JP2009171951A - 糖の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】セルロース含有原料から効率的にセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供すること。
【解決手段】下記計算式で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【選択図】なし
【解決手段】下記計算式で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
【選択図】なし
Description
本発明は、糖の製造方法に関する。
パルプ等のセルロース含有原料を粉砕して得られるセルロースは、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている（例えば、特許文献１）。セルラーゼ等の酵素を利用してバイオマスから糖を製造する際には、その前処理工程としてセルロース結晶構造が非晶化されたセルロースにすることが有用である。例えば、特許文献１には、塩化リチウム／ジメチルアセトアミド等のセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。
特許文献２の実施例１及び４には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献３の実施例１〜３には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献４の実施例１及び２には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献５には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。
特許文献２の実施例１及び４には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献３の実施例１〜３には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献４の実施例１及び２には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献５には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献６）、過酸化水素を用いて熱水処理したセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法（特許文献７及び８）が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
本発明は、セルロース含有原料からセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、特定のセルロース含有原料を出発原料として、ロッドを充填した振動ミルで前処理（非晶化）を行った後にセルラーゼの等の酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が２０質量％以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
すなわち本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が２０質量％以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
本発明の糖の製造方法は、その前処理においてセルロース含有原料からセルロースＩ型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率良く得ることができるので、酵素の反応により糖を効率よく生産することができる。
本発明は、下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が２０質量％以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ、糖化することを特徴とする糖の製造方法である。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースＩ型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
〔セルロース含有原料〕
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、植物殻類、及び木材類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９重量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また、市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、後述する粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の糖の生産を効率よく行うことができる。
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類；稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、植物殻類、及び木材類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には７５〜９９重量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また、市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が２０質量％以下であれば、容易に粉砕できるとともに、後述する粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の糖の生産を効率よく行うことができる。
〔セルロースＩ型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低下させたものである。セルロースＩ型結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
結晶化度が３３％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でセルロースＩ型結晶が検出されない０％が特に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。セルロースＩ型結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低下させたものである。セルロースＩ型結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
結晶化度が３３％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でセルロースＩ型結晶が検出されない０％が特に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。セルロースＩ型結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
〔振動ミル〕
本発明では、前記セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理する。ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理することにより、原料中のセルロースを効率的に非晶化させることができる。
本発明で用いられる振動ミルとしては、中央化工機株式会社製の振動ミル、株式会社吉田製作所製の小型振動ロッドミル１０４５型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルＰ−９型、日陶科学株式会社製の小型振動ミルＮＢ−Ｏ型等を用いることができる。処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
