JP2006271350A - 反応容器処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
反応容器の反応部からの蛍光を高感度に検出できるようにする。
【解決手段】
蛍光検出部６４の動作中は、ＬＥＤ９２が点滅点灯させられた状態でこの光学ユニットが反応容器４１に対して相対的に走査させられる。光軸が反応容器４１のプローブ配置部１８の下にきたときに光検出器１０４の検出信号がサンプルホールドされる。
【選択図】 図１２

Description

本発明は化学反応を初め、医療現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器を用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための反応容器処理装置に関する。検出された遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なうことができる。

遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。

ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。

ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
特表２００２−５３３０９６号公報 特開２００１−２９９３６６号公報 特開２００２−３００８９４号公報 特許第３４５２７１７号公報 Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7

本発明者らは、化学反応の測定や遺伝子多型を自動的に検出することを目的として、化学反応の測定や遺伝子多型検出を自動化するのに適する反応容器を提案している。
その反応容器はサンプルに反応を起こさせる少なくとも１つの反応部を平板状基板に備えたものである。この反応容器は、化学反応、生化学反応を初め、種々の反応の測定に用いられるものである。

そのような反応容器を用いて反応部での反応を検出する反応容器処理装置も提案している。その反応容器処理装置は、反応部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部を少なくとも備えている。

反応部での反応を検出する際、反応によっては充分な検出感度を得るまでに反応が進行するためには長時間を要するものがある。
例えば、遺伝子多型を診断しようとすると、反応部が複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部となっている遺伝子多型診断用反応容器を用いて、サンプルのゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液をプローブ配置部に分注し、所定の温度に保ってタイピング反応を起こさせることが必要である。しかし、そのタイピング反応には時間がかかる。蛍光検出装置としてＬＥＤ（発光ダイオード）を備えたものを使用し、ＬＥＤを通常行なうように連続発光させて蛍光を検出すると、十分な蛍光強度を得ることができる状態になるまでには２０〜４０分間を要する。その結果、全体の測定時間が長くかかる。

反応部での蛍光標識の濃度を高めることによって蛍光強度を高めることも考えられるが、蛍光標識に用いられる蛍光試薬は高価であるため、コスト高を招いてしまう。
本発明は、反応容器の反応部からの蛍光を高感度に検出できるようにすることを目的とするものである。

本発明の反応容器処理装置は、サンプルに反応を起こさせる少なくとも１つの反応部を平板状基板に備えた反応容器を装着する反応容器装着部を備え、さらに図１に示されるように、反応部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部６４と、蛍光検出部６４の検出動作を少なくとも制御する制御部１１８とを少なくとも備えており、その蛍光検出部６４は励起光源として発光素子を備え、その発光素子を連続発光よりも発光強度を高めるように点滅点灯させながら蛍光を検出するようにしたことを特徴とするものである。
発光素子としてはＬＥＤやＬＤ（レーザダイオード）を使用するのが適当である。

反応容器は同じ基板に凹部として形成され、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部をさらに備えたものとすることができる。また、反応容器は同じ基板に凹部として形成されサンプルの反応に使用される試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも１つの試薬収容部をさらに備えたものとすることもできる。不揮発性液体収容部と試薬収容部をともに同じ基板に備えることもできる。不揮発性液体収容部や試薬収容部を備えた場合には、この反応容器処理装置は、図１に示されるように、ノズル２８による吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部１１２を備え、制御部１１８は分注部１１２の分注動作も制御するものとなる。

この反応容器処理装置を遺伝子多型検出装置として使用する場合には、反応容器装着部に装着される反応容器は、試薬収容部としてタイピング試薬収容部を少なくとも含み、反応部が複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部となっている遺伝子多型診断用反応容器となる。その場合、この反応容器処理装置は、図１に示されるように、プローブ配置部の温度をサンプルのゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液をプローブ配置部のプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部１１０をさらに備え、制御部１１８はタイピング反応温度制御部１１０の温度制御も行なうものとなる。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部１１０はインベーダ反応のための温調部となる。

