JP2009298752A

JP2009298752A - 皮膚外用剤組成物

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Publication number: JP2009298752A
Application number: JP2008158042A
Authority: JP
Inventors: Kaori Inoue; かおり井上; Yuji Katsuta; 雄治勝田; Toshihiko Hibino; 利彦日比野
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2008-06-17
Publication date: 2009-12-24

Abstract

【課題】皮膚刺激性が極めて低く、且つ優れた表皮細胞増殖促進作用を有し、しかも簡便に使用することが可能な皮膚外用剤組成物を提供する。
【解決手段】本発明にかかる皮膚外用剤組成物は、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含有することを特徴とする。
前記皮膚外用剤組成物において、ＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することが好適である。
前記皮膚外用剤組成物において、キサンチン誘導体がカフェイン及び／またはテオフィリンであることが好適である。
また、前記皮膚外用剤組成物において、該組成物は表皮細胞増殖促進剤であることが好適である。
また、本発明にかかるリーブオン型化粧料は、前記皮膚外用剤組成物を含むことを特徴とする。
また、本発明にかかる表皮細胞増殖促進方法は、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含む皮膚外用剤組成物を皮膚表面に適用することを特徴とする。
前記方法において、皮膚外用剤組成物がＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することが好適である。
【選択図】なし

Description

本発明は皮膚外用剤組成物、特にＡＤＰ及びキサンチン誘導体の配合による低皮膚刺激性の表皮細胞増殖促進剤としての使用に関する。

従来、ＡＴＰ及びＡＤＰは、表皮細胞増殖作用を有することが知られていた（非特許文献１）。前記作用は、表皮細胞に存在し、ＡＴＰやＡＤＰが結合するＡＴＰ受容体のサブタイプであるＰ２Ｙ_１及びＰ２Ｙ_２を介したものであると考えられている。また、ＡＤＰが特にＰ２Ｙ_１のアゴニストであることも知られている。
また、一般にケミカルピーリング剤に用いられるグリコール酸が表皮細胞の増殖をもたらすことが知られており、そのメカニズムが報告されている（特許文献１）。特許文献１では、グリコール酸（α−ヒドロキシ酸の一種）が表皮細胞に存在するＴＲＰＶ１（ＶＲ１）受容体に結合することにより、表皮細胞内のＣａイオンが増加し、表皮細胞から細胞外にＡＴＰを遊離すること、それがＰ２Ｙ受容体に結合し、その結果増殖を誘導することが明らかにされている。また、同文献には乳酸についても、マウス表皮細胞においてＡＴＰの細胞外遊離を誘起することが報告されている。
すなわち、これらはある一定濃度の細胞外ＡＴＰによって、表皮細胞の増殖が亢進されることを示唆している。

しかしながら、前記ＴＲＰＶ１受容体は、ケミカルピーリング剤などの酸による刺激によって活性化するため、用いうる酸濃度によっては皮膚刺激、発赤、ピリピリ感、疼痛を惹起することが知られている。また、皮膚に炎症刺激を与えるという性質から、薬剤濃度調整が極めてデリケートである上、厳格に設定された塗布時間の後直ちに薬剤を洗い流す等、その適用方法においても管理を要するため、一般にケミカルピーリングは専門医による施術が推奨されている。したがって、刺激が少なく、且つ皮膚の細胞増殖効果にも優れ、しかも通常の化粧品のように簡便に使用することのできる薬剤の開発が望まれていた。

ところで、ＨａＣａＴｃｅｌｌｌｉｎｅ（株化ヒトケラチノサイト）には、ＡＤＰのＡＴＰ変換に関与するアデニル酸キナーゼ、Ｆ_１Ｆ_０ＡＴＰシンターゼ、及びヌクレオチドジホスホキナーゼ（ＮＤＰＫ）が存在し、皮膚細胞（ＨａＣａＴ）培養系にＡＤＰを添加するとＡＴＰ濃度の上昇が認められたことが報告されている（非特許文献２）。
また、有効量のＡＤＰを含む化粧品もしくは医薬組成物が皮膚の線維芽細胞のＡＴＰレベルを増加させ、皮膚老化を防止し得ることが開示されている（特許文献２）。
これらの知見から、前述した従来のケミカルピーリング剤（酸）に替え、ケラチノサイトにＡＤＰを供給することで、皮膚に炎症刺激を与えることなく細胞外へＡＴＰを遊離させることが可能となると考えられる。

しかしながら、ＨａＣａＴｃｅｌｌｌｉｎｅにおいて細胞外ＡＴＰを適用すると、時間と共に細胞外ＡＴＰ濃度が減少することから、ＡＴＰ分解酵素の存在もまた示唆されている（非特許文献２）。すなわち、ヒトケラチノサイトには、ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素と、そのＡＴＰを分解する酵素が存在する。したがって、細胞外にＡＤＰを適用し、それがＡＴＰに変換されたとしても、ＡＴＰ分解酵素による作用を受けてＡＴＰ遊離量が減少し、細胞増殖に寄与するほどのＡＴＰ濃度を維持することができなかった。
Greig AVH etal,: Purinergic receptors are part of a functional signaling system forproliferation and differentiation of humab epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 120:1007-1015, 2003 Burrell,H. E., Wlodarski, B., et al.,: Human Keratinocytes Release ATP and UtilizeThree Mechanisms for Nucleotide Interconversion at the Cell Surface. J. Biol.Chem., Vol. 280, No. 33, pp. 29667-29676, 2005 特開２００６−２６２８０６号公報特表２００１−５０３４４７号公報

