EA006603B1 - Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток - Google Patents

Abstract

Данное изобретение посвящено пептидам, композициям и методам лечения заболеваний, например доброкачественных и злокачественных опухолей, требующих удаления или разрушения вредных или нежелательных клеток у пациента, которому требуется такая терапия; лечение включает использование белков (а также пептидов, произведенных из аминокислотных последовательностей этих белков), аминокислотная последовательность которых включает по крайней мере одну аминокислотную последовательность, произведенную из протеинов нервной нити и другие родственные молекулы.

Description

Это заявление истребует приоритет предварительной патентной заявки с регистрационным номером 60.306,161, озаглавленной «Белки и пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», поданной 19 июля 2001; приоритет предварительной патентной заявки с регистрационным номером 60.306,150, озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», поданной 19 июля 2001, и приоритет предварительной патентной заявки с регистрационным номером 60.331,477, озаглавленной: «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», поданной 16 ноября 2001. Каждая из заявок полностью включена сюда в виде ссылки.

Область изобретения

Данное изобретение касается способов лечения заболеваний, требующих удаления или разрушения клеточных элементов, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли людей. При лечении используются белки и пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые являются соответствующими, аналогичными или гомологичными определенной части аминокислотной последовательности белков нервных нитей. Способ включает, без ограничения, введение веществ внутримышечно, орально, внутривенно, спинально, внутрь опухоли, через носовую полость, локально, через кожу и т.д. отдельно или совместно с носителем.

Предпосылки изобретения

Многие способы лечения и процедуры включают удаление или разрушение вредной или нежелательной ткани. Примеры таких способов лечения включают хирургическое удаление злокачественных тканей, разрушение метастатических опухолей путем химиотерапии и уменьшения железистой гиперплазии (напр. простаты). Другие примеры включают удаление с лица нежелательных волос, бородавок, подкожной ткани, лимфоидной ткани или жировой ткани.

Необходим эффективный агент, который будет разрушать и, следовательно, способствовать удалению вредных или нежелательных клеток и тканей или будет подавлять их дальнейший рост; и который, обладая минимальной системной токсичностью или не обладая ею вовсе, будет оказывать только местное влияние. Класс таких агентов составляют белки нервных нитей и родственные им молекулы. Это показано в патентной заявке с регистрационным номером 10.092,934 озаглавленной «Способы лечения опухолей и родственных заболеваний, с использованием белков нервных нитей», поданной 8 марта 2002 года и полностью включённой сюда в виде ссылки. Пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие определенной части аминокислотной последовательности белка нервной нити ΆΌ70-ΝΤΚ. тоже являются такими агентами. Эти пептиды описаны в патентной заявке США с регистрационным номером 10.153,334 озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», поданной 24 мая 2002 года и полностью включённой сюда в виде ссылки.

Рак является аномалией внутренних регуляторных механизмов клеток, которая приводит к нерегулируемому росту и размножению клетки. Нормальные клетки образуют ткани. Когда эти клетки теряют способность функционировать в виде специфических регулируемых и координированных единиц (утрата способности к дифференциации), то такой дефект ведет к беспорядку в клеточной популяции. В этом случае образуется опухоль.

Доброкачественные гипертрофии ткани являются такими аномалиями, когда из организма желательно удалить клетки. Доброкачественные опухоли являются пролиферациями, которые не образуют в организме метастазы, однако вызывают симптомы болезни. Такие опухоли могут быть летальными, если они локализованы в недоступных областях органов, например в мозге. Существуют доброкачественные опухоли таких органов, как легкое, мозг, кожа, гипофиз, щитовидная железа, кора надпочечника и костный мозг, яичник, матка, яичко, соединительная ткань, мышца, кишки, ухо, нос, горло, миндалины, рот, печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, предстательная железа, сердце и другие органы.

Хирургическое вмешательство часто является первым шагом при лечении рака. Задачи хирургического вмешательства различны. Иногда оно применяется для удаления по возможности большей части видимой опухоли, или уменьшения её размеров (для удаления основной части опухоли таким образом, чтобы отпала необходимость лечения другими способами). В зависимости от типа рака и его местонахождения хирургическое вмешательство также может обеспечивать некоторое симптоматическое облегчение пациенту. Например, если хирург может удалить большую часть растущей опухоли мозга и уменьшить вследствие этого давление внутри черепа, то состояние больного улучшится.

Однако не все опухоли поддаются хирургическому лечению. Некоторые из них могут быть расположены в тех частях тела, откуда полностью удалить их невозможно. В качестве таких примеров могут служить опухоли ствола мозга (часть мозга, которая регулирует дыхание), или же опухоль, которая растет вокруг главного кровеносного сосуда. В таких случаях роль хирургического вмешательства ограничена из-за большого риска, связанного с удалением опухоли.

В некоторых случаях хирургическое вмешательство с целью уменьшения размера опухоли не применяют, так как в этом нет необходимости. Примером является лимфома Ходжкина, рак лимфатических узлов, который очень хорошо поддаётся комбинированному лечению химиотерапией и радиационной

- 1 006603 терапией. В случае лимфомы Ходжкина хирургическое вмешательство редко применяется для лечения, но почти всегда используется с целью установления диагноза.

Химиотерапия - обычный способ лечения рака, который включает применение медикаментов (обычно их принимают через рот или путем инъекций), которые специфически атакуют быстро делящиеся клетки (типа тех, которые находятся в опухоли) повсюду в организме. Это делает химиотерапию необходимой для лечения опухолей, которые уже образовали метастазы, а также опухолей, которые способны распространяться через кровь и лимфатические системы, но не выражены вне первичной опухоли. Химиотерапия может также использоваться, чтобы усилить ответную реакцию локализованных опухолей к хирургическому вмешательству и лучевой терапии. Так обстоит дело в случае некоторых раковых образований головы и шеи.

К сожалению, другие клетки человеческого организма, которые обычно тоже быстро делятся (такие, как выстилка желудка и волосы) также подвергаются воздействию химиотерапевтических средств. По этой причине многие химиотерапевтические агенты вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как тошнота, рвота, анемия, потеря волос и другие признаки. Эти побочные эффекты являются временными, и существуют лекарства, которые ослабляют многие из них.

По мере развития наших познаний, исследователи изобрели новые химиотерапевтические агенты, которые не только более успешно уничтожают раковые клетки, но и оказывают меньше побочного влияния на пациента.

Химиотерапевтические средства пациентам дают разными путями. Некоторые из них - пилюли, а некоторые вводят внутривенно или другой инъекцией. При инъекционной химиотерапии пациент посещает кабинет врача или больницу. Другие химиотерапевтические средства требуют непрерывного вливания в кровоток в течение 24 ч в сутки. В таких случаях требуется незначительное хирургическое вмешательство для имплантации маленького насоса, носимого пациентом. После имплантации насос медленно вводит медикамент. Во многих случаях такой постоянный порт помещен в вену пациента, чтобы устранить необходимость повторных уколов.

Лучевая терапия - другое традиционно используемое оружие в борьбе против рака. Радиация уничтожает рак путем разрушения ДНК внутри раковых клеток. Радиация подается различными способами, наиболее популярный из которых предусматривает очень точное направление на пациента луча радиации и его фокусировку на опухоли. При выполнении этой процедуры пациент лежит на столе и луч перемещается вокруг него/неё. Процедура длится в течение нескольких минут, однако она может быть проделана ежедневно в течение нескольких недель (в зависимости от типа опухоли) с целью достижения общего количества предписанной дозы.

Иногда используется другой радиационный метод, названный брахитерапией, который включает отбор радиоактивных пилюль (зерен) или проволок, и имплантацию их в теле пациента в области опухоли. Имплантанты могут быть временными или постоянными. В случае постоянного имплантанта радиация зерен угасает в течение нескольких дней или недель таким образом, чтобы пациент не был бы радиоактивен. В случае временных имплантантов полную дозу радиации обычно поставляют в течение нескольких дней, и в течение этого времени пациент должен находиться в больнице. В обоих случаях радиация в облучаемой области обычно поставляется очень целенаправленно, чтобы осуществить локальный контроль над раком (в отличие от химиотерапии, когда воздействию препарата подвергается организм в целом).

Некоторые специально отобранные пациенты могут подвергаться трансплантации костного мозга. Эта процедура обычно выполняется в случаях, когда пациент болен раком, который является особенно агрессивным, или вследствие того, что у пациента, подвергнутого обычной терапии снова наблюдается рецидив рака. Трансплантация костного мозга - сложная процедура. Существуют много типов трансплантации, которые отличаются по способности вызывать побочные эффекты и достигать исцеления. Большинство трансплантаций костного мозга выполнено в специальных центрах, и во многих случаях их осуществление рассматривают как научное достижение.

Существует множество других видов терапии, хотя большинство из них все еще исследуется в клинических условиях, и пока не разрешено в качестве стандартного способа лечения. Такие примеры включают использование иммунотерапии, моноклональных антител, анти-ангиогенезисных факторов и генную терапию.

Иммунотерапия: существуют различные методы, которые предназначены помочь иммунной системе пациента бороться с раком и которые весьма отличаются от радиационной терапии или химиотерапии. Часто для достижения цели исследователи вводят пациенту специально разработанную вакцину.

Моноклональные антитела: эти антитела предназначены для того, чтобы связываться с канцерогенными (но не с нормальными) клетками, используя для этого различия в антигенных и/или других характеристиках между злокачественными и доброкачественными клетками. Антитела могут быть введены пациенту отдельно или в виде конъюгата с различными цитостатическим соединениями, или в радиоактивной форме таким образом, чтобы антитело было бы нацелено предпочтительно на злокачественные клетки, поставляя при этом последним токсический агент или радиоактивность.

- 2 006603

Антиангиогенезисные факторы: поскольку раковые клетки быстро делятся и опухоли растут, возможно скорое прекращение их кровоснабжения. Чтобы компенсировать такой процесс, некоторые опухоли выделяют вещество, которое, как считают, способствует индуцировать рост кровеносных сосудов в их близости, обеспечивая таким образом раковые клетки сосудистым аппаратом для подачи питательных веществ. Поэтому были разработаны методы экспериментальной терапии для прекращения роста таких, питающих опухоли, кровеносных сосудов.

Генная терапия: рак - результат ряда мутаций, которые в конечном счете ведут к образованию раковой клетки и его чрезмерно быстрой пролиферации. Раковые образования можно лечить, подводя к раковым клеткам гены, которые будут регулировать или прекращать процесс пролиферации рака, включать запрограммированные механизмы клетки для уничтожения раковой клетки, улучшать иммунное распознавание клетки или вызывать экспрессию пролекарства, которое превращается в токсический метаболит или цитокин, подавляющий рост опухоли.

Доброкачественные опухоли и деформации также можно лечить разнообразными методами, включая хирургическое вмешательство, радиотерапию, лекарственную терапию, тепловую или электрическую абляцию, криотерапию и другие. Хотя доброкачественные опухоли не образуют метастазы, они могут стать большими и могут рецидивировать. Хирургическое удаление доброкачественных опухолей связано со всеми трудностями и побочными явлениями, которые вообще характерны для операционного вмешательства, и часто неоднократно применяется в случае некоторых доброкачественных опухолей таких как аденомы гипофиза, менингеомы мозга, гиперплазии простаты и других.

Существуют еще и другие условия, вовлекающие нежелательные клеточные элементы, когда желательно селективное удаление клеток. Например, сердечная болезнь и инсульты обычно вызываются атеросклерозом, являющимся пролиферативным повреждением фиброжирных и модифицированных гладких элементов мышцы, которые искажают стенку кровеносного сосуда, сужают просвет, уменьшают поток крови, предрасполагают к образованию фокальных сгустков крови и, в конечном счете, ведут к блокаде и инфаркту. Различные методы лечения атеросклероза включают шунтирование трансплантатов, искусственные трансплантаты, ангиопластику с реканализацией, кюретаж, радиацию, лазер или другие способы удаления; медикаментозное лечение с целью подавления атеросклероза путем уменьшения липида; различные виды антикоагулянтной терапии; общие критерии диеты, упражнений и образа жизни. Необходим метод для удаления атеросклеротических бляшек без риска и побочных эффектов, характерных для хирургических процедур.

Другие примеры нежелательных клеточных элементов, где желательно селективное удаление клеток, включают рост, индуцируемый вирусами типа бородавок. Ещё одним примером являются гипертрофические воспалительные образования, найденные в воспалённых тканях, а также гипертрофические рубцы или келоиды. Другие примеры можно найти в косметической сфере, в частности при удалении нежелательных волос, например, волос на лице или рубцовом сморщивания нежелательных областей ткани, например, кожи лица, соединительных тканей или кожи и соединительной ткани конечностей.

Для специалистов будут очевидны и другие примеры. Во всех, или в большинстве этих примеров, подчеркнута необходимость в таком лечении, при котором можно удалять или уничтожать нежелательные клеточные элементы без риска и побочных эффектов, которые характерны для обычных методов терапии, а также удалять нежелательные клеточные элементы с большой точностью.

Белки нервных нитей (ΝΤΡ) - семейство недавно описанных белков мозга. Один член этого семейства - Αϋ7ο-ΝΤΡ - является ассоциированным с мембраной фосфопротеином с молекулярной массой ~41 кД, с функциями, связанными с основным отростком нейрона (Де Ла Монте и др., 1. С1ш. ΙηνοδΙ. 100:3093-3104 (1997); Де Ла Монте и др. Αΐζ. Вер., 2:327-332 (1999); Де Ла Монте С.М., и Уандс Дж.Р., 1оита1 о£ ЛШюнпег'х Эйеаке, 3:345-353 (2001)). Ген, который кодирует ΑΩ7ο-ΝΤΡ и предсказанную последовательность белка для Αϋ7ο-ΝΤΡ, был идентифицирован и описан (Де Ла Монте и другие, 1. Οΐίη. Шуей., 100:3093-3104 (1997)). Кроме разновидности ~ 41 кД, были идентифицированы другие разновидности белка нервной нити (~26, ~21, ~17 и ~15 кД) и связаны с нейроэктодермальными опухолями, астроцитомами и глиобластомами, а также с нарушениями, обусловленными гипоксией, ишемией или мозговым инфарктом (Ксу и другие, Сапсег Кекеагсй, 53:3823-3829 (1993); Де Ла Монте и другие, 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1, 55(10): 1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, 1. йеигоГ 8с1, 138(1-2):26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. йеигоГ 8с1„ 755(2): 118-25 (1996); Де Ла Монте и другие, 1. С1ш. 1пуе§!., 100:3093-3104 (1997); и Де Ла Монте и др., Α1ζ., Вер., 2:327-332 (1999)).

Разновидности белка нервной нити были описаны и регистрированы в патентах США №№ 5948634; 5948888 и 5830670 под заглавием «Экспрессия гена белка нервной нити и обнаружение заболевания Альзгеймера» и в патенте США № 6,071,705, под заглавием «Метод обнаружения неврологической болезни или дисфункции». Содержание этих патентов специально включено сюда в полном масштабе в виде ссылок. Согласно их описанию ΝΤΡ - регламентирован и образуется в процессе смерти клетки. Таким образом показано, что мертвые и умирающие нервные клетки перепроизводят ΝΤΡ и, соответственно, присутствие последнего указывает на смерть нервных клеток и начала болезни Альзгеймера (ΑΌ).

Другие разновидности белка нервной нити были идентифицированы в виде других продуктов гена ΑΌ7^ΝΤΡ (например, 112 белковых аминокислот, описанных в базе данных NСΒI ΕηΙΐΌζ-ΡΐΌ^ίη. Доступ

- 3 006603 № ХР_032307 РГО §15928971) или в виде продуктов, схожих с белками нервной нити (например, 106 белковых аминокислот, описанных в базе данных ΝΟΒΙ Еп1гсх-Рго1ст. Доступ № ААН14951 РГО §15928971, других 106 белковых аминокислот, описанных в базе данных NСΒI Еп1гсх-Рго1ст. Доступ № ХР_039102 РГО §18599339, и 61 белковых аминокислот, описанных в базе данных ΝΟΒΙ Еп1гсх-Рго1ст. Доступ № ААН02534 РГО §12803421).

Белок нервной нити связан с АО, а ΝΤΡ регламентирован гибелью клетки в процессе АО. По сравнению с контролем, Α07ο-ΝΤΡ ιηΚ,ΝΛ регламентирована в мозге с АО; уровни белка ΑΟ70-ΝΤΡ в мозге и в С8Р выше в АО, чем в контроле; и иммунореактивность ΑΟ70-ΝΤΡ найдена в старческих бляшках, нейрофибриллярных клубках (ΝΕΤ), вырождающихся нейронах, нейропильных нитях и дистрофических невротических отростках при болезни мозга АО и Синдромом Дауна (Озтурк и другие, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 86:419 423 (1989); Де Ла Монте и другие, I. С1ш. Ιηνθδΐ., 86(3):1004-13 (1990); Де Ла Монте и другие, I. №ита1. 8сЕ, 113(2):152-64 (1992); Де Ла Монте и др., Апп. №ито1, 32(6):733-42 (1992); Де Ла Монте и другие, I. №итора1йо1. Ехр. №ито1., 55(10): 1038-50 (1996), Де Ла Монте и другие, I. №иго1 8сЕ, 138(1-2):26-35 (1996); Де Ла Монте и другие, I. №ито1 8сЕ, 135(2): 118-25 (1996); Де Ла Монте и другие, I. СИп. Ιηνθδΐ., 100:3093-3104 (1997); и Де Ла Монте и другие. АО., Вер., 2:327-332 (1999)). ΝΤΡ локализован внутри клеток, внутри мелких образований в нейропиле или находится во внеклеточном пространстве больного мозга как при АО, так и при Синдроме Дауна. (Де Ла Монте и другие, Апп. №ито1, 52(6):733-42 (1992)).

Высокие уровни белка Α^7с-NΤΡ были найдены в С8Е и в моче больных АО (Де Ла Монте и Уандс, Етоп! Вюка 7: 989-96 (2002); Де Ла Монте и Уандс, 1оигпа1 о£ Акйетет'к ИНеаке 3: 345-353 (2001); Мунзар и др., Λ1ζНе^те^'к Веройк 4: 61-65 (2001); Каале и другие, №ито1о§у 54: 1498-1504 (2000); Мунзар и др., Акйетет Веройк 3: 155-159 (2000); Де Ла Монте и другие, Акйетет'к Веройк 2: 327-332 (1999); и Де Ла Монте и др., I. СИп. 1^ек1. 100:3093-3104(1997).

Было также показано, что сверх-экспрессия ΝΤΡ связана с процессом гибели клетки при болезни Альзгеймера (Де Ла Монте и Уандс, 1. №игора1йо1. Ехр. №ито1, 60:195-207 (2001); Де Ла Монте и Уандс, Се11 Мо1 ЬИе 8сЕ, 58: 844-49 (2001). Α^7с-NΤΡ был также идентифицирован в ткани мозга при Синдроме Дауна (Уандс и другие, Международная Патентная Публикация № \¥О 90/06993; Де Ла Монте и другие, I №ито1 8сЕ, 135: 118-25 (1996); Де Ла Монте и др. АН., Вер., 2:327-332 (1999)). Существуют данные, что сверх-экспрессия ΝΤΡ может быть также связана с глаукомой нормального напряжения (ГолубничаяЛабудова и др., Сигг Еуе Век 21:867-76 (2000)).

ΝΤΡ оказался эффективным агентом для уничтожения клеток в культурах клеток глиомы и нейробластомы ш νίΟΌ, в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани, дермисе и различных исходных опухолях человека и животных, включая карциному молочной железы, карциному и папиллому кожи, карциному ободочной кишки, глиому мозга и других, в модельных экспериментах с грызунами. См., заявку на патент США № 10/092,934, под заглавием «Методы лечения опухолей и родственных заболеваний с использованием белков нервных клеток», поданную 8 марта 2002.

Все описанные здесь публично доступные документы, в том числе и все американские патенты, специально полностью включены в виде ссылок в это описание, а также в описание предпосылок данного изобретения. Предшествующее описание данного изобретения ни в коем случае не предназначено для признания того факта, что ни один из описанных там документов, включая данную заявку, не является прототипом данного изобретения.

Однако все еще существует потребность в разработке новых, менее токсичных способов лечения нежелательных клеточных образований. Данное изобретение удовлетворяет эту потребность.

Сущность изобретения

Данное изобретение частично включает открытие, согласно которому содержащиеся в Α^7с-NΤΡ пептидные последовательности, являющиеся по данным авторов данного изобретения эффективными агентами для разрушения или удаления вредных или нежелательных клеток, а также их варианты и гомологи, найдены в других белках в других организмах, включая людей и других млекопитающих. Сразу же после обнаружения пептидных последовательностей специалист может найти эти белки с помощью широко доступных общественных и коммерческих баз данных по протеинам, таких как база данных по протеинам Национального Центра Биотехнологической Информации и с помощью исследовательских программ Β^Λ8Τ® (Вакю Ьоса1 АИдишеп! 8еатсй Що1). См. Альтшуль, Стефен Ф., Томас Л. Мадден, Александро А. Шэфер, Джингуй Дзенг Дзанг, Уебб Миллер и Давид Дж. Липман (1997), «Щелевой БЛАСТ и ПСИ-БЛАСТ, новое поколение базы данных программ исследования белка», №.1с1е1с Ас1бк Век. 25:3389-3402.

Специалист в этой области может осуществить скрининг этих белков, используя описанный здесь метод испытания, чтобы определить их эффективность, как агентов для разрушения или удаления нежелательных или вредных клеток. Найдя один или несколько таких эффективных агентов, он может затем определить, какие части этих агентов содержат последовательности, гомологические или подобные описанной здесь последовательности пептида Λ^7с-NΤΡ. или последовательности, описанной в патентной заявке США № 10/153,334 озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», которая была подана 24 мая 2002. Имея указанные

- 4 006603 части этих синтезируемых агентов и используя методы, известные специалистам, он может испытать синтезируемые агенты на их эффективность в качестве средств для разрушения или удаления нежелательных или вредных клеток. Кроме того, квалифицированный специалист может также использовать аминокислотные последовательности любых таких белков, чтобы определить другие пептидные последовательности, не подобные или гомологичные или подобные последовательностям пептида ΆΌ7ε-ΝΤΡ, описанным здесь и в патентной заявке США № 10/153,334, озаглавленной «Пептиды, эффективные в лечении опухолей и других заболеваний, требующих удаления или разрушения клеток», которая была подана 24 мая 2002. Эти новые синтезируемые последовательности были тогда проверены на их эффективность в качестве агентов для разрушения или удаления нежелательных или вредных клеток.

Данное изобретение касается пептидов, составов и методов лечения нежелательных клеточных пролифераций, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли, железистая гиперплазия (например простата), нежелательная волосистость лица, бородавки и нежелательная жировая ткань. Такой метод включает введение млекопитающему, которому требуется такая терапия, терапевтически эффективного количества Родственного Белка, Родственного Пептида, или Пептида ΝΤΡ, известных в качестве эффективных агентов для уничтожения клеток. Термины «Родственный Белок», «Родственный Пептид» и «Пептид ΝΤΡ» определены ниже.

Пептиды, описанные в данном изобретении, имеют по крайней мере одну аминокислотную последовательность, соответствующую части аминокислотной последовательности разновидности белка нервной нити. Композиции изобретения включают пептиды и фармацевтически приемлемый носитель. Пептиды или белки, описанные в данном изобретении («пептид, убивающий клетку») могут быть введены в организм отдельно или в виде конъюгата с носителем или антителом и могут быть сформулированы в виде композиций. Убивающие клетку пептиды могут быть введены внутримышечно, перорально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацереброваскулярно, внутрь опухоли, через пораженный участок, интрадермально, интратекально, через нос, внутриглазно, внутриартериально, локально, трансдермально, через аэрозоль, вливанием, инъекцией болюса, посредством имплантированного устройства, посредством лекарственной формы с замедленным высвобождением медикамента; упомянутые препараты могут вводиться отдельно или в виде конъюгата с носителем. Альтернативно, экспрессия убивающего клетку пептида возможна ίη νίνο путем управления геном, который обусловливает экспрессию пептида путем введения в организм вакцины, которая индуцирует образование такого пептида или путем введения в организм клеток, бактерий или вирусов, которые обусловливают экспрессию пептида ίη νίνο или путем генетической модификации или как-либо иначе.

Кроме того, убивающий клетку пептид может быть использован совместно с другими методами лечения для лечения доброкачественных и злокачественных опухолей и других видов нежелательного или вредного роста клеток. Предшествующее общее описание и последующее детальное описание являются иллюстативными и разъяснительными и предназначены для обеспечения более детального объяснения данного изобретения. Другие цели, преимущества и новые особенности будут легко доступны специалистам из последующего детального описания этого изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает полную аминокислотную последовательность и последовательность нуклеиновой кислоты гена ΑΌ7ο-ΝΤΡ и белкового продукта ΑΌ7ο-ΝΤΡ этого гена (последовательности 120 и 121, из патентов США №№ 5,830,670, 5,948,634 и 5,948,888; ДеЛа Монте и другие, 1. С1ш. Ιηνοκΐ.. 700:30933104 (1997); №ΒΙ Еп1ге7-Рго1еш Ассезяоп № ААС08737; ΡΙΌ §3002527) [БЕр ΙΌ ΝΟ. 1].

Фиг. 2 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 122 аминокислот (последовательность 40, из патентов США №№ 5,830,670, 5,948,634 и 5,948,888; Νί,’ΒΙ Еп1гех-Рго1е1п Ассеадоп № ААЕ25447 РЮ §10048540) |БЕС ΙΌ ΝΟ. 2] («ΝΤΡ-122»).

Фиг. 3 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 112 аминокислот (Νί,’ΒΙ Еп1гех-Рго1еш Ассекыоп №ХР_032307 РЮ §15928971) |БЕС ΙΌ ΝΟ. 3] («ΝΤΡ112»).

Фиг. 4 показывает полную аминокислотную последовательность белка, аналогичного белку нервной нити и состоящего из 106 аминокислот (Νί,’ΒΙ Еηί^еζ-Ρ^οΐе^η Ассекыоп №ААН14951 РЮ §15928971) [БЕР ΙΌ ΝΟ. 4] («NΤΡ-106Α»).

Фиг. 5 показывает полную аминокислотную последовательность белка, аналогичного белку нервной нити и состоящего из 106 аминокислот (NСΒI Еηί^еζ-Ρ^οΐе^η Ассекыоп №ХР_039102 РЮ §18599339) [БЕР ΙΌ ΝΟ. 5] («ΝΤΡ-106Β»).

Фиг. 6 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 98 аминокислот (последовательность 30, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; NСΒI Епΐ^еζ-Ρ^οΐе^η Ассекщоп № ААЕ25445, РШ §10048538) [БЕр ΙΌ ΝΟ. 6] («ΝΤΡ-98»).

Фиг. 7 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 75 аминокислот (последовательность 48, из патентов США №№ 5830670 5948634 и 5948888; NСΒI Еηί^еζ-Ρ^οΐе^η Ассекыоп № ААЕ25448, РЮ §10048541) [БЕр ΙΌ ΝΟ. 7] («ΝΤΡ -75»).

- 5 006603

Фиг. 8 показывает полную аминокислотную последовательность белка нервной нити, состоящего из 68 аминокислот (последовательность 36, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888; ЫСВ1 Еп1гех-Рго1ет Ассеккюп № ААЕ25446, РГО §10048539) |8ЕО ГО N0. 8] («ΝΤΡ -66»).

Фиг. 9 показывает полную аминокислотную последовательность белка, аналогичного белку нервной нити и состоящего из 61 аминокислот (ΝΟΒΙ Еп1гех-Рго1ет Ассеккюп №ААН02534, РГО §12803421) |8ЕС ГО Ν0.9](«ΝΤΡ-61»).

Детальное описание предпочтительных осуществлений изобретения

Если не указано иначе, то все используемые здесь термины и фразы даны в соответствии со сформулированным ниже определениями.

Выражение «АЭ7с-№ГР» относится к белку ~ 41кД, гену и последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности, описанные в работе Де Ла Монте и других, 1. С1т. 1пуек1., 100:3093-104 (1997), Последовательности 120 и 121, из патентов США №№ 5948634, 5948888 и 5830670, и нуклеиновую кислоту и аминокислотную последовательность из СепВапк* АЕ010144, которые изображены на фиг. 1. Термин «АП7С-№ГР» включает также биологически активные фрагменты, варианты, производные, гомологи и имитаторы ΛΌ7^ΝΤΡ.

Термин «ΝΤΡ» или «белок нервной нити» относится к белкам нервной нити и родственным молекулам (включая панкреатический белок нити) и к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности этих белков, включая (без ограничения) следующие белки и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности следующих белков:

(a) АП7с-КГР;

(b) ~42, ~26, ~21, ~17, ~14, и ~8 кД разновидности белка нервной нити, как описано в патентах США №№ 5948634, 5948888, 5830670 и 6071705, и в работах: Де Ла Монте и др., 1. №игора1йо1. Ехр. №иго1, 55(10): 1038-50 (1996), Де Ла Монте и др., 1. №иго1. 8ск, 138(1-2):26-35 (1996); Де Ла Монте и др., 1. №иго1 8сц 135(2): 118-25 (1996), Де Ла Монте и др., 1. С1т. 1пуек1., 100:3093-3104 (1997) и Де Ла Монте и др., АП. Вер., 2:327-332 (1999);

(c) белки, определенно узнаваемые моноклональным антителом № 2, на депозите Американской Коллекции Типов Культур, Мапаккак, Уа., под номером доступа НВ-12546 или моноклональным антителом № 5 на депозите Американской Коллекции Типов Культур, Мапаккак, Уа., под номером доступа НВ12545;

(б) белки, кодированные геном АП7с-№ГР;

(е) белок нервной нити, состоящий из 122 аминокислот, и описанный последовательностью 40, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888, каталогизированный в NСВI Еп1гех-Рго1ет Ассеккюп №ААЕ25447, РГО §10048540, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 2 («ΝΤΡ122»);

(ί) белок нервной нити, состоящий из 112 аминокислот, каталогизированный в ΝΟΒΙ Еп1гех-Рго1ет Доступ №ХР_032307, РГО §14725132, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 3 («ΝΤΡ-112»);

(§) белок, аналогичный белку нервной нити, состоящий из 106 аминокислот, каталогизированный в ΝΟΒΙ Еп1гех-Рго1ет Доступ №ААН14951 РГО §15928971, аминокислотная последовательность которого показана на Фиг. 4 («№ГР-106А»);

(11) белок, аналогичный белку нервной нити, состоящий из 106 аминокислот, каталогизированный в ΝΠΒΙ Еп1гех-Рго1ет Доступ №ХР_039102, РГО §18599339, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 5 («№ГР-106В»);

(ί) белок нервной нити, состоящий из 98 аминокислот, описанный последовательностью 20, из патентов США №№ 5830670, 5948634 и 5948888 и каталогизированный в NСΒI Еп1гех-Рго1ет Доступ №ААЕ25445, РГО §10048538, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 6 («ΝΊΓ98»);

(ί) белок нервной нити, состоящий из 75 аминокислот и описанный последовательностью 48 из патентов США №№. 5,830,670, 5,948,634 и 5,948,888 и каталогизированный в ΝΠΒΙ Еп1гех-Рго1ет Доступ №ААЕ25448, РГО §10048541, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 7 («ΝΊΓ75»);

(k) белок нервной нити, состоящий из 68 аминокислот и описанный последовательностью 36 из патентов США №№. 5,830,670, 5,948,634, и 5,948,888, и каталогизированный в NСΒI Еп1гех-Рго1ет Доступ №ААЕ25446, РГО §10048539, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 8 («ΝΊΓ68»);

(l) белок, аналогичный белку нервной нити, состоящий из 61 аминокислоты, каталогизированный в NСΒI Еп1гех-Рго1ет Доступ №ААН02534, РГО §12803421, аминокислотная последовательность которого показана на фиг. 9 («№ГР-61»);

(т) панкреатический белок нити;

(п) белок нервной нити (пРТР), описанный в патенте США № 6,071,705; и (о) белки, определенно узнаваемые антителами, образуемыми гибридомой из группы, состоящей из НВ 9934, НВ 9935, и НВ 9936, которые депонированы Американской Коллекцией Типов Культур. Если в

- 6 006603 контексте не указано иначе, то выражение «пептид ΝΤΡ» относится к пептидам, включающим аминокислотные последовательности, соответствующие по крайней мере части аминокислотной последовательности ΝΤΡ или к фрагментам ΝΤΡ и включает гомологи, производные, варианты, конъюгированные белки и пептидные имитаторы таких пептидов. Выражение «пептид ΝΤΡ» включает также (без ограничения) пептиды, определенно внесенные в список патентной заявки США №№ 10/092,934 и 10/153334. Выражение «пептид ΝΤΡ» также предпочтительно включает (без ограничения) следующие аминокислотные последовательности ΝΤΡ:

(a) ΝΤΡ пептид №1: [8Ер ГО ΝΟ 10] АО7с-КГР, стр. 239-243

883ΥΟΥ

8ег-8ег-Тгр-Авр-Тут (b) ΝΤΡ пептид №2 [8Е<2 ГО ΝΟ. 11], ΑΟ70-ΝΤΡ, стр. 31-39

РА8А8РУАО

Рго-А1а-8 ег-А1а-8 ет-Рто-V а1-А1а-О1у (c) ΝΤΡ пептид №3 [8ЕО ГО ΝΟ. 12], ΑΕ)7ο-ΝΤΡ, стр. 14-24

СгА18АНК5ШКЕ <31у-А1а-Пе-5ег-А1а-Н18-Агд-Авп-ТсиАтд-Ьеи (ά) ΝΤΡ пептид №4 [8ЕО ГО ΝΟ. 131. ΑΕ>7ο-ΝΤΡ, стр. 53-58

ГГЪУЕМ РЪе-РИе-Теи-Уа1О1и-Ме1 (е) ΝΤΡ пептид №5 [ЗЕр ГО ΝΟ. 14], ΑΟ70-ΝΤΡ, стр. 208 -216

ЗУТрАСУрЗУ

8ег-Уа1-ТЬг-О1п-А1а-Сг1у-Уа1-Сг1п-Тгр (ί) ΝΤΡ пептид №6 [ЗЕр ГО ΝΟ. 15], ΝΤΡ-122, стр. 106-122

ГОРРУТЗКПСЬЕПЖСЬ

Пе-А8р-С1п-С1п-Уа1-Ьеи-8ег-Аг§-Пе-Ту5-Теи-С1и-11е- Ьуз-АгдСув-Ьеи (§) ΝΤΡ пептид №7 [8ЕО ГО N0.16], ΝΤΡ-122, стр. 111-119

ЬЗШКЬЕК

Теи-Зег-Агд-Пе-Ьуз-Теи-СЬ-Пе-Ьув а также включает гомологи, производные, варианты, фрагменты, конъюгированные белки и пептидные имитаторы таких специально каталогизированных пептидов ΝΤΚ.

Термин «Родственный Белок» относится к белкам, содержащим один или более аминокислотных последовательностей, идентичных, подобных или гомологичных одному или большему количеству пептидов ΝΤΡ.

Выражение «Родственный Пептид» относится к пептидам, состоящим из аминокислотных последовательностей, соответствующих по крайней мере части аминокислотной последовательности Родственного Белка и включает гомологи, варианты, конъюгированные белки, реверсные-Ό пептиды и пептидные имитаторы таких пептидов. Выражение «Родственный Пептид» также предпочтительно включает (без ограничения) следующие аминокислотные последовательности Родственных Белков:

- 7 006603 (а) Родственный пептид №1 [8Е() ГО N0. 17] переходный канал потенциала рецептора 6, вариант дельта (ΝΓΒΙ Доступ САОО 1686, РЮ §9716913), стр. 356-377

ΟϋΗΟΚΡΝΙΉΚΙΧΙΑΙΚΥΕνΚΚΜ

С1у-А5р-Н15-С1у-Аг§-Рго-А5п-Ееи-8ег-Аг§-Ееи-Ьу5-Ьеи-А1а-ПеЬуБ-Туг-С1и-У а1-Ьу8-Ьуз-Ме!

(b) Родственный Пептид №2 [8Е(^ ГО N0.18] мнимый емкостный канал кальция (МСВ1 Доступ ΝΡ_065122, РГО §9966865), стр. 345-360 (да1АУКРЬАУР6У81

О1п-С1п-8ег-11е-А1а-Уа1-Ьу5-Р11е-Ьеи-А1а-Уа1-РЬе-О1у-Уа1-8егНе (c) Родственный Пептид №3 [8Еф ГО N0. 19] йр-родственный белок 4 усеченный вариант гамма, (Ν0ΒΙ Доступ АР063825_1, РГО §6665596), стр. 337-357

СЬЕРРУРЗУСУЫАРКБРЬСЬ

Сг1у-Ьеи-Ьеи-Р11е-Рго-Уа1-РЬе-8ег-Уа1-Су8-Туг-Ьеи-11е-А1а-Рго-Ьу8-8егРго-Ьеи-Сг1у-Ьеи и включает гомологи, производные, варианты, конъюгированные белки и пептидные имитаторы этих специально каталогизированных пептидов.

Термин «пептид смерти клетки» относится к Родственному Белку или Родственному Пептиду, который оказался эффективным агентом, вызывающим смерть клетки.

Термин «фрагмент» относится к белку или полипептиду, который состоит из непрерывной подпоследовательности аминокислотной последовательности ΝΤΡ белка, ΝΤΡ пептида, Родственного Белка или Родственного Пептида и включает распространенные в природе фрагменты, такие как сплетенные варианты и фрагменты, образовавшиеся в результате деятельности встречающейся в природе ίη νίνο протеазы. Такой фрагмент может быть отрезан с аминного конца, с карбоксильного конца и/или от средней части (как например, при природном сращивании). Такие фрагменты можно получить из метионина в качестве терминальной аминогруппы, или же без него. Термин «фрагмент» включает фрагменты, которые идентичны или различаются от того же самого белка ΝΤΡ, или пептида ΝΤΡ, или Родственного Белка или Родственного Пептида, с обычной или необычной соприкасающейся аминокислотной последовательностью, которые соединены друг с другом непосредственно или через линкер.

Термин «вариант» относится к белку или полипептиду, который, в отличие от аминокислотной последовательности белка ΝΤΡ, пептида ΝΤΡ, Родственного Белка, или Родственного Пептида, содержит одну или более аминокислотных заместителей, делеций и/или инсерций и включает встречающиеся в природе аллельные варианты или альтернативные сплетенные варианты белка ΝΤΡ, пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида.

Термин «вариант» включает замещение одной или более аминокислот в последовательности пептида подобной или гомологичной аминокислотой (аминокислотами) или неподобной аминокислотой (аминокислотами). Существуют много параметров, по которым аминокислоты могут оцениваться как подобные или гомологичные. (Гуннар фон Хейджен, Анализ Последовательности в Молекулярной Биологии, стр. 123-39 (Аеабет1е Ргезз, Нью-Йорк, ΝΥ 1987.) Предпочтительные варианты включают аланиновые замещения в одной или более аминокислотных позиций. Другие предпочтительные замены включают консервативные замещения, в результате которых незначительно меняется или не меняется общий результирующий заряд, полярность или гидрофобность белка. Консервативные замещения приведены ниже в табл. 2.

