JP2009065938A - タンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なタンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】タンパク質は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性である。破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害する破骨細胞分化阻害剤は、上記タンパク質を含む。炎症性の骨破壊を治療する炎症性骨破壊治療薬は、上記タンパク質を含む。遺伝子は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする。組み替えベクターは、上記遺伝子を含む。タンパク質の製造方法は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を微生物において発現させて、該タンパク質を合成するステップ、及び該微生物から該タンパク質を水又は水溶液に溶出させるステップを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法に関する。

例えば、リウマチ ４３（４）：６２４−６３１，２００３（非特許文献１）に開示されるように、関節リウマチは、自己免疫性の慢性炎症性疾患であり、増殖した滑膜が活発に骨へ進入し、多発性の関節破壊をもたらす。非ステロイド性抗炎症薬およびステロイド等の免疫調節を中心に作用する薬剤の進歩により、疼痛や炎症に関してはある程度までコントロールが可能になってきている。しかし、現在、骨破壊を確実に予防できる治療法は確立されていない。

また、臨床免疫 ４４（６）：６２２−６２８，２００５（非特許文献２）に開示されるように、骨は、形成されたあとも、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成を繰り返し、体液中のカルシウム濃度を一定に保っている。骨吸収を担う破骨細胞の分化と活性化は、骨芽細胞が厳密に調節している。すなわち、骨芽細胞は、破骨細胞の分化と活性化に重要なサイトカインである核因子（ＮＦ）−κＢの受容体活性化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ；ＲＡＮＫＬ）とマクロファージコ ロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）を産生する。ＲＡＮＫＬは、活性型ビタミンＤ３などの骨吸収因子の刺激により分泌される。一方、Ｍ−ＣＳＦは、骨芽細胞から恒常的に分泌されている。

さらに、臨床免疫 ４４（６）：６４１−６４６，２００５（非特許文献３）より、関節リウマチにおける骨破壊において、炎症滑膜に浸潤したＴ細胞が、ＲＡＮＫＬを産生し、破骨細胞の分化を亢進することが知られている。また、炎症性サイトカインの１つである腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）も骨芽細胞においてＲＡＮＫＬの産生を誘導する。また、ＴＮＦ−αは、破骨細胞の前駆細胞に直接作用し、破骨細胞への分化を誘導する。このため、ＲＡＮＫＬやＴＮＦ−αに対する抗体が、関節リウマチの骨破壊の阻止に利用され始めている。しかし、ＲＡＮＫＬやＴＮＦ−αは、正常な免疫反応においても重要なサイトカインであるため、免疫反応の低下をもたらす可能性が危惧されている。

また、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１１６，Ｎｏ．５，２００６，ｐｐ．１２０２−１２０９（非特許文献４）には、以下に示すような事項が開示されている。

Ｗｎｔは個体発生過程における器官形成から癌の発生に至るまで、多彩な生物活性を持つサイトカインである。Ｗｎｔは分泌性の糖タンパクで、そのシグナル経路は、大きく分けてβ−カテニンを介する古典経路とそれを介さない非古典経路の２つがある。

Ｗｎｔが受容体に結合すると、転写共役分子であるβ−カテニンが細胞質に蓄積し、細胞核に移行する。β−カテニンは転写因子であるＴＣＦ・ＬＥＦとともに標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、その遺伝子のｍＲＮＡ合成を開始する。ＬＲＰ５／６やＧＳＫ−３βの阻害剤であるＬｉＣｌは、この古典経路を活性化する。

非古典経路では、ｃ−ｊｕｎＮ末端キナーゼ（ｃ−ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ；ＪＮＫ）、カルモジュリンキナーゼ（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ；ＣａＭＫ）やプロテインキナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ；ＰＫＣ）などが括性化される。Ｗｎｔ５ａとＲｏｒ２は、非古典経路を活性化する。

ヒトやマウスにおけるＬＲＰ５の変異モデルの研究から、Ｗｎｔの古典経路が活性化されると、骨芽細胞への分化や骨形成が活性化することが示されている。

一方、古典経路を活性化するとＲＡＮＫＬの発現が低下することが示されている。さらに、成熟骨芽細胞でβ−カテニンの発現を喪失させると、ＲＡＮＫＬの阻害因子であるオステオプロジェリンの発現が低下し、骨吸収が上昇する結果、骨量が減少することが示されている。