また、反応容器内で遺伝子増幅反応も行なわせる場合には、反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えた遺伝子多型診断用反応容器となる。その場合、この反応容器処理装置は、図１に示されるように、増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部１２０をさらに備え、制御部１１８は増幅反応温度制御部１２０の温度制御も行なうものとなる。

遺伝子増幅反応としてＰＣＲ反応を使用する場合は、増幅反応温度制御部１２０はＰＣＲ反応のための温度サイクル用の温調部となる。
制御部１１８を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部１１８にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１２２を接続してもよい。

光学ユニットの励起光照射部は励起光源として互いに発光波長の異なる発光素子を備えたものであることが好ましい。発光素子としては、ＬＤ（レーザダイオード）やＬＥＤ（発光ダイオード）を使用することができ、コストの点でＬＥＤが好ましい。特に高輝度のＬＥＤが好ましい。

励起光源として発光素子を用いた場合は、発光素子は互いに異なるタイミングで発光され、発光のタイミングで光検出器による蛍光検出を行なうことにより各光学ユニットからの蛍光の検出を区別することができる。
２種類の蛍光を検出する場合には、光学ユニットが２台設けられ、それぞれの光学ユニットの発光素子が交互に発光され、各光学ユニットが受光した蛍光はその光学ユニットの発光素子が発光中に検出されるようにすることができる。

ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはＳＮＰである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムＤＮＡなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はＰＣＲ反応試薬である。

ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含むサンプルそのものを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。

既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取するＤＮＡ量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルからＤＮＡを抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。

図１３は本発明の反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用して遺伝子多型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。

ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのｐＨ緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及びＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等の塩類などの必要な試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。本発明で用いることのある増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施しているものであってもよく、核酸抽出操作を施していないものであってもよい。核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる場合には、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル２と混合したときに２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。

ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。

合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。

ＰＣＲ工程では、生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルはゲノム抽出操作を施したものであってもよいが、ここではゲノム抽出操作を施していないものを使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。

ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。

次に、インベーダ試薬６が添加された反応液を複数のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。各プローブ配置部８には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。

インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものが用意されており、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。

タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。

本発明の反応容器処理装置では、蛍光検出部が励起光源として発光素子を備え、その発光素子を連続発光よりも発光強度を高めるように点滅点灯させながら蛍光を検出するようにしたので、蛍光検出の感度が上がり、通常であれば十分な蛍光強度が得られるまで長時間を待たなければならない反応の測定も短時間で行なうことができる。
また、発光素子として発光強度の大きい高価な素子を使用しなくても、連続発光に替えて点滅点灯させることにより発光強度を高めるので、この反応容器処理装置を小型で安価に実現することができる。

高価な蛍光試薬を多く使用する必要もないので、反応容器の反応部を蛍光標識する場合には反応容器を安価に提供することができる。
励起光源として発光素子を使用するので反応容器処理装置の小型化に寄与することができ、発光素子としてＬＥＤを使用すればよりより低コスト化に寄与することができる。

図２は本発明の反応容器処理装置で使用する反応容器の第１の例である。（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
平板状の基板１０の同じ側に試薬収容部１４及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部１６が凹部として形成されている。

反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。

実施例では、不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。基板１０の同じ側にはさらに、反応部１８も形成されている。
試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６はフィルム２０で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム２０を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム２０をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
基板１０の表面は、フィルム２０上から、試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び反応部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。

この反応容器の具体的な用途の一例は、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入し、インベーダ反応によりＳＮＰを検出する遺伝子多型診断用試薬キットとなったものである。図２を参照して、その遺伝子多型診断用試薬キットとしての実施例を詳細に説明する。
平板状の基板１０の同じ側にサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、及びミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、複数のプローブ配置部１８も形成されている。