- 8 006603

Таблица 2

Консервативные Аминокислотные Замещения

Основные:	аргинин
Кислотные:	лизин гистидин глутаминовая кислота
Незаряженные полярные:	аспарагиновая кислота глутамин
Неполярные:	аспарагин серин треонин тирозин фенилаланин
	триптофан цистеин глицин аланин валин пролин метионин лейцин изолейцин

В табл. 3 представлена другая схема аминокислотного замещения: Таблица 3

Исходный

Остаток Замещения

А1а

Агд

Азп

Азр

Суз

О1п

О1и

С1у

Н18

Пе; 1еи; \'а1

Ьеи

Ьуз

Ме!

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

Туг

Уа1 §1у; зег

1уз д1п; Ыз д!и зег азп азр а1а; рго азп; д1п

Пе; уа1 агд; д1п; д1и 1еи; !уг; Не те!; 1еи; !уг !Ьг зег !уг ΐτρ; рЬе

Пе; 1еи

Другие варианты могут состоять из менее консервативных аминокислотных замещений типа селекции остатков, которые существенно отличаются по их эффекту сохранять: (а) структуру основной цепи полипептида в области замещения, например, в виде плоской или спиральной конформации, (Ь) заряд или гидрофобность молекулы на целевом участке или (с) большую часть боковой цепи. Предполагают, что замены, в основном оказывающие наиболее существенное влияние на функцию - это такие замещения, в которых: (а) глицин и/или пролин замещается другой аминокислотой, или удаляется, или включается; (Ь) гидрофильньный остаток, например, серил или треонил, заменяется (или замещается) гидрофобным остатком, например, лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (с) остаток цистеина заменяется (или замещается) любым другим остатком; (с,1) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил заменяется (или замещается) остатком, имеющим электроотрицательный заряд, например, глутамилом или аспартилом; или (е) остаток, имеющий большую боковую цепь, например, фенилаланин, заменяется (или замещается) не обладающим такой боковой цепью остатком, например, глицином. Другие варианты включают те, которые разработаны для образования нового участка (новых участков), или те гликозилирования и/или фосфорилирования, которые разработаны для удаления существующего участка (существующих участков) гликозили

- 9 006603 рования и/или фосфорилирования. Варианты включают по крайней мере одно аминокислотное замещение на участке гликозилирования, на участке протеолитического расщепления и/или в остатке цистеина. Варианты также включают белки ΝΤΡ, пептиды ΝΤΡ, Родственные Белки и Родственные Пептиды, которые имеют дополнительные аминокислотные остатки в начале или в конце белка ΝΤΡ, пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или аминокислотных последовательностей Родственных Пептидов линкера. Например, остаток цистеина можно добавить как к аминному концу, так и к карбоксильному концу Родственного пептида, чтобы осуществить циклизацию этого пептида путем образования дисульфидной связи. Термин «вариант» также охватывает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность Родственного Белка или Родственного Пептида по крайней мере с 1-25 или более дополнительными аминокислотами, фланкирующими или связанными с 3' или 5' концами Родственного Белка или Родственного Пептида.

Термин «производная» относится к химически модифицированному белку или полипептиду, который был модифицирован химически или в результате естественных процессов, таких как процессинг и другие пост-трансляционные модификации, а также и химическими методами модификации, как например, присоединением одной или более молекул полиэтиленгликоля, сахаров, фосфатов, и/или других таких молекул, где молекула или молекулы присоединены к Родственным Белкам или Родственным пептидам не естественным образом. Производные включают соли. Такие химические модификации хорошо известны специалистам и описаны в традиционной литературе, в более детальных монографиях, а также в обширной исследовательской литературе. Следует учитывать, что тот же самый тип модификации в той или иной степени может присутствовать на нескольких участках данного белка или полипептида. Данный белок или полипептид может также содержать много типов модификаций. В белке или полипептиде модификации могут произойти везде, включая основную цепь пептида, боковые аминокислотные цепи, а также аминные и карбоксильные концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, ΑΌΡ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, форматирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ анкера, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристилирование, окисление, протеолитическое превращение, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гаммакарбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ΆΌΡ-рибозилирование, селенирование, сульфирование, катализируемое транспортной РНК присоединение аминокислот к белкам, например аргинилирование и непредсказуемое присоединение аминокислот. См., например, БелкиСтруктура и Молекулярные Свойства, 2-ое изд., ред. Т.Е. Крейтон, В.Г. Фримэн и Компания, Нью-Йорк (1993), и Уолд, Ф., «Модификации пост-трансплантационных Белков: Достижения и Перспективы», стр. 1-12 в сб. «Посттрансплантационные Ковалентные Модификации Белков» ред. Б.К. Джонсон, Асабетю ΡΐΌ55. Нью-Йорк (1983); Сейфтер и другие., Ме111. Επζνιηοΐ. 182:626-646 (1990), и Раттан и другие, «Синтез Белка: Пост-трансплантационные модификации и Старение», Αηη. Ν.Υ. Асаб. 8сь 663: 48-62 (1992). Термин «производные» включает химические модификации, в результате которых образуется разветвленный или неразветвленный циклический белок или полипептид. Циклические, разветвленные или разветвленно-циклические белки или полипептиды могут образоваться в результате естественных посттрансляционных процессов и могут быть получены также исключительно синтетическими методами.

Термин «гомолог» относится к белку, который является по крайней мере на 60 процентов идентичным по его аминокислотной последовательности белку ΝΤΡ, пептиду ΝΤΡ, Родственному Белку или Родственному Пептиду в зависимости от обстоятельств, обусловленных стандартными методами, которые обычно используются для установления идентичности расположения аминокислот в двух полипептидах. Степень подобия или идентичности между двумя белками может быть легко рассчитана известными методами, включая, без ограничения, описанные в следующих трудах: Вычислительная Молекулярная Биология, Леска А.М., изд., ОхГогб Ишуегайу ΡϊΌδδ, Нью-Йорк, 1988; Биовычисление: Информатика и Проекты Генома, ред. Смит Д.У., Асабетю ΡϊΌδδ, Нью-Йорк, 1993; Компьютерный Анализ Данных Последовательности, Часть I, Ред. Гриффин, А.М., и Гриффин, Г.Дж. Нитапа ΡϊΌδδ, Нью-Джерси, 1994; Анализ Последовательности в Молекулярной Биологии, Фон Гейндж, Г., Асабетю ΡϊΌδδ, 1987; Анализ Последовательности Праймера, ред. Грибсков, М. и Деверо, Дж., М. 81оск1оп ΡϊΌδδ, Нью-Йорк, 1991; и Карилло Г. и Липман, Д., 8ΙΑΜ, 1. АррИеб Ма1й., 48:1073 (1988). Разработаны предпочтительные методы для определения идентичности, с целью выявления максимального сходства между исследуемыми последовательностями. Эти методы определения идентичности и подобия запрограммированы, а соответствующие компьютерные программы публично доступны.

Предпочтительные компьютерные программные методы, пригодные для определения идентичности и подобия между двумя последовательностями включают, без ограничения, пакет программы ССС (Деверо, Дж. и другие, №.1с1еш Ас1б§ Кекеатсй, 12 (1): 387 (1984)), ΒΕΑ8ΤΡ, ΒΕΑ8ΤΝ, и ΕΑ8ΤΑ, Алтшуль, С.Ф. и другие, 1. Мо1ес. ΒίοΙ, 215: 403-410 (1990). Программа ΒΕΑ8Τ X публично доступна из NСΒI и

- 10 006603 других источников (Руководство по ВЬА8Т, Алтшуль, С. и другие, ΝΟΒΙ ЫЬМ ΝΙΗ ВеШекйа, Мй. 20894; Алтшуль, С. и другие, ΐ. Мо1. ΒίοΙ., 215: 403-410 (1990). Посредством примера, используя компьютерный алгоритм типа САР (Компьютерная Группа по Генетике, Висконсинский Университет, Мэдисон, Висконсин), два белка или полипептида, для которых должна быть определена процент идентичности последовательности, были выровнены для оптимального соответствия их соответствующих аминокислот (для выявления «согласованного промежутка», как это определяется алгоритмом).

Пенальти промежутка интервала (который рассчитывают как 3 умноженное на среднюю диагональ; «средняя диагональ» является средним значением диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» - это показатель или число, заданное для каждой истинной аминокислоты специфической матрицей сравнения) и пенальти расширения промежутка (который обычно является 1/10 частью пенальти промежутка интервала), так же, как и матрица сравнения типа РАМ 250 или ВЬО§иМ 62, используются вместе с алгоритмом. С алгоритмом может использоваться также и стандартная матрица сравнения (для матрицы сравнения РАМ250 смотрите Дейхоф и другие, в сб.: Атлас Последовательности и Структуры Белка, т. 5, кирр.3 [1978]; для матрицы сравнения ВЬО8иМ 62 см. Хеникофф и др., Ргос. №И. Асай. 8сГ И8А, 89:10915-10919 [1992] ). В этом случае процент идентичности рассчитывают по алгоритмому. По сравнению с белком ΝΤΡ, пептидом ΝΤΡ, Родственным Белком или Родственным Пептидом, гомологи обычно будут иметь одно или более аминокислотных замещений, удалений и/или включений.

Термин «имитатор пептида» или «миметик» относится к биологически активным соединениям, которые подражают биологической деятельности пептида или белка, но по химический природе они больше не являются пептидами, то есть они больше не содержат никакие пептидные связи (т. е., амидные связи между аминокислотами). Здесь термин «имитатор пептида» используется в более широком смысле и включает молекулы, которые по своей химической природе больше не являются типичными пептидами, такие как псевдопептиды, полупептиды и пептоиды. Примеры имитаторов пептидов, в таком более широком смысле (где часть пептида замещена структурой, не содержащей пептидние связи), описаны ниже. Молекулы, полностью или частично лишенные химической природы пептида, имитаторы пептида, согласно этому изобретению, обеспечивают пространственную расстановку реагирующих химических компонентов, которая очень походит на пространственную расстановку активных групп в пептиде ΝΤΡ, Родственном Белке или Родственном Пептиде, которые являются основой для имитатора пептида. В результате этой геометрии с подобным активным участком, имитатор пептида проявляет относительно биологических систем такие эффекты, которые являются подобными биологической деятельности пептида ΝΤΡ, Родственного Белка, или Родственного Пептида.

Имитаторы пептида, описанные в данном изобретении, существенно подобны как по своей пространственной форме, так и по биологической активности описанным здесь пептидам ΝΤΡ, Родственным Белкам, или Родственным Пептидам. Примеры методов структурной модификации известного в науке пептида, с целью создания имитатора пептида, включают инверсию хиральных центров основной цепи, ведущих к структурам Ό-аминокислотных остатков, которые могут, в особенности на Ν-конце, привести к увеличению стабильности относительно протеолитической деградации, не оказывая при этом отрицательного влияния на активность. Пример этого дается в статье «Т-связывание тритилированного Ό-ала¹ пептида», Смита К. С., и других., Лгид Эсус1ортсп1 Век., 15, стр. 371-379 (1988). Вторым методом является изменение циклической структуры для увеличения стабильности, например, образование межмолекулярной Ν - С связи в имидах и лактамах (Эде и другие в сб. «Пептиды: Химия и Биология», ред. Смит и Ривиер. Ексот, Лейден (1991), стр. 268-270). Пример этого дается в конформационно-ограниченных соединениях, подобных тимопентину, таких, которые описаны в патенте США № 4 457 489 (1985), Гольдшейна, Дж. и других, сущность которого включена здесь в виде ссылки. Третий метод заключается в замещении пептидных связей псевдопептидными связями в Родственном Белке или Родственном Пептиде, что ведет к повышению протеолитической стабильности.

Было описано множество псевдопептидных связей, которые вообще не влияют на структуру пептида и его биологическую активность. Одним из таких примеров является замещение ретро-инверсопсевдопептидных связей («Биологически активные ретроинверсо-аналоги тимопентина», Систо А. и другие, в сб. «Пептиды: Химия и Биология», ред. Смит и Ривиер. Ексот, Лейден (1991), стр. 722-773), и Дальпоззо и другие, (1993), Ιηΐ. ΐ. Рерййе Рго1ет Век.; 41:561-566, которые включены здесь в виде ссылок). Согласно этой модификации, аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида ΝΤΡ, Родственного Белка, или Родственного Пептида, описанных выше, за исключением того, что один или более пептидных связей замещены ретро-инверсопсевдопептидной связью. Предпочтительно, большинство Ν-терминальных пептидных связей замещены, так как в результате такого замещения увеличивается устойчивость к протеолизу, который катализируется экзопептидазами, влияющими на Ν-терминал. Дальнейшие модификации также могут быть получены путем замещения химических групп аминокислот другими химическими группами аналогичной структуры. Другая подходящая псевдопептидная связь, которая увеличивает стабильность к ферментному расщеплению, не влияя на биологическую активность или незначительно уменьшая ее, это - восстановленная изостерическая псевдопептидная связь (Коудер и другие. (1993), Ιηΐ. ΐ. Рер11йе Рго1ет Век., 41:181184, полностью включенный здесь в виде ссылки).

- 11 006603

Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида ΝΤΡ, Родственного Белка, или Родственного Пептида, за исключением того, что один или более пептидных связей замещены изостерической псевдопептидной связью. Выражение «аминокислотная последовательность (аминокислотные последовательности)» используется здесь, чтобы обозначить последовательность по крайней мере двух аминокислот, предпочтительно, по крайней мере четырех, и более предпочтительно, по крайней мере - пяти. Предпочтительно, большинство Ν-концевых пептидных связей замещено, так как в результате такого замещения увеличивается устойчивость к протеолизу, который катализируется экзопептидазами, влияющими на Ν-терминал. Синтез пептидов с одной или более восстановленной изостерической псевдопептидной связью известен в науке (Коудер и другие. (1993), процитированный выше). Другие примеры включают использование кетометиленовой или метилсульфидной связей для замещения пептидных связей.

Пептоидные производные пептидов ΝΤΡ, Родственных Белков и Родственных Пептидов представляют другой класс имитаторов пептидов, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической активности, хотя и не содержат пептидных связей, что придает им устойчивость к протеолизу (Саймон, и другие, 1992, Ргос. №И. Лсаб. 8сь υδΑ, 89:9367-9371, полностью включенный здесь в виде ссылки). Пептоиды - это олигомеры Ν-замещенных глицинов. Описано множество Ν-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Саймон и другие. (1992), процитировано выше). Некоторые или все аминокислоты пептидов ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида могут быть замещены Ν-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.

Термин «имитатор пептида» или «имитатор» включает также реверсные-Ό пептиды и энантиомеры, как это определено ниже.

Термин «реверсный-Ό пептид» относится к биологически активному белку или пептиду, состоящему из Ό-аминокислот, расположенных в обратном порядке по сравнению с последовательностью Ьаминокислотного пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида. Таким образом, карбокси-терминальный остаток Ь-аминокислоты пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида, для Ό-аминокислотного пептида становится амино-терминалом, и т.д. Например, пептид ΝΤΡ, 88\УЭУ. становится Υ,ιΌΑΥ-ιδ,ιδ,ι· где Ό* 8* \¥,| и У_а являются Ό-аминокислотами, соответствующими Ьаминокислотам, Ό, δ, ^, и У, соответственно.

Термин «энантиомер» относится к биологически активному белку или пептиду, в котором один или больше Ь-аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида заменены соответствующим(и) О-аминокислотным(и) остатком (остатками).

Аминокислоты и аминокислотные остатки, описанные здесь, могут быть перечислены согласно принятому коду одной или тремя буквами, приведенными в таблице ниже.

Таблица 1

Аминокислота	Код с одной буквой	Код с тремя буквами
Аланин	А	А1а
Аргинин	К	Аг§
Аспарагин	N	Азп
Аспарагиновая кислота	ϋ	Азр
Цистеин	С	Суз
Глутамин	0	С1п

Глутаминовая кислота	Е	С1и
Глицин	С	С1у
Г истидин	Н	ΗΪ3
Изолейцин	I	Не
Лейцин	ь	Ьеи
Лизин	к	Ьуз
Метионин	м	Ме!
Фенилаланин	Р	РЬе
Пролин	Р	Рго
Серин	8	8ег
Треонин	т	ТЬг
Триптофан	те	Тгр
Тирозин	Υ	Туг
Валин	V	Уа!

- 12 006603

Данное изобретение описывает композицию, включающую пептиды смерти клеток, как это определено выше. Предпочтительный пептид смерти клетки подобен или гомологичен пептиду ΝΤΡ. Однако использование других пептидов смерти клетки, основанных на частях или фрагментах Родственных Белков, также затронуто в данном изобретении. Например, в широком разнообразии человеческих и нечеловеческих белков («Родственные Белки») тоже найдены последовательности пептида ΑΌ7ε-ΝΤΡ и подобные варианты и гомологи. В частности, ген ΑΌ7ε-ΝΤΡ содержит последовательности А1и-типа, которые являются весьма подобными последовательностям, найденным в других генах человека и других геномах приматов.

Поэтому разумно ожидать, что некоторые, если не все, из Родственных Белков, также окажутся эффективными агентами для уничтожения клеток, так как они содержат последовательности пептида, которые являются гомологами или подобными пептидам ΑΌ7ε-ΝΤΡ («Родственные Пептиды»). Следовательно, квалифицированный специалист может синтезировать определенные Родственные Пептиды, основываясь на аминокислотной последовательности для любого Родственного Белка, способного быть эффективным агентом для уничтожения клеток и соответствующим образом проверить их эффективность.

Из Родственного Белка, являющегося эффективным агентом для уничтожения клеток, можно получить другие пептидные последовательности, обладающие аналогичной физиологической активностью. Специалист в данной области без излишнего экспериментирования сможет синтезировать фрагменты эффективного Родственного Белка, охватывающие полную аминокислотную последовательность этого белка, для идентификации других эффективных пептидных последовательностей.

Некоторые Родственные Белки включают белки, содержащие аминокислоты, идентичные, близко подобные или аналогичные последовательностям пептида ΝΤΡ:

Белок 8Е(?. Аминокислотная последовательность белка

Идентификационный номер ГО ΝΟ.

(РЮ) §10121865 20 МЕУЗРБРРУЯ ΕΝΜφνΝΚΙΚΚΝΕϋΑΚΚΚΕδΥ'

ЕК1У()ККТ(2Ь ΕΗΙΕΕΚΡϋΤΥ ΙΟδνΕΙΎΤί^ ΜλννΥΟΕϋνΟΙ ΝΥΡΕνΤΡνΡΟ БУК1РОЕ1БУ ΝΑΑϋΝΚζ)ΚΙ)Ρ КМ8С1К.УТГО ΡΕΝΝΕΙδΙΧΥΝ ' ΝΟΚΟΙΡννΕΗ КУЕКМУУРАБ ΙΓΟζ)ΕΕΤδδΝ

ΥΏϋϋΕΚΚνΤΟ ΟΚΝΟΥΟΑΚΧΟ ΝΙΡδΤΚΓΤνΕ ΤΑ8ΚΕΥΚΚΜΡ К^ВУМОНМСК. ΑΟΕΜΕΕΚΡΓΝ 6ΕϋΥΤ(2ΙΤΓ(2 ΡΟΕδΚΓΚΜΟδ БОКО1УАБМУ ΚΚΑΥΏΙΑΟ8Τ ΚΌνΚνΡΕΝΟΝ ΚΕΡνΚΟΓΚδΥ УОМУЪКЕЖБО ΕΤΟΝ8ΕΚνΐΗ Εί^νΝΗΚΨΕνΟ БТМ8ЕКОРС)(2 ΙδΡνΝδΙΑΤδ К60КНУ0УУА Ώί^ΐνΤΚΕνον νΚΚΚΝΚΟΟνΑ νΚΑΗζ)ΚΈΕΟΝ ΟΑΙΕΑΗΟΝΕΚ ΕΜΟδδϋδΡΑδ ΑδΚνΑΟΐΑΟΟ СННТ<ЗЕ1ГУГ БУЕТОРННУО ρΑΟΕΕΚΕΤδΟ ϋΡΡΑδΑδρδδ σίΤϋνΚΥΚΝΗ μψιγυναειε ΝΡΤΕϋδΟΤΚΕ ΝΜΤΕςΡΚδΡΟ δΤΟρΕδΕΚΡΙ КАА1ОСО1УЕ δΙΕΝΥ/νΚΕΚΑ (^ΕΝΚΚΟδΑ νΚΗΝΚΙΚΟΙΡ ΚΕϋΟΑΝΌΑΟΟ ΚΝδΊΈΟΤΕΙΕ ΤΕΟϋδΑΚΤΕΑ νδΟΕΟνΥΟΚΟ КУСУГРБНСК ΙΕΝΥΚΕΑδΗΚ (}

- 13 006603 §10257409

ΜΤΟΟΚΟΡςΚί 8Ο88ΥΟ8Ι88 РТ8РТ8РСРО

ОАРРКЕТУЪЗ ΕΚΙΡΙΡϋΤΚΡ бТРЗЬНКХУ/А

ΡΤΟΡΟΡΕΜ8Ι ΑΓ1Χ)ΡΟΝΙΕ8 ОЬОАСАУАОР

К1ХУЛХ1АУАТ УЬОЬЬСрКЬА АКЬСУУТОКО

ЕОЕУСНЬУУР К.8Е8К8УАО8 СУОУХОУЗЗЬ рРЬРРКСРАР 880 £10433567

ММЬЗУОЕРГУН КС1СКНУАРР ТАРНЬРРЕТЕ ЗНЗУТОАСУО ХУСОЬСЗЬОРЗ РРСРКОР8СХ 8Ь8Я8У/ОУНР νΡΕΟΕΑΝΡΐν ГЬУЕТСРСРУ ООАОЬК1ХТ8 8ОЬРА8АС08 АСОУКНЕРЬК. ЬАЬТЕСНПЗ КТСТЗУОРУ! ΟΚΕΧΕΚΙΡΗΟ н £10434441

ЕЦЗАНКХХНЬ ΡΟ88Ν8ΡΑ8Α РЬ88ХУОУКНУ РРСРАИУУРЬ УЕМОРЬНУОО АОЬЕЬРТЗОО ΡΡΊΧΑ808Α61ТОУ8НБ.ТУ/0 ЕРА8ЬТУ8ОА УЕКМЬУХУОРО ΡΕΝΗ08ΚΙΧΜ ΑδΕΟϋδδΕνΡ ΡΕΥΡΙΧΝΕΝ §10436387

М0О8Н8АУ0А СУУЛУСННОЗЬ 0ΡΨΡΡΟΕΕΕ8 ЗСХЗЬОЗЬУ/О УКЗЬАЕЗЬБХ АСЕЮТТЗАНС 01X1X88808 ΡΑδΑδςνΑΟΙ ТОЕКТАЕРНК АНААООЕКНЬ 88ΗΜ8ΡΟΕΝΜ ТЕКГСРОРКА 8РНЬК1ЬАА8 ΚΗΟΥΚΚΙΧΝΈ УТУТХХКОКЗ ΥΕΚΝΝ :10437485

ΜΚΝΥΥΥΗΧΟ ОЪТЬЗРКЬЕС 88Т18АНСМЪ ΗΕίΟ88Ν8Ρν АА8РУАСТТС ТСННОХУЫРУ РЬУЕТСРНН1 СКЭТСХЕРЬТЗ ООРРТЬАЗКЗ АО1ТОУ8НСА ХУРТРШУОМК НЗГЫКРХУП ΕΥνΡΑΐδ £10441986

ΜΚΚΕΙΧΑΟΧ ΕΚΊΤΕΝΡΡΕΡ РГЬРРРЕУУР ΡΙΥΡΥΡΥΡΡΕ, ЕМЕ8НУУА0А 6ΕΕΕΕΟ88ΝΡ РА8А8ЬУАОТ ЬЗУННСАСРЕ 8РТКККККЕК ΚΑΓΚΕίςΟΕΙ, ЬСЕЬКУКРЕО ΗΟΟνΝδΟΏΟΕ ΚΟΥΡΟΟΙΡΜΟ ААРХУЕОТ §10945428

Μ8Κ.ΊΧΚΚΚΚΗ УХЗКУОЕСАУ 8ХУА0РРС0Р0 ΑΕΙΚΟΟΑΕΚΟ ЕРРУЬОКЬКЕ ЕРОССТСС1У δΟΚΑΡΝΡδΟν ΕΕΕνΝΟΤΡνδ ОЕТЫКОТЕАУ ΙΗΗΡΡ-ΕΡΙΚΕ ΚΤνΚΡΟΚνίΝ КВЬКНУЪЗЬр РОКОЗЮНЬХ ΟΟνίΡΒΝΕΥΕ КТ1РСГГКАР ΚΟΟΕΥΡΟΥϋΥ ΝΡΙδνΕΟΡΚΑ ЬЕЕЗОАЕЬЕЗ ΟΤΥΟΟΝΡΥΟΤ ΡΚΡΡΑΕΡ8ΡΡ ОРОРУООУЬР ΟΝΕΓΟΑΕ8ζ)Κ. ККТТ8У8КМЕ ΚΜΟ88ΕΡΕΕΕ ΕΟΕϋΚΟΑΙΝΟ 80ΝΑΕΝΚΕΚΗ 8Е88ОУ/МКТУ

Ρ8ΥΝςΤΝ88Μ ϋΡΚΝΥΜΜΚΟΕ ТЬЕРЕРКХУХ ΜΑΥΤϋΤΟΜΙΥ ΡΙΟΗΝΤΚΤΤΤ УХОРКХСККА ΚΑΡΕΏΟΕΟΟΕ ΉΡΥΟν/ΕΚΙΕΟ ΡΟΥΟΤΥΥΎϋΡ ТЬУА(2АОУ(АУ НОЕСЗЬС^РРР ΡΟΡΝΗΣΝΟΚΤ ΡΕΕΝΡνΕΕΑΚ ΕΚΚί^ΟρνΕΙ ΟδδΚΡϋΜΕΚδ ΗΕΤΚΟΡδζίΕΚ ОУЬУКАЗЕКК 8ТМОРСЕТП СООКРОЕРЬО νΚΝνΕΚΟΟΡΑ ΑΟΟΟΚΙΑΡΟϋ νΐνΩΙΝΟΝΟν ΡΟΗΤΗΑΕ>ννς) ΜΡςχνρνΝΟΥ УРХТЕСКХУР ЬРОЭЗЕОРУУ О1УААТРУ1М 605ЕТКОЕТС ΜΝΡ0ΟΡΚΡΟΑ ΜνΕΕΟΝΟΚδΟ ΗΤδΤΟΟΟΣΝΟ ΡδϋΑδΕΟΚνδ ΜΑδδΟδδςΡΕ ЬУТ1РИКОР ΚΟΡΟΡΑ1ΑΒ8 ΡΤΟςΚΥΚΜΙΕ ΟδςνΧΟΟΙ^Κ ΕΟΙΙΚΕΙΥΗΡ ΝνΟΝΙΧΉΕΟν νΕνΕΚςΡΡνο АВУРЬЫЕКО ΟΡΡ8ΤΤΚΤΑΚ ΜΚΤΟΚΚΕΝΑΟ 8ΕΕΑΙΝΕΡΙΡ ςΡΜΡΡΡΡδΙΙ Κ8Ο8ΡΚΧΟΡ8 ΕνΥΧΚδΚΤΕΥ ΕϋΚΡΡΝΤΚΒΕ ϋνΡΕΚΚςΕδΟ РСРКУЬОСЮО ΡΟ08ΙΥΙΟΑΙ 1РЬСААЕКЕ>О КЕКААОЕЕМС ГОО1РУКОК.8 НКОУЬОЕМТТ ААХХХНУРРТ УКККП-'УСЕК ςΡΕΟΟδδΟΑΕ ΙδΤςΝΟδΡΚΕ ΝΚΑΕνΡΑΚΡΑ Р0ЕРУОУУЕ0 ККЕКЕСРОРУ ΙΕΤ5ΚΝΚΡΡΡ ανίΡΗΚΙΟΚν 1ЕС8РАОКСО кькусэшза νΝΟΟδίνΕΕδ ΗΑΝίνςΕΙΚΕ» АСЗУТУТЕТУ! ΑΕΕΕΗΗΟΡΡ8 ΟΤΝ8ΑΚΧ)8ΡΑ ЬОНКРМООЗР ΑΝΗΙΡΟΟΚ5Α ЕЕОЕЮКЛУЗ Т8УКН8ХУ8ОН КНЕАС^РЭТАУ Ι8νν08Κ_ΗΝζ» ΝΕΟΟΥΡΥΕΕΕ К.0РЯ0Р0Р8Е КСОКБУММСЬ ПЕКЬАЕООР АЧСООЮНУО ϋΟίνΕΙΝΟΕΡ ΤςΟΙΊΉΤΚΑΙ ЕЫОАООЯКУ ΙΧΕΕΚΡ0Τ6Ε 1РЭНСЕАР8С ЬСЗУУКРЕРН §1117849

ΜΑΟϋΟΟΟΙΕΕ ς)θνΕΟ8ΑΝΕϋ 8УОАКРОК88 РУР8ЬР8ККК ΚΝΥΤΜΗ8ΙΚΤ ΤΚΟΚνΡΤΥζ)Υ ΝΜΝΡΕΚΧΟΚΟ ΙΙΙΝΝΚΝΡϋΚ УТОМОУККОТ ОКОАЕАЕГКС ЕК8ЕОРОУ1У ΥΝϋΟδϋΑΚΜς ϋΕΕΚΚΑ8ΕΕΟ ΗΤΝΑΑΟΡΑΟΙ ΕΕ8ΗΟΕΕΝΜΕ ЗСЗУТрАОУО ККОИЗЯЕОРР РРКЕАЕОРЗЕ ММА8КРТКСР δΜΤςΜΕΙΕϋΤ ΚδςΨΚίΤδδδ ΡΙΡΚΓί^ΑΙΤΚ (ЗОАСЗЕЕАРСЕ СКР8АР8ХУП8 ТЕКТУ/КЗСКЗ 8РС §11493409

МСХ81А8НГС ЬЕПСКУЕКМ ЕРРРККЗЬАЕ С(2АОУ0У/КУЬ δςΕΓΑΑδΑδν/ УОАХСХЗЬР 88ТОУКНМРР КРАИРСЮЗК ОО18РСХУРОУ/ 8К8ЕОЕУ1КР РЯРРКУЬЮрЗ А

- 14 006603 £11493483 зо мс^пргшт ехузртеуара ονρν/ΕΰεδδΡ ζ)ΡΡΡΡΕΕΚΕΡ ЗСБЗРРЗЗУТ) ΥΕΗΑΡΡΗΡΑΝ РУРБУЕТСРЕ ЕУОРАСЕЕЪЕ ΤδΟϋΡΡΑδΑδ ςδΑΟίτανδΗ ητρροαννρέ κκχρςκΕΡ £12654881

ΜΟΗΡΚΑΐςΡδ УРРЗРУПУНГ ББУИЕСРУЕ ΚΙΟΚΕΗΙΚΣΚ ОБНРЕР8РЕР ГРРЕТрЗНЗУ ТЮ-ЕС8ОТ18 АНСНЪСБРСЗ 8Ν8ΡΑ8Α8ρν АСТТСТСННА РБ1РУРЕАЕМ СЕННЮрОбБ ϋΕΝΕΥΙΗΡΡΕ ЗРКАБбЕрА §12803929

МРИНУЗРСРС РСРСРЕЕ8БА БЗРЕЕЕСЗбА

ΙΕΑΗ6ΚΕΗΕΡ Ο3ΕΗ8ΡΑ3Α8 РУАОТКСАЕН

НАКЫРЬУР §13359183

ΕΡΤΝ8ΡΡ8ΕΕ ЗРАрУ/ЪСРбТ НБбНУрЗУЗН Бр\УЕб8УрЕЗ БЕЗУЕЯЗЕСА ЕРМБЗАРСЗБ ЗБНРЕЕРЗБЗ РРРРРЕГЕУБ БУЕрлбУр^с убсзбррерр 6Ρκρρ86Ε8Υ рззхупукерр ΡΕΡΑΝΡ6ΙΡ8 ТРбУЗРСУТК ХУЗБЗБОЕМГЕ ррОрреуизъ ρν §13375624

МбЕБУББУ/бА АУРЕЕббУСМА БбрОбДЕОУО ΐρΐΙΥΡΝΕΕΤ νςντν/ΝΑδΚΥ 8ΕΤΝΕΤΡΗΥΚ ΡΝΟϋΕΑΥϋρΟ ΤΝΥΕΕΡΕ6ΗΤ ЗбСЕБОАЕрЕ ΟϋΙΕΥΡδΙΕΝ бТНРУБТАЗЕ У/МУУУЪКЕ88

РКНУЕГЗУ/НР ОАУТУТСЗОЕ ЗУбЭЕЕУЕУр γκερροτεν/ρ трзЕЗУТрло νρν/соЕСББр РЗРРЕРККРЗ СЬЗЪРЗЗХУОУ ЕНРРРЕБАХЕ СПЗЕБбУЗР С\УР6У/8ЕТСО бе §13375628

МЕРЕКУАЕКЛ ККЕрЬЕр^К ЕЬ5УЬЕЕО1К ΕνΕΕΜ86ΕΥδ РУЗЕОЗТУРр ΡΕΑΡ8Ρ3Η83 ΙΙΏ8ΤΕΥ8ΡΡ РбРЗбЗЗрАб уру/еуеозбр ΡΡΡΡΕΥΚΕΡ8 СБТЕРЗЗУ/ОУ ЕЕБРРИЕТК-К. ΡΡΨΥΝ8ΤΕΑ8 ЕЕКЕЪ ТАНГЕ БЕЕрСУРЗТЕ МЗЕ18БП8ЕТ АЗрБОЕРрЕС ЬЗКЕТЕУКЗУ ΕΡΕΑΤΕ3ΥΑ8-ΟΕΥΝ688ΐν8 δΙΕΡϋΚηΟΟΥ РА1АОУТКК1 ΚνΥΕΥΏΤνίρ ΟΑνΟΙΗΥΡΕΝ ΕΜΤ6Ν8ΚΙ86 Ιδν/δδΥΗΚΝΣ ЕАЗЗОУЕбТУ 1БУ/ПбРТОрЕ ΕΚνγςΕΗΕΚΚ σν/δνΟΡΝΕΜΌ ΡΚΙΤ-ΑδΟδΌΏ ΑΚνΚΙΛνδΤΝΕ БИЗУАЗГЕАК АНУССУКРЗР ЗЗЕУНЕАРбС АОНСУНУУВБ ΚΝΕΚςΡΙΜνΡ КбНККАУЗУА КГУЗбЕЕГУЗ АЗТОЗрЬКЕХУ ИУбКРУСЬЕЗ ΡΚ6ΗΙΝΕΚΝΕ νΟίΑδΝΟΟΥΊ Α6Ο8ΕΝΝ8ΕΥ ЕУУКбБЗКТБ БТРКЕПТУКЗ УЕБКВЕКЕОО ТЫЕРУ8АУС\\ΕΑΕΡϋ6Ε8Νν ЫААЯЗрбТ! КУБЕБУ £13376550

МОЗУРУАКАб СКЕЕбБКбТЗ НГ8ЕРКСКНС ККЕРЕРбБРР БРГУРРРЕЕК 8ЕАБ8РЕЕЕС 86А1УАНСКБ 6ЕР68ЕН8РА 8А8рУАбТ1б ТСНЛТКПРС 1ЕУЕТ6РНЕУ ЗрЭбУОББТБ §13430856

МОСбЗУббрЕ ТрКЕРОЕрЕЕ ЕРЕРУбБЗбЕ РббЗЕТЗАЕК СР8АЕ8Б6ЕО АБЕРЕАРААК ббУЗКАЗРЕЕ ЕЕЕЕУРЗРЕБ ААААРЕЕрЕб ϋΑΈΕΒΕΕΟΥΑ АРРАбЕЗбАУ/ ЕСЗРбУАААА бАЕРрУНбРА РАЕУЗСЕЕЕБ ЗЕЗАбЗЕрЕЕ ΕΚΕΕΏΡΤ886 8ΕΚΕΥΡΟΤΗΑ ЕУСЕЕЕОИЕЗ НЗНрАбУрУ/ НЗБбЕБрРРР Р6РКЕ85НБ1 БЕЗЗХУОУКНА ΡΡΗΕϋΝΡδνΕ ЕЬЕТОРННУб РАбЕКБЕТЗЗ РРРТЪАЗ §13431835

МЗРАТТбТРБ БТУУ81Р8КУ НЗОЕКУУРЗА бУЪРУНУБЕЕ ΕΥΡΚΟΕΡΡΡΥ ΡΚΡ6ΕΙ8ΝΌΡ

ΙΤΡΝΤΝΕΜΟΥ ΡϋΕΡΟν/ΕΕΥΊ рКТРУЗОбУБ УбЗРТАЕМУб ΚΡΤΙΙΕΙΤΑΥ ΝΕΕΤΡΕΤΑΕΗ

ΝΕΙΙΝΙΜ5ΑΕ ΌΡΡΕΡΥρΑΕΡ ΡΙΚΝΜΝνΕΕΜ ЕАЗЕУЕООРЕ ОАУЮЧУХУрРЕ ΕΕΝΑΙΝΙΤ8Α БОЕббЕУРБР ΙΝϋΕΚΕΟνΥν МУОАЭУРРЗЗ ΟΕΕΕνΕΝΡςΝ РБЕСЗрЕМЕР У1ТСОККГЕТ ρργιοψ6Κΐ8 Ενϋκτκςνετ γςενίΕΟΕΟι ьросоеукрр δΟδεΗδΕΏΥΥ торытьаур ЗАУАЬУЕРЫ ЬАУТМССЕЕЕ бУЕККЯМрТР ΌΐρΕνΗΗ8ΑΙ РКЗТКЕЕКЛМ δΚΝΕΕΙΑν/РБ ЗТБРУРНРУТ 6ЕПРРБНТП ΝΥΟ3ΤΝΜΡΕΜ РТРРУ/ЗРАРУ АРАбУрУ/КЕБ 68ΕΡΡΡΡΡΕ.Ν ΕΡΗρτριρρρ ρττοκνζγρ §13435153

ΜΕ6ΕΕΚΑΑΑΙ ЗЕЕЕЕЬГУбЕр БАТЕЕМЗрКК Ε6Γ66ΝΡΕΓΕ ΝΕΑΙΙΡΤΚΙ5 ЗЗГЕГЕЕЕрЗ ΕΤΕ8ΡΒΕΕ6Ν 6А18АНСНЕЕ ΕΡΟ88Ν5ΡΑ8 АЗрУТбЕГОЗ НННАУЫРУГ ЕУЕТОГСНУО Ρϋ6ΕΕΕΕΤ56 БРРАЗАЗРЗА 61Т6МЗННТУ/ РТОЕГГКТУБ РАКЕ6БТО88 V §13489079

МНАУРЕбРбК КУЕУбУрЗСР ЗРГЗбРАСРР РЗЗУРХУЗЬЬК МЕРГЕЕНЕЕЕ Ι68ΝΡ38ΑΜΡ ΕΝΕΡΑΙΕΝ8Ε РРСЗЕАРЗУО ОЗЕУААЮрБ АГЕЕНЕТБАр ЬРЗУЬТОЗСЕ УЕПбРрСррБ ЕЗБЗБАИЕбМ ΜΟΚννΥΜΡΑΕ ЗОМБКНСККЕ ЕРЕЕБЕРРУГ ЗАЯАрРГрАЕ ЗрСРЗБрЕБС ЕУЗКЗбТБрР ОАУЬАРМАЕС ЕрУУМСНБРТ

- 15 006603 §13489081 §13540498 §13543287 §13569856 §13591868 §13591870 §1362993 §13631907 §13644612 §13646055

ОЕЗЕАТСКЗЕ (^δΕΕΚΚΨΟΕ УТСКЯРРЕРТ

ЕЕЯЕЕРЗАЯТ ЗЯАТСЯЖ^РС ЕРПЗОУУССР

СОЯРЕАУ861 ΙΕνσνδΡΞίν УКТГСУУРУБ

ΕΚΝίϋΥΑδίΓ рбусбретез ΗδννςΑονς^ ябеззеорее δΟΕςρςρρΕρ ееыеееюрз усру!

