JP2005068140A - セロオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
幅広い分野での使用が見込まれているセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースを製造する工程において、セルラーゼ反応性の高いある特定の結晶化度と保水度のパルプを用いることにより、簡単かつ低コストでセロビオースの工業的規模の大量生産が可能となる。
【解決手段】
セルラーゼ反応基質に、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式(式−1)によって算出された値が10%〜80%であり、かつ保水度が200%〜1000%であるパルプを用いる。前記パルプを、フィブリル化処理、メカノケミカル処理、化学的処理のいずれか一つあるいは複数の処理を施して得る。
χc =（（I002C − Ia）／ I002C） × 100 … 式−1
χc ： セルロースＩ型結晶化度 (%)
I002C ： 002面(2θ=22.6°)の回折強度
Ia ： アモルファス部分(2θ＝18.5°)の回折強度

Description

本発明はセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースの効率的な製造法に関するものである。

セロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースは、グルコースがβ-1,4結合した二糖類であり、保水性、吸油性、保形性、熱安定性、乳化安定性、低甘味性、低カロリー、難消化性、低う蝕性、整腸作用、コレステロール低減作用等の特徴を有することから、食品および食品添加剤、錠剤賦形剤、分散剤、保形剤、保水剤、保湿剤、充填剤、構造化剤、増量剤、飼料添加物、各種糖変性物に関する発底原料等として、食品、医薬品、化粧品、トイレタリー、飼料、液晶、電子素材、ゴム・プラスチック等の幅広い分野での使用が見込まれている。

一般に、セロビオースを得る方法としては、（１）シュクロースを原料に酵素による合成反応を用いた方法と（２）セルロースを原料に酵素による分解反応を用いた方法が知られている。
（１）酵素による合成反応としては、リン酸の存在下、シュクロースを発底原料にシュクロースホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼおよびセロビオースホスホリラーゼを順に作用させることで、セロビオースを得る方法(特許文献１参照)が知られている。しかしながら、この方法ではセロビオースを得るために高価な酵素を3種類使用し、かつそれぞれ3段階の反応を行わねばならず、工業生産を考慮すると酵素のコストがかかり、また生産性が低いという課題があった。

一方、（２）酵素による分解反応としては、セルロース系材料をセルラーゼにより分解する方法が公知である。この酵素分解反応に関しては、（Ａ）生成したセロビオースからグルコースへの分解を如何に防止するかという点、（Ｂ）セルラーゼのセルロースに対する反応性を如何に高めるかという点が鍵となる。
（Ａ）グルコースへの分解を防止するという点に関しては、セロビオースをグルコースへと変換させるβ-グルコシダーゼをセルラーゼから選択的に除去することでセロビオースの分解を防止する方法(特許文献２,３参照)、反応装置として限外ろ過装置を使用することで生成したセロビオースを反応系外へ抜き出すことによってグルコースへの分解を抑制する方法(特許文献４,５参照)が開示されている。
一方、（Ｂ）セルラーゼのセルロースへの反応性を高める点に関しては、柔細胞セルロースを原料に使用すること(特許文献４参照)、乾燥工程を経ていないスラッシュパルプまたは特定の物性値のスラッシュパルプを原料にすること(特許文献５、６参照)でが開示されている。
しかしながら、セロビオースの工業生産を考慮した場合、柔細胞セルロースは希少であることから原料として適さない。

特許文献６には、スラッシュパルプの保水度及び濾水度を規定することで、反応性を高めることが可能であると記載されている。しかし、工業的にセロビオースを製造するためには、特許文献６記載のスラッシュパルプでも、セルラーゼの反応性が低く、コストが高いという課題があった。また、スラッシュパルプはドライパルプとは異なり、多量の水を含有することから、原料の輸送コストが高くなる点および輸送中または貯蔵中において、まれにスラッシュパルプが腐敗するという課題があった。この点に関しては、パルプ製造工場でのオンサイトでのセロビオース製造によって解決できるものの、製造場所が限られてしまうという課題があった。

