JP2008118996A

JP2008118996A - アスパラギン酸プロテアーゼの一種であるナプシンのクローニングおよび特徴付け

Info

Publication number: JP2008118996A
Application number: JP2007297327A
Authority: JP
Inventors: Gerald Koelsch; コエルシュジェラルド; Xinli Lin; リンシンリ; Jordan J N Tang; ジェイ．エヌ．タンジョーダン
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 2007-11-15
Publication date: 2008-05-29
Also published as: DE69738653D1; WO1998022597A2; AU734220B2; PT948630E; JP2001503643A; AU5459298A; DE69738653T2; CA2271294A1; US6225103B1; EP0948630B1; DK0948630T3; ES2308791T3; EP0948630A2; WO1998022597A3; ATE393227T1

Abstract

【課題】これまで未同定のアスパラギン酸プロテアーゼを提供すること。アスパラギン酸プロテアーゼを特徴付け、そしてクローニングすること。アスパラギン酸が発現される組織を同定し、そして臨床化学および診断に適用すること。
【解決手段】単離されたナプシン。前記ナプシンをコードする、単離されたヌクレオチド分子。ナプシンＡは、イソ型Ａであり、特定の（イソ型Ａの）アミノ酸配列を有し、イソ型Ａに対応する特定のヌクレオチド配列によってコードされる。また、ナプシンＢは、イソ型Ｂであり、他の特定の（イソ型Ｂの）アミノ酸配列を有し、イソ型Ｂに対応する特定のヌクレオチド配列によってコードされる。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
本発明は、ヒト肝臓cDNAライブラリーからの遺伝子のクローニングによって単離された、ヒト肝臓に存在するこれまで未知のアスパラギン酸プロテアーゼに関する。

アスパラギン酸プロテアーゼファミリーのメンバーは、それらの活性中心における触媒アスパラギン酸残基の存在によって特徴付けられる。ヒトの体内に存在することが公知である５つのアスパラギン酸プロテアーゼが存在する。ペプシンおよびガストリクシン（gastricsin）は、食物消化のために胃に分泌される。ガストリクシンはまた、精奬に存在する。カテプシンＤおよびカテプシンＥは細胞内に存在して、タンパク質代謝を行う。血漿に存在するレニンは、アンジオテンシン系および最終的に血圧を調節する鍵となる酵素である。

真核生物（ヒトを含む）アスパラギン酸プロテアーゼは、タンパク質および遺伝子配列において相同であるが、異なるアミノ酸およびヌクレオチド配列を有する。５つ全てのヒトアスパラギン酸プロテアーゼのcDNAおよび遺伝子は、クローニングされ、そして配列決定されている。それらは、約380残基の一本鎖チモーゲン前駆体を合成し、これは細胞内小胞に分泌されるかまたは指向されるかのいずれかである。自己触媒プロセス（プロレニンを除く）による活性化に基づいて、約45残基のN-末端proセグメントが切断され、成熟酵素が産生される（非特許文献１）。いくつかの場合において、例えば、カテプシンＤおよびレニンでは、成熟タンパク質はさらに、２つの鎖に切断される。アスパラギン酸プロテアーゼの３次元構造は、非常に類似している。各酵素は、２つの内部相同葉を含む（非特許文献２）。活性部位中裂（これは、８つの基質残基を収容し得る）および２つの触媒性アスパラギン酸は、葉の間に位置する。

これらのプロテアーゼは、異なり、かつ重要な生理学的役割を有する。生理学的機能におけるそれらの重要性に加えて、これらの酵素はまた、病理学的状態に関連する。例えば、ヒトペプシンおよびガストリクシンは、胃潰瘍およびガンのための診断用指標である（非特許文献３；非特許文献４）。カテプシンＤは、リソソームに位置する。その主な機能は、組織タンパク質の代謝である。しかし、機能的カテプシンＤ遺伝子を有さないマウスからの近年の証拠は、この酵素が、新生動物における腸の発生における役割を果たすことを示す。カテプシンＤはまた、ヒト乳ガン転移に関連する（非特許文献５）。カテプシンＥは、いくつかの細胞（例えば、赤血球および胃粘膜細胞）の小胞体に位置する。免疫細胞における抗原のプロセシングに適用されている。

ヒトアスパラギン酸プロテアーゼには、重要な医療用用途がある。血流に存在するヒトペプシノーゲンおよびプロガストリクシンの酵素前駆体のレベル、および２つのレベルの間の比は、ヒト胃ガン（非特許文献６；非特許文献４）および潰瘍（非特許文献７）の診断用スクリーニングにおいて使用される。プロカテプシンＤの分泌は、乳ガン組織において上昇する。従って、乳ガンにおけるプロカテプシンＤのレベルは、臨床予後のために使用される（非特許文献５）。高血圧の診断におけるレニンの分析は、日常的な臨床手順である（非特許文献８）。