МЕЕБЕПОЕК ТР(}ЯУСАЕП ΚΗδςςίΟΟδΨ ЕХУКРЗКОСЗП СУМСК1НГ01 ΚΝΟδνΜ5ΗΕΟ АЗТНОРТСЕР ΜΕνΚδΟδντς АСУрБГФЕЗЗ Εςρρρδαρκς) гзсезерзму/ буясвренба νγευρ

МТТСЕРЕГ1Р ΕΚΕί^νΤΡΙΟΝ ΙΑΡΕΚΑΥΡδν НКМОК1БККЕ 3ΝΓ8ΡΕΤΗΚ0 ЗБТЕ8РЯЕЕС 3ΟΑΙ3ΑΗΟΝΕ ΗΕΕΟ88Ν8ΑΑ 8А5ЯУАСТТО

АСННА0Б1РУ РБУЕТСЕННУ С(}БСЕСБ1-Т3

ΜδΟΝΡδΡΟΟΙ ОКОНЕМЯЕУБ АББОЕС5Я1С ЭОЗОУНУКУБ ΝΚΚΚΟΡΑνν/Ο ЕЯА()1БККБУ ΚΟΝΜΟΚΕΙίΝ ТРБЕТУОЕСА УЕБЕЯТЕРЕ РЕНТОКСЯУЗ ОУУБУБСЗТУ ΥΑΕδΥΙΕΠΌ

ТРЕЯСМ1УЮ ЕЕТНРАСЖБСг БррзюБлрт БЕКБОРУУСЯ БКТОТРРЮА ΚΕ8ΙΝΡ8ΙΕΝ ΚΗΙΡΒΝΡ5ΙΡ ΡδΡΤΝΕΤνΨΙ КРЕОрЬРСУЬ ТНТМРКУОЕ1 νΐ_ΚΝΕΗΕΝ5Η νΚΕΤΤΡΟΡΡΥ СР51ЕЗКУБЯ ΡΡΝΚΕΗρνΨΕ ЕРЕСМБЗББ1 УРСЮБЗМТБР ΑΕίςΕΚΜΙΤΟ 1КОБЕКАКУ1 (^РБОУЕББЕР ΕΜΕΟΝΟΑΙδΑ ННМБРБРОУО У<ЗУОУЬЭРК.р 1ТРЗЬЕТН1У (^ΚΕΡΕΑσςίΝ ΟΤΤΟΥΕΕΑΑΑ фСУ1АС1МА8 ЕЯУ8ЯКРРРУ νδΚΤΕΟΥΊΟν БЮБЕТТБОТ 5ЕРУЯМКТ5К УЕГКЕЗБЯРБ ΝΑΒδΚΕΤΕΧΟ УКПА<ЗСУ5(К) ΚΥΕΚΑϋν/ΜΚδ ЗБЕЕО13УЕК 5ΙΕΡΕ35Κ\νΚ ΚΕΙΡΕΑ318Τ ЗЯЗЕРУЯАББ УЬКУЕЕУПМП ЗЕАКАУРЕРЕ ККУТКСКЕЕА ЕЯЕК1ЕАТУЕ ЗУБРНС^Е! КСУС^БЕАЕС) БРКБЕБУБТ! ЯБУ8Б8НЕУК ЕКБНРЗКРрТ ЮААЗШРОУ ΤΡΑΑΙΙΝίΧΚ. РУК.ТТС)ЯЯ(23 АМЫЕЗЗКТБО УБСБАБЯЕС^Е ЯЕБ

МРРБУВ188С У/ТЗРСРБРРЗ РБОСУББСРР 6ν/ΝΑνΑΚ.δ(2Ε ΤΑΤ3Α3ςνζ)Α 1ББУ8А5ОУА ΟΙΙΟΤΟΗΗΑζ) Р1РУРБУЕМО РННУСРАСЕК ΕΕΝδΟΟΡΡΑδ ΑδςδΑΟΙΤΟΜ 8ННАЯРРРЕР Р5Р

Μ8ΕΑΕΝΕΡΙΝ ΑΥΎΑΤΑΛΙΕΑΝ (ЭДСУ/ЕСУЕБ ρεααονοερψ мурамзеу/ ιοςγι^ν/Εν/ϋΝ ТУ/РСРБРБЗС} ЗУЗБЗРЯЕЕС ЗОТ1ЕАрС14Е

СББОЗЗБЗРА δΑδςΥΑΟΙΙΟ АСЯНАУ/Е1РС ΙΡδΚΌΟΥδΡΥ СРО

МАЕРЕБКМОЗ Εζ)ΚΌΝΥ8δρ5 ΟΜΙΡΟδΥ^ΗΚ МКБ0Б1БК58 ΚΑΥΥνΕδΟΑΑ ΜδΕςΚΥΟΚΑί ΚΥΙΚΧΑίςδΗ ЮТУССБСТИМ Б8ЕУЕЕРЕ8С> УБТБСОйКЭБ ΜΕΑαΝΑΝΝΚΑ ΑΗΕΕΕΡΗΥςΤ ΚΕΏζ)ΕΙΕΗ8Ε НЯЕ38С(}6УР (2А\УТТУ/ЕТУС БСЗЕАНАУЕЗ ΙΟΚΚΟΡΝΙΚν ΕΙΡΑΕΥΕΡΙΥ РЕЯЯ8РАБУА ΟΑΟνςν/ΟΝΕΟ 8БКРРРРСРК (^РЗСЕЗБРЗЕ ΨΝΥΗΗΑΡΡΟΡ Α8ΡΡΨΡΡΚ.ΥΕ СБ(^

Я8ЕТЕУФЗБЕ ΥδΟΤΙδΑΗΟΝ БЯБРОЗЗБЗЯ А8А8ЯААО1Т ОУЗНСАКРСМ БРЭРЕРРЕБА СУ<2ББРРЕРР ТСКАЕЗЯКЕ)

МЕРЯКБЯОМЕ ТЯРРАЛТАКБ ςΡΡΡΒΕΡδδδ ΡΚΚζ)ΕδΕ88Ο ББУББУБ1РТ РАЕОТРРРЕР РКРКЕЯЗРЗБ ΕΟΡΟδΜΟϋϋΟ 0Б8РОУБУЯС ΑδΟΡΡΡΝδΡΡ РСРРР5Т88Р НЕТАН8ЕР8Б ν/ΝΡΡδΚΕΕϋΚ РРЕБРРККЕК МКККОСАББУ ΚΕΡΝΟΟΡΕΚΙ Η8ΤΑΑ\νΤΗΡ8 ТКЕК^НБББСА ΕΕΟΙΡΙΕΝΡΝ ООЕАТБЕМБР Р8ЯТТ\УУУ31 ΝΝνΕΜδΕδΟΚ ТРНБУ8Н81Б ОББЕККЕТЯА ΟΝΡίΑΗΐδΡΗ яебаяккмуз τκιςοτκοσρ АССУАЕОА88 СОРРБСОАБЕ ТЗУУБЕ<2У/УР РМИКРЕБУЯр УБРРБРТРБ8 УРАББТОРС8 ЕЕРАУС1ОУ8 РОЯРОК8УЕР НТУЯР6АЕ8С У/ЕОЕМ8ТЕНЯ ΟΡνζ)νΤζ>νΕΕ БМУМУЕМБС8 УКЕУТРЕО8Р УЯОЕЯТРЕ1Р МТЕАУЕАУАМ УСССУБРАРУ/К Н6У(^УУ/АБС8 ООББОЕБКЛР ТЕТРКБЕОЗР КБЕС36Т18Р НСМЕЕБРОЗЗ ΝδΡΑδΑδΡΥΑ О1ТОБ

М8МУЕССРР8 ΚΟΗΤΑ5ΏΕΥΡ ςίΡΗΝΙδΡΡΕ ТЕ8С8УАС)АС νςΥΖΟΝΕΟδΕί} АБРРЯРТРРЗ

СБ8БР88УЯ)У ΡΗΡΡΡΟΡϋΝΥ РУР8УЕТОЕН

ΟνδςϋΟΕΝΕΕ ТЕ мбссзуссс^я τςκΕΡσκςκΕ бреруоезоя

РОО8ЕТ8АЯЯ СБ8АБ8ОСБО АБЯРКАРААЯ

ОСУ8ЯАЗРЕЕ БЕББУРЗРЯЕ ААААРЯЯ0БО

ОУ/ЕЯЗЯЕСУА АРРАСК88АУ/ ЯСЗРСУАААА

ΟΑΕΡςΥΗΟΡΑ РАБУ8СЯЯЕБ ЗБЗАОЗЕС^БЕ

ЯКЯЯВРТ38С ЗЯКБУЕБТНА ЕУСЕБЕБКЕЗ

ΗδΡΚ^ΑΰνΟΨ Н8ЕОБЕ(^РРР РОРКЯ88НЕ1

БЕЗЗУ/БУЯНА ΡΡΗΕΟΝΡδΥΓ ББЕТОЕННУС

- 16 006603

РА6ЬКЬЬТ85 РРРТБА8 ^13646423

ΜΝΡΡΡΚΤΕΡΕ 8УТ0АОМ0\УН ΝΡ88Ε0ΡΕΡΡ ОРК0Р8СЬ8Е Ε88ΨΏΥΚΗΤΡ РСРАИРС1Р8 РООУЗРС^ЗО ΨδΚΤΡϋΡΜΙΗ РРКРРКУЬЯЕ ОК §13648611

МРЕААУСУЬК УУСКОЗУСЕУ ТБУКНЮЮСК ΟΥνΐΚΚΕΝΤΚΝΑ33ΚΕΚΚΑΑ ЕОЕАОЫЗОЕ ΚΗΡΝίντγκΕ εψΕσοΌσιχγ гумсесесют ЬУККЬКЕОКС ΟΙΧΡΕΝΟννΕ ^УРУ01АМАЬ0 ΥΕΗΕΚΗΙΕΗΚ ΏΕΚΤΟΝνΡΕΤ ΚΤΝΠΚνΟΌΕ ΟΙΑΕνεΕΝΗε ОМАЗТЬЮТР ΥΥΜ8ΡΕΕΡ8Ν ΚΡΥΝΥΚ3ϋν\ν АЕОССУУЕМА ΤΕΚΗΑΡΝΑΚΒ ΜΝδενΥΚΙΙΕ ΟΚΕΡΡΜΡΚΏΥ ЗРЕЬАЕЫКТ МЕЗККРЕЕКР ЗУНЗП-КОРУ ΙΚΚ0Ι8ΡΡΕΕ ΑΤΚΙΚΤ8ΚΝΝ ΙΚΝΟΏ808ΚΡ РАТУУ8СЕАЕ δΝΗΕΥΙΗΡΟΡ Ь88Е(380ТУ1 МОЕбКСЪЗОЕ КРКАЗСЬЕКЗ РАЗБКАНТСК ΟΟΕΕΝΤΊΈίΑ Т188УМБ1Ь РАКСКГ8У8О ΟΡνΟΕΝΟΡΚΥ ΕΌΑ8ΝΕΕΟΟΙ С318ОУЕЕЕМ Ε0ϋΝΤΚ88Α0 ΡΕΝΠΡΜν/δδ ΏΐνΤΟΕΚΝΕΡ УКРБОРИКЕ 0КРКВ08ЬАЬ 5РКЕЕСЗОТ1 ЬАНЗЯЕКЕЕС 88Ώ8ΡΑ8Α8Κ. УАО1ТСУСНН А0О0УАСЕС1 ΙΕΚΟΟΚΙΗΡΩ εΟΡΗΝδΟδΕΡ δεδΡΟΚΚΟΚΕ ΡΕΟΤΕΗΡΟΕΚ КОУРРЭЬРАР ОЕ8РРРРЬР8 Ηρίνοκνϋντ 8Τ0ΚΕΑΕΝ0Ρ КУУТСЗУЗЗЗ Κ88ΕΜ885ΚΠ РРЬЗАРЕРРК ΕΚ080ΕΕΜ88 ЗОРЗУККАЗБ ЗУАСРОКРОЕ ЕООРЬРАКЯЕ ЗЗЭСЗУТОЕР КОШСЬЗЕОЕ ЬЗЗЗТЗЗТЭК 8ϋΟϋΥ<3ΕΟΚΟ ΟΤΝΕΙΝΑενΟ ЬМТОТЬКЕОЗ КЕЗСЕЭУРУА ΝΡΥδΕΡΚΧΗΡ ΚΥΚΌΤΕΙΕΙ-ΙΟ КУАЕЕАЕЕ1Н РКЕЬР8А1МР СЗЕЮКРЕУЕ уертэугрсь ανςεΡΕονγΌ еьеееоерок ЕУРЬРЕНМСЕ ΚΥΤΤΥδΥΚΑΚ ΟΕΚΡΓΕΕΝΜΝ Р §13651342

ΜΡΙδΡΟΡίΙΡ 8РРЕТУ/8Е8Ь 8РРЕЕС8СТ1

ЪАНС1УРТ80У 0ΑΙΕΡΑ8Α8Ρ УАО1ТОМННН

ТСЫРУЪЕУК МСРСНУСНАС ЕЕБУТ §13652010

МЕЗООРЗЬЗР ΥΡΕΡΙΥΡΡΕΙ СЗНРУТОАОУ Ο\\ΉΝΤ_ϋ8ΕΟΕ ЗЬАЗАРОУАб ТТСЗАСННАКЕ 1РОУРСР1Э\УУ ЬРС §13653409

МЕЬУЭАСОРЕ РМР8ОАРЕЕА ЕРЕТРЕРСАЕ АКЕУЕЕТ1ЕО МЬЕРЬЕЕРСЗ ЬАОЫРЗОТЗ ΟΙΣΕΕΝΙΡνε КАКЕ ТЕМК <31 ΥΑΚΎΌΡΙΈΑΓ УКМУОННУАР ЬЕАВУЪОАЕР ОНОАЕРОАЬР

Р\УЕС8АСЕР8 РКХУЕСЗСП ΡΑΚΟΝΕΚΕΡΟ 58О8РА8А50 УАС1РЕУТСТ 6АРПУРААНТ V §13699916

Μ8Ρ6ΝΕΝΡΕΤ ИККОТУБКЕК ОККЬАККбРА

ΥΜΡΝΌΗ8Τ8Ε δΙΕΕΕΡΡΕϋΑ ΑΕΥΟΝΙΡνΥΡ ΚΜΕΕΕΟΕδΕΝ νΝΟνϋΥΜΟΟΝ ΑΕςεΑνΑΝΕΠ ЕЕ1ТЕЕЕБКК ΕΝΕδΡνΟϋΑΕ ЕБА13КСУУК ΓνΕΑΙΕΝΗΡΑ РАЕСКЕЬАТ8 РЗОЗЕЬООЕЮ ΡΥΑΥΟΕΌΟΤΡ РЗНОУТРПБ ААНСОЕУЫУ ΗπχκκοΑΡί ΕΡΡΗΟΥτεκσ тесзококнэ 8Ρ8Η8Ρ8ΡΙΝ ΑΥΚΟΕΑΒΡΑΥ БЗБЗЗЕОРУМ ΤΑΕΕΕδΝΕίΑ УБАМЕКЕРК ΝϋΥΚΚΕδΜΟΟ ΚΏΡννΟΕΕΌΕ СЕМТЕЕУЕА1 ΕΝΟϋΑΕΤΡΟΡ 6ϋΕΑΚΡΝΕ5Κ. ΕΚΕΑΙΚΥΕνΚ КРУАНРИСОО ΟΕΕδίν/ΎΕΝΕ ЗОБНООТМАУ КРБУУБАУА1 ОЬРРЬАиУУ/ САРСЗКМОК1 ЬКСРРМКРУА НАА8РТ1РБО ΕΕΥΜΝΑΑΌΚ-Ε ΕΟΤΚΕΕΡΝΕΤ 8ΤΏΝΑΡΟΕΡΡ ΜΚΤ8ΟΡ8ΨΜΕ МБПЗЧ/УЮМ ΙΨΑΕΟΚΕΙΨΤ ОСРКЕУЕРЕБ УЛ4МБПРОМЕА ΙΡΑΑ8ΡΙΑΚΡ ΜΑΡΨΗΑ5ΚΑ0 δΙΙΏΑΝΏΤεΚ ОБТКУТБСОХ ΥΚΥΥΝΕΑΚΙΚ ауорторопз ΕΟΕΥΑΪΑννε 8Ρ8ΡΙΑΥΙΕΡ ΑΝΕδΡαΡεΟΙ ЗБбРТУКШГ КРМУ1Р1МУР УАРМЮМРХЕ Υ8ΥΥΙΟΑΚ0Ν ЕАРТТУЕЕЗР КТЕР\УА1РОЪ δΕνΚδννίΝΥ ΝΗΚΡΙΕΝ1ΟΥ УБУСУУкРУТМ УТУББЫМЫЛ ΜΙΝ88ΡΟΕΙΕ ΏΟΑΟΥΕΨΚΡΑ ΡΑΚΕν/ΓδΥΡΕ ΕΟΚΤΕΡνΡΓΝ ЪУРЗРКЗЬЕУ ЕЕБКРКК\УМЗ ЕЫОбНККОР ΟΕϋΑΕΜΝΚΡΝ ЕЕККРО1БО8 ΗΕΏΕδΚΡδΕϋ ΡΝ0ΕΑΗΝΚ08 8ΤΚ88ΕΟΡΗΕ Ν8Ρ8ΝΡΡΡΟΥ 0К1МКРЫКК γνεΟΑςιοκΕ зоеуяесеек Είκοϋΐδδερ ΥΕεΕΕΕΚδΟΝ ТЕОЬАЕиКК БОЕКЕЗБЕЗК ΟΕΕ8ΚΚ §13702149

Μ8Ε.ΟΝΕΝΚΕΤ НРРОТУБРЕК ΟΚΚΕΑΝΚΟΡΑ ΥΜΡΝΏΗδΤδε 8ΙΕΕΕΡΡΕϋΑ ΑΕΥΟΝΙΡνΥΡ КМЕЕЕСБЗЕМ νΝΟνΏΥΜΟΟΝ АБОБАУАХЕН ЕЕПЕББЕКК ΕΝΕδΡνΟΟΑΕ ЕЕА18КСУУЯ ΐνΕΑΙΕΝΗΡΑ'ΡΑΕΟΚΡΕΑΤδ РЗОЗЕБООБО руаупеостр рзнбутрпе аансоеуыу НТЕБККСАК1 ЕРРНЭУЕСКС ΤΕΟδςΚΟΚΗΏ 8Ρ8Η8Ρ8ΡΙΝ ΑΥΚΟΕΑ8ΡΑΥ БЗБЗЗЕРРУМ ΤΑΕΕΕ3ΝΕΕΑ УБАМЕКЕГК ЕЮУЯКБЗМОС КЛРУУСББОЕ СРИТЕЕУЕА1 ΕΝΟϋΑΕΤΡςΡ ΟΟΕΑΚΡΝΕδΚ ЕКБАГКУЕУК КРУАНРИСОО ΟΕΕ8ΐν/ΥΕΝΕ 8СЕК00ТМАУ КРЕУУЬАУА! СБРРБАЕ1У\У САРС8КМСК1 БКСРРМКРУА НАА8РТ1РБО ΕΕΥΜΝΑΑϋΚΡ ΕΟΤΚΕΕΡΝΕΤ

- 17 006603 δΤΌΝΑΒ^ΕΓΒ. МКТ8СР5Ж4Е ΜΕΙΙδΨΥΙΟΜ 1У/АЕСКЕ1\УТ рСРКЕУЬЕЕЬ ΨΝΜΕϋΡΟΜΕΑ ΙΡΑΑ5ΡΙΑΚΡ ΜΑΡν/ΗΑ3ΚΑς δΙΙϋΑΝΏΤΕΚ ΟΕΤΚνΤΈΟϋΝ УКУУЖАМК ΑνθΡΤϋΡ(?ΙΙ5 ЕОЬУАиУУЬ 3Ρ8ΚΙΑΥ1ΕΡ ΑΝΕδΕΟΡίςΐ 8ЕОКТУКВ1Р КГМУ1Р1МУГ УАРМЮМГЖ ΥδΥΥΊΟΑΚςΝ ЕАРТТУЕЕЗР КТЕР^А1РСЬ 8ΕνΚ8ννΐΝΎ ΝΗΚΡΙΕΝΙ6Υ νίΛΟνΥΝΥΤΜ νΐνΕΕΝΜίΙΑ ΜΙΝ83Ρζ)ΕΙΕ ΚΝΕΕΚΚΡΟΙΡ, 63ΗΕΌΕ8ΚΡ8 ίΟΚΝζ)ΕΑΗΝΚ ς)83ΤΚ.88ΕϋΡ ΗΕΝ8Ρ8ΝΡΡΚ. ζ)ΥΟΚΙΜΚΚΕΙ ККУУИЗАСДО ΚΕΞϋΕνΝΕΟΕ ΕΚΕΙΚ.ςθΙ88 ΕΚΥΕΙΧΕΕΚδ (^ΝΤΕϋΕΑΕΙΛ ЕКЬСЕКЕЗЬЕ 8К(}ЕЕ8Ю<

§14043238 §14192931 §14198309 §14249973

МЕЗЕЗУАС^АО У£)\УРОЕСЗЕО РЬРРКРККЕР СЕЗЬрЗЗТОУ ΚΗΑΡΡΕΡΑΝΡ УРЬУЕТОРСН У89А6ЬЕ1ХТ 88ЭРРРКРРК УЕК

УиЗУНСЖСЕ РС88ОРРА8А 80УАО1ТСУк НСМАЗСАУЪХ КУРКНОСЗСЭ ЬЕУКОЗНСЗЕ <ЭЕАРХУ6К8УР ОК6ТАЗККОР ΟΑΟνίΟΝδΚΈ АЗТ(ЭКА(}У/ЗА ΡνίΡΑΤζίΕΑΚ. АООЬЕЕРЯгЬ Ι8ΑνΖΑΤΥζ)ϋΕ Ι3ΙΝΚΕΚΕΚΚ О

ΜΤΚ3ΕΡΚ.ΟΝΡ У/8АО1Ь8Т1С ΥΕΝΊίρΗΕΝΝ ΟΚΚΝΟΚΕΡΕϋ РЬКЕКААбЕЕ КЛ'СКЛЬЕЖЗ кккрсо<28Е1 ΝΊΈΚΚΑΕΕνρ κςςνϋΝνΑςσ НКЗЬАрЗЬКЕ ЕАККМЕЕРЕЕ ΚςΚΚ^ΚΚΚΜΕ 8ΗδνΤζ)Α<σΑ<2 ν/ΗϋΕΟ8Εζ)ΑΕ РРСРМРРЗСЬ 8ΕΡ83ΧΥΝΥΚΕ РРРРКЕАЕРЕ ΝςΟΗΟΥΑ

МЕЗНЗУТС^АС УСТУКОЬСЗИЗ РЬРРСРКОЕЗ НЬЗЕРЗЗТОУ ΚΚνΡΡΥΕΟΝΡ С1Р8ОЕ6У8Р Сй'РС'УЗ §16226025

МбЗЬЗТАЖЕ РСЬОУГКЕЕЫ δΝΝΙΟΩΝΊΡΡ ЗЗЕЗЪЬУАЬЗ МУЬЬСАКОЕТ АЕОЕЕКУЬНР ЗНТУПЗЬКР.С ΡΚΌ8ΡΚσ8ςΑ СК1Н5ЕРСУЕ Γ8ζ)ΙΝ(2ΡΌ8Ν ΟΤΕδΙΑΝΡΕΥ ΟΤΚΤΜΑΡΗςς ΥΕδε8ΕΚ\νγς ΑΚΕςτνϋΡΕρ зтееткктпм Αν/λΈΝΚΤΝΟΚ УАЖРОКЗТ1 ЭРЗЗУМУЕУХ ΤΙΥΡΚΟζίΚφΝ ΚΡρνΚΕΙΎΚδ ΡΡςΕδΕΟΚΝΥ ΤΥΕΜΜΥςίΟΤ ΡΚΧΑΡνΚΕΡ(} М(2УЕЕЪРУУК ИКЕЗМПЬЕР ν01ΑΝΙ_Κζ)ΙΕ Κί^Ι,ΝδΟΤΡΗΕ ν/ΤδδδΝΜΜΕΒ. ЕУЕУНЬРКРК ШКУЕЬЫЗЕ ЬКРЕСУТЬЕР ИРУКАЛЬЗСМ ЗРТКСЬУЪЗК ΑΙΗΚδΥΈΟνδ ЕЕ6ТЕААААТ ОЭ81АУК8ЕР

ΜΚΑΟΕΚΑΝΗΡ РЬРРИШТНТ КПЬРССКЕА 5Р §16517174

ΜΑςΡΥΥΚΚΝν ΝΑΡΥΚΟΚΙΡί КГ/КАЕЗЕЬЗ

РЗЕКАУЬЫАУ ΕΚΟΌΥΑδνΚΚ ЗЬЕЕАЕГУРК ΓΝΙΝΟΙϋΡΕϋ ΚΤΑΣΕΙΑΙΕΝ ЕЖЕЫЕЕЕЕ 8ΓΝνΥνθϋΑΕ Ы-ШККЕУУО АУЕЬЬЕКНКК ΡδΟΕκςνρρι ιχοκςρδΕΡΤ ропрпьаа ΗΤΝΝΥΕΙΙΚΕ ЬУ(ЖСУ8УРК РНЕУКСМСУЕ ενδδδϋνϋδΕ ΕΗ5Ε3ΚΕΝΙΥ КА1А8Р8ЫА БЗЗЕЭРРЕТА РСЗЬЗУ/ЕЫЗЕЕ ЗКУЕЫЕРКЗЕ ΥΕΕΕδΡ^ΟΚς РАКОЬЬОРТК. 33ΚΕΕΕΙΙΕΝ ΥΚΒΟΝδΙΊΕΕ рЗСХТЭЕАКЬК ΉΛΙΚΥΚςΚΕΡ УАРРЫССЗСДХ АЗЮУУОЕРРб ХУРКЕЕГУАУКМ УТСР1ЮЕЕР РУРЗУСУЫА РК8РЕСЪР1К КРР1КР1СНТ Α3ΥΕΤΡΕΡΕΕ ЬЕАЗрНЮЕЗ ОЬМ^СРРРТ 1УЕ\УМ1ЬР\УУ ЬОР1\УОЕ1К0 МУЛЭОСЬЗОУ! НПШУЖМЕРУ ΜΝ3ΕΥΕΑΤΙ3 ЬК1УАГУКУ8

ЛЬИРКЕЗТОМ У/НРТЬУАЕАЬ ΡΑΙΑΝΙΡ33Ε ΚΕΙ3ΕΡΤΑΝ3 НЪбРЬСДЗЬб ΚΜΕΕϋΙΕΚΓΕ ΡΙΥΟυ/ΣΧΑΡ ΑΝΟΕΝί^ΕΥΓΥ УЕЕТКСЬТСК ΟΙΚ,ΟΕΚζίΝΝΑ Ρ3ΤΕΡΕΤΕζ)5 ίΡΨδΙΓσΕΙΝ ЬУУТМУКАрН ЕРТЕРУОАТМ ΡΟΤΥΝνίδίν УЬЬХМЫАММ ΝΝ8Υ(^ΕΙΑΏΗ ΑΟΙΕΥ/ΚΡΑΚΤ КЬУ/МЗУТЕЕб αΤΕΡΤΡΕΝνΐ РЗРКЗЬОТЫ ΚΨΙΨΤΗΕΕΚΚ ΚΜΚΚΚΡΕ3ΡΟ Т1ОУЕТ0НЯЕ ААЬЖЮ<ННр УС^ЕУМКЖУК ΚΥΥΑΑΜΙΚΌΑ ΚΤΕΕΟίΤΕΕΝ РКЕЬКсдаЗЗ РКГЕУЕ6ЕЕВ. ОЗКЬЗТ^ЗА ΝΑ8ΚΕ88Ν8Α ОЗОЕКЗЭЗЕС Ν8ΚΙ)ΚΚΚΝΡ8 ЬРОЬТТЫНР Κ.8ΑΑΙΑ8ΕΚΗ

ΝΙ8ΝΟ8ΑΕνν ςΕΡΡΚΕΚΚ^ΚΚ νΝΡνΤϋΙΚΝΡ ΟΕΡΗΚΒ.3Κ.(1)Ν ΑΑΕςΝΑΝί^ΙΡ ЗУЗЕЕУАЖ^ ΑΑΟΡΙ,ΕΚΝίς) ЕЕЗКСЬАЗКО ϋΕδΙΡΟΕδΕς СУЬУОНКЕКМ ΤΟΊΈΟΙ^νΟΚ КУСРРКЗЕКУ УУЕОТУРПР КЕКНАКЕЕБЗ ЗЮУЬЪЖРО ΤΥΤΗΕΌΥνΤΤ ЕЕ §16517176

ΜΑΟΡΥΥΚΚΝΥ ΝΑΡΥΚϋΕΙΡΕ ЮУЕАЕЗЕЕЗ

ΡδΕΚΑΥΕΝΑν ΕΚΌϋΥΑδνΚΚ ЗЬЕЕАЫУРК ΙΝΙΝαίΟΡίΟ ΕΤΑΕΕΙΑΙΕΝ ΕΝΕΕΜΕίβΕ ΞΡΝνΥνΟΟΑΕ ЕНА1ККЕУУО ΑνΕΕΙ-ΕΝΗΚΚ

ΡΒΟΕΚρνΡΡΙ ЕЕОКрРЗЕРТ РБ1ТРПЕАА ΗΤΝΝΥΕΙΙΚΕ ЬУрКОУЗУРК РНЕУКСЖУЕ СУЗЗЗОУОЗБ ΚΗ3Ε3ΚΕΝΙΥ ΚΑΕΑ8Ρ3ΕΙΑ ЕЗЗЕОРРБТА ΡςΕδΥ/ΕΕςΕΕ ЗКУЕМЕГКЗЕ ΥΕΕΕδΚςεκς РАКЖЕОрТЕ δδΚΕΙΈΙΙΕΝ ΥΚϋϋΝδΕΙΕΕ ςδΟΝΏΕΑΚΕΚ ΕΑΙΚΥΚςΚΕΑ

- 18 006603

ЗУСЕКЬЫКСб ΜΑΒΡΚΤΤ8ΜΙ СС1 §16758330 §17978303 §18376629 §1843388

МЗОЗРОРУТК КСО8РКААРО ΑΟΑΚΚΝΕδΟΩ уььмоеьооо суроьоорру суурзркоке ΝΡΕΤΗΚΚςτν ΕΚΈΚΟΚΉΕΑΝ ΚΟΡΑΥΜΡΝΏΗ 3Τ8Ε8ΙΕΕΕΚ ГЫЗААЕУСМ РУУЯКМЬЕЕС ЬЗЬБГЛЧСУОУ МСрКАЬфЬАУ ΑΝΕΗΕΕ1ΤΕΕ ΙΧΚΚΕΝΙδΚν СОАЫХА13К. СУУКТУЕАЛΝΗΡΑΡΑΕΟΚΚ БАТЗРЗОЗЕЕ ΟΟϋϋΡΥΑΥϋΕ ОСТКР8НВУТ РПБААНСОЕ УЫУНТЕЬЮС САК1ЕНРИОУ РСКСТЕС30К 0ΚΗϋ8Ρ8Η8Κ. ЗКтАУКСЬА 3ΡΑΥΕ3Ε88Ε ОРУМТАБЕЕЗ ΝΕΙΑνΕΑΝΙΕ ΚΕΡΚΝϋΥΚΚΕ 8М0СКПЕУУС ШОЕСКЛТЕЕ УЕАЛ-КСПАЕ ТК.ОРСОЬАКР ΝΕ8ΚΕΚΕΑΙΚ УЕУККГУАНР N000(^819/ УЕЖЗОЕК-ОО ТМАУКГЬУУЬ АУАЮЬРЕЬА ЫУАСАРСЗК МОК1ЬКОРЕМ КРУАНАА8РТ ΙΡΕΟΙΧνΜΝΑ АВКРЕОТКЕЬ ΡΝΕΤδΤϋΝΑΚ 0ЕРКМКТ8СР 59/ΜΕΜΕΙΙ8Ψ УЮМ1ААЕСК ΕΙΨΤΟΟΡΚΕΥ ΕΡΕίλνΝΜΕϋΡ ΟΜΙ.ΑΙΓΑΑ8Ε ΙΑΚΡΜΑΓΨΉΑ δΚΑΟδΠϋΑΝ ЭТЕКОЕ'ГКУТ ЬСПЫУКУУЬП. АК1КТОРТОР 0И8ЕСЬУА1 ΑννΈδΕδΚΙΑ ΥΙΕΡΑΝΕ8ΡΟ РЬ018ЬСКТУ КВ1ЕКЕМУ1Е 1МУРУАРМ1С ΜΡΝΕΥδΥΥΙΟ ΑΚφΝΕΑΡΤΤν ЕЕЗЕКТЬРАА 1РСЕЗЕУК8У νΐΝΥΝΗΚΡΙΕ МСУУЬУОУУ ΝντΜνινιχΝ МЫАМПЧЗЗР ΟΕΙΕΟϋΑΌνΕ 9/ΚΕΑΚΑΚΕ9/Ε ЗУРЕЕСКТЬР УРРЖУРЗРК ЗЬЕУЕЬЕКЕК К9/М8ЕЫ0СН ККСГ0ЕОАЕМ ΝΚΚΝΕΕΚΧΡϋ ШОЗНЕОЬЗК ЕЗиЖКОЬАН ΝΚΟ33ΤΚ38Ε ΌΕΗΙ.Ν8Ε8ΝΡ ΡΚ0Υ0ΚΙΜΚΚ. ЫККУУЬОАО ЮКЕЗОЕУИЕ ОЕЬКЕ1К0О1 ЗЗЬКУЕЕЕЕЕ Κ30ΝΤΕΟ1.ΑΕ икКЪСЕКЬЗ ЬЕЗКОЕЕЗКК §1710216 66

МСНРКА10РЗ УРРЗРУЭУНГ П.УР1КСРУ1. К1СЯГЕПКЕК СЬНЕЬЕЗРЕЕ ЕРЕЕТОЗН8У ТК1ЕС8СТ18 АНСЖСЕРСЗ 8Ν8ΡΑ8Α8ΚΥ АСТАСТСЕКА ОЫЕУЕЕАЕМ ОЕННУОКОСЬ ОЕЖУШРРК. ЗРКАЬСЬОА

МОЗЕЗТАЯУЕ РСЬОУРКЕЬМ 8ΝΝΙΟΏΝ1ΕΡ δδΕδίχΥΑί,δ муеесакоет аеоеекуьнг ЗНТУОЗЬКРС РКО5РКС30А сшнзегсуе Ρ50ΙΝ0ΡΟ8Ν ΌΤΕδΙΑΝΡΙΥ СТКТМАЕНфО УЪЗСЗЕКУ/УО ΑΚΕΟΤΥΏΓΕΟ 8ΤΕΕΤΚΚΜΙΝ Α9/νΕΝΚΤΝ€Κ νΑΝΕΡΟΚδΤΙ ОРЗЗУМУЕУИ ΤΙΥΕΚΟ0Κ0Ν ΚΡςνΚΕΤΥΚδ РЕОЬЗЕаКЕА

ΤνΕΜΜΥΟΙΟΤ ЕКЕАЕУКЕРО Μςνί.ΕΙ.Ρλ'λ'Ν ЫКЬЗМПЬЕР νΟίΑΝΕΚΟΙΕ Κ0ΕΝ8ΟΤΡΗΕ ΑΤδδδΝΜΜΕΚ ЕУЕУНЪРКРК ЬЕ1КУЕЬКЗЬ ΕΚΡΙΌνΤΏΙΤ ΝςνΚΑΟΕδΟΜ ЗРТКОЬУЬЗК ΑΙΗΚδΥΕϋνδ ЕЕСТЕААААТ СО51АУК5ЬР ΜΚΑΟΓΚΑΝΗΡ Η.ΓΗΚΉΤΗΤ ΝΤΙΕΓΟΟΚΕΑ 5Ρ

ΜΕΚΝ8ΤΡΚΝΜ ОККНТТБКЕК СКК0А1КСРА УМРХЕКСТЗЬ ТРЕЕЕКРЬОЗ ΑΕΥΟΝΙΡννΚ ΚΜΕΕΕ5ΚΤΈΝ ΕΝΟνΟΥΜΟΟΝ АЬОЬАУСХЕН ЬЕУТЕЬЕЬКК ΕΝΕΑΚνΟΟΑΣ РЕА13КСУУИ ΐνΕΑΙΙ.ΝΉΡΑ ГАОбОКЬТЬЗ ΡΕΕΟΕΕΚΌϋΏ ΡΥΑΥΟΕϋΟΤΚ ГЗНЫТРПЬ ААНСОЕУЕГУ ШЬЬЬКСАК1 ЕКРНПУЕСКС ΝΕΟΤΕΚΟΚΚΌ 8Ρ8Η8Κ8ΚΜΝ АУКСЬАЗААУ БЗЕЗЗЕОРУБ ТАЕЕБЗЫЕЕА ΚΕΑΝΙΕΤΕΕΚ ΝϋΥΚΚΕδΜΟΟ КОРУУСУБОБ СКПТЕЕУЕА1 ΕΝΟΟνΝΡςνΑ 8ΌΗΗΚΡ8Ε8Κ1КБА1КУЕУК КРУАНРИСОО ОЬЬТМАУЕЖ ЗОЬКООЗИУ КЕЕАУРСУ81 СЕРРЬАГАУА 1АРС8КБСК.Т БКЗРРМКГУА НАУЗРТ1РБО ΕΙΑ/νΝΑδΌΚΕ ЕОУКТЕРМЕТ РТЭУРКО1РК УКТТОРЗ\УТЕ мпмку/урсм 1АЗЕСКЕ1ХУЕ ЕСРЕЕУУЬНЬ \УКиХ>Р6М1.5 1РУА8РТАКР МАТЬКАТБАО ΕΥνϋΟΗΥΟϋϋ ТЬНРГУЗЬРРЕ νΑΥΕΤΥΑΚϋΚ Ψν/Ρ8ϋΡΟΙΙδ ЕСЕУА1АУУБ 8ЕЗЕ1АУ1БР ΑΝΕ8ΡΟΡΕΟΙ 5ΙΌΚΤνΚϋΙΓ КРМУ1Р1МУР УАРМКЭМРЖ Υ8ΥΥΚΌΑΚΥΝ РАРТТУЕЕ8Р КТБРА51РСР 8ЕУ18УУБКУ ΟΗΚΡΙΕΝΙΟΥ УБУОУУЖТМ УУУЕЬЯМЫА ΜΙΝΝ3Υ0ΕΙΕ ЕОАОУЕУ/КГА КАКБЖЗУРО ΕΟΚΤΕΡΑΡΡΝ БУРЗРКЗРУУ ЫМК1КМСЫ КЬСКЗКАКЗС ΕΝΟΕΕΜΟΜΕΝ 3ΚΡΚΚΤΕΥΟΑ ΟΜΚΝδΕΝΕΤΑ ΝΝΊΊ-3ΚΡΤΚ.Υ 0ЮМККА1КК ΥνΕΚΑςνϋΚΕ РЮЕУКЕОЕЕК ΕΙΚΟΟΙ88ΕΚ УЕЕБЕЕКЗОА ТСЕБАВЫОО БЗЕКЕСКЖК КОНБРУРГКОК ϋΐ