このようなことから、スラッシュパルプを用いる場合は、さらにセルラーゼの反応性を向上させること、また、扱いやすいドライパルプの反応性をスラッシュパルプ並、若しくはそれ以上に高め、高効率でセロオリゴ糖、特にセロビオースを製造することができれば、セロビオースの工業生産において大きな飛躍をもたらすと考えられた。

特許番号第2815023号公報 特公平6-83674号公報 特開平5-115293号公報 特開平2-295492号公報 特公平8-2312号公報 特開平9-107987号公報

本発明は、上記のような従来技術の問題を解決するために創案されたものであり、セロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースを簡単な操作で、しかも大量に生産し得る工業的に有利な製造方法を提供するためになされたものである。

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の範囲の結晶化度及び保水度を有するパルプにセルラーゼを作用させることで、セルロースの酵素分解反応が著しく促進すること、及び前記パルプを得るために、前処理としてフィブリル化処理、メカノケミカル処理、アルカリ処理のいずれかあるいは複数の処理を施すことにより、セルロースの結晶化度を低下させ、かつセルロースの表面積を増大することを見いだし、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

上記反応の詳細に関しては、パルプに対し、予め上記処理を施すことで、セルロースの結晶構造及び繊維形態が変化し、セルロースのアクセシビリティーが向上するため、セルラーゼによるセルロースの酵素分解反応が飛躍的に促進したものと考えている。
即ち、本発明は、
（１）Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式(式−1)によって算出された値が10%〜80%であり、かつ保水度が200%〜1000%であるパルプを用いることを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
χc =（（I002C − Ia）／ I002C） × 100 … 式−1
χc ： セルロースＩ型結晶化度 (%)
I002C ： 002面(2θ=22.6°)の回折強度
Ia ： アモルファス部分(2θ＝18.5°)の回折強度
（２）パルプにフィブリル化処理、メカノケミカル処理、化学的処理のいずれか一つあるいは複数の処理を施すことを特徴とする請求項１記載のセロオリゴ糖の製造方法。
に関するものである。

本発明の方法を用いると、パルプをセルラーゼにより酵素分解しセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースを製造する工程において、特定の結晶化度及び保水度を有するパルプをセルラーゼの基質とすることで、スラッシュパルプ、ドライパルプ共にセルラーゼの酵素分解反応が著しく促進され、セロオリゴ糖、特にセロビオースを高収率で得ることが出来る。

本発明においてセルラーゼの基質となるパルプは、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値（以下、単に結晶化度という）が10%〜80%、好ましくは15%〜75%であり、かつ保水度が200%〜1000%、好ましくは250%〜900%のものである。
保水度が200%未満であると、パルプの膨潤および繊維表面の毛羽立ちが少ない、即ち、セルロースの表面積が小さいために、セルロースのアクセシビリティーの低下に繋がるため好ましくない。保水度が1000%を超えた場合はセルラーゼの反応効率とパルプの前処理コストを比較し、効果が著しく小さくなるため、好ましくない。

ここで言う保水度とは、J.TAPPI NO 26-78で規定されるもので、一定量のパルプ懸濁液を遠心分離(3000G)した後の、絶乾パルプに対するパルプの保有する水量を百分率で示したものである。保水度が高いほど、繊維間結合力が低く繊維内部に含まれる水量が多い、即ち、セルロースの表面積は大きくなる傾向にある。

パルプの結晶化度が80%を超えた場合は、前処理前後におけるパルプ中のセルロースの構造変化が小さいため、アクセシビリティーの向上が見られないので好ましくない。また、結晶化度が10%未満の場合、セルラーゼの反応効率とパルプの処理コストを比較し、効果が著しく小さくなるために、好ましくない。

ここで言う、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことであり、結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合であり、本発明ではＸ線回折法により測定した。結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対するアクセシビリティー、化学反応性は低下する。

また、予め化学的処理を施したパルプとして、マーセル化パルプが市販されているが、同品が、前記の物性を満たしていれば、そのままセロオリゴ糖の製造用原料として使用可能である。

上記パルプを得るために用いる原料パルプとしては、パルプ製造工程において、乾燥工程を経ていないパルプ（スラッシュパルプ）、乾燥工程を経たパルプ（ドライパルプ）のどちらでも用いることができる。