上記問題により、皮膚に炎症刺激を与えることなく細胞外のＡＴＰ濃度を高め、表皮細胞の増殖を賦活し得る皮膚外用剤は未だ知られていない。
本発明は、かかる事情に鑑みて行なわれたものであり、皮膚刺激性が極めて低く、且つ優れた表皮細胞増殖促進作用を有し、しかも簡便に使用することが可能な皮膚外用剤組成物を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために本発明者らが鋭意研究を行なった結果、ＡＤＰとキサンチン誘導体とを特定量配合した皮膚外用剤が、ＡＴＰの分解抑制及び細胞外ＡＴＰ濃度の上昇を引き起こし、これにより表皮細胞の増殖が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明にかかる皮膚外用剤組成物は、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含有することを特徴とする。
前記皮膚外用剤組成物において、ＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することが好適である。
前記皮膚外用剤組成物において、キサンチン誘導体がカフェイン及び／またはテオフィリンであることが好適である。
また、前記皮膚外用剤組成物において、該組成物は表皮細胞増殖促進剤であることが好適である。
前記皮膚外用剤組成物において、ＡＤＰ：キサンチン誘導体の配合比が、質量比で１：１〜５：１であることが好適である。
また、本発明にかかるリーブオン型化粧料は、前記皮膚外用剤組成物を含むことを特徴とする。
また、本発明にかかる表皮細胞増殖促進方法は、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含む皮膚外用剤組成物を皮膚表面に適用することを特徴とする。
前記表皮細胞増殖促進方法において、皮膚外用剤組成物がＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することが好適である。

本発明によれば、炎症刺激を伴わずに表皮細胞の増殖を賦活することがすることができる。本発明の皮膚外用剤組成物は皮膚に炎症を起こさないため、従来のケミカルピーリング剤では困難であったリーブオン型の化粧料として提供し、誰もが簡便に使用することを可能とする。また、前記組成物は、表皮細胞の増殖が促進されることにより、抗老化、美白、抗しわ、抗くすみ、創傷治癒等に有用である。

以下、本発明について詳細に説明する。
体内において、細胞内ＡＴＰが、例えば筋肉の収縮、生体物質の生合成、イオン輸送・濃縮などを起こす際にエネルギーとして非常に重要な役割を果たしていることは周知である。一方、細胞外ＡＴＰについては、１９９０年代になってＧ．Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋらによって情報伝達物質としての役割を果たしていることが見出され、細胞外に放出されたＡＴＰが情報伝達物質として周辺細胞に働きかけ、細胞増殖や痛みなど種々の生理作用が発現されることが明らかとなってきている。従来のケミカルピーリング剤は、この細胞外ＡＴＰの情報伝達物質としての役割を利用し、主成分である酸によって表皮細胞のＶＲ１受容体に炎症刺激を与え、この刺激により該細胞における細胞外ＡＴＰの遊離を促進し、細胞の増殖を誘導するというものである。すなわち、ケミカルピーリング剤は、炎症刺激によって表皮細胞の増殖機能を作動させることに基づく。
一方、本発明にかかる皮膚外用剤組成物は、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含むものである。前記皮膚外用剤組成物において、ＡＤＰは主にＡＴＰ合成に利用され、キサンチン誘導体は主にＡＴＰの分解を抑制する。これら両作用によって表皮細胞外ＡＴＰ濃度が上昇し、細胞増殖を促進せしめる。すなわち、本発明は細胞増殖に際して炎症刺激を必要としない。したがって、本発明は細胞増殖に際して炎症刺激を必要としないため、基本的に炎症刺激によりＶＲ−１受容体に作用する物質（ケミカルピーリング成分）を含まない。

以下、本発明により表皮細胞の増殖が促進される機構について説明する。
ＡＴＰ及びＡＤＰのようなＡＴＰアナログは、Ｐ２Ｘ（イオンチャンネル内蔵型）及びＰ２Ｙ（Ｇタンパク質共役型）の２つのサブグループを有するＰ２受容体の活性化を経て、増殖等の様々な細胞プロセスに関与することが知られている。Ｐ２受容体サブタイプの発現は種及び細胞型に依存し、正常なヒトケラチノサイトにおいては、Ｐ２Ｙ_１、Ｐ２Ｙ_２、Ｐ２Ｙ_４、Ｐ２Ｙ_６、Ｐ２Ｙ_１１、Ｐ２Ｙ_１２、Ｐ２Ｙ_１３の存在が確認されている。
例えば、組織の損傷などの状況下で近傍細胞から放出されたＡＴＰは、前記Ｐ２Ｙ受容体に結合することによって、細胞内Ｃａ濃度を増加させる。その後ＡＴＰは分解酵素により直ちにＡＤＰ、ＡＭＰ、もしくはアデノシンへ分解され、前記活性は沈静化する。
このような表皮細胞の増殖機構において、本発明は、ＡＤＰを配合した外用剤を皮膚へ適用することによって、ＡＴＰによるＰ２Ｙ受容体の活性化を積極的に誘起することを意図するものである。

