが、これらに限定されない。
化学連結剤としては、活性化剤、縮合剤、および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および紫外光）が挙げられるが、これらに限定されない。自己連結（すなわち、連結剤なしでの自発的な連結）もまた、本発明の範囲内である。化学的連結方法についての詳細なプロトコルおよび適切な反応基の説明は、とりわけ、以下で見出され得る：Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓ．、２７：８７５−８１（１９９９）；ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２２：２３６６−６９（１９９４）；ＫａｎａｙａおよびＹａｎａｇａｗａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３−３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅおよびＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓおよびｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１−２４（１９９４）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：３３００−０４（１９９９）；ＷａｎｇおよびＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：３７１３−１９（１９９２）；ＡｓｈｌｅｙおよびＫｕｓｈｌａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：２９２７−３３（１９９１）；ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３２：１５３−５５（１９８８）；ＮａｙｌｏｒおよびＧｉｌｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：２７２２−２８（１９９６）；および米国特許第５，４７６，９３０号。
特定の実施形態では、以下の逐次的な手順の少なくとも１サイクルを用い得る：第一の標的特異的プローブおよび第二の標的特異的プローブの、連結に適している配列特異的部分を、それらのそれぞれの相補的標的領域にハイブリダイズさせる工程；第一の標的特異的プローブの３’末端を、第二の標的特異的プローブの５’末端と連結して、連結産物を形成する工程；および核酸二重鎖を変性して、標的配列から連結産物を分離する工程。このサイクルは、繰り返しても、繰り返さなくてもよい。例えば、限定ではないが、連結反応の熱サイクルを行うことにより、連結産物の量を線形に増大させる。
また、本発明の範囲内には、連結技術があり、例えば、ギャップ充填連結であり、これには、ギャップ充填ＯＬＡおよびＬＣＲ、架橋オリゴヌクレオチド連結、および訂正連結が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術の説明は、とりわけ、以下において見出され得る：米国特許第５，１８５，２４３号、公開欧州特許出願ＥＰ３２０３０８およびＥＰ４３９１８２、および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０１０６９。
検出可能な複合体はまた、いかなる連結工程も行わない核酸のハイブリダイゼーションによって生成され得る。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ＰＮＡ、ＬＮＡ、または天然に存在する核酸ハイブリダイゼーションよりも高いＴｍを有する他の合成核酸と共に生じる。
他の検出可能な複合体はまた、抗体−抗原相互作用、アプタマー−タンパク質相互作用、および他の特異的結合対の作用（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン反応）によって生成され得る。
検出可能な複合体はまた、プライマー伸長反応によって生成され得る。プライマー伸長反応としては、単一塩基伸長（ＳＢＥ）反応、配列決定反応（例えば、サンガージデオキシ配列決定反応）、およびポリメラーゼを含む他の反応が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、検出可能な複合体は、リガンド−レセプター反応において生成される。非限定的な例として、コード化可能標識およびプローブは、リガンド分子に結合され得る。レセプターは、分離部分（例えば、磁性ビーズ）に結合される。
特定の実施形態では、プローブが、標的核酸配列にハイブリダイズされ、そしてこの標的核酸配列が存在する場合、単一ヌクレオチドに結合されたコード化可能標識が、ポリメラーゼ反応によってプローブに結合される。
特定の実施形態では、核酸標的配列に相補的な核酸を含むプローブが、分離部分（例えば、磁性ビーズ）に結合される。特定の実施形態では、次いで、このプローブは、核酸標的配列を含むサンプルに添加される。特定の実施形態では、ヌクレオチドに結合されたコード化可能標識は、ポリメラーゼと共にサンプルに添加される。特定の実施形態では、核酸標的配列がサンプル中に存在する場合、プローブが、標的にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼは、コード化可能標識が結合したヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブに付加し、検出可能な複合体を形成する。特定の実施形態では、サンプル核酸からの変性後、次いで、磁性ビーズを用いてプローブがサンプルから分離される。特定の実施形態では、検出可能な複合体が計数される場合、サンプル中に標的が存在する。
特定の実施形態では、サンプル中の標的の数は、検出反応の開始時に存在する検出可能な複合体の数と比較した、サンプルから除去された検出可能な複合体の数によって表される。特定の実施形態では、多数の検出可能な複合体が、サンプルに添加される。特定の実施形態では、これらの検出可能な複合体は、一本鎖核酸プローブの一方の末端に結合したコード化可能標識、およびこの一本鎖核酸プローブの他方の末端に結合した分離部分を含む。特定の実施形態では、サンプル中に標的が存在する場合、この標的は、一本鎖プローブにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。特定の実施形態では、二本鎖核酸を切断するエンドヌクレアーゼが、反応に添加される。このような実施形態では、残存する検出可能な複合体の数は、反応に最初に添加された検出可能な複合体の数に等しく、サンプル中に存在する標的の数より少ない。
（分離部分および方法）
用語「分離部分」とは、検出可能な複合体中に含まれる場合、サンプル中の少なくとも１つの他の部分から検出可能な複合体を分離するために使用され得る任意の部分をいう。
特定の実施形態では、分離は、検出可能な複合体中に取り込まれたいかなる特定の分離部分をも用いることなく達成される。特定の実施形態では、特定の分離部分を使用しない方法としては、密度、サイズ、電子変化またはイオン変化に基づく分離、拡散、熱、フローサイトメトリー、および定方向光（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌｉｇｈｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、検出可能な複合体の検出は、他の部分からの検出可能な複合体のいかなる分離も伴うことなく生じる。
特定の実施形態において、この方法は、１つ以上の標的の定量またはそれらの存在もしくは非存在の検出の前に、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しない分離部分から分離する工程を包含する。当業者は、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しない分離部分から分離するための特定の実施形態に従って使用され得る方法がいくつか存在することを認識している。特定の実施形態における非限定的な例として、分離部分の密度または大きさの差が、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しない分離部分から分離するために使用され得る。分離方法としては、サイズ排除フィルター（ｓｉｚｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）、サイズ排除カラム、密度勾配、重力による分離、および遠心分離の使用が挙げられるがこれらに限定されない。このようなサイズ分離部分の例としては、ポリマービーズが挙げられるがこれらに限定されない。
例えば、特定の実施形態において、以下のようにして、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しない分離部分から分離し得る。プローブセットは、第１のプローブを含む分離ビーズおよび第２のプローブを含む検出ビーズを含み得る。分離ビーズはさらに、第１のコード化可能標識をさらに含み、検出ビーズは、第２のコード化可能標識をさらに含む。分離ビーズの大きさは、検出ビーズよりも小さい。連結後、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中の検出ビーズおよび検出可能な複合体中に存在しない分離ビーズの大きさの差に基づいて、分離ビーズから分離し得る。例えば、この材料を、分離ビーズを通過させ検出可能な複合体を保持するサイズ排除フィルターに通し得る。
また、特定の実施形態において、以下のようにして、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しない分離部分から分離し得る。プローブセットは、第１のプローブを含む分離ビーズおよび第２のプローブを含む検出ビーズを含み得る。分離ビーズはさらに、第１のコード化可能標識をさらに含み、検出ビーズは、第２のコード化可能標識をさらに含む。分離ビーズは、検出ビーズよりも高い密度を有する。検出可能な複合体が形成された後、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中の検出ビーズおよび遊離の分離ビーズの密度の差に基づいて、検出可能な複合体中に存在しない分離ビーズから分離し得る。例えば、特定の実施形態において、この材料を、密度勾配にかけ得、遊離の分離ビーズから検出可能な複合体を分離する。また、特定の実施形態において、重力が使用されて、遊離の分離ビーズから検出可能な複合体を分離し得る。従って、分離ビーズが検出ビーズよりも高い密度を有する場合、分離ビーズは、検出可能な複合体よりも下に沈む。
特定の実施形態に従って、プローブセットにおけるプローブの他の異なる特性が、検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しないプローブおよびコード化可能標識から分離するのに使用され得る。例えば、特定の実施形態において、分離部分を特定の位置に引きつける特定の特性を有する分離部分およびその特性を欠く反応混合物中の他の部分を使用し得る。例えば、特定の実施形態に従って、分離部分は、磁性粒子を含み得、そして反応混合物中の他の部分は、磁性粒子を含まない。
用語「磁性粒子」は、磁力を用いて移動可能な材料をいう。これとしては、磁化した粒子、磁化していないが磁場により影響を受ける粒子（例えば、コロイド鉄、酸化鉄（例えば、フェライトおよび磁鉄鉱）、ニッケル、およびニッケル鉄合金）、および磁化し得る粒子（例えば、フェライト、磁鉄鉱、鉄、ニッケル、およびそれらの合金）が挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、磁性粒子は、フェライト、磁鉄鉱、ニッケル、および鉄のうちの１つ以上を含み、そして反応混合物中の他の部分は、このような材料を含まない。このような実施形態において、分離部分のこのような特有の特性を使用して、分離ビーズを含む検出可能な複合体を、検出可能な複合体中に存在しないプローブおよびコード化可能標識から分離し得る。
検出可能な複合体を他の部分から分離する他の方法としては、密度による分離、電荷による分離、薬物の抵抗係数による分離（例えば、電気泳動の移動度）、拡散または透析による分離、および熱または光による分離（例えば、標識された粒子を移動させるためにレーザーを用いる）が挙げられるがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、検出可能な複合体中に存在しない分離部分、コード化可能標識、またはプローブ（遊離成分）を、サンプル中の標的核酸配列を定量する前に、検出可能な複合体を含む組成物から除去し得る。特定の実施形態において、検出可能な複合体を、サンプル中の標的核酸配列を定量（またはその存在もしくは非存在を検出）する前に、遊離成分を含む組成物から除去し得る。
特定の実施形態において、検出可能な複合体を遊離成分から分離する工程は、検出可能な複合体を標的核酸配列から分離する工程、および検出可能な複合体をサンプルから分離する工程を包含する。
特定の実施形態において、検出可能な複合体は、連結産物である。特定の実施形態において、標的配列からの検出可能な複合体の分離は、熱変性を含む。
非限定的な例示として、特定の実施形態において、以下のようにして、サンプル（例えば、細胞溶解産物）中の異なる標的核酸配列の存在または非存在を検出し得る。サンプルは、異なる標的核酸配列の各々に特異的な異なるプローブセットと組み合わされる。各々のプローブセットは、ビーズに組み込まれた磁性粒子および第１の標的特異的プローブを含む分離ビーズを含み、そしてビーズおよび第２の標的特異的プローブを含む検出ビーズを含む。プローブセットの分離ビーズは、検出ビーズよりも高い密度を有する。
各々のプローブセットの分離ビーズはさらに、第１の標的特異的プローブに特異的な第１のコード化可能標識を含み、そして各々のビーズセットの検出ビーズはさらに、第２の標的特異的プローブに特異的な第２のコード化可能標識を含む。第１のコード化可能標識は、第２のコード化可能標識と検出可能に相違する。各々のビーズセットにおける標的特異的プローブは、相補的な標的配列に互いに隣接してハイブリダイズする場合、一緒に連結されるのに適している。
サンプルが、所定のプローブセットの第１および第２の標的特異的プローブに相補的な標的核酸配列を含む場合、プローブは、リガーゼ（Ｌ）の存在下でアニーリングし連結されて、分離ビーズおよび検出ビーズを含む検出可能な複合体を形成する（例えば、図７を参照のこと）。連結後、標的核酸配列は、検出可能な複合体から熱変性される。