スラッシュパルプとしては、晒または未晒クラフトスラッシュ木材パルプ、晒または未晒サルファイトスラッシュ木材パルプ、晒または未晒溶解スラッシュ木材パルプ、晒または未晒クラフトスラッシュ非木材パルプ、晒または未晒サルファイトスラッシュ非木材パルプ、晒または未晒溶解スラッシュ非木材パルプ、粗または精製スラッシュリンターパルプを用いることが出来る。なお、パルプ中のリグニンが除去されることで細孔容積が増大すること、またヘミセルロースなどが除去されることにより、セルロース純分が高くなることから、例示したセルロース系材料の中でも、晒溶解スラッシュ木材パルプ、晒溶解スラッシュ非木材パルプ、精製スラッシュリンターパルプが好ましい。また、スラッシュパルプに含まれる水分は、パルプ製造条件、即ち、脱水工程の条件によって左右されるが、50〜99%、より好ましくは60〜98%であるのが望ましい。水分50%未満の場合、脱水工程によって生じるシェアによって、パルプ内の細孔容積が潰れ角質化を起す恐れがあり、セルロースのアクセシビリティーの低下を引き起こす可能性があるため、また、水分が99%を超える場合はパルプの処理効率が低下し、前処理コストが増大するために好ましくない。

ドライパルプとしては、晒または未晒クラフト木材パルプ、晒または未晒サルファイト木材パルプ、晒または未晒溶解木材パルプ、晒または未晒クラフト非木材パルプ、晒または未晒サルファイト非木材パルプ、晒または未晒溶解非木材パルプ、粗または精製リンターパルプ、古紙パルプ、脱インキパルプ、ホヤセルロースおよび酢酸菌等の微生物によって生産されるセルロース等、または上記セルロース系材料を苛性ソーダ溶液、銅アンモニア溶液、モルホリン誘導体等の何らかの溶媒に溶解し、改めて紡糸された再生セルロース、苛性ソーダ溶液により処理されたマーセル化パルプ等を用いることが出来る。なお、パルプ中のリグニン分が除去されること、またヘミセルロースなどが除去されることにより、セルロース純分が高くなることから、例示したセルロース系材料の中でも、晒溶解木材パルプ、晒溶解非木材パルプ、精選リンターパルプ、再生セルロース、マーセル化パルプが好ましい。

ドライパルプに含まれる水分は、パルプ製造条件、即ち乾燥工程の条件によって左右されるが、5〜30%であるのが好ましい。水分が5%未満の場合、パルプの角質化、即ち、分子間・分子内における水素結合が進行し、セルロースのアクセシビリティーが低下する恐れがあること、一方、水分が30%を超える場合は、輸送コストが高く、腐敗しやすいために好ましくない。

本発明は、セルラーゼに対し反応性の高いパルプを得るために、セルロースＩ型の結晶化度及び保水度を特定の範囲に規定する。結晶化度を低下させるためには、主にメカノケミカル処理及び／または化学処理を行えばよく、保水度を本発明の範囲内にするには、主にフィブリル化処理を行えばよい。以下のその処理について詳述する。
なお、一つの処理よりも複数の処理を組み合わせて行う方が、効率よくパルプの結晶化度を低下、保水度を高めることができ、セルラーゼの反応性を高めることができる。

フィブリル化処理は、セルロースの表面積を増加させ、セルラーゼのセルロース表面への吸着を容易にすることを目的として、パルプを磨砕・剪断するような機械を用いて、（１）セルロース繊維の微細構造をゆるませ、繊維内部に水を取り込んで膨潤させる（内部フィブリル化）、（２）セルロース繊維表面を毛羽立たせ、あるいは繊維を枝分かれさせ繊維表面積を増加させる（外部フィブリル化）、（３）微細繊維を生成させ、結果として繊維表面積を増加させることである。

フィブリル化処理は、湿式条件下でセルロース繊維を磨砕・剪断し、フィブリル化できるものであれば公知の機種を用いて構わない。あえて例示するならば、パルプの叩解機である、ビーター（ナイアガラビーター 熊谷理機工業製）、PFIミル(PFIミル 熊谷理機工業製)、リファイナー（ディスクリファイナー 東西精機製)や、高圧ホモジナイザー(ニロ・ソアビ製)、超高圧ホモジナイザー(シンマルエンタープライゼス製)、ナノマイザー(特殊機械工業製)、石臼型磨砕機（スーパーマスコロイダー、セレンディピター 共に増幸産業製)、等が挙げられる。