本発明では、前記セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理する。ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理することにより、原料中のセルロースを効率的に非晶化させることができる。
本発明で用いられる振動ミルとしては、中央化工機株式会社製の振動ミル、株式会社吉田製作所製の小型振動ロッドミル１０４５型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルＰ−９型、日陶科学株式会社製の小型振動ミルＮＢ−Ｏ型等を用いることができる。処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
〔ロッド〕
振動ミルに充填するロッドとは棒状の媒体であり、ロッドの断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
ロッドの材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
ロッドの外径としては、好ましくは０．５〜２００ｍｍ、より好ましくは１〜１００ｍｍ、更に好ましくは５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの長さとしては、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッドのかけら等が混入して粉末セルロースが汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。
ロッドの充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースとロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの容積に対するロッドの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ロッドの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは０．０１〜５０ｈｒ、より好ましくは０．０５〜２０ｈｒ、更に好ましくは０．１〜１０ｈｒである。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
振動ミルに充填するロッドとは棒状の媒体であり、ロッドの断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
ロッドの材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
ロッドの外径としては、好ましくは０．５〜２００ｍｍ、より好ましくは１〜１００ｍｍ、更に好ましくは５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの長さとしては、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッドのかけら等が混入して粉末セルロースが汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。
ロッドの充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースとロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの容積に対するロッドの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ロッドの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは０．０１〜５０ｈｒ、より好ましくは０．０５〜２０ｈｒ、更に好ましくは０．１〜１０ｈｒである。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
上記の処理方法により、前記セルロース含有原料から、セルロースＩ型結晶化度が３３％以下の非晶化セルロースを効率よく得ることができ、振動ミル処理の際に、ミル内部に粉砕物が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
また、本発明における振動ミル処理には、ロッドを充填した振動ミルでの粉砕、非晶化をより効率的に行う観点から、嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上のセルロース含有原料を用いることが好ましく、１２０ｋｇ／ｍ3以上がより好ましく、１５０ｋｇ／ｍ3以上が更に好ましい。この嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上であれば、セルロース含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、振動ミルへ原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、好ましくは５００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下、更に好ましくは３５０ｋｇ／ｍ3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、好ましくは１００〜５００ｋｇ／ｍ3、より好ましくは１２０〜４００ｋｇ／ｍ3、更に好ましくは１５０〜３５０ｋｇ／ｍ3である。
振動ミルに供給するセルロース含有原料は、振動ミル中に粉砕原料を効率的に分散させる観点から、平均粒径が０．０１〜１ｍｍの範囲にあるものが好ましい。この平均粒径が１ｍｍ以下であれば、振動ミル中に供給する際に、振動ミル中に粉砕原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、０．０１ｍｍ以上が好ましい。これらの観点から、この平均粒径としては、０．０１〜０．７ｍｍがより好ましく、０．０５〜０．５ｍｍが更に好ましい。なお、上記の平均粒径及び嵩密度は、実施例に記載の方法により測定することができる。
〔振動ミル粉砕の前処理〕
本発明では、振動ミルに供給するセルロース含有原料を前処理することが好ましい。例えば、セルロース含有原料を押出機で処理することで、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径を、前述の好ましい範囲にすることができる。
セルロース含有原料を押出機に投入する前には粗粉砕しておくことが好ましい。粗粉砕物の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ、より好ましくは１〜３０ｍｍである。１〜５０ｍｍに粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができ、粉砕に要する負荷を軽減することができる。
本発明では、振動ミルに供給するセルロース含有原料を前処理することが好ましい。例えば、セルロース含有原料を押出機で処理することで、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径を、前述の好ましい範囲にすることができる。
セルロース含有原料を押出機に投入する前には粗粉砕しておくことが好ましい。粗粉砕物の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ、より好ましくは１〜３０ｍｍである。１〜５０ｍｍに粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができ、粉砕に要する負荷を軽減することができる。
セルロース含有原料を粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。ロータリーカッターを使用する場合、得られる粗粉砕物の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、１〜５０ｍｍが好ましく、１〜３０ｍｍがより好ましい。スクリーンの目開きが１ｍｍ以上であれば、適度な嵩高さを有する粗粉砕物が得られ取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが５０ｍｍ以下であれば、後の粉砕処理において、粉砕原料として適度な大きさを有するために、負荷を低減することができる。