図８および図９に示される特定の実施形態において、サンプルは次いで、密度勾配に供され、それによって、検出可能な複合体および検出ビーズが、容器中で、分離ビーズの上に配置される。検出可能な複合体は次いで、磁気供給源によって、連結していない検出ビーズから分離され得る。例えば、検出可能な複合体を、磁気供給源を用いて連結していない検出ビーズを含むサンプルから除去し得、そして、検出可能な複合体は、連結していないビーズをいっさい含まない分離容器中に入れ得る。（図８および９を参照のこと）。次いで、コード化可能標識の特有の組み合わせの計数によって、検出可能な複合体の存在または非存在を検出し得る。
特定の実施形態において、より高密度の連結していない分離ビーズを引きつけ保持するが、より低密度の検出可能な複合体および連結していない検出ビーズは引きつけも保持もしない、第２の磁石を容器の底付近で使用し得る（図８を参照のこと）。しかし、このような容器の底付近の第２の磁石は、必須ではない。例えば、特定の実施形態において、任意の連結していない分離ビーズと検出可能な複合体との間の分離の距離が、検出可能な複合体が磁気デバイスに引きつけられることを可能し、かつ連結していない分離ビーズが磁気デバイスに引きつけられるのを許容しないように、ビーズの密度を設計し得る。
図１０および１１に示される特定の実施形態において、連結後、サンプルは加熱され、ハイブリダイズしたプローブおよび標的核酸配列が変性される。重力により、連結していない分離ビーズは、検出可能な複合体および連結していない検出ビーズより下に沈む（図１０を参照のこと）。次いで、より高密度の連結していない分離ビーズを引きつけ保持し、かつより低密度の検出可能な複合体および連結していない検出ビーズを引きつけも保持もしないように、容器の底付近に電磁石（磁石）を配置し得る（図１１を参照のこと）。また、検出可能な複合体を引きつけ保持するように、容器の上面に電磁石（磁石）を配置し得る（図１１を参照のこと）。
検出可能な複合体を保持する電磁石は次いで持ち上げられ、検出可能な複合体が、連結していない検出ビーズから分離され得る（図１１および１２を参照のこと）。次いで、コード化可能標識の特有の組み合わせを計数することによって、連結していないビーズを含むサンプルから検出可能な複合体を除去することなく、検出可能な複合体の存在または非存在を検出し得る（図１２を参照のこと）。図１２は、検出可能な複合体が照射され、コードが識別され、そして連結産物がＰＭＴセンサにより計数される特定の実施形態を示す。
図１８に示す特定の実施形態において、第１のコード化可能標識を含む磁性ビーズおよび第２のコード化可能標識を含む非磁性ビーズを含む検出可能な複合体が形成される。特定の実施形態において、電磁石（磁石）が、ビーズおよび検出可能な複合体を含む反応容器のすぐ下に配置される。電磁石のスイッチが入れられた場合、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズは、容器の底に引きつけられる。図１８Ｃを参照のこと。
特定の実施形態において、検出可能な複合体中に存在しない非磁性ビーズおよび他の非磁性部分は、入口チューブおよび出口チューブを備える連続フローシステムにより除去される。図１８Ｄを参照のこと。特定の実施形態において、電磁石のスイッチが次いで切られ、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズが、フローサイトメーターのチューブを用いて引き抜かれる。図１８Ｅを参照のこと。
特定の実施形態において、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズが次いで、フローサイトメーターに通され、第１および第２のコード化可能標識の組み合わせのみが計数される。図１８Ｆを参照のこと。このような実施形態において、検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズは、第１のコード化可能標識のみを含み、これは計数されない。
特定の実施形態において、コード化可能標識を含まない磁性ビーズを用いて、図１８について上述した方法を実施し得る。検出可能な複合体中に存在しない非磁性ビーズの分離後、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズが次いで、フローサイトメーターに送られる。このような実施形態において、磁性ビーズはコード化可能標識を有さないので、検出可能な複合体中の非磁性ビーズのコード化可能標識のみが計数される。
図１９に示される特定の実施形態において、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、およびコード化可能標識を含む検出可能な複合体が形成される。特定の実施形態において、第１の電磁石が、ビーズおよび検出可能な複合体を含む反応容器のすぐ下に配置される。第１の電磁石のスイッチが入れられた場合、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズは、容器の底に引きつけられる。図１９Ｃを参照のこと。
特定の実施形態において、検出可能な複合体中に存在しない非磁性ビーズおよび他の非磁性部分は、入口チューブおよび出口チューブを備える連続フローシステムにより除去される。図１９Ｄを参照のこと。特定の実施形態において、ひっくり返した場合に実質的な量の液体が流出しないようにひっくり返され得る容器が使用される。特定の実施形態において、このことは、容器をひっくり返した場合に表面張力が容器からの液体の流出を防止するような小さい容器を用いて達成され得る。ひっくり返される容器を用いる実施形態において、容器および第１の電磁石が次いでひっくり返され、そして第１の電磁石のスイッチが切られる。次いで、ひっくり返された容器の底にある第２の電磁石のスイッチが入れられ、検出可能な複合体および検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズが引きつけられる。図１９Ｅを参照のこと。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズよりも多くの抵抗および小さい密度を有する。従って、このような実施形態において、検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズは、検出可能な複合体よりも速く、第２の電磁石の方に移動する。検出可能な複合体中に存在しない磁性ビーズが、第２の電磁石上で回収された後（図１９Ｅを参照のこと）、検出可能な複合体は第２の電磁石に達する前に、容器はもとに戻される。
特定の実施形態において、検出可能な複合体は、次いで、フローサイトメーター管を用いて引き出され（図１９Ｆを参照のこと）そしてフローサイトメーター通して送られ、そしてこの検出可能な複合体の検出可能な標識が、計数される。
特定の実施形態において、図１９について上で議論された方法を、コード化可能標識を含まない磁性ビーズを用いて実施し得る。特定の実施形態において、図１９について上で議論された方法を、コード化可能標識を含まない非磁性ビーズを用いて実施し得る。
図２０に示される特定の実施形態において、検出可能な複合体は、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、およびコード化可能標識を備えて形成される。フィルタが、容器内に備えられる。特定の実施形態において、磁性ビーズは、これらがフィルタを通過し得るように設計され、そして非磁性ビーズは、これらがフィルタを通過し得ないように設計される。特定の実施形態において、電磁石が、ビーズおよび検出可能な複合体を含む反応容器の下に配置される。第一の電磁石がオンにされると、検出可能な複合体、および検出可能な複合体内にない磁性ビーズが、容器の底部に引き付けられる。図２０Ｃを参照のこと。
検出可能な複合体内にない磁性ビーズは、磁石の方へとフィルタを通過する。検出可能な複合体は、磁石の方へと引かれるが、この複合体の非磁性ビーズの観点から、フィルタを通過し得ない。検出可能な複合体は、磁石の引力によって、フィルタに保持される。特定の実施形態において、検出可能な複合体内にない非磁性ビーズ、および他の非磁性部分は、次いで、連続フローシステム（投入管および排出管を備える）によって除去される。図２０Ｄを参照のこと。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、次いで、電磁石からフィルタを離して移動させることによって、検出可能な複合体内にない磁性ビーズから分離され得る。このようなフィルタの移動は、検出可能な複合体を、電磁石から離して、そして検出可能な複合体内にない磁性ビーズから離して引く。
特定の実施形態において、検出可能な複合体は、次いで、フローサイトメーター管で引き出される。図２０Ｅを参照のこと。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、次いで、フローサイトメーターを通して送られ、そして検出可能な複合体のコード化可能標識が計数される。図２０Ｆを参照のこと。
特定の実施形態において、図２０について上で議論された方法を、コード化可能標識を含まない磁性ビーズを用いて実施し得る。特定の実施形態において、図２０について上で議論された方法を、コード化可能標識を含まない非磁性ビーズを用いて実施し得る。
特定の実施形態において、容器内の溝を使用し得、この溝は、検出可能な複合体を、標識のセットの存在または非存在の検出を容易にする様式で整列させることを補助する。特定の実施形態において、「整列した連結産物」とは、産物の分離ビーズが、検出ビーズより容器の所定の表面に近い産物である。例えば、図１３に示される特定の実施形態において、分離ビーズは、大きさが検出ビーズより小さくあり得る。溝は、この溝内に分離ビーズがフィットするように設計され、そして分離ビーズは、この溝にフィットするためには大きすぎる（図１３を参照のこと）。特定の実施形態において、磁気供給源を、容器内の溝の近くに配置して、分離ビーズをこの溝内に誘引および保持し得る。次いで、コード化可能標識の組み合わせを計数して、検出可能な複合体の存在または非存在を検出し得る。図１３に示される特定の実施形態において、溝は、角度の付いた励起ビームが、読み取りの少ない両方のビーズを照射するように、検出可能な複合体を配置する。
特定の実施形態において、電気泳動がまた使用されて、分離部分を、電荷によってかまたは電荷：質量比によって分離し得る。特定の実施形態において、荷電した分離部分はまた、イオン交換によって（例えば、イオン交換カラムまたは電荷に基づくクロマトグラフィーを使用することによって）分離され得る。
特定の実施形態において、分離部分はまた、アフィニティーセットのメンバーであり得る。アフィニティーセットとは、互いに特異的に結合する分子のセットである。例示的なアフィニティーセットとしては、ストレプトアビジン−ビオチン対、相補的な核酸、抗体−抗原対、および親和性結合化学物質（米国特許第５，８３１，０４６号；同第５，８５２，１７８号；同第５，８５９，２１０号；同第５，８７２，２２４号；同第５，８７７，２９７号；同第６，００８，４０６号；同第６，０１３，７８３号；同第６，０３１，１７号；および同第６，０７５，１２６号によって例示されるように、ＰｒｏｌｉｎｘＴＭ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、分離部分は、それらの移動度の観点で分離される。特定の実施形態において、移動度の観点で分離することは、分離部分の大きさによって達成される。特定の実施形態において、移動度改変剤が、電気泳動の間に使用され得る。例示的な移動度改変剤およびそれらの使用法は、例えば、米国特許第５，４７０，７０５号；同第５，５８０，７３２号；同第５，６２４，８００号；および同第５，９８９，８７１号に記載されている。特定の実施形態において、コード化可能標識の移動度を変化させることによって、標的の存在に関連する信号を、標的の存在に関連しない標識からの信号と区別し得る。
特定の実施形態において、２つ以上の異なる分離部分または方法が使用され得る。非限定的な例として、特定の実施形態において、検出可能な複合体は、磁性ビーズ、連結産物、およびビオチンコーティングされたビーズを備え得る。例えば、図２１、パートＡを参照のこと。ストレプトアビジンでコーティングされた電磁石が、サンプルに入れられ、そしてオンにされる。例えば、図２１、パートＢを参照のこと。検出可能な複合体および検出可能な複合体中にない磁性ビーズは、電磁石に引き付けられる。検出可能な複合体におけるビオチンコーティングされたビーズは、電磁石上のストレプトアビジンに結合する。例えば、図２１、パートＣを参照のこと。次いで、電磁石がオフにされ、そして検出可能な複合体内にない磁性ビーズがこの電磁石から落ち、一方で、検出可能な複合体は、電磁石に結合したままである。特定の実施形態において、この電磁石は、次いで、検出可能な複合体がこの電磁石に結合した状態で、サンプルから取り除かれ、そして検出可能な複合体内のコード化可能標識が、カメラまたはスキャナによって検出される。例えば、図２１、パートＤを参照のこと。
特定の実施形態において、標的の存在は、検出可能な複合体の形成を容易にするよりむしろ、防止する。特定のこのような実施形態において、プローブおよび／またはコード化可能標識の数は、制限される。特定のこのような実施形態において、検出可能な複合体の計数は、標的と結合しない、多数のコード化可能標識を提供する。計数された、検出可能な結合体の数を、標的の完全な非存在下において予測される検出可能な複合体の総数から減算することによって、サンプル中に存在する標的の数が与えられる。
（検出可能な複合体の管分離における管）
図２８に示される特定の実施形態において、検出可能な複合体は、コード化可能標識および分離部分（例えば、ビオチン分子）を含むビーズを備えて形成される。特定の実施形態において、検出可能な複合体を形成するプロセスにおいて、連結反応を包含し得る。特定の実施形態において、検出可能な複合体を形成するプロセスにおいて、抗体−ペプチド反応を包含し得る。特定の実施形態において、ビオチン以外の分離部分を使用し得る。
図２８に示される実施形態において、コード化可能標識を含むビーズを有する第一のプローブ、およびビオチンに結合した第二のプローブを含む、プローブセットが使用される。図２８Ａにおいて、標的が存在する場合に、連結が起こって、検出可能な複合体を形成する。図２８（Ｂ）に示される特定の実施形態において、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズが、添加される。ストレプトアビジンコーティングされたビーズは、検出可能な複合体内のビオチン分子に結合する。特定の実施形態において、コード化可能標識を含む、ビオチンに連結していないビーズは、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズに結合しない。特定の実施形態において、図２８に示されるプロセスは、連結に関与しないプロセスを使用することによって、コード化可能標識およびビオチンを含むビーズを含む、検出可能な複合体を形成するように改変され得る。