フィブリル化処理する際のパルプ濃度は1.0〜20%、より好ましくは、2.0〜15%とする。パルプ濃度が1.0%未満である場合、処理量が著しく増加するだけでなく、水が可塑剤として作用しフィブリル化処理の度合いが低下するため、また、パルプ濃度が20%を超える場合はパルプ濃度が高過ぎて流動性が低下し、フィブリル化処理が行い難くなるために好ましくない。また、フィブリル化処理時間は、パルプ濃度および用いた機種によって最適値は異なるものの、3分〜5時間が好ましく、より好ましくは5分〜3時間である。フィブリル化処理時間が3分未満の場合、パルプの形態変化が少なく、保水度の上昇が余り見られないため、また、処理時間が5時間を超えると、セルラーゼの反応効率とパルプの処理コストを比較し、効果が著しく小さくなるために、好ましくない。なお、石臼型磨砕機のような連続処理を行う機種では、上記の処理時間になるように、複数回繰り返し処理または循環して処理を行うことが出来る。

本願発明のメカノケミカル処理とは、セルロース繊維の結晶化度を低下させる目的で行うもので、セルロース繊維に強力なエネルギーを加えて、セルロース自体の結晶構造を変化させる、即ち、結晶化度を低下させることである。

メカノケミカル処理は、セルロースの結晶化度を低下させることができる処理であれば、公知の方法を用いて構わないが、媒体ミルを用いて処理することが好ましい。媒体ミルは、公知の機種を用いてよいが、あえて機種を例示するならば、振動ボールミル(中央化工機製)、S/Gミル(五十嵐機械製)、アペックスミル(コトブキ技研工業製)、スーパーアペックスミル(コトブキ技研工業製)、アクアマイザ(ホソカワミクロン製)、ウルトラビスコミル(アイメックス製)等が挙げられる。

メカノケミカル処理は、パルプ100部を水0〜10000部、より好ましくは、水0〜5000部に分散させた状態で行う。水が10000部を超える場合は、処理量が著しく増加するだけでなく、水が可塑剤として作用しメカノケミカル処理が低下するために好ましくない。

メカノケミカル処理に使用される媒体ミルの媒体としては、市販されているφ1mm〜φ50mmのアルミナ製、セラミック製、チタン製、ジルコニア製、ガラス製等が使用でき、その充填率は50%〜95%が好ましい。充填率が50%未満の場合、セルロースに対する接触頻度が小さくなり、メカノケミカル反応が生じ難くなるため、また、充填率が95%を超えた場合は、媒体の動きが妨げられるために好ましくない。

処理時間は、5分〜5時間、より好ましくは10分〜3時間が好ましい。本発明においては、メカノケミカル処理の時間が重要である。処理時間が5分未満の場合、セルロースの結晶構造にほとんど変化が見られず、5時間を超える場合は、セルロースＩ型結晶化度は低下し、結晶構造のアモルファス化は見られるものの、セルロース繊維が著しく凝集し、硬くなるため、保水度が著しく低下するために好ましくない。一般に、保水度とセルロースの表面積には、相関関係があり、保水度が低下すると表面積が少なくなるため、仮に結晶化度が低下してもセルラーゼの反応性は低下してしまう。

本発明における、化学的処理は、セルロースの結晶下度を下げることを目的としており、マーセル化処理に代表されるアルカリ処理が好ましい。

アルカリ処理としては、パルプ100部を、パルプ濃度1.0〜20%かつ苛性ソーダ濃度3〜30%のアルカリ水分散液500〜10000部になるように調整し、5分〜5時間処理することが好ましい。より好ましくは、パルプ100部を、パルプ濃度2.0〜15%かつ苛性ソーダ濃度5〜20%のアルカリ水分散液になるように調整し、10分〜3時間処理する。
パルプ濃度が1.0%未満の場合、処理量が著しく増加するだけでなく、苛性ソーダ濃度を保つために苛性ソーダ量が増加する、即ち、薬品コストが大幅にアップするため、また、パルプ濃度が20%を超える場合はパルプ濃度が高過ぎで流動性が低下し、アルカリ化処理が不均一に進行するために好ましくない。

