JP2006011440A

JP2006011440A - 顕微鏡

Info

Publication number: JP2006011440A
Application number: JP2005182095A
Authority: JP
Inventors: Volker Seyfried; ザイフリートフォルカー; Werner Knebel; クネーベルヴェルナー; Jan Schroeder; シュレーダーヤン
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-22
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2025-06-22
Also published as: US20050286122A1; JP4932184B2; DE102004031048A1

Abstract

【課題】クリティカルな測定パラメータが存在する場合であっても、支障のない撮像（画像生成）が可能でありかつ検出器の不都合な損傷が回避可能な顕微鏡を提供すること。
【解決手段】少なくとも１つの光源と、被検対象へ光源光を導く照明光路と、検出器と、該被検対象から該検出器へ検出光を導く検出光路とを含んで構成される、とりわけ蛍光顕微鏡等の顕微鏡において、前記検出光路（３）に、該検出光路（３）中での光強度の制御及び／又は制限をするための可制御要素を有することを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、少なくとも１つの光源と、被検対象へ光源光を導く照明光路と、検出器と、該被検対象から該検出器へ検出光を導く検出光路とを含んで構成される、とりわけ蛍光顕微鏡等の顕微鏡に関する。

本書で取り扱う種類の顕微鏡は、古くから、多彩な用途に対し極めて多様な構造形態で使用されている。幾つかの用途、とりわけ蛍光利用測定では、被検試料中に大きな強度（ないしパワー）の光が生成され、そのため大きな強度の検出光が検出ビーム路に沿って検出器へ導かれるという問題が生じる。この場合、検出器に入射する光量が余りにも大きいため、検出器がその技術的可能性の範囲内において処理を行うことができないという事態も生じ得る。大きな光強度によって引き起こされる検出器の非線形的な振舞いにより画質が著しく損なわれることに加え、過大な光入射により、検出器の損傷が引き起こされたり、場合によっては検出器の完全な損壊に至ったりすることさえあり得る。

上述の効果の例としては、いわゆるフライモード（FlyMode）で実行される蛍光利用測定、例えばＦＲＡＰ（光退色後蛍光回復：fluorescence recovery after photobleaching）又はＦＬＩＰ（光退色中蛍光消失：fluorescence loss in photobleaching）を指摘することができる。これらは、照明光ビームを高速で被検試料上で案内することにより試料を２方向においてスキャンする検査方法である。検出器としては、この種の測定において一般的な光電子増倍管が使用される。この場合、具体的には、２つの深刻な問題が生じ得る。ひとつは、フライモードにおける大きなスキャン速度のため、光電子増倍管に生じる電荷量を十分な速さでは除去・処理することができないことである。その結果、使用に堪えない画像が得られる。もうひとつは、検出器に生じる蛍光光線の強度が大きいため、検出器の損傷、とりわけ光電子増倍管の高感度の感光性陰極の損傷が引き起こされ得ることである。

上述の問題が良く起こる部類の試験のひとつは、上述のＦＲＡＰ測定である。この種の試験では、所定のＲＯＩ（目的領域：region of interest）が、まず、小さい光強度によって照射され、次いで、大きな光強度によって退色（漂白：gebleicht）される。次に、蛍光光線の再生（回復）の時間経過が測定される。回復プロセスは、例えば自由拡散によって受動的に、又は能動的輸送プロセスによって行うことができる。分子の移動性、即ち試料の非退色領域から試料の退色領域への分子の移動の検出に利用される蛍光色素としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＧＦＰ誘導体が使用されることが多い。とりわけ退色（Bleich）過程中においては、この種の測定の場合も、検出器に対し過大な負荷がかかりうる。

それゆえ、本発明の課題は、例えば大きなスキャン速度及び／又は退色（漂白）過程における強い励起光のようなクリティカルな測定パラメータが存在する場合であっても、支障のない撮像（画像生成）が可能でありかつ検出器の不都合な損傷が回避可能な、冒頭で述べた種類の顕微鏡を提供することである。

上記の課題を解決するために、本発明の一視点により、少なくとも１つの光源と、被検対象へ光源光を導く照明光路と、検出器と、該被検対象から該検出器へ検出光を導く検出光路とを含んで構成される、とりわけ蛍光顕微鏡等の顕微鏡が提供される。この顕微鏡において、前記検出光路に、該検出光路での光強度の制御及び／又は制限をするための可制御要素を有することを特徴とする（形態１・基本構成）。

本発明の独立請求項１により、上記課題に対応する効果が上述のとおり達成される。即ち、本発明の顕微鏡では、クリティカルな測定パラメータが存在する場合であっても、支障のない撮像（画像生成）が可能であり、かつ検出器の不都合な損傷も回避することができる。
更に、各従属請求項により、付加的な効果が後述のとおりそれぞれ達成される。