前記セルロース含有原料、好ましくは前記粗粉砕したセルロース含有原料を押出機で処理することにより、圧縮せん断力を作用させ、セルロースの結晶構造を破壊して、セルロース含有原料を粉末化させることができる。
圧縮せん断力を作用させて機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、粉砕物が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の平均粒径及び嵩密度を有する粉砕原料が得られ、取扱い性を向上させることができる。
圧縮せん断力を作用させて機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、粉砕物が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の平均粒径及び嵩密度を有する粉砕原料が得られ、取扱い性を向上させることができる。
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
処理方法としては、前記セルロース含有原料、好ましくは前記粗粉砕したセルロース含有原料を押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、１０ｓｅｃ-1以上が好ましく、２０〜３００００ｓｅｃ-1がより好ましく、５０〜３０００ｓｅｃ-1が特に好ましい。せん断速度が１０ｓｅｃ-1以上であれば、有効に粉砕が進行する。その他の処理条件としては、特に制限はなく、好ましくは処理温度５〜２００℃である。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、セルロースの結晶化度及び重合度を低下させる観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、セルロースの結晶化度及び重合度を低下させる観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
〔セルラーゼ等の酵素による糖化〕
上述した処理にて得られた非晶化セルロースは、その結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により、効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとは、セルロースのβ-１,４-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
上述した処理にて得られた非晶化セルロースは、その結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により、効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとは、セルロースのβ-１,４-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
かかる糖化の処理に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては特に制限はなく、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。セルラーゼの例としてはセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）等のトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、またはバチルス エスピー （Bacillus sp.） KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N115（FERM P-19726）、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-N659 （FERM P-19730）等の各株由来のセルラーゼ、更には、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム セルロリティクス（Acremonium celluloriticus）、イルペックス ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、あるいはフミコーラ インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、例えばセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社）を用いることにより、効率良く糖が製造できる。
また、ヘミセルラーゼの例としてはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ インソレンス（Humicola insolens）、バチルス アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更には、サーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製β-グルコシダーゼ）やトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来の酵素（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製β-グルコシダーゼ）やトリコデルマ リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来の酵素等が挙げられる。
上述した処理により得られた非晶化セルロースをセルラーゼによる酵素処理で糖化する場合の反応条件について、前処理により得られた非晶化セルロースの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。例えば、セルラーゼとしてノボザイムズ社製のセルクラスト１．５Ｌを使用し、パルプ由来の結晶化度０％のセルロースを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対してセルクラスト１．５Ｌを０．００１〜１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質として０．０００１７〜２．５％相当）となる様に添加し、ｐＨ２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐＨを選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Ｌを用いる場合、好ましくはｐＨ３〜７、特に好ましくはｐＨ５付近）の緩衝液中、反応温度１０〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト１．５Ｌを用いる場合、好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは約５０℃）で、反応時間３０分〜５日間、好ましくは０．５〜３日間反応させることにより糖を製造することができる。
非晶化セルロース又はセルロース含有原料の平均粒径、嵩密度、Ｘ線回折強度、及び水分含量の測定は、下記に記載の方法により行った。また、非晶化セルロース等の各種セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
（１）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度２５℃にて測定した。
（２）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中の非晶化セルロースの質量を測定することにより算出した。
（１）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で１分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度２５℃にて測定した。
（２）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器（容量１００ｍＬ）に受け、該容器中の非晶化セルロースの質量を測定することにより算出した。
（３）Ｘ線回折強度の測定
Ｘ線回折強度は、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、上記計算式（１）に基づいてセルロースＩ型結晶化度を算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／試料採取量（ｇ）］×１００