МКУШЛЖОЕЗ ΑΑΑΚνΚΑΡδΟ ЕООРРОАНОЕ Ι8ΕΕΕΕΕΥΟΑ БСОААВЖТ ΡΕ6ΤΕΕΝΕΗΕ ΚΚΡςνΤλΥΕΕΗ ЯКНБРЕЖУР ЗЕРЕБОЗЖР ΑίνδΟΙΚΕΟΤ ТТНОТСЗЕОТ Υ5ΤΕΕ0ΚΥ0Κ ЗЕЕЕБКРУАЕ ЕАУЪЕСОККЮ АУУОЕ0МТМК ТКОКМБТЕОУ/ ЕБРКОККР1Е ЕОБТЖСКАУТ ΟΕΝΝΡΤϋΤΜΚ НУБЗЗКЕЗМР ΟΟΡΝΟΝΥΚΚΚ САСООС8Б8Н 1ЕТСС1МОРР ΥΤΟϋΙΗΙΗΟΕ ΡΕΟνΏΡΑΡΌΥ ЕАЕКЗРР5У5 ЗАЗЗОЗОЗЗЗ Р1Т1ООНРКЬ 1БТ0808АРТ РСЗЭОЕОУАР

- 19 006603

Ι,δΑΚΓΑΟΙΥΡ ΕδΝΥΏΟΤΕνν ΑΝΜΝ0ΙΗ3ΕΕ ΝΟΟΟΕΝΜΑΣΚ ϋΕ8Ρςΐ88Τ8 ЗЗЗЗЕАВВЕЕ ΑΏΟΕ586ΕΡΡ бАРКЕОСУЬС 8Κ8ΡΚΤΕΕ8Κ ΑΏ8ΡΡΡ8ΥΡΤ (^АЕОАРЫТС ЕСНУСКрЕАЗ СЬТРЗАМТАС АЕРРОНСД-ЕЗ РЕКРТНРАЬН ЬУРШНОНУР ЬНТУРНЬРКР ΠΗΡΤ1ΎΑΤΡ РГТНЗКАЬРР ΑΡνρΝΗΤΝΚΗ ςνΡΝΑ8Ι_0ΟΗ ΙΥΡδΟΡΟΝΤΡ Εν/Ν83ΚΓΙ8Ε ν/ΟδΕνΝΊΝΌΚΝ ν/ΝΡΟΤΡΕΡΒΤ Ι8Ο8ΕΙ1ΌΡΤ ЬЗЕТЯРЕАЕР ΡΡ88ΝΕΤΡΑν 8Ο8ΚΕΚΚΝΑΑ ΚΚΚίΧΥΝΓΟϋ ΑΡΜΕΑΝΚννΜ АТ88АТЗЗУ8 ΟΤΑΤΤνςδδΝ зс^ркуззккр ΡδνοονρΗΟΐ зкеэнкнзар ААРК№РТСЬ АРЬРАЬЗРАА Ε8ΡΑΑΕ3ΡΑ3 ТРНЬАИЬААР ЗРРКТАТТТР СРУВТЕК8РС РАРЬРРАТОС 318АРР8УС8 ЭРВСЕСНКСЕ ΝΟνΥΌΡίχΦΟ СЮЕЗАВЕВЗС 8ЕН838Т5Т8 ТЪ^КЕСКУСО ССУСЕРРСНС ΟΡΡΑΑΡΤ2ΚΝ УАЕМРЕКЕНЕ ΚΕΤΚΚΚΕΕζίΡ ККМ0(Д8ЕКЕ ЗУУОНККУЕО ЬЬС^РПЧЗЗЕТ КРУ88ТКААК ΚΑΚΗΚζίΕΚΕΕ ЕКАКЬЕАЕАК АКЕНЬНЬрЕЕ ςΚΚΚΕΕΕΕϋΕ ΕΕΕΕϋΚΡΚΕΕ РрКЕрЕЕрЬСЕ КАУКККККЕК РЗКОСРКЪВМ υΤΗΝΡςΑΑΤΕ 8νΡΝ8ΟΝΙΗΝ Ο8ΕΕζ)ΤΕΕΡΕ Τ33Η8Ρ3ΚΉΜ ΝΗδΕΡΚΡΟΕΟ АВСЭААВРУО ΤίΕΟδΚΡΕΕΡΚ ΕνΝΟΚςΗΕΡΕ δΡΡΡΟΙΜςΗΗ ΚΕΟΝΟΚΡΚΧΕ ζ)Τ8ΚΑ88ΕΡΑ ΚΚΡΤΕΡΡΚΑΤ ΕΟςδΚΡΚΑί^Τ Ε8ΚΑΚννΐ)]_Μ 3ΙΤΕζ)Κ_ΚΕΕΚ ΚνΝΒΝΝΝΝΚΚ ζ)ΕΝΗΙΚϋΕΚ8 ΝΡΤΡΜΕΡΤ8Ρ ΟΕΗςςΝδΚΣν ίΑΕδρςρκοκ νκκνκκκκοω κνΝΝδίυανδ ΙΛΕΡδΕΟΥΝΟ А1ЬАНС14ЪКХ Р688ВСАА8А δονναιτοον рьрквгоиэз уомветекеу ЕУРККРСЕВ8 АЖ^ТКРКЕЗ! Νν/3ΝΡ8ΕΚΚΑ ТГААН §20140144

МСЗЬЗТАЖЕ РСЬПУРКЕЫЧ 8ΝΝΙΟΟΝΙΡΡ ЗЗЕЗЬЕУАЬЗ МУТЬСАКСЕТ ΑΕςΕΕΚνΕΗΡ ЗНТУОЗЬКРО ЕКЭЭРКСЗРА СЮН8ЕРОУЕ ΡδςϊΝςρπδΝ сп^амкьу стктмарнс^с ΥΙ,δΟδΕΚν/Υς ΑΚΧςτνϋΡΕΟ зтеетккмпч Α\ννΕΝΚΤΝΟΚ УА14ЬРОК8Т1 ОР88УМУЕУМ ιίγρκος^Ν κτςνκΕτνκδ ρρςρδΕΟΚΝν ТУЕММУ(Д(ЭТ ΡΚΧΑΡνΚΕΡς Μζ)νΐ_ΕΕΡΥνΝ ΝΚΣδΜΙΙΕίΡ νΟΙΑΝίΚί^ΙΕ Κ^ίΝδΟΤΡΗΕ ν7Τ888ΝΜΜΕΚ ЕУЕУНЕРКРК ΕΕΙΚΥΕΕΝ8Ε ЬКРЬОУТОЬР ΝςνΚΑηίδΟΜ ЗРТКОЬУЕЗК ΑΙΗΚδΥΕϋνδ ЕЕСТЕААААТ ОВ81АУК8ЕР ΜΗΑςΡΚΑΝΗΡ РЬРРПШТНТ ΝΤΙΕΡΟΟΚΕΑ 8Ρ §20476660 71 ММААЬУРЗТО ЪЗСАЗЗЗЗЕР 88Ρ8888ΡΝΕ νΜΑΉΚϋνΚΕν ΚΕΕΝ'ΤΕΝΕΚΕ ΡΕΕΑΟΒΚΟΒΥ ΥΜΥΚΚΙΕΕΕΝ 886ΒΕΝΙΝ0ν ΟνΈΟΚΝΑνΤΙ ΤΙΕΝΕΝΕΒΙΕ рЕЕЕВУОС(}5 ΑΒΑΙΧνΑΙΒδ ΕννΟΑΥϋΙΙΧ ΝΗΚΡΚΚ38ΚΡ ЛУКЬМЕЮС}

- ΝΡΕΥδΤΤΜϋν ΑΡνίΕΑΑΗΒΝ ΜΥΕΙΕΤΜΣΕΚ СЗПУЗЬРКРНА УССЕСТЬСЗА ΚΝΚΚΡ8ΕΚΗ8 ΚΕΚΕΒΙΥΚΟΕ АЗРАЫМЬТЕ ΕϋΡΙΕΚΑΡΕΕ 8АПЕКЕЕ5ЕУ ΕΥΕΡΚΝΏΥΕΕ ЕАКрСКМРАК ΟΙΛΑρΑΚΝδΚΕΕΕνίΕΝΗΤδ 8ΒΕΡΕΒΚΚΟΕ ΕΕΕΚΜΝΕ8ΚΕ ΚΕΑΙΚΥΝςΚΕ РУЗС^ЫС!^? ЬМТУХУРСС^МЗ СУКБКРТСКК1МТУЕТУС1Г . \УРУЬ8ЕСУЫ АРКЗСДЧЖП ΗΤΡΡΜΚΡ1ΙΗ ' ОАЗУГТГЬЕЕ ΕΝΕΥδΕνΥΝΕ ΌΚΚΝΤΜΟΡΑΕ

ЕМВУЬЫЬХУ ΙΙΟΜΙ\ν8ϋΙΚ ΚΕΨΥΕΟΕΕΒΡ ΕΕΕ3ΚΝΟΕ8Ρ Ук№8ЬУЬАТЕ АЕКУУАНККР НЛЕАВЕКЛТО АГНРТЬУАЕС ЬГАЕАЫУЬБУ ЕЯЬРРМУТТЗ 81ЕСРЬ(}18М ΟΟΜΙ^ϋΡΟΚΓ ЬОМРЕЬУЕР8 РТЮЕТС^УВ КСУТЗОДКР СУО1РСЕ(^8 ΝΒΤΡΗ8ΡΙΟΤ СРАЕР\УУ1Р5 ЕАНУА1РУТБ РЗУСЕЕЕОЗР νΟΑνίΥΟΤΥΝ УУУУГУЕТКЕ ЕУАМЪНК8Р(2 ΕΙΑΝΗΕϋΚΕΨ КГАКАКЕ\УЕ8 УРВОКСТЕРР ΡΡΝΙΙΡ8ΡΚΤ 1СУМ185Е8К УЛСЗНТЗКСК V КОДИ 5 Ь КБ XV ΚΝΕΚςΚΚΒΕΝ УОКУМССЕУН КУБТЗМ^КМ ζ)8ΤΟ(^)ΑΤνΕΝ ΕΝΕΕΚΡΒΕ8Κ ПШЕНЮБЕС ΡΚ.Τ8ΚΥΑΜΡΥ ΡΚΝ §20546044 72 МА(}РУУЮШУ ΝΑΡΥΚΏΕΙΡΕ ШУКАЕЗЕБЗ

РЗЕКАУБШУ ЕКОВУАЗУКК 8БЕЕАЕПТК

ΙΝΙΝΤΙΟΡΕΟ ΡΤΑΣΕΙΑΙΕΝ ΕΝΕΕΕΙΕΕΕΕ 8ΡΝΥ УУСВАЕ ЕНА1ККЕУУО АУЕЕБЕННКК ΡδΟΕΚΧ^νΡΡΙ ЕБВКС^РЗЕРТ РВ1ТРПБАА ΗΤΝΝΥΕΙΙΚΕ БУрКОУЗУРК. РНЕУЯСИСУЕ СУЗЗЗОУВЗБ ΚΗ3Κ3ΚΕΝΙΥ ΚΑΕΑ3Ρ8ΕΙΑ БЗЗЕОРРЕТА РС^ВУ/ЕБС^ЕЕ ЗКУЕЫЕРКЗЕ ΥΕΕΕδΚρΰΚς ΡΑΚΌΒΕΏςΤΕ 88ΚΕΕΕΙΙΕΝ ΥΚΒΌΝδΕΙΕΕ (28ΟΝϋΕΑΚΕΚ БАЖУШ^КЕР УАРРИСРРЕЕ АЗКХУУВЕРРО ХУКККНХУАУКМ УТСРПСЕБР ΡνΡδνόΥΕίΑ РКЗРБбБРЖ КРР1КР1СНТ Α5ΥΕΤΡΕΡΕΕ ББАЗРИЮКЗ ВБШрСРРРТ ΐνΕΨΜΙΕΡΨν Ъ6Р1У/СЕ1Кр Μν/ΟΟΟΕςΌΥΙ ШЖУ/ЖМВРУ ΜΝ8ΕΥΕΑΤΙ3 ЕКГУАГУКУ8 ΑΕΝΡΕΕΒΨΌΜ ХУНРТБУАБАЕ РАИМРЗЗБ ΚΕΙ8ΕΡΤΑΝ3 НЕСРБСДЗЕС КМЕЕЕНЬКРЕ ПУСБУББАР ΑΝΟΕΝί^ΥΡΥ УЕЕТКОЬТСК

- 20 006603 §20881287 §2105420 §2119643 §2119644 §2136328

ΟΙΚ,ΰΕΚί^ΝΝΑ РЗТЕРЕТЕфЗ БГЖ1РСБ1К ΕΥνΤΝνΚΑ(2Η ΕΡΤΕΡνΟΑΤΜ ΡΟΤΥΝνίδΕν УБЕБЖШАММ ΝΝ3Υ(}ΕΙΑΒΗ ΑΌΙΕΨΚΡΑΚΤ Κίν/ΜδΥΡΕΕΟ ΟΤΕΡΤΡΡΝνΐ ΡδΡΚδΕΨΥΣΙ К\\Ч\\^ГТНЬСКК ΚΜΚΚΚΡΕ8Ρ6 ТЮУКТС^НКР. ΑΑΒΝΕΚλΗΗΟ Υί^νίΜΕΝΙΖ/Κ КУУААМ1К0А ΚΤΕΕΟΕΤΕΕΝ ΡΚΕΕΚ()ΟΙ88 РКРЕУБСБЕК. СЗКБЗТКЗЗА ΝΑδΚΕδδΝδΑ ϋδΏΕΚδϋδΕΟ ΝδΚΌΚΚΚΝΡδ БРОБТТБ1НР Κ.8ΑΑΙΑ5ΕΚΗ ЬПЗЫСЗАБУУ (^ΕΡΡΚΕΚςΚΚ νΝΡνΤΌΙΚΝΡ ΟΕΡΗΚΗδΚΟΝ ΑΑΕΟΝΑΝΟΙΡ ЗУЗЕБУАТ^ ΛΑΟΡΕΕΚΝΙζ) ЕЕЗКОБАЗКО ОЕ31РОБЗЕ(2 СУЕУОНКЕЮ4 тотиадуск КУСРРКЗЕКУ ννΕΏΤΎΡΠΡ КЕКНАКЕЕЭ8 δΙϋΥϋΕΝΕΡϋ ΤνΤΗΕΌΥνΤΤ КБ

МЗрЗРКРУТК КСОЗЕКААР6 ΑΟΤΚΚΝΕδΟϋ ΥΕΕΜΟΕΕΟϋϋ ΟΥΡςΕΡΕΡΡΥ 6ΥΥΡ8ΡΚ6ΝΕ ΝΚΕΤΗΚΚςΤΙ ΕΚΕΚΟΚΚΕΑΝ ΚΟΡΑΥΜΡΝΏΗ 3ΤδΕ3ΙΕΕΕΚ ΡΕϋΑΑΕΥΟΝΙ РУУККМБЕЕС ΗδΕΝΎΝΟνΌΥ МС(}]ЧАБ(1)ЕАУ ΑΝΕΗΕΕΙΊΈΕ ΙΈΚΚΕΝΕδΚν ООАБББА18К ΟΥΥΚΙΥΕΑΙΕ

ΝΗΡΑΡΑΕΟΚΚ ΕΑΤ8Ρ8(}8ΕΕ (ΧΡϋΡΥΑΥϋΕ ООТКРЗНЛУТ РПЬААНСОЕ ΥΕΐνΗΤΤΕΚΚ ΟΑΚΙΕΚΡΗΟΥ РСКСТЕСЗРК ςΚΗϋδΡδΗδΚ 8ΚΙΝΑΥΚΟΕΑ 8ΡΑΥΕ3Εδ8Ε ОРУМТАБЕЕ8

МЕБАУБАМЕ ΚΕΡΚΝΏΥΚΚΕ ЗМрСКОРУУО БЕЭБСЮТЕЕ νΕΑΙΕΝΟϋΑΕ ТКОРСЭРОКР ΝΕδΡΕΚΕΑΙΚ УЕУККГУАНР ΝΟΟΟΟΕΕδίν/ ΥΕΝΕ3<3ΕΚς(3 ТМАУКРБУУБ-АУАЮБРРЕА ЫУЛУСАРСЗК ΜΟΚ1ΕΒ.ΟΡΡΜ КРУАНААЗРТ ΙΡΕΟΕΕνΜΝΑ АБКЕЕОТКЕБ ΡΝΕΤδΤϋΝΑΚ <2ЬРКМКТ8СР ЗАУМЕМБПЗЧУ У1СМ1У/АЕСК ΕΙ\νΤ<26ΡΚΕΥ ΕΡΕΕΨ/ΝΜΕΠΡ ΟΜΕΑΙΡΑΑ3Ρ ΙΑΚΓΜΑΡΨΗΑ 8ΚΑζ)5ΙΙΟΑΝ ϋΤΕΚΏΕΤΚντ ΕΟΌΝνΚΥΥΝΕ ΑΚΙΚΨΏΡΤΏΡ (^ΙΙδΕΟΕΥΑΙ АУУЕЗРЗМА ΥΙΕΡΑΝΕ8ΡΟ РЕСД8Е6КТУ ΚΌΙΡΚΡΜνίΡΊΜνΡνΑΡΜΙΟ ΜΓΝΕΥδΥΥΙΟ ΑΚζ)ΝΕΑΓΤΤν ЕЕЗРКТБРУ/А 1РСЕЗЕУК8У νΤΝΥΝΗΚΡΙΕ ΝΙΟΥνίΥΟνΥ ΝνΤΜνίνΕΕΝ ΜΕΙΑΜΓΝ88Ρ ζ)ΕΙΕΟϋΑΏ\Έ У/КЕАЯАКБУ/Г 8ΥΈΕΕΟΡΤΙ-Ρ УРРИЕУРЗРК ЗЕБУБЪЕКЕК К^УМСЕЕК^ КОСРС^ЕОАЕМ ΝΚΚΝΕΕΚΚΓΟ Ι8Ο8ΗΕΏΕ8Κ ΡδΕΏΚΝζ^ΕΑΗ ΝΚζ)88ΤΚ.83Ε ΌΥΗΕΝ8Ρ3ΝΡ ΡΚ(2Υ(2ΚΙΜΚΚ ΕίκκγνΕςΑς ЮКЕЗБЕУЯЕ СЕБКЕ1К(}01 88ΕΚΥΕΕΕΕΕ

Κδζ^ΝΤΈϋΕΑΕ Б1ККБСЕКБ8 БЕРКЪЕЕЗКК

РЗСЕРЕБРУБ РАЕООЕЕББ8 ΝΑ8θνοανΕ\ν ςΚΚίΚΚΕΑΕΑ ΕΝΓΡΡΗΕΗΡΟ КЗЕЕОКУКХЕ ΥΕΕδΟΨΤΟΕΚ ΌΤζ)88Τν8ΤΤ ΕΑΕΡΥΥΚ8ΕΚ ΏΡ3Ρζ)ΕΡΡΤ(} ЕЕУЗУЗКОРТ ΟΕϋΕΟΜΑΓΡΟ ΗΕΥΏΕνΕΚΤΥ РРЗОААУСРБУ 0ЕУ0М6Р\У0Б ΗΨΡΕΌΤΥΟϋΡ ΚΟΙΥΏΟνΑΟΟ БРТБЕРО5ЕР ΡΕίΡΟΗΕνν/Ο ΡΝΗνδί^ΑΟΙΧ ЕБА88ОРРА5 Α8ζ)8ΑΕΓΓΕ8 Н8УУ()У(ЗУр\У КУЕСЗБНРБР ΡΟ8ΚΌ8ΕΑδΑ δΚΙΑΟΙΤΑΡν/ ЕАВУЗКЗРРО Т(5О8РУТК8С РР8ЕС^2Ь2 ΡϋΟΟΑΡΗΕΚΟ ТОЕБТКАББУ БКБСАУ/РРБУ ТНОШ^АХУЗ ККББОЗКБЗО АРБКАЗУУбС) РУАСЕТАЕЕУ КССУ(№КТЬ ЗБКРББАУРТ ΕΕΕΡϋδΑΑΚΚ МКБННУОС^Аб БЕЕЕТРААЗО 8УА(}А<ЗУ(ЗУ/К ς88ΏΚ0σ6Ν<3 АААЗКЗЗЕЕС} ЕААГ8РРСОК Ε(}ΕΡΑ()ΡΑ8Ι< НОАК6КОЗМК АК8БТ8КНЕБ Α8(}Οζ)ΕΤΙΙΚ ТКУК1РАЕХУК АЕРСС^НЗКТР 8φ(3ΝΚ8(2ΥνΤ ТБ\УЕАОУОКЗ ΕΕΝΕΟνδΟΕΝ ΑΕζ)ΝρΗΕΚΑ8 ЕЗКЕНКУТРР АСТЗТЗОРРЗ ΑΑΟΙΟΨΗδΚΕ НКУАС^УАКАС) НУКЕБУБАЕУ Τ3ΕΝΡΑΕ8ΕΕ УААБАУЮЛТЧЗ Р6ЕС6РХУУ У/Ν ТУС^АСБКОТР ЕКБОКЛАЕАА НКАОЕАРСУК ΕνΚΟΑλΤϋΚΕ КАУАрБНбМЕ ΌΡΤρΡΏΥΕΑΤ 3ΕΕΝΚΑ5ΡΡ8 УЗКСБЕБМБТ НУАКНОРМСН ΕΜνΑ8ΗΝΕΕ3 УК-ОАТККМте ЕО1РЕОСТУС ГбрББОМСОН УЗБАБСИЗАОУ УУУК81РУС8 ΕΕΕνίΡΥΕΙΚ ΚΑ(}ΕΝΙ<8νΕ(2 ОАККЕ(}ЕББ8 ζΙΕΕΨΚΒΕΕΡΟ СКЯ1РН .

ЗСЗУТБАОУО АУКОЕОББОРЕ РРКГКХРЗСБ

ЗРРЗЗХУОУК

ЕМЕР1ЧСЕ8С8 νΤΕΑΟνςν/ΚΟ ΕΟΕΕςΡΕΡΡΚ РККР8СБ8РР ЗЗУ/ОУК

МСРС1РСРКА ЕААУСТТНРР 88РОАУ/ЕС8<3 ЗОЗОРУОАРР Р8Р6ЕРР8У/А ΑΜΜΑΑΕΥΡ3Τ ΌΕδΟΑ8888Ε Ρ88Ρ8888ΡΝ ЕУМАБЮЗУКЕ νΚΕΕΝΤΕΝΕΚ ΕΡΕΕΑΟΏΚΟΌ ΥΥΜνΚΚΙΕΕΕ Ν880ϋΕΝΙΝΰ УОУЕОЮЧАУТ ΙΤΙΕΝΕΝΕϋΙ Εζ^ιχογσος кбмекк^ре узттмпуару ΙΕΑΑΗΚΝΝΥΈ 1БТМББК(}ОУ 8ЕРКРНАУОС ЕСТБСЗАКЖ КЭЗЕКНЗКРК БШУЕСЪАЗР ΑΕΙΜΕΤΕΕΌΡ ΙΕΚΑΡΕΕ3ΑΏ ЕКЕБЗБУЕУЕ ΡΚΝΌΥΕΕΕΑΚ (^СКМГАКЛЕБ Α(}ΑΚΝ8ΚΕΕΕ

- 21 006603 §3766191 §403460 §4200234 §4200238 §423149 §4336401 νΠ,ΝΗΤδδϋΕ РЬОККОЬЬЕЕ ΚΜΝΕ8ΡΕΚ1>Α ΙΚΥΝί^ΚΕΡνδ ςδΝΟζ)ζ)ΓΕΝΤ νΨΗ^ΜδΟΥΚ ККРТСКК1МТ νΈΤνΟΙΡΨΡν ЬЗЬСУЫАРК 89Γ6ΚΠΗΤΡ ΓΜΚΓΠΗΟΑ8 ΥΕΤΕΙΧΙΧΝΕ ΥδίνΥΝΕΟΚΚ ΝΤΜΟΡΑΕΕΚΙ ОУШЬХУПб М1У78ЫКК1ДУ УЕОБЕОГЕЕЕ δΚΝί^δΓνΜΝ 8ΈΥΕΑΤΡΑΕΚ УУА1ΙΝΚΓΗΟΓ ΑϋΚΚυΨϋΑΡΗ РТЕУАЕОЕРА ЕАЖЪЗУЕЖ РГМУТТ551Ь ОРЬСДЗМСОМ ЬрЭГбКРЕОМ ΡΙΧνΕΡδΡΤΙ ОЬТРЬУЛКОУ ΤδΚΕρΚϋσνΟ 1РСЕ(^8№Т РН8РЮТСРА ЬРУ/У1Р8ЬАН УА1ГУТКРЗУ ОЕЕЬРЗРУОА νίνθΤΥΝννν УТУЕТКЕБУА МЬНКЗРС^иА ΝΗΕϋΚΕ\νΚΡΑ ΚΑΚΕΨΕδΥΕϋ ΌΚΟΊΈΡΡΡΡΝ ПР8РКТ1СУ М188Ь8ЮУ1С 8НТ8КОКУКК. ζ)Ν8ΕΚΕν/ΚΝΕ ΚΧ^ΚΚΏΕΝΥςΚ умссьункуь τδΜκςκΜςδτ оратуешме ЬКРОЬЗКРКЯ ΕΙΚΟΙΕΟΓΚΤ 8Κ.ΥΑΜΡΥΡΚΝ

Μ8ΚΟΝΕΝΚΕΤ ЖВДТ1ЕКЕК ΟΚΚΙΑΝΚΟΡΑ ΥΜΡΝΏΗ8Τ8Ε δΙΕΕΕΚΡΙΌΑ АЕУОЬПРУУК КМЬЕЕСНЗШ УХСУОУМбрО АКТУАЛЕН ΕΕΙΤΕΣΣΕΚΚ ΕΝΕδΚνΟϋΑΕ ΙΛΑΙδΚΟΥνΚ ΐνΕΑΙΕΝΗΡΑ РАЕОККЪАТЗ РЗрЗЕЬррОО ΡΥΑΥΟΕΌΟΤΚ. ΡδΗΏνΤΡΙΙί ААНСрЕУЫУ НТЬЬККСАК1 ЕКРНОУРСКС ΤΕΟδρκρΚΗϋ 8Ρ8Η8Κ3ΚΙΝ АУКСЬАЗРАУ ЬЗЬЗЗЕОРУМ ТАЕЕЬЗКЕЬА УЬАМЕКЕРКХОУККЕЗМРС КБРУУОЕЕББ СЮТЕЕУЕА1 ΕΝΟϋΑΕΤΚρΡ ΟϋΡΟΚΡΝΕδΚ ЬКЕАГКУЕУК КРУАНРЯСРО Эьь81У/теж заиадтмАУ кгьууеауа1 ОЬРГЬАХЛУЧУ САРС8КМ6К1ЬКХЭРРМКРУА НАА8РТ1РЕС ΕΕνΜΝΑΑΟΡΓ ЕбТКЬЬРИЕТ δΤΟΝΑΚςΕΡΚ МКТ8СР8\УМЕ МЕП8\УУ1СМ ШАЕСКЕЖТ рОРКЕУЪРЕЬ У/ХМЬЭРСМЬА ΙΡΑΑ8ΡΙΑΚΡ ΜΑΡΨΗΑΞΚΑς 8ΠΏΑΝΏΤΕΚ ΌΕΤΚνΊΈΟϋΝ νΚΥΥΝΣΑΚΙΚ ЧУОРТЭРрПЗ ЕОЬУА1АУУЕ 8Ρ8ΚΙΑΥΙΕΡ ΑΝΕδΡΟΡΙ^Ι ЗЬСКТУКХИР КГМУ1Р1МУР УАРМЮМГЖ Υ8ΥΥΙΟΑΚ(}Ν ЕАРТТУЕЕ8Р ΚΊΧΕΨΑΙΕΟΕ 8ЕУК8УУП4У ΝΗΚΓΙΕΝΙΟΥ УЬУОУΥΝΥΤΜ У1УЫ,ММ1ДА ΜΙΝ88Ρ0Ε1Ε ООАОУЕ^УКГА КАКЬАУРЗУЕЕ ΕΟΚΤΕΡνΡΡΝ ЕУРЗРКЗЬЬУ ЬЬЕКРККАУМС ΕΠΟΟΟΚ^ΟΡ (^ΕΟΑΕΜΝΚΚΝ ЕЕККРС18С8 НЕОЬЗКРЗЬО ΚΝΟΣΑΗΝΚςδ 8ΤΚ.88ΕϋΥΗ1, Ν8Ρ8ΝΡΡΚ.0Υ ςΚΙΜΟΕΙΚΚ УУИ^АРЮКЕ δϋΕΥΝΕΟΕΕΚ ΕΙΚ0ΟΙ85ΕΚ

ΥΕΕΕΕΕΚδρΝ ТЕОЬАЕЫКК ЬСЕКЕЗЕЕРК ΕΕΕ8ΡΚ

ОКЬЗЕЕЗРКЬ ЕСХОМКАНС КЕКЬРСРКЯР ЗСЕЗЕРЗЗТО УКНУРРКрУН РУР8УЕТОРН КАбрАСЕЕЕЬ Т88УРРТ8АР РКС\УО ΥΚΚΌΟ рА^/РТЬЗЗРК ΟΕΝΚΡΑΡΕΡΚ РРАНР18рРр КУЕСЬГУССР! ΕΕΑΜΚλΤΑΥδ ЗЬРОАОТМЕУ РУЕУЕРЕАЗЬ АУСЬПСКрКР Η^νΈΥρίδΗΣ ΥΚΟνίνΟΝΕΕ ЬНРОСКЕТОТ ΙΡΡΕ8ν/νκρΝ ЗЬУОРРРОТЕ ЗКЗУАЕЕРКЬ ЕС8САМ8ТЕН ТУЕКРАУ5Н1 УНРОУКЕКТН ΡΕΟΝνΓΝΚΚΚ ΕρΚΚΙΕΚΤΡΝ РЕСАЪНЗАРЗ РЗЬРРРЕКСТ ΟΚΣΡΡΥΕΟΕΏ ОРЬРУАбАЕМ ΡΕΡνδΡΕΝΡΗ тет^рррсст κ.8ϋεΝΡΕκ.ορ шзаезнзь РТСЬЗМРЕ

МААЬУАСТКС НРКРРРЕАЕЗ рОррЬСКЕСК 1АНРУУКСТУ СКТЕУрОЕКЬ ΕΟΝΟΤΙδΑΗΟ ΝΕΗΕΡΟδδϋδ РА888КУАО1 ΤΟΙΚΤΝΤΙΟΚ КСАрКУрЬУО ТРКРСрУСЬП ГААНСЫКСР КСТМЗЕККУС РРУЗСЕрСКр рСАРЭЕКБОК ККУОСКЬЬС^ ЕСТЬЗУКЕУЕ РКТКЕРККНЕ 3338КАСНРЕ КЕРУЗКЬЗОО СНУИБрКТЕЗ Τ83ΙΡΝΕΙΡΚ ΚΚ8ΚΓΕ8ΙΤΤ ΝΟϋδΡδΡΌΕΑ ΕΌδΡΟΤϋΗΡν ПАРЕКЕЕУА ТЕККМЕНрКЕ ςΜΙΕΕΚΕΚΚΙ ΤΕΕΚΑΒΡΡΥΡ Ε30ΜΕΑΚΜΝΡ МЕКТНКЕУТЕ ΡΕΡΑΚΝΚΕΕΕ ΚΡΑΑΑΕ8Κ5Κ КЗЕК8СА1Т8 Ρ

МААЬУАСТКС НрКРРРЕАЕЗ-рСррЕСКЕСК 1АНРУУКСТУ СКТЕУРрЕКЬ ЕСЬЮПЗАНС ΝΕΗΕΡΟ83Ο8 РА388КУА<31 ТС1КТЫТ1СК КСАрИУрЕУб ТРКРСрУСМ ΙΑΑΡΙΟΝΚΟρ КСтаЗЕККУС РРУЗСЕрСКР ρΟΑΡΟΒΚϋΩΒ. ΚΚνϋΟΚΕΕσν/ ЕСТЕЗУККУЬ рКТКЕрККНЕ ЗЗЗЗКАОНрЕ КЕрУЗЯЬЗСС ΟΗΥΝ8Ρ8ΡΏΕ АЬОЗРОТОНР УПАРЬКЕЕУ АТЬККМЕНрК ЕрМГЕЕКЕКК ГГЕЬКАОРрУ ΡΕδρΜΚΑΚΜΝ РМЕКТНКЕУТ ЕрБрАЕМКЕЕ ЕКрАААЕ8К8 КК8ЕК8СА1Т 8Р .