ＡＤＰの供給により、表皮細胞におけるＡＤＰ濃度が０．０１ｍＭ以上となると、細胞外に遊離されるＡＴＰの量は顕著に増進する。したがって表皮細胞へＡＤＰを供給するほどＡＴＰの産生は活発になるが、生体に対する影響を考慮するならば、該細胞におけるＡＤＰの濃度は０．０１〜１００ｍＭ程度とすることが好適である。
本発明にかかる皮膚外用剤組成物の適用によって、表皮細胞におけるＡＤＰ濃度を前述のレベルとする場合、組成物中のＡＤＰ濃度が０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように配合することが好ましい。組成物における配合質量は前記濃度範囲に応じて適宜調整することができるが、好ましくは０．０００５〜５質量％である。
ケラチノサイト（表皮細胞）には、ＡＴＰ合成反応を触媒する酵素としてエクトアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）、エクトＦ_１Ｆ_０ＡＴＰシンターゼ、エクトヌクレオチドジホスホキナーゼ（ＮＤＰＫ）の存在が知られており、本発明によりケラチノサイトへ供給されたＡＤＰは、下記反応をもってＡＴＰへ変換される（Ｐｉはリン酸を示す）。

なお、上記反応を経由せず、ＡＴＰを直接皮膚外用剤組成物へ配合すると、様々な調節にかかるＡＴＰが過剰に供給されることによる生体システムへの影響が危惧される。したがって、本発明においては、ＡＤＰとして表皮細胞へ供給し、生体が上記合成酵素の調整を経て必要なＡＴＰを産出する形態とすることが好ましい。通常、表皮細胞へＡＤＰを供給すれば、ＡＤＰはＡＴＰに変換され、該ＡＴＰの細胞外への放出も活性化される。

また、ケラチノサイトには、上記ＡＴＰ合成酵素と共に、ＡＴＰをＡＤＰ及びＡＭＰへ加水分解するＡＴＰ分解酵素が存在する。
本発明者らは、ＡＴＰ分解酵素として知られる４種類のＮＴＰＤａｓｅのうち、３種類（ＮＴＰＤａｓｅ２、３、４）がヒトケラチノサイトにおいて発現していることを確認した。また、ＡＭＰをさらにアデノシンへ分解する酵素として５’−ヌクレオチダーゼが知られている。すなわち、ケラチノサイトでは、前述のＡＴＰ合成反応と共に下記ＡＴＰ分解反応が酵素調整の上行われている。

したがって、表皮細胞へＡＤＰを供給したのみでは、ＡＤＰから合成されたＡＴＰがＰ２受容体と結合せず、直ちに上記分解を受けてしまうことがある。そのため、供給したＡＤＰから変換されたＡＴＰを効率的に作用させるには、上記ＡＴＰ分解反応を抑制する必要があった。
上記の一連の分解反応の検討において、本発明者らは５’−ヌクレオチダーゼを阻害することが知られたキサンチン誘導体（Tsuzuki and Newburgh, 1975）が、ＡＴＰ分解にかかるＮＴＰＤａｓｅの発現を阻害することを見出した。

つまり、ＡＤＰとの共存下において、キサンチン誘導体を表皮細胞へ供給すると、細胞外ＡＴＰ合成酵素によってＡＤＰによるＡＴＰの合成がなされる共に、キサンチン誘導体によるＡＴＰの分解抑制が同時に機能する。これらの作用により、表皮細胞におけるＡＴＰ濃度は平常時よりも著しく高まってＡＴＰのＰ２Ｙ受容体への結合が活発化し、表皮細胞の増殖が促進されることになる。

特に、表皮細胞レベルでは、０．０１〜１００ｍＭのＡＤＰ共存下において、キサンチン誘導体濃度が０．０００５〜５％であると、ＡＴＰの細胞外遊離量は相乗的に増加する。
ＡＤＰの添加を伴わずにキサンチン誘導体を表皮細胞へ適用しても、ＡＴＰ産生の向上において十分な効果を得ることはできない。
本発明にかかる皮膚外用剤組成物の適用によって、表皮細胞におけるキサンチン誘導体濃度を前述の好適なレベルとする場合、組成物中にキサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％配合することが好ましく、より好ましくは０．０００５〜０．５質量％である。
本発明に用いることのできるキサンチン誘導体としては、例えば、キサンチン、アミノフィリン、テオフィリン、コリンテオフィリン、カフェイン、テオブロミン、１，７−ジメチルキサンチン、オクストリフィン、ジプロフィリン、プロキシフィリン等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、特にカフェイン及び／またはテオフィリンが好適である。
ＡＤＰに対するキサンチン誘導体の配合比は、質量比として１：１〜５：１とすることが好ましい。

なお、ＮＴＰＤａｓｅの阻害手段としては、上記の他に表皮細胞を低ｐＨ環境下に曝すことが知られ、一般のケミカルピーリング剤に利用されてきた。すなわち、従来のケミカルピーリング剤の主成分であるグリコール酸等は、ＶＲ１受容体の刺激を介して細胞からＡＴＰを放出させると共に、そのＡＴＰの分解を阻害する作用を担っている。これに対し、本発明においては、ＡＤＰ及びキサンチン誘導体の配合により、酸による刺激を与えることなく高い表皮細胞増殖効果を達成することができる。