苛性ソーダ濃度が3%未満の場合、セルロースの結晶構造の変化は認められず、苛性ソーダ濃度が30%を超えた場合、既にセルロースＩ型結晶は完全に消失し、アモルファス化していることから、過剰な高濃度処理は薬品コストの大幅な増大に繋がるために好ましくない。

アルカリ処理時間が5分より短い場合、マーセル化反応の進行度合いが小さく、セルロースＩ型結晶化度の低下度合いが小さいため、また、アルカリ処理時間が5時間を超えてもセルロースの更なる結晶構造の変化は見られないために好ましくない。

本発明において使用可能なセルラーゼとしては特に限定はなく、Trichoderma 属、Aspergillus属、Irpex属、Aeromonas属、Clostridium属、Bacillus属、Pseudomonas属、Penicillium属、Humicola属などの各種の起源のもの及び／または遺伝子組み替えにより製造したものを単独若しくは二種以上を混合して用いることも出来る。なお、酵素源としては、一般に市販されているセルラーゼ製剤や上記菌の培養物やそのろ過液を直接使用することも出来る。

本発明におけるセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースの製造方法について、詳述する。

特定の結晶化度及び保水度を有するパルプを基質として、通常0.5〜20重量%の範囲内で水性反応液中に懸濁し、酵素であるセルラーゼを対基質当たり0.5〜30重量%添加し酵素分解反応を行う。その際、反応液のpHおよび温度は、酵素が失活しない範囲内であればその条件は問わないが、通常、pHは2〜10、温度は20〜70℃の範囲であれば良い。また、長期間運転を行う場合は、雑菌の繁殖若しくは反応液の腐敗対策として、酵素分解反応に影響を与えない程度に公知の防腐剤、例示するならば、安息香酸、安息香酸ソーダ、ショ糖エステル、アルコール等を添加することも出来る。

また、反応時間は、酵素分解反応条件により相違するが、通常3〜48時間程度で十分である。なお、反応装置としては、生成したセロビオースによるセルラーゼの反応性阻害の防止およびβ-グルコシダーゼによるセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースの分解防止のために、セロビオースを含む生成したセロオリゴ糖およびグルコースのみを連続的に系外へ除去することが可能な装置であれば問題なく使用できる。あえて、同装置を例示するならば、限外ろ過装置を用いることが好ましい。上記、限外ろ過装置に使用する限外ろ過膜は使用するセルラーゼの漏出がないものであれば特に差し支えはないが、好ましくは分画分子量が1000〜50000程度のポリアミド系、セルロースアセテート系、ポリエーテルスルホン系などのような有機膜、セラミックフィルター、金属焼結フィルターなどのような無機膜に代表される限外ろ過膜を単独若しくは組み合わせて用いるのが好ましい。反応終了後のセロオリゴ糖、その中でも特にセロビオースを含む酵素分解液は、必要に応じて公知の精製手段を用いて純度を調節すること、また場合により、公知の乾燥粉砕工程を経ることで乾燥粉末化することも出来る。

以下、本発明を実施例により詳述するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、配合量を示す「部」および「%」は、すべて「固形分重量部」および「固形分重量%」を示した。

［原料１］
市販の溶解パルプ(NDPT、日本製紙ケミカル製)を乾燥工程前より湿潤状態で採取したスラッシュパルプを用いた。なお、同原料の保水度は210%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は83.3%であった。

［原料２］
原料１に対し、フィブリル化処理を行った。原料１をパルプ濃度3%になるように調整した水懸濁液10Lを、GC-10-46のグラインダー（マスコライダーの砥石）をクリアランスが20μmになるようにセットしたマスコロイダー(増幸産業製)にて、回転数1800rpmの条件下、処理時間が合計1時間になるように繰り返し処理を行った。なお、同原料の保水度は533%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は68.5%であった。