図２８（Ｃ）に示される特定の実施形態において示されるように、第一の管が提供され、この管は、より大きい第二の管の内部に配置される。特定の実施形態において、これら２つの管は、コード化可能標識を含むビーズより大きい密度を有する緩衝液で、部分的に満たされる。特定の実施形態において、第二の管は、この緩衝液で部分的に満たされ、そしてこの第二の管は、外側の管の内部に配置され、その結果、この緩衝液は、第一の管および第二の管において、つり合った高さにくる。
特定の実施形態において、連結反応後、サンプルの少なくとも一部が、第一の管の内部の高密度緩衝液の頂部に配置され、その結果、ビーズが緩衝液中で浮遊する。図２８（Ｄ）に示される特定の実施形態において、次いで、磁石が、第二の管の底部に適用され、その結果、結合していないストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズおよび検出可能な複合体が、第二の管の底部におけるこの磁石に引き付けられる。検出可能な複合体内にない、コード化可能標識を含むビーズは、第一の管内の高密度緩衝液に浮遊したままであるか、またはこの緩衝液の頂部へと浮遊したままである。図２８（Ｅ）に示される特定の実施形態において、第一の管の頂部は、実質的に密封してシールされており、そして第一の管は、第二の管内の緩衝液より上に持ち上げられる。従って、検出可能な複合体内にはないコード化可能標識を含むビーズは、検出可能な複合体を含む緩衝液から分離される。特定の実施形態において、第一の管は、ビーズが第二の管の壁に接着することを防止する。
特定の実施形態において、第二の管内の検出可能な複合体は、計数されるために取り出され得る。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、フローサイトメーターの使用に供される。特定の実施形態において、第二の管の底部の磁石は、検出可能な複合体と共に取り除かれ、そしてコード化可能標識が、この磁石上で検出される。
（検出方法）
特定の実施形態において、本発明は、コード化可能標識の検出を提供する。特定の実施形態において、本発明は、標識の計数を提供する。標識の検出および／または計数のいくつかの方法が企図され、そして当業者は、補発明のコード化可能標識を検出および／または計数し得る種々の方法を理解する。
上で議論されたように、検出可能な標識の計数とは、個々の標識の実際の計数をいう。特定の実施形態において、検出および／または計数とは、検出可能に異なる複数の標識が同一の手順において使用される場合、標識のコードを同定することをさらに包含する。
特定の実施形態において、コード化可能標識は、ある型のフローサイトメトリー（例えば、蛍光補助セルソーター（ＦＡＣＳ）、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ検出デバイス、または単一のコード化可能標識分子の検出のために開発された類似の技術）を用いて検出される。特定の実施形態において、コード化可能標識は、電気泳動によって分解され、そしてコード化可能標識の電気泳動移動の間または後に検出される。電気泳動としては、キャピラリー電気泳動および電解電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、このような方法は、コード化可能標識を励起させるデバイス（例えば、非限定的な例として、レーザー）およびコード化可能標識を計数する走査デバイスを包含する。図９に示される特定の実施形態において、検出可能な複合体は、検出容器内に放出され、そしてこの容器の底部に沈降する検出可能な複合体が、ＰＭＴセンサによって読み取られる。特定の実施形態において、ＰＭＴセンサは、６０分未満で１０００万のビーズを走査する、１０個の５００ｋＨｚデジタイザーを備える６要素ＰＭＴデバイスである。
特定の実施形態において、検出の他の方法は、静的な検出方法を包含する。特定の実施形態において、このような方法は、コード化可能標識または複合体を、プレート（非限定的な例として）上に配置する工程、コード化可能標識を１つ以上の励起源（例えば、レーザーまたは異なる波長）で励起させる工程、およびコード化可能標識を計数するために、平面にわたって走査デバイスを移動させる工程を包含する。特定の実施形態において、このプレートは、走査デバイスの検出場を横切って前後に移動される。特定の実施形態において、コード化可能標識は、プレートまたはスライドに付着される。特定の実施形態において、カメラが、場全体を画像化し得、そしてコード化可能標識を計数するために、この画像が走査され得る。
特定の実施形態によれば、サンプル中の複数の標的が検出され得、そして異なるコード化可能標識を使用して区別され得る。特定の実施形態において、コード化可能標識は、２つ以上の標識を使用してコード化され得る（例えば、特定の実施形態において、量子ドット、発蛍光団、または色素が使用される）。特定の実施形態において、複数の波長または色の標識を使用し得、これは、潜在的な異なるコード化可能標識の数を増加させる。例えば、所定のコード化可能標識が二進コードを与えられる場合、標識の特定の色の存在または非存在が検出され得る（「１」または「０」のいずれか、従って、二進コード）。１つのみの二進色が使用される場合、２つのコードが存在し、一方は、標識を有し、そして一方な、標識を有さない。２つの二進色が使用される場合（例えば、赤色および青色）、４つのコードが可能である（（１）赤色、（２）青色、（３）赤色および青色、ならびに（４）色なし）（図３を参照のこと）。各さらなる色は、可能なコードを２ずつ増加させる。従って、１０色の標識が使用される場合、１，０２４の二進コードが可能である。
特定の実施形態において、このコード化可能標識は、ビーズに組み込まれるかまたはビーズに結合される。特定の実施形態において、このコード化可能標識は、ビーズに組み込まれることなしに、プローブに直接結合され得る。
強度がまた、コード化可能標識を区別するときの要因として使用され得る。特定の実施形態において、単波長の標識を同一数含むコード化可能標識を使用することによって、強度のバリエーションが達成され得るが、異なるプローブを有する異なるコード化可能標識は、様々な強度レベルを有する標識を有する。特定の実施形態において、単一放射スペクトルの同一数の標識を含むコード化可能標識を使用することによって、強度のバリエーションが達成され得るが、様々なプローブを有する様々なコード化可能標識は、様々な強度レベルを有する標識を有する。特定の実施形態において、様々なプローブに結合する様々なコード化可能標識おいて同一波長の標識数を変化させることによって、強度バリエーションが達成され得る。特定の実施形態において、様々なプローブに結合する様々なコード化可能標識おける同一放射スペクトルの標識数を変化させることによって強度バリエーションが達成され得る。例えば、特定の実施形態において、様々なコード化可能標識において同一波長の標識を使用し得、そして、各々の異なるセットにおける異なる数の標識を使用して、コード化可能標識間の区別をし得る。例えば、コード化可能標識が、３成分コード（標識の各々の色について強度の３つのレベル）を与えられる場合、標識の１つの色は、以下の可能なコードを提供する：（１）標識なし、（２）１標識、および（３）２標識。２つの色が使用される場合に、９個の３成分コードが可能である（図３における非限定的な例を参照のこと）。６色によって、７２９の３成分コードが可能となる。
さらに、コード化可能標識が、（例えば、ビーズに組み込むことによって）プローブセットの２つのプローブに結合される場合、潜在的なコードの数がさらに倍増される（図４における非限定的な例を参照のこと）。例えば、２成分コードにおいて２色を使用すると、１６の異なるプローブセットコードが、可能である（４×４）。３成分コードにおいて２色を使用すると、８１の異なるプローブセットコードが可能である（９×９）。２成分コードにおいて１０色を使用すると、百万を超えるプローブセットコードが可能である（１，０２４×１，０２４）。３成分コードにおいて６色を使用すると、５００，０００を超えるプローブセットコードが可能である（７２９×７２９）。
さらに、特定の実施形態において、その標識（例えば、量子ドット）は、信号を伝達するのに特に効率よく、その結果、コード化可能標識は、検出され得る。特定のこのような実施形態において、このコード化可能標識は、標的増幅なしに、サンプル内の極少数の分子を検出するために使用され得る。
特定の実施形態において、プローブセットは、分離ビーズおよび検出ビーズを含み、この分離ビーズは、分離部分、第１のプローブおよび第１のコード化可能標識を含み；そして、この検出ビーズは、第２プローブおよび第２コード化可能標識を含む。特定のこのような実施形態において、第１のコード化可能標識は、第１のプローブに特異的な強度レベルを有する。特定のこのような実施形態において、第２のコード化可能標識は、第２のプローブに特異的な強度レベルを有する。特定の実施形態において、プローブセットのビーズは、同一の波長の標識を含むが、第１のコード化可能標識は、第１のプローブに特異的な強度レベルを有し、そして、第２のコード化可能標識は、第２のプローブに特異的な強度レベルを有する。
特定の実施形態において、コード化可能標識は、少なくとも１，０００標識を含み、ここでこれらの標識は、各々のコード化可能標識を、他のコード化可能標識と区別させる予め決定された波長の組み合わせを有する。
特定の実施形態において、このコード化可能標識は、２〜１，０００を超える任意の標識数を含み得る。特定の実施形態において、検出可能な複合体中の特定の標的特異的プローブの存在または非存在を検出を可能にするコード化可能標識を使用する。特定の実施形態において、コード化可能標識を使用して、その結果、標識の特定の組み合わせの存在の検出によって、１つの特定の検出可能な複合体の存在を確認する。そして、標識のこのような特定の組み合わせの非存在の検出によって、１つの特異的な検出可能複合体の非存在が確認される。
特定の実施形態において、これらの標識は、量子ドット、蛍光体（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、および蛍光色素から選択される。
特定の実施形態において、それは、第１のビーズおよび第２のビーズを使用すると特定の実施形態において、そのプローブセットの分離ビーズをおよび検出ビーズをの両方が、磁性粒子を含む。特定のこのような実施形態において、これらのビーズは、伸長され、そしてその一方の端に磁性粒子を含み、他方の端に標的特異的プローブを含む。これらのビーズは、そのビーズの長さ方向に沿った特定の順序で配置された標識をさらに含む（例えば、図１４（ａ）を参照のこと）。例えば、米国特許第４，０５３，４３３号（これは、特定の順序で標識を有する伸長したポリマーについて記載する）を参照のこと。
特定の実施形態において、このビーズにおける磁性粒子の極性または方向は、その検出可能な複合体の整列が容易になるように設計される。例えば、特定の実施形態において、検出可能な複合体を含む容器が、磁気供給源の付近に位置付けられる、表面上の溝（グルーブ）を備える（例えば、図１４（ｂ）を参照のこと）。それらのビーズにおける磁性粒子の極性または方向によって、検出可能な複合体の第２のビーズよりも、検出可能な複合体の各々の第１のビーズを溝の一方の端に近接させた、その溝内での検出可能な複合体の整列を生じるように、これらのビーズは設計される（例えば、図１４（ｂ）を参照のこと）。次いで、コード化可能標識の特定の順序の組み合わせを定量することによって、検出可能な複合体を定量し得る。
このような実施形態において、同一のコード化可能標識を含む、第１のビーズおよび第２のビーズを有するプローブセット使用し得る。なぜならば、この同一のコード化可能標識の順序は、整列した検出可能複合体における、第１のビーズ上、および第２のビーズ上において異なっているためである（例えば、図１４（ｃ）を参照のこと）。
（本発明の例示的実施形態）
標識が核酸配列である特定の実施形態において、プローブの配列特異的部分は、標的配列において相補的な配列に対して特異的なアニーリングをすることを可能にするのに十分な長さである。特定の実施形態において、配列特異的な部分の長さは、１２〜３５ヌクレオチドである。配列特異的アニーリングを提供するプローブ設計の詳細な説明が、特に、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ならびにＫｗｏｋら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５，１９９０）において見出され得る。
特定の実施形態において、本発明に従うプローブは、第１の標的特異的プローブおよび第２の標的特異的プローブを含み、ここで、これらのプローブは、同一の標的配列に近接してハイブリダイズする。各々のプローブセットにおける第１の標的特異的プローブの配列特異的部分は、配列特異的様式で標的配列の下流領域とハイブリダイズするように設計される（例えば、図１におけるプローブＡを参照のこと）。そのプローブセットにおける第２の標的特異的プローブの配列特異的部分は、配列特異的様式で、標的配列の上流領域とハイブリダイズするように設計される（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。そのプローブの配列特異的部分は、適切に、標的配列において相補的な配列と特異的にアニーリングすることを可能にするのに十分な長さである。適切な条件下において、隣接してハイブリダイズするプローブは、一緒に連結されて、連結生成物が形成され得るが、但し、これらは、適切な反応基（例えば、以下に限定することはないが、遊離した、３’水酸基、または５’リン酸基である）を含む。
特定の実施形態において、２つの異なるプローブセット、１以上のヌクレオチド異なる２つの異なる標的配列を定量するために使用され得る（例えば、図２を参照のこと）。本発明の特定の実施形態に従って、第１の標的特異的プローブの配列特異的部分が下流の標的領域とハイブリダイズし（例えば、図１のプローブＡおよび図２のプローブＡおよびＢを参照のこと）、そして、第２の標的特異的プローブの配列特異的部分が上流の標的領域とハイブリダイズする（例えば、図１および図２のプローブＺを参照のこと）ように、プローブセットは、設計される。特定の実施形態において、この中心的ヌクレオチド塩基に相補的な、すなわち、「中心的相補体（ｐｉｖｏｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」であるヌクレオチド塩基は、そのプローブセットの第１の標的特異的プローブまたは第２の標的特異的プローブのいずれかの近位端の上に存在する（例えば、図１におけるプローブＡの３’末端、ならびに図２における、プローブＡおよびプローブＢの３’末端を参照のこと）。