РРРРРРЕТЕ8 С8УАЕАСУр\У СОЕСЗЬКЗРР РО38О8РА8А 8К.УАО1ТОМН ННТрШРУРБ УЕТбЗНМрЬЗ ϋδΤίνίΤΤΑΡ ΝΑΚΙΤΑΕΑΡΚ ОЬРРРРРРРР

ЬРЕЕРКМЕСК СМТЗАНСИЕС ΚδΟδδϋδΡΑδ

- 22 006603

А8КУАС1ТОТ СННАСД-ЗРРГ §4336402

ЪРЬЬРКМЕСК. СМГЗ'АНСЫЪС КЗОЗЗЛЗРАЗ

А8КУАС1ТСТ СИНАС^Ь §4379098 85

ΜΟΙΕΌΕΕΝΜ8 ЗЗбТЛУКЕЖЖЛЖЗРКЛС 8ТРО?СЕО8<2 ίδΝΟΟΟΟΟΡΟ ΡΚΚΡΕΕΕΟδΝ СНЗКУКЬККК ККТРОРУЕРК ΝΑΕΜζΟΓΕΙΚ РОЬС^ТЫ^ ТОРУНАРЬРУ МЗУЕХТ^УР ЕО8СРТКККА КЕНААЕКАЖ 8ΡνςΡΡΝΑ8Ε ΑΗΣΑΜΟΚΤΕδ УЖЛРТЗЛРА ΏΡΡϋΊΕΡΝΟΡ ЕТРЛКАЕРРР УУСЗКОЛЛЗР ЗЗЗОЛЕЗЕЗА ЗРУРАЗЬАрР РЬРУЬРРРРР Р8ОКМРУМ1Ь ЖЕКРОЬКУЛ РЬ8Е8ОЕ8НА К8РУМ8УУУЛ Οζ>ΡΡΕΟ86ΚΝ ΚΚΕΑΚΑΚΑΑς 8АЕАА1РЖН ЕЛ(}ТР8К.(2Р1 Р8Е6Ь(}ЬНЕР (^УЬАОАУЗКЕ УЬСКРСПЬТЭ ΝΡ88ΡΗΑΚΚΚ УЪАОУУМТТС τυνκϋΑκνίδ узтоткспчо еумзокоьаь ЫЛСНАЕПЗК. КЗЬЬКРЬУТр ЕЕЕУЕХЖЛЛ ()ΚΚ.8ΙΡ(2Κ8Ε ΚΟΟΡΗΕΚΕΝν (^РШЛТЗТЗР ССЛАК1Р8РН ЕР1ЬЕС8Я8У ΤΟΑΟνςΨΟΝΗ С8Ь(2РКРРСЬ ЕЗЛРЗТЗТРО СЛОТТЕР АЛЯ ΗΡΝΚΚΑΚΟςΕ К.ТК1Е8ОЕ6Т ΙΡνΚδΝΑδΙΟ ТУТСУьроЕК. ььтм8С8ЛК1 ΑΚΨΝννοιςο 8ЬЬ81ГУЕР1 УРЗЗКЕОЗЬ УНСЛНЬЗКАМ УрРИЗМЕЛЬ РРЬУТЬККРЬ ΕδΟΙδΝΑΕΑΚ (^ΡΟΚΑΡΝΡδν Ν\ντνθϋδΑΐΕ νίΝΑΤΤΟΚΕΕ ЬСКАЗКЬСКН АЬУСКЛУХАСА ^ОЗЬРЬТТЬ ζ)ΏΥ<3Αζ)Κ.νΡ §4504601

ΜΙΧδΟΝΑΓίν КЗЫиУЕМУУ ΙδΙΥΓΟΙδΥΠ ЗРЛУТЛЕЗСТ ΡΚΙ8ΕΡΝΡΚ8 ΙΕδΧΥΕΕΚΝΗδ ГУРТЬГУТТЕУ ТШЗКРЕЛЬК νΥΚΝΟΑΝΤΤΚ. ЗРСЛЬТОЕХУК ЗТНЕАУУТУЬ ΕΟΡ3ΟΝΤΤΕΡ ЗСЗНЖУТА! ЛМ8РЕРРЕРЕ ΐνΟΡΤΝΗΙΝν МУКГРЗГУЕЕ ЕЬ(2РЛЬ5ЬУ1 ΕΕςδΕΟίνΚΚ ΗΚΡΕΙΚΟΝΜ8 ΟΝΡΤΥΙΙΕΚΕ ΙΡΝΤΝΥΟνδν УЕЕНЗЛЕС^АУ ПСЗРЬКСТЬЬ ΡΡΟ(}Ε8Ε3ΑΕ δΑΚΙΟΟΠΤν ΓΕΙΑΕνίΤδΤ 1УТЬКУДСУ1 СЫШЗЬРКУЬ ^ΟΕΤΚΟΨΝΑ νΑΙΗΚΟδΗΝΑ Ы^ЕТРЕЪКС} 88СЬ8ГР88№ ОУККА8ЬСР8 Л §4507277

МРЬААУСУЬЕ УУОКСЗУОЕУ ТЬУКНККВСК (^ΥνίΚΚΙΝίΚΝΑδδΚΕΚΚΑΑ ЕС^ЕАСЗЬЬЗфЕ ΚΗΡΝίνΤΥΚΕ ЗУ'ЪОСЛСЕТУ ГУМОРСЕООЛ ЬУККЬКЕ<2КО (^ΕίΡΕΝζίννΕ Ψ/ΕνρίΑΜΑΕφ ΥΕΗΕΚΗΙΕΗΚ. ЛЕКТРИУЕЕГ ЯТМЖУООЬ

О1АКУЬЕЖС ЛМАЗТЫСТР ΥΥΜ8ΡΕΕΡ3Ν ΚΡΥΝΥΚδϋνχν АЕОССУУЕМА ТЕКНАГНАКЛ ΜΝδΕνΥΚΙΙΕ ОКЕРАМРКЛУ ЗРЕЬАЕЫКТ МЬЗККРЕЕКР ЗУЕЗШК^РУ ΙΚΚςΐ8ΡΡΕΕ ΑΤΚΙΚΤ8ΚΝΝ ΙΚΝΟϋδςδΚΡ РАТУУ8ОЕАЕ 8ΝΗΕνΐΗΡζ)Ρ Εδ8ΕΟδ()ΤΥ1 ΜΟΕΟΚΟΕδςΕ ΚΡΚΑ8ΟΕΕΚ3 РА8ЕКАНТСК (ЗЛЕЗКТТЕЬА ПЗЗУЪПЛП. РАКОКЛ8У8Л ΟΡνςΕΝ(}ΡΙ<Υ ΕϋΑδΝΕΕΟΟΙ С818(уУЕЕЕМ ΕςθΝΤΚ88Α(} РЕЖ1РМХУ88 ϋΐνΤΟΕΚΝΕΡ УКРЪрРЫКЕ (даКЛС^ЗЕАЛ 5РКЕЕС5ОТ1 ΕΑΗδΝΕΚϋΕΟ 88ЛЗРА8А8К УАО1ТСУСНН ΑςϋςνΑΟΕΟΙ ιεκ^οκιηρο ΕζίΡΗΝδΟδΕΡ δΕδκςκκρκκ КЕС2ТЕНК.СЕК Ж^УЖЛЕЕАГ ςΕδΡΡΕΕΕΡδ ΗΡίνοκνυντ 8Τ(}κεαεν(2κ κνντοενδδδ К85ЕМ888КЛ ΚΡΕ3ΑΚΕΚΚΚ ΕΚ.ς)8(2ΕΕΜ88 ЗОРЗУККАЗЛ ЗУАСРСКРС^Е ЕЛрРЛРАККЛ 88ЛС8УТ(}ЕК КРШСЬЗЕЛЕ Ь888Т88ТЛК ЗЛОЛУСЕОКС ζΧΓΝΕΙΝΑΕνζ) ЛМТС^ТЕКЕЛЗ КЕЗСЕЛУРУА ЫРУЗЕГКЬНК КУКЛТЫЕНС КУАЕЕАЕЕ1Н РКЕЛРЗА1МР 63ЕК1ККХУЕ УЕЯТЛУИЮЛ ОУОЛЛЕрУУЛ ЕЛЕЕЕЛЕРЛН ЕУКЕРЕНМСЕ КУТТУЗУКАК ζ)ΕΚΓΡΕΕΝΜΝ Е §4507685 88

ΜΜΑΑΕΥΡδΤϋ Л8СА8838ЛР 88Ρδ888ΡΝΕ УМАЛКЛУКЕУ ΚΕΕΝΤΕΝΕΚΕРЛЛАСЛКОЛУ ΥΜνΚΚΙίΕΕΝ δδΟΟΕΝΙΝΟν ЛУЛОЮ<АУТ1 ΤΙΕΝΕΝΕϋΙΕ СМЕЛЕЛ ΥΟΟ(}Κ ΕΜΕΚΚ^ΝΡΕΥ ЗТТМЛУАРУ1 ΕΑΑΗΚΝΝΥΕΙ ЛТМЛЛКрЛУЗ ЛРКРНАУОСЕ СТЛСЗАКЫКК Л8ЛЯНЗКЕКЕ Л1УКСЛА8РА Л1МЛТЕЕЛР1 ЛКАГЕЛ8АЛЛ КЕЕ8ЛУЕУЕР КМЛУЕЕЛАКр СКМГАКЛЛЛА (^АКЯЗКЕЕЕУ ΙΕΝΗΤ83ϋΕΡ ЛЛККСЛЛЕЕК ΜΝΕδΡΕΚίΑΊ ΚΥΝρΚΕΓΥ8ζ) δΝΟί^ΡΕΝΤν ν/Ε6ζ)Μ8ΟΥΚΚ. КРТСКК1МТУ ЛТУСНРХУРУЛ ЗЬСУЫАРКЗ (^ΓΟΚΠΗΤΡΓ ΜΚΓΙΙΗΟΑ8Υ ΡΤΡΕΕΕΕΝΕΥ ЗЛУУЖЛККЯ ТМСРАЬЕШЛ ΥΕΕΙΕΨΙΙ6Μ ШЗЛГККЛХУУ ЕСЛЕЛРЛЕЕЗ ΚΝζ)Ε8ΡνΜΝδ Ε УЛАТЕ АЛКУ УАНЖЕНЛЕА ЛККЛТОАРНР ТЕУАЕОЕРАР АМУЬЗУЬКЕГ ΡΜΥΤΤ88ΙΕ6 РЕС^ЗМОС^МЛ РЛРОКРЕСМР ЬЬУЬГЗГТЮ ЬТСЗЬУЛКСУТ 8КЕ(2КЛСУ(л1 РСЕС^ЗЫЛТР ИЗРЮТСГАЛ ΡΨΥΙΡ8ΕΑΗν ΑΊΡνΤΚΡΒΥΟ ЕЕЕ138РУСАУ 1УСТУКУУУУ ГУЛТКЛЛУАМ ΕΗΚδΡςΕΙΑΝ НЕЛКЕХУКГАК АКЛХУЛЗУЕЛЛ КСТЛРРРРМ 1РЗРКТ1СУМ 138Л8К\У1С8 НТЗКОКУКЖ} ΝδΕΚΕΧΥΚΝΕΚ

- 23 006603 §4507687 §4885373 §5730102 §5802234 §6005868 §604969 ςκΕΟΕΝΥςκν мссбункует δΜκςκΜςδτο (^ΑΤνΕΝΕΝΕΕ ΚρϋΕ8ΚΓΚΝΕ ИШББ6РКТЗ ΚΥΑΜΡΥΡΚΝ '

МЕС8Р8ЕЕХМ ГУМКЕКОКРр ΑνΚΟΡΑΓΜΚΝ ΏΚΟΤ8ΕΤΑΕΕ ЕШТРААЕУО МРУУККМБЕ ' ΕδΚΤΕΝνΝΟν ΏΥΜΟρΝΑΙ,ρΕ АУОЫЕНБЕУТ ΕΕΕΕΚΚΕΝΕΑ ΚΙΟΏΑΕΕΕΑΙ ЗКСУУШУЕА

ΙΕΝΗΡ6ΕΑΑ8 ККЬТЬЗРСЕр ΕΕρϋϋϋΡΥΑΥ ϋΕΟΟΤΗΓδΡϋ 1ТРПЕААНС рКУЕУУНМЫ. ΜΚΟΑΚΙΕΚΡΗ ОУРСКССОСМ ЕКрКНОЗРЗН 8Κ.8ΚΙΝΑΥΚΟ ЕАЗРАУБЗЕЗ ЗЕОРУБТАЕЕ Ε5ΝΕΕΑΚΕΑΝ ΙΕΚΕΡΚΝΟΥΚ КЬЗМрСКПЕУ УОУЕОЕСКОЗ ΕΕνΕΑΙΕΝΟΟ ЕЕЗАЕРБЕУН КНКАЗЕ8РУК ЕА1КУЕУККР ΥΑΗΡΝΟΡΡΡΙ. ΕΤίν/ΥΕΝΕδΟ ЬКЕрТ1А1КС ЕУУЕУУАЕОБ ΡΓΕΑΙΟΥΨΙΑ РС8КЕСК1ЕК ЗРРМКЕУАНА А8РПГЕСЕЕ νΓΝΑ8ΟΚΓΕΟ ΙΊΤΕΡΝΙΤνΤ ΟΥΡΚρίΕΚνΚ ТТрЕТХУТЕМЬ 1МУ У/УЕОММУ/ ЗЕСКЕБУ/БЕС ΡΗΕΥΊΕΡΕΨΝ УЕЮГОМБ81Г 1ААРТАКЕЕА ЕБРАТКАррУ УИЗУУ СВЕЗЕТ ЗЕУТЕРРЕК} УРТУАШЖУ/Е РЗОРрПЗЕС ЕУА1АУУЕ8Р 8ΚΙΑΥ1ΕΡΑΝ Е8РОРЕ(}18Е ОКТУКО1РКЕ муеямугга ρμιομριευε ΥΥΕΟΑΚνΝΑΑ РТТУЕЕ8РКТ ЕРУ/81РСЕ8Е УТЗУУБКУОН ΚΓΙΕΝΙΟΥνΕ УОГУИУТМУУ νΕΕΝΜΕΙΑΜΙ ΝδδΥρΕΙΕΟϋ ЗЭУЕУ/КЕАКЗ ΚΕν/Ε5ΥΡΟΏΟ КТБРРРР8ЕУ РЗРКЗГУУН ΜΚίνΝΡΡΚΟΚ. ЮЧадКШЕМ ΟΜΟΝ5Κ3ΚΕΝ ΕΓΤ(25Ν8Ρ.νΡ Ε3Η8ΡΝ8ΙΕΝ ρΡΤΚΥς(21ΜΚ КБ1КК.УУЕКА ρνϋΚΕΝΏΕνΝ ΕΟΕΕΚΕΙΚ(}ϋ 188ЬКУЕБЕЕ ОК8(2АТЕЕБА 1Б1НКБ8ЕКБ КРЗМЕКСЕ

МЗЕТУРРАРА А8ААРЕКРБА ΟΚΚΑΚΚΡΑΚΑ АААЗКККРАО Р8УЗЕБ1У(2А АЗЗЗКЕКОСУ ЗБААЕККАЕА ΑΑΟΥΟνΕΚΝΝ 3ΚΙΚΕ6ΙΚ8Ε У8КОТЕУС)ТК ΟΤΟΑ8Ο8ΡΚΕ ΝΚΚΑδδνΕΤΚ РОАЗКУАТКТ КАТОА5ККЕК КАТОАЗККЗУ КТРККАККРА ΑΤΚΚ55ΚΝΡΚ КРКТУКРККУ АК8РАКАКАУ КРКААКАКУТ КРКТАКРККА АРККК

МЗОЗРАГОРК КО85РКОААО ΑΑΑΡΛΝΕδςϋ ΥΕΕΜϋδΕΕΟΕ ЭССР(?АРБРС УОУУРСРКСЗ ΌΝΡΕΑΗΚΡ.ζ)Τ УБКЕКОККБА ΝΚΟΡΑΥΜΡδϋ ΚδΤδΕδΙΕΕΕ ΚΡΕϋΑΑΕΥΟΝ 1РУУККМБЕЕ СНЗБНУЯСУО ΥΜΟ(}ΝΑΕςΕΑ УАКЕНБЕПЕ

ЕЕБККЕЫЕЗК. У6ОАБЕЕА18 КОУУЕ1УЕА1 ЕЗНРАРАЕОК КБАТЗРЗрЗЕ Εί^ϋϋΡΥΑΥΌ ΕΌΟΤΚΓδΗϋν ТРПБААНСР ΕΥΕΓΥΗΤΕΕΚ КОАЕ1ЕКРШЭ ΥΡΟΚΟΝΌΟΝς К(}КНО8Р8НЗ Κ8ΚΙΝΑΥΚΟΕ АЗРАУЪЗЕЗБ ЕЦРУМТАБЕБ ЗЫЕБАУБАМ ΕΚΕΡΚΝϋΥΚΚ ЕЗМС^СТОРУУ СЕЕОБСРЖЕ ΕνΕΑΙΕΝΟϋν ЕТБрЗСОНСК ΡΝΕ8ΚΕΚΕΑΙ КУЕУККРУАН ΡΝΟζ)ζ)ςΕΕ8Ι У/УБЖЗСБКР ОТМАУКРБУУ ЕАУАЮБРГЕ АЕ1УЛУРАРСЗ ΚΜΟΚΙΜΚΟΡΡ МКРУАНААЗР ΤΙΡΕΟΕΕνΜΝ ААВКЕЕОТКБ ΕΡΝΕΤ8ΊΌΝΑ К(2БГКМК.Т8С Р85УМЕМБП8 \УУ1ОМ1У/АЕС ΚΕίν/Τί^ΟΡΚΕ ΥΕΓΕΕν/ΝΜΕϋ ΡΟΜΕΑΙΡΑΑ3 Р1АЯГМАРХУН А8КАР81ЮА КОТБКПБТКУ ΤΕΟϋΗνΚΥΥΝ БАЯ1КХУПРЗО РС^ПЗЕОБУА 1АУУЕ5Р8К1ΑΥΙΕΡΑΝΕ3Ρ ΟΡΕί^ΙδΕΟΚΤ νΚΏΙΡΚΡΜνί Р1МУРУАРМ1 ΟΜΡΝΕΥ3ΥΥΙ ΟΑΚ(}ΝΕΑΓΤΤ УЕЕЗРКТБРХУ А1РОЕ8ЕУК8 ννίΝΥΝΗΚΡΙ ЕМбУУЕУОУ ΥΝΥΤΜΥΐνΕΕ ΝΜΕΙΑΜΙΝ88 Р0Е1ЕПОАОУ ΕΨΚΡ АРАКЕ \У РЗУРЕЕОКТБ РУРРЫБУРЗР КЗБРУБББКЕ ККУ/18ЕБГОС ΗΚΚΟΡςΕΟΑΕ ΜΝΚΙΝΕΕΚΚ1 ΟΙΕΟδΗΕϋΕδ ΚΙδΕΏΚΚςνΟ ΗΝΚ(2Ρ5ΙΚδδ ΕΌΡΗΕΝ8ΚΝΝ РРК.(2УС2К1МК КЫККУУЕрА (ДОКЕЗОЕУИ ΕΟΕΕΚΕΙ^ϋ 138ЕКУЕББЕ ΕΚ3ζ)ΝΤΕΟΕΑ ЕБ1КЕЕСЕКБ 8ΜΕΡΝ()ΕΕΤΝ К

ЗРВРРАЗАЗр УТ61К.

МАЗЕ8КАБКУ АААНРКС^ЗРТ ΚΟΜΟΡΟΝΕδδ ААОРТАЕК8У ΡΥςΚΤΕΚΕΟς СТ8УУАРСР8 ΚΡΕΡδΤΑΝνν УЮООЗЬОСр ТЪУНЕАКБОМ ЗОАУББЕКЕК ЬТЗСГПУНТА ОЬЬ^рЬКРЗО УЕУЕЕЕАНТК К.УУ8КЕЕЕЕЕ ТОШТОУЛрИ ΟΟΕΡΙΑδΝΚς КБОЕУКЯЕМЗ ЕОКАУОУЕЗН УБЗРАЕТКТБ ΥΡΕΜΝνϋϋΕΥ ОТЕУУРНЛОТ МОРАОТСТТБ ΑΚΑΑδΑΚΟΑς νΐΕΝΟΡνΤΟΙ κνν/τοορονκ ЕУАСУЕтрно δίρτροννΝΟ АОУХУАЗАУСК МАОУКУРБУА МННАУУУТЕК 1ЕО^8РТБЕ РТБЕУЗОТУЗ ΑΗ0ΝΕΚΕΡΟ5 8Ν8ΚΑ8Α8Ην АО1КСАКННТ КБ1РРС1БУЕ ТЕРННУАКАО ΕΕΕΕ38ΟΝΡΡ ΙδϋΡρδΑΚΙΤ 6У5ННА

ЕЕАУУЕЕАУАТУ ΕΟΕΕΟςΚΕΑΑ РГОУУТСКПЕ

ОЕУСНЕУУРК 8Е8К8УАС)8С У(^СОУ53Б(2

РЕРРК.СРАР8 80

- 24 006603 §6650810

МЕТЕЗСЗУАС? Αθνςν/ΗΝ1Ό3 ЬРРРРЗКЬКС) ЬЗУЬЗЕРЗЗХУ ЭУКСТРРНРА ΝΡΣΥΡΝΚΟΟΙ ЗРССРОШРТ РКЬТОЗТНЬО Ь8КС §6665594 97

ΜΑςΡΥΥΚΡΝν ΝΑΡΥΚΒΚΙΡΕ ЮУКАЕЗЕЕЗ Ρ8ΕΚΑΥΙ-ΝΑV ΕΚΟϋΥΑδνΚΚ 8ΕΕΕΑΕΙΥΡΚ ПЛИСЮРЬС ΚΤΑΕΣΙΑΙΕΝ ЕНЬЕЫЕиЬ ЗЕКУУУСОАЬ ίΗΑΙΚΚΕννΟ ΑνΕΕίΧΝΗΚΚ ΡδΟΕκςνρρι ιχοκςρδΕΡΤ рэгтриьаа ΗΤΝΝΥΕΙΙΚΙ, ЪУ()КСУ8УРК. РНЕУКСМСУЕ σνδδδϋνϋδΣ янзкзкерлу каьазрзыа ЬЗЗЕОРРЬТА Ρ()Ε8λνΕ1,ζ)ΕΙ- 8ΚΥΕΝΕΡΚ3Ε УЕЕЬ8К.С)СК(2 ΓΑΚΟΕΙ-ΟςΤΚ. δΒΚΕΕΕΙΙΣΝ ΥΚΌΌΝ3ΕΙΕΕ (^δΟΝΌΣΑΚΣΚ ΣΑΐΚΥΚςΚΕΡ УАС^РКСС^ЬЬ Α8ΚΨΥΌΕΡΡΟ ХУКККНХУАУКМ УТСРПОЬЕР РУЕЗУСУЫА РКЗРЬбЬПК. КРПКЯСНТ ΑδΥΣΤΕΙ-ΠΧ ΕΕΑ3ζ)ΗΙϋΚ.δ ΟΣΝΚςΟΡΡΡΤ ΐνΕΨΜΙΙ-ΡΧνν ΙΌΓΙΨΟΕΙΚ() Μν/ΏΟΟΕςΟΥΙ ΗΟΧνν/ΝΙ-ΜΟΡν ΜΝ8Ι-ΥΙ-ΑΤΙ8 ЬКХУАГУКУЗ

ΑΕΝΡΚΕδΨΏΜ ХУНРТЕУАЕАЕ ΡΑΐΑΝΤΡδδί ΚΕΙ8ΕΕΤΑΝ5 НЬОРЕСДЗЬС ΚΜΕΕϋΙΕΚΡΕ Е1УСЬУЬЕАЕ ΑΝΟΣΝΟΕΥΕΥ УЕЕТКСЬТСК σίΚϋΕΚςΝΝΑ ЕЗТЪЕЕТЬРЗ ΕΡΥ/δΙΓΟΕΓΝ ΕΥνΤΝνΚΑΟΗ ЕРТЕРУОАТМ ΓΟΤΥΝνίδΕν νΕΕΝΜΕΙΑΜΜ ΝΝδΥΟΕΙΑΏΗ ΑϋΙΕΨΚΡΑΗΤ КЬХУМЗУРЕЕС ΟΤΕΡΤΡΓΝΥΙ Ρ8ΡΚ8ΕΨΥΕΙ

КХУШТНЕСКК КМКККРЕЗГС ΤΙΟΚΚΑΑϋΝΙΚΚΗΗςΥί^ΕνΜ КЖУККУУАА ΜΙΚΌΑΚΤΕΕν ΑΚζ>()ΑΑΟΡΕΕ ΚΝΙΟΣΕδΕΟΣ Α8Κ.αϋΕ31ΡΟ Ь8ЕС)СУЕУ1)Н ΡΕΡΝΤΏΤΕΟΕ ()УСКРУСРРК ЗЕКУУУЕОТУ ΡΙΙΡΚΕΚΗΑΚ ΕΕΟδδΙϋΥβΣ ΝΣΡΏΤνΤΗΕΟ ΥΥΤΤΚΕ §6665596 98

ΜΑ()ΓΥΥΚΚΝν ΝΑΡΥΚΒΚΊΡΕ ШУКАЕ8ЕЕ8 ΡδΕΚΑΥΈΝΑν ΕΚΌϋΥΑδνΚΚ 5ΕΕΕΑΕΙΥΡΚ ΙΝΙΝΟΌΡΕΟ ΚΤΑίΣΙΑΙΕΝ ΕΝΕΕΣΙΕΕΕΕ ЗГКУУУСОАЬ ЕНА1ККЕУУС ΑνΕΣΕΕΝΗΤΕΚ 121 ΡδΟΕΚςνΡΡΙ ΣΕΟΚςΡδΕΓΤ ροιτριιςαα ΗΤΝΝΥΕΙΙΚΙ, Σνςκονδνρκ РНЕУКСКСУЕ СУ888ОУО8Е ΚΗ3Κ3ΚΕΝΙΥ ΚΑΣΑ8Ρ3ΕΙΑ ΣεδΕΟΡΕΣΤΑ Εζ)Ε3ΨΕΕ()ΕΕ ЗКУЕЫЕЕКЗЕ ΥΈΕΣδΗςεκς ΓΑΚΟιχηςτκ δδΚΕΕΕίΐΣΝ ΥΚΟΏΝδΣΙΕΕ ζ)8ΟΝΏΕΑΚΙ,Κ ΣΑΙΚΥΚςΚΕΡ УАРРЯСС^ЬЕ ΑδΚν/ΥΒΕΓΡΟ ΨΚΧΧΗΨΑνΚΜ УТСР1ЮЕЕР РУГЗУСУПА РКЗРИЭЕПВ К-РГ1КР1СНТ ΑδΥΕΤΕίΡΣΕ ΣΕΑδςΗΙΟΚδ ϋΕΝΚςΟΡΡΡΤ ΐνΕν/ΜΙΣΡΨν ΕΟΡΙΧΥΟΕΙΚς Μν/ΏΟΟΕΙ^ΥΙ ΗΟΨΨΝΕΜΏΕν ΜΝ8ΕΥΕΑΤΙ8 ЕЮУАЕУКУЗ ΑΕΝΡΚΕ8ΨϋΜ ΧΥΗΡΤΕΥΑΕΑΙ. ΓΑΙΑΝΙΕ33Ε ΚΕΙδΙΤΤΑΝδ ΗΣΟΡΕρίδΕΟ ΚΜΕΣΟΙΕΚΕΈ ПУСЬУЬЬАГ ΑΝΟΙΓΕΙ, УГУ УЕЕТКСЕТСК ΟΙΚΟΕΚςΝΝΑ ΓδΤΣΓΕΤΕςδ ΣΕΧΥδΙΓΟΕΓΝ ΕΥνΤΝΥΚΑφΗ ЕЕТЕГУСАТМ ΓΟΤΥΝΥΙδΕΥ νίΧΝΜΙ,ίΑΜΜ ΝΝδΥρΕΙΑΚΚ. ΑΑϋΝΕΚΚΗΗς УОЕУМКЬИУК ΚΥνΑΑΜΙΚΌΑ ΚΤΕΕΟΕΤΕΕΝ ГКЕЪКсдаЗЗ ЕКГЕУЕОЕЬК ΟδΚΧδΤίςδΑ ΝΑ5ΚΕ33Ν5Α ϋ3θΕΚ8Ο3ΕΕ ЕУАЖ^ААСР ЬЕРКК^ЬЕЗК СЬА5КООЬ81 РОЕЗЕрСУЬУ ΟΗΚΕΚΝΤΌΤΣ СЬС/УСКЮ/СР ΕΚδΕΚννΥΕϋ ТУРПРКЕКН ΑΚΕΕΏ85ΙΏΥ ϋΕΝΙ-ΡΏΤνΤΗ ΕβΥΥΤΤΚΕ §6690167

ΜΚΤΚ8ΕΚΕΙΗ ЕСУЬОГРХРР ΓΕΤΟ8Κ.3νΑς АОУОКНЗНСЗ ьрркрроио ЕЗНЕЗЕРЗЗУ/ ΏΥΚΗΑΡΡΗΕΥ ΝΕί §6690252

100 РГРРЕЕЕГЕЕ 8К5ГАрАОУ() ν/ΚΥΣΟΒΕί^ΡΡ

РРбЕТКРЗСЬ ЗЬЬЗЗХУОУКЯ ΡΡΡΚΡΑΝΕΕΥ Г §7243280

101 ΕΣδΕΡΕΣδΕΏ ЕСАН()СЕО8 Α ΟΜΟβΜΚΤΡΏΡ

ООЬЬААгаР ΏΙΏΑΝΕΑΙΗ8 0ΡΕΕΝΕ0Ρ06 РОКРЕРОУС8 ЕЗЕБТАААЗА σΏ6ΡθνΡΑζ)Α ЗОНбЬРРРШ δννδνίνΚΝΤ УСРЕ()8ЕАЕА 6СЗАСЮСА(2А АОУТКЕСРУО РНЕМРИСРОЗ РЕРЗЬРСТРН ЗРАРРЗОСТХУ КЕКСМЕОКТР ΣΏΕΤΑΗΡΟΡΕ ΡΟΟΗδϋΡΕΡΡ 8АР8РТКЕ6А ЬТРРРЕРЗЗГ ΕΣΑςΕΝΟΡΟΜ (^РРУЗЗРРЕб АЕ,К()Е8С8РН ΗΡ<)νΐ,Αζ)ζ>(38 Ο88ΡΚΑΤΟΙΡ АЗАЗРРРУАО УРЕРКрЗРОН (^ЗРЕАЗРКУР УСРРЬКЕЕОО ϋΕΟΡνϋΚδδΡ СЗР()8Р88ОА ΕΑΑΏΕΟ5ΝΏ3 РАЗЗЗЗКРЬК УК1КТ1КТЗС ΟΝΙΤΚΤνΤ()ν РЗОРОРРАРЬ АЕ6АГЕАЕАЗ ЬЬКЕЗРАТРТ ЗЕ<ЭРКУУ8У<2 ЬСОСТЕЕКСТ УЕРУАТ1рЫА ЗТАМЬМААЗУ АККАУУЕРСС ТАТЗРКМ1АК№ЕСЬУР()АЕ РКАЭСКАСЕС Τ6Ο()ΚνΝ(}Α8 ννΜνςΡδΚΤΑ ТСРЗТСООТУ Ι8Κ.Τ(3δ3ΕνΕ ΑΓΝΚΠ,ΝδΚΝ ΕΙ,ΡΑΥΚΡΝΙ,δ ΡΡΑΕΑΟΣΑΙ-Ρ РТСУКСЬЕСО ОАГЗЬЕКЗЬА ΚΗΥΏΚΚ3ΜΚΙ ЕУТСМНСАКК. ЕУЕРЕГКСЗЕЕ ΕΗΑΚΕΗΚΌΚΟ ЕУМС^СЗНЬУМ ЯРУАЕОрМУО ςΡΟΙΊΤΣΕΡν АУРРУЗСРЬА ЬРАЬСКОЕСА ΙΤ83ΑΙΤΤΥΑ АЕАРУЬРЬЗТ ЕРРААРАТЗА УТСРКСЬЕСК Е()СКЕ>КАОМА ΑΗΡί^ΕΟΡΡΑ

- 25 006603

РОАТЗШСРТ СРММЕРКК-СЗ Ρ8ΑΗ0ΚΜΗΚΝ КРРНУСРЕСС ΟΝΡΕΟΑΝΤςΤ НЕКЕАСЕНУ8 ЕЖУСУКСРЗС ЗУУРС;6УУ'81 К.8НК2Т8НСЕ УРНКСИСРМ АРК5ОР8АНА НЬУЗОНРЗРО τςςΑΚίΐΥκο амсе>туртнк рььззнгоон ЬЬР<2Ю/8УРК СРХСРШАр КЛТМЬЕНЬКИ ТН08ОКЕЕЕТ ΑΟΚΟΑΟΟΑΙΧ ТРКТЕРЕЕЕ А У80С6ЛАРАТ ЕЕ88888ЕЕЕ ЕУР88РЕРРК РАККРККЕЬО ЗКОЬКОООСО Р6СЛУТС0ЕСН δνΤΡΕΚΟΕΥν АНМККЕН6К8 УККРРСМ.СЕ К8РС8АР8ЬК ΚΗνκνΝΗΕΟΙ КРУ УРСКУСТ ЕСККТРЗЗКЕ И.ЕКНУОУЯН СЬОЕОАуКРО КСТТЕАРО88 АКАрСРСР.КЛ К088О8СХЕЕ РОЗТТРРАКЗ РКООРОЗООН ΟΡΙ..ΚΥΚ5558 ТЕЕ>8ЬММСЬК УЕОСАОССЕО ССЕСРАЗРСЗ Ь8КНКЯ8НК КККСУОКА8А ЕСЕСЮСЕЕЕЛ ΡΡΒΚΒβΡϋΟΟ О5РЕРА86СР ЬТСКУССКХС ϋδΡΙ,ΝΙ,ΚΤΗΕ КТНОМАНКА КрСАУОИУ

87305597 102

М8ЦЗРКРУТК Р.СС8ЕКААР6 АОТКЛУЕЗрЕ) УЕЬМОЕЬСОО ОУРОЬРЬРРУ СУУР8ΡΚ6ΝΕ ΝΚΕΤΗΡΤ7ΟΊΊ ΕΚΕΚ6ΡΤ.Ι.ΑΝ ΚΟΡΑΥΜΡΝΟΗ 8Τ8Ι.8ΙΕΕΕΚ Π,ϋΑνΕΥΟΝΙ ΡννψΚΜΙ-ЕЕС НЗЫФ/МСУОУ МОрМАЕрЕАУ ΑΝΕΗΕΕΙΤΕΕ ΙΧΚΚΕΝΕΒΚν СОАЕЕЕЛ18К ОУУШУЕА1Ь ΝΗΡ3ΡΑΕΟΚΚ ЕАТ5Р8С>8ЕЕ 00ΌΟΓΥΑΥΌΕ ООТКРЗНОУТ РПЬААНССгЕ УЕ1УНТЬЬКК ОАК1ЕКРЕГОУ ЕСКСТЕС50К ОКНП8ЕЗН8Е 3ΚΙΝΑΥΚΟΕΑ 8РАУЬ8Е88Е ОРУМТАЕЕЕ5 ΝΕΕΑνί,ΑΝΙΕ ΚΕΕΚΝΟΥΕΚΕ 8М<2СКОРУУС ШЭЕСЮТЕЕ ΥΕΑ1ΕΝΟΟΑΕ ТК.ОРСПР ОКР ΝΕ8ΚΙ.ΚΙ.ΑΙΚ оеуккруанр ысеэсэрьъз!^ УЕУЕЗСЕКОС) ТМАУКРЬУУЕ АУАЮЬРЕЬА ΕΙ У'УСАРСЖ МОЫЬРКРРМ КРУАНААЗРТ ΙΗ,ΟυΐνΜΝΑ АОНЕЕОТЕЕЕ ΡΝΕΤ8Τ0ΝΑΚ рЪРКМКТЗСР 8\УМЕМЫ18Ш УЮМ1\¥АЕСК ЕЮТСЮРКЕУ ЕЕЕЕУ/УМЕОг СМЬА1НАА8Р 1АКРМАГ\УНА 8ΚΑ08ΙΙΟΑΝ ЦТЕКОЬТКУТ ЬбОКУКУУАТ АК1КТОРТОР 0ΙΙ8Ε&ΕΥΑΙ АУУЬ8Р8К1А ΥΙίΡΑΝΕδΡΟ РЬОЕЕЕСЖТУ КО1РКГМУ1Р ЕШТУАЕМЮ ΜΓΝ1.Υ8ΥΥΙ6 ΑΚΕΙΝΈΑΠΤΥ ЕЕ8ЕК'1ЪР\УЛ ЛОЬЗЕУКЗV νΐΝΥΝΗΚΡΙΕ ΝΙΟΥνί,ΥΟνΥ ΝνΐΜνίνίΕΝ ΜΕΙΑΜΙΝ88Ρ рЕ1ЕОГ)АОУЕ ν/ΚΓАРАКЕν/Ρ 8ΥΡΕΕΟΚΤΕΡ УРЕУЕУРЗРК ЗЕЕУЪЕЕКРК К\¥МСЕЫ()С<2 КрОРОЕОАЕМ ΝΚΚΝΕΕΚΚΡΟ 18С8НЕОЕ8К ЕЗШКЖЗЕАН ΝΚΟ88ΤΚ83Ε ϋΥΗΕΝ8Ρ8ΝΡ ΡΚ(2Υ(}ΚΙΜΚΚ ΕΙΚΕΥνί,.ρΑ',) ЮКЕЗОЕУИЕ ΟΕΕΚΕΙΚςϋΙ ЗЗЕКУЕЕЬЕЕ Κ80Ν8ΕΟΕΑΕ ЫККЕСЕКЕЗ ЕЕРКЕЕЕЗКЖ »7512448

103 ΟΡΕΡΑΤΚΝΕΕ ΝΕΚΝΉΟνΕΗΤ 8УУЕЕТЕМСЕ

Κ,ΧΡΌΜΕΑίΙΕΡ. ΕΝΕΚΕνΡςΕν ΚΙΕΚΝΕΙΜ8Ο УЗРСНОУЗСН ΕϋΡΡΕςνίΕΙΕ кшиьотоо □Ό88ΕΑΜΝΟΙ ΕΑςνΑΤΝΤΕΤ 3ΚΝν0ΝΑ3ΕΥ ΕΤνίΤΙΜΟΙΚ 8Е8С1ЕКУЕА1 ΝΙΕΟΚΡΕΕΝΝ ϋΚΝΙΚΥνΑΕΤ ЗЕЕКТУРТЕН ΝΑν<2ΚΗΚ5Τ1 ТОСЕКОЕОУЗ ΙΚΚΚΑΜΕΕ8Ρ ΑΕνΝΟΝΝΙΚΟ ΜΜΚΕΕΕΥΡΕϋ ЗСЕРЕРКАЭС А8С1РЕААЕК ΥΑΡ8ΚΚΨΗΙϋ Т1МКУЕПАС; 3ΥνΚΟΟΑνΡΝ ицитизУЕ мнаутурм. υ к/уьооувор ΡίνΕΑ'ААЗУС1 бЕУСОЕЬУЗб <ЭСЕЕЕЕРЮ« ТЕОЕУЬЦЖЕ 8νΕΙ8ΝΜ8Τ8 УТКОУАЕТАЗ МКЕ8ТКГТСТ νΝΚΙΚΚννεί УОЗЗЮУЕЬр ΚΚΑνΕΥΝΑΕΡ ΚΚΥΌΗΜΚ8ΑΕ ЕЕКМРУМЕКУ ΤΤΝΟΡΐΕΙΥΟ таОЕТЕРАРЬ ΕΤΚΡΡΡ8ΟΡ<2 ΡΤ8Ρ-Α.ΥΌΕΕΟ ΕΕΟΟΝΌΠ ΡΥ ΙΡΤΑΡΤ8ΚΡ8 8А66ЕЬЕП1.Е ΟΓ)ΓΝΕΤΟ8Η8 У8ОЛС>У0’ЛТ)»' Ε08ΕΟΡΕΡΡΑ ΕΚ

87522630

104 МУ/РЯС88ЕСР СРКРТЕПТЕЕ ΕΚΚ1ΙΑ8ΡΆΤ

ААЗРСУУСгЕА ЗЫЪЕАЬЗУЕА ОАКО<ЗОЗНТК 58ЕЕТЕЕСС-Е УЕТЕЕЕСЕЕУ Т6Т1УУ8рНА АЕРЕЗУНАУЭР ССКЕСКРМОУ УКПРРОЕЗРЬ ЕЕСААМА8ЕК УЕС1ТКРР8В. ΡΑνΑδζΕΚΑΨ АТУСЬУЗУААА ЕАЕОЬЕРЕЕС УСК.УТУ<2УРС 8\УСРЕТЬОАЕ 8СОУАРСЕЕЕ ЗМЪССЕЗУСЕ 8ΡΕΕΝΤν8νΑ ТЕСНУУЪСрЕ ААР0КР1ШЗЕ Е'ЕММлрЕЕС! МУУЛ8УСУТ.|> И.УПЛОТУЕ ΚΝΡΡΑΜ8ΡΑΟ РЕ5ЖТТЕКЕЕ ΕΙΥΕΚΥΑΤ’Α'Ν (ЛЕОРУ/УУТЕ ΡΚΚΑνΕΚΚΕς РКЕЗТКРКК8 ЬТЕ\УР8ЕЕУ8 ΟΤΙΒΑΗΕΝΕΚ. ЕРО8808КА5 А8КААО1ТСУ ЗНСАКРСМЕР ΟΡΕΡΟίΕΑΟν (ЖЕРРЕРРТС КАЕЗККО §7669477 105

ΜϋΙΕΕ>ΕΕΝΜ8 358ΤβνΚΕΝΚ ЖОЫУЗРКОС 8ТРаРОЕ<зз<2 ΕδΝασοααρο κκκρεεεο8ν СНЗКУРЕККК ККТРОРУЕРК ΚΛΕΜγΕΥΕΙΚ ΡΟΕΡΥΤΕΕ8Ρ ТОРУНАРЕРУ МЗУЕУУСрУТ ЕС8СРТКККА КЕИААЕКАЕК 8Ρν0ΡΡΝΑ8Ε АНЕАМСКТЕЗ νΝΤϋΓΤ8Ο<2Α ϋΡΡΟΤΕΡΝΟΡ ΕΤΡϋΚΑΕΡΡΡ ΥνΟδΝΟβϋδΡ 888СОЕ5Е8А ЗРУРАЗЕАЦР РЬРУЕРРГРР ΡδΟΚΝΡνΜΙΕ ΥΈΕΓ<Ρ6ΕΚΥΙ> РЕ5Е8СЕ8НА КЗРУМЗУУУР

- 26 006603

ΟςΓΡΕΟδΟΚΝ ΚΚΕΑΚΑΚΑΑς 5АЬАА1КЖН ЕОрТРЖрР! РЗЕОИЭЬНЬР ОУЕАОАУЗКЕ УШКЕОПЕТО ΝΕ88ΡΗΑΚΚΚ УЕАОУУМТТО ΤϋνΚΌΑΚνΐ8 УЗТОТКОИС ЕУМЗОКОЬАЕ иоснаензк ввшитутс εεευεννκοο РКЛ51ГОК8Е ΚααΡΚίΚΕΝν (2ΓΗΕΥΙ8Τ8Ρ ССОАК1Е8РН ΕΡΙΕΕΟ8Ι68Υ ТрАОУрА'СА'Н бЗЕОРКРРСЬ ЕВОРЗТЗТРр ОАСТТЕРАОК. ΗΡΝΚΚΑΚΟάΙ. ΚΤΚΙΕ86Ε6Τ ΙΡνΚδΝΑΧΚ) ГТООУЬООЕК ЕЕТМ8С8ОК1 АКЗУНУУОЩО 8ЕЕ81Е\^ГЕР1 ΥΕ881ΙΕ68Ε УИСЮНЕЗК.АА! ΥρΡΥδΝΙΕϋΕ ΡΡΕΥΤΕΝΚΡΕ Ε8ΟΙ8ΝΑΕΑΡ. ςΡΟΚΑΡΝΡ8ν Ν’ΛΤνΟΕΕΑΙΕ νίΝΑΤΤΟΚΒΕ ЕОКА8КЕСКН АЕУСКХУМКУН СКУР8НЕЕК8 ΚΙΤΚΡΝνΥΗΕ 5ΚΕΑΑΚΕΥ0Α ΑΚΑΚΕΕΤΑΗ КАОЕСАУУЕК РТЕООрЕЁР.Т Ρ

87669479

87770147 §7706747 §8922960 §8923251

106 ΜϋΙΕϋΕΕΝΜδ δδδΤΟνΚΕΝΚΝΕϋΝνδΡΚΟα 8ТРСРОЕС8С2 ЕЗНСОСССРС ΚΚΚΡΕΕΕΟ8Ν ΟΗ8ΚΥΚΕΚΚΚ ККТРОРУЕРК Ν.ΑΕΜΕΕ ΛΕΙΕ ΡΟΕΟΥΤΕΕ8ζ) ΤΟΡνΗΑΡΕΕν М8УЕУН6<Л'Р ΕΟ8ΟΡΤΚΚΚΑ ΚΕΗΑΑΕΚΑΕΚ. 8Ενζ)ΕΡΝΑ3Ε ΑΗΕΑΜΟΜΈδ νΕΤΟΕΤΕΟΟΛ ϋΡΡΟΤΕΡΝΟΡ ЕТРЕЖАЕРРЕ ΥνΟδΝΟΟϋδΡ 888ΟΟΕ3Ε5Α 8РУРА8ЕАрР РЕРУЕРРЕРР РЗСКИРУМЮ ΝΕΕΚΡΟΕΚΥΟ ΡΕ8Ε8ΟΕ8ΗΑ Κ.8ΡУМЗУУУО ΟΟΡΡΕΟΒΟΚΝ ККЕАКА.РААр δΑΕΑΑΙΡΝΈΗ ΕΟζ>ΤΡ8Κ.ζ)ΡΙ Ρ8ΕΟΕΟΕΗΕΡ (ЗУЕАЛАУЗКЕ УЕОКГОЛЕТО ΝΕ88ΡΗΑΚΚΚ УЕАОУУМТТС ΤΟΥΚΟΑΚΥΙ8 νδΤΟΤΚΟΙΝΟ ΕΥΜΙΙΌΓΎΕΑΕ НОСНАЕПЖ Κ8ΕΕΡ.ΕΕΥΤΟ ΕΕΕΥΕΝΝΚΟϋ ΟΚΚΥΡςΚΧΕ ΚΟΟΡΚΕΚΕΝν ΟΓΗ1. ΥΥΤ5Ρ ссиашрзрн εριεεο8Ρ8υ τςΑΟνςν/ΟΝΗ С5ЕРРКРР6Е Ε50Ρ8Τ8ΤΕΟ САОТТΈΡΑΏΚ ΗΡΝΚΚΑΗΟάΕ К.ТК1Е8ОЕСТ 1ΡνΚ8ΝΑ8ΐς ТУЛОУЕрОЕК ЕЕТМ8С8ОК.1 ΑΚΥΥννΟΙΡίι δίΕδΙΡνΕΡΙ ΥΡ88ΙΙΕΟ8Ε ΥΗ6ϋΗΕ5ΚΑΜ ΥρΡΙδΝΙΕΟΕ ΡΡΕΥΤΕΝΚΡΕ Ε8ΟΙ8ΝΑΕΑΚ . ΟΡΟΚΑΡΝΡδν ΝλντνΟϋδΑΙΕ νίΝΑΤΤΟΚΟΕ НЭКАЗКЕСКН АЕУСКЗУМКУН ОКУР8НЕЕК.8 ΚΙΤΚΡΝνΥΗΕ 8ΚΕΑΑΚΕΥζ>Α АКУН

107 МЕУЕЕРЕР1Р ЕТЕ8С8У1М. ΕΟ8Ο8ΕςΡΡΡ РКРК6>Р8СЕ8 ЕРЗЗУЛЭУКСР РРСРЮТОТ ОТЛКУЗРСХУР СУ/ЗК8К

108 ΜΑΟΡΥΥΚΚΝν ΝΑΡΥΚΌΜΡΕ К1УКАЕ8ЕЕ8 ΡδΕΚΑΥΕΝΑν ΕΚΟϋΥΑδνΚΚ 8ΕΕΕΑΕΙΥΕΚ ΙΝΙΝΟΙβΡΕΟ ΚΤΑΕΕΙΑΙΕΝ ΕΝΕΕίΙΕΟΕΕ δΡΝνΥνΟΟΑΕ ЕНА1ККЕУУС ΑνΕΕΕΕΝΗΚΚ ΡδΟΕΚςνΡΡΙ ΕΕΏΚΟΡ8ΕΡΤ ΡϋΙΤΡΙΙΕΑΑ ΗΤΝΝΥΈΠΚΕ ЕУрКОУЗУРК РНЕУКСИСУЕ СУ888Е)УО8Е ΡΗ8Κ8Μ.ΝΙΥ ΚΑΕΑΞΡδΕΙΑ Ε88ΕϋΡΡΙ.ΤΑ ΡΟΕ.Υν'ΕΕγΕΕ 8ΚνΕΝΕΡΚ8Ε РТЕЬбР.рСКр ΕΑΚΕΕΕΟΟΤΚ 88ΚΕΕΕΙΙΕΝ ΥΚΟϋΝδΕΙΕΕ рЗб'ХОЕАКЕК ΕΑΙΚΥΚρΚΕΡ УАСЗРИССЖЕ Α8ΚΎΥΟΕΡΡΟ ЗУККЛНУ'АУКМ УТСРПСЬЕР РУР8УСУЕ1А РКЗРЕСЬНК КРР1КТ1СНТ АЗУЪТРЕРЕЕ Ы.Л8рН1Г)Р,8 ϋΕΝΚρΟΡΡΡΤ • ΓνΕΎΜΙΕΡΎΥ ЕСР1\УОЕ1Кр МУ/ОНОЕрОУ!