［原料３］
原料１に対し、メカノケミカル処理を行った。1L容ポットにφ30mmのセラミックボールを充填率が65%になるように入れ、更に原料１をパルプ濃度6%になるように調整した水懸濁液333mlを投入し、振動ボールミル(中央化工機製)にて30分間処理を行った。なお、同原料の保水度は383%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は74.3%であった。

［原料４］
原料１に対し、アルカリ処理を行った。原料１をパルプ濃度5%になるように調整した15%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、30分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。なお、同原料の保水度は267%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は40.4%であった。

［原料５］
原料１に対し、アルカリ処理及びフィブリル化処理を行った。原料１をパルプ濃度5%になるように調整した15%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、30分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。その後、パルプ濃度10%になるように再調整した水懸濁液300mlを、PFIミル(熊谷理機工業製)にて10000回転になるまで処理を行った。なお、同原料の保水度は648%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は39.9%であった。

［原料６］
原料１に対し、フィブリル化処理を行った。原料１をパルプ濃度10%になるように調整した水懸濁液300mlを、PFIミル(熊谷理機工業製)にて10000回転になるまで処理を行った。なお、同原料の保水度は235%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は82.3%であった。

［原料７］
原料１に対し、アルカリ処理を行った。原料１をパルプ濃度5%になるように調整した2%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、10分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。なお、同原料の保水度は233%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は81.7%であった。

［原料８］
原料１に対し、メカノケミカル処理を行った。1L容ポットにφ30mmのセラミックボールを充填率が65%になるように入れ、更に原料１をパルプ濃度15%になるように調整した水懸濁液333mlを投入し、振動ボールミル(中央化工機製)にて24時間処理を行った。なお、同原料の保水度は112%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は52.2%であった。

［原料９］
市販の溶解パルプ(NDPTのドライ品、日本製紙ケミカル製、水分 7.5%)を用いた。なお、同原料の保水度は175%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は86.6%であった。

［原料１０］
原料９に対し、フィブリル化処理を行った。原料９をパルプ濃度3%になるように調整した水懸濁液10Lを、GC-10-46のグラインダーをクリアランスが20μmになるようにセットしたマスコロイダー(増幸産業製)にて、回転数1800rpmの条件下、処理時間が合計1時間になるように繰り返し処理を行った。なお、同原料の保水度は463%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は69.5%であった。

［原料１１］
原料９に対し、メカノケミカル処理を行った。1L容ポットにφ30mmのセラミックボールを充填率が65%になるように入れ、更に原料９をパルプ濃度6%になるように調整した水懸濁液333mlを投入し、振動ボールミル(中央化工機製)にて30分間処理を行った。なお、同原料の保水度は327%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は74.3%であった。

［原料１２］
原料９に対し、アルカリ処理を行った。原料９をパルプ濃度5%になるように調整した15%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、30分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。なお、同原料の保水度は257%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は41.7%であった。

［原料１３］
原料９に対し、アルカリ処理及びメカノケミカル処理を行った。原料９をパルプ濃度5%になるように調整した15%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、30分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。その後、パルプ濃度10%になるように再調整した水懸濁液300mlを、PFIミル(熊谷理機工業製)にて10000回転になるまで処理を行った。なお、同原料の保水度は628%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は41.1%であった。

［原料１４］
原料９に対し、フィブリル化処理を行った。原料９をパルプ濃度10%になるように調整した水懸濁液300mlを、PFIミル(熊谷理機工業製)にて10000回転になるまで処理を行った。なお、同原料の保水度は205%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は85.3%であった。

［原料１５］
原料９に対し、アルカリ処理を行った。原料９をパルプ濃度5%になるように調整した2%水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、室温下、10分間攪拌(200rpm)し、遠心分離機にて余分なアルカリを除去した後、pHが中性になるまでイオン交換水で洗浄した。なお、同原料の保水度は198%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は85.7%であった。

［原料１６］
原料９に対し、メカノケミカル処理を行った。1L容ポットにφ30mmのセラミックボールを充填率が85%になるように入れ、更に原料９を20部投入し、振動ボールミル(中央化工機製)にて10時間処理を行った。なお、同原料の保水度は83%、Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式によって算出された値は34.1%であった。