さらに、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｉｓｍ Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ． ４，２００１，ｐｐ．７７２−７８１（非特許文献５）、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４４，２００５，ｐｐ．７０８−７１３（非特許文献６）、及びＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．６，２０００，ｐｐ．２７９１−２７９６（非特許文献７）などには、リウマチ患者から採取された滑膜組織では、Ｗｎｔ５ａが非常に多く発現することが示されている。また、細胞培養の実験で、滑膜組織から得られた細胞（滑膜細胞）をＷｎｔ５ａで刺激すると、炎症性サイトカインであるＩＬ−１５やＲＡＮＫＬの発現が上昇することが報告されている。しかし、Ｗｎｔ５ａの作用を効率よく遮断できる方法が確立されていないため、リウマチの骨破壊におけるＷｎｔ５ａの役割は、いまだ不明である。

加えて、Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ，２００３，ｐｐ．６４５−６５４（非特許文献８）には、Ｗｎｔ５ａが、Ｒｏｒ２細胞外領域のｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ（ＣＲＤ）に結合することによって、Ｒｏｒ２の細胞内領域のチロシンキナーゼ領域が活性化され、細胞内にシグナルが伝達されることが報告されている。

以上に示すように、現在、関節リウマチの治療法としては抗炎症薬か炎症性サイトカインに対する抗体を投与する方法がある。しかし、抗炎症薬による治療では、炎症を抑えることはできるが、骨吸収を完全に抑制できるまでには至っていない。また、ＴＮＦ−αやＲＡＮＫＬに対する抗体療法では、ＴＮＦ−αやＲＡＮＫＬが、正常な免疫反応においても重要な役割を果たすサイトカインであるため、正常な免疫反応の低下をもたらす可能性が危惧される。そこで、免疫システムに影響を与えることなく、骨破壊を防御できる方法が必要とされている。
リウマチ ４３（４）：６２４−６３１，２００３ 臨床免疫 ４４（６）：６２２−６２８，２００５ 臨床免疫 ４４（６）：６４１−６４６，２００５ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１１６，Ｎｏ．５，２００６，ｐｐ．１２０２−１２０９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｉｓｍ Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ． ４，２００１，ｐｐ．７７２−７８１ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４４，２００５，ｐｐ．７０８−７１３ ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．６，２０００，ｐｐ．２７９１−２７９６ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ，２００３，ｐｐ．６４５−６５４

本発明の第一〜第六の目的は、それぞれ、新規なタンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法を提供することである。

本発明の第一の態様は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であることを特徴とするタンパク質である。

本発明の第二の態様は、破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害する破骨細胞分化阻害剤において、本発明の第一の態様であるタンパク質を含むことを特徴とする破骨細胞分化阻害剤である。

本発明の第三の態様は、炎症性の骨破壊を治療する炎症性骨破壊治療薬において、本発明の第一の態様であるタンパク質を含むことを特徴とする炎症性骨破壊治療薬である。

本発明の第四の態様は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子である。

本発明の第五の態様は、本発明の第四の態様である遺伝子を含むことを特徴とする組み替えベクターである。

本発明の第六の態様は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を微生物において発現させて、該タンパク質を合成するステップ、及び該微生物から該タンパク質を水又は水溶液に溶出させるステップを含むことを特徴とするタンパク質の製造方法である。

本発明の第一〜第六の態様によれば、それぞれ、新規なタンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法を提供することができる。

次に、本発明の実施の形態を図面と共に説明する。

本発明の第一の実施形態は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であることを特徴とするタンパク質である。

ここで、Ｒｏｒ２は、破骨細胞の前駆細胞に存在する公知の受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体２を意味する。また、Ｒｏｒ２の細胞外領域は、Ｒｏｒ２の受容体の外側から順に、Ｒｏｒ２の免疫グロブリン様のドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ：ＩｇＬＤ）、Ｒｏｒ２のシステインが豊富なドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ：ＣＲＤ）、Ｒｏｒ２のクリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ：ＫＤ）からなる。なお、Ｒｏｒ２の細胞外領域を構成するＩｇＬＤ、ＣＲＤ、及びＫＤの各々のアミノ酸配列が公知であるため、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列もまた公知である。しかしながら、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質は、知られていない。また、本発明の第一の実施形態であるタンパク質は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性である限り、特に限定されない。