Ｘ線回折強度は、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、上記計算式（１）に基づいてセルロースＩ型結晶化度を算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ，管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで４時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５gに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加え、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで３〜４回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／試料採取量（ｇ）］×１００
（６）糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の非晶化セルロース等の各種セルロース基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（防腐剤として添加）、蓋つきスクリュー管（No.5, φ27×55ｍｍ マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら、所定の時間で反応させた。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を以下に示すＤＮＳ法及びＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
（７）ＤＮＳ法（生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
（８）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社 ４×２５０ｍｍ）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
（９）タンパク質の定量
ＤＣプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の非晶化セルロース等の各種セルロース基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（防腐剤として添加）、蓋つきスクリュー管（No.5, φ27×55ｍｍ マルエム社）に懸濁し、適量の酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら、所定の時間で反応させた。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を以下に示すＤＮＳ法及びＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
（７）ＤＮＳ法（生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
（８）ＨＰＬＣ法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社 ４×２５０ｍｍ）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
（９）タンパク質の定量
ＤＣプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
製造例１
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、結晶化度８１％、セルロース含有量９６質量％、水分含量７質量％）、をシュレッダー（株式会社明光商会製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。
〔振動ミル処理〕
得られたチップ状のパルプを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５Ｌ）に１００ｇ投入し、ロッドとして、直径２５ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１６本を振動ミルに充填（充填率４９％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｃｐｍの条件で、３時間処理を行った。振動ミル処理後に得られた非晶化セルロースの平均粒径は８０μｍであった。また、得られた非晶化セルロースの温度は、処理に伴う発熱により、８５℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた非晶化セルロースを前記振動ミルから取り出し、得られた非晶化セルロースの平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ（Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、８００ｍｍ×６００ｍｍ×１．５ｍｍ、結晶化度８１％、セルロース含有量９６質量％、水分含量７質量％）、をシュレッダー（株式会社明光商会製、「ＭＳＸ２０００−ＩＶＰ４４０Ｆ」）にかけ、約１０ｍｍ×５ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状パルプにした。
〔振動ミル処理〕
得られたチップ状のパルプを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５Ｌ）に１００ｇ投入し、ロッドとして、直径２５ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１６本を振動ミルに充填（充填率４９％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｃｐｍの条件で、３時間処理を行った。振動ミル処理後に得られた非晶化セルロースの平均粒径は８０μｍであった。また、得られた非晶化セルロースの温度は、処理に伴う発熱により、８５℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた非晶化セルロースを前記振動ミルから取り出し、得られた非晶化セルロースの平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表１に示す。
製造例２
〔押出機処理〕
製造例１と同じ粉砕原料を実施例１と同じシュレッダー処理して得たチップ状パルプを、二軸押出機（株式会社スエヒロＥＰＭ製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、３０〜７０℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径１２１μｍ、嵩密度２５４ｋｇ／ｍ3であった。
〔振動ミル処理〕
次に、押出機処理後に得られたパルプを用いて、製造例１と同様の振動ミル粉砕を行い、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物は見られなかった。結果を表１に示す。
〔押出機処理〕
製造例１と同じ粉砕原料を実施例１と同じシュレッダー処理して得たチップ状パルプを、二軸押出機（株式会社スエヒロＥＰＭ製、「ＥＡ−２０」）に２ｋｇ／ｈｒで投入し、せん断速度６６０ｓｅｃ-1、スクリュー回転数３００ｒｐｍ、外部から冷却水を流しながら、１パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、２列に配置されたスクリューは、スクリュー径４０ｍｍのスクリュー部と、互い違い（９０°）に１２ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、２本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、３０〜７０℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径１２１μｍ、嵩密度２５４ｋｇ／ｍ3であった。
〔振動ミル処理〕