НОΨΤΥΝΕΜϋΡν ΜΝ8ΕΥΕΑΤΙ8 1.К1УАНУК Υ5 ΑΕΝΡΚΕ8ΨΟΜ \У11РТ1Л^;АЕЛЕ ΡΑΙΑΝΙΡ88Ε ΚΕΙ8ΕΡΤΑΝ8 НЕОРИДЗЕС КМЕЬОЮКРЕ НУСЬУЕЕАР ΑΝΟΕΝςΕΥΡΥ УЕЕТКОЕТСК ΟΙΚΟΕΚςΝΝΑ ΡδΤΕΡΕΤΕςδ ΕΡΎΒΙΡΟΕΙΝ ΕΥνΤΝνΚΑΘΗ ΕΡΤΕΡνΰΑΤΜ ΡΟΤΥΝνίδΕν νΕΕΝΜΣΙΑΜΜ ΝΝ8Υ(2Ε1ΑΟΗ ΑϋΙΕΨΚΡΑΚΤ КЕУ/МЗУРЕЕС ΟΤΕΡΤΡΡΝνΐ ΡδΡΚδΕΨΥΕΙ КХУ1ν/ТНЕСКК ΚΜΚΚΚΡΕ8ΡΟ ΤΙΟΚΡΑΑΟΝΕ ЕЛННрУрЕУМ ΚΝίνΚΚΥνΑΑ М1КОАКТЕЕС ΕΊΈΕΝΓΚΕΤ.Κ ρθί РЗЕРТЕУ ОСТЕР.СЙК1А ΤΙΘ8ΑΝΑ8ΚΕ 88Ν8ΑΟ80ΕΚ 308ΕΟΝ5ΚΟΚ ΚΚΝΡδΕΡϋΕΤ ТИНРК8АА1 Α8ΕΚΗΝ18ΝΟ δΑΕννςΕΡΡΚ ΕΚςΚΚνΝΡνΤ ШКИЕСЕЕНК Κ.8Κ<2ΝΑΑΕΟΝ ΑΝζ>ΙΕ8УЗЕЕ УАКррЛАОРЕ ΕΚΝίρΕΕίΤΟ ΕΑ8ΚΟΟΕ5ΙΡ СЕЗЕрСУЕУЮ ΗΡ.ЕКНТОТЕСт Г.рУСЖВУСРГ К8ЕКУУУЕОТ УРПРКЕКНА ΚΕΕΟδδΙΟΥΓ) ΕΝΕΡΟΤνΤΗΕ ΟΥΥΠΡΕ

109 ΜΕδΥδνΤΟΑΟ УрЗУНЕЬСЗЕр» Р5РРЕТК.ЕМС 1ЕРОСК.УНЕТ ννΥΡΟΚΕΕΙΝ ЕУКСУЕЕЛТЗ ΚΑΑΝΕΚΝΕΤΕ ίςΕΝΟΕΡΒΚα КСЕОУОАКРЗУ КСЗИУЕЕЕЕС ΟνΟΙΥΡΤΒΕΕ ΕΝΤΕΚΕΝΤςΡ σκκνργρνΕΡδςΥΝΡοιίΥΟ нноауррее<? <ЗЕУ1ККЕТСР ЗУКОЕОРОМТС ςΥΚδϋΡΙΝΙΟ αΕϋΕϋΙΚΟΨΟ ΟΕϋνΗΕΥΚΚΥ ΕΗδΝΕίννΚΤ РУКСЕЕНЕ1УН ЕККСМОЕЕТР Е<2УКМСМ(}8К ΑΜΝΕΑΒΗΟςΕ СМЕУЕКНЕ1Е ΑΗΕΚΚ(2Κ<2ΚΤ 88ΚΚΤ

110 МО1ТЕУККЕЕ ρΕΕζ>ΝΕ ΥΚζ)Ν δΊΉΤΑςςΑΕΕ ιςς>ΕςνΕΝΜΌ тркуеююео νΗΤΑΕδίβγς КОУИЕЕЮСЕ ΕΤΤΚ8ΝΕΑΜΕ Κ.ς8νΤΝΕ<2Ο<3

- 27 006603 ί,Εζ)ΚΕζ)ΕΝΑΚ. ЕКЕКК^ЕЗСЮ АРБРБРрЕЕБ РБУЗАфУРНК. РЗЕЗЗБЕТЕМ νδφΚΕΕΙΕΥΕ ζ)ΕΚΕΚΙΑΝΕΚ Ε8ΕΝΙ8ΑΝΚΟ Р5ЮС31МТ8А ЕСКНКЕРРУК КЕРЕБЕРКЕЗ ΡΤΒ8ΕΕΕ()ΚΕ ΚΚΑΕΚΚΙΕΝΕ ΕΚΑΕ<2ΕΚ8<2Ε ΝΒΕΕΚΌΑΗΕΚ №<Έΐυ^ΜΕΩΤΝΥΚΑνΚΕζ)ΕΚ ςν/ЕЕСЗОМТЕ ΙΚΚΙΚΚΑΒΡζ) (^ЕЖЗЕВЕБАУ ΧνΝΕΕΑΥΓΚΡΕ ΝφΕΕΜίςΚΜΝ ЕЕЕЕЕБЕЕКУ Н181БКАА10 ЕЕЫКСУАЕВК. ΕΕζ>ΕΡΚ.3(3ΕΒ БЕУККЕТРЕК ΝΟΚΕΜΕΕςΤΕ (^ΚνίΕΕΕΝΚΕ Κ3ΡΕΚΒ.3ΚΚΕ ΚΕΟΝΚΚΕΜΚΕ ΝΒΕΕΚΕΕΕΚς (^ЕБТЕТЯЕК ΕΕΕςίΙΚΌδΚ ΒνΕΚΕΝΤΕΕζ) УК18ЕЕЕТЕУ ТЗЕЯЖ^УАЕА ΝΑΕΚΝΕΝΕΕΕ ΙΝΡΜΕΚ8Ηζ)5 АБКАК8ЕМАТ МКУЯЗСКУБС КТТМТКУКРК ААККЛСЗУОЯ ΗΗΤΎΕΝΗδΙΚ νΜΕΝνΡΕΝΕΕ КБСХУЕБУЕЕЕ 88Β8ΕΑςΤ8(2 ТБСТПУЕТЗ БЮЕртебск бркезбртеб ΕςτοοκΕίνς ΤΥΕΝΙΒ6ΚΤΡ ΚΒΥΡΗΩΚΝΑΚ ΚΡΤΕςΚΚΝΟΚ М<5К88НТАУР ΤΚνΝΡΕΚΥΚΝ ΙΤΑςΚ83£ΝΙ ΙΕΕΚΕΚΙΙ8Ε ζ)ζ>ςΝ3νΕςΝΑ ККТАЕЕ5УКЕ ΥΚΕνΝΕΚΕΕΗ (^ςνΕΒςΚΕί} ΤΕΡςΤΙΚΚΕΝ ЕБЕАОЕККЕК ЕВЕБККЕЕ28 8ΕΙΤ8ΕΑΕΕΝ 8ζ>νΤΓΡΚΙζ>ν Т8Е8Р8К8МБ БЕМК^ЕфУКЕ ΚΝΑΤΝΕΕΤΚφ ЗЗКУКТЕКРЕ ΕΕΑΚΕΕΗΙΚΕ ΜΗΕΚΙ8ΚΜΕΚ ΒΙΤΜΚΚΗΕΙΕ БЕКРЖ^КУЛЕ ΕΕΝΚ8Ρ5ΕΜΕ ζ)ΝΕΒΚΚνΚΤΕ ТЕЕСЗИККУЗ ΙΒΕΕΚί^ΚΕΝν ΑνΚΕΚδςΥΕς ΜΥςΚδΚΕΕΕΕ ККБЕКЕТЕЕУ 8ΚΙ8ΕΤΕ8ΑΜ ΑΕΙΕΤΑΑΕΚΧ} Εζ>ΕΕΑΕζ)3ΕΡ УЕЕОАБКТЕЕ ΕΑΝΕΚνΕΕΡΤ теукаеакеб (^ΝΒνΗννκκς ΙΚΕΕΚΚΜΚΚΝ КБАСКТЕТНК Αζ)ΤΕΑΑ3ΙΕΝ 13Я8ВЕЕЕ1Е БТЕБ<ЗУЕ1ЕК ΤΚΙϋΑΕΝΒΚΕ У/МБУК^КБЕЕ С(28БТЕ5РКБ ΚΟΝΟΑΙΜΑΗς ИЕКБРБЗЗЕЗ АЗАЗ

§8923273

111 МКУУРЕКМАУ ШБУ/ОЯЕКСА КАМ6А<ЖЕО ЕБУЕБКТК.У/М КУ/ЕСКЯУЕЕР Б8РЯ8ТРББА РЕРБЯТЕБАЗ ΤΗΥΝΗΝΙΥΙΤ ЕУКТСКСУНЗ БЮНЯКТРУ/С УТРНРТ18СЕ 1АЗССЕБСЕУ ШУ/БЕН668Е 8\УРТБ8ША1 АЗБАРНРТАС) ΕΕΕΙΑΤΑΝΕΙ НРУУБКЕККЕР РАУУКТАЗЕМ ЕКУКБУЯРБР ЕСНУБЕТА1У ΝΡΕΝςςΟΟπΕ РЕ1Р1БОТЕБ 8ΗΥΚ.ςΚΑΕΕ<2 ЕрРУЯКТРЕЕ ΗΝΡΕΗΜΕ88Κ. δδϋΐςΤΕΡΡΗ ΡΡΕςΑδδΤΡΡ Β<2<3ΕΕΝΚΡ3Α Р8ТУ(}88ТАС №ΈΡΝΕ3Ε<3Ρ ТЯКЕБССРЕЕ 3ΗΡ3ΚΥΗΚΈΙ АРОЕТСЗЕХУТ ЮГУЕ8ЕИ8Я8 ЕАЕЗМРРРЯГ ЗАЕЗУЕББЕУ БК-С^ЕСЗСЗРА 8УУТ8АТЕ6Я СРРАЕСЕАТЕ

8ϋ<3ΟΝΟ880Ν ΝδΟδΙΚΗΕΕς СБЕККРРЕЕУ ВКБрЕЕВ(23Е 80ΕΑΡφΤ(^Α ςΕΜΕΝΝΝΙΕΕ ΕΚΡΟΡ8ΗΟΡΤ ΡΗ88ΕΝΝ8ΝΕ δΡΟΗΕΝΡΟΚΑ ΟΗΝΕΕΤΡΝΝΒ ΤΕΚΨΕΚΤΤΡΝ Υ88ΟΕΑ888Ψ ςνΡδδΓΕδνΡ δδΟδςΕΡΡΕΕ Κ,ΤΕΟζίΤΡδδδ КБЕЕ888А8Р (}ЕЕКТУСтУАГ ΝςΕΤΟΗλΥΕΠΙ ΥΤςδ8Κ8ΟΤν δςΕΑΕΗρϋΜΡ ЕЕ55ЕЕВЗБЯ КЯ8БАБ8РЯЕ ЕУ8СА1ЕАНС КЕКБРС8СН8 ΡΑ8Α8ςνΑΟΤ ТОАНННАЯЕ1 РАРЕУЕМЕРН НУЗОАСгЕЕЕЕ Т8СБЕРТ8А8 ζ)νΕ6Εζ)Α §8923360 §8923454 §8923691

112 МУНЗРЯЕЕУА НРЗОУЕРРЕЕ РЕРРРРБЯрЗ ΡΑΕνΑςΑσν(} λνΚΝΕΟδΕςΡΡ ΡΡΟΡΚςΡδΟΕ ЗЕЕЗЗУ/БУЯН АРРСРАУГУР БУБМСРРНУО РТОБЕЕБТЗС БРРАЗА8ОЗА ΟΠΌΟδΗΚΑς ΡΤδδΝΡΥΟΙΥ РРРЕРУКТР8 СМЗС^ЕАОВСЯ ΕΤ §8923452 113

МРТАТСЕТЕБ Τ8Α88ΑΙ8ΒΡ ООЕУ8АРУ/О6 ЕКТУ/ТС^РЕЯС У/ЕКББРРРСБ РКТУАЕИТрр БЕССЕРС8СР АЯРБ8ККРЕС ОКЕО1БРСС8 88АУ/РЕО8РЯ ΡΡ(^ΜΝΕΡ8ΡΕ δΡΡΡΕΡΡΡΡΕ ЮУ8ЕТЕЗРКЕ ЕС88А18АНС ΝΕΡΕΡΟ53Ν8 РАЕА80УАС1 ТС1СННАЖД РУРЕУЕТСРС НУСрАОЕЕЕЕ Ι3ΟΒ3ΡΑ3ΑΡ ОЗАОПОУЗН КАКРС8УРБА Κ8ΕΕ8ΕΥΕΚΡ ОС^ЕСШУКУ

114 МЕЕУБАБРРЕ РМК.8ОАКЕЕА ЕРЕТРЕРОАЕ АКЕУЕЕТ1ЕС МЕБЯЕЕЕРСЗ БАБЕ1Я8БТ8 СИБЕЕЕПРУЕ КАКБТЕМЖ31 УАКУБЯЕЕ.АР УКМУОННУАР ΕΕΑΒνΕζ)ΑΕΚ БНОАРРРАЕР КДУЕС8АОЕР8 РЮ4УЕС8ОТ1 ΡΑΡΟΝΕΡΕΡΟ δδΒδΡΑδΑδΟ УАС1ТЕУТСТ (ЭАКБУКААНТ V

115 М8УУЗСКУББ ςΤΤΡΡΗνίΟς ЕБКЕ1ЕЕУ8Т ББОУБЕУРМЕ НРУ/ТЕОРОЕБ АОЗУНУЮКЯ БАИЕС^МУБАН УТМЕБУТБУЗ ТБТУСДРКББ МКРАББЗСР УААЖБНРЕБ ННУ1РМРБЕК ОТБОБИРУУН РБУ/КП^РРБР РБМЕЗЕЗУА(} АСУС^ХУНБЕОЗ ΕςΡΗΕΡΟδδΝ ЗАСЕЗБРЗЗХУ БУКНАРРНЕР ИРСПЕКБСУ ЕРСУ/РСУ73

§8924071	116 ΜΕδΡδνΑςΤΟ νΗΨΗΝΕδδΕζ) РБРРЯРК()Р8 СЕЗБЯЗЗ^УБУ ТНБРРСБАМР РУРБУЕТАГК НУОрАОБКЕБ ТЗОБОРТЗАЕ ζ)8Α(3ΠΌΙ3Η ятрруокри твзп-ърутб еекрз183
§8924204	117 МЗКУЕОСРРЗ К6НТА8БКУР ζΠΕΗΝΙδΡΡΕ

- 28 006603

ТЕ8С5УА0А6 ν<3ΧνεΝ1Β5Ες АЕРРКРТРР8

СЕХРЗЗУ/ОУ ΚΗΡΡΡΟΡΌΝν РУР8УЕТСРН

СУЗОООЬХЪЬ ТЕ §8980667 118

МАООШКУТ РЕОРТНАУСУ ЕОТЕТОЕОЮ . 88АРЕОСТ5Р 8П4А8Р6УУУ ШАН8РРАКК Κ8ΤΟ88ΤΨΡΕ ЭРОУЕУТЕТМ ΚΑΑ308ΤΟ0ς ΚνΟΙδΥΥΟΡΚ ТРРУКАЕЬУЪ ТАУЭСУЗРСН ΡΟΧΥ8ΑΜΗΏΕΑ ΗΟΝΕΚΕζίνΟΑ ШСРЗУРБЗУ/ ТТОАСННАХУЕ 1РУРЕУЕМЕР ННУО0АОЕЕЕ ΕΤ8ΟϋΕΡΑ8Ο 808ΑΚΙΤΟΜΝ НСАКР81РЕ1 ΕΚΥΤ §9716913

119 Μ8ζ)5ΡΑΓΟΡΚ К.С88РКОААО ΑΑΑΚΚΝΕδζΒ

УЕЬМПЗЕЕСЗЕ ЭОСР0)АРЕРС УОУУРСРКОЗ ϋΝΚΕΑΗΚΚςΤ УЕКЕКОККЕА ΝΚ.ΟΡΑΥΜΡ3Ό Κ8Τ8Ε3ΙΕΕΕ ΚΓΕΏΑΑΕΥΟΝ1РУУЮСМЕЕЕ ΟΗδΕΝΥΝΟνΟ ΥΜΟζίΝΑΕςΕΑ УАМЕНЕЕ1ТЕ ΕΕΕΚΚΕΝΕ8Κ. ΥΟΟΑΕΤΕΑίδ κογνκινΕΑΐ Ε8ΗΡΑΡΑΕΟΚ КТАТЗРЗС^ЗЕ ΕρΟΟϋΡΥΑΥϋ ЕОСТКРЗНОУ ТРПЬААНСО ΕΥΕίνΡΠΈΕΚ. ΚΟΑΚΙΕΚΡΗΟ ΥΓΟΚΌΝΌΟΝΟ ΚςΚΗϋδΡδΗδ Κ8ΚΙΝΑΥΚΟΕ Α8ΡΑΥΕ8Ε38 ЕЭРУМТАЕЕЕ 8ΝΕΕΑνΕΑΝΙ ΕΚΕΡΚΝϋΥΚΚ БЭМрСКОРУУ ΟΕΕϋΕΚΚΝΤΕ ЕУЕАШЫСОУ ΕΤΕςδΟΟΗΟΚ ΡΝΕ8ΚΕΚΧΑΙ ΚΥΕΥΚΚΜΟΚΙ МКСРРМКРУА

ΗΑΑ8ΡΤ1ΡΕΟ ΕΕΥΜΝΑΑΟΚΡ Ε6ΤΚΕΕΡΧΈΤ

8ΤΟΝΑΚ0ΕΡΚ МКТ8СР81УМЕ ΜΕΙΙδΨνίΟΜ ΙΧνΑΕΟΚΕΙΨΤ ΟΟΡΚΕΥΕΡΕΕ ΨΝΜΕΟΡΟΜΕΑ ΙΡΑΑ8ΡΙΑΚΓ МАРУ/НАЗКА0 ΞΙΙϋΑΝϋΤΕΚ ϋΕΤΚνΤΕΟϋΝ νΚΥΥΝΕΑΚΙΚ ТОР8ОР0П8 ΕΟΕΥΑΙΑννΕ 5Ρ8ΚΙΑΥΤΕΡ ΑΝΕδΡΟΡΕςΐ δΕΟΚΤνΚΌΙΡ КРМУ1Р1МУР ΥΑΡΜΙΟΜΕΝΕ

ΥδΥΥΙΟΑΚςΝ ЕАРТТУЕЕ8Р КТЕРХУА1РСЕ 8ΕνΚ5ννΐΝΥ ΝΗΚΡΙΕΝΙΟΥ νΕΥΟνΥΝνΤΜ νΓνΤΕΝΜΕΙΑ ΜΙΝ88ΡΟΕΙΕ ϋΌΑΟνΕν/ΚΡΑ КАКЬУ/РЗУРЕ ΕΟΚΤΕΡνΡΡΝ ΕΥΡ8ΡΚ8ΕΡΥ

ΕΕΕΚΤΚΚΧνίδ ЕЕР0ОНККСР (^ΕΟΑΕΜΝΚΙΝ ЕЕККЕОХОЗ ΗΕϋΕ8ΚΕ8ΕΏ ΚΚςνΟΗΝΚςΡ 8ΙΚ.88ΕΌΡΗΕ ΝδΡΝΝΡΡΚ,ςΥ ςΚΙΜΚΚΕΙΚΚ УУЕ(ЗА(ДЕЖЕ бЭЕУИЕОЕЕК ΕΙΚρΟΙδδΕΚ ΥΕΕΕΕΕΚ3ζ)Ν ΤΕϋΕΑΕΕΙΚΕ ΕΟΕΚΕ8ΜΕΡΝ ΟΕΕΤΝΚ §9966865 120 ΜΕΚΝ8ΤΡΚΝΜ ОЮЕНТТЬКЕК ΟΚΒ0ΑΙΚΟΡΑ

ΥΜΡΝΕΚΟΤ8Ε ΤΡΕΕΕΚΡΕϋδ ΑΕΥΟΝΙΡννΚ ΚΜΕΕΕ8ΚΤΕΝ ΡΝΟνϋΥΜΟςΝ АЕСХАУОКЕН ЕЕУТЕЪЕЕКК ЕМЕАКУСОАЕ ΕΕΑΙδΚΟΥνΚ ΙΥΕΑΠ-ΝΗΡΑ ΡΑΟΟζίΚΙ/ΓΕδ РЕЕ0ЕЕКООЭ

РУАУВЕЭСТК Ρ8ΗΒΙΤΡΙΪΤ ΑΑΗΟςΕΥΕίν ΗΧΕΕΚΟΑΚΙ ЕКРНОУРСКС ΝΕΟΤΕΚςκΚΒ 8Ρ8Η8Κ.8ΚΜΝ ΑΥΚΟΕΑ8ΑΑΥ ЕЗЕЗЗЕОРУЬ Τ.ΑΕΕΕδΝΕίΑ ΒΙ,ΑΝΙΕΤΕΡΚ ΝΟΥΚΚΙΛΜΟΟ КОГУУСУ1Х>Е СКОТЕЕУЕА1 ЕЫбОУХТрУХТ ΕϋΗΗΚΡδΕδΚ ΙΚΕΑΙΚΥΕνΚ ΚΡνΑΗΡΝΟ-ΟΟ ΟΕΕΤΜΛΥΥΕΝΕ 8ОЕК0081АУ КРЬАУРОУ81 ΟΕΡΕΈΑΙΑΥΧν 1АРС8К1ОКТ ЕЯ8РРМКГУА НАУ8РТ1РЕО ΕΕννΝΑδΟΚΡ ΕΟνΚΤΕΡΝΕΤ ΓΤΏΥΡΚ(2ΙΡΚ νΚΤΤΟΡδΨΤΕ ΜΤΙΜΚΨΥΕΟΜ ΙΨδΕΟΚΕΙΨΕ ЕСРЯЕУУЕНЬ ΨΝΙΧ.ΟΡΟΜΕ8 1РУА8РТАКР МАРЬКАТЕАО ΕΥνϋί^ΗνΟΏΟ ТЕНИУЗЬРРЕ ΥΑΥΕΤΥΑΚΟΚ УУ/ΡδΟΡςΐΙδ ЕОЕУА1АУУЕ δΡδΚΙΑΥΠ,Ρ ΑΝΕδΡΟΡΕςΐ δίΟΚΊνΚΟΙΡ КРМУ1Р1МУР νΑΡΜΙΟΜΡΝΕ Υ8ΥΎΚΟΑΚΥΝ РАГТТУЕЕ8Р ΚΤΕΡΧΥδΙΡΟΣ 8ЕУ18УУЬКУ ϋΗΚΡΙΕΝΙΟΥ νίΥΟνΥΝνΤΜ νννίΕΝΜΕΙΑ ΜΙΝΝ8Υ0ΕΙΕ ΕϋΑΌνΕν/ΚΡΑ КАКЬ^ЬЗУРЭ ΕΟΚΤΈΡΑΡΡΝ ΕνΡδΡΚδΡΥΥ иМК1КМСЕ1 КЬСКЗКАКЗС ΕΝΏΕΕΜΟΜΕΝ 8ΚΡΚΚΤΚΥ0Α ОМКИЗЕЖТА ΝΝΤΕ8ΚΡΤΚΥ 0К1МККЫКК ΥλΧΚΑςνϋΚΕ ΝΏΕνΝΕΟΕΕΚ ΕΙΚΟΌΙδδΕΚ УЕЬЬЕЕКЗОА ΤΟΕΣΑΒΕΙΟΟ ΕδΕΚΡΟΚΝΣΝ КОНЕКУШОК ϋΐ §9967846 121

МОООСРрЕРЕ ΡΡΗΟΥΥΡδίΚ ΟΤϋΝΚΕΤΗΚΚ ОТУЬКЕКСКЯ ΕΑΝΚΟΡΑΥΜΡ ΝΌΗ8ΤΤΕ8ΙΕ ΕΕΚΡΕϋΑΑΕΥ ΟΝΙΡννΚΚΜΕ ΕΕΟΕδΕΝνΝΟ νΏΥΜΟζ)ΝΑ1,ζ) ЕАУАИЕНЬЕ] ΤΕϋΕΕΚΚΕΝΕ ЗКУООАЬЕЬА 18КОУУК1УЕ АГЬЗНРАГАЕ ОККЬАТЗРЗО δΕΣΟΟΟΩΡΥΑ ΥϋΕΏΟΤΚΡδΗ ОУТРПЬААН ΟςΕΥΕίνΗΤΕ ЬККОАЮЕКР НОУРСКСЗЕС Νζ)Κ(2ΚΗΟ8Ρ8 Η8Κ.8ΚΙΝΑΥΚ. ОЕАЗРАУЪЗЕ ЗЗЕОРУМТАЬ ЕЬЗИЕЕАУЕА ΝΙΕΚΕΡΚΝΟΥ ККЕ8М0СКВР УУСЬЕРЕСКК ΤΕΕνΕΑΙΕΝΟ ОУЕТС(}8ОО0 ОКРИЕЗКЕКЬ ΑΙΚΥΕνΚΚΡν ΑΗΡΝΟΟΟΟΕΕ 81ХУУЕЫЬ8ОЕ Κ.ρζ)ΤΜΑνΚΤΈ УУЬОУАЮЬР РЬАНУХУСАР С8КМОК1МКО РРМКРУАНАА ЗРПРЕСЕЕУ ΜΝΑΑϋΚΡΕΟΤ Κ1Ι<ΡΝΕΤ8Τϋ ΝΑΚ,ςΕΡΚΜΚΤ ЗСРЗХУМЕМЫ ΙδΧννίΟΜΙΨΑ ЕСКЕ1У/А0ОР ΚΕΥΤΡΕΕν/ΝΜ ЕЭРОМЬАГРА Α8Ρ1ΑΚΕΜΑΡ ΨΗΑδΚΑςδΙΙ ΟΑΝΟΤΈΚΌΕΤ КУТЕСЕИУКУ ΥΝΕΑΚΙΚΑΒΡ 8ϋΡ01Ι8ΕΟΕ УА1АУУЪ8Р8 КЕАУТЬРАКЕ 8РОРЕ<218ЬО КТУКВ1РКРМ У1Р1МУРУАР ΜΙΟΜΡΝΙ,ΥδΥ ΥΙΟΑΚζϊΝΕΑΡ ТТУЕЕЗРКТЬ РУЛАбРОЬЗЕУ ΚδΥΥΙΝΥΝΉΚ

- 29 006603 §9967886

ΡΙΕΝΙΟΥνί,Υ ΟνΥΝνΤΜντν ЬЮТМЫАМПЧ ΕΕΕρΕΙΕϋϋΑ ОУЕХУКРАКАК ίν/ΡΕ ΥΡΕΕΟΚ ТЬРУРРЫЬУР ЗРКЗЕЕУЪЕЬ ΚΓΚ.Κ'ΛΌΡΕΕΡ ρΟΗΚΚΑΡζΙΕΟ ΑΕΜΝΚΚΝΕΕΚ КРО1ЬО8НЕО ЕЗЮТЗУПККр Ε60ΝΚ088ΙΚ. 88ΕΟΓΗΕΝ3Ρ ΝΝΡΡΚ(2Υ(?ΚΙ ΜΚΚΙΙΚΚΥνί рАрЮКЕЗОЕ УМЕСЕЬШК РШЗЗЕКУЕЬ ЕЕЕКЗрМТЕО ЬАЕЫККЬОЕ КЬ88ЕРКС)ЕЕΙΝΚ

122 МЕЬТОНЗТТЬЗ 1ЕЕЕКРЫЭАА ΕΥΟΝΙΡννΚΚ.

МЕЕЕСЕЗЪМУ ΝΟνΏΥΜΟΟΝΑ ЕрЕАУАМЕНЕ Е1ТЕЫ.ЕККЕ ХЬЗВУСОАЕЕ ΕΑΙδΚΟΥνΚΙ УЕА1Ь8НРАР АЕСККЬАТЗЬ ЗрЗЕЕрОООР ΥΑΥ0Ε06ΤΕΡ ЗНОУТРПЬА АР!СрЕУЕ1УН ТЬЬККОАМЕ КРНОУРСКСЗ ЕСКрКрЮТОЗ Ρ8Η8Κ8ΚΙΝΑ УКСЕАЗРАУЬ ЗЬЗЗЕОРУМТ АЕЕЕЗМЕЕАУ Ι,ΑΝΙΕΚΕΡΚΝ ОУККЕЗМрСК 0РУУ6ЕЕ0ЕС ВМТЕЕУЕА1Ь ΝΟϋΙΕΤΕρΡΟ ΟΟσΚΡΝΙ,δΚΕ ΚΕΑΡΚΥΕΥΚΚ РУАНРМСррр ЕЬЗЖУЕМЕЗ ОЫНЗОТМАУК РЬУУЬОУАЮ ЬРРЪАЫтеС АРС8КМОК1М ЕОРЕМКРУАН ΑΑ8ΡΤΙΠ.0Ι. ЕУММААОЮТ СгТКЕРРМЕТЗ ΤΟΝΑΚΧ2Ι.ΡΚΜ КТЗСРЗХУМЕМ ЬПЗУ/УКЗМУ ХУАЕСКЕГУ'Ар ΟΡΚΕΥΕΡΕί.Λν ΝΜΟΟΕ6ΜΕΑ! ΡΑΑ8ΡΙΑΕΡΜ АГХУНАЗКАрЗ Ι1ΟΑΝΏΤΙ.ΚΟ ЕТКУТЬОЕОУ ΚΥΎΤ\ΈΑΚΙΚ.Χν ОРЗЭРрПЗЕ 6ЬУА1АУУЕ8 ΡδΚΙΑΥΙΙ,ΡΑ ΝΕ5ΡΟΡΕΡΙ8 1ЛЖТУКО1РК ΡΜνίΡΙΜνρν ΑΡΜΙΟΜΓΝΕΥ 8ΗΥΙΟΑΚ0ΝΕ ΑΡΤΤΥΥΙδΟν ίΤΜΕΙΑϋ §9967888 123

МООССРрЬРЕ РРНОУУРЗЬК ОТОМРЕТ! ЮТ ОТУЬКЕКОВВ. ΕΑΝΚΟΡΑ ΥΜΡ МПН5ТТЕ51Е ЕЕКГиЭААЕУ ОТЛРУУККМЕ ЕЕСЕЗТМУМС УОУМСрМАЕр ЕАУАМЕНЕЕ! ТЕ1ЮТККЕМЕ ЗКУООАЕЬОА !ЗКОУУР1УЕ А1Ь8НРАРАЕ СКЮТАТЗРЗр δΕΕρρΟϋΡΥΑ ΥΏΕΙ9ΟΤΚΓ8Η ОУТРПЬААН СрЕУЕ! УРНЕ ЬККСАМЕКР НОУРСЕСЗЕС Ν0ΚΡΚΗΟ8Ρ8 Η8Κ8ΗΙΝΑΥΚ ΟΡ.Α8ΡΑΥΕ8Ε ЗЗЕОРУМТАЬ ЕЬЗМЕЕЛУЕА ΝΙΕΚΕΡΚΝΟΥ ККЕЗМрСЮТР УУСЮТЕСРЕ; ТЕЕУЕАЮТб ОУЕТСрРОТр СЮТЮТЮЮТ ΑΙΚΥΕνΚΚΡν АНРМСрррЬЕ 81УОТЕЫЕ86Ь кррТМАУКРЬ УУЬОУАЮЬР РЬАЬГУХУСАР С8КМОК1МКО РЕМКРУАНАА 8РТ1И.ОЫ.У ΜΝΑΑΟΚΡΕΟΤ ΚΕΡΡΝΕΤ8ΤΟ МАКОЬНТМКТ 8СР8Х¥МЕМЬ1 Ιδν/νίΑΚΙΚΨ ϋΡδϋΡρίΙδΕ СЬУА1АУУЬ8 РЗМАУЮРЛ МЕ8РОРЕр13

ЬСКТУКИРК ΡΜνίΡΙΜνρν ΑΡΜΙΟΜΡΗΕΥ δΥΥΙΟΑΚρΝΕ АРТТУЕЕ5РК ТЕРУ/ЛЮТЕЕ ЕУКЗУУГМЮТ ΗΚΡΙΕΝΙΟΥν Ι,ΥΟνΥΝνΤΜν 1УШШЫАМ ΙΝ85ΡΡΕΙΕΟ ОАОУЕХУКР.АК ΑΚΕΨΓδΥΡΕΕ ΟΚΤΕΡνΡΓΝΙ. УР8РК8ЬЕХТ. ЕЕКЕКЮТОТЕ ЕРрСгНКЮАЕр ΕϋΑΕΜΝΚΚΝΈ ΕΚΚΡ6ΙΙΧ38Η ЕОЕЗОТЗТОК КрЕбрЕКСЮТ 1Р88ЕОРНЬМ 8ΡΝΝΡΡΚ<3Υ<2 ИМККЫККУ УЬОАРЮКЕЗ ОЕУМЕСЕЬКЕ ΙΚζιΟΙ85ΕΚ Υ ЕЕЕЕЕКЗрМТ ЕОЬАЕЫККЬ 6ЕКЕ88ЕРКР ΕΕΙΝΚ §9716913

124 МЗрЗРАРОРР К688РКСААО АААРРМЕЗрО УЕЕМОЗЕЕОЕ ОССРрАРЬРС УСУУРСЕКОЗ ОМРЕАНКррТ УЕЕЕК6РРЕА ΝΚΟΡΑΥΜΓδϋ К8Т8Ь81ЕЕЕ ΚΡίΟΑΛΕΥΟΝ 1РУУККМЬЕЕ ΟΗδΕΝνΝΟνϋ ΥΜΟρΝΑΟΡΕΑ УАЫЕНЮТТЕ ΙΧΙ,ΚΚΕΝΙ,δΒ УбОАЮТАК κογνκινΕΑΐ Ε8ΗΡΑΡΑΕΟΚ ΡΕΛΤ8Ρ8Ρ8Ε ЕррООРУАУ’О ЕОСтТР.РЗНОУ ТРПЬААНСР ΕΥΕΙУНТ1ЮТ КСАРМЕРРНО УЕСКСМОСМр К(7КНЮТ8И8 Κ8ΚΙΝΑΥΚΟΕ А8РАУЪ8Ь88 ЕОРУМТАЕЕЕ ΞΝΕΕΑνΈΑΝΙ ΕΚΕΓΚΝϋΥΚΚ Е8М<2СКОЕУУ ΟΕΕΟΕΡΡΝΤΕ ЕУЕАШМбОУ ЕОТрЗООНСК РМЬЗКЕКЕА! КУЕУККМОМ МКОРРМКГУА НАА8РТ1РЬО ЬЬУММААОКР ΕΟΤΚΕίΡΝΕΤ 8ΤΟΝΑΚΤΕΓΡ, МКТ8СР8ΨΜΕ МЬП8ХУУ1СМ ΙΨΑΕΟΚΕΙΨΤ РОРКЕУЪРЕЬ УОТМЬОРСМЕА ΙΡΑΑ8Ρ1ΑΚΡ \ЮТ\УНА8КЛР ЗПОАМОТЬК ЮТПТУ’ТЕООМ νΚΥΥΝΙ,ΆΚΙΚ ХТОРЗБРРИЗ ЕОЬУА1АУУЕ 8Ρ8ΚΙΑΥΤΙ.Ρ АМЕЗЕСРЕр! ЗЬСКТУКТЛР ΚΓΜνίΕΙΜνΕ νΑΡΜΙΟΜΕΝί Υ8ΥΥΙΟΑΚ0Ν ЕАРТТУЕЕЗР КТЮТТАЕ'ОТ ЗЕУКЗУУШУ ΝΗΚΗΕΝΙΟΥ УЕУОУУМУТМ УтЫЧМЫА ΜΓΝ88ΡΡΕ1Ε ОПАОУЕХУКРА КАКЬХУРЗУЕЕ ЕОРОТРУРЕМ ЕУР5РК8ЕР Υ

ЪЕЕЕЕКЮТТЗ ЕЕРроНККОТ ρΕϋΑΕΜΝΚΙΝ ееккьсюсз неоьзкюто κκρνοΗΝκρρ 3ΙΚ88ΕΕΙΡΗΕ Ν8ΡΝΝΡΡΚΡΥ РК1МКЮТ1КК УУЬРАРЮКЕ δϋΕνΝΕΟΕΕΚ Е1КрО183ЕК

ΥΕΕίΕΕΚδΡΝ ТЕОЬАЕЫКЕ ΕΟΕΚ1.8ΜΕΡΝ рЕЕТЖ

- 30 006603

Пептиды ΝΤΡ, Родственные Белки, Родственные Пептиды и их фрагменты, варианты, производные, гомологи и имитаторы, которые охватывает данное изобретение, могут быть получены, используя известные специалистам методы, такие как рекомбинантная технология ДНК, синтез белка и выделение встречающихся в природе пептидов ΝΤΡ, Родственных Белков, Родственных Пептидов и их фрагментов, вариантов, производных и гомологов.