これらの例は、ヒトアスパラギン酸プロテアーゼがヒト疾患に関連し、そしてこれまで未同定のさらなるアスパラギン酸プロテアーゼが、診断適用を有するようであることを確証する。
TangおよびWong, J.Cell.Biochem. 33,53-63(1987) Tangら、Nature 271,618-621(1978) Samloff, Gastroenterology 96,586-595(1989) Mikiら、Jpn.J.Cancer Res. 84,1086-1090(1993) Rochefort, Acta Oncologica 31,125-130(1992) Defize,ら、Cancer 59,952-958(1987) Miki,ら、Adv.Exp.Med.Biol. 362,139-143(1995) Brownら、Handbook of Hypertension 1,278-323 Robertson, editor（Elservier Science Publishers, Amsterdam, 1983

それゆえ、本発明の目的は、これまで未同定のアスパラギン酸プロテアーゼを提供することである。

本発明のさらなる目的は、アスパラギン酸プロテアーゼを特徴付け、そしてクローニングすることである。

本発明のなお別の目的は、アスパラギン酸が発現される組織を同定し、そして臨床化学および診断に適用することである。

（発明の要旨）
これまで未知の、加水分解によるタンパク質の切断が可能な、アスパラギン酸プロテアーゼ（本明細書中で「ナプシン」と称す）は、ヒト肝臓ライブラリーからクローニングされた。２つのcDNAクローンが、クローニングされ、配列決定され、そして発現されている。これらは、プロテアーゼのアイソザイムをコードし、「ナプシンＡ」および「ナプシンＢ」と称する。１つのクローンは、終止コドンを含まない点で異常であるが、タンパク質を発現するために使用され得る。遺伝子もまた得られ、部分的に配列決定された。固定化ペプスタチンを用いる、酵素の迅速な精製のためのプロセスもまた開発されており、そして酵素は、ヒト腎臓組織から単離されている。酵素に対するポリクローナル抗体が作製されており、これもまた、酵素の単離および検出に有用である。

他のアスパラギン酸プロテアーゼ、特にカテプシンＤに対する類似性は、診断用アッセイにおける酵素ならびにプロテアーゼの有用性を確証する。特定の組織において発現されるナプシンの量または型のいずれかまたは両方は、ナプシンに対する標識した抗体またはヌクレオチドプローブを用いて検出され得る。

上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
１．単離されたナプシン。
２．前記タンパク質がイソ型Ａである、項目１に記載のナプシン。
３．図１Ａ〜１Ｄのアミノ酸配列を有する、項目２に記載のナプシン。
４．図１Ａ〜１Ｄのヌクレオチド配列によってコードされる、項目２に記載のナプシン。
５．前記タンパク質がイソ型Ｂである、項目１に記載のナプシン。
６．図４Ａ〜４Ｅのアミノ酸配列を有する、項目５に記載のナプシン。
７．図４Ａ〜４Ｅのヌクレオチド配列によってコードされる、項目５に記載のナプシン。
８．ナプシンをコードする、単離されたヌクレオチド分子。
９．ナプシンＡをコードする、項目８に記載の分子。
１０．図１Ａ〜１Ｄのヌクレオチド配列によって示される、項目９に記載の分子。
１１．ナプシンＢをコードする、項目８に記載の分子。
１２．図４Ａ〜４Ｅのヌクレオチド配列によって示される、項目１１に記載の分子。
１３．検出可能な標識で標識された、項目８に記載の分子、またはナプシンに固有の少なくとも14ヌクレオチドの一部。
１４．ナプシンを単離するための方法であって、組織抽出物において固定化ペプスタチンに結合したタンパク質を単離する工程を包含する、方法。
１５．前記組織が腎臓細胞である、項目１４に記載の方法。
１６．組織に存在するナプシンの量または型を検出するための方法であって、該組織を、ナプシンをコードするDNAもしくはRNAに特異的にハイブリダイズする標識化ヌクレオチド分子プローブと反応させる工程、または該組織を、ナプシンと特異的に免疫反応性の標識化抗体と反応させる工程を包含する、方法。
１７．前記組織が、ナプシンＡおよびナプシンＢの両方の発現のレベルについてスクリーニングされる、項目１６に記載の方法。
１８．前記組織に存在するナプシンの量または型が、正常なコントロール組織に存在するナプシンの量または型と比較される、項目１６に記載の方法。
１９．ナプシンと特異的に免疫反応性の抗体。
２０．前記抗体が、ナプシンＡまたはナプシンＢのいずれかと免疫反応性である、項目１９に記載の抗体。