次に、押出機処理後に得られたパルプを用いて、製造例１と同様の振動ミル粉砕を行い、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物は見られなかった。結果を表１に示す。
製造例３
振動ミルに充填したロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５７％）し、振動ミルの処理時間を１ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
振動ミルに充填したロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５７％）し、振動ミルの処理時間を１ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
製造例４
振動ミルに充填したロッドの本数を１４本に変更して振動ミルに充填（充填率６２％）した以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
振動ミルに充填したロッドの本数を１４本に変更して振動ミルに充填（充填率６２％）した以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
製造例５
振動ミルに充填したロッドとして、直径３６ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレスのロッド８本を用いて振動ミルに充填（充填率５１％）し、振動ミルの処理時間を１ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
振動ミルに充填したロッドとして、直径３６ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレスのロッド８本を用いて振動ミルに充填（充填率５１％）し、振動ミルの処理時間を１ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
製造例６
振動ミルに充填したロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレスのロッド１１本を用いて振動ミルに充填（充填率４８％）し、振動ミルの処理時間を３ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
振動ミルに充填したロッドとして、直径３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、材質ステンレスのロッド１１本を用いて振動ミルに充填（充填率４８％）し、振動ミルの処理時間を３ｈｒに変更したこと以外は製造例２と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表１に示す。
製造例７〜１０
セルロース含有原料として、上質紙（製造例７：セルロース含有量８３質量％、水分含量５．７質量％）、ダンボール（製造例８：セルロース含有量８４質量％、水分含量７．２質量％）、新聞紙（製造例９：セルロース含有量８３質量％、水分含量７．７質量％）、籾殻（製造例１０：セルロース含有量６０質量％、水分含量１３．６質量％）を用いて、製造例１に記載の方法及び条件でシュレッダー処理した後、製造例２の方法及び条件で押出機処理した。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例７：上質紙／平均粒径７１μｍ／嵩密度２７４ｋｇ／ｍ3、製造例８：ダンボール／平均粒径９３μｍ／嵩密度２１６ｋｇ／ｍ3、製造例９：新聞紙／平均粒径６１μｍ／嵩密度３０３ｋｇ／ｍ3、製造例１０：籾殻／平均粒径８５μｍ／嵩密度３８０ｋｇ／ｍ3であった。
更に製造例６の方法及び条件で振動ミル処理を行って、それぞれ非晶化セルロース（製造例７：上質紙／結晶化度０％／平均粒径４２μｍ、製造例８：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、製造例９：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径５５μｍ、製造例１０；籾殻／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ）を得た。
セルロース含有原料として、上質紙（製造例７：セルロース含有量８３質量％、水分含量５．７質量％）、ダンボール（製造例８：セルロース含有量８４質量％、水分含量７．２質量％）、新聞紙（製造例９：セルロース含有量８３質量％、水分含量７．７質量％）、籾殻（製造例１０：セルロース含有量６０質量％、水分含量１３．６質量％）を用いて、製造例１に記載の方法及び条件でシュレッダー処理した後、製造例２の方法及び条件で押出機処理した。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例７：上質紙／平均粒径７１μｍ／嵩密度２７４ｋｇ／ｍ3、製造例８：ダンボール／平均粒径９３μｍ／嵩密度２１６ｋｇ／ｍ3、製造例９：新聞紙／平均粒径６１μｍ／嵩密度３０３ｋｇ／ｍ3、製造例１０：籾殻／平均粒径８５μｍ／嵩密度３８０ｋｇ／ｍ3であった。
更に製造例６の方法及び条件で振動ミル処理を行って、それぞれ非晶化セルロース（製造例７：上質紙／結晶化度０％／平均粒径４２μｍ、製造例８：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、製造例９：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径５５μｍ、製造例１０；籾殻／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ）を得た。
製造例１１〜１２
[剪定枝の粗粉砕処理]
セルロース含有原料として、棒状の街路樹の剪定枝（製造例１１：φ１０ｍｍ×３００ｍｍ、水分含量１２質量％）、棒状のみかん木の剪定枝（製造例１２：φ１０ｍｍ×５００ｍｍ、セルロース含有量６４質量％、水分含量２２質量％）を用いて、プラスチック粉砕機（森田精機工業株式会社製 JC-2型）にかけ、約２ｍｍ×３ｍｍ×1ｍｍのチップ状にした。その後、得られたチップ状の街路樹及びみかん木の剪定枝の水含有量をそれぞれ２．３質量％、３．５質量％になるまで乾燥機にて乾燥させた。得られたチップ状のみかん木の剪定枝の嵩密度は、２２４ｋｇ／ｍ3であった。
[剪定枝の振動ミル処理]
得られたチップ状の剪定枝を用いて製造例６の方法及び条件で振動ミル処理を行い、それぞれ非晶化セルロース（製造例１１；街路樹の枝／結晶化度０％／平均粒径４９μｍ、製造例１２；みかん木の枝／結晶化度０％／平均粒径４４μｍ）を得た。
[剪定枝の粗粉砕処理]
セルロース含有原料として、棒状の街路樹の剪定枝（製造例１１：φ１０ｍｍ×３００ｍｍ、水分含量１２質量％）、棒状のみかん木の剪定枝（製造例１２：φ１０ｍｍ×５００ｍｍ、セルロース含有量６４質量％、水分含量２２質量％）を用いて、プラスチック粉砕機（森田精機工業株式会社製 JC-2型）にかけ、約２ｍｍ×３ｍｍ×1ｍｍのチップ状にした。その後、得られたチップ状の街路樹及びみかん木の剪定枝の水含有量をそれぞれ２．３質量％、３．５質量％になるまで乾燥機にて乾燥させた。得られたチップ状のみかん木の剪定枝の嵩密度は、２２４ｋｇ／ｍ3であった。
[剪定枝の振動ミル処理]
得られたチップ状の剪定枝を用いて製造例６の方法及び条件で振動ミル処理を行い、それぞれ非晶化セルロース（製造例１１；街路樹の枝／結晶化度０％／平均粒径４９μｍ、製造例１２；みかん木の枝／結晶化度０％／平均粒径４４μｍ）を得た。
比較製造例１
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に１００ｇ投入し、回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル（日陶科学株式会社製、「ポットミル ＡＮＺ-５１Ｓ」、容器容積１．０Ｌ、１０ｍｍφジルコニアボールを１．８ｋｇ充填、充填率５３％）に１００ｇ投入し、回転数１００ｒｐｍの条件で４８時間処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのＸ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
比較製造例２