本発明の皮膚外用剤組成物は、上記必須成分の他、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調製剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて適宜配合し、目的とする剤形に応じて常法により製造することが出来る。

また、その他の配合可能成分として、例えば、防腐剤（エチルパラベン、ブチルパラベン等）；消炎剤（例えば、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒノキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等）；美白剤（例えば、胎盤抽出物、ユキノシタ抽出物、アルブチン等）；各種抽出物（例えば、オウバク、オウレン、シコン、シャクヤク、センブリ、バーチ、セージ、ビワ、ニンジン、アロエ、ゼニアオイ、アイリス、ブドウ、ヨクイニン、ヘチマ、ユリ、サフラン、センキュウ、ショウキュウ、オトギリソウ、オノニス、ニンニク、トウガラシ、チンピ、トウキ、海藻等）、賦活剤（例えば、ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体等）；血行促進剤（例えば、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等）；抗脂漏剤（例えば、硫黄、チアントール等）；抗炎症剤（例えば、トラネキサム酸、チオタウリン、ヒポタウリン等）等が挙げられる。

本発明の皮膚外用剤の剤形は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティック等、どのような剤形でも構わない。あるいは、不織布等のシートに含浸ないし塗布した製剤なども可能である。また、本発明の皮膚外用剤の製品形態も任意であり、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料；ファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料；日焼け止め化粧料（サンスクリーン剤）；ボディー化粧料；芳香化粧料；メーク落とし、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス、育毛料等の毛髪化粧料；軟膏等に用いることが出来る。特に、本発明は、日常的な使用が可能であり、塗布直後の洗い流しを要さないリーブオン型の化粧料として好適に用い得る。
以下、本発明の実施例を具体的に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、下記実施例において、成分の濃度は全て培養細胞に対するものとする。

＜ＡＴＰアナログの選出＞
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をそのプロトコル従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり１×１０⁴となるように播種し、２４時間の培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄して１時間静置した。
その後、各ウェルの培地に、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、アデノシン、ＡＭＰ、ＵＤＰをそれぞれ１０μＭとなるように添加し、ＡＴＰアッセイキット（ＡＴＰＬｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて室温で５分間処理し、プレートごと発光プレートリーダーに置いて測定した。
本試験より得た各ＡＴＰアナログ添加による細胞外ＡＴＰ遊離量を図１に示す。

図１に示すとおり、アデノシン、ＡＭＰ、ＵＤＰを添加した場合は、ＡＴＰアナログ無添加（medium）のサンプルと同様、細胞外へのＡＴＰの遊離はほとんど認められなかった。これに対し、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰを添加した場合においては、明らかなＡＴＰ遊離量の増加が認められた。
以上のことから、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰの添加により、皮膚細胞のＡＴＰ産出量が亢進されることが明らかである。

＜細胞増殖に対するＡＴＰアナログの影響＞
上記試験においてＡＴＰ産生の亢進が認められたＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰについて、ａｌａｍａｒｂｌｕｅ試薬を用いて細胞増殖に対する作用を評価した。
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をそのプロトコル従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり３×１０^３となるように播種し、４日間培養した。培養５日目に各ウェルの培地に、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰをそれぞれ０．０１〜２５０μＭの濃度で添加し、翌日にａｌａｍａｒｂｌｕｅ試薬（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）を添加した。さらに２４時間後、蛍光プレートリーダーにて５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。
ＡＴＰアナログを添加していない未処置の培養系における蛍光強度を１００％とし、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰを０．０１〜２５０μＭの濃度で添加した各サンプルの吸光度の相対値を算出し、これを細胞増殖率とした。結果を図２に示す。

図２に示すとおり、ＧＴＰを添加した培養系では、低濃度域では若干の細胞増殖率の増加が見られたが、１．９５μＭをピークに減少し始め、２５０μＭになると未処置時とほぼ同等となった。ＵＴＰを添加した場合、ＵＴＰ濃度の上昇に伴って細胞増殖率も上昇した。ＡＤＰを添加した場合は、すべての濃度において優れた細胞増殖率を示した。特に、６２．５μＭ以上の添加からさらに増殖率は上昇傾向にあった。
以上の結果から、皮膚細胞の増殖において、特にＡＤＰを添加することが好適である。

さらに、ＡＴＰ、ＡＤＰ、アデノシンを０．０３〜２５０μＭ添加した細胞系において、ＭＴＴアッセイをそれぞれ行った。試験方法及び細胞増殖率の算出は上記に準じた。結果を図３に示す。
図３に示すとおり、ＡＴＰ及びＡＤＰの添加により細胞増殖率の増加が認められたが、ＡＤＰを添加したサンプルの方により高い細胞増殖が認められた。アデノシンを添加した場合、濃度が上がるほど細胞増殖率は著しく減少した。
以上の試験結果から、表皮細胞における細胞外ＡＴＰ遊離量を増加させ、細胞増殖を促進する物質として、特にＡＤＰが適することが明らかである。