以下に、本発明の好ましい実施の形態を、上記基本構成を形態１として示すが、これらは従属請求項の対象でもある。
（１）形態１（上掲）。
（２）上記形態１の顕微鏡において、前記可制御要素は、迅速に切換可能に構成されることが好ましい（形態２）。
（３）上記形態１又は２の顕微鏡において、前記可制御要素は、フレーム的、ライン的、ピクセル的又はサブピクセル的に切換可能に構成されることが好ましい（形態３）。
（４）上記形態１〜３の顕微鏡において、前記可制御要素は、プログラム制御可能に構成されることが好ましい（形態４）。
（５）上記形態１〜４の顕微鏡において、前記可制御要素は、波長特異的（選択的）に作動可能に構成されることが好ましい（形態５）。
（６）上記形態１〜５の顕微鏡において、前記可制御要素は、音響光学変調器（ＡＯＭ）又は音響光学偏向器（ＡＯＤ）として構成されることが好ましい（形態６）。
（７）上記形態１〜５の顕微鏡において、前記可制御要素は、好ましくは平行な端面（複数）を有する音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）として構成されることが好ましい（形態７）。
（８）上記形態１〜５の顕微鏡において、前記可制御要素は、ＬＣＤ（液晶ディスプレイ）又はＬＣＴＦ（液晶同調（チューナブル）フィルタ）として構成されることが好ましい（形態８）。
（９）上記形態１〜５の顕微鏡において、前記可制御要素は、ＧＬＶ（グレーティングライトバルブ）として構成されることが好ましい（形態９）。
（１０）上記形態１〜４の顕微鏡において、前記可制御要素は、ガルバノメータとして構成されることが好ましい（形態１０）。
（１１）上記形態１〜１０の顕微鏡において、複数の可制御要素が、前記検出光路に配されることが好ましい（形態１１）。
（１２）上記形態１〜１１の顕微鏡において、前記検出光路から外部へ射出された光を捕捉するための光トラップを有することが好ましい（形態１２）。
（１３）上記形態１〜１２の顕微鏡において、前記可制御要素は、検出ピンホール装置に前置されることが好ましい（形態１３）。
（１４）上記形態１３の顕微鏡において、前記可制御要素は、前記検出ピンホール装置に前置されるアクロマート装置に前置されることが好ましい（形態１４）。
（１５）上記形態１〜１２の顕微鏡において、前記可制御要素は、前記検出ピンホール装置に後置されることが好ましい（形態１５）。

本発明により、第一に確認されたことは、所定の顕微鏡検査法においては、試料（被検対象）から出て検出器に入射する検出光線の量は、撮像の質（ないし生成画像の質）の観点からも検出器の損傷の観点からもクリティカルな量ないしパラメータをなすということである。このような損傷を回避するために、本発明により、検出器に入射する検出光の制御及び／又は制限をすることが可能な可制御要素が、検出光路に配される。本発明のこの形態により、例えば照明光路における光強度の低減は不要とすることができる。蛍光が非常に強くかつスキャニングが非常に高速であるような場合でさえも、更に例えば退色過程中においても、支障のない撮像（画像生成）を小さくした光強度によって実行することが可能である。

好ましい一実施形態では、迅速に切換可能な可制御要素が配される。ここに、「迅速な」とは、この文脈においては、スキャン過程と可制御要素における切換過程（複数）との間での時間的同期が可能であることを意味するものとする。切換可能性の迅速性が十分に大きい場合、可制御要素は、１つのスキャン過程の間に、フレーム的に（フレーム毎に）又はライン的に（ライン毎に）切換えを行うことができるだけではなく、ピクセル的に（ピクセル毎に）更にはサブピクセル的に（サブピクセル毎に）切換えを行うことも可能である。検出器に入射する光の量は、可制御要素をピクセル的に又はサブピクセル的に切換えを行う場合、極めて大きな正確さで制御することができるので、全スキャン過程中における検出器の過負荷（Uebersteuerungen）を効果的に回避することができる。

とりわけスキャナの往路において試料が退色されかつ復路において観察が行われる場合は、可制御要素はライン的に切換えるのが特に好ましい。この場合、可制御要素は、退色中に、例えば放出された蛍光光線が完全に遮光されるように切換えることができる。尤も、退色過程中においても、試料の構造に関する特別な情報が得られることがあるので、蛍光光線を完全に遮光する代わりに単に減弱するように構成することも可能である。この場合、可制御要素は、スキャナの往路において、検出器がそのダイナミックレンジにおいてかろうじて作動できる程度の蛍光光線が検出器に到達するように、切換えられることも可能である。このようにして、少なくとも蛍光光線の強度の動的（ダイナミック）経過が退色過程中においても観察することができる。