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、カッターミル（株式会社ダルトン製、「パワーミルＰ−０２Ｓ型」）に５００ｇ投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
比較製造例３
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ハンマーミル（株式会社ダルトン製、「SAMPLE-MILL」）に５００ｇ投入し、回転数１３５００ｒｐｍの条件で０．５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ハンマーミル（株式会社ダルトン製、「SAMPLE-MILL」）に５００ｇ投入し、回転数１３５００ｒｐｍの条件で０．５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
比較製造例４
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ピンミル（ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」）に５００ｇ投入し、回転数１３０００ｒｐｍの条件で０．２５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ピンミル（ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」）に５００ｇ投入し、回転数１３０００ｒｐｍの条件で０．２５ｈｒ処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表２に示す。
比較製造例５
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
製造例１と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの平均粒径を測定し、Ｘ線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表２に示す。
比較製造例６〜１１
製造例７〜１０のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、または製造例１１〜１２の街路樹の剪定枝、みかん木の剪定枝についても同様にプラスチック粉砕機による粗粉砕処理を行い、次いで振動ミル処理を行わずに粉末またはチップ状のセルロース（比較製造例６：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較製造例７：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較製造例８：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ、比較製造例９：籾殻／結晶化度４７％／平均粒径８５μｍ、比較製造例１０：街路樹の剪定枝／結晶化度５１％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、比較製造例１１：みかん木の剪定枝／結晶化度４６％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍを得た。
製造例７〜１０のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、または製造例１１〜１２の街路樹の剪定枝、みかん木の剪定枝についても同様にプラスチック粉砕機による粗粉砕処理を行い、次いで振動ミル処理を行わずに粉末またはチップ状のセルロース（比較製造例６：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較製造例７：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較製造例８：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ、比較製造例９：籾殻／結晶化度４７％／平均粒径８５μｍ、比較製造例１０：街路樹の剪定枝／結晶化度５１％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、比較製造例１１：みかん木の剪定枝／結晶化度４６％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍを得た。
実施例１及び比較例１
実施例１として、製造例６における押出機処理とロッドを充填した振動ミル処理によって調製した非晶化セルロース（結晶化度０％、粒径５７μｍ）、ならびに比較例１として同じく製造例６の非晶化セルロース調製時の前処理として押出機処理のみを行って調製した粉末パルプ（結晶化度７６％、粒径１５６μｍ）のセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間１８時間、２６時間及び４２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表３に示す。
実施例１として、製造例６における押出機処理とロッドを充填した振動ミル処理によって調製した非晶化セルロース（結晶化度０％、粒径５７μｍ）、ならびに比較例１として同じく製造例６の非晶化セルロース調製時の前処理として押出機処理のみを行って調製した粉末パルプ（結晶化度７６％、粒径１５６μｍ）のセルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン）に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間１８時間、２６時間及び４２時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表３に示す。
実施例２〜４及び比較例２〜４
実施例２〜４として、前述の製造例６の条件で非晶化セルロースを調製した（実施例２〜４：結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）。比較例２〜４は、前述の比較製造例５の条件で調製した粉末パルプ（比較例２〜４：結晶化度７６％／平均粒径１５６μｍ）を使用した。これらの、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例２及び比較例２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例３及び比較例３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例４及び比較例４：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表４に示す。
実施例２〜４として、前述の製造例６の条件で非晶化セルロースを調製した（実施例２〜４：結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）。比較例２〜４は、前述の比較製造例５の条件で調製した粉末パルプ（比較例２〜４：結晶化度７６％／平均粒径１５６μｍ）を使用した。これらの、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例２及び比較例２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例３及び比較例３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例４及び比較例４：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表４に示す。
実施例５
実施例２で得られた糖化液上清（反応７２時間）を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水
注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。グルコースは保持時間約５．５分、キシロースは約６．５分、キシロビオースは約１４分、セロビオースは約１４．５分にピークが現われた。糖化液上清は１００倍希釈し、１０μＬを注入した。結果を表５に示す。
実施例２で得られた糖化液上清（反応７２時間）を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：CarboPac PA1（Dionex社 4×250mm）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水