＜ＡＤＰ濃度＞
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をそのプロトコルに従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり１×１０^４となるように播種し、２４時間の培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄して１時間静置した。
その後、各ウェルの培地に、ＡＤＰをそれぞれ０、０．０１、０．１、１、１０、１００μＭとなるように添加し、ＡＴＰアッセイキット（ＡＴＰＬｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて室温で５分間処理し、プレートごと発光プレートリーダーに置いて測定した。
本試験より得た各濃度のＡＤＰによる細胞外ＡＴＰ遊離量を図４に示す。

図４に示すとおり、ＡＤＰの濃度を１μＭよりも高くしたサンプルにおいて、ＡＴＰ遊離量の著しい増加が認められた。一方、ＡＤＰ濃度が１μＭに至るまでは、細胞外ＡＴＰの遊離量の増加はほとんど増加しなかった。
以上のことから、細胞外ＡＴＰ遊離量の促進効果を得るには、ＡＤＰ濃度を１０μＭ（０．０１ｍＭ）以上とすることが好適であることが明らかになった。

＜キサンチン誘導体のＡＴＰ分解酵素抑制能＞
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をその操作書に従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり１×１０^４となるように播種し、２４時間の培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄して１時間静置した。
その後、各ウェルの培地には、カフェインを０％、０．０００５％、０．００５％の濃度となるように添加し、３７℃にて２４時間培養した。
培養後、各ウェルの培養細胞について、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、そのプロトコルに従って全ＲＮＡ抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製してＲＴ−ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動に供し、ＮＴＰＤａｓｅ１〜４の発現を確認した。結果を図５に示す。
（プライマー及びプローブ）
NTPDase1
5’- ATGCAGGGTTAAAGGTCCTGGAATCTC
5’-TGACTGAATTTGCCCAGCAGATAGTTG
NTPDase2
5’-CTACCGAGTCTACACCCACAGCTTC
5’-TCCACAGTGTAGAAGAAGGCAGAGA
NTPDase3
5’- AAAGCTACTTCAAGTCCCAGCCCTTTG
5’-CAGGAGCATTGCCAGAAACTTCTTCTC
NTPDase4
5’- CGAGTATTTGTTTACTGCTGGCCAAGG
5’-GGGATATCGGTCAGAAGGTCTTCCAG

図５に示すとおり、培養ヒト表皮細胞において、ＡＴＰ分解酵素であるＮＴＰＤａｓｅ２〜４が発現していた。ＮＴＰＤａｓｅ１は既に報告されているとおり、表皮細胞において発現が認められなかった（Georgiou JG et al, :Human epidermal and monocyte-derived langerhans
cells express functional P2X7 receptors. J Invest Dermatol: 125:482-490, 2005）。
発現が認められた３種の分解酵素（ＮＴＰＤａｓｅ２〜４）の全てにおいて、カフェイン添加による発現の抑制が認められた。この酵素阻害作用は極めて低いカフェイン濃度から認められ、濃度が高くなるほど酵素発現は抑制された。

さらに、ＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト）を９６穴プレートに１ウェル当たり１×１０^４となるように播種し、２４時間後にＢＳＳ（NaCl 150 mM; KCl 5 mM; CaCl2 1.8 mM; D-glucose 10 mM; HEPES 25 mMを溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した水溶液）で洗浄後、３０分間静置した。
その後、各ウェルの培地にＡＴＰ１０μＭ、ＡＴＰ１０μＭ＋カフェイン０．０００５％混液、ＡＴＰ１０μＭ＋テオフィリン１０μＭ混液をそれぞれ添加し、直後、ＢＩＯＭＯＬＧＲＥＥＮ（ＢＩＯＭＯＬ社製）を１００μＬ添加し、室温で２０分放置後、吸光プレートリーダーにて６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
ＡＴＰ及びキサンチン誘導体無添加で２４時間培養した系（未刺激）における吸光度を１００％として、各サンプルの吸光度の相対値を算出し、これを遊離リン酸量とした。結果を図６に示す。

図６に示すとおり、表皮細胞へＡＴＰを添加した場合、通常時（未刺激）よりも遊離リン酸量が増加した。これは、ＡＴＰを添加したことにより細胞の恒常性維持機能が働き、リン酸の遊離を伴うＡＴＰ分解反応が活性化したためと考えられる。培養系にＡＴＰとカフェインまたはテオフィリンの混液を添加すると、遊離リン酸量は低下した。これは、カフェイン及びテオフィリンがＡＴＰ分解反応を抑制することにより、遊離リン酸量が減少したためであると考えられる。
以上の結果から、キサンチン誘導体がＮＴＰＤａｓｅの発現を阻害し、表皮細胞における遊離ＡＴＰの分解反応が抑制されていることが明らかである。

＜ＡＤＰ＋キサンチン誘導体によるＡＴＰ遊離量＞
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をその操作書に従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり１×１０^４となるように播種し、２４時間の培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄して１時間静置した。
その後、各ウェルの培地に、培養液のみ、ＡＤＰを１０μＭ、ＧＴＰを１０μＭとなるように添加し、さらにそれぞれについてカフェインを濃度が０、０．０００５、０．００５％となるように加えたサンプルを用意し、ＡＴＰアッセイキット（ＡＴＰＬｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて室温で５分間処理し、プレートごと発光プレートリーダーに置いて測定した。結果を図７に示す。また、ＡＤＰ無添加培地（コントロール）とＡＤＰ１０μＭ添加培地とを、０．０００５％カフェインの有無で比較した結果を図８に示す。