発明の詳細な説明
Ｉ．ナプシンイソ型のクローニングおよび発現
Ａ．ヒトナプシンＡ。

１．ナプシンＡをコードするcDNAのクローニング
Institute for Genome Research（Adamsら、Science 252,1651-1656(1991)）のヒトcDNA配列データベースの相同性探索によって同定されたクローン（カテプシンＤの部分をコーすることが報告された）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville,MD）から入手した。これらを、それぞれ、ATCCクローン番号559204、540096、346769、351669、および314203；Genbank番号W19120、N45144、R18106、R11458、およびT54068、と称す。これらに示される配列の分析は、カテプシンＤをコードせず、そして全長cDNAではなかった。プライマーを設計し、そしてPCRに使用して、テンプレートとしてヒト肝臓cDNAライブラリーを用いて、さらなるクローンを得た。得られたクローンは、ATCCクローンに存在しない領域を含んだ。

これらのクローンはともに、約600bpのcDNAのみを提供するので、より長いcDNAクローンを、5’RACE PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて探した。ここで、λgt10にクローニングされた２つの別々のヒト肝臓cDNAライブラリーからのDNAを、テンプレートとして使用し、そしてプライマーは、近傍5’末端配列（AGGGCACAGTGAAGAAGTGGCATCTCC）および順方向におけるインサートから上流のλgt10ベクターの配列（CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG）に基づいた。２つのクローンpHL-1（154bp）およびpHL-2（288bp）を得た。このうち１つは（pHL-2）、5’末端配列をリーダーペプチド領域（図１Ａ〜１Ｄ）に及んだ。

ヒトナプシンＡcDNA配列は、得られた全てのクローンからの終止コドンを欠如するが、全ての他の特徴は、機能的アスパラギン酸プロテアーゼを示し、これは、インタクトな活性部位エレメント、保存されたTyr75（ペプシン番号付け）、および約40アミノ酸のプロペプチドを含む。ペプシンとは異なり、特徴的なアスパラギン酸プロテアーゼであるナプシンＡは、Ｃ末端の延長、プロリン残基の豊富さ、および哺乳動物アスパラギン酸プロテアーゼ（すなわち、ペプシンおよびカテプシンＤ）の相同な結晶構造によって判定されたナプシンの3-D構造の表面に近いRGDモチーフ（インテグリン結合モチーフ）を含む。

ナプシンのいくつかの関連cDNAクローンを、ヒト肝臓cDNAライブラリーのスクリーニングによって得、そしてヌクレオチド配列を決定した。これらのクローンは、ナプシンメッセンジャーRNAの異なる部分を示す。ともにスプライスされ、推定アミノ酸配列を有するナプシンＡをコードするヌクレオチド配列を、図１Ａ〜１Ｄに示す。

２．組換えナプシンＡの発現
ナプシンＡのcDNA（リーダーペプチドならびに3’未翻訳領域およびポリアデニンのストレッチを含む）を、プライマーPLHNAP-FWD（5’AAGCTTATGTCTCCACCACCGCTGCTGCTACCCTTGCTGC）およびPLHNAP-REV（5’AAGCTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGGAAATATTGG）とPCR増幅し、そしてCMVプロモーター（Dusty Miller）からの発現のために、ベクターpLNCXのHindIII部位にクローン化した。単離したプラスミドを、ヒト腎臓293細胞（ATCC）に形質転換した。細胞を回収し（８〜120mg）、そして50mM NaOAc、20mM 双極性界面活性剤（zwittergent）（pH3.5）（NAZ緩衝液）で、ボルテックスしながら溶解した。溶解物を、氷上で１時間インキュベートした。14,000×gでの遠心分離からの上清を、ペプスタチン-Ａ-アガロース（Sigma）の40μlアリコートの添加によって発現したナプシンＡの検出のために、直接使用した。サンプルを、50mlコニカルチューブ中で、４℃にて１週間回転させた。マトリクスを固定し、そして20mlのNAZ緩衝液で２回、そして20mM Tris HCl、0.5M KCl（pH8.2）（TK緩衝液）で３回洗浄した。最終洗浄を、20mM Tris HCl、50mM NaCl、および20mM 双極性界面活性剤（pH9.5）で行った。固定したペプスタチン-Ａ-アガロース（約40μl）を、40μlのSDS-β-メルカプトエタノールサンプル緩衝液（NOVEX）と混合し、そして70℃に10分間加熱した。アリコートを、10％Tricine SDS-PAGE（NOVEX）にかけ、そしてTris-Tricine緩衝液系を用いて、PVDF膜にトランスブロットした。膜を、免疫化学検出のために、アミドブラックで染色するか、または５％スキムミルク溶液でブロックした。自動化タンパク質シーケンサーにおけるアミノ末端配列分析のために、アミドブラックで染色した膜の区画を切除し、そして滅菌H₂Oで洗浄した。