サンプル注入部１２はＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させた生体サンプル反応液が注入されるものであるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を１０〜３００μＬ収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを２０〜３００μＬ収容しており、これらのタイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６はノズルで貫通可能なフィルム２０で封止されている。

各プローブ配置部１８は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。各プローブ配置部１８の凹部の大きさは、例えば直径が１００μｍ〜２ｍｍ、深さが５０μｍ〜１.５ｍｍの円形である。

基板１０の表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。このシール材２２もアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴフィルムなどの樹脂との積層膜などであるが、貼りつけ強度はフィルム２０よりは弱く、粘着剤などにより剥離可能な程度に貼りつけられている。

基板１０は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは０.３〜４ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。低自蛍光性の観点から基板１０の厚さは薄い方が好ましい。

この実施例の反応容器の使用方法を示す。
図３に示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２に外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液２４がピペット２６などにより２〜２０μＬ注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。

検出装置において、図４に示されるように、ノズル２８がフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル２８によりサンプル注入部１２に移送される。サンプル注入部１２ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とタイピング試薬が混合される。

その後、サンプル反応液とタイピング試薬との反応液がノズル２８により各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬずつ分注される。各プローブ配置部１８にはノズル２８によりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注されて、そのミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。

図５は反応容器の第２の実施例である。（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線位置での拡大断面図である。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅と、インベーダ反応によるＳＮＰ検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。

平板状の基板１０ａの同じ側に、図２の実施例と同じサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、及び複数のプローブ配置部１８が形成されている。この反応容器では、さらに遺伝子増幅試薬収容部３０、ＰＣＲ終了液注入部３１、及び増幅反応部３２が基板１０ａの同じ側に形成されている。

遺伝子増幅試薬収容部３０も基板１０ａに凹部として形成され、複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容している。遺伝子増幅試薬収容部３０はタイピング試薬収容部１４及びミネラルオイル収容部１６とともに、ノズルで貫通可能なフィルム２０で封止されている。遺伝子増幅試薬収容部３０にはＰＣＲ反応試薬が２〜３００μＬ収容されている。タイピング試薬収容部１４には図２の実施例と同様に、タイピング試薬が１０〜３００μＬ収容されており、ミネラルオイル収容部１６には２０〜３００μＬのミネラルオイルが収容されている。

ＰＣＲ終了液注入部３１は増幅反応部３２でＰＣＲ反応を終了した反応液とタイピング試薬とを混合するためのもので、基板１０ａに凹部として形成され、使用前の状態では空の状態で提供される。
増幅反応部３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。

増幅反応部３２の部分の断面を拡大して図６に示す。図６は図５のＹ−Ｙ線位置での断面図である。図６に示されるように、増幅反応部３２の液分注用ポート３４ａ，３４ｂはノズル２８の先端形状に対応した形状の開口３６ａ，３６ｂをもち、ノズル２８の先端に密着できるようにＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性素材で構成されている。

増幅反応部３２は熱伝導率をよくするためにその部分の基板１０ａの下面側が、図５（Ｃ）、図６に示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．２〜０．３ｍｍである。
サンプル注入部１２は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。

図２の実施例と同じく、タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを収容している。
各プローブ配置部１８も図２の実施例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。

基板１０ａの表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、ＰＣＲ終了液注入部３１、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、遺伝子増幅試薬収容部３０、増幅反応部３２及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。フィルム２０とシール材２２の材質及びその貼りつけ方法は図２の実施例と同じである。
基板１０ａも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは１〜２ｍｍである。

この実施例の反応容器の使用方法を示す。
図７に示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び遺伝子増幅試薬収容部３０を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２にサンプル２５がピペット２６などにより０.５〜２μＬ注入される。図２の実施例では、注入されるサンプルは外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。