そのプローブセットの第１および第２の標的特異的プローブが、適切な上流および下流の標的領域にハイブリダイズし、そして、その中心的相補体は、その標的配列上でその中心的ヌクレオチドと塩基対形成する場合に、そのハイブリダイズした第１および第２の標的特異的プローブは、一緒に連結され、連結産物を形成し得る（例えば、図２（ｂ）〜（ｃ）を参照のこと）。しかし、中心的ヌクレオチドでの誤対合（ミスマッチ）した塩基は、誤対合がなければ両方のプローブがそれらの各々の標的領域に完全にハイブリダイズするような場合でさえも、その連結反応を妨害する（図２（ｂ）〜（ｃ）を参照のこと）。従って、特定の実施形態において、単一のヌクレオチドとういう少ない程度で異なる高度に関連性のある配列が、識別され得る。
例えば、特定の実施形態に従って、以下のような２つの異なるプローブセットを使用して１つの対立遺伝子座における２つの潜在的な対立遺伝子を識別し得る。各々プローブセットのちの第１の標的特異的プローブが、その中心的相補体で、互いに異なり、そして、その２つの異なる第１の標的特異的プローブと結合したコード化可能標識は、検出可能なほど異なっている（例えば、図２（ａ）におけるプローブＡおよびプローブＢを伴うコード化可能標識を参照のこと）。各々のプローブセットはまた、同一の第２の標的特異的プローブを含み得、そして、その同一の２つの第２の標的特異的プローブに結合するコード化可能標識は同一である（例えば、図２（ａ）のプローブＺを伴うコード化可能標識を参照のこと）。
２つの異なるプローブセットと、このサンプルとを組み合わせ得る。（特定の実施形態において、各々のプローブセットのプローブのうちの１つは、分離部分をさらに含み得る。３つの標的特異的プローブの全ては、適切な条件下で、標的配列とハイブリダイズする（図２（ｂ）を参照のこと）。ハイブリダイズした中心的相補体を伴う第１の標的特異的プローブが、ハイブリダイズした第２の標的特異的プローブと連結する（例えば、図２（ｃ）を参照のこと）。従って、１つの対立遺伝子のみがサンプル中に存在する場合に、その標的に対して１つの連結反応物のみが、生成される（例えば、図２（ｄ）における連結産物Ａ−Ｚを参照のこと）。両方の連結反応物（Ａ−ＺおよびＢ−Ｚ）は、ヘテロ接合性の個体からのサンプル中に形成される。
さらに、特定の実施形態において、プローブセットは、第１の標的特異的プローブまたは第２の標的特異的プローブの末端における中心的相補体を含まない。むしろ、この標的ヌクレオチドまたは検出されるべきヌクレオチドは、第１の標的特異的プローブまたは第２の特異的プローブのいずれかの配列特異的部分中に位置付けられる。それらの標的領域と完全に相補的な配列特異的部分を有するプローブは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。対照的に、配列特異的部分において１以上の誤対合塩基を有するプローブは、それらのそれぞれの標的領域にハイブリダイズしない。第１の標的特異的プローブおよび第２の標的特異的プローブの両方が、連結生成物が生成されるためにはその標的とハイブリダイズされなければならない。検出されるヌクレオチドは、両方とも、中心的または内部のものである。
特定の実施形態において、プローブセット中の第１の標的特異的プローブおよび第２の標的特異的プローブは、類似の融点（Ｔｍ）を有するように設計される。特定の実施形態において、プローブが中心的相補体を含む場合に、求められる標的中心的ヌクレオチドの中心的相補体を含むプローブに対するＴｍは、プローブセット中に中心的相補体を含まない他のプローブに比べて、約４℃〜６℃低い。好ましくは、この中心的相補体を含むプローブはまた、連結温度付近のＴｍを有するように設計される。従って、このような実施形態において、誤対合したヌクレオチドを有するプローブは、この連結温度においてその標的からより容易に解離しやすい。このような実施形態では、従って、この連結温度は、例えば、その標的中の複数の潜在的な対立遺伝子の間を区別するために別の方法を提供する。
（検出標的の特定の例示的実施形態）
本発明は、サンプル中の標的を定量するための方法、試薬、およびキットに関する。特定の実施形態において、連結反応を使用して標的核酸配列の存在または非存在を検出する。
特定の実施形態において、検出されるべき標的核酸配列の各々について、少なくとも１つの第１の標的特異的プローブおよび少なくとも１つの第２の標的特異的プローブを含むプローブセットが、サンプルおよび必要に応じて連結剤とともに、組み合わされて、連結反応混合物を形成する。この少なくとも１つの第１のプローブは、少なくとも２つの標識を含む第１のコード化可能標識をさらに含み、そして、その第１のコード化可能標識は、第１の標的特異的プローブに対して特異的である。この少なくとも１つの第２のプローブは、少なくとも２つの標識を含む第２のコード化可能標識を含み、そして、その第２のコード化可能標識は、第２の標的特異的プローブに対して特異的である。この第１のコード化可能標識は、第２のコード化標識とは検出可能に異なる。
特定の実施形態において、各プローブセット中の第１および第２の標的特異的プローブを、標的配列の中心的ヌクレオチドにすぐ隣接する配列に相補的であるように設計する（例えば、図２（ａ）のプローブＡ、Ｂ、およびＺを参照のこと）。プローブセットの第１の標的特異的プローブまたは第２の標的特異的プローブのいずれか（しかし、両方ではない）は、中心的相補体を含む（例えば、図２（ａ）のプローブＡを参照のこと）。標的配列がサンプル中の存在する場合、第１および第２の標的特異的プローブは、適切な条件下で、標的上の隣接する領域にハイブリダイズする（例えば、図２（ｂ）を参照のこと）。中心的相補体が、適切な連結薬剤の存在下で塩基対形成される場合、２つの隣接したハイブリダイズされるプローブを、ともに連結して、連結産物を形成し得る（例えば、図２（ｃ）を参照のこと）。
次いで、連結産物の存在または非存在を検出することにより、標的核酸配列の存在または非存在が検出され得る。
複数の対立遺伝子を検出することを包含するが、これらに限定されない、特定の実施形態において、連結反応混合物は、複数対立遺伝子標的遺伝子座（multiallelictarget locus）における各潜在的な対立遺伝子についての異なるプローブセットを含み得る。特定の実施形態において、例えば、それらに限定されないが、単一のスクリーニングアッセイが、６つのプローブセットを使用して、個体における３つの二対立遺伝子座（例えば、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３）の存在を検出するために使用され得る。例えば、以下の表１を参照のこと。
Figure 2009229468
 このような実施形態において、２つの異なるプローブセットは、各遺伝子座における各対立遺伝子の存在または非存在を検出するために使用される。各遺伝子座に対するこの２つの異なるプローブセットの第１の標的特異的プローブ（例えば、遺伝子座Ｌ１に対するプローブＡおよびプローブＢ）は、同じ上流配列特異的部分を含むが、中心的相補体において異なる。また、この２つの異なるプローブＡおよびプローブＢは、異なるコード化可能標識を含む。各遺伝子座に対するこの２つの異なるプローブセットの第２の標的特異的プローブ（例えば、遺伝子座Ｌ１に対するプローブＺ）は、同じ下流配列特異的部分を含む。また、このプローブＺは、同じコード化可能配列を含む。（特定の実施形態において、各プローブセットのうちのプローブの１つは、分離部分をさらに含み得、各プローブセットのうちの他方のプローブは、分離部分を含んでいなくても良い）。
従って、表１に示される実施形態において、３つのプローブＡ、Ｂ、およびＺは、２つのあり得るＬ１連結産物を形成するために使用され、ここでＡＺは、第１のＬ１対立遺伝の連結産物であり、ＢＺは、第２のＬ１対立遺伝子の連結産物である。同様に、プローブＣ、Ｄ、およびＹは、２つのあり得るＬ２連結産物を形成するために使用される。同様に、プローブＥ、ＦおよびＸは、２つのあり得るＬ３連結産物を形成するために使用される。
隣接してハイブリダイズされた第１および第２の標的特異的プローブの連結の後、各対立遺伝子についてコード化可能標識の独特の組み合わせの存在または非存在を検出することにより、その遺伝子座の各々に対する対立遺伝子の各々の連結産物の存在または非存在が検出され得る。例えば、コード化可能標識の以下の組み合わせが検出され得る：（１）２赤色／２青色；（２）４橙色／４青色；（３）２黄色／２緑色；および（４）４黄色／２緑色。このような個体は、遺伝子座Ｌ１における対立遺伝子１についてホモ接合性、遺伝子座Ｌ２における対立遺伝子２についてホモ接合性、および遺伝子座Ｌ３における対立遺伝子１および２の両方についてヘテロ接合性であると決定される。
当業者は、特定の実施形態において、複数対立遺伝子座における３つ以上の対立遺伝子がまた、これらの方法を使用して区別され得ることを理解する。また、特定の実施形態において、１つを超える遺伝子座が分析され得る。
当業者は、特定の実施形態において、プローブが、第１の標的特異的プローブまたは第２の標的特異的プローブのいずれかにおける任意の位置で中心的相補体を伴って設計され得ることを理解する。さらに、特定の実施形態において、複数の中心的相補体を含む標的特異的プローブは、本発明の範囲内である。
（スプライス改変体の検出）
特定の実施形態に従って、本発明は、標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定するために使用され得る。例えば、遺伝子（タンパク質をコードするＤＮＡ）は、非コード領域（イントロンといわれる）が散在する一連のコード領域（エキソンといわれる）を含み得る。スプライシングプロセスにおいて、イントロンが除去され、エキソンは、最終的なＲＮＡ分子（代表的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））が、連続したコード配列を含むように、並置される。いくつかの遺伝子は、単一のタンパク質またはポリペプチドをコードする一方、他の遺伝子には、選択的スプライシングに起因して、複数のタンパク質またはポリペプチドをコードし得る。
例えば、遺伝子は、少なくとも１つのイントロンによって他のエキソンから各々分離されている、５つのエキソンを含み得る（図５を参照のこと）。一次転写物をコードする仮定遺伝子（図５の上に示される）は、３つの異なるタンパク質をコードし、その各々は、３つの成熟ｍＲＮＡのうちの１つによってコードされる（図５の下に示される）。選択的スプライシングに起因して、エキソン１は、（ａ）エキソン２ａ−エキソン３、（ｂ）エキソン２ｂ−エキソン３、または（ｃ）エキソン２ｃ−エキソン３と並置しており、この３つのスプライシング選択肢（これは、成熟ｍＲＮＡの３つの異なるバージョンを生じる）は、図５に示される。
ラット筋肉タンパク質であるトロポニンＴは、選択的スプライシングの一例に過ぎない。トロポニンＴをコードする遺伝子は、５つのエキソン（Ｗ、Ｘ、α、β、およびＺ）を含み、各々は、最終的タンパク質のドメインをコードする。この５つのエキソンは、イントロンによって分離されている。２つの異なるタンパク質（α−形態およびβ−形態）が、トロポニンＴ遺伝子の選択的スプライシングによって生成される。α−形態は、エキソンＷ、Ｘ、α、およびＺを含むｍＲＮＡから翻訳される。β−形態は、エキソンＷ、Ｘ、β、およびＺを含むｍＲＮＡから翻訳される。
特定の実施形態において、各異なるスプライス改変体に対する異なるプローブセットを使用して、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸配列における異なるスプライス改変体の存在または非存在を検出するための方法が提供される。
スプライス改変体を同定するための特定の非制限的な実施形態は、図６に例示される。このような実施形態は、２つの異なるスプライス改変体を同定することを可能にする。一方のスプライス改変体は、エキソン１、エキソン２、およびエキソン４（スプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４）を含む。他方のスプライス改変体は、エキソン１、エキソン３、およびエキソン４（スプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４）を含む。
スプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４に特異的なプローブセットは、少なくとも１つの第１の標的特異的プローブＱを含み、このプローブＱは、エキソン１の少なくとも一部にハイブリダイズする配列特異的部分を含む（例えば、このプローブＱは、エキソン２またはエキソン３のいずれかに隣接しているエキソン１の末端にハイブリダイズし得る）。この少なくとも１つの第１の標的特異的プローブは、第１のコード化可能標識をさらに含む。スプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４に特異的なこのプローブセットは、少なくとも１つの第２の標的特異的プローブＲをさらに含み、このプローブＲは、エキソン２の少なくとも一部にハイブリダイズする配列特異的部分を含む（例えば、このプローブＲは、エキソン１に隣接するエキソン２の末端にハイブリダイズし得る）。スプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４に特異的なプローブセットのうちの少なくとも１つの第２の標的特異的プローブは、第１のコード化可能標識とは異なって検出される第２のコード化可能標識をさらに含む。
スプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４に特異的なプローブセットは、少なくとも１つの第１のプローブを含み、このプローブは、スプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４に特異的なプローブセットのうちの少なくとも第１のプローブと同じである。スプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４に特異的なプローブセットは、少なくとも１つの第２の標的特異的プローブＳをさらに含み、このプローブＳは、エキソン３の少なくとも一部にハイブリダイズする配列特異的部分を含む（例えば、このプローブＳは、エキソン１に隣接しているエキソン３の末端にハイブリダイズし得る）。スプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４に特異的なプローブセットのうちの少なくとも１つの第２のプローブは、第２のコード化可能標識をさらに含み、この第２のコード化可能標識は、第１のコード化可能標識とは異なって検出され、かつスプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４に特異的なプローブセットのうちの少なくとも１つの第２のプローブの第２のコード化可能標識とは異なって検出される。