Пептид ΝΤΡ, Родственный Белок или Родственный Пептид могут быть получены, используя известные рекомбинантные методы технологии ДНК типа сформулированных у Самбрука и др., (Молекулярное Клонирование: Лабораторное Руководство, Со1б Бргшд НагЬог БаЬогаЮгу Рге55, Со1б Бргшд НагЬог, Нью-Йорк [1989]), и/или у Аусубеля и др., ред., Текущие Протоколы по Молекулярной Биологии, Сгееп РиЬйкйегк 1пс. и \Убеу апб §ои5, Нью-Йорк [1994].

Ген или кДНК, кодирующие пептид ΝΤΡ, Родственный Белок или Родственный Пептид могут быть получены, например, путем скрининга геномной или кДНК библиотеки или путем РСВ амплификации. Зонды или праймеры, необходимые для скрининга библиотеки, могут быть выработаны на основе информации о последовательности для других известных генов или фрагментов генов тех же самых или Родственных семейств генов, например таких, как законсервированные мотивы, найденные в других Родственных Белках. Кроме того, если ген, кодирующий пептид ΝΤΡ, Родственный Белок или Родственный Пептид был идентифицирован у одной разновидности, то все или часть этого гена может использоваться в качестве зонда для идентификации гомологичных генов у других разновидностей. Зонды и праймеры могут использоваться для скрининга библиотек кДНК различных источников тканей, которые осуществляют экспрессию пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или гена Родственного Пептида. Как правило, для уменьшения полученного при скрининге числа ложных положительных показателей используют повышенную точность измерения.

Другой способ получить ген, кодирующий пептид ΝΤΡ, Родственный Белок или Родственный Пептид состоит в том, чтобы использовать химический синтез, применяя известные специалисту методы, типа описанных Энгельсом и др. (Аидете. СНет. 1и11. Еб., 28:716-734 [1989]). Эти методы включают, среди прочего, фосфотриэфирные, фосфорамидитные и Н-фосфонатные методы синтеза нуклеиновых кислот. Предпочтительный метод для такого химического синтеза - это синтез на полимерным носителе с применением стандартных методов, используемых в химии фосфорамидитов. Как правило, длина ДНК, кодирующей пептид ΝΤΡ, Родственный Белок или Родственный Пептид будет составлять несколько сотен нуклеотидов. С помощью этих методов нуклеиновые кислоты, содержащие больше чем приблизительно 100 нуклеотидов, могут синтезироваться в виде нескольких фрагментов. В таком случае фрагменты могут быть связаны вместе, чтобы формировать всю длину пептида ΝΤΡ, Родственного Белка или Родственного Пептида. Обычно, фрагмент ДНК, кодирующий аминный конец белка, будет иметь АТС, который кодирует остаток метионина. Этот метионин, в нативной форме может присутствовать или отсутствовать в Родственном Белке, Родственном Пептиде или в пептиде ΝΤΡ в зависимости от того, предназначен ли синтезированный в клетке хозяина белок для выделения из этой клетки.

Ген, кДНК или их фрагмент, кодирующие Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть включены в соответствующий вектор экспрессии или амплификации, используя при этом стандартные методы лигирования. Обычно выбирается вектор, который способен функционировать в конкретно используемой клетке хозяина (то есть вектор совместим с такими механизмами клетки хозяина, функционирование которых может привести к амплификации гена и/или экспрессии гена). Амплификация/экспрессия гена, кДНК или их фрагмента, кодирующих Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ, может осуществляться в клетках прокариотов, дрожжей, насекомых (системы Ьаси1оуии8) и/или в клетках-хозяевах эукариотов. Выбор клетки-хозяина частично будет зависеть от того, должны ли подвергаться гликозилированию и/или фосфорилированию Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ. Если ответ положительный, то предпочтительны клетки-хозяева дрожжей, насекомых или млекопитающих.

Как правило, векторы, используемые в любой из клеток хозяина, будут содержать 5' фланкирующую последовательность (именуемую также промотором), и другие регулирующие элементы, такие как энхансер(ы), источник репликационного элемента, терминирующий транскрипционный элемент, полная последовательность интрона, содержащая сайт присоединения донора и акцептора, сигнальная пептидная последовательность, сайт элемента связывания рибосомы, полиаденилирующая последовательность, регион полилинкера для включения нуклеиновой кислоты, которая кодирует предназначенный для экспрессии полипептид и выбираемый элемент маркера. Каждый из этих элементов обсужден ниже. Произвольно вектор может содержать концевую последовательность, то есть олигонуклеотидную молекулу, расположенную в 5' или 3' концах Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, кодирующего последовательность; олигонуклеотидная молекула кодирует ро1уН18 (типа НехаНк), или концевую последовательность, типа ЕЬАС, НА (вирус инфлюэнцы гемаглютинина) или тус, для которого существуют коммерчески доступные антитела. Эта концевая последовательность обычно сконденсирована с полипептидом при экспрессии полипептида и может служить средством для аффинной очистки Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ от клетки хозяина. Аффинная очистка может быть достигнута, например, хроматографией на колонке с использованием антител в качестве аффинного

- 31 006603 матрикса относительно концевой последовательности. Впоследствии, концевая последовательность может быть удалена от очищенного Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ различными способами, например, путем использования некоторых пептидаз.

Квалифицированный специалист может соединять петлю иммуноглобулина человека и Рс область с Ν-концом или С-концом Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Соответствующий сконденсированный Рс-белок может быть очищен при помощи аффинной колонки Белка А. Как известно, Рс характеризуется длинным фармакокинетическим периодом полупревращения ίη νίνο, и, как оказалось, белки, конденсированные с Рс, обладают существенно более длинным периодом полупревращения ίη νίνο, чем их неконденсированный прототип. Кроме того, конденсация с Рс регионом позволяет димеризовать/полимеризовать молекулы, что может способствовать биологической активности некоторых молекул.

5' фланкированная последовательность может быть гомологичной (т.е. из тех же самых видов и/или штаммов, что и клетка хозяина), гетерологичной (т.е. из других видов, чем виды и/или штаммы клетки хозяина), гибридом (т.е. комбинацией 5' фланкирующих последовательностей, более чем из одного источника), синтетической или она может быть нативным Родственным Белком, Родственным Пептидом или 5' фланкирующей последовательностью гена пептида ΝΤΡ. По существу, источником 5' фланкирующей последовательности может быть любой одноклеточный прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организ или любое растение при условии, что 5' фланкирующая последовательность функциональна и может быть активизирована механизмами клетки хозяина.

5' фланкирующие последовательности, необходимые в векторах, описанных в данном изобретении, могут быть получены любым из известных в науке методов. Как правило, нужные в данном случае 5' фланкирующие последовательности, которые отличаются от фланкирующих последовательностей, кодирующих Родственный Белок, Родственный Пептид или ген пептида ΝΤΡ, предварительно будут идентифицированы путем картирования и/или путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой и, таким образом, могут быть изолированы из соответствующих тканей путем применения соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях полная нуклеотидная последовательность 5' фланкирующей последовательности может быть известна. В данном случае 5 фланкирующая последовательность может быть синтезирована, используя описанные выше методы для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.

Информацию о том, известна ли вся 5' фланкирующая последовательность или только ее часть, можно получить, используя ΡΟΒ, и/или путем скрининга геномной библиотеки подходящим олигонуклеотидом, и/или фрагментами 5' фланкирующей последовательности из тех же самых или других разновидностей.

Если 5' фланкирующая последовательность не известна, то из крупной части ДНК, которая может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены, может быть изолирован фрагмент ДНК, содержащий 5' фланкирующую последовательность. Выделение может быть достигнуто путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой, используя один или более тщательно отобранных ферментов, чтобы изолировать надлежащий фрагмент ДНК. После расщепления желательный фрагмент может быть изолирован путем очистки на геле агарозы на колонке ^^адеη®, или другими известными методами. Выбор подходящих ферментов для достижения этой цели очевиден для специалиста.

Началом репликационного элемента обычно является часть коммерчески доступных прокариотических векторов экспрессии, и указанный элемент способствует амплификации вектора в клетке хозяина. Амплификация вектора в виде определенного числа дубликатов в некоторых случаях может иметь важное значение для оптимальной экспрессии Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Если вектор выбора не содержит начала репликационного сайта, то его можно химически синтезировать на основе известной последовательности и лигировать в виде вектора. Элемент завершения транскрипции типично расположен в позиции 3' конца Родственного Белка, Родственного Пептида или кодирующей последовательности пептида ΝΤΡ и служит для завершения транскрипции Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Обычно, элемент завершения транскрипции в прокариотических клетках является С-С-богатым фрагментом, за которым следует поли-Т-последовательность. Хотя элемент может быть клонирован из библиотеки или куплен коммерчески, как часть вектора, его можно также легко синтезировать, используя методы для синтеза нуклеиновых кислот, типа описанных выше.

Выбираемый элемент гена маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки хозяина, выращенной в отборной культивационной среде. Типичные гены маркера выбора кодируют белки, которые: (а) придают прокариотическим клеткам хозяина сопротивляемость к антибиотикам или другим токсинам, например, к ампициллину, тетрациклину или канамицину, (б) дополняют ауксотрофные дефициты клетки; или (с) снабжают критическими питательными веществами, не доступные из сложных питательных смесей. Предпочтительно выбираемыми маркерами являются: ген резистентности к канамицину, ген резистентности к ампициллину и ген резистентности к тетрациклину.

- 32 006603

Элемент, связывающий рибосому, обычно называемый последовательностью Шайна-Делгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты), обычно необходим для инициирования трансляции мРНК. Этот элемент обычно расположен в позиции 3' промотора и в позиции 5' последовательности кодирования Родственного Белка, Родственного Пептида или синтезирующегося пептида ΝΤΡ. Последовательность Шайна-Делгарно различна, но является типичным полипурином (то есть, содержит большое количество А-С). Было идентифицировано много последовательностей Шайна-Делгарно, каждая из которых может быть легко синтезирована специалистом, путем применения сформулированных здесь методов, и использована в прокариотическом векторе.

В случае, когда Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ выделяются из клетки хозяина, последовательность сигнала может использоваться для направления Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ из клетки хозяина, где они синтезируется, а карбокси-терминальная часть белка может быть удалена, чтобы предотвратить анкеровку мембраны. Как правило, последовательность сигнала расположена в области кодирования Родственного Белка/Родственного Пептида/гена пептида ΝΤΡ или кДНК, или непосредственно в 5' конце региона кодирования Родственного Белка/Родственного Пептида/гена пептида ΝΤΡ. Было идентифицировано много сигнальных последовательностей, и любая из них, которая является функциональной в отобранной клетке хозяина, может использоваться совместно с Родственным Белком/Родственньм Пептидом/геном пептида ΝΤΡ или кДНК. Поэтому, последовательность сигнала может быть гомологичной или гетерологичной Родственному Белку/Родственному Пептиду/гену пептида ΝΤΡ или кДНК и может быть гомологичной или гетерологичной Родственному Белку/ Родственному Пептиду/гену пептида ΝΤΡ или кДНК. Кроме того, сигнальная последовательность может синтезироваться химически, используя методы, сформулированные выше. В большинстве случаев, секреция полипептида из клетки хозяина в присутствии сигнального пептида приводит к удалению амино-концевого метионина из полипептида.

Во многих случаях, транскрипция Родственного Белка/Родственного Пептида/гена пептида ΝΤΡ или кДНК может быть увеличена присутствием в векторе одного или более интронов. Это особенно справедливо, когда Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ произведены в эукариотических клетках хозяина, особенно в клетках-хозяевах млекопитающих. Используемые интроны могут быть природного происхождения, встречающиеся в Родственном Белке/Родственном Пептиде / гене пептида ΝΤΡ, особенно где используемый ген является геномной последовательностью полной длины или ее фрагментом. Если интрон не встречается в природе в пределах гена (как большинство кДНК), то интрон(ы) может быть получен из другого источника. Вообще, позиция интрона относительно фланкирующей последовательности и Родственного Белка/Родственного Пептида/гена пептида ΝΤΡ важна, поскольку, чтобы быть эффективным, интрон должен быть транскрибирован. По существу, когда Родственный Белок/Родственный Пептид/ген пептида ΝΤΡ, включенный в вектор экспрессии, является молекулой кДНК, то предпочтительная позиция для интрона - 3' к сайту начала транскрипции и 5' к поли-Апоследовательности завершения транскрипции. Предпочтительно в случае Родственного белка / Родственного Пептида/кДНК пептида ΝΤΡ интрон или интроны будут расположены на одной или другой стороне молекулы кДНК (то есть, 5' или 3') таким образом, что это не прерывает данную кодирующую последовательность. Для практической реализации данного изобретения можно использовать любой интрон из любого источника, включая любой вирусный, прокариотический и эукариотический организм (растение или животное), при условии, что он совместим с клеткой (клетками) хозяина, в которую он вводится. Здесь включены также и синтетические интроны. В векторе можно произвольно использовать больше чем один интрон.

Когда один или больше сформулированных выше элементов отсутствуют в используемом векторе, они могут быть индивидуально получены и лигированы в вектор. Методы, используемые для получения каждого из элементов, известны специалистам и сопоставимы с методами, сформулированным выше (т.е. синтез ДНК, скрининг библиотеки, и т. п.).

Заключительные векторы, используемые для практической реализации данного изобретения, обычно сконструированы из исходных векторов типа коммерчески доступного вектора. Такие векторы могут содержать или не содержать некоторые из элементов, которые будут включены в законченный вектор. Если ни один из желательных элементов не присутствует в стартовом векторе, то каждый элемент может быть индивидуально лигирован в вектор путем сокращения вектора соответствующей эндонуклеазой (эндонуклеазами), ограничивая его таким образом, чтобы концы элемента были лигированы и концы вектора были совместимы для лигирования. В некоторых случаях необходимо притуплять предназначенные для совместного лигирования концы, чтобы получить удовлетворительную лигатуру. Притупление достигается первым наполнителем, заполняющим липкие концы, используя ДНК полимеразу Кленова или Т4 ДНК полимеразу в присутствии всех четырех нуклеотидов. Эта процедура известна в науке и описана выше, например в работе Самбрука и других. Альтернативно, два или больше из элементов, которые будут введены в вектор, сперва могут быть лигированы вместе (если они должны быть расположены смежными друг с другом), а затем лигированы в вектор.

Дополнительный метод для конструирования вектора состоит в том, чтобы провести все лигации различных элементов одновременно в одну реакционную смесь. В таких условиях из-за неправильной

- 33 006603 лигации или вставки элементов будет произведено много бессмысленных или нефункциональных векторов. Функциональный вектор может быть идентифицирован и отобран только путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой.

Предпочтительные векторы для реализации данного изобретения - это те, которые совместимы с клетками-хозяевами организмов бактерий, насекомых и млекопитающих. Такие векторы включают, среди прочего, рСВ11, рСВ3, и рс^NА3.1 (1пукго§еп Сотрапу, 8ап П1е§о, Са11Е), рВ811 (81га1а§епе Сотрапу, Ьа 1о11а, Са1Ш), рЕЖ5Ь (№уа§еп, Майкоп, \У1к.), РОЕХ (Рйагташа Вю1еск Р1кса1а^ау, Ν.Ι), рЕОЕР-№ (С1оп1еск Ра1о Ако, Са1Щ, рЕШ (В1иеВас11; 1пукго§еп), и рБак1ВасЭиа1 (Оксо/ВЕБ, Огапб 1к1апб, Ν.Υ.).

После того, как вектор был построен и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полную длину или усеченную структуру Родственного Белка, Родственного Пептида, или пептида №ГР, была вставлена в надлежащий сайт вектора, законченный вектор может быть вставлен в подходящую клетку хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Клетки хозяина могут быть прокариотическими клетками-хозяевами (типа Е. Со11), или эукариотическими клетками-хозяевами (типа клеток дрожжей, клеток насекомых или клеток позвоночных). Клетка хозяина, культивируемая в соответствующих условиях, может синтезировать Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΕ, которые впоследствии могут быть выделены из среды культивирования (если клетка хозяина выделяет их в среду) или непосредственно из производящей их клетки хозяина (если клетка хозяина не выделяет их в среду).

После выделения Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΕ может быть очищен, используя такие методы, как хроматография на молекулярных ситах, аффинная хроматография и т.п. Выбор клетки хозяина для получения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида №ГР будет частично зависеть от того, должны ли гликозилироваться или фосфорилироваться Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид №ГР (в таком случае, в качестве клетки-хозяина предпочтительны эукариотические клетки), а также от способности клетки хозяина свернуть белок в виде его нативной третичной структуры (например, надлежащая ориентация дисульфидных мостиков, и т.д.), таким образом, чтобы из Родственного Белка или Родственного Пептида получить биологически активный белок, или из пептида №ГР получить пептид, обладающий биологической активностью. Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΕ могут быть свернуты после синтеза, используя соответствующие химические условия, как это обсуждено ниже. Подходящие клетки или линии клеток, пригодные при осуществлении данного изобретения, включают клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки 293 или 293Т почки человеческого эмбриона (НЕК) или клетки 3Т3. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающих и методов для трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также выделения и очистки продукта может быть осуществлен специалистом путем применения приведенных здесь руководящих принципов. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают линии клеток С08-1 и С08-7 обезьяны и линию клеток СУ-1. Следующие образцовые клетки-хозяева млекопитающих включают линии клеток приматов и линии клеток грызунов, включая трансформированные линии клеток. Пригодны также нормальные диплоидные клетки, штаммы клеток, полученные из первичной ткани в виде культур ш уйго, а также первичные животные ткани, культивируемые в искусственной среде. В гене выбора клетки-кандидаты могут быть генотипично несовершенные или могут содержать доминантно действующий ген выбора. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают, без ограничения, клетки нейробластомы мыши ЮА, НеЬа, клетки Б-929 мыши, линии 3Т3, полученные от Швейцарца, Ва1Ь-с или ΝΙΗ мышей, линии клеток ВНК или НаК хомяка.

Для данного изобретения в качестве клетки-хозяина аналогично пригодны также и бактериальные клетки. Например, в области биотехнологии хорошо известны как клетки-хозяева различные штаммы Е. сой (например, НВ101, ОН5.а1рка., ΌΗ10, и МС1061). Различные штаммы В. киЫШк, Ркеиботопак крр., другие ВасШик крр., 81гер1отусек крр., и т.п. можно также использовать в этом методе. Для экспрессии полипептидов, описанных в данном изобретении, в качестве клетки-хозяина можно использовать также клетки многих дрожжевых штаммов, известных специалистам.

Кроме того, где желательно, в методах данного изобретения могут использоваться также системы клеток насекомых. Такие системы описаны например у Киттса и других (Вю1ескшдиек, 14:810-817 [1993]), у Луклоу (Сигг. 0рш. Вю1ес11поБ, 4:564-572 [1993]) и Луклоу и других (1. У1го1, 67:4566-4579 [1993]). Предпочтительными клетками насекомых являются 8ί-9 и Н15 (1пуйго§еп, Саг1кЬаб, Са11Е).

Инсерция (также обозначаемая как трансформация или трансфекция) вектора в отобранную клетку хозяина может быть достигнута методами хлорида кальция, электропорации, микроинъекции, липофекции или ОЕАЕ-декстрана. Отобранный метод частично будет зависеть от типа используемой клетки хозяина. Эти и другие подходящие методы известны специалистам и сформулированы, например, у Самбрука и других (см. выше).

Клетки хозяина, содержащие вектор (т.е., трансформированный или трансфектированный), могут быть культивированы, применяя хорошо известные специалисту стандартные среды. Эти среды обычно должны содержать все питательные вещества, необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для культивирования клеток Е. сок являются, например, Бульон Лурия (ЬВ) и/или Отменный Бульон (^Γπίχ Вгой). Подходящими средами для культивирования эукариотических клеток являются

- 34 006603

ΚΡΜΙ 1640, МЕМ, ΌΜΕΜ, которые могут быть дополнены сывороткой и/или факторами роста, как этого требует специфика культивируемой клетки. Подходящая среда для клеток насекомых - эта среда Грейса, к которой, по мере необходимости, добавлен дрожжевой гидролизат, гидролизат лактальбумина и/или сыворотка эмбриона теленка. Как правило, к среде культивирования добавляется только антибиотик или другой компонент, способствующий селективному росту трансформированных клеток. Применяемый компонент будет определяться выбираемым маркерным элементом, присутствующим на плазмиде, при помощи которой клетка хозяина была преобразована. Например, если выбираемый маркерный элемент устойчив к канамицмину, то в таком случае компонентом, который добавляют к среде культивирования, будет канамицин.

Количество Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, вырабатываемого в клетке хозяина, можно определить используя стандартные методы, известные в науке. Такие методы включают, без ограничения, анализ \Уек1егп Ыо1, электрофорез в δΌδ-полиакриламидном геле, неденатурирующий гель-электрофорез, НГЬС разделение, масс-спектроскопию, иммунное осаждение и/или определение активности, как например, определение сдвига гели связывающей ДНК,

Если было предусмотрено, что Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ должны выделяться из клеток хозяина, то большая часть Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ может быть найдена в среде культивирования клетки. Белки, полученные этим способом, как правило, не содержат амино-терминальный метионин, поскольку в процессе секреции он удаляется из клетки. Если Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ не выделяются клетками хозяина, но содержатся в цитоплазме и/или ядре (для клеток-хозяев эукариотов), или в цитозоли, (для клеток-хозяев грам-отрицательных бактерий), то они могут содержать амино-терминальный метионон.

Для выделения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, содержащихся в цитоплазме и/или ядре клетки хозяина, обычно, клетки хозяина сначала разрушают механически или при помощи детергента, чтобы содержание клетки перешло в буферный раствор. После этого, Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть выделены из этого раствора.

Выделение Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ из раствора может быть достигнута различными методами. Если синтезируется такой белок, который в обоих его концах, карбоксильном и аминном, содержит метку типа гекса-Гистидина (например. ΝΤΡ пептид/гекса-Гис), или другой маленький пептид типа ЕЬАС (81дта-А1бпсй, δΐ. Ьошк, М8), или кальмодулин-связывающий пептид (81га1адепе, Ьа 1о11а, СА), то его можно существенно очистить одностадийным процессом, путем пропускания раствора через аффинную колонку, где матрица колонки имеет высокий аффинитет к метке или непосредственно к белку (т.е. моноклональное антитело, специфически опознающий Родственный Белок или Родственный Пептид). Например, полигистидин обладает высоким аффинитетом и специфичностью к никелю, цинку и кобальту. Таким образом, используя метод иммобилизированной ионами металлов аффинной хроматографии, в частности, аффинные полимеры, содержащие никель (например, их используют в системах О|адеп'к 01Лехргекк кук1ет или 1пу11годеп'к Хргекк), или аффинные полимеры, содержащие кобальт (например, их используют в системе ΒΌ Β^ο8с^еηсе8-С^ОNΤΕСН'8 Τа1οη), можно добиться очистки Родственного Белка/полиГис. (Смотрите например, Аусубель и другие, ред., Текущие Протоколы в Молекулярной Биологии), Раздел10.11.8, 1оНп \УПеу & 8опк, Нью-Йорк [1993]).

Если Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ получены без присоединенной метки, и не доступны никакие антитела, то используют другие известные методы очистки. Такие методы включают, без ограничения, ионообменную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию гидрофобного взаимодействия, хроматографию на молекулярных ситах, НГЬС, электрофорез нативной гели в комбинации с элюцией геля, и препаративное изоэлектрическое фокусирование (I корите тасЫпе/1есНп1цие, НоеГег 8с1епййс). В некоторых случаях для достижения высокой степени очистки два или более из этих методов могут быть объединены.

Если ожидается, что Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ, прежде всего содержатся внутри клетки, то внутриклеточный материал (включая тела включения для грамотрицательных бактерий) может быть извлечен из клетки хозяина, используя любую стандартную технику, известную специалисту. Например, с целью извлечения периплазмы/цитоплазмы, клетки хозяина могут подвергаться лизису французским прессом, гомогенизацией и/или ультразвуком с последующим центрифугированием. Если Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ образуют тела включения в цитозоли, то такие тела включения часто связываются с внутренними и/или внешними клеточными мембранами и, таким образом, после центрифугирования они прежде всего концентрируются в осадочном материале. В таком случае тела включения расщепляют, извлекают их содержимое и растворяют, обрабатывая осадочный материал при экстремальных значениях рН, или же агентом, вызывающим диссоциацию комплексов, таким как детергент, гуанидин, производные гуанидина, мочевина или производные мочевины, в присутствии восстанавливающего агента, такого как дитиотрейтол при щелочных значениях рН, или как трис-карбоксиэтилфосфин при кислых значениях рН. В такой растворимой форме Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть проанализированы, используя гель-электрофорез, иммунное осаждение и т.д. Если нужно выделить Родственный Белок, Родственный

- 35 006603

Пептид или пептид ΝΤΡ, выделение может быть достигнуто, используя стандартные методы типа сформулированных ниже и описанных Марстоном и другими (Ме(Н. Εηζ., 182:264-275 [1990]).

В некоторых случаях после выделения Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть биологически неактивны. Существуют различные методы для повторного свертывания или превращения полипептида в его третичную структуру и образования дисульфидных связей, которые могут использоваться для восстановления биологической активности. Такие методы включают обработку растворенного полипептида при рН обычно более чем 7 и присутствие специфической концентрации агента, вызывающего диссоциацию комплексов. Методика выбора агента, вызывающего диссоциацию комплексов, очень подобна методике, которую используют при выборе метода растворения тела включения, но обычно при более низкой концентрации. При этом не обязательно, чтобы тот же самый агент, вызывающий диссоциацию комплексов и используемый для растворения, использовался и для диссоциации. В большинстве случаев, свертывающий/окисляющий раствор содержит также и восстанавливающий агент, или же восстанавливающий агент совместно с его окисленной формой в определенном соотношении для создания специфического окислительно-восстановительного потенциала, позволяющего осуществить перестановку дисульфидных связей и образование цистеиновых мостиков белка. Некоторые из обычно используемых окислительно-восстановительных пар включают цистеин/цистамин, глутатион (С8Н)/дитиобис С8Н, хлорид двухвалентной меди, дитиотреитол (ПТТ)/дитиан-ОТТ, 2-меркаптоэтанол (ЬМЕ)/дитио-Ь(МЕ). Во многих случаях для увеличения эффективности свертывания необходим сорастворитель и другие обычные реактивы, в том числе глицерин, полиэтиленгликоль различных молекулярных весов и аргинин.

Если Родственный Белок, Родственный Пептид или тела включения пептида ΝΤΡ в значительной степени не сформированы в клетке хозяина, то после центрифугирования гомогената, Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ следует искать прежде всего в надосадочной жидкости, и Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть выделены из надосадочной жидкости методами типа сформулированных ниже.

В тех ситуациях, где это предпочтительно для частичного или полного выделения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, очистка может быть достигнута использованием известных специалисту стандартных методов. Такие методы включают, без ограничения, электрофоретическое разделение, сопровождаемое электроэлюцией, различные типы хроматографии (иммуноаффинные, молекулярных сит и/или ионного обмена), и/или жидкостную хроматографию высокого разрешения. В некоторых случаях для полной очистки целесообразно использование нескольких методов.

В дополнение к подготовке и очистке Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ и используемых рекомбинантных методов ДНК Родственные Белки, Родственные Пептиды или пептиды ΝΤΡ и их фрагменты, варианты, гомологи и производные получают химическими методами синтеза (типа твердофазного синтеза пептидов) с использованием методов, известных в технике, таких как сформулированные Меррифильдом и другими, (1. СНет. 8ос., 85:2149 [1963]), Хаутеном и другими, (Ггос. №И. Асаб. 8ск И8А , 82:5132 [1985]), а также Стюартом и Янгом (Твердофазный Синтез Пептидов, йегсе СНет1са1 Со., КоскГогб, 111 [1984]). Такие полипептиды могут синтезироваться с метионином или без метионина в виде аминного терминала. Химически синтезируемые Родственные Белки, Родственные Пептиды или пептиды ΝΤΡ могут быть окислены, используя методы образования дисульфидных мостиков, сформулированные в этих трудах. Предполагают, что Родственные Белки, Родственные Пептиды или пептиды ΝΤΡ будут обладать биологической активностью, сопоставимой с активностью Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ, полученных путем рекомбинации или путем выделения из природных источников, и, таким образом, могут использоваться попеременно с рекомбинантным или природным Родственным Белком, Родственным Пептидом или пептидом ΝΤΡ.

Химически измененный Родственный Белок, Родственный Пептид или композиции пептида ΝΤΡ, в которых Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ связаны с полимером, рассмотрены в данном изобретении. Отобранный полимер обычно является водорастворимым, так чтобы связанный с ним белок в водной среде, типа физиологической среды, не выпадал в осадок. Отобранный полимер обычно модифицируют, чтобы он имел единственную реакционную группу, такую как активная сложноэфирная группа для ацилирования или альдегидная группа для алкилирования, чтобы можно было регулировать степень полимеризации, как это предусмотрено в указанных методах. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным или линейным. В указанные полимеры Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ включены также и смеси полимеров.

В некоторых случаях желательно получить нуклеиновую кислоту и/или аминокислотные варианты встречающихся в природе Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ. Варианты нуклеиновых кислот могут быть получены, используя сайт, направляющий мутагенез, ГСК. амплификацию или другие соответствующие методы, где праймер(ы) имеют желательные точечные мутации (описание методов мутагенеза см. Самбрук и др., (выше) и Аусубель и другие (выше)). Для получения вариантов таких кислот может использоваться также и химический синтез с применением методов, описанных Энгельсом и др. (см. выше). Можно использовать также и другие известные специалисту методы.

- 36 006603

Предпочтительными вариантами нуклеиновых кислот являются те, которые содержат нуклеотидные замещения, ответственные за предпочтительный кодон в клетке хозяина, используемой для получения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Такая оптимизация кодона может быть определена через компьютерные алгоритмы, которые включают таблицы частот кодона, типа Есо1нд11 Сой, показывающие предпочтение кодона высоко выраженных бактериальных генов, как это предусмотрено Версией 9.0 Пакета Компьютерной Группы Генетики Висконсинского Университета, Майкоп, \νίκ. Другие полезные таблицы частот кодона включают Се1едапк_Ыдй.сой, Се1едапк_1о^.сой, ПгокорЫ1а_Ыдй.сой, Нитап_Ыдй.сой, Ма^ζе_Ыдй.сοй, и Уеак1_1нд11.сой. Другие предпочтительные варианты по сравнению с диким типом - это те, которые кодируют консервативные замещения аминокислот, как описано выше (например, когда заряд или полярность боковой цепи природной аминокислоты существенно не изменяется при его замещении различными аминокислотами), и/или те, которые предназначены для создания нового(ых) сайта(ов) гликозилирования и/или, фосфорилирования или те, которые предназначены для удаления существующего(их) сайта(ов) гликозилирования и/или фосфорилирования.

Родственные Белки, Родственные Пептиды, пептиды ΝΤΡ, их фрагменты, гомологи, варианты, производные и соли могут быть получены, используя обычные методы синтеза пептида, известные специалистам. Эти методы включают химические методы сочетания (ср. Вунш, Е: «МеШойеп йег огдашксйеп Сйет1е», том 15, часть 1+2, ЗупФеке νοη Ρерΐ^йеη, Лпете Уег1ад, ЗШИдаИ (1974), и Баррани, Г., Маррифилд, Р. Б.: «Пептиды», ред. Е. Гросс, Дж. Майенхофер, т. 2, Глава 1, стр. 1-284, Асайетю Ργο^ (1980)), ферментативные методы сочетания (ср. Уидмер, Ф., Иохансен, Дж. Т., Саг1кЬегд Век. Соттип., т. 44, с. 37-46 (1979), и Куллманн, У.: «Ферментативный Синтез Пептида», СВС Бгекк 1пс Воса ВаЮп, Р1а. (1987), и Уидмер, Ф., Иохансен, Дж. Т., в «Синтетические Пептиды в Биологии и Медицине»:, ред. Алитало, К., Партанен, П., Ватиери, А., с.79-86, Е1кеу1ег, Амстердам (1985)) или комбинацию химических и ферментативных методов, если это экономично и выгодно для проекта. Используя приведенные здесь руководящие принципы, специалисты могут изменить пептидные последовательности Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ с целью получения гомолога, имеющего ту же самую или подобную биологическую активность (биоактивность), как исходный или нативный Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ.

Использование непосредственно не самого белка, а миметических структур данного Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, предоставляет определенные преимущества. Вообще, имитаторы пептидов биологически более аккумулируемы, имеют более длинную продолжительность действия и являются более дешёвыми, чем белки и пептиды.

Таким образом, описанные выше Родственные Белки, Родственные Пептиды и пептиды ΝΤΡ пригодны для получения таких малых химических соединений с подобной биологической активностью и, следовательно, с подобным терапевтическим применением. Пептидные имитаторы Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ могут быть получены путем применения методов комбинаторной химии и других методов, известных в науке (см. например. Труды 20-ого Европейского Симпозиума по Пептидам, ред. Г. Юнг, Е. Байер, стр. 289-336 и приведенные там ссылки).

В науке известны примеры методов структурной модификации пептидов с целью создания имитаторов пептидов; эти методы включают инверсию хиральных центров основной цепи, которая ведет к структурам остатков Ό-аминокислот, способных, особенно в Ν-терминале, увеличить стабильность к протеолитической деградации, не влияя при этом на активность. Пример этого описан в статье Смита К. С., и других, «Т-связывание тритилированного Ό-ала¹ - пептида», Эгид Эеуе1ортеп1 Век., 15, стр. 371-379 (1988).

Другой метод заключается в изменении циклической структуры с целью увеличения стабильности и приводит к структурам типа Ν - С связанных имидов и лактамов (Эде и другие, в сб. «Пептиды: Химия и Биология», ред. Смит и Ривиер, Ексот, Лейден (1991), стр 268-270). Примером этого служат конформационно ограниченные тимопентин-подобные соединения, например, описанные Гольдшейном, Гю и другими в патенте США № 4 457 489 (1985), который включен сюда в виде ссылки.

Третий метод состоит в замещении пептидных связей в Родственном Белке, Родственном Пептиде или пептиде ΝΤΡ псевдопептидными связями, что придает устойчивость к протеолизу. Было описано множество псевдопептидных связей, которые вообще не затрагивают структуру пептида и его биологическую активность. Одним из примеров этого подхода является замещение ретро-инверсо-псевдопептидных связей («Биологически активные ретро-инверсо-аналоги тимопентина», Систо А. и др., в сб. «Пептиды, Химия, Структура и Биология», ред. Ривиер, Дж. Е. и Маршалл, Г. Р. Ексот, Ье1йеп (1990), стр. 722-773) и Дальпоззо и др. (1993), ΙπΙ. 1. Герййе Ρι^ώ Век., 41:561-566, включенные здесь в виде ссылок). Согласно этой модификации, аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ, описанных выше, за исключением того, что один или больше пептидных связей замещены ретро-инверсопсевдопептидными связями. Предпочтительно, большинство Ν-терминальных пептидных связей замещены, так как такое замещение придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на Ν-терминал.

- 37 006603

Синтез пептидов с одной или более восстановленными ретро-инверсо-псевдопептидными связями известен в науке (Систо (1990) и Дальпоззо и другие (1993), процитированые выше). Таким образом, пептидные связи могут быть замещены непептидными связями, которые позволяют имитатору пептида принимать подобную исходному пептиду структуру и, соответственно, биологическую активность. Можно сделать также и дальнейшие модификации, заменяя химические группы аминокислот на другие химические группы подобной структуры. Другая подходящая псевдопептидная связь, которая, как известно, увеличивает стабильность к ферментативному расщеплению без или небольшой потери биологической активности - эта восстановленная изостерическая псевдопептидная связь (Коудер и другие, (1993), Ιηΐ. 1. РерПбе Рго1ет Век., 41:181-184, включенный здесь в виде ссылки). Таким образом аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательностям Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ за исключением того, что одна или больше пептидных связей замещены изостерическими псевдопептидными связями. Предпочтительно, большинство Νтерминальных пептидных связей замещены, так как такое замещение придает сопротивляемость к протеолизу экзопептидазами, действующими на Ν-терминал. Синтез пептидов с одной или более восстановленными изостерическими псевдопептидными связями известен в технике (Коудер и др., (1993), процитирован выше). Другие примеры включают введение кетометиленовых или метилсульфидных групп для замещения пептидных групп.