３．ゲノムDNAのクローニング
ヒトナプシンのゲノムクローンを、ヒトゲノムDNAライブラリーのスクリーニングによって得、細菌人工染色体（pBELO-BAC11）にクローン化した（Kimら、Nucl.Acids Res. 20,1083-1085(1992)）。ライブラリーのためのゲノムDNAの供給源は、978SKおよびヒト精子細胞株に由来し、そして140,000を超えるクローンを含んでいた。合成オリゴヌクレオチドプローブを、一次スクリーニングNap-3’（GAGGGCGAGCGCGCGCCAGTCCCACTCGTGCGCCGCTCTTCATGTCCCCG）および二次スクリーニングNap-5’（CCATCCCCTCAGTAGGTTCAGGGTCCTGCGTCCAGGGTGGACTTGACGAA）のために、³²Pで標識した。

スクリーニングを、Research Genetics, Huntsville, Alabmaで行う。２つの独立したクローンを単離し（両方とも約30kbp長であった）、そして制限酵素で切断し、そしてパルスフィールド（pulse-field）アガロースゲル電気泳動によって分析した。インサートのフラグメントを、サザンブロッティングによって同定し、pBlueにサブクローン化し、そして配列決定した。ヒトナプシＡのゲノムDNAを、図３Ａ〜３Ｅに示す。

ヒトナプシンＡ遺伝子は、９エキソンにコードされる（図３Ｆ）。エキソン／イントロン接合部は、cDNA配列および接合部モチーフの両方によって明確に規定される。ヒトナプシンＡコード領域は、約1.2kbの開始コドンATG（図１Ａ〜１Ｄのヌクレオチド１）からcDNA配列におけるポリＡストレッチを開始するオープンリーディングフレームを含む。ナプシンＡのcDNA配列におけるように、ナプシンＡのゲノムエキソン配列は、ポリＡストレッチの前の全体のコード領域におけるインフレーム終止コドンを含まない。ナプシンＡにおける終止コドンの非存在が確認される。終止コドンの非存在は、他の哺乳動物タンパク質の遺伝子に観察されていない。ナプシンAのcDNA（従ってmRNA）は、異なるヒト組織に存在する。ナプシンＡ遺伝子がタンパク質産物を発現し得るかどうか確かめることが目的である。これらの結果を以下に記載する。

Ｂ．ヒトナプシンＢ。

１．cDNAおよび遺伝子構築
ヒトナプシンＢを発現するクローン559204および163167をATCCから得、そして上記のように部分的に配列決定した。図４Ａ〜４Ｅは、ナプシンＢをコードする、得られた全長DNA配列および推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド１〜1191を、ゲノムクローン（ナプシンＡについて上記）およびATCC cDNAクローン由来の1192〜1910から得た。ナプシンＢ遺伝子配列は、ナプシンＡのものに92％同一であり、そして各々からの推定タンパク質配列は、91％同一性を示す。ナプシンＡと同様に、推定ナプシンＢタンパク質配列は、代表的なアスパラギン酸プロテアーゼモチーフ、ならびにナプシンＡのcDNAにおいてと同じＣ末端延長、RGDモチーフ、およびプロリンリッチ領域を保有する（図４Ａ〜４Ｅ）。ナプシンＡ遺伝子とは異なり、ナプシンＢ遺伝子は、インフレーム終止コドンを有する。

II.ナプシンタンパク質の単離および特徴付け。

ナプシンＡ配列の３つの他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼ酵素前駆体との比較を、図２Ａ〜２Ｃに示す。ナプシンが、ヒトカテプシンＤに関連し、そしてマウスアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質に類似であるが、差異は容易に明らかであることが明らかである。他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼに対する関係は、図２Ｄにおいてさらに分析され、これは、相関の程度の図であり、そして同一残基の割合もまた示す。明らかに、両方の基準によって、ナプシンは、それらが互いに異なるのと同じように、他のアスパラギン酸プロテアーゼと異なる。

他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼに対する配列類似性に加えて、ナプシンがアスパラギンプロテアーゼであるという結論は、以下の観察から導かれる。（ａ）位置32および215での重要な活性部位アスパラギン酸残基は、保存されたDTG配列に存在する。（ｂ）Tyr-75（Ｙ）およびその周りのいくつかの保存された残基の存在は、アスパラギン酸プロテアーゼの特徴である機能的「フラップ（flap）」を示す。（ｃ）残基１p〜44pに対応するプロ領域がナプシンに存在し、これは、アスパラギン酸プロテアーゼの酵素前駆体であり、そして活性化し得ることを示す。

RGD配列は、位置315〜317（慣例によるブタペプシン残基番号）で見いだされる。このモチーフは、インテグリン結合において重要であることが示されており、これは、細胞周期のような細胞機能、うっ血、炎症、および細胞増殖の調節に関連する。この配列は、ナプシンを意味する特定の機能を有し得る。