本発明の第一の実施形態であるタンパク質は、好ましくは、ＧＳＴのアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とするタンパク質である。

ここで、ＧＳＴは、グルタチオンＳトランスフェラーゼを意味する。ＧＳＴのアミノ酸配列もまた公知である。また、本発明の第一の実施形態であるタンパク質は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列及びＧＳＴのアミノ酸配列からなると共に水溶性であることを特徴とするタンパク質であってもよい。

本発明の第二の実施形態は、破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害する破骨細胞分化阻害剤において、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を含むことを特徴とする破骨細胞分化阻害剤である。

ここで、本発明の第一の実施形態であるタンパク質は、破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害することを可能にするものであり、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を、破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害する薬剤の有効成分として使用することを可能にする。また、本発明の第二の実施形態である破骨細胞分化阻害剤に含まれる本発明の第一の実施形態であるタンパク質の含有率（濃度）は、好ましくは、１００μｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下である。

本発明の第三の実施形態は、炎症性の骨破壊を治療する炎症性骨破壊治療薬において、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を含むことを特徴とする炎症性骨破壊治療薬である。

ここで、本発明の第一の実施形態であるタンパク質は、破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害することを可能にするものであるため、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を、炎症性の骨破壊を治療する薬剤の有効成分として使用することが可能になる。本発明の第三の実施形態である炎症性骨破壊治療薬は、水又は本発明の第一の実施形態であるタンパク質を溶解させる水性溶媒を含んでもよい。水性溶媒は、例えば、リン酸緩衝液であってもよい。炎症性の骨破壊の疾患としては、例えば、関節リウマチにおける骨破壊の症状が挙げられる。また、本発明の第三の実施形態である炎症性骨破壊治療薬に含まれる本発明の第一の実施形態であるタンパク質の含有率（濃度）は、好ましくは、１００μｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下である。

本発明の第四の実施形態は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子である。

本発明の第四の実施形態である遺伝子は、好ましくは、前記タンパク質は、ＧＳＴのアミノ酸配列を含むことを特徴とする遺伝子である。なお、前記タンパク質は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列及びＧＳＴのアミノ酸配列からなると共に水溶性であることを特徴とするタンパク質であってもよい。

本発明の第五の実施形態は、本発明の第四の実施形態である遺伝子を含むことを特徴とする組み替えベクターである。

ここで、本発明の第四の実施形態である組み替えベクターは、本発明の第四の実施形態である遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターに結合させて得られるものである。ベクターとしては、例えば、大腸菌のプラスミドＤＮＡなどが挙げられる。例えば、本発明の第四の実施形態である組み替えベクターを微生物の細胞に導入して、その微生物において本発明の第四の実施形態である遺伝子を発現させることによって、本発明の第四の実施形態におけるＲｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質を合成することが可能になる。

本発明の第六の実施形態は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を微生物において発現させて、該タンパク質を合成するステップ、及び該微生物から該タンパク質を水又は水溶液に溶出させるステップを含むことを特徴とするタンパク質の製造方法である。

ここで、微生物としては、例えば、大腸菌、ほ乳類又は昆虫の培養細胞などが挙げられる。Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を微生物において発現させるために、例えば、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を含む組み替えベクターを用いてもよい。

本発明の第六の実施形態であるタンパク質の製造方法は、好ましくは、前記タンパク質は、ＧＳＴのアミノ酸配列を含むと共に該水溶液は、グルタチオンを含むことを特徴とするタンパク質の製造方法である。前記タンパク質は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列及びＧＳＴのアミノ酸配列からなると共に水溶性であることを特徴とするタンパク質であってもよい。また、グルタチオンは、好ましくは、還元型グルタチオンである。

前記タンパク質が、ＧＳＴのアミノ酸配列を含むと共に該水溶液が、グルタチオンを含む場合には、ＧＳＴ及びグルタチオンが、比較的良好に結合するために、微生物から前記タンパク質をより効率的に溶出（又は精製）することが可能になる。なお、還元型グルタチオンは、細胞内に存在する主要なグルタチオンであるため、グルタチオンが、還元型グルタチオンである場合には、前記タンパク質が溶出させられた水又は水溶液の利用に関する生体に対する安全性は、相対的に高いものであると考えられる。