とりわけ好ましい一実施形態では、可制御要素は、プログラム制御可能に構成することができる。そのため、可制御要素の切換状態をスキャン過程全体のための測定の前に予め設定しておくことも可能である。これは、検出光路に見込まれ得る光強度が検査されるべきＲＯＩの内部において測定の前に既に少なくともおおよそ分かっている場合にとりわけ都合が良い。また、可制御要素は、その都度検出される光量に応じて、測定中オンラインで切換えることも可能である。

大きな柔軟性（フレキシビリティ）という観点から、波長特異的（選択的）に作動する可制御要素を検出光路に配することができる。このようにして、例えば照明光のうち検出光路に存在する部分ないし成分を目標を定めて検出光路から除去ないし分岐することにより、本来的に関心のある（蛍光）検出光が妨害的な励起光（この励起光の強度は検出光の強度よりも数桁大きいことが多い。）によって重畳されないようにすることができる。付加的に又は代替的に、試料から放出された蛍光光線を、例えば全スペクトルにわたって一様に減弱し又はスペクトル選択的に減弱することも可能である。

可制御要素は、具体的には、音響光学変調器（ＡＯＭ）又は音響光学偏向器（ＡＯＤ）とすることができる。これらの構造要素は、蛍光光線の検出光路からの減弱ないし完全な除去にとりわけ良好に適することが分かっている。検出光路中に存在する励起光（実用上一般的にはシステム内に生成する励起散乱光がこれに該当する。）の遮光ないし可及的に完全な抑制のために、とりわけ音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）を使用することができる。

検出光路中に存在する蛍光光線の光強度を制御するために、音響光学素子の代わりに、ＬＣＤ（液晶ディスプレイ）又はＬＣＴＦ（液晶同調（チューナブル）フィルタ）を使用することも可能である。

同様に、グレーティングライトバルブ（ＧＬＶ：grating light valve：シリコンライトマシンズ（Silicon Light Machines）社の商品名）を使用することも可能である。この電気的に制御可能な回折格子では、入射する検出光ビームは、格子に所定の格子間隔に対応して印加される電圧に応じて反射ないし回折される。格子を構成するセラミックストリップ（複数）は、格子の反射及び／又は回折特性を変化するために、ごく僅かしか撓む必要がないので、このライトバルブの使用は、とりわけ迅速な切換が必要とされる場合に都合が良い。

とりわけ波長特異的な減弱が必要とされない単純な一実施形態では、ガルバノメータを可制御要素として使用することができる。

検出光路に可制御要素を１つのみ使用する実施形態の代わりに、システム構成のとりわけ高度な柔軟性の観点から、複数の、好ましくは２つの可制御要素を備えることも可能である。この場合、専ら励起散乱光の遮光を可能とするように第１の可制御要素を選択し、蛍光光線を波長特異的に減弱するよう第２の可制御要素を構成することも可能である。

好ましい一実施形態では、１つの可制御要素又は複数の可制御要素によって検出光路から外に分岐された光が（顕微鏡）システムの各成分において散乱されないようにし、場合によっては妨害作用を引き起こすことがないようにするために、検出光路から外部に分岐された光を捕捉する１つ又は複数の光トラップを備えることも可能である。

検出光路における可制御要素の配置の観点からは、可制御要素が検出ピンホール装置に前置されるよう構成することも可能である。検出ピンホール装置に前置されたアクロマートを有する顕微鏡を使用する場合、可制御要素が当該アクロマートに前置されるよう構成すると都合がよい。

可制御要素が検出ピンホール装置に後置されるよう構成することもまた多くの場合好都合である。

以下に、本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の実施例は発明の理解の容易化のためのものであって、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等の適用を排除することは意図していない。また、特許請求の範囲に付した図面参照符号も発明の理解の容易化のためのものであって、本発明を図示の態様に限定することは意図していない。なお、これらの点に関しては補正・訂正後においても同様である。

図１は、本発明の顕微鏡の一例の基本構造を模式的に示したものである。この顕微鏡では、試料（被検対象）１から放射された検出光２は、検出光路３に沿って進行し、光電子増倍管４として構成された検出器５に導かれる。照明光（不図示）は、照明光路に沿って進行し、ビームスプリッタ６と対物レンズ７とを介して試料１上に導かれる。検出光２は、照明光とは反対の順に、対物レンズ７とビームスプリッタ６とを通過する。