２．ナプシンＡの免疫化学検出。

ナプシン特異的モノクローナル抗血清を、以下の手順を用いて産生した。ナプシンＡの18アミノ酸エピトープを、Molecular Biology Resource Facility（OUHSC）によるポリリジン骨格における複数の抗原性ペプチド（MAP）として合成した。このエピトープ（MKSGARVGLARARPRG）は、ナプシンＡおよびＢの両方に共通しており、そしてカテプシンＤ（それらの最も近いホモログ）とは充分に異なった。この領域は、カテプシンＤ結晶構造座標（Erickson,1993）から決定されたように、ナプシンＡの表面に位置するようである。１mlのH₂O中１mgのアリコートを使用して、ヤギを免疫化した（Hybridoma Lab, Oklahoma Medical Research Foundation）。回収した血清を、複数回硫安沈澱し（Antibodies Lab manual）、そしてaffi-gel 10（Bio-Rad）に結合したナプシンＡ MAPを用いてアフィニティー精製した。この抗血清を、SDS-PAGEゲル（NOVEX）からトランスブロットしたPVDF膜上のナプシンＡの検出において、1:5000希釈で使用した。ECL系（Pierce）を、一次抗体の検出のために使用した。

上記のように調製したヒト腎臓293細胞からの組換えナプシンＡサンプルのイムノブロットは、ナプシンＡを検出した。これらの結果は、ナプシンＡ遺伝子の発現が免疫特異的バンドを産生したことを示し、これはナプシンＢの移動度と類似の移動度を有するSDS-ポリアクリルアミド電気泳動において移動した。従って、ナプシンＡにおける終止コドンの非存在にもかかわらず、そのタンパク質は、ヒト細胞株において正確に発現される。このナプシンＡタンパク質を、ペプスタチンアフィニティーカラムから回収したという事実は、全てのアスパラギン酸プロテアーゼに類似の活性部位の存在を示唆する。

３．ヒト組織および細胞株におけるナプシンＢの検出
ヒト腎臓皮質（Cooperative Human Tissue Network, National Cancer Institute, NIH）の約８グラムの切片を、Waringブレンダー中で、20mM Tris HCl、50mM NaCl、20mM 双極界面活性剤、および１μMの各TPCK、TLCK、およびEDTAからなる緩衝液（pH7.5）（緩衝液TZ）中で均質化した。ホモジネートを、穏やかに撹拌しながら、40％硫酸アンモニウムにし、そして10,000×gで遠心分離した。得られた上清を70％硫酸アンモニウムにし、そして10,000×gで遠心分離した。70％硫酸アンモニウムに不溶性の物質（40〜70％カット）を、15mlの緩衝液TZに溶解し、そして30mlのNAZ緩衝液でpH4.0にした。氷上での１時間のインキュベーションに続いて、サンプルを、14,000×gで遠心分離した。得られた上清に、ペプスタチン-Ａ-アガロース（Sigma）の0.1mlアリコートを添加した。細胞株におけるナプシンＢの検出は、組換えナプシンＡの検出について上記にした手順に従った。

ナプシンＢを、ヒト腎皮質の組織サンプルにおいて、および明白な４つの形態におけるヒト腎臓細胞株Hut-78：ヒト腎臓（０〜40％硫酸アンモニウムカット）；ヒト腎臓（40〜70％カット）；Hut-78細胞において検出した。０〜40％硫酸アンモニウムカットにおいて、SPGDKPIFVPLSNYRのタンパク質配列に由来する異種アミノ末端配列を有する（Asp4およびLys5で他の末端を有する）50〜54kDaの一本鎖プロテアーゼを検出した。これらのN-末端配列は、同種プロカテプシンＤおよび他のアスパラギン酸プロテアーゼチモーゲンにおける活性切断部位と比較することによって、プロナプシンＢにおける推定活性切断部位と十分一致した。40〜70％硫酸アンモニウムカットにおいて、３つの形態を検出した。46〜50kDa一本鎖形態、および２つの二本鎖形態。46〜50kDaバンドは、40％硫酸アンモニウムカットにおけるより大きな分子量バンドについて得られたのと同じ異種配列ナプシンＢ配列を産生した。約８kDaおよび４kDaの２つのより低い分子量のフラグメントは、ナプシンＢのC-末端領域に対応する、同じアミノ末端配列（VRLCLSGFQALDVPPPAGPF）を産生した。トランスブロット調製物の顕著な40kDaバンドを配列決定し、そして46〜50kDaバンドと同じ異種アミノ末端配列を産生した。これは二本鎖ナプシンＢの２つの種を示す：８kDa種および40kDa種ならびに４kDa種および40kDa種。