培養液のみ（medium）の場合、カフェイン濃度を上げてもＡＴＰ遊離量の増加はほとんど見られなかった。ＧＴＰを添加した培地の場合は、ＧＴＰの添加だけでも培養液のみの場合に比べてＡＴＰ遊離量の著しく増加したが、カフェインの添加によるＡＴＰ遊離量への影響はほとんど認められなかった。
一方、ＡＤＰを添加した培地の場合、カフェイン無添加のサンプルはＧＴＰ添加による細胞外ＡＴＰ遊離量に及ばなかったものの、カフェインを添加すると細胞外ＡＴＰ遊離量が飛躍的に増加し、ＧＴＰ添加よりも優れたＡＴＰ遊離量（およそ３００ｎＭ）を示した。
また、図８によれば、ＡＤＰが添加されていないとカフェインを適量添加してもＡＴＰ遊離量の増加はほとんど認められなかった（コントロール）のに対し、ＡＤＰ配合系においてはカフェインの添加により著しいＡＴＰ遊離量の増加が起こったことが分かる。
この顕著なＡＴＰの増加は、ＡＴＰの基質となるＡＤＰの添加に基づくＡＴＰ合成の亢進と、カフェインの添加に基づくＡＴＰ分解の抑制によるものと考えられる。さらに、図８のコントロールにおけるカフェイン添加によるＡＴＰ遊離量の増加幅と、ＡＤＰ添加培地における増加幅との比較から、ＡＤＰ及びカフェインがＡＴＰ遊離量の増加に対し、相乗的に作用していると推察された。
以上のことから、特にＡＤＰをキサンチン誘導体とを共存させることにより、表皮細胞の細胞外ＡＴＰ遊離量が著しく促進されることが明らかである。
また、さらに検討を行ったところ、ＡＤＰ：キサンチン誘導体濃度が質量比で１：１〜５：１であるとき、特に顕著な細胞外ＡＴＰ遊離量の増加が認められた。

＜細胞増殖に対するＡＤＰ＋キサンチン誘導体の作用＞
テストスキンへＡＤＰ及びキサンチン誘導体を適用し、細胞増殖活性の変化を測定した。
テストスキンは、ヒト由来表皮ケラチノサイト（表皮細胞の一つである表皮角化細胞）からなる表皮層と真皮線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルから成る３次元皮膚モデルであり、特に表皮層はマウスよりもヒトの皮膚に近い厚さをもち、培養しながら情報伝達物質などの測定が容易である。表皮の上には角質層も形成されており、薬剤の塗布と除去が可能である。

試験方法
テストスキン（ＬＳＥ−０１１Ａ、東洋紡社製）をそのプロトコルに従って培養した。添付のシリコンリングを表皮上に装着し、水（コントロール）、ＡＤＰ３ｍＭ溶液、ＡＤＰ１０ｍＭ溶液、ＡＤＰ３０ｍＭ溶液、カフェイン０．１％溶液、ＡＤＰ及びカフェイン溶液（ＡＤＰ濃度１０ｍＭ、カフェイン濃度０．１％）をリングの中央に入れ、２４時間培養後、培養液とテストスキンを回収した。回収の２時間前にＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン）を培養液に添加し（終濃度５０μＭ）、複製中の細胞のＤＮＡを標識した。
テストスキンは中央部を含むように幅２ｍｍ、長さはモデル全直径となるように採取し、常法に従いパラフィンブロックに包埋し、薄切切片を作製した。この切片を抗ＢｒｄＵ抗体で免疫染色し、ＢｒｄＵで標識された細胞核（ＢｒｄＵ陽性細胞）の数をカウントし、細胞増殖活性の指標とした。ＢｒｄＵは、チミジンの類似体として複製中のＤＮＡに取り込まれ、増殖中の細胞の識別に用いられる。ＢｒｄＵを添加して１〜２時間後に組織を採取し、ＢｒｄＵに対する抗体で染色すると、増殖中の細胞の核が染まる。この核が多いほど増殖活性が高い。
図９に各切片の抗ＢｒｄＵ染色画像、及び１切片あたりのＢｒｄＵ陽性細胞数を示す。

図９左画像に示すように、ＡＤＰの添加により、ＢｒｄＵを取り込み染色された細胞数が増加した。特に、ＡＤＰに加え、カフェインを添加したサンプルにおいてＢｒｄＵ陽性細胞数が多数認められた。なお、図９の各画像において、上方の帯状の部分は表皮、その下の部分が真皮に相当する部分であり、染色された細胞は濃色の点として現れている。
また、図９の右グラフに示すように、ＡＤＰ溶液またはカフェイン溶液の添加においても水に比べてＢｒｄＵ陽性細胞数の増加が認められたが、特にＡＤＰとカフェインの両方を含む溶液により、極めて高い陽性細胞数の増加を示した。この細胞数の増加は、ＡＤＰのみによる増加幅及びカフェインのみによる増加幅よりも顕著であり、ＡＤＰとカフェインの併用により両者が相乗的に細胞増殖効果を奏するものと考えられる。