隣接しているハイブリダイズした第１および第２の標的特異的プローブの連結の後、各スプライス改変体に対するコード化可能標識の独特の組み合わせの存在または非存在を検出することにより、スプライス改変体の各々に対する連結産物の存在または非存在が検出され得る。例えば、図６に示される特定の方法において、２つのドットおよび４つのドットの組み合わせを有する連結産物の存在が検出される場合、サンプル中のスプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４の存在が、検出される。コード化可能標識の組み合わせが存在しない場合、サンプル中のスプライス改変体Ｅ１Ｅ２Ｅ４の非存在が検出される。また、図６に示される特定の方法において、２つのドットおよび６つのドットの組み合わせを有する連結産物の存在が検出される場合、サンプル中のスプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４の存在が検出される。コード化可能標識のその組み合わせが存在しない場合、サンプル中のスプライス改変体Ｅ１Ｅ３Ｅ４の非存在が検出される。
特定の実施形態において、その少なくとも１つの標的核酸配列は、ＲＮＡから生成された少なくとも１つの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。特定の実施形態において、その少なくとも１つのｃＤＮＡは、少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から生成される。特定の実施形態において、その少なくとも１つの標的核酸配列は、サンプル中に存在する少なくとも１つのＲＮＡ標的配列を含む。
（アドレス可能な部分を使用する方法）
特定の実施形態において、独特の特異的にアドレス可能なオリゴヌクレオチド、すなわち「アドレス可能な部分」が使用される。アドレス可能な部分は、アドレス可能な部分の相補体にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドである。互いに相補的なアドレス可能な部分の対に対して、一方のメンバーは、アドレス可能な部分といわれ、他方は、相補的にアドレス可能な部分といわれる。
特定の実施形態において、この方法は、以下を含む連結混合物を形成する工程：第１のプローブ（これは、第１のアドレス可能な部分および第１の標的特異的部分を含む）；第２のプローブ（これは、第２のアドレス可能な部分および第２の標的特異的部分を含む）（ここで、第１および第２の標的特異的部分は、標的上に互いに隣接してハイブリダイズされた場合、一緒になって連結するために適切である）；連結薬剤；およびサンプル。標的がサンプル中に存在する場合、第１および第２のプローブの第１および第２の標的特異的部分は、一緒に連結されて、連結産物を形成する。
図２２は、連結反応混合物を含む例示的実施形態を示し、この連結反応混合物は、以下を含む：第１のプローブ１２（これは、第１の標的特異的部分１４および第１のアドレス可能な部分１８を含む）；および第２のプローブ２０（これは、第２の標的特異的部分２２および第２のアドレス可能な部分２４を含む）。このプローブの標的特異的部分は、標的１６にハイブリダイズする。この連結反応混合物は、連家反応に供され、この第１および第２のプローブの第１および第２の標的特異的部分は、一緒に連結されて、連結産物を形成する。
特定の実施形態において、第１のアドレス可能な部分および第２のアドレス可能な部分を含む任意の連結産物の形成の後に、ビーズ対が、連結混合物に添加される。特定の実施形態において、ビーズ対は、第１の相補的なアドレス可能な部分を含む第１のビーズ（ここでこの第１の相補的なアドレス可能な部分は、第１のアドレス可能な部分に相補的である）；および第２の相補的なアドレス可能な部分を含む第２のビーズ（ここでこの第２の相補的な部分は、第２のアドレス可能な部分に相補的である）を含む。この連結産物の第１のアドレス可能な部分は、第１のビーズの第１の相補的なアドレス可能な部分にハイブリダイズし、この連結産物の第２のアドレス可能な部分は、第２のビーズの第２の相補的なアドレス可能な部分にハイブリダイズして、第１のビーズ、連結産物、および第２のビーズを含む、検出可能な複合体を形成する。特定の実施形態において、第１のビーズもしくは第２のビーズのいずれか、または両方のビーズは、分離部分であり得る。特定の実施形態において、第１のビーズもしくは第２のビーズのいずれか、または両方のビーズは、コード化可能標識を含み得る。
特定の実施形態において、ビーズと結合した、相補的なアドレス可能な部分は、ヘアピン構造中に含まれる。特定の実施形態において、このヘアピン構造は、相補的なアドレス可能な部分およびアンカー部分を含む。特定の実施形態において、このアンカー部分は、この相補的なアドレス可能な部分から上流にあり、このアンカー部分は、互いに相補的な、第１の部分および第２の部分を含む。特定の実施形態において、このヘアピン構造のアンカー部分は、ビーズに結合されている。ヘアピン構造５２および５４の特定の例示的実施形態は、図２３に示される。
特定の実施形態において、このヘアピン構造のアンカー部分の第１および第２の部分は、互いにハイブリダイズし、その結果、このアンカー部分は、相補的なアドレス可能な部分および相補的なアドレス可能な部分と連続した末端に折りたたまれている反対側のフリーな末端を含む。例えば、図２３を参照のこと。特定の実施形態において、連結産物の第１のアドレス可能な部分および第２のアドレス可能な部分は、それぞれ、第１の相補的なアドレス可能な部分および第２の相補的なアドレス可能な部分にハイブリダイズし、これらアドレス可能な部分は、２つの異なるビーズに結合されている２つの異なるヘアピン構造中に含められて、検出可能な複合体を形成する。例えば、図２３を参照のこと。特定の実施形態において、このヘアピン構造が設計されて、その結果、アンカー部分のフリーな末端は、連結産物（これは、ヘアピン構造にハイブリダイズされている）の隣接したアドレス可能な部分と一緒に連結される。例えば、図２３を参照のこと。特定のこのような実施形態において、連結産物およびヘアピン構造は、連結反応に供される。このような実施形態において、検出可能な複合体は、ビーズおよび連結産物（これは、ビーズに結合されているヘアピン構造に連結している）を含む。
特定の実施形態において、第１のアドレス可能部分および第２のアドレス可能部分を含む任意の連結生成物の形成の後に、連結オリゴヌクレオチド対およびビーズ対が、連結混合物に添加される。特定のこのような例示的な実施形態は、図２４に示される。特定の実施形態において、ビーズ対は、第３のアドレス可能部分を含む第１のビーズ；および第４のアドレス可能部分を含む第２のビーズを含む。このような実施形態において、連結オリゴヌクレオチド対は、第１の連結オリゴヌクレオチドおよび第２の連結オリゴヌクレオチドを含む。この第１の連結オリゴヌクレオチドは、連結生成物の第１のアドレス可能部分に相補的な第１の相補的アドレス可能部分；および第１のビーズの第３のアドレス可能部分に相補的な第３の相補的アドレス可能部分を含む。この第２の連結オリゴヌクレオチドは、連結生成物の第２のアドレス可能部分に相補的な第２の相補的アドレス可能部分；および第２のビーズの第４のアドレス可能部分に相補的な第４の相補的アドレス可能部分を含む。第１、第２、第３および第４の特異的アドレス可能部分は、それぞれ、第１、第２、第３および第４の特異的アドレス可能部分にハイブリダイズして、連結生成物およびビーズを含む検出可能な複合体を形成する。特定の実施形態において、第１のビーズもしくは第２のビーズのいずれか、または両方のビーズが、分離部分であり得る。特定の実施形態において、第１のビーズもしくは第２のビーズのいずれか、または両方のビーズが、コード化可能標識を含み得る。
特定の実施形態において、連結オリゴヌクレオチドは、第１、第２、第３および第４の特異的アドレス可能部分が、それぞれ、第１、第２、第３および第４の特異的アドレス可能部分にハイブリダイズした後、第１および第３のアドレス安濃部分の隣接末端が、共に連結するのに適切であり、かつ第２および第４のアドレス可能部分の隣接末端が、一緒に連結するのに適切であるように、設計される。特定のこのような実施形態において、ハイブリダイズされた連結生成物、連結オリゴヌクレオチドおよびビーズのアドレス可能部分は、連結反応に供される。このような実施形態において、検出可能な複合体は、ビーズ、およびこのビーズのアドレス可能部分に連結される連結生成物を含む。
特定の実施形態において、第１のアドレス可能部分および第２のアドレス可能部分を含む任意の連結生成物の形成の後、この連結生成物は、標的にハイブリダイズされていない過剰なプローブから分離される。特定のこのような実施形態において、標的を捕獲し、かつハイブリダイズされていないプローブが通過するように設計されたフィルターが用いられ得る。連結生成物は、標的にハイブリダイズされるので、この連結生成物もまた、フィルターによって捕獲される。特定の実施形態において、標的にハイブリダイズされていないプローブが除去され、そして連結生成物と共に進行する。
特定の実施形態において、連結生成物は、標的由来の連結生成物を変性することによって、標的から分離され得る。特定の実施形態において、この標的は、次いで、破壊され得る。例えば、標的がｍＲＮＡである特定の実施形態において、Ｒｎａｓｅが、連結生成物を損傷することなく、ｍＲＮＡを分解するために加えられ得る。
（単一ビーズアッセイ）
特定の実施形態において、標的の検出は、２つの分離部分および１つのコード化可能標識を使用して行われ得る。特定の実施形態において、検出は、図２５に示されるように、第１のアドレス可能部分（Ｚ１）および第１の標的特異的部分（ＴＳＯ１）を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブを含むプローブセットを使用する。特定の実施形態において、このプローブセットは、図２５に示されるように、第２の標的特異的部分（ＴＳＯ２）、非特異的スペーサー部分（Ｓ）および第１の分離部分（例えば、ビオチン分子）を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。特定の実施形態において、標的の存在下で、第１の標的特異的部分および第２の標的特異的部分は、標的にハイブリダイズし、その結果、これら２つの標的特異的部分は、連結に適切である。従って、特定の実施形態において、標的分子が存在する場合、隣接してハイブリダイズされた２つの第１および第２の連結プローブが、一緒に連結されて、図２５に示されるように、第１および第２の特異的部分、第１のアドレス可能部分、スペーサー部分、ならびにビオチン分子を含む連結生成物を形成し得る。
特定の実施形態において、この方法は、第２のアドレス可能部分（Ｚ２）を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドに結合したコード化可能標識を含むビーズを用いる。例えば、図２６を参照のこと。特定の実施形態において、第２のアドレス可能部分Ｚ２は、第１のアドレス可能部分Ｚ１に相補的であり、その結果、連結生成物が形成された場合、このプローブセットは、図２６に示されるように、コード化可能標識を含むビーズ、第１のアドレス可能部分Ｚ１にハイブリダイズされた第２のアドレス可能部分Ｚ２、第１および第２の標的特異的部分（ＴＳＯ１およびＴＳＯ２）、スペーサー部分（Ｓ）、ならびにビオチン分子を含む検出可能な複合体を形成する。
特定の実施形態において、第２のアドレス可能部分Ｚ２を含むオリゴヌクレオチドは、コード化可能標識を含むビーズに共有結合される。特定の実施形態において、この第２のアドレス可能部分Ｚ２は、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、２’−Ｏ−メチル核酸、または任意の他のプローブ材料を含み得る。特定の実施形態において、第１および第２のアドレス可能部分（Ｚ１およびＺ２）の配列は、特定の融解点およびハイブリダイゼーション結合強度に最適化される。
特定の実施形態において、第２のアドレス可能部分Ｚ２は、コード化可能標識を含むビーズに結合されたヘアピン構造の一部である。例えば、図２９を参照のこと。図２９に示される特定の実施形態において、このヘアピン構造は、第１のアドレス可能部分Ｚ１が第２のアドレス可能部分Ｚ２にハイブリダイズした場合に、この第１のアドレス可能部分が、ヘアピン構造の３’末端への連結に適切であるような構造である。特定の実施形態において、連結生成物は、ヘアピン構造の３’末端に連結されて、検出可能な複合体を形成する。
特定の実施形態において、コード化可能標識を含むビーズは、磁性材料（例えば、フェライト）と共に埋めこまれたポリスチレンビーズであり、このことは、このようなビーズを磁性にし、特定の緩衝液よりも高密度にする。特定の実施形態において、コード化可能標識は、ビーズに埋めこまれたかまたはビーズに結合された光子放出粒子であり得る。特定の実施形態において、この光子放出粒子は、固有の波長でシグナルを生成し得、そして各ビーズの粒子数は変化し得、これにより、異なるシグナル強度および波長が固有のビーズの数が固有のビーズ数を増加させ得る。
特定の実施形態において、連結反応の後、この混合物は、図２７（Ａ）に示されるように、コード化可能標識を含む容器に加えられる。特定の実施形態において、連結反応後、この混合物をコード化可能標識を含むビーズを含む容器に加える前に、連結生成物中に存在しない第１のオリゴヌクレオチドプローブが、３’ホスフェート末端で始まるプローブを破壊する化学によって、実質的に除去され得る。このような実施形態において、連結生成物は、破壊されなければならない。なぜなら、ビオチン分子は、３’末端に存在するからである。特定の実施形態において、標的は、非限定的な例として、ＲＮａｓｅを用いるような酵素消化によって、実質的に除去され得る。特定の実施形態において、フィルターが、ＲＮＡ標的またはＤＮＡ標的を除去するために使用され得る。