注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。グルコースは保持時間約５．５分、キシロースは約６．５分、キシロビオースは約１４分、セロビオースは約１４．５分にピークが現われた。糖化液上清は１００倍希釈し、１０μＬを注入した。結果を表５に示す。
実施例６〜１１
前述の製造例６の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）のセルラーゼ酵素製剤（実施例６〜８：ＴＰ−６０、明治製菓株式会社製、タンパク質６５０ｍｇ／ｇ、実施例９〜１１：ウルトラフロＬ、ノボザイムズ社製、５０ｍｇタンパク質／ｍＬ）による糖化反応を行った。非晶化セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．８３％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．５４％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．４２％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．２８％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例８：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１７％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．１１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例９：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１０％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１０：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質として０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１１：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、２％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表６に示す。
前述の製造例６の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）のセルラーゼ酵素製剤（実施例６〜８：ＴＰ−６０、明治製菓株式会社製、タンパク質６５０ｍｇ／ｇ、実施例９〜１１：ウルトラフロＬ、ノボザイムズ社製、５０ｍｇタンパク質／ｍＬ）による糖化反応を行った。非晶化セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．８３％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．５４％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．４２％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．２８％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例８：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１７％（ｗ／ｖ）ＴＰ−６０（タンパク質０．１１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例９：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１０％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１０：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質として０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１１：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、２％（ｖ／ｖ）ウルトラフロＬ（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表６に示す。
実施例１２及び１３
実施例１２及び１３として、前述の製造例６の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）のセルラーゼ酵素製剤（実施例１２：セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製、実施例１３：セルクラスト１．５Ｌ及びβ−グルコシダーゼとしてノボザイム１８８、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質として０．１％相当）、０．０３％（ｖ／ｖ）ノボザイム１８８（タンパク質０．００７５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表７に示す。
実施例１２及び１３として、前述の製造例６の条件で調製した非晶化セルロース（結晶化度０％／平均粒径５７μｍ）のセルラーゼ酵素製剤（実施例１２：セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製、実施例１３：セルクラスト１．５Ｌ及びβ−グルコシダーゼとしてノボザイム１８８、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１２：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト（タンパク質０．１％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１３：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．６％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質として０．１％相当）、０．０３％（ｖ／ｖ）ノボザイム１８８（タンパク質０．００７５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表７に示す。
実施例１４及び１５
実施例１２及び１３で得られた糖化液上清（反応７５時間）を、前述の実施例５と同様に、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて分析した。結果を表８に示す。
実施例１２及び１３で得られた糖化液上清（反応７５時間）を、前述の実施例５と同様に、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて分析した。結果を表８に示す。
実施例１６〜１８及び比較例５〜７
実施例１６〜１８として、前述の製造例７〜９で得られた非晶化セルロース（実施例１６：上質紙／結晶化度０％／平均粒径４２μｍ、実施例１７：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、実施例１８：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径５５μｍ）、及び比較例５〜７として、前述の比較製造例６〜８で得られた粉末セルロース（比較例５：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較例６：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較例７：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１６〜１７及び比較例５〜６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１８及び比較例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１２％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質２％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表９に示す。