本発明の第七の実施形態は、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を用いることを特徴とする破骨細胞の分化を阻害する方法である。本発明の第七の実施形態である破骨細胞の分化を阻害する方法においては、例えば、本発明の第二の実施形態である破骨細胞分化阻害剤を用いてもよい。

本発明の第八の実施形態は、本発明の第一の実施形態であるタンパク質を用いることを特徴とする炎症性骨破壊を治療する方法である。本発明の第八の実施形態である炎症性骨破壊を治療する方法においては、例えば、本発明の第三の実施形態である炎症性骨破壊治療薬を用いてもよい。

図１は、本発明の実施形態におけるタンパク質の例を概略的に説明する図である。

図１に示すタンパク質１０は、Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列１１及びＧＳＴのアミノ酸配列１５からなる。このため、タンパク質１０は、水溶性であり、例えば、リン酸緩衝液（水溶液）に溶解させられ得る。Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列１１は、Ｒｏｒ２の免疫グロブリン様のドメイン（ＩｇＬＤ）のアミノ酸配列１２、Ｒｏｒ２のシステインが豊富なドメイン（ＣＲＤ）のアミノ酸配列１３、Ｒｏｒ２のクリングルドメイン（ＫＤ）のアミノ酸配列１４からなる。すなわち、タンパク質１０においては、ＧＳＴのアミノ酸配列１５、Ｒｏｒ２のＩｇＬＤのアミノ酸配列１２、Ｒｏｒ２のＣＲＤのアミノ酸配列１３、Ｒｏｒ２のＫＤのアミノ酸配列１４が、この順に直線的に連結されている。

以下は本発明の好ましい実施形態について詳述して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明の好ましい実施形態は、骨吸収において、Ｗｎｔ５ａが破骨細胞の分化に、重要な役割を果たすことを示し、Ｗｎｔ５ａの共受容体であるＲｏｒ２の可溶型（ｓＲｏｒ２）を作製し、Ｗｎｔ５ａの作用を阻害することで、骨破壊の進行を制御する方法を提供する。

より詳しくは、本発明の好ましい実施形態は、関節リウマチにおける骨破壊において、β−カテニンを介さないＷｎｔ５ａシグナル経路が、破骨細胞の分化を亢進することを明らかにする。Ｗｎｔ５ａの共受容体であるＲｏｒ２の可溶型（ｓＲｏｒ２）を作製し、リウマチモデルマウスに投与することで、骨破壊の進行を防御する方法を提供する。

本発明の好ましい実施形態を説明する前に、骨量の維持におけるＷｎｔの役割を説明する。

上述したように、Ｗｎｔは分泌性の糖タンパクで，その細胞活性化シグナルの経路は、大きく分けてβ−カテニンを介する古典経路とそれを介さない非古典経路の２つがある。

β−カテニンを介する古典経路を活性化する共受容体であるＬＲＰ５の異常によって、骨粗鬆症を伴う偽神経膠腫症が発症する。ＬＲＰ５の異常によって、骨芽細胞の分化および骨形成が低下し、骨量が減少することが示されている。これらの報告は、Ｗｎｔ古典経路が活性化されると、骨芽細胞への分化や骨形成が活性化することを示している。

骨吸収に対するＷｎｔ古典経路の役割も解析されている。成熟骨芽細胞において、β−カテニン遺伝子を欠損すると、オステオプロジェリンの発現が低下し、骨吸収が亢進する結果、骨量が減少することが示されている。この結果は、骨芽細胞においてＷｎｔ古典経路が活性化するとオステオプロジェリンの発現が増加し、破骨細胞の分化と括性化を抑制することを意味する。

しかし、Ｗｎｔ非古典シグナルが、破骨細胞前駆細胞や破骨細胞に直接作用し、骨吸収に対しどのような作用を発揮するか明らかではない。

そこで、本発明の好ましい実施形態においては、Ｗｎｔ５ａが、破骨細胞の分化を促進することを明らかにする。より具体的には、Ｗｎｔ５ａの作用を阻害するため、Ｗｎｔ５ａの共受容体であるＲｏｒ２の可溶型タンパク（可溶型Ｒｏｒ２）を作製し、作製した可溶型Ｒｏｒ２を含有する関節リウマチの治療剤として使用する。