図２７（Ｂ）に示される特定の実施形態において、検出可能な複合体が、ストレプトアビジン被覆磁石に曝露され、そしてビーズがこの磁石に結合される。図２７（Ｃ）に示される特定の実施形態において、この磁石が切られ、そしてビオチン分子との検出可能な複合体は、ストレプトアビジン被覆磁石に結合したままであり、一方、検出可能な複合体に存在しないコード化可能標識を含むビーズは、このストレプトアビジン被覆磁石から離れて落ちる。特定の実施形態において、第２の磁石が容器の底に置かれ得、その結果、この第２の磁石は、ストレプトアビジン被覆磁石から未結合のビーズを除去するが、ビオチン分子によってストレプトアビジン被覆磁石に結合された検出可能な複合体中のビーズは除去しない。図２７（Ｄ）および２７（Ｅ）に示される特定の実施形態において、当業者は、この磁石の作動プロセスを繰返し、検出可能な複合体をストレプトアビジン表面に結合させ、磁石を切り、そして検出可能な複合体中にないコード化可能標識を含むビーズを、落とし得る。図２７（Ｆ）に示される特定の実施形態において、次いで、ストレプトアビジン被覆磁石が、結合された検出可能な複合体と共に除去される。特定の実施形態において、コード化可能標識を評価して、磁石に結合した検出可能な複合体を計数しそして同定するために、カメラが使用され得る。次いで、検出可能な複合体の数が使用されて、サンプル中の標的分子が定量される。
特定の実施形態において、各々が、コード化可能標識および異なるアドレス可能部分を有する所定数の異なるビーズの同じセットを含む、複数のウェルが使用され得る。特定の実施形態において、各ウェルは、異なるビーズのアドレス可能部分に相補的な異なるアドレス可能部分を有する１セットの第１のオリゴヌクレオチドプローブのセットを含む。しかし、別個のウェルにおいて、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、異なる標的に相補的な異なる標的特異的部分を有し得る。特定のこのような実施形態において、異なるビーズの同じセットを用いる異なる多重アッセイが、異なるウェルで実施され得る。特定の実施形態において、１ウェルあたりの多重アッセイの数が、１，０００である場合、１，０００個の異なるビーズは、３８４ウェルプレートにおいて３８４，０００の異なるアッセイを可能にする。
（標的の定量）
本発明の特定の実施形態において、サンプル中の１つ以上の標的（例えば、標的核酸配列）の量が定量され得る。定量は、標的の存在または非存在を検出することに関して上で考察された方法のいずれかに適用され得る。例えば、限定することなく、サンプル中の異なる特定の核酸配列の数（１つ以上の遺伝子座における種々の対立遺伝子の数、特定の単一ヌクレオチド多型の数、および特定のスプライス改変体の数が挙げられるが、これらに限定されない）が定量され得る。
特定の実施形態において、サンプル中の標的核酸配列の数を定量するために、連結生成物についてのコード化可能標識の特定の組合せの量を決定することによって、サンプル中の特定の連結生成物の量が決定される。特定のこのような実施形態において、生物学的サンプルを増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）に供することなく、この生物学的サンプル中の特定の標的配列の量が決定され得る。
また、標識として量子ドットを用いる特定の実施形態において、決定された量子ドットのセットの組合せの数は、サンプル中の連結生成物の実際の数に直接相関する。従って、このような実施形態において、蛍光シグナルの強度のレベルをコントロールシグナルと比較して、サンプル中の連結生成物の数を評価する必要はない。
核酸配列の定量は、多くの有用な用途を有し得る。生物の遺伝子構築は、この生物のゲノム内に含まれる遺伝子によって決定される。遺伝子は、タンパク質を作製するのに必要な情報をコードする長鎖またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーから構成される。生物の特性、能力および形質は、しばしば、この生物によって生成されているかまたは生成されていないタンパク質の型および量に関連する。
タンパク質は、以下のような遺伝子から産生され得る。第１は、タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであり、例えば、タンパク質「Ｘ」は、「転写」として公知のプロセスによって、リボ核酸（ＲＮＡ）に変換される。転写の間、遺伝子の一本鎖相補ＲＮＡコピーが作製される。次いで、このＲＮＡコピー（タンパク質ＸメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と称される）が、タンパク質Ｘを作製するための細胞の生物学的機構（「翻訳」と呼ばれるプロセス）により使用される。基本的に、細胞のタンパク質製造機構は、ｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡコードを「読み取り」、そしてこれをタンパク質Ｘのアミノ酸配列に「翻訳」する。要約すると、ＤＮＡは、転写されてｍＲＮＡを作製し、このｍＲＮＡは、翻訳されてタンパク質を作製する。
細胞によって産生されるタンパク質Ｘの量は、しばしば、この細胞内に存在するタンパク質ＸのｍＲＮＡの量に大きく依存する。細胞内のタンパク質ＸのｍＲＮＡの量は、少なくとも部分的に、遺伝子Ｘが発現される程度に起因する。特定の遺伝子が発現されるか否か、また発現される場合のそのレベルは、生物に対して有意な影響を有し得る。
例えば、とりわけ、タンパク質インシュリンは、血中グルコースのレベルを調節する。個体において産生されるインシュリンの量は、その個体が健康であるか否かを決定し得る。インシュリンの欠乏は、糖尿病、潜在的な胎児疾患を生じる。糖尿病個体は、代表的に、低レベルのインシュリンｍＲＮＡを有し、従って、低レベルのインシュリンを産生し、一方、健康な個体は、代表的に、より高いレベルのインシュリンｍＲＮＡを有し、そして正常なレベルのインシュリンを産生する。
代表的に異常に低い遺伝子発現に起因する別のヒト疾患は、Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病である。Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ病を有する子供は、スフィンゴリピドの破壊に必要なタンパク質を欠くか、またはこのタンパク質が欠乏している。従って、これらの子供は、異常に高いレベルのスフィンゴリピドを有し、これは死に至り得る神経系障害を引き起こす。
遺伝子の過剰発現または過小発現によって引き起こされるさらなる遺伝子ベースの疾患／障害を同定および検出することは、有用である。さらに、癌および特定の他の公知の疾患または障害は、特定の遺伝子の過剰発現または過小発現によって検出され得るか、またはこれらに関連し得る。例えば、前立腺癌に罹患する男性は、代表的に、異常に高レベルの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を産生し；そして腫瘍抑制遺伝子由来のタンパク質は、多くの型の癌の発生において重要な役割を果たすと考えられる。
特定の実施形態において、核酸技術を使用し得、微少量の生物学的サンプルは、代表的に、多くの異なる疾患、障害、および素因に対する同時の試験に十分な材料を提供し得る。さらに、細胞または生物における特定の標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の量を定量すること、時々、「遺伝子発現プロファイリング」といわれるプロセスが望ましい他の多くの状況が存在する。例えば、特定の細胞型または組織あるいは個体内の特定の標的核酸の量が既知である場合、特定の場合において、この細胞型、組織、または個体に対する遺伝子発現プロファイルを編集し始め得る。個々の遺伝子の発現プロファイルを、公知の発現プロファイルと比較することによって、特定の場合における特定の疾患または障害の診断を可能にし得る。将来において発症する特定の疾患または障害に対する素因または感受性はまた、特定の場合において、遺伝子発現プロファイルを評価することによって同定され得る。遺伝子発現プロファイル分析はまた、とりわけ、特定の場合における遺伝的カウンセリングおよび法廷試験について有用であり得る。特定の実施形態において、１つ以上の標的核酸配列に対する遺伝子発現プロファイルは、本明細書中で開示される本願方法に従って得られる定量的情報を使用して編集され得る。
特定の実施形態において、サンプルについてのいくつかの標的核酸配列の遺伝子発現レベルが既知である場合、このサンプルについての遺伝子発現プロファイルが編集され、他のサンプルと比較され得る。例えば、限定されないが、サンプルは、同じ細胞集団由来の細胞の２つのアリコートから得られ得、ここで、１つのアリコートは、化合物または薬物の存在下において増殖し、もう一方のアリコートは、増殖しなかった。薬物の存在下での増殖する細胞に対する遺伝子発現プロファイルを薬物の非存在下で増殖する細胞と比較することによって、特定の標的遺伝子の発現に対する薬物効果を決定し得る。
（タンパク質検出）
本発明の特定の実施形態において、サンプル中の少なくとも２つの標的タンパク質の存在または非存在を検出する方法が、提供される。特定の実施形態において、本方法は、少なくとも２つの標的タンパク質の各々に対して特異的な異なるプローブセットと、サンプルとを合わせる工程を包含し、各プローブセットは：（ａ）少なくとも１つの分離ビーズ（磁性粒子を含む）、第１のコード可能標識（少なくとも２つの標識を含む）、および第１の標的特異的プローブ（ここで、第１のコード化可能標識は、第１の標的特異的プローブに対して特異的である）ならびに（ｂ）少なくとも１つの検出ビーズ（少なくとも２つの標識を含む第２のコード化可能標識を含む）および第２の標的特異的プローブ（ここで、第２のコード可能標識は、第２の標識特異的プローブに対して特異的である）を含む。特定のこのような実施形態において、第１および第２の標識特異的プローブは、同じ標的タンパク質の異なる部分に結合する。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、標的タンパク質が、サンプル中に存在する場合、形成される。特定の実施形態において、本方法は、少なくとも２つの標的タンパク質の各々に対する検出可能な複合体を計数することによって、サンプル中の少なくとも２つの異なるタンパク質の存在または非存在を検出する工程をさらに包含する。
特定の実施形態において、標的特異的プローブは、抗体または抗体のフラグメントである。
例えば、特定の実施形態において、第１の標的特異的プローブは、特定の標的タンパク質の第１の部分に特異的に結合し得る第１の抗体であり、第２の標的特異的プローブは、標的タンパク質の異なる第２の部分に特異的に結合し得る第２の抗体である。特定のこのような抗体に対する抗体を調製する非限定的な例として、標的タンパク質の１つのフラグメントが、第１の抗体を産生するために使用され、標的タンパク質の異なるフラグメントは、第２の抗体を産生するために使用される。第１の抗体は、磁性分離部分に結合される。第２の抗体は、コード化可能標識に結合される。
特定の実施形態において、標的タンパク質の存在下で、第１の抗体および第２の抗体は、標的タンパク質の異なる部分に特異的に結合し、その結果、タンパク質に対する第１の抗体および第２の抗体いずれかの結合が、もう一方の抗体のタンパク質に対する結合を阻害しない。標的タンパク質が存在する場合、検出可能な複合体が形成される。特定の実施形態において、検出可能な複合体は、上記に議論される分離技術を使用して、非結合抗体から分離され得る。コード化可能標識の特有の組み合わせを計数することによって、特定の検出可能な複合体の存在または非存在を検出し、このことは、サンプル中の標的タンパク質の存在または非存在を示す。特定の実施形態において、検出可能な複合体の数を決定することによって、サンプル中の標的タンパク質の量を決定し得る。
（キットの特定の実施形態）
特定の実施形態において、サンプル中の標的核酸配列を検出するためのキットが、提供される。特定の実施形態において、キットは、標的核酸配列の各々に対して特異的な異なるビーズセットを含む。特定の実施形態において、各異なるビーズセットは、以下：（ａ）少なくとも１つの分離ビーズ（磁性粒子を含む）、第１のコード化可能標識（２つ以上の標識を含む）、および第１の標的特異的プローブ（ここで、第１のコード化可能標識は、第１の標的特異的プローブに対して特異的である）、ならびに（ｂ）少なくとも１つの検出ビーズ（２つ以上の標識のセットを含む第２のコード可能標識を含む）、および第２の標的特異的プローブ（ここで、第２のコード化可能標識は、第２の標的特異的プローブに対して特異的である）を含み、ここで、第２のコード化可能標識は、第２の標識特異的プローブに対して特異的であり；そして第１のコード化可能標識は、第２のコード化可能標識と検出可能に異なる。特定の実施形態において、各セット中の標的特異的プローブは、相補的標的配列上に互いに隣接してハイブリダイズされる場合、一緒に連結されるのに適している。
特定の実施形態において、キットは、連結剤を含む。特定の実施形態において、連結剤は、リガーゼである。特定の実施形態において、連結剤は、熱安定性リガーゼである。特定の実施形態において、熱安定性リガーゼは、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼの少なくとも１つから選択される。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示し、本発明の範囲を全く限定しない。
（実施例１）
以下の実験は、ビーズに結合されたプローブが、標的核酸配列にハイブリダイズし、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）において連結されたことを示した。ビーズに結合されるプローブを用いて産生される連結産物の量を、ビーズに結合されなかった同じプローブによって産生される連結産物の量と比較した。
磁性ビーズを、オリゴヌクレオチドプローブに結合した。ストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズを、Ｓｅｒａｄｙｎｅ（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ．，ＬｏｔＮｏ．１１３５６４）から得た。ビオチンを、以下のようにオリゴヌクレオチドプローブ（標的特異的オリゴヌクレオチド（ＴＳＯプローブ））に結合した。ビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブ（標的特異的オリゴヌクレオチド（ＴＳＯプローブ））を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。ＴＳＯプローブを、標的核酸配列にハイブリダイズするように設計した。ＴＳＯプローブの配列を、以下の表２に示す。約１００μｌのストレプトアビジンコート磁性ビーズ（１ｍｇ／ｍｌ）を、０．２ｍｌチューブ中の、１００μｌのビオチン−ＴＳＯプローブ（１０μＭ）に添加した。混合物を、４℃で６０分間インキュベートし、ビオチンをストレプトアビジンに結合させた。