実施例１６〜１８として、前述の製造例７〜９で得られた非晶化セルロース（実施例１６：上質紙／結晶化度０％／平均粒径４２μｍ、実施例１７：ダンボール／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、実施例１８：新聞紙／結晶化度０％／平均粒径５５μｍ）、及び比較例５〜７として、前述の比較製造例６〜８で得られた粉末セルロース（比較例５：上質紙／結晶化度７１％／平均粒径７１μｍ、比較例６：ダンボール／結晶化度７１％／平均粒径９３μｍ、比較例７：新聞紙／結晶化度５６％／平均粒径６１μｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例１６〜１７及び比較例５〜６：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１．５％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．２５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、実施例１８及び比較例７：１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１２％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質２％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表９に示す。
実施例１９〜２１及び比較例８〜１０
実施例１９〜２１として、前述の製造例１０〜１２で得られた非晶化セルロース（実施例１９：籾殻／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、実施例２０：街路樹の剪定枝／結晶化度０％／平均粒径４９μｍ、実施例２１：みかん木の枝／結晶化度０％／平均粒径４４μｍ）、及び比較例８〜１０として、前述の比較製造例９〜１１で得られた粉末あるいはチップ状のセルロース（比較例８：籾殻／結晶化度４７％／平均粒径８５μｍ、比較例９：街路樹の剪定枝／結晶化度５１％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、比較例１０：みかん木の剪定枝／結晶化度４６％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表１０に示す。
実施例１９〜２１として、前述の製造例１０〜１２で得られた非晶化セルロース（実施例１９：籾殻／結晶化度０％／平均粒径４８μｍ、実施例２０：街路樹の剪定枝／結晶化度０％／平均粒径４９μｍ、実施例２１：みかん木の枝／結晶化度０％／平均粒径４４μｍ）、及び比較例８〜１０として、前述の比較製造例９〜１１で得られた粉末あるいはチップ状のセルロース（比較例８：籾殻／結晶化度４７％／平均粒径８５μｍ、比較例９：街路樹の剪定枝／結晶化度５１％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ、比較例１０：みかん木の剪定枝／結晶化度４６％／大きさ：２ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ）を使用し、セルラーゼ酵素標品（セルクラスト１．５Ｌ、ノボザイムズ社製）による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース０．１５ｇを３ｍＬの酵素反応液中、５０℃で振とう攪拌しながら３日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、３％（ｖ／ｖ）セルクラスト１．５Ｌ（タンパク質０．５％相当）、３０μｇ／ｍＬテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（グルコース換算）した。結果を表１０に示す。
表１及び表２から、製造例１〜６の非晶化セルロースの製造方法は、比較製造例１〜５に比べて、セルロースの結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができ、生産性に優れることが分かる。また、製造例１と比較製造例１とを比べると、振動ミルの媒体にロッドを用いた場合は、セルロースの結晶化度を０％に低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができることが分かる。更に、製造例１〜６で得られた非晶化セルロースは、比較製造例２〜５に比べて、適度な平均粒径を有していた。
表３及び表４の結果から、実施例１〜４に示した本発明の糖の製造方法は比較例１〜４に比べてその生産性が高く、また表５の結果から、生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表６の結果から酵素製剤の種類を問わず効率的な糖製造が可能であること、また表７及び表８の結果から、セルラーゼ製剤に更にβ−グルコシダーゼを追加することでより効率的な糖製造が可能なことが分かる。更に表９及び表１０の結果から、本発明の糖の製造方法は、パルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類、籾殻等の植物殻類等、また各種木材等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
表３及び表４の結果から、実施例１〜４に示した本発明の糖の製造方法は比較例１〜４に比べてその生産性が高く、また表５の結果から、生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表６の結果から酵素製剤の種類を問わず効率的な糖製造が可能であること、また表７及び表８の結果から、セルラーゼ製剤に更にβ−グルコシダーゼを追加することでより効率的な糖製造が可能なことが分かる。更に表９及び表１０の結果から、本発明の糖の製造方法は、パルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類、籾殻等の植物殻類等、また各種木材等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。
Claims (7)
- 下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３３％を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が２０質量％以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースＩ型結晶化度を３３％以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００ （１）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、及びＩ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕 - ロッドを充填した振動ミルの処理時間が、０．０１〜５０ｈｒである、請求項１に記載の糖の製造方法。
- セルロース含有原料の嵩密度が、１００〜５００ｋｇ／ｍ3である、請求項１又は２に記載の糖の製造方法。
- セルロース含有原料の平均粒径が、０．０１〜１ｍｍである、請求項１〜３のいずれかに記載の糖の製造方法。
- セルロース含有原料が、押出機で前処理されたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の糖の製造方法。
- 押出機が、二軸押出機である、請求項５に記載の糖の製造方法。
- セルロース含有原料がパルプ類、紙類、植物殻類、及び木材類からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれかに記載の糖の製造方法。
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