検出装置において、図８に示されるように、ノズル２８がフィルム２０を貫通して遺伝子増幅試薬収容部３０に挿入されてＰＣＲ反応試薬が吸入され、ＰＣＲ反応試薬はそのノズル２８によりサンプル注入部１２に２〜２０μＬ移送される。サンプル注入部１２ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とＰＣＲ反応試薬が混合されてＰＣＲ反応液となる。

次に、図６（Ａ）に示されるように、そのＰＣＲ反応液がノズル２８により増幅反応部３２へ注入される。すなわち、ノズル２８が増幅反応部３２の一方のポート３４ａに挿入されてそのＰＣＲ反応液３８が注入され、続いて増幅反応部３２での反応中にＰＣＲ反応液３８が蒸発するのを防ぐために、ポート３４ａ，３４ｂにノズル２８によりミネラルオイル４０が注入されてポート３４ａ，３４ｂでのＰＣＲ反応液３８の表面がミネラルオイル４０で被われる。

ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液がノズル２８により回収されるが、このとき回収を容易にするために、図６（Ｂ）に示されるように、増幅反応部３２の一方のポート３４ａからミネラルオイル４０が注入される。反応終了後のＰＣＲ反応液３８ａは他方のポート３４ｂに押しやられる。そこで、そのノズル２８が挿入され、ＰＣＲ反応液３８ａがノズル２８に吸入される。ポート３４ａ，３４ｂはその開口３６ａ，３６ｂの形状がノズル２８の形状に合わせて形成され、かつ弾性素材で形成されているので、ノズル２８がポート３４ａ，３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。
ノズル２８により増幅反応部３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応液３８ａはＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。

次に、ノズル２８がフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル２８によりＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。ＰＣＲ終了液注入部３１ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬が混合される。

その後、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬との反応液がノズル２８により各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬずつ分注される。各プローブ配置部１８にはノズル２８によりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。

以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。

タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。

図９は上記の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型反応容器処理装置に本発明を適用した一実施例を示したものである。
装置内にヒータとして上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されている。反応容器装着部は下側ヒートブロック６０上に図２又は図５に示された反応容器４１がスライドして所定の位置に位置決めされる案内部が形成されていることにより、構成されている。反応容器装着部には反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。

下側のヒートブロック６０は遺伝子増幅反応部３２の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅反応温度制御部を構成している。また、両ヒートブロック６０，６２によりプローブ配置部１８の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部を備えている。増幅反応温度制御部とタイピング反応温度制御部は、図１ではそれぞれ符号１２０，１１０で示されている。増幅反応温度制御部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応温度制御部の温度は、例えば６３℃に設定されている。

図１０に示されるように、タイピング反応温度制御部を構成する上側のヒートブロック６２はプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５０をもち、下側のヒートブロック６０でタイピング反応温度制御部を構成する部分もプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５２をもっている。ヒートブロック６２上にはタイピング反応温度制御部カバー１５４が被せられており、そのカバー１５４にもヒートブロック６２の開口１５０の位置にのみ開口１５６が開けられている。開口１５０，１５６を介してノズル２８で反応容器４１のプローブ配置部へ反応液を分注することができる。

図９に戻って説明すると、ノズル２８による液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部としてＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向に移動する送液アーム６６が設けられており、送液アーム６６はノズル２８を備えている。分注部は図１では符号１１２で示されている。

図１１はノズル２８の先端部を表わしたものである。ノズル２８はその先端に使い捨て可能なチップ７０が着脱可能に装着される。（Ａ）はノズル２８にチップ７０が装着されていない状態、（Ｂ）はノズル２８にチップ７０が装着された状態を表わしている。ノズル２８はチップ７０内への液の吸入と吐出を行なう。そのため、ノズル２８はその先端にチップ７０を装着する外形寸法をもつ装着部２８ａと、その装着部２８ａの先端にあって、分注する液と接触しない長さで装着部２８ａよりも外形寸法の小さい突出部２８ｂとを備えている。