検出光路３では、検出光路３における光強度の制御及び／又は制限をするための２つの可制御要素が光電子増倍管４に前置されている。具体的には、可制御要素は、図示の実施例では、ＡＯＴＦ８及びＡＯＭ９である。

ＡＯＴＦ８は、高周波電源によって制御されるピエゾ音響発生器（超音波発生圧電素子）によって生成される音波（超音波）が通過せしめられる。この２つの構成要素即ち高周波電源及びピエゾ音響発生器は、図の記載の簡明化の観点から図示は省略した。ＡＯＴＦ８を通過する音波の周波数を変化することによって、ＡＯＴＦ８は、所定の波長成分を検出光路３から除去して光電子増倍管４に入射しないように切換え可能に構成されている。所望の波長成分は、音響的励起によっては影響を受けず、検出光路３から分岐射出されない。ここでいう不所望の波長成分とは、妨害的な励起散乱光１０であるが、これは光トラップ１１によって捕捉される。

検出光２の０次光が（音響光学）結晶を通過し、分離除去されるべき＋１次又は−１次回折光が偏向されるようにＡＯＴＦ８が作動されるのが好ましい。（音響光学）結晶の入射面ないし出射面は、０次光（検出光）に対し分散（発散）が生じないような切り口となるよう構成されると都合がよい。通常は、この２つの面が互いに対し平行になるように構成される。

ＡＯＴＦ８には、更なる可制御要素としてＡＯＭ９が後置されている。ＡＯＭ９に印加されるＲＦ（ラジオ周波数）パワーを変化することにより、ＡＯＭ９の回折効率を変化することができる。ＡＯＭ９は、図示の実施例では、試料１から放射された蛍光光線のうちの不所望の波長成分が検出光路３から外部に分岐射出されて光トラップ１３に吸収されるように、切換えられる。

０次（回折）光が検出のために使用され、かつ１次回折光が光の減弱のために使用されるようにＡＯＭ９が作動するのが好ましい。

ＡＯＴＦ８及びＡＯＭ９の後方ないし下流域の検出光路３に辿り着いた検出光２は、アクロマート１４及び検出ピンホール装置１５を通過し、最終的に光電子増倍管４に入射する。この検出光２は、光強度の観点から、光電子増倍管４が過負荷されずかつ入射光強度が問題なく即ちとりわけ線形的な応答特性に関して問題なく処理可能であるように、波長特異的に、制限されている。このため、過大な光入射による光電子増倍管４の損傷更には損壊は、効果的に回避される。

光電子増倍管４の代わりに、像増幅器を有するＣＣＤ、アバランシュフォトダイオード（ＡＰＤ）、ＥＭＣＣＤ（電子増倍型ＣＣＤ）等のようなその他の検出器を使用することができることに注意すべきである。

本発明の顕微鏡の一例の模式的側面図。

符号の説明

１試料（被検対象）
２検出光
３検出光路
４光電子増倍管
５検出器
６ビームスプリッタ
７対物レンズ
８ＡＯＴＦ
９ＡＯＭ
１０励起散乱光
１１光トラップ
１２分岐射出された蛍光光線
１３光トラップ
１４アクロマート
１５検出ピンホール装置

Claims

少なくとも１つの光源と、被検対象へ光源光を導く照明光路と、検出器と、該被検対象から該検出器へ検出光を導く検出光路とを含んで構成される顕微鏡において、
前記検出光路（３）に、該検出光路（３）での光強度の制御及び／又は制限をするための可制御要素を有すること
を特徴とする顕微鏡。
前記可制御要素は、迅速に切換可能に構成されること
を特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、フレーム的、ライン的、ピクセル的又はサブピクセル的に切換可能に構成されること
を特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、プログラム制御可能に構成されること
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、波長特異的に作動可能に構成されること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、音響光学変調器（ＡＯＭ）（９）又は音響光学偏向器（ＡＯＤ）として構成されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）（８）として構成されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、ＬＣＤ（液晶ディスプレイ）又はＬＣＴＦ（液晶同調フィルタ）として構成されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、ＧＬＶ（グレーティングライトバルブ）として構成されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、ガルバノメータとして構成されること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の顕微鏡。
複数の可制御要素が、前記検出光路（３）に配されること
を特徴とする請求項１〜１０の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記検出光路（３）から外部へ射出された光を捕捉するための光トラップ（１１、１３）を有すること
を特徴とする請求項１〜１１の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、検出ピンホール装置（１５）に前置されること
を特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、前記検出ピンホール装置（１５）に前置されるアクロマート装置（１４）に前置されること
を特徴とする請求項１３に記載の顕微鏡。
前記可制御要素は、前記検出ピンホール装置（１５）に後置されること
を特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の顕微鏡。