Пептоидные производные Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ представляют собой другой класс пептидных имитаторов, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической деятельности и при этом не содержат пептидную связь, придавая таким образом сопротивляемость к протеолизу (Саймон и др., 1992, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 89:9367-9371 и включенный здесь в виде ссылки). Пептоиды - это олигомеры Ν-замещенных глицинов. Было описано множество Ν-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Саймон и др., (1992), процитированный выше и включенный здесь в виде ссылки). Некоторые или все аминокислоты Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ заменены Ν-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.

Усовершенствованию пептидных имитаторов можно способствовать путем определения третичной структуры исходного Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ спектроскопией ЯМР, кристаллографией и/или автоматизированным молекулярным моделированием. Эти методы помогают в развитии новых композиций более высокой потенции и/или большей биоаккумуляции и/или большей стабильности, чем исходный пептид (Деан (1994), ВюЕккаук, 16: 683-687; Коэн и Шатцмиллер (1993), 1. Мо1. Сгарй., 11: 166-173; Уилей и Рич (1993), Меб. Век. Ве^, 13: 327-384; Мур (1994), Τιβηάδ ΡΗα^α^Ι. 8сг, 15: 124-129; Хруби (1993), Вюро1утегк, 33: 1073-1082; Багг и другие, (1993), 8с1. Ат., 269:92-98, все включены сюда в виде ссылок).

После идентификации потенциального пептидного имитатора его можно синтезировать и анализировать, используя методы оценки его активности, описанные в нижеследующих примерах. Данное изобретение включает соединения - пептидные имитаторы, полученные вышеупомянутыми методами, имеющие биологическую активность Родственных Белков, Родственных Пептидов или Пептидов ΝΤΡ и подобную трехмерную структуру. Для специалиста очевидно, что имитатор пептида, имеющий одну или более описанных выше модификаций, может быть получен из любого из Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ. Кроме того будет очевидно, что имитаторы пептидов, описанные в данном изобретении, в дополнение к их применению в терапевтических композициях, могут далее использоваться для получения еще более активных непептидных соединений.

Сегодня существует множество организаций, которые способны синтезировать описанные здесь Родственные Белки, Родственные Пептиды и Пептиды ΝΤΡ. Например, учитывая последовательность Пептида ΝΤΡ, организация может синтезировать пептид и переслать синтезируемый пептид с сопровождающей документацией и доказательством идентичности пептида.

Это изобретение охватывает также использование Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ и соответствующих им молекул нуклеиновых кислот для испытательных тестов, для качественного или количественного определения Родственных Белков, Родственных Пептидов, пептидов ΝΤΡ, ДНК или соответствующую РНК Родственного Белка/Родственного Пептида/пептида ΝΤΡ, присутствующих в тканях млекопитающих или жидких образцах тела. Родственные Белки, Родственные Пептиды, пептиды ΝΤΡ и соответствующие им молекулы нуклеиновых кислот можно использовать в качестве препаратов в испытаниях биологической активности Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ или кодированного Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Родственный Белок, Родственный Пептид или последовательность нуклеиновой кислоты пептида ΝΤΡ могут быть полезным источником для гибридных зондов, предназначенных для качественного или количественного определения содержания Родственного Белка, Родственного Пептида или ДНК пептида ΝΤΡ или соответствующей РНК в тканях млекопитающих или жидких образцах тела.

Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ, которые - сами по себе биологически неактивны, могут быть применены для получения антител, которые распознают и/или связываются с Родственными Белками, Родственными Пептидами или пептидами ΝΤΡ. Такие антитела можно полу

- 38 006603 чить, используя стандартные методы. Таким образом, в пределах данного изобретения рассмотрены также антитела, которые реагируют с Родственными Белками, Родственными Пептидами или пептидами ΝΤΡ, так же как и с короткоцепными фрагментами антител и с другими реагирующими фрагментами таких антител. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, рекомбинантными, химерными, однонитевыми и/или биспецифическими. Как правило, антитело или его фрагмент имеет человеческое происхождение или гуманизирован, т.е., при введении в организм пациента, предотвращает или минимизирует иммунную реакцию на антитело. Предпочтительные антитела - антитела человека, как поликлональные, так и моноклональные. Фрагментом антитела может быть любой фрагмент, который реагирует с Родственными Белками, Родственными Пептидами или пептидами ΝΤΡ данного изобретения, такие как Е_аь, Е_аь, и т.д. Данное изобретение включает также гибридомы, вырабатываемые в присутствии любого Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, как антигена к отобранному млекопитающему, например, к клеткам млекопитающего (например, к клеткам селезенки), слившимся с некоторыми раковыми клетками, для создания известными методами линий увековеченных клеток. Данное изобретение охватывает также методы, используемые для создания линий таких клеток и антител, направленных против целых молекул или отдельных частей Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ.

Антитела могут далее использоваться ίη νίνο и ίη νίίτο для диагностических и исследовательских целей в меченном виде для обнаружения присутствия Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ в образцах жидкостей или клеток тела.

Это изобретение охватывает также использование одного или более Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ, как калибровочных стандартов в анализах, которых проводят для качественного или количественного определения Родственных Белков, Родственных Пептидов, пептидов ΝΤΡ, ДНК или соответствующую РНК Родственного Белка/Родственного Пептида/пептида ΝΤΡ, присутствующих в тканях млекопитающих или жидких образцах тела.

Данное изобретение описывает новые методы лечения тех заболеваний, которые требуют удаления клеток, таких как клетки доброкачественных и злокачественных опухолей, железистой гиперплазии (например простаты), нежелательных волос на лице, бородавок и нежелательных жировых тканей. Такой метод включает введение больному организму млекопитающего терапевтически эффективных количеств Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ.

Болезнь может быть, например, опухолью легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, лимфатического узла и лимфатической системы и других органов.

Используемый здесь термин «злокачественная опухоль» охватывает все формы карцином, сарком и меланом человека, которые встречаются в плохо дифференцированной, умеренно дифференцированной и хорошо дифференцированной формах.

Это изобретение удовлетворяет потребность в способе лечения, при помощи которого можно удалить доброкачественные опухоли с меньшим риском и меньшими нежелательными побочными эффектами, характерными для хирургии. Особенно необходим метод удаления хирургическим путем доброкачественных опухолей из опасных областей, таких как места, расположенные глубоко в теле (например, мозг, сердце, легкие, и другие).

Способ лечения заболеваний, требующих удаления клеток, может использоваться в сочетании с обычными методами лечения заболеваний, типа хирургического вмешательства, химиотерапии и радиации. Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть введены пациенту до, во время или после таких обычных лечебных процедур.

Заболеваниями, которые можно лечить подобным образом, являются также гиперплазия, гипертрофия или чрезмерно быстрый рост ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также лимфатических узлов и лимфатической системы.

Другие заболевания, которые можно лечить, используя метод данного изобретения - это вирусные, бактериальные или паразитические изменения ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичников, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также узлов лимфы и лимфатической системы.

- 39 006603

Заболевание, которое будет рассмотрено ниже, может также быть уродством или нарушением ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, а также узлов лимфы и лимфатической системы.

В частности, заболевание, которое будет рассмотрено ниже, может быть гипертрофией миндалевидной железы, гиперплазией простаты, псориазом, экземой, дерматозами или геморроем. Заболевание, которое будет рассмотрено ниже, может быть сосудистой болезнью, типа атеросклероза или артериосклероза, или сосудистой болезни, типа варикозных вен. Заболевание, которое будет рассмотрено ниже, также может быть косметической модификацией ткани, типа кожи, глаза, уха, носа, горла, рта, мышцы, соединительной ткани, волос или грудной ткани.

В сферу данного изобретения включены терапевтические композиции Родственных Белков, Родственных Пептидов и/или пептидов ΝΤΡ. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ с добавленным к нему фармацевтически приемлемым носителем. Материалом носителя может быть вода для инъекции, предпочтительно содержащая добавленные к ней другие материалы, обычно используемые для введения в организм млекопитающих. Как правило, для терапевтического применения Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ вводятся в виде композиции, включающей очищенный Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ в сочетании с одним или большим количеством физиологически приемлемых носителей, наполнителей или разбавителей. Исключительно подходящими носителями являются нейтральный буферированный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Предпочтительно продукт сформулирован в виде лиофилизированной массы с использованием соответствующих наполнителей (например, сахарозы). При желании могут быть включены также и другие стандартные носители, разбавители и наполнители. Композиции, содержащие известные специалистам буферные системы с соответствующим диапазоном значения рН, в том числе буфер Триса, имеющий рН приблизительно 7.0-8.5 или ацетатный буфер, имеющий рН приблизительно 4.0-5.5, могут дополнительно содержать сорбитол или подходящую замену.

Использование Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ, конъюгированных, взаимосвязанных, сцепленных с антителом, фрагментом антитела, подобной антителу молекулой или молекулой с высоким аффинитетом к определенному маркеру опухоли, такой как клеточный рецептор, сигнальный пептид или сверх-выраженный фермент для прицеливания на нежелательные клеточные элементы, также затронуто данным изобретением. Антитело, фрагмент антитела, подобная антителу молекула или молекула с высоким аффинитетом к определенному маркеру опухоли используются для прицеливания на Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ, сопряженных с определенной целевой клеткой или тканью. Например, опухоль с отличительным поверхностным антигеном или выраженным антигеном может преследоваться антителом, фрагментом антитела или подобной антителу связывающей молекулой в результате чего клетки опухоли могут быть убиты Родственным Белком, Родственным Пептидом или пептидом ΝΤΡ. Такой подход с прицеливанием антитела имеет ожидаемые преимущества, выражающиеся в уменьшении дозировки, увеличении вероятности их связывания или поглощения целевыми клетками и увеличении их полезности для прицеливания и обработки метастатических опухолей и опухолей микроскопических величин.

Это изобретение также охватывает использование Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ, конъюгированных или взаимосвязанных или сцепленных к белку или другой молекуле, для образования композиции, которая расщепляет участок(и) опухоли, или смежный участок(и), или опухолевые и другие нежелательные клетки ферментом, специфическим для данной опухоли, или протеазой, или конъюгированным антителом, которые нацелены на опухоль или другие нежелательные клетки; при этом композиция выделяет Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ около участка(ков) опухоли или других нежелательных клеток.

Это изобретение охватывает также использование Родственных Белков, Родственных Пептидов и пептидов ΝΤΡ, конъюгированных, или взаимосвязанных, или сцепленных с белком или другой молекулой для образования композиции, которая выделяет Родственный Белок, Родственный Пептид, или пептид ΝΤΡ, или некоторые биологически активные фрагменты Родственного Белка, Родственного Пептида, или пептида ΝΤΡ при освещении обрабатываемой ткани видимым светом (как в случае лазерной терапии или другой фотодинамической или фотоиндуцированной терапии), и другими формами электромагнитной радиации, такими как инфракрасная и ультрафиолетовая радиация, рентгеновские или гамма лучи, локальная термообработка, альфа или бета радиация, ультразвуковая эмиссия или другие источники ограниченной энергии.

Родственные Белки, Родственные Пептиды или пептиды ΝΤΡ могут использоваться отдельно, вместе или в комбинации с другими фармацевтическими композициями, такими как цитокины, факторы

- 40 006603 роста, антибиотики, агенты индуцирующие апоптоз, противовоспалительные и/или химиотерапевтические агенты в соответствие с лечебными показаниями.

Это изобретение охватывает также терапевтические композиции Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ, использующие дендримеры, фуллерены и другие синтетические молекулы, полимеры и макромолекулы, где Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ и/или соответствующая его ДНК конъюгированы или соединены с молекулой, полимером или макромолекулой, или включены в них самостоятельно или совместно с другими разновидностями молекул, такими, как специфические маркеры опухоли. Например, в патенте США № 5 714 166, «Биологически Активные и/или Целеуказанные Дендримерные Конъюгаты», среди прочего описаны способы получения и применения конъюгатов дендритового полимера, состоящего по крайней мере из одного дендримера с целевой директорией(ами) и конъюгированного с ним по крайней мере одного биологически активного агента.

Это изобретение также охватывает терапевтические композиции Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ и/или генов и носителей для лекарств, таких как липидные эмульсии, мицеллярные полимеры, полимерные микросферы, электрически активные полимеры, гидрогели и липосомы.

Использование Родственных Белков, Родственных Пептидов или пептидов ΝΤΡ или родственных генов или эквивалентов гена, переданных нежелательным клеткам, также затронуто в данном изобретении. Сверхэкспрессия Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ в пределах опухоли может использоваться, чтобы индуцировать смерть клеток опухоли и тем самым уменьшать в ней популяцию клеток. Полагают, что передача гена или эквивалента гена Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, с целью обработки нежелательных клеточных элементов, имеет преимущества, так как требует малых доз и проникает в потомственные образования целевых клеточных элементов, обусловливая тем самым потребность менее частой терапии и меньшей общей терапии. Это изобретение также охватывает передачу генов, которые кодируют слившийся белок, содержащий Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ и нежелательные клети или соседние им клети, где, после экспрессии гена, образования и/или выделения слившегося белка, последний расщепляется при воздействии на них нативных ферментов или протеаз, а также под влиянием предшественников лекарств, которые выделяют Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ в нежелательные клетки или около них.

Использование клонированных рекомбинантных конъюгатов типа Родственный Белок-, Родственный Пептид-, или ΝΤΡ пептид-антитело; клонированных рекомбинантных конъюгатов типа Родственный Белок-, Родственный Пептид-, или ΝΤΡ пептид-фрагмент антитела; клонированных рекомбинантных конъюгатов типа Родственный Белок-, Родственный Пептид-, или ΝΤΡ пептид-белок подобный антителу также затронуто в данном изобретении. Преимущества клонированного Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, объединенного с нацеленным конъюгатом (типа антитела, фрагмента антитела, подобной антителу молекулы или молекулы с высоким аффинитетом к рецептору, специфическому к раку или другому маркеру опухоли), состоят в том, что такая молекула объединяет описанные выше преимущества нацеливания в дополнение к преимуществам производства и стандартизации клонированной конъюгированной молекулы.

Твердые формы дозировки для орального приема включают, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, порошки, и гранулы. В таких твердых формах дозировки, активное соединение предпочтительно смешивают по крайней мере с одним из следующих: (а) с одним или более инертным наполнителем (или носителем), таким как цитрат натрия или двузамещенный фосфат кальция; (б) с наполнителями или расширителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремневая кислота; (в) со связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик; (г) с гигроскопическими веществами типа глицерина; (д) с распадающимися агентами типа агар-агара, карбоната кальция, крахмала картофеля или тапиоки, альгиновой кислоты, некоторых комплексных силикатов и карбоната натрия; (е) с замедлителями растворения типа парафина; (ж) с ускорителями поглощения типа четвертичных аммонийных соединений; (з) со смачивающими агентами типа ацетилового спирта и моностеарата глицерина; (и) с адсорбентами типа каолина и бентонита; и (к) со смазками типа талька, стеарата кальция, стеарата магния, твердых полиэтиленгликолей, лаурилсульфата натрия, или их смесей. Для капсул, таблеток и пилюль формы дозировки могут также включать вещества буферного действия.

Жидкие формы дозировки для орального приема включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным соединениям жидкие формы дозировки могут включать инертные разбавители типа воды или других растворителей, обычно используемых в технике, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы. К образцовые эмульгаторам можно отнести этиловый спирт, изопропиловый спирт, этил-карбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, такие как хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, жирнокислые сложные эфиры сорбитана или смеси этих веществ и т. п.

- 41 006603

Помимо таких инертных разбавителей композиция также может включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подслащивающие, ароматизирующие и благовонные агенты.

Фактические уровни дозировки активных компонентов и методы их введения в композициях данного изобретения могут быть различны с целью получения таких количеств Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, которые являются эффективными для достижения желательной терапевтической ответной реакции на конкретную композицию. Поэтому отобранный уровень дозировки зависит от желательного терапевтического эффекта, пути введения, желательной продолжительности лечения и других факторов.

Млекопитающим, включая людей, эффективные количества могут быть введены, основываясь на площадь поверхности тела. Взаимосвязь дозировок для животных различных видов и размеров, а также для людей (основанный на тд/М² поверхности тела) описана у Е. Дж. Фрайрайх и др. Сапсег Сйето1йег. Кер., 50 (4):219 (1966). Область поверхности тела может быть приблизительно определена по высоте и весу индивидуума (см. например, Научные Таблицы, Се1ду Ρйа^тасеиΐ^са1κ, Лгбх1еу. Ν.Υ., стр. 5 537-538 (1970)).

Полная ежедневная доза Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ может вводиться в организм хозяина одной или несколькими порциями. Дозировки могут содержать такие количества его дольных единиц, которые в сумме составляют ежедневную дозу. Следует, однако, учитывать, что определенный уровень дозы для любого специфического пациента будет зависеть от разнообразия факторов, включая вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время и путь введения, активность введенного препарата, степень поглощения и выделения, комбинацию с другими лекарствами и серьезность конкретной болезни.

Метод введения Родственного Белка, Родственного Пептида или композиции пептида ΝΤΡ согласно данному изобретению включает, без ограничения, введение соединений внутримышечно, орально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутрь опухоли, через пораженный участок, через кожу, интратекально, через нос, интраокулярно, внутриартериально, локально, трансдермально, через аэрозоль, путем инфузии, инъекцией шарика, через имплантированное устройство, системой медленного выделения, и т.д.

Другой метод введения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, - это трансдермальный или кожный путь. Пример такого осуществления - использование заплаты. Заплата может быть приготовлена из тонкой суспензии Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, например, в диметилсульфоксиде (ДМСО) или в смеси диметилсульфоксида с хлопковым маслом и наложена на поверхность опухоли млекопитающего путем помещения заплаты в углубление кожи. Другие среды или их смеси с другими растворителями и твердыми носителями также функционируют одинаково хорошо. Заплата может содержать Родственный Белок, Родственный Пептид или соединение пептида ΝΤΡ в виде раствора или суспензии. В таком случае, заплата может быть наложена на кожу пациента, например, посредством ее помещения в углубление кожи пациента, сформированное путем сгибания кожи и ее закрепления посредством стежков, клипов или других зажимных приспособлений. Этот мешочек должен использоваться таким образом, чтобы был обеспечен непрерывный контакт с кожей без вмешательства млекопитающего. Помимо использования такого мешочка из кожи, может использоваться любое приспособление, которое гарантирует устойчивый контакт заплаты с кожей. Например, для закрепления заплаты на кожу можно использовать клейкий бандаж.

Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ могут быть введены в виде лекарственной формы или препарата с замедленным высвобождением медикамента. Подходящие примеры лекарственных форм с замедленным высвобождением медикамента включают полупроницаемые полимерные матриксы в виде форменных изделий, например, пленки или микрокапсулы. Матриксы с замедленным высвобождением медикамента включают полиэстеры, гидрогели, полилактиды (США 3773919, ЕР 58481), сополимеры Ь-глутаминовой-кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (Сидмэн и другие, Вюро1утетк, 22: 547-556 [1983]), поли-(2-гидроксиэтилметакрилат) (Лэнгер и др., 1. Вютеб. Ма1ег. Кек., 15: 167-277 [1981] и Лэнгер, Сйет. Τесй., 12: 98-105 [1982]), этиленвинилацетат (Лэнгер и другие., (см. выше)) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133,988). Лекарственные составы с замедленным высвобождением медикамента также могут включить липосомы, которые можно приготовить любым из методов, известных в технике (например, Эппштейн и другие, йгос. №111. Асаб. 8сг И8А, 82: 3688-3692 [1985]; ЕР 36676; ЕР 88046 и ЕР 143949).

Другой метод введения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, основан на прямой или косвенной инфузии Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ в опухоль или другую ткань, подвергаемую лечению. Пример такого осуществления - прямая инъекция Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ в опухоль или другую ткань. Лечение может состоять из одной инъекции, многократных инъекций в один приём или ряда инъекций в течение часов, дней или месяцев, что приводит к регрессии или разрушению опухоли или другой ткани. Лечение контролируется посредством биопсии, визуализации или других методов контроля тканевого роста. Инъекцию в опухоль или другую ткань, подвергаемую лечению можно осуществить

- 42 006603 устройством, вставленным в полость, типа носа, рта, уха, влагалища, прямой кишки или уретры или через разрез, чтобы проникнуть в опухоль или ткань ίη νίνο, и можно выполнить с применением метода визуализации или оптической системы, типа ультразвукового индикатора или волоконной оптики для идентификации соответствующего участка для инъекции(й). Другой пример такого осуществления - использование устройства, которое может обеспечить постоянную инфузию Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ в ткань в течение некоторого времени.

Другой метод введения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, заключается в комбинации с хирургической или подобной процедурой, используемой для физического удаления, ампутации или разрушения опухолевых или других тканей или клеточных элементов, удаления или разрушения которых желают достичь путем введения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ непосредственно в область удаляемой опухоли или другой ткани или в соседнюю область, чтобы уничтожить клетки опухоли или воспрепятствовать росту любых клеток, не удаленных или разрушенных в соответствие с вышеописанной процедурой.

Другим методом введения Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ, описанного в данном изобретении, является имплантация устройства в пределах опухоли или другой ткани, подлежащей лечению. Примером такого осуществления является внедрение пластины, содержащей Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ в опухоль или другой ткань. Через какое-то время, пластина выделяет в ткань терапевтическую дозу Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Альтернативно или дополнительно композиция может быть введена локально путем имплантации в обрабатываемую область мембраны, губки, или другого соответствующего материала, на котором были абсорбированы Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ. Если используется имплантационное устройство, то оно может быть внедрено в любую подходящую ткань или орган и поставку Родственного Белка, Родственного Пептида, или пептида ΝΤΡ можно осуществить устройством непосредственно через таблетку, или путем непрерывного введения, или через катетер, используя непрерывную инфузию.

Альтернативный метод введения состоит в том, чтобы ввести одну или более копий гена, кодирующего Родственный Белок, Родственный Пептид, или пептид ΝΤΡ в целевую клетку и, если необходимо, индуцировать копией(ми) гена внутриклеточное образование Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ. Один из способов, при котором генная терапия может быть применена, состоит в том, чтобы использовать ген, кодирующий Родственный Белок, Родственный Пептид или пептид ΝΤΡ, (или геномную ДНК, кДНК и/или синтетическую ДНК, кодирующую Родственный Белок, Связанный Пептид или пептид ΝΤΡ или их фрагмент, вариант, гомолог или производное), которые могут быть действенно связанными с конститутивным или индуцируемым промотором для образования ДНКконструкта генной терапии. Промотор может быть гомологичным или гетерологичным эндогенному гену, кодирующему Родственный Белок, Родственный Пептид, или пептид ΝΤΡ при условии, что он активен в клетке или ткани такого типа, в которую будет помещен конструкт. Другие компоненты ДНКконструкта генной терапии произвольно включают, по мере необходимости, молекулы ДНК, предназначенные для сайт-специфической интеграции (например, эндогенные фланкирующие последовательности, необходимые для гомологичной рекомбинации), тканеспецифичный промотор, ускоритель(и) или замедлитель(и), молекулы ДНК, способные к обеспечению отборного преимущества перед родительской клеткой, молекулы ДНК, необходимые в качестве меток для идентификации трансформированных клеток, отрицательные системы выбора, агенты для специфического связывания клетки (например, агенты для нацеливания на клетки), специфические факторы интернализации клетки и факторы транскрипции для усиления экспрессии вектора, а также факторы, позволяющие изготовлять вектор.

Средства поставки гена к клетке или ткани ίη νίνο или ех νίνο включают (без ограничения) прямую инъекция простой ДНК, баллистические методы, опосредованную липосомой передачу, опосредованную рецептором передачу (комплекса ДНК-лиганд), электропорацию, и осаждение фосфатом кальция, как описано, например, в пат. США № 4,970,154, XVО 96/40958, пат. США № 5,679,559, пат. США № 5,676,954, и пат. США № 5,593,875, описания которых включены сюда в виде ссылок. Они также включают использование вирусного вектора типа ретровируса, аденовируса, адено-связанного вируса, вируса сифилиса, лентивируса, вируса папилломы или вируса герпеса простого, использование конъюгата ДНКбелок и использование липосомы. Использование векторов генной терапии описано, например, пат. США № 5,672,344, пат. США № 5,399,346, пат. США № 5.631,236 и пат. США № 5,635,399, содержания которых включены сюда в виде ссылок.

Ген, кодирующий Родственный Белок, Родственный Пептид, или пептид ΝΤΡ, можно внедрить в некоторые клетки, которые проектировались генетически ех νίνο для экспрессии и секреции Родственного Белка, Родственного Пептида или пептида ΝΤΡ или их фрагментов, вариантов, гомологов или производных, используя для этого методы типа описанных здесь. Такие клетки могут быть животными или человеческими клетками и могут быть получены из собственной ткани пациента или из другого источника, человеческого или нечеловеческого. При желании, клетки могут быть иммобилизованы или они могут быть стволовыми клетками. Однако, чтобы уменьшить шанс на иммунологическую ответную реакцию, предпочитают инкапсулировать клетки, уменьшая инфильтрацию в окружающие ткани. В каче

- 43 006603 стве материала для инкапсуляции обычно используют биологически совместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые позволяют выделить белковый продукт(ы), но предотвращают разрушение клеток посредством иммунной системы пациента или другими вредными факторами окружающих тканей. Методы, используемые для мембранной инкапсуляции клеток, знакомы специалистам, а подготовка инкапсулированных клеток и их имплантация в организм пациентов может быть достигнута без неуместного экспериментирования. См., например, пат. США №№ 4892538; 5011472 и 5106627, содержания которых включены сюда в виде ссылок. Система инкапсуляции живых клеток описана в заявке РСТ, \УО 91/10425, описание которой включено сюда в виде ссылки. Методы формулирования разнообразных других форм с замедленным или регулируемым высвобождением медикамента, типа носителей липосом, био-эродируемых частиц или бусинок также известны специалистам и описаны, например, в пат. США № 5653975, который включено сюда в виде ссылки. Клетки, инкапсулированные или без герметизации могут быть внедрены в подходящие ткани тела или органы пациента.

Следующие примеры приведены для иллюстрации данного изобретения. Следует, однако, отметить что изобретение не должно быть ограничено определенными условиями или деталями, описанными в этих примерах. На протяжении всего описания данного изобретения, все ссылки на публично доступные документы, включая патенты США, специально включены в описание.

В частности, это изобретение определенно включает в виде ссылки примеры, содержавшиеся в патентной заявке США № 10/092934, Методы Лечения Опухолей и Родственных Заболеваний, Предусматривающие Использование Белков Нервных Нитей, которые показывают, что целевой белок ΛΩ7^ΝΤΡ эффективный агент для уничтожения клеток, как ίη νίΙΐΌ, в глиоме и клеточных культурах нейробластомы, так и ίη у1уо, в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани и дермисе, а также в разнообразии различных опухолей человеческого и нечеловеческого происхождения, включая грудную карциному, карциному кожи и папиллому, карциному толстой кишки, глиому мозга и другие опухоли в модельных экспериментах с грызунами. Это изобретение также определенно включает в виде ссылок примеры, содержащиеся в патентной заявке США № 10/153334, которые показывают, что пептиды ΝΤΡ - эффективные агенты для уничтожения клеток ίη у1уо в нормальной ткани мышцы грызуна, подкожной соединительной ткани, дермисе и другой ткани.

Пример 1. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние пептида ΝΤΡ № 6 на ткани, на участках инъекции.

Крысы самцы Спрагу-Долея (весом в пределах 300 г), были анестезированы эфиром и им был введен пептид ΝΤΡ № 6 путем инъекции в простату, после открытой хирургической визуализации простаты. Инъекции состояли из 300 мкл пептида ΝΤΡ № 6, 1 мг/мл в ΡΒ8 рН 7,4. (1,0 мг/кг) (и = 8), контрольные инъекции только ΡΒ8 (и = 6) и контроля без инъекции (и = 2). После 72 ч крыс безболезненно умерщвляли. Предстательные железы были нарезаны, фиксированы в 10% буферированном формалине в течение 24 ч, залиты в парафин, приготовлены срезы и окрашены реагентом Н & Е. Для каждого животного целая железа простаты была залита и нарезана. Все окрашенные срезы были исследованы гистологически и измерены. Для каждой простаты были исследованы по крайней мере 4 гистологических среза, и для каждого гистологического среза были измерены два диаметра (И) поперечного сечения, в 90° друг от друга (общее количество >8 измерений на каждую простату). Средний диаметр этих измерений для каждой простаты использовался для оценки объема, согласно формуле

Результаты: сокращение объема простаты у крыс, инъецированных пептидом ΝΤΡ № 6, согласно проведенным измерениям, составляло в среднем 45% по сравнению с контролем (там не было никаких заметных различий между контролем, инъецированными только ΡΒ8 и контролем без инъекций). В простате подвергшихся лечению крыс наблюдались обширная потеря железистого эпителия, сглаживания и атрофии. Открытые инфузии в простату крысы пептида ΝΤΡ № 6 в ΡΒ8 рН 7,4, 1,0 мг/кг вызвали сокращение объема простаты >40%, по сравнению с простатой не подвергшихся лечению животных или и инъецированных только ΡΒ8, в течение 72 ч.

Пример 2. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние пептида ΝΤΡ № 7 на ткани в участках инъекции.

Четырем нормальным крысам, каждой в четырех различных точках а также и в оконечности скелетной мышцы в двух различных точках был введен в кожу и подкожно, солевой раствор пептида ΝΤΡ № 7, в количествах 100-400 мл, при концентрациях 0,1-1 мг/мл, при помощи пластмассовых шприцов с иглой 26 из нержавеющей стали.

Животных наблюдали в течение 24 ч и затем безболезненно умерщвляли. Индивидуальные центры инфильтрации были нарезаны, фиксированы в 10%-ом формалине, залиты в парафин, окрашены и исследованы стандартными гистопатологическими методами.

Контрольным животным вводили только солевой раствор.

Результаты: инъекция пептида ΝΤΡ № 7 вызывала острый некроз ткани на участках инъекции. Некроз был очевиден в ткани мышцы, подкожной соединительной ткани и дермисе, на участках, где был

- 44 006603 введен пептид ΝΤΡ № 7. Некроз коррелировал с областями инъекции и казалось, не распространялся дальше, вне участка инъекции.

Кроме умеренных областей воспаления контроль не показал никаких признаков некроза или потери клеток. В контрольных образцах наблюдались минимальные изменения мышечной ткани, или же такие изменения вообще отсутствовали. Контрольные инъекции вызывали умеренное или очень слабое острое воспаление на участках инъекции и фокальные микро-кровоизлияния, вызванные иглами.

Пример 3. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние Связанного Пептида № 1 на ткани на участках инъекции.

Крысы были инъецированы через кожу и подкожно как в примере 2 (см. выше) с Родственным Пептидом № 1.

Животных наблюдали в течение 24 ч и затем безболезненно умерщвляли. Ткани были нарезаны, фиксированы в 10%-ом формалине, залиты в парафин, окрашены и исследованы стандартными гистопатологическими методами.

Контроль был тот же самый, что в примере 2.

Результаты: инъекция Родственного Пептида № 1 вызывала смерть клеток и некроз ткани на участках инъекции. Аналогично примеру 2 (см. выше), смерть клеток наблюдалась в мышечной ткани, подкожной соединительной ткани и дермисе на участках, где был введен Родственный Пептид №. 1.

Кроме умеренных областей воспаления, контроль показал минимальные симптомы некроза или потери клеток. Контрольные инъекции вызывали умеренное или минимальное острое воспаление на участках инъекции и случайные фокальные микро-кровоизлияния, вызванные иглами.

Пример 4. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние Родственного Пептида № 2 на ткани на участках инъекции.

Крысы самцы Спрагу-Долея (весом в пределах 300 г), были анестезированы эфиром и им был введен Родственный пептид № 2 путем инъекции в простату после открытой хирургической визуализации простаты. Инъекции состояли из 300 мкл Родственного пептида № 2,1 мг/мл в ΡΒ3 рН 7.4. (1,0 мг/кг) (п = 8), контрольные инъекции только ΡΒ8 (п = 6), и контроля без инъекции (п = 2). Спустя 72 ч крыс безболезненно умерщвляли. Предстательные железы были нарезаны, фиксированы в 10% буферированном формалине в течение 24 ч, залиты в парафин, приготовлены срезы и окрашены реагентом Н & Е. Для каждого животного целая предстательная железа была залита и нарезана. Все окрашенные срезы были исследованы гистологически и измерены. Для каждой простаты были исследованы по крайней мере 4 гистологических среза, и для каждого гистологического среза были измерены два диаметра (Ό) поперечного сечения, в 90° друг от друга (общее количество > 8 измерений на каждую простату). Средний диаметр этих измерений для каждой простаты использовался для оценки объема, согласно формуле

Результаты: как в вышеупомянутом примере 1, инъекция Родственного Белка № 2 вызвала существенную потерю клеток и атрофию в простате за 72 ч. В контроле изменения отсутствовали или же наблюдались минимальные изменения, состоящие из умеренных фокальных микрокровоизлияний, вызванных иглами.

Пример 5. Цель этого примера состояла в том, чтобы определить влияние Родственного Пептида № 3 на ткани на участках инъекции.

Аналогично вышеупомянутым примерам 1 и 4 нормальным крысам был введен в простату Родственный Пептид № 3. Через 72 ч крыс безболезненно умерщвляли и после этого их предстательные железы исследовали, как в вышеупомянутых примерах 1 и 4.

Результаты: существенная потеря клеток и атрофия простаты были обнаружены через 72 ч по сравнению с контролем, где наблюдались минимальные изменения.

Изобретение было описано ссылаясь на особенно предпочтительные способы осуществления и примеры. Квалифицированные специалисты, однако, смогут предложить различные модификации данного изобретения, не отступая от его принципов и возможностей.

Claims (36)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид белка нервной нити (пептид ΝΤΡ) отобранный из последовательности ЗЕО ΙΌ №№ от 10 до 124.
2. 2. Композиция, включающая один или более пептидов согласно п.1 и носитель.
3. 3. Миметик пептида согласно п.1.
4. 4. Белок, включающий пептид согласно п.1, присоединенный к антителу, фрагменту антитела или подобной антителу молекуле.
5. 5. Нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую пептиду согласно п.1.
6. 6. Композиция, включающая одну или более нуклеиновых кислот согласно п.5 и фармацевтически приемлемый носитель.

   - 45 006603
7. 7. Пептид, включающий по крайней мере один фрагмент аминокислотной последовательности пептида согласно п.1.
8. 8. Композиция, включающая один или более пептидов согласно п.7 и носитель.
9. 9. Миметик пептида согласно п.7.
10. 10. Пептид, включающий пептид согласно п.7, присоединенный к антителу, фрагменту антитела или подобной антителу молекуле.
11. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность, соответствующую пептиду согласно п.7.
12. 12. Композиция, включающая одну или более нуклеиновых кислот согласно п.11 и фармацевтически приемлемый носитель.
13. 13. Способ лечения заболевания пациента, требующий удаления или разрушения клеток, заключающийся во введении млекопитающему, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества пептида, миметика, нуклеиновой кислоты или композиции согласно любому из пп.1-12.
14. 14. Способ лечения согласно п.13, отличающийся тем, что введение препарата включает способ, отобранный из следующей группы способов: оральный, подкожный, интрадермальный, интраназальный, внутривенный, внутримышечный, интратекальный, внутриопухолевый, локальный и трансдермальный.
15. 15. Способ лечения согласно п.13, отличающийся тем, что пациент подвергается лечению до, во время или после того, как пациент начал или будет лечиться способом, отобранным из группы, состоящей из хирургического вмешательства, трансплантации, прививания, химиотерапии, иммунотерапии, вакцинации, удаления путем термообработки или электрообработки, криотерапии, лазерной терапии, фототерапии, терапии гена и радиации.
16. 16. Способ лечения согласно п.13, где заболевание - доброкачественная или злокачественная опухоль ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, живота, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичника, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, живота, прямой кишки, пищевода, сердца, селезенки, слюнной железы, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, узлов лимфы и лимфатической ткани.
17. 17. Способ лечения согласно п.13, где заболевание - гиперплазия, гипертрофия или чрезмерно быстрый рост ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, желудка, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичка, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, прямой кишки, пищевода, сердца, селезенки, слюнной железы, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалины, рта, узлов лимфы и лимфатической ткани.
18. 18. Способ лечения согласно п.13, где заболевание - вирусное, бактериальное или паразитическое изменение ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, желудка, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичка, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, прямой кишки, пищевода, сердца, селезенки, слюнной железы, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалины, рта, узлов лимфы и лимфатической ткани.
19. 19. Способ лечения согласно п.13, где заболевание - уродство ткани, отобранной из группы, состоящей из легкого, груди, желудка, поджелудочной железы, простаты, пузыря, кости, яичка, кожи, почки, пазухи, толстой кишки, кишечника, прямой кишки, пищевода, сердца, селезенки, слюнной железы, крови, мозга и его покрытий, спинного мозга и его покрытий, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалины, рта, узлов лимфы и лимфатической ткани.
20. 20. Способ согласно п.16, отличающийся тем, что тканью является лимфоидная ткань.
21. 21. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - тонзилярная гипертрофия.
22. 22. Способ, согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - гиперплазия простаты.
23. 23. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - псориаз.
24. 24. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - экзема.
25. 25. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - дерматоз.
26. 26. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - косметическая модификация ткани.
27. 27. Способ согласно п.26, отличающийся тем, что тканью является ткань кожи, глаза, уха, носа, горла, рта, мышцы, соединительной ткани, волоса и груди.
28. 28. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - болезнь сосудов.
29. 29. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - геморрой.
30. 30. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание - варикозное расширение вен.
31. 31. Способ согласно п.28, отличающийся тем, что заболевание - атеросклероз или артериосклероз.

    - 46 006603
32. 32. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что заболевание отобрано из группы, состоящей из воспаления, аутоиммунной болезни, нарушения обмена веществ, наследственной/генетической болезни, травматической болезни или физического повреждения, болезни пищевого дефицита, инфекционной болезни, амилоидоза, фиброза, болезни депонирования, врожденного уродства, болезни ферментного дефицита, отравления, опьянения, экологической болезни, лучевой болезни, эндокринной болезни, дегенеративной болезни и механической травмы.
33. 33. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что пептид получен из аминокислотной последовательности нити панкреатического белка.
34. 34. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что пептид конъюгирован, связан или прикреплен к молекуле, отобранной из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и подобной антителу связывающей молекулы, где молекула имеет более высокий аффинитет связываться с опухолью или другой целью, чем с другими клетками.
35. 35. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что пептид - часть отдельной новой клонированной рекомбинантной молекулы, состоящей из пептида и молекулы, отобранной из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела и подобной антителу связывающей молекулы, где молекула имеет более высокий аффинитет связываться с опухолью или другой целью, чем с другими клетками.
36. 36. Пептид, включающий по крайней мере один пептид, отобранный из:

    (ΐ) пептида с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЕ) 10 № 15 (11е-А8р-О1п-О1п-Уа1-Ееи-8ег-Агд-11е-Еу8-Ееи-О1и-11е-Еу8-Агд-Су8-Ееи); или (ΐΐ) пептида с аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЕ) 10 №18 (Ο1η-Ο1η-8е^-I1е-А1а-Vа1-^у8-ΡЬе-^еи-А1а-Vа1-ΡЬе-Ο1у-Vа1-8е^-I1е).