図１０に示されるように、ヒートブロック６０の下部には蛍光検出を行なう蛍光検出部６４が配置されており、蛍光検出部６４は反応容器４１の下面側からヒートブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部に励起光を照射し、反応容器４１の下面側でヒートブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部からの蛍光を検出する。蛍光検出部６４は図９の矢印Ｘ方向に移動してブローブ配置部１８からの蛍光を検出する。反応容器装着部によるプローブ配置部１８のＹ方向移動と、蛍光検出部６４のＸ方向移動により各ブローブでの蛍光検出を行なう。

図９に戻って説明すると、ヒートブロック６０，６２、蛍光検出部６４及び送液アーム６６の動作を制御するために、それらの近くに制御部１１８が配置されている。制御部１１８はＣＰＵを備えて、動作のためのプログラムを保持している。制御部１１８はヒートブロック６０，６２により実現されるタイピング反応温度制御部１１０や増幅反応温度制御部１２０の温度制御、蛍光検出部６４の検出動作、及び分注部１１２の送液アーム６６の分注動作を制御する。
反応容器４１として図２の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は必要ではなく、制御部１１８も増幅反応温度制御部の温度制御のための機能を備える必要がない。

図１２は蛍光検出部６４を詳細に示したものである。ヒートブロック６０，６２及びカバー１５４の図示は省略している。プローブ配置部１８にはインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無を検出するために、そのＳＮＰの塩基に応じたレポータプローブが保持されており、レポータプローブは蛍光体で標識されている。その標識蛍光体として、例えば を使用する。
各プローブ配置部１８にはインベーダプローブと反応させるための反応液１７０が分注され、反応中に反応液が蒸発するのを防ぐために反応液１７０の表面はミネラルオイル４０で被われている。

蛍光検出部６４は励起光照射部と蛍光受光部を備えた光学ユニットを構成している。標識蛍光体からの蛍光を検出するために、励起光源としてＬＥＤ９２を備え、そのＬＥＤ９２の発光を励起光として反応容器４１のプローブ配置部１８の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６とダイクロイックミラー９８を備えている。また、ＬＥＤ９２の発光のうち４８８ｎｍの光を選択して励起光とするためのフィルタ９４も備えている。レンズ９４はＬＥＤ９２からの励起光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされダイクロイックミラー９８で反射された励起光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。

対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する標識蛍光体からの蛍光を集光するレンズとしても作用する。ダイクロイックミラー９８は４８８ｎｍの励起光を反射し、５２５ｎｍの蛍光を透過させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の透過光（蛍光）の光路上には励起光成分を除去し、蛍光成分を透過させるフィルタ９９が配置されている。そのフィルタ９９を透過した光路上には集光レンズ１０２が配置され、その集光レンズ１０２により集光された蛍光が光検出器１０４に導かれる。光検出器１０４としては、光電子増倍管やフォトダイオードなどを使用する。
ＬＥＤ９２、レンズ９４、フィルタ９５、ダイクロイックミラー９８及びレンズ９６が励起光照射部を構成し、レンズ９６、ダイクロイックミラー９８、フィルタ９９、及びレンズ１０２が蛍光受光部を構成している。

蛍光検出部６４の蛍光検出動作は制御部１１８により制御される。ＬＥＤ９２は点滅点灯するように制御される。蛍光検出部６４の動作中は、ＬＥＤ９２が点滅点灯させられた状態でこの光学ユニットが反応容器４１に対して相対的に走査させられる。光軸が反応容器４１のプローブ配置部１８の下にきたときに光検出器１０４の検出信号がサンプルホールドされる。

ここでは１種類の蛍光を検出する場合を示しているが、検出する蛍光波長の異なる２台の光学ユニットによる２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを検知することができる。さらに、３種類以上の蛍光を検出する必要がある場合には、同様にして３種類以上の蛍光を検出することができる。
標識蛍光体としては、ＦＡＭ、Redmond Red、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡなどを使用することができる。