次に、本発明の好ましい実施形態としての実施例を図面と共に具体的に説明する。図２から図７は、可溶型Ｒｏｒ２が破骨細胞の分化を抑制することを培養実験とリウマチモデルマウスを用いて調べた結果を示す。

まず、細胞培養で、マクロファージから破骨細胞へ分化させる方法を説明する。６週齢から８週齢のマウスの足の長管骨から、骨髄細胞を採取する。採取した骨髄細胞をマクロファージ刺激因子であるＭ−ＣＳＦの存在下で、３日間培養し、マクロファージへの分化を促す。この細胞群を骨髄マクロファージと呼ぶ。次に、骨髄マクロファージをＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬで、さらに刺激し破骨細胞に分化させる。

次に、マクロファージから破骨細胞へ分化におけるＷｎｔ５ａの効果について説明する。この骨髄マクロファージから破骨細胞へ分化を誘導する培養系に、Ｗｎｔ５ａを添加した。Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬによるマクロファージから破骨細胞への分化培養実験において、Ｗｎｔ５ａを添加した培養を行った結果を図２に示す。図２に示すように、Ｗｎｔ５ａを添加した培養では、破骨細胞への分化が用量依存的に促進された。言い換えれば、Ｗｎｔ５ａは添加量に応じて、骨髄マクロファージから破骨細胞への分化を促進した。ここで、Ｗｎｔ５ａの細胞受容体について説明すると、Ｗｎｔ５ａは、細胞が発現するＦｒｉｚｚｌｅｄ ２およびＦｒｉｚｚｅｌｅｄ ５に結合し、細胞を活性化し、また、共受容体であるＲｏｒ１およびＲｏｒ２に結合することが知られている。本実施例においても、破骨細胞の前駆細胞である骨髄マクロファージは、Ｗｎｔ５ａの受容体と報告されているＦｒｉｚｚｌｅｄ ２、Ｆｒｉｚｚｅｌｅｄ ５およびＲｏｒ２のｍＲＮＡを発現していた。

次に、Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔ５ａによる破骨細胞分化促進作用に必須であるか調べた。その結果を図３に示す。具体的には、ＳｈＲＮＡを用いて骨髄マクロファージのＲｏｒ２の発現を低下させた。Ｒｏｒ２を低下させた骨髄マクロファージでは、Ｗｎｔ５ａによる破骨細胞分化促進作用が消失したことから、Ｗｎｔ５ａによる破骨細胞促進作用は、Ｒｏｒ２を介することが示唆された。

また、Ｗｎｔ５ａは、Ｒｏｒ２細胞外領域のシステインの豊富なドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）に結合すること、及び、この結合によって、Ｒｏｒ２の細胞内領域のチロシンキナーゼ領域が活性化され、細胞内にシグナルが伝達されることが、知られている。

そこで、本実施例では、Ｗｎｔ５ａとは結合することができるが、細胞内へシグナルを送ることのできない可溶型Ｒｏｒ２を作製した。

次に、本発明の実施例における可溶型Ｒｏｒ２（受容体タンパク質）及びその製造方法を説明する。

Ｒｏｒ２受容体ｃＤＮＡを含むベクター（クローン番号３０５３５６１５）をＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社より入手した。このＲｏｒ２受容体ｃＤＮＡを鋳型に、Ｒｏｒ２の細胞外領域をコードするＤＮＡ断片をポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法にて増幅した。増幅したＲｏｒ２の細胞外領域ｃＤＮＡをＧＥヘルスケアバイオサイエンス社から入手可能なグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の下流，すなわちＧＳＴの遺伝子をもつｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターにつないだ。このＧＳＴ−Ｒｏｒ２細胞外領域の遺伝子をもつベクターを大腸菌に取り込ませ、その大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で一晩培養する。この培養した大腸菌液２０ｍｌを４００ｍｌの新しい１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌する。この大腸菌液を３７℃で２時間培養後、タンパク合成誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの濃度で添加し、タンパク合成を誘導した。ＩＰＴＧ添加後、６時間３７℃で培養し、大腸菌にＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク質を合成させた。

ＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク（可溶型Ｒｏｒ２）を発現する大腸菌を、超音波破砕機（バイオラプター，ＵＣＤ−２００型、コスモバイオ（株））を使用して、超音波処理によって破砕した。破砕した大腸菌成分から、ＧＳＴとグルタチオンの結合を利用して、ＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク質を精製した。すなわち、グルタチオンを結合したセファロースビーズ（グルタチオンセファロースＦＦ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）と破砕した大腸菌溶液（ＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパクを含む）の上清を４℃で１６時間混和し、ＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパクをグルタチオンセファロースに結合させる。グルタチオンセファロースに結合したＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク質を大腸菌成分から回収する。すなわち、グルタチオンセファロースＦＦに非特異的に結合した大腸菌成分を０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン社より入手）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）で洗い流し、可及的にＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク質のみビーズに残った状態にする。このビーズを過剰量の還元型グルタチオンを含む溶液（５ｍＭ還元型グルタチオン（和光純薬（株））、１５０ｍＭ食塩を含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）に懸濁し、ＧＳＴ−可溶型Ｒｏｒ２融合タンパク質をグルタチオン結合セファロースビーズから溶出する。

溶出した可溶型Ｒｏｒ２溶液は透析膜カセットに入れ、３リットルのＰＢＳ中で攪拌する。これを２回繰り返すことによって、ほぼ完全に溶出に使用した溶液成分（５ｍＭ還元型グルタチオン、１５０ｍＭ食塩を含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）が、ほぼ完全にＰＢＳと置き換えることができる。すなわち、透析によって可溶型Ｒｏｒ２溶液から、低分量のグルタチオンを含む溶出に使用した緩衝液成分を取り除き、溶液をＰＢＳにする。

可溶型Ｒｏｒ２溶液に含まれる大腸菌由来の内毒素をＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（シグマアルドリッチジャパン社より入手）による相分離によって除去する。すなわち、可溶型Ｒｏｒ２溶液に最終濃度１％になるようにＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を加え、４℃で３０分間混和する。

混和した可溶型Ｒｏｒ２溶液を３７℃に温め、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を析出する。これを遠心し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を沈殿させる。このとき溶液に含まれていた内毒素は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４とともに沈殿相に移行する。

この上清を回収し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４による相分離を６回繰り返す。

カブトガニのライセートのゲル化反応によって、内毒素を除去した溶液中の内毒素の量を定量する。

溶液中の内毒素が、１μｇタンパク量あたり０．１ＥＵ（エンドトキシン単位）以下の可溶型Ｒｏｒ２溶液を使用する。

次に、作製した可溶型Ｒｏｒ２とＷｎｔ５ａタンパクが結合するか調べた。

可溶型Ｒｏｒ２とＷｎｔ５ａタンパクをＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝液）中で混和した。グルタチオン結合セファロースビーズを用いて、この溶液から可溶型Ｒｏｒ２を回収すると、この可溶型Ｒｏｒ２に結合したＷｎｔ５ａも一緒に回収された。しかし、ＧＳＴとＷｎｔ５ａタンパクをＰＢＳ緩衝液中で混和した溶液からは、Ｗｎｔ５ａは回収できなかった。つまり、可溶型Ｒｏｒ２は、Ｗｎｔ５ａに結合することが確認できた。

次に、Ｗｎｔ５ａによる破骨細胞の分化が、作製した可溶型Ｒｏｒ２で抑制できるか調べた。その結果を図４に示す。Ｗｎｔ５ａを添加した培養では、破骨細胞の分化促進効果がみとめられた。ここに、可溶型Ｒｏｒ２を添加するとＷｎｔ５ａによる破骨細胞への分化促進効果は抑制された。この結果から、作製した可溶型Ｒｏｒ２はＷｎｔ５ａと結合し、Ｗｎｔ５ａの作用を阻害することが示された。