（表２）
Figure 2009229468
 次いで、磁性ビーズを、以下のように、洗浄し、ビーズから非結合ＴＳＯを除去した。４０μｌのＰＢＳ緩衝液を、各々０．２ｍｌチューブ中の２０μｌの混合液に添加した。ＰＢＳ緩衝液は、以下を含有した：
ＫＰＯ４（二塩基性） １．８２ｇ／ｌ
ＮａＰＯ４（一塩基性） ０．２２ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ８．７６ｇ／ｌ
ｐＨ７．４に調整された。
サンプルを、軽くボルテックスし、次いで、４分間磁石の上に置いた。４分後、４０μｌを、各々の０．２ｍｌのチューブから除去する一方、０．２ｍｌのチューブを、なお磁石の上に置いた。各チューブから４０μｌの上清を、後の分析のために１ｍｌのチューブ中で保存した。全部で４回の磁気分離および洗浄について、磁気分離および洗浄を、３回を超えて繰り返した。
第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ｐＴＳＯプローブ）を、ＴＳＯプローブ配列に対して相補的な領域に続く、標的核酸配列にハイブリダイズするように設計した。ｐＴＳＯプローブは、ＴＳＯプローブおよびｐＴＳＯプローブの両方が、標的核酸配列にハイブリダイズする場合、ＴＳＯプローブに隣接している。ＴＳＯプローブおよびｐＴＳＯプローブの両方が、標的核酸配列にハイブリダイズする場合、これらは、連結反応において一緒に連結され得る。ビオチン標識ｐＴＳＯプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。ｐＴＳＯプローブの配列を、表２に示す。
ストレプトアビジンでコートされた蛍光ビーズを、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ，ＩＮ）から得た。
連結反応（ＯＬＡ）を、実施した。１１の異なる反応を、磁性ビーズを結合されたＴＳＯプローブ、蛍光標識されたストレプトアビジンコートビーズ、ビオチン結合されたｐＴＳＯプローブ、リガーゼおよび各反応について異なる濃度の合成標的核酸と混合することによって調製した。合成標的の配列を、表２に示す。１１反応の各々において合成標的核酸配列濃度は、高い順に１０ｎＭ〜１０ａＭ程度までの範囲であった（実際の濃度については、図１５を参照のこと）。合成標的核酸配列を有さない１つのコントロールが存在した。
反応のための配合表は、以下の通りであった：
２μｌ １０×Ｔａｑ リガーゼ緩衝液
２μｌ ビオチン−標識ｐＴＳＯプローブ（１００ｎＭ）
２μｌ 蛍光ビーズ（１００μｇ／ｍｌ）
１６μｌ ＴＳＯに結合された磁性ビーズ（１ｍｇ／ｍｌ）
０．５μｌ リガーゼ（４０Ｕ／μｌ）
２μｌ 合成標的（１０ｎＭ〜１０ａＭ）。
連結反応を、ＡＢＩ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで、９５℃１５秒での１０サイクルの間インキュベートし、次いで、５０℃で２０分間冷却した。Ｔａｑリガーゼおよびリガーゼ緩衝液を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号Ｍ０２０８）から得た。
連結反応後、磁性ビーズを、洗浄し、任意の連結されない蛍光ビーズを除去した。４０μｌのＰＢＳ緩衝液を、０．２ｍｌのチューブの各々において、２０μｌの混合物に添加した。サンプルを、軽くボルテックスし、次いで、４分間磁石の上に置いた。４分後、４０μｌを、各々の０．２ｍｌチューブから除去する一方、０．２ｍｌチューブを、なお磁石の上に置いた。各チューブからの４０μｌの上清を、後の分析のために、１ｍｌのチューブに保存した。全部で４回の磁気分離および洗浄について、磁気分離および洗浄を、３回を超えて繰り返した。
ビーズを含む１１のＯＬＡ反応に加えて、１１の他のＯＬＡ反応を、ビーズを有さない同じＴＳＯプローブおよびｐＴＳＯプローブ、同じリガーゼ、同じリガーゼ緩衝液、ならびに同じ濃度の標的核酸配列を使用して、ビーズなしで実施した。これらの反応のための配合表は、以下の通りであった：
２μｌ １０× リガーゼ緩衝液
１１．５μｌ 水
２μｌ ビオチン−標識ＴＳＯプローブ（１００ｎＭ）
２μｌ ビオチン−標識ｐＴＳＯプローブ（１００ｎＭ）
０．５μｌ リガーゼ（４０Ｕ／μｌ）
２μｌ 合成標的（１０ｎＭ〜１０ａＭ）。
種々の濃度の各々の反応液からの磁性ビーズを、次いで、磁石を用いて反応液から除去した。ビーズを、上記されるように洗浄し、各異なる反応について別々の検出容器に移した。検出容器は、Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓｅｒ計数チャンバー（ＶＷＲ、カタログ番号１５１７０−０４８）であった。連結産物の蛍光ビーズを、次いで、ＡＢＩ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて検出した。
図１６は、５つの反応から可視であるビーズ対（蛍光ビーズを含む）の５枚の写真および可視光顕微鏡のみによる磁性ビーズ写真を示す。各パネルにおける１つの「ビュー」は、約０，５μｌの平均容積の連結産物を表す。図１６は、蛍光ビーズが、磁性ビーズと首尾良く対形成し、洗浄され、そして移動されたことを示す。
プローブに結合されたビーズとのＯＬＡ反応は、プローブに結合されたビーズ無しでの対応標的濃度のＯＬＡ反応の各々と比較された。連結産物は、ＴａｑｍａｎＴＭ分析を用いて測定された。
３９９−Ｔａｑｍａｎプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。プローブの配列は、表２に与えられる。ＴａｑｍａｎＴＭプローブおよびそれらを使用するための手順は、例えば、米国特許第５，５３８，８４８号に記載される。ＴａｑｍａｎＴＭプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって作動する。ＴａｑｍａｎＴＭプローブは、標的が存在する場合、標的核酸配列にハイブリダイズする。Ｔａｑｍａｎプローブは、プローブの１つの端部に蛍光分子を有し、そしてプローブの他の端部にクエンチング分子を有する。プローブが結合された蛍光分子およびクエンチング分子の両方とインタクトである場合、蛍光はない。
標的核酸配列にもハイブリダイズするプライマーが添加される。次いで、重合反応は、プライマーにおいて開始し、これは、ヌクレオチドをプライマーの末端に追加する。標的核酸配列上のＴａｑｍａｎＴＭプローブは、ＤＮＡ重合の間に存在する鎖置換の結果として、重合反応の間に切断される。この切断は、蛍光分子をプローブ上のクエンチング分子の存在から自由し、これは、蛍光分子の蛍光を生じる。従って、蛍光の検出は、ポリメラーゼ反応に関与する特定の標的核酸配列の存在を示す。
さらに、蛍光のレベルは、サンプル中の標的核酸配列の量と相関する（蛍光のレベルが、高くなるにつれて、標的核酸配列の量は多くなる）。所定のサンプルについての蛍光のレベルについてのＣｔ値は、計算され得る。Ｃｔ値は、蛍光のレベルと逆に相関する。言い換えれば、Ｃｔ値がより低くなると、蛍光のレベルは、より高くなる。
２２の異なるＯＬＡ反応からの産物の各々についてのＴａｑｍａｎＴＭ分析のための方法は、以下の通りであった：
１μｌ ３９９−ＴａｑｍａｎＴＭプローブ（５μＭ）
２．５μｌ １１６／１１５プライマー（１０μＭ）
６．５μｌ 水
１２．５μｌ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
先のＯＬＡ反応からの２．５μｌ サンプル
ＴａｑｍａｎＴＭ反応を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒の第１工程、および６０℃で１分の第２工程を含むサイクルが続く。特定の数のサイクルの後、シグナルが現れる。シグナルが現れる前に反応が受けるサイクルの数が記録され、そしてＣｔ値として呼ばれる。ＴａｑｍａｎＴＭ分析反応のための１１６／１１５プライマーの配列を、表２に与える。Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た（カタログ番号４３１８７３９）。
存在するビーズとのＯＬＡ反応の各々の産物のＴａｑｍａｎアッセイは、ビーズ無しでの対応標的核酸配列濃度のＯＬＡ反応の産物と比較された。結果は、図１５に示される。図１５のＴａｑｍａｎ分析は、溶液中のプローブおよびビーズに結合されたプローブについて、ハイブリダイゼーション（１時間未満）および標的感度（１ｆＭより高い）を示す。検出は、約１時間の反応時間で起こった。
（実施例２）
異なる量の合成標的分子が使用された場合に検出されたビーズ対の数を決定するために、以下の実験を行った。
ポリスチレンビーズをＢａｎｇから得た（番号、ＰＡ０５Ｎ／２０５７）。ビーズは、約３．１μｍの直径であり、１μｍ２当たり１０５部位の密度で表面上に−ＮＨ２基を有し（製造業者に従う）、そして１．０７３ｇ／ｃｍ３の密度を有した。
実施例１において考察されるように、ＴＳＯプローブは、標的核酸配列にハイブリダイズするように設計された。ＴＳＯプローブの配列を表２に与える。ＴＳＯプローブは、以下のプロトコルに従って、Ｂａｎｇビーズのアミン基に対して５’末端に取り付けられて、ＴＳＯ−ビーズを作製した。
ビーズ（１００ｍｇ／ｍｌにおいて１．０ｍｌ）を、先に記載されたように、１０．０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。第２の洗浄後、ビーズを１０．０ｍｌのグルタルアルデヒド溶液（ＰＢＳ中１０％のグルタルアルデヒド）中に再懸濁させた。ビーズを、連続的に混合しながら、２時間室温で反応させた。次いで、ビーズを、先に記載されたように、２回、ＰＢＳ中で洗浄し、そして５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。アミン結合ＴＳＯプローブを、５ｍｌのＰＢＳ中に配置し、そしてビーズを含む５ｍｌの溶液と組み合わせた。この混合物を室温で、２〜４時間、連続的に混合しながら反応させた。次いで、ビーズを再び洗浄し、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。再懸濁されたビーズを３０分間インキュベートさせた。次いで、ビーズをもう一回洗浄し、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍｌのＰＢＳを貯蔵庫ににおて再懸濁させた。
上に議論されるように、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ｐＴＳＯプローブ）を、ＴＳＯプローブ配列に相補的な領域に隣接する標的核酸分子配列にハイブリダイズするように設計した。ｐＴＳＯプローブは、ＴＳＯプローブおよびｐＴＳＯプローブの両方が標的核酸配列にハイブリダイズする場合、ＴＳＯプローブに隣接する。ＴＳＯプローブおよびｐＴＳＯプローブの両方が標的核酸配列にハイブリダイズする場合、これらは、連結反応において一緒に連結し得る。ビオチン標識ｐＴＳＯプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成され、そこから得られた。ｐＴＳＯの配列は、表２に与えられる。
オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応を実施した。ＴＳＯビーズをビオチン標識ｐＴＳＯ、リガーゼおよび合成標的と種々の濃度で混合することによって、８つの異なる反応を調製した。反応混合物は、以下の通りであった：
２μｌ １０×リガーゼ緩衝液
２μｌ ビオチン標識ｐＴＳＯ（１００ｎＭ）
２μｌ ＴＳＯ−ビーズ
１４μｌ ｄｄＨ２Ｏ
０．２５μｌ リガーゼ（４０Ｕ／μｌ）
２μｌ 合成標的（１ｎＭ〜１ｆＭの種々の濃度および標的無しでの１つの反応）。
連結反応を、ＡＢＩ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにおいて、９５℃で１５秒間、次いで、５０℃で２０分間に冷却する１０サイクルで、インキュベートした。Ｔａｑ Ｌｉｇａｓｅおよびリガーゼ緩衝液を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから得た（カタログ番号、Ｍ０２０８）から得られた。
ストレプトアビジンコート磁性ビーズを、Ｓｅｒａｄｙｎｅから得た（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ．，Ｌｏｔ番号１１３５６４）。これは、４０％磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）を含むポリスチレンから作製され、約１．０μｍの直径であり、そして１．５ｇ／ｃｍ２の密度を有した。ストレプトアビジンは、ビーズ当たり１０７部位の密度で、ビーズの表面にあった。
別の反応において、２０μｌの各々の８個の異なるＯＬＡ反応物を、２０μｌのストレプトアビジンコートビーズ（１０６ビーズ／μｌ）に添加した。これらの混合物を、１時間、４℃でインキュベートした。
インキュベーション後、各々４０μｌのＯＬＡストレプトアビジンコートビーズ混合物を、手短にボルテックスし、次いで、ＶＷＲ「Ａｑｕａｓｏｎｉｃ」超音波クリーナーにおいて、出力レベル９で１０秒間超音波処理した。超音波処理後、２０μｌの各々の混合物を、別々の０．２ｍｌのチューブに配置し、次いで、磁気分離に供し、そして洗浄した。
磁気分離および洗浄の手順は、以下の通りであった。４０μｌのＰＢＳ緩衝液を、０．２ｍｌのチューブの各々に、２０μｌの混合物に添加した。サンプルを手短にボルテックスし、次いで、４分間、磁石の上部に配置した。４分後、４０μｌを、０．２ｍｌのチューブの各々から除去し、一方、０．２ｍｌのチューブを依然として磁石上においた。各チューブからの４０μｌの上清を、後の分析のために、１ｍｌのチューブに保存した。磁気分離および洗浄を、合計４回の磁気分離および洗浄のために、さらに３回繰り返した。
磁気分離および洗浄の後に、１ｍｌのチューブにおいて収集された上清の各々を、５分間、遠心分離した。
磁気分離および洗浄後に、０．２ｍｌのチューブに残った８つの異なるＯＬＡ反応の各々の残留物の一部をＴａｑｍａｎＴＭ分析に供して、各反応における連結されたビーズ対の数を決定した。さらに、ＴａｑｍａｎＴＭ分析を、１ｍｌのチューブ中の上清の各々の一部について実施して、どれだけ多くのビーズ対が、磁気分離手順によって洗浄緩衝液から分離されなかったかを決定した。
３９９−Ｔａｑｍａｎプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって提供された。プローブの配列を、表２に与える。一般的に、ＴａｑｍａｎＴＭプローブおよびそれらを使用するための手順は、例えば、米国特許第５，５３８，８４８号に記載される。ＴａｑｍａｎＴＭプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって作動する。ＴａｑｍａｎＴＭプローブは、標的が存在する場合、標的核酸配列にハイブリダイズする。Ｔａｑｍａｎプローブは、プローブ一端上の蛍光分子およびプローブの他端におけるクエンチング分子を有する。プローブが、結合された蛍光分子およびクエンチング分子の両方でインタクトである場合、蛍光は無い。
標的核酸配列にもハイブリダイズするプライマーを添加する。次いで、ポリメラーゼ反応を、プライマーにおいて開始し、これは、ヌクレオチドをプライマーの末端に追加する。標的核酸配列上のＴａｑｍａｎＴＭプローブは、ＤＮＡ重合の間に存在する鎖置換の結果として、重合反応の間に切断される。この切断は、蛍光分子をプローブ上のクエンチング分子の存在から自由にし、これは、蛍光分子の蛍光を生じる。従って、蛍光の検出は、ポリメラーゼ反応に関与する特定の標的核酸配列の存在を示す。
さらに、蛍光のレベルは、サンプル中の標的核酸配列の量と相関する（蛍光のレベルが、高くなるにつれて、標的核酸の量は多くなる）。所定のサンプルについての蛍光のレベルについてのＣｔ値は、計算され得る。Ｃｔ値は、蛍光のレベルと逆に相関する。言い換えれば、Ｃｔ値がより低くなると、蛍光のレベルは、より高くなる。
８つの異なるＯＬＡ反応からの産物および８つの取っておいた上清の各々についてのＴａｑｍａｎＴＭ分析のための方法は、以下の通りであった：
１μｌ ３９９−ＴａｑｍａｎＴＭプローブ（５μＭ）
２．５μｌ １１６／１１５プライマー（１０μＭ）
６．５μｌ 水
１２．５μｌ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
先のＯＬＡ反応からの２．５μｌ サンプル
ＴａｑｍａｎＴＭ反応を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒の第１工程、および６０℃で１分の第２工程を含むサイクルが続く。ＴａｑｍａｎＴＭ反応のための１１６／１１５プライマーの配列を、表２に与える。Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た（カタログ番号４３１８７３９）。
さらに、各反応および収集された各々の上清由来のビーズ対の一部を、グリッド上に別々にプレートした。このグリッドは、上清の各々および反応の各々におけるビーズ対の合計数を計算するために視覚的に検査された。
ＴａｑｍａｎＴＭ分析および視覚的検査の結果を、図１７および表３、４、および５に示す。
（視覚検査により決定した場合の各反応におけるビーズ対およびビーズの数）
Figure 2009229468
 表３は、各反応に対するグリッドにおいて計数されたビーズ対の総数、およびグリッドに入れられた反応物質の割合を考慮して各反応において磁気的に分離されたと計算されたビーズ対の数を示す。サンプル中に存在する標的分子あたりの生成されたビーズ対の計算された割合、およびビーズ対に組み込まれていないビーズの数もまた示される。
（Ｔａｑｍａｎ分析により決定された首尾良い連結の計算された数）
Figure 2009229468
 表４は、Ｔａｑｍａｎ分析により決定された場合の連結産物の計算された収量を示す。表４は、磁気分離手順の前後に存在したと計算された連結産物の濃度および数、ならびにサンプル中の標的あたりの生成された連結の計算された割合を示す。
（Ｔａｑｍａｎ分析による分離後の連結の数）
Figure 2009229468
 表５は、分離手順後に各反応系に存在していたと計算された連結産物の数を示す。表５はまた、磁気分離手順により洗浄緩衝液および他の反応物から分離されたＯＬＡ反応の各々において生成された連結の計算された割合を示す。連結産物の数を、Ｔａｑｍａｎアッセイにより決定した。
（実施例３）
直径約５．６μｍのコード化ポリスチレンビーズを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から購入した。購入したビーズは、２色の色素を含浸されており、そして異なる強度の色素を有し、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにより検出可能な特有の光学的コードを生じる。オリゴヌクレオチドを、Ｌｕｍｉｎｅｘのマニュアルに記載されるＮＨ２エステル化学を使用してビーズの表面に結合させた。１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ上のアミン基と結合されたオリゴヌクレオチドの５’末端との間に含ませた。このオリゴヌクレオチドは、２０塩基のプライマー配列と、特定の温度における最小の交差反応性で特異的にハイブリダイズするように設計された２０塩基長の配列（アドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）部分と呼ぶ）を含んでいた。このプライマー配列を、ＰＥＧリンカーとアドレス可能部分との間に配置した。オリゴヌクレオチドを結合させた後、このビーズを、ビーズに共有結合していないオリゴヌクレオチドを除去するために、上記の実施例１で記載したように、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。この洗浄は、５０〜６５℃であり、そして２０分続けた。異なるようにコード化された２つのビーズに結合された、２つの異なるアドレス可能な部分を伴う２つの異なるオリゴヌクレオチドの配列を、以下の表６に示すようにＺ１およびＺ２と名付ける。Ｚ１およびＺ２の配列のアドレス可能な部分を、太字で示す。
Figure 2009229468
 第１のＬｕｍｉｎｅｘビーズ（Ｂ１）のセットおよび第２のＬｕｍｉｎｅｘビーズ（Ｂ２）のセット（一セットあたり１０，０００ビーズ）を使用した。第１のビーズ（Ｂ１）は、第１のコード化可能標識およびオリゴヌクレオチドＺ１を含んでいた。第２のビーズ（Ｂ２）は、第２のコード化可能標識およびオリゴヌクレオチドＺ２を含んでいた。
連結プローブを以下のように使用した。２つのプローブは、対立遺伝子特異的オリゴ（ＡＳＯ１およびＡＳＯ２、表６に示される）であり、これらは、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む標的配列に相補的な標的特異的部分を含んでいた。これらのＡＳＯを、プローブの３’末端に位置する、ＳＮＰに相補的な塩基を含むように設計した。従って、ＡＳＯ１およびＡＳＯ２は、それらの３’末端に異なる塩基を有していた。
ＡＳＯ１は、標的特異的部分の５’側にアドレス可能な部分を含んでいた。ＡＳＯ２は、標的特異的部分の５’側に異なるアドレス可能な部分を含んでいた。両方のＡＳＯとも、４０塩基長であった。ＡＳＯの３’末端における２０塩基は、標的特異的部分であり、一方５’末端における２０塩基は、アドレス可能部分であった。ＡＳＯ１およびＡＳＯ２のアドレス可能部分を、表６において太字で示す。
遺伝子座特異的オリゴ（ＬＳＯ）もまた提供される。ＬＳＯの配列を表６に示す。ＬＳＯは、ＡＳＯの標的特異的部分に相補的である標的の部分に隣接して、標的に対して相補的な標的特異的部分を含んでいた。それにより、ＬＳＯおよびＡＳＯ１またはＡＳＯ２は、標的にハイブリダイズした場合に、一緒に連結するのに適していた。ＬＳＯは、ＰＥＧリンカーで３’末端に結合されたビオチン分子を有していた。このＰＥＧリンカーを、３’末端の最後のヌクレオチドとビオチン分子との間に配置した。ＬＳＯは、４０塩基長であった。ＬＳＯの５’末端における２０塩基は、標的特異的部分であり、一方ＬＳＯの３’末端における２０塩基は、特定のＴａｑｍａｎプライマーに相補的であった。
合成テンプレートＺ３は、ビーズＢ１上のオリゴヌクレオチドＺ１のアドレス可能な部分に相補的な３’末端配列を含んでおり、そしてＡＳＯ１上のアドレス可能な部分に相補的な５’末端配列を含んでいた。その結果、ＡＳＯ１およびオリゴヌクレオチドＺ１は、合成テンプレートＺ３にハイブリダイズした場合に連結に適切である。
合成テンプレートＺ４は、ビーズＢ２上のオリゴヌクレオチドＺ２のアドレス可能な部分に相補的な３’末端配列を含んでおり、そしてＡＳＯ２上のアドレス可能な部分に相補的な５’末端配列を含んでいた。その結果、ＡＳＯ２およびオリゴヌクレオチドＺ２は、合成テンプレートＺ４にハイブリダイズした場合に結合に適切である。
標的は、３０分間１００℃で加熱されたゲノムＤＮＡであった。この標的は、ＡＳＯ１に相補的であるがＡＳＯ２に相補的でない一塩基多型（ＳＮＰ）を含むことが既知であった（他の手段により確認した）。
連結反応体積は、６．７５マイクロリットルであった。この反応混合物は以下のとおりであった。
０．５μｌ １０×リガーゼ緩衝液
０．５μｌ １００ｎＭのＡＳＯ１プローブ（３×１０１０個のプローブ）
０．５μｌ １００ｎＭのＡＳＯ２プローブ（３×１０１０個のプローブ）
０．５μｌ １００ｎＭのＬＳＯプローブ（３×１０１０個のプローブ）
０．５μｌ １０ｎＭ濃度のテンプレートＺ３（３×１０９個の分子）
０．５μｌ １０ｎＭ濃度のテンプレートＺ４（３×１０９個の分子）
１μｌ Ｂ１の溶液（１０，０００個のビーズ）
１μｌ Ｂ２の溶液（１０，０００個のビーズ）
０．２５μｌ Ｔａｑリガーゼ（４０単位／μｌ）
０．５μｌ 加熱したｇＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）
Ｔａｑリガーゼおよび１０×リガーゼ緩衝液を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号Ｍ０２０８）から購入した。ビーズを、１０秒間超音波処理して、その後反応混合物に加えた。この反応混合物を、熱サイクルにかけて、５０℃にて５分間から初めて、ＡＳＯプローブおよびＬＳＯプローブを標的に対してハイブリダイズさせて連結させ、そしてＺ１オリゴヌクレオチドまたはＺ２オリゴヌクレオチドを、合成テンプレート上のＡＳＯプローブに連結させた。次いで、標的からプローブを変性させるために温度を８５℃まで１５秒間上げて、そしてプローブおよびオリゴヌクレオチドから合成テンプレートを変性させた。このサイクルを１００回繰り返した。この熱サイクルの完了時に、ビーズをＰＢＳ緩衝液０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で８５℃にて３回洗浄した。
約１千万個の直径１μｍのストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズを、連結反応後に反応混合物と混合した。このビーズを、Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．から購入し、そしてこのビーズは、４０％の磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）を含むポリスチレン製であり、１．５ｇ／ｃｍ３の密度を有し、そしてストレプトアビジンコーティング（ビーズ１個あたり１０５〜１０６個のストレプトアビジン分子）を有していた。使用前に、この磁性ビーズを、ＰＢＳ緩衝液０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ＢＳＡで５回洗浄し、そして１０秒間超音波処理した。ビオチン分子に磁性ビーズを結合するために使用した結合緩衝液は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む体積２０μｌのＰＢＳであった（連結反応からの反応混合物１０μｌ、磁性ビーズ１０μｌ）。２０μｌ体積の磁性ビーズおよび連結反応からの反応混合物は、結合混合物を形成し、そしてこれをチューブを連続的に回転させながら、室温（２５℃）にて２時間このチューブ中でインキュベートした。磁性ビーズ上のストレプトアビジンがＬＳＯ上のビオチンに結合していた場合、ビーズ対が形成した。
結合混合物をインキュベートした後、この結合混合物を１０秒間超音波処理した。この結合混合物を第１のチューブにピペットで移し、この第１のチューブを、６×ＳＳＣ（９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．９ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の高密度溶液（約１．３ｇ／ｃｍ３）および０．１％ウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で満たした第２のチューブに入れておいた。この第１のチューブは底を有していないので、これは、この高密度溶液で部分的に満たされていた。結合混合物のより低密度（約１．０５ｇ／ｃｍ３）の結合緩衝液は、有意な混合なしに高密度液の上部に留まっていた。これらのチューブの下に位置する磁石は、磁性ビーズを第２のチューブの底に誘引した。
磁性ビーズと対をなしていないＬｕｍｉｎｅｘビーズは、第１のチューブの上部の方に留まり、そしてこれらは第２のチューブから第１のチューブを取り出すことにより廃棄した。この取り出すことは、第１のチューブの上部を覆い、次いで第１のチューブを第２のチューブから持ち上げることにより行った。次いで、磁性ビーズにより下に引張られた検出可能な複合体におけるＬｕｍｉｎｅｘビーズを、磁気から放して、そしてボルテックスして均質な溶液とした。次いで、この均質溶液をフローサイトメーターに吸引した。このＬｕｍｉｎｅｘビーズをある時点で読み出し、そしてそれらの正体をビーズ（Ｂ１またはＢ２）上の特有のコードにより決定した。ほとんど全てのＬｕｍｉｎｅｘビーズが、Ｂ１ビーズであり、ＡＳＯ１に対応するＳＮＰの存在を示していた（データは示さず）。

Claims (1)

  1. 標的を定量するための方法であって、該方法は、以下：
    該標的をおそらく含むサンプル；コード化可能標識；１つ以上の標的特異的プローブ；および分離部分、を含む反応混合物を形成する工程であって、ここで、各標的特異的プローブは、選択的結合条件下で該標的に特異的に結合する、工程；
    該標的が存在する場合に検出可能な複合体が生じるような反応条件下で該反応混合物を処理する工程であって、該検出可能な複合体は、該コード化可能標識、該標的特異的プローブおよび該分離部分を含む、工程；ならびに
    コード化可能標識の数を計数することによって、該標的を定量する工程、
    を包含する、方法。
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