III.ナプシンの適用
酵素についての種々の臨床用途および診断用途を、関連するアスパラギン酸プロテアーゼの使用に対する相似性に基づいて設計し得る。タンパク質、ヌクレオチド分子、ならびに単離およびその使用のための方法は、広範な種々の適用、特に診断適用を有する。アスパラギン酸プロテアーゼは、特定の障害（例えば、乳ガンおよび高血圧）と相関することが周知であり、そしてナプシンは腎臓で発現されるので、組織（特に腎臓）中に発現したナプシンのレベルおよび／または型の測定は、障害の存在および重篤度と相関し得る。組換えDNAおよびそれに由来する試薬は、健康体および疾病に罹患した人において、ナプシン発現についてのアッセイに使用され得る。ナプシン配列は、疾患に関連し得る患者において、ナプシン遺伝子の存在を追跡するために使用され得る。

Ａ．診断適用
ナプシンの量は、ナプシンの組織からの単離物の範囲で、標準的なスクリーニング技術を用いて（例えば、固定化抗ナプシン（または抗ナプシンＡもしくは抗ナプシンＢ）またはペプスタチンを用いて）、標識抗体での検出および定量のために、組織中で転写されたmRNAの量を決定するために、標識されたヌクレオチドプローブを用いて決定され得る。

抗体産生
ポリクローナル抗体を、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント）との組み合わせにおける精製タンパク質での動物の免疫化のための、標準的な技術を用いて産生した。モノクローナル抗体もまた、標準的な技術を用いて（例えば、抗体力価が十分に高くなるまでマウスを免役し、脾臓を単離し、そして融合を行い、次いで目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることによって）調製され得る。これらは、任意のナプシンと反応性である抗体であり得るか、またはナプシンＡには反応性であるがＢには反応しない抗体、またはその逆の抗体であり得る。

治療適用のためのヒト化抗体、および組換え抗体フラグメントもまた、標準的な方法論を用いて作製され得る。ヒト化抗体は、抗体認識部位または相補性決定超可変領域（CDR）のみが非ヒト起源であり、そして可変ドメインの全てのフレームワーク領域（FR）が、ヒト遺伝子の産物である抗体である。動物モノクローナル抗イディオタイプ抗体のヒト化の１つの方法において、RPASを、Daughertyら、Nucl.Acids Res., 19:2471-2476(1991)によって記載されるCDR移植方法と組み合わせる。簡単には、選択された動物組換え抗イディオタイプScFvの可変領域DNAを、Clackson,T.ら、Nature, 352:624-688(1991)の方法によって配列決定する。この配列を用いて、動物CDRを、動物可変遺伝子の既知の配列におけるCDRの位置に基づいて、動物フレームワーク領域（FR）から区別する。Kabat,H.A.ら、Sequence of Proteins of Immunological Interest,第４版（U.S.Dept.Helth and Human Services, Bethesda, MD, 1987）。一旦、動物CDRおよびFRを同定すると、CDRを、合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）組換えの使用によって、ヒト重鎖可変領域フレームワークに移植する。動物重鎖CDRのコドン、ならびに有用なヒト重鎖可変領域フレームワークを、４つのオリゴヌクレオチド（各々100塩基長）で組み立てる。PCRを用いて、400塩基の移植DNA配列を形成し、これは、組換え動物CDR／ヒト重鎖FR保護をコードする。組換えCDR移植免疫グロブリン遺伝子の発現を、完全な移植抗体を分泌するヒト293細胞（形質転換された主要胎児性腎臓細胞、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville,MD 20852）から市販）へのそのトランスフェクションによって達成する。例えば、Daugherty B. L.ら、Nucl.Acids Res., 19:2471-2476, 1991を参照のこと。あるいは、ヒト化ScFvを、バクテリオファージの表面で発現させ、そして下記のRPAS法におけるように、E.coli中で産生させる。

Pharmacia（Pharmacia LKB Biotechnology, Sweden）の「組換えファージ抗体システム」（RPAS）を、この目的のために使用し得る。RPASにおいて、抗体可変重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を、ハイブリドーマmRNAから別々に増幅し、そして発現ベクターにクローン化する。重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインを、可撓性ペプチドをコードする短いリンカーDNAと結合させた後、同じポリペプチド鎖において同時発現させる。この集合体は、一本鎖Fvフラグメント（ScFv）を生じ、これは、抗体の完全な抗原結合ドメインを組み込む。抗原駆動スクリーニング系を用いて、本来のモノクローナル抗体の結合特徴に等価な結合特徴を有するScFvを選択する（例えば、McCafferty,J.ら、Nature, 348:552-554(1990)；Clackson,T.ら、Nature, 352:624-688(1991)を参照のこと）。組換えScFvは、インタクトなモノクローナル抗体よりもかなり少ない数のエピトープを含み、そしてそれにより、ヒトに注入した場合に、より弱い免疫原生刺激を示す。それゆえ、ScFvのヒトへの静脈内注射は、現在使用される全体のモノクローナル抗体と比較して、より効率的および免疫学的に許容性であることが予期される（Norman,D.J.ら、Transplant Proc., 25（補遺）1:89-93(1993)）。