［実施例１］
10g(固形分換算)の原料２に酢酸緩衝液(pH 5.5)を適量加え、1%懸濁液を調整した。同懸濁液および市販のセルラーゼ(セルライザー、ナガセ生化学工業製)0.5ｇを分画分子量10000のポリスルフォン平膜をセットした攪拌機付き限外ろ過器（平膜型）に入れ、攪拌機の回転数200rpm、40℃にて、8時間糖化反応を行った。この反応の間、限外ろ過器内の反応液（糖化液）は、限外ろ過器を0.2〜0.3MPaに加圧することにより、限外ろ過膜を透過させて連続的に限外ろ過透過液として抜き出した。また、それと同時に、抜き出した透過液量と同量の酢酸緩衝液(pH 5.5)を限外ろ過器に連続的に補充し、限外ろ過器内の容量がほぼ一定となる条件を設定した。反応終了後、抜き出した透過液中に含まれるセロビオース生成量の測定、および限外ろ過器内に残存した懸濁液中に含まれる未反応物の重量を測定した。

［実施例２〜４、比較例１〜４］
表１における原料を用い、実施例１と同様にしてセルラーゼによる酵素分解反応を行った。試験結果を表２に示す。

［実施例５〜８、比較例５〜８］
表１における原料を用い、実施例１と同様にしてセルラーゼによる酵素分解反応を行った。試験結果を表３に示す。

＜測定方法＞
＜保水度＞
J.TAPPI NO26-78に準拠し、保水度を測定した。
＜セルロースＩ型結晶化度＞
セルロースＩ型結晶化度は、X線回折測定装置(RAD-2Cシステム、理学電気製)を用いてセルロース系材料のX線回折を測定することで求めた。セルロースＩ型結晶化度の算出はSegalらの手法(L.Segal,J.J.Greely et al,Text.Res.J.,29, 786,1959)、並びにKamideらの手法(K.Kamide et al,Polymer J.,17,909,1985)を用いて行い、X線回折測定により得られた回折図の2θ=4°〜32°の回折強度をベースラインとして、002面の回折強度(2θ=22.6°)とアモルファス部分の回折強度(2θ=18.5°)から次式により算出した。即ち、この値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないことを示す。
χc =（（I002C − Ia）／ I002C） × 100
χc ： セルロースＩ型結晶化度 (%)
I002C ： 002面(2θ=22.6°)の回折強度
Ia ： アモルファス部分(2θ＝18.5°)の回折強度

＜セロビオースの定量法＞
セロビオースの定量は、限外ろ過器より抜き出した透過液を対象に、高速液体クロマトグラフィーを用い、そのピーク面積より算出した。なお、カラムはセンシュー化学製NH2(φ4.6mm×250mm)、溶離液はアセトニトリル/水(65/35)、流速は1ml/minの条件で、示差屈折計(昭和電工製)にて測定を行った。

＜未反応率の測定法＞
酵素分解反応終了後、限外ろ過器に残存した懸濁液より、未反応物を回収し、その重量を測定することで、未反応率(残存率)を算出した。

表２及び表３の結果から、発底原料がドライ及びスラッシュパルプいずれの場合もパルプに予め前処理を施し、一定の値に結晶化度を低下させ、保水度を高めた場合の方が、セロビオース生成量、反応率ともに向上した。ドライパルプとスラッシュパルプを比較すると、スラッシュパルプの方がセロビオース生成量、反応率ともに高かった。これは、ドライパルプは、乾燥工程を経るため、セルロース同士の結合度合いがスラッシュパルプに比べて大きく、前処理の効果がスラッシュパルプほどは出にくいためと思われる。

Claims (2)

1. Ｘ線回折法によるセルロースＩ型結晶化度の計算式(式−1)によって算出された値が10%〜80%であり、かつ保水度が200%〜1000%であるパルプを用いることを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
   χc =（（I002C − Ia）／ I002C） × 100 … 式−1
   χc ： セルロースＩ型結晶化度 (%)
   I002C ： 002面(2θ=22.6°)の回折強度
   Ia ： アモルファス部分(2θ＝18.5°)の回折強度
2. パルプにフィブリル化処理、メカノケミカル処理、化学的処理のいずれか一つあるいは複数の処理を施すことを特徴とする請求項１記載のセロオリゴ糖の製造方法。