＜ケミカルピーリング剤との比較＞
ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を添加した皮膚細胞と、一般的なケミカルピーリング剤成分であるグリコール酸（ＧＡ）による処理を行った皮膚細胞について下記比較試験を行った。
試験方法
市販の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ、クラボウ社製）をその操作書に従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行なった。細胞は９６穴ブラックプレートに１ウェル当たり１×１０^４となるように播種し、２４時間の培養後、ＰＢＳ（−）で洗浄して１時間静置した。
その後、各ウェル細胞を、濃度を変えたグリコール酸溶液に５〜１０秒間曝して刺激を与えた。同じ細胞に前記刺激を２回与え、培養液で酸を洗浄後、培養液を加えて３７℃にて２４時間培養した。また、別のウェルの細胞には、ＡＤＰを１０μＭ、カフェインを０．０００５％添加して同様に培養を行った。培養後、ＡＴＰアッセイキット（ＡＴＰＬｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて室温で５分間処理し、プレートごと発光プレートリーダーに置いて測定した。

図１０に示すように、グリコール酸（ＧＡ）によるＡＴＰ遊離量の増加は、ＧＡ濃度が０．５９％のときに最も顕著に現れ、その際のＧＡ溶液のｐＨは３．７と極めて高い酸性を示した。一方、ＡＤＰ１０μＭ及びカフェイン０．０００５％を配合したサンプルは、濃度０．５９％ＧＡ処理のものと同等のＡＴＰ遊離量（約２７０ｎＭ）を示した。その際の培養液ｐＨは７．６であり、生理的ｐＨに近いものであった。
特開２００６−２６２８０６号公報によれば、皮膚モデル上で４０％グリコール酸（ｐＨ２．８）による処理を３分間行い、１０分後に培養液中の遊離ＡＴＰが約３００ｎｍであることが示され、このようなＡＴＰ遊離によって表皮細胞の増殖が促進され得ることが示唆されている。これは、図８で示した、ＡＤＰ及びカフェイン共存下におけるＡＴＰ遊離量とほぼ等しい。これらを考慮すると、細胞外ＡＴＰ遊離量が約３００ｎＭであることが、表皮細胞の増殖促進を示す指標となり得ると考えられる。
つまり、ＧＡによるＶＲ１受容体刺激によるＡＴＰ遊離を経てなる細胞増殖作用（ケミカルピーリング効果）を得るには、強い酸を肌に塗布し、直ぐに洗い流す必要がある。それに対し、本発明においては、ＡＤＰ及びカフェインを配合することで、表皮細胞に酸による強い刺激を与えることなく、ケミカルピーリング効果と同等の細胞増殖作用を得ることができると考えられる。
また、ＡＤＰ及びカフェインの配合系は生理的ｐＨに近く、刺激がほとんどないため、皮膚への塗布後直ぐに洗い落とさずに、長時間の使用が可能である。

以下に、本発明にかかる皮膚外用剤組成物の処方例を示すが、これらは本発明を限定するものではない。
＜処方例１：クリーム＞
（成分）（質量％）
ＡＤＰ１
カフェイン０．５
スクワラン１０
セトステアリルアルコール３．５
ミツロウ３
還元ラノリン５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミチン酸エステル２
ステアリン酸モノグリセリド２
１，３−ブチレングリコール０．１
グリセリン４
防腐剤０．３
香料０．０５
ｐＨ調整剤適量
精製水残余

＜処方例２：化粧水＞
（成分）（質量％）
ＡＤＰ０．５
カフェイン０．５
エタノール５
１，３−ブチレングリコール４
ポリオキシエチレン（１８）オレイルアルコールエーテル０．５
グリセリン４
防腐剤０．２
香料０．０５
ｐＨ調整剤適量
精製水残余

＜処方例３：乳液＞
（成分）（質量％）
ＡＤＰ０．５
カフェイン０．５
ステアリン酸１．５
セチルアルコール０．５
ミツロウ２
ポリオキシエチレン（１０）モノオレイン酸エステル１
グリセリン７
１，３−ブチレングリコール０．５
防腐剤０．３
香料０．０３
ｐＨ調整剤適量
精製水残余

＜処方例４：化粧水＞
（成分）（質量％）
グリセリン２．０
ジプロピレングリコール２．０
１，３−ブチレングリコール３．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンジメチルエーテル３．０
ヒアルロン酸ナトリウム０．２
ＰＰＧ−１３デシルテトラデセス−２４０．５
４−メトキシサリチル酸ナトリウム０．５
水溶性コラーゲン０．１
ＡＤＰ０．０００５
テオフィリン０．０００５
エタノール１０．０
クエン酸適量
クエン酸ナトリウム適量
ＥＤＴＡ適量
フェノキシエタノール適量
香料適量
精製水残余

＜処方例５：乳液＞
（成分）（質量％）
グリセリン１０．０
ジプロピレングリコール５．０
ポリエチレングリコール２０００００．５
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンジメチルエーテル５．０
水添ポリデセン４．０
ワセリン２．０
ジメチコン３．５
バチルアルコール１．０
テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル２．０
エチルヘキサン酸セチル４．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル２．０
ジステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル２．０
（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ＶＰ）コポリマー１．５
エタノール５．０
ＡＤＰ０．１
カフェイン０．０５
苛性カリ適量
ＥＤＴＡ適量
フェノキシエタノール適量
メチルパラベン適量
香料適量
精製水残余