ヌクレオチドプローブ
ヌクレオチドプローブを使用して、ナプシン発現あるいは存在するイソ型の型および／または比についてスクリーニングし得る。これらは、本明細書中で報告される配列に基づいて設計されるか、あるいは異なる細胞型または種から作製したライブラリーから標準的な技術を用いて得られる、cDNA配列または他の分子であり得る。本明細書中で報告される配列は、ヒト起源の配列であるが他の動物の種において同じプロテアーゼが存在し、そしてアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方においていくらかの程度変化することが理解される。ナプシンは、本明細書中で、ヒトまたは他の動物由来の天然に存在するアミノ酸配列を有するアスパラギン酸プロテアーゼ、あるいは上で議論した、活性部位とは異なる等価位置で、ある種から別の種へのアミノ酸置換によって構築される複合配列といわれる。ナプシンをコードするヌクレオチド分子は、本明細書中に記載のように天然で存在し得るか、またはアミノ酸配列に基づいて設計および合成的に作製され得る。さらに、少なくとも２つのイソ型が同定されているので、さらなるイソ型が、腎臓または肝臓とは異なる組織に見いだされることが予期される。これらのイソ型は、用語「ナプシン」内に含まれることが意図される。

ヌクレオチド分子を、量、型、またはそれらの組合せについて、標準的な診断用技術を用いてアッセイするために使用し得る。一般的には、プローブは、少なくとも14ヌクレオチドのナプシンをコードするDNAからのセグメントを含み、これは、標準的なハイブリダイゼーション条件下で、そしてなおストリンジェントな条件下での特異性を提供するのに十分であるべきである。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの核酸配列へのハイブリダイゼーションについての反応条件は、オリゴヌクレオチド長、ＧおよびＣヌクレオチドの数、およびハイブリダイゼーション反応に利用する緩衝液のような因子の組成に依存して、オリゴヌクレオチドによって異なる。中程度にストリンジェントな条件は、一般的に、完全な塩基対化二本鎖DNAの融点より約25℃低い条件として、当業者に理解される。高度な特異性は、一般的に、より高い温度を有するインキュベーション条件、換言すればよりストリンジェントな条件を使用することによって達成される。一般的には、配列が長いか、またはＧおよびＣ含量が高いほど、より高い温度および／または塩濃度が要求される。Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（1990）の研究室マニュアルの第11章は、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーについてのハイブリダイゼーション条件を非常に詳細に記載し、これは、関与する要因および特異性を有するハイブリダイゼーションを保証するのに必要なストリンジェンシーのレベルの記載を含む。10未満のヌクレオチドでは、ハイブリダイズされる系は安定ではなく、そして20℃を超えて変性を開始する。テキストMOLECULAR GENETICS, Stent,G.S.およびR.Calender,213-219頁（1971）においてより詳細に記載されるように、100,000を越えるヌクレオチドの場合には、ハイブリダイゼーション（再生）は、はるかにゆっくりで、そして不完全なプロセスになることを見い出す。理想的には、プローブは、20〜10,000ヌクレオチドであるべきである。より少ないヌクレオチド配列（20〜100）は、それら自体に、自動化有機合成技術による産生を付与する。100〜10,000ヌクレオチド配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ処理から得られ得る。より小さなプローブの比較的バルクな化学発光部分での標識は、いくつかの場合において、ハイブリダイゼーションプロセスを妨害し得る。

標識
抗体およびヌクレオチド分子の両方を、標準的な技術で、例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、色素、酵素、および検出のための他の手段（例えば、磁性粒子）で標識し得る。例えば、活性部位のフルオレセインでの選択的標識は、Bockの方法によって行い得る（Bock,P.E.(1988) Biochemistry 27,6633-6639）。簡単には、ブロッキング試薬を、室温にて１時間、酵素と反応させる。透析後、共有結合的に修飾された酵素を、室温にて１時間、200μM 5-（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（Molecular Probe）とともにインキュベートする。遊離フルオレセインを、PD-10カラム（Pharmacia）におけるゲル濾過によって除去する。この方法を用いる場合、フルオレセイン化酵素の各分子は、活性部位で単一の色素を含み、それゆえ、全ての蛍光性分子は同様に挙動する。あるいは、ヨードゲン(iodogen)（Pierce）を、製造業者のプロトコルに従って、Na[¹²⁵I]（Amersham）で酵素を放射標識するために使用し得る。遊離¹²⁵Iを、PD-10カラムにおけるゲル濾過によって除去し得る。

組換えタンパク質
組換えタンパク質およびそのフラグメントは、診断方法におけるコントロールとして有用である。ナプシンＡのcDNAおよび遺伝子配列を決定した。DNAを、組換え系（ヒト細胞株）において発現し、そして酵素の活性を特徴付けた。ナプシンＢのcDNAおよび遺伝子配列を決定した。タンパク質を標準として使用し得るか、または以下に議論するように、アスパラギン酸プロテアーゼとして治療的に、そして酵素挙動の研究において使用し得る。終止コドンを含まないcDNAからの組換えタンパク質の発現は、特定の利点を提供し得る。