通常、破骨細胞の分化は、破骨細胞の前駆細胞であるマクロファージが、骨芽細胞に接触し、骨芽細胞が発現するＲＡＮＫＬの刺激を受けることで起こる。マウスの頭蓋骨から得た骨芽細胞と長管骨より得た骨髄細胞を一緒に培養し、ここに、骨吸収刺激因子として活性型ビタミンＤ３を添加すると、細胞培養実験においても、より生体内に近い状態で、破骨細胞を分化させることができる。この破骨細胞分化―培養系に、可溶型Ｒｏｒ２を添加した結果を図４に示す。可溶型Ｒｏｒ２を添加すると、活性型ビタミンＤ３添加によって誘導される破骨細胞の分化は、添加量依存的に抑制された。

骨芽細胞におけるＷｎｔ５ａの発現を調べると、破骨細胞前駆細胞に比べて、骨芽細胞は、Ｗｎｔ５ａを著明に発現していた。つまり、骨芽細胞は、Ｗｎｔ５ａを常に分泌しており、骨芽細胞が分泌するＷｎｔ５ａは、ＲＡＮＫＬとともに破骨細胞の前駆細胞を刺激することによって、破骨細胞への分化を促進していることが示された。さらに、可溶型Ｒｏｒ２は、このＷｎｔ５ａのシグナルをブロックし、破骨細胞の分化を抑制することが示された。

一方、リウマチ滑膜においてＷｎｔ５ａが高発現することが示されている。しかし、リウマチの病態におけるＷｎｔ５ａの役割は明らかではない。

そこで、上述した精製した可溶型Ｒｏｒ２を破骨細胞の分化を誘導した培養系や生体内で骨吸収を亢進させたモデルに投与した。

ここで、リウマチモデルマウスの作製方法について説明する。関節組織に多く含まれるＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体を一匹につき３ｍｇ静脈内投与した。抗体投与後２日目に、１匹につき７５μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を投与し、関節炎を発症させた。リウマチモデルマウスに関節炎が発症後、マウスを生理食塩水、ＧＳＴおよび可溶型Ｒｏｒ２（２μｇ、２０μｇ）を投与する４つのグールプに分けた。各グループにそれぞれの薬剤を２週間毎日マウスの腹腔内に投与した。

ここで、可溶型Ｒｏｒ２の投与方法について説明する。可溶型Ｒｏｒ２の投与量は、以下の方法で決める。骨芽細胞と骨髄細胞を一緒に培養する。この培養系に活性型ビタミンＤ３を添加し、破骨細胞を誘導する。この破骨細胞誘導培養系に５００ｎｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌの終濃度となるよう可溶型Ｒｏｒ２を生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で希釈する。そして、破骨細胞の分化を最も抑制する可溶型Ｒｏｒ２の濃度を決める。この濃度の１００倍の濃度の可溶型Ｒｏｒ２の０．２ｍｌを体重３０ｇのマウスの腹腔内へ毎日投与する。投与は２週間行う。

まず、関節リウマチの１つの臨床症状として、手足の腫れが挙げられる。手足の腫れに関しては、生理食塩水、ＧＳＴおよび可溶型Ｒｏｒ２（２μｇ、２０μｇ）を投与した４つのグールプの間で、統計学的に有為な差は認められなかった。

次に、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴを用いて、足根部の骨吸収の状態を観察した。リウマチを起こしていないコントロールでは、足根部の骨に、骨吸収の後であるレントゲン透過像（骨の黒い部分）が認められなかった。リウマチを起こした群では、足根部の骨に、著明なレントゲン透過像を認めた。可溶型Ｒｏｒ２を２０μｇ投与した群では、レントゲン透過像が著明に減少していた。リウマチによって引き起こされた骨のレントゲン透過像を定量化した結果を図５に示す。可溶型Ｒｏｒ２−２０μｇ投与群は、ＧＳＴ投与群に比べ有為に吸収部位が減少していた。

次に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴを用いて、脛骨近心部の骨の状態を調べた。ｍｉｃｒｏＣＴによって得られた海綿骨量を定量化した結果を図６に示す。リウマチを発症していない対照群と比較して、リウマチを発症したＧＳＴ投与群では、著明な海綿骨の減少が認められた。一方、可溶型Ｒｏｒ２−２０μｇ投与したマウスでは、リウマチによる海綿骨の減少が抑制されていた。