本発明は種々の化学反応の測定のほか、例えば遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。

本発明を概略的に示すブロック図である。 反応容器の第１の例を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の前半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の後半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 反応容器の第２の例を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線位置での断面図である。 同反応容器における遺伝子増幅反応部を図５（Ｂ）のＹ−Ｙ線位置での断面図として示す図であり、（Ａ）は反応液が注入された状態、（Ｂ）は反応液を回収するため状態である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の前半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の後半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 本発明の反応容器処理装置の一実施例を示す概略斜視図である。 同実施例におけるタイピング反応温度制御部を示す断面図である。 同実施例におけるノズル先端部を表わした正面図であり、（Ａ）はノズルにチップが装着されていない状態、（Ｂ）はノズルにチップが装着された状態を表わしている。 同実施例における蛍光検出部を示す概略構成図である。 本発明が関係することのあるＳＮＰ検出方法を概略的に示すフローチャート図である。

符号の説明

２ サンプル
４ ＰＣＲ反応試薬
６ インベーダ試薬
８ プローブ配置部
１０，１０ａ 基板
１２ サンプル注入部
１４ タイピング試薬収容部
１６ ミネラルオイル収容部
１８ プローブ配置部
２０ フィルム
２２ シール材
２８ ノズル
２８ａ チップ装着部
２８ｃ 突出部
３０ 遺伝子増幅試薬収容部
３１ ＰＣＲ終了液注入部
３２ 遺伝子増幅反応部
４１ 反応容器
６０，６２ ヒートブロック
６４ 蛍光検出部
６６ 送液アーム
７０ チップ
９２ ＬＥＤ
９４，９６，１０２ レンズ
１０４ 光検出器
１１０ タイピング反応温度制御部
１１２ 分注部
１１６ チップ位置センサ部
１１８ 制御部

Claims (7)

1. サンプルに反応を起こさせる少なくとも１つの反応部を平板状基板に備えた反応容器を装着する反応容器装着部と、
   前記反応部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部と、
   前記蛍光検出部の検出動作を少なくとも制御する制御部とを少なくとも備え、
   前記蛍光検出部は励起光源として発光素子を備え、その発光素子を連続発光よりも発光強度を高めるように点滅点灯させながら蛍光を検出するようにしたことを特徴とする反応容器処理装置。
2. 前記発光素子はＬＥＤ又はＬＤである請求項１に記載の反応容器処理装置。
3. 前記反応容器は前記基板に凹部として形成され、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部をさらに備えたものであり、
   該反応容器処理装置はノズルによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、前記分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部とを備えた請求項１又は２に記載の反応容器処理装置。
4. 前記反応容器は前記基板に凹部として形成され前記サンプルの反応に使用される試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも１つの試薬収容部をさらに備えたものである請求項３に記載の反応容器処理装置。
5. 前記反応容器は前記基板に凹部として形成され前記サンプルの反応に使用される試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも１つの試薬収容部をさらに備えたものであり、
   該反応容器処理装置はノズルによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、前記分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部とを備えた請求項１又は２に記載の反応容器処理装置。
6. 前記反応容器は前記試薬収容部としてタイピング試薬収容部を少なくとも含み、前記反応部が複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部となっている遺伝子多型診断用反応容器であり、
   該反応容器処理装置は前記プローブ配置部の温度をサンプルのゲノムＤＮＡと前記タイピング試薬との反応液を前記プローブ配置部のプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部をさらに備え、
   前記制御部は前記タイピング反応温度制御部の温度制御も行なうものである請求項４又は５に記載の反応容器処理装置。
7. 前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えた遺伝子多型診断用反応容器であり、
   該反応容器処理装置は前記増幅反応部の温度を前記サンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部をさらに備え、
   前記制御部は前記増幅反応温度制御部の温度制御も行なう請求項６に記載の反応容器処理装置。

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