＜処方例６：美容液＞
（成分）（質量％）
グリセリン１０．０
１，３−ブチレングリコール５．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンジメチルエーテル５．０
エリスリトール０．５
オクタン酸セチル１．０
デカメチルシクロペンタシロキサン２．０
スクワラン２．０
テトラオクタン酸ペンタエリスリット１．０
ポリアクリルアミド０．１
エタノール５．０
（アクリル酸Ｎａ／アクリロイルジメチルタウリン）コポリマー０．１
（Ｃ１０−Ｃ３０）アクリル酸・メタクリル酸コポリマー０．１
ＡＤＰ０．５
テオフェリン０．５
トラネキサム酸メチルアミド塩酸塩３．０
グリチルリチン酸ジカリウム０．０５
酢酸トコフェロール０．５
酵母エキス１．０
シリカ２．０
メタリン酸ナトリウム適量
水酸化カリウム適量
クエン酸適量
クエン酸ナトリウム適量
黄酸化鉄適量
フェノキシエタノール適量
香料適量
精製水残余

＜処方例７：クリーム＞
（成分）（質量％）
グリセリン１２．０
ジプロピレングリコール８．０
水添ポリデセン２．０
ワセリン４．０
デカメチルシクロペンタシロキサン５．０
セチルアルコール１．０
テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル２．０
ジステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル２．０
ポリオキシエチレンフィトステロール０．５
エタノール３．０
寒天１．０
サクシノグルカン１．０
（ジメチルアクリルアミド／アクリロイルジメチルタウリンＮａ）クロスポリマー０．５
ＡＤＰ５．０
テオフィリン１．０
トラネキサム酸３．０
ビタミンＣエチル０．５
ばら抽出液０．５
クエン酸適量
クエン酸ナトリウム適量
メタリン酸ナトリウム適量
フェノキシエタノール適量
香料適量
精製水残余

＜処方例８：日中用美容液＞
（成分）（質量％）
グリセリン５．０
アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム０．００１
デカメチルシクロペンタシロキサン１．０
カプリリルメチコン２．０
エチルヘキサン酸エチルヘキシル２．０
イソステアリン酸１．５
ＰＥＧ−１０ジメチコン１．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油０．５
エタノール１０．０
オクトクリレン８．０
オクチルメトキシシンナメート７．０
酸化チタン０．３
酸化亜鉛０．２
サクシノグルカン０．５
ポリアクリルアミド０．５
（アクリル酸Ｎａ／アクリロイルジメチルタウリン）コポリマー０．２
アスコルビン酸グルコシド３．０
グリチルリチン酸ジカリウム０．０１
ＡＤＰ０．０００８
カフェイン０．０００６
クエン酸適量
クエン酸ナトリウム適量
メタリン酸ナトリウム適量
フェノキシエタノール適量
香料適量
精製水残余

上記処方例１〜３の皮膚外用剤組成物は、いずれも低刺激性で、且つ高い表皮細胞増殖効果を示した。

培養表皮細胞における、ＡＴＰアナログの添加による細胞外ＡＴＰ遊離量を示すグラフである。培養表皮細胞における、ＡＴＰアナログの添加による細胞増殖作用を示すグラフである。培養表皮細胞における、ＡＴＰアナログの添加による細胞増殖作用を示すグラフである。培養表皮細胞における、ＡＤＰ添加濃度による細胞外ＡＴＰ遊離量を示すグラフである。培養表皮細胞における、カフェインによるＡＴＰ分解酵素の発現抑制を示す画像である。培養表皮細胞における、ＡＴＰ添加により分解によって生じる遊離リン酸量に対するキサンチン誘導体の効果を示すグラフである。培養表皮細胞における、カフェイン濃度による細胞外ＡＴＰ遊離量を示すグラフである。培養表皮細胞における、ＡＤＰ及びカフェインの添加による細胞外ＡＴＰ遊離量の変化を示すグラフである。皮膚モデルにおける、ＡＤＰ及びカフェインの添加による細胞増殖を示す画像、及びＢｒｄＵ陽性細胞数の変化を示すグラフである。培養表皮細胞における、各濃度のＧＡ、またはＡＤＰ及びカフェイン処理による細胞外ＡＴＰ遊離量の変化を示すグラフである。

Claims

ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含むことを特徴とする皮膚外用剤組成物。
ＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することを特徴とする請求項1に記載の皮膚外用剤組成物。
キサンチン誘導体がカフェイン及び／またはテオフィリンであることを特徴とする請求項1又は２に記載の皮膚外用剤組成物。
表皮細胞増殖促進剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
ＡＤＰ：キサンチン誘導体の配合比が、質量比で１：１〜５：１であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
請求項１〜５のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物を含むことを特徴とするリーブオン型化粧料。
ＡＤＰ及びキサンチン誘導体を含む皮膚外用剤組成物を皮膚表面に適用することを特徴とする表皮細胞増殖促進方法。
皮膚外用剤組成物がＡＤＰを０．０１〜１００ｍＭ含有し、キサンチン誘導体を０．０００５〜５質量％含有することを特徴とする請求項７に記載の表皮細胞増殖促進方法。