次に、脛骨近心部の組織切片を作り、破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色した。脛骨近心部に認められる破骨細胞数を定量化した結果を図７に示す。可溶型Ｒｏｒ２を投与したものでは、頸骨近心部のＴＲＡＰ陽性破骨細胞が、著明に減少していた。

このように、リウマチの病態において、滑膜組織や骨芽細胞が産生するＷｎｔ５ａは、マクロファージに存在するＲｏｒ２受容体を介し、細胞内にシグナルを伝えることによって、ＲＡＮＫＬと協調して破骨細胞の分化を増強し、骨破壊を起こしていることが推定された。

また、リウマチの骨破壊において、可溶型Ｒｏｒ２を投与することは、Ｗｎｔ５ａのシグナルをブロックし、破骨細胞の分化を抑制する。この機序によって、可溶型Ｒｏｒ２は、リウマチに伴う骨破壊を防御できる手段であることが確認された。

以上、本発明の実施の形態及び実施例を具体的に説明してきたが、本発明は、これらの実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、これら本発明の実施の形態及び実施例を、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく、変更又は変形することができる。

本発明の実施形態のいくつかは、Ｗｎｔ可溶型Ｒｏｒ２受容体タンパク質を用いた骨吸収の阻害薬やＷｎｔ可溶型Ｒｏｒ２受容体による炎症性骨破壊の阻害に利用可能であると考えられる。

例えば、今までのところ、関節リウマチを完全に治す治療薬は存在していない。薬による対症治療として、痛みを抑える抗リウマチ剤等の薬がある。また、症状の悪化した患者さんについては切除手術がある。しかし、本発明の実施形態のいくつかを利用すると、骨形成と骨破壊のバランスを調整することができるため、関節リウマチの治療薬として利用することを期待することができる。

このように、医療分野において、骨減少に至る様々な病気の治療に可溶型Ｒｏｒ２を用いることで、骨量減少の予防に役立てることが期待される。特に、現在のところ確実な治療法の確立していない関節リウマチにおいて、治療薬として治療に役立てることが可能であると考えられる。

本発明の実施形態におけるタンパク質の例を概略的に説明する図である。 骨髄マクロファージから破骨細胞への分化に対するＷｎｔ５ａの効果を示す図である。 Ｒｏｒ２タンパク質の発現を抑制した骨髄マクロファージから破骨細胞への分化に対するＷｎｔ５ａの効果を示す図である。 骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養系での破骨細胞分化に対する可溶型Ｒｏｒ２の効果を示す図である。 リウマチモデルマウスの足根骨の骨吸収に対する可溶型Ｒｏｒ２投与の効果を示す図である。 リウマチモデルマウスの脛骨近位端の海綿骨量に対する可溶型Ｒｏｒ２投与の効果を示す図である。 リウマチモデルマウスの脛骨近位端の破骨細胞数に対する可溶型Ｒｏｒ２投与の効果を示す図である。

符号の説明

１０ タンパク質
１１ Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列
１２ Ｒｏｒ２のＩｇＬＤのアミノ酸配列
１３ Ｒｏｒ２のＣＲＤのアミノ酸配列
１４ Ｒｏｒ２のＫＤのアミノ酸配列
１５ ＧＳＴのアミノ酸配列

Claims (8)

1. Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であることを特徴とするタンパク質。
2. ＧＳＴのアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
3. 破骨細胞の前駆細胞が破骨細胞へ分化することを阻害する破骨細胞分化阻害剤において、
   請求項１又は２に記載のタンパク質を含むことを特徴とする破骨細胞分化阻害剤。
4. 炎症性の骨破壊を治療する炎症性骨破壊治療薬において、
   請求項１又は２に記載のタンパク質を含むことを特徴とする炎症性骨破壊治療薬。
5. Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
6. 前記タンパク質は、ＧＳＴのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の遺伝子。
7. 請求項５又は６に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組み替えベクター。
8. Ｒｏｒ２の細胞外領域のアミノ酸配列を含むと共に水溶性であるタンパク質をコードする遺伝子を微生物において発現させて、該タンパク質を合成するステップ、及び
   該微生物から該タンパク質を水又は水溶液に溶出させるステップ
   を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法。

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