ナプシンの単離のための手順
抗体およびヌクレオチドプローブは、ナプシンまたはそのイソ型の検出において第一に有用である。いくつかの場合において、精製タンパク質を単離するために有用でもあり得る。上記のように、ナプシンＡおよびナプシンＢをペプスタチン-アフィニティーカラムに結合するための手順を考案した。固定化ペプスタチンを、診断用適用のために、天然に存在するかまたは組換えのいずれかのナプシンを、それが発現される組織から精製するために使用し得る。

Ｂ．酵素適用。

アスパラギン酸プロテアーゼは、カテプシンＤを使用するためのものと類似の適用に有用である。臨床的には、まさに一過性にナプシンをコードする遺伝子をトランスフェクトして、個体がプロテアーゼを欠損している障害を処置するため、あるいはアンチセンス、標的化リボソームもしくはリボザイムガイド配列、または三重らせんをトランスフェクトして、上昇したレベルの酵素によって特徴付けられる障害を有する個体において、酵素発現を予防または減少するために有利であり得る。

図１Ａ〜１Ｄは、ヒトナプシンＡのcDNA（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図１Ａ〜１Ｄは、ヒトナプシンＡのcDNA（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図１Ａ〜１Ｄは、ヒトナプシンＡのcDNA（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図１Ａ〜１Ｄは、ヒトナプシンＡのcDNA（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図２Ａ〜２Ｃは、ヒトナプシンＡアミノ酸配列の、マウスアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（Mori,ら、1997）およびヒトカテプシンＤ（「cathＤ]）との比較である。図２Ａ〜２Ｃは、ヒトナプシンＡアミノ酸配列の、マウスアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（Mori,ら、1997）およびヒトカテプシンＤ（「cathＤ]）との比較である。図２Ａ〜２Ｃは、ヒトナプシンＡアミノ酸配列の、マウスアスパラギン酸プロテアーゼ様タンパク質（Mori,ら、1997）およびヒトカテプシンＤ（「cathＤ]）との比較である。図２Ｄは、ナプシンと他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼとの間の配列関連性の模式図または樹状図である。図３Ａ〜３Ｅは、ヒトナプシンＡのゲノムDNA（配列番号３）である。イントロンは小文字で示され、エキソンは大文字で示される。推定アミノ酸配列は、イントロン-エキソン接合部の位置を示す。図３Ａ〜３Ｅは、ヒトナプシンＡのゲノムDNA（配列番号３）である。イントロンは小文字で示され、エキソンは大文字で示される。推定アミノ酸配列は、イントロン-エキソン接合部の位置を示す。図３Ａ〜３Ｅは、ヒトナプシンＡのゲノムDNA（配列番号３）である。イントロンは小文字で示され、エキソンは大文字で示される。推定アミノ酸配列は、イントロン-エキソン接合部の位置を示す。図３Ａ〜３Ｅは、ヒトナプシンＡのゲノムDNA（配列番号３）である。イントロンは小文字で示され、エキソンは大文字で示される。推定アミノ酸配列は、イントロン-エキソン接合部の位置を示す。図３Ａ〜３Ｅは、ヒトナプシンＡのゲノムDNA（配列番号３）である。イントロンは小文字で示され、エキソンは大文字で示される。推定アミノ酸配列は、イントロン-エキソン接合部の位置を示す。図３Ｆは、ヒトナプシンＡの模式図である。エキソンは、上記の番号で垂直線として示される。二重ヘッド矢印は、配列が決定された領域を示す。文字は制限部位の位置であり、ここで、ＸはXhoI、Ｂは、BamHI、およびＥはEcoRIである。図４Ａ〜４Ｅは、ヒトナプシンＢのcDNA（配列番号４）および推定アミノ酸配列（配列番号５）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図４Ａ〜４Ｅは、ヒトナプシンＢのcDNA（配列番号４）および推定アミノ酸配列（配列番号５）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図４Ａ〜４Ｅは、ヒトナプシンＢのcDNA（配列番号４）および推定アミノ酸配列（配列番号５）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図４Ａ〜４Ｅは、ヒトナプシンＢのcDNA（配列番号４）および推定アミノ酸配列（配列番号５）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。図４Ａ〜４Ｅは、ヒトナプシンＢのcDNA（配列番号４）および推定アミノ酸配列（配列番号５）である。特徴的な活性部位エレメント（DTG）およびTyr75に下線を付した。RGDインテグリン結合モチーフにもまた、下線を付した。カルボキシ末端のリジンは、ポリＡ領域に対応する。

（配列表）

Claims

明細書中に記載されるナプシン。