JP2001290081A - 試料照射装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】その配置が簡素であり、各誘導ビーム経路用の
光学素子の数を削減することができるような試料照射装
置を提供する。 【解決手段】本発明は、好ましくは共焦点蛍光走査型顕
微鏡法において、１つの光源（３）の１つの照射ビーム
経路（２）およびさらに別の光源（５）の少なくとも１
つのさらに別の照射ビーム経路（４）を有する試料
（１）を照射する装置に関する。照射ビーム経路におけ
る配置を簡素にし、光学素子を削減するために、少なく
とも１つの光学素子（７）が照射ビーム経路（２，４）
の少なくとも一方に配置され、光学素子（７）が光を変
性するようになっている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、好ましくは共焦点
蛍光走査型顕微鏡法において、１つの光源の１つの照射
ビーム経路およびさらに別の光源の少なくとも１つのさ
らに別の照射ビーム経路を有し、照射ビーム経路が互い
に少なくとも部分的に重なり合うことができる試料照射
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】国際公開第９５ ２１ ３９３号によ
り、特に共焦点蛍光走査型顕微鏡法に関して、一般的な
タイプの装置が既知である。この装置において、試料点
の横解像度を向上させるために、試料点は励起光ビーム
を用いて照射され、その結果、励起光によって作用され
る蛍光分子が励起状態に達する。さらに、試料点は、適
切な波長の誘導光ビームを用いて照射され、その結果、
励起状態にある蛍光分子を誘導放出のプロセスによって
基底状態に戻らせることができる。このような関係にお
いて、励起光ビームおよび誘導光ビームは、その強度分
布または照射パターンが試料領域において、互いに部分
的に重なり合うように配置される。オーバーラップ領域
にある蛍光分子は、励起光ビームによる励起直後に、誘
導放出によって基底状態に達するため、蛍光は、誘導ビ
ームの照射パターンまたは２つの照射パターンのオーバ
ーラップ領域に位置するのではなく、励起ビームの照射
パターンに位置する蛍光分子からのみ検出される。誘導
放出光および反射誘導光は、光学フィルタによって走査
型顕微鏡の検出ビーム経路からフィルタリングされるた
め、励起ビームの照射パターンの領域から２つの照射パ
ターンのオーバーラップ領域を除いた蛍光のみが検出さ
れる。このような縮小により、回折限界画像の限界より
小さいサイズまで蛍光放射に寄与する試料領域を縮小さ
せることができるため、解像度が向上する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述した既知の一般的
な装置において、励起光ビームおよび誘導光ビームの調
整は、２つの光ビームが空間的に明確に定義された方法
で互いにそろえなければならないため、問題をはらんで
いる。このような配置にするため、個別の光学素子は、
手動またはモータを備えた方法で位置調整がなされる。
このような位置調整は、特に長期の安定性を備える必要
があるため、設計に相当の費用が必要となる。温度変化
によって、光学的な配置全体の長手方向の膨張もまた、
補償されなければならない。形成される誘導光ビームの
照射パターンの形状に応じて、複数の光学素子を使用す
る必要がある可能性があり、このことは不都合なことに
調整の自由度を増大させる。

【０００４】したがって、本発明の目的は、その配置が
簡素であり、各誘導ビーム経路用の光学素子の数を削減
することができるような試料照射装置を構成および開発
することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、請求項１
に記載の装置によって実現される。本願の請求項１に記
載の試料照射装置は、好ましくは共焦点蛍光走査型顕微
鏡法において、１つの光源（３）の１つの照射ビーム経
路（２）およびさらに別の光源（５）の少なくとも１つ
のさらに別の照射ビーム経路（４）を有し、前記照射ビ
ーム経路（２，４）が互いに少なくとも部分的に重なり
合うことができるような試料（１）を照射する装置であ
って、少なくとも１つの光学素子（７）が前記照射ビー
ム経路（２，４）の少なくとも一方に配置され、光を変
性することと、試料領域における前記照射ビーム経路
（２，４）の照射パターンが形状を変形するように、前
記素子（７）の光学特性が影響を受けるまたは変性され
ることとを特徴としている。

【０００６】

【発明の実施の形態】図１は、共焦点走査型蛍光顕微鏡
法に関して、試料１を照射する装置を示している。走査
型蛍光顕微鏡は、試料１の点状蛍光励起を形成する光源
３の照射ビーム経路２を有する。さらに別の光源５のさ
らに別の照射ビーム経路４は、明確に定義された試料領
域において蛍光分子の誘導放出を形成する。照射ビーム
経路２，４は、互いに重なり合うことができる。２つの
照射ビーム経路２，４は、ビームスプリッタ６によって
結合される。

【０００７】本発明によれば、照射ビーム経路４の光を
変性する光学素子７は、照射ビーム経路４中に配置され
る。素子７の光学特性は、試料領域における照射ビーム
経路４の照射パターンが形状を変形させるように影響を
及ぼしたり変化させたりすることができる。

【０００８】光学素子７は、対物レンズ８の焦点面に共
役なフーリエ平面に配置される。

【０００９】光学素子７は、光の位相および振幅を変化
させ、光透過素子として具体化される。

【００１０】光学素子７は、ピクセルごとに入射光の位
相をλ／２遅延するＬＣＤ素子である。したがって、個
別の空間周波数は、ＬＣＤ素子の励起関数として、λ／
２位相遅延させることができ、さらに、振幅に関して減
衰させることができる。光学素子７によるさらに別の照
射ビーム経路４の位相または振幅を変化させた結果、試
料領域におけるさらに別の照射ビーム経路４の照射パタ
ーンの形状を変形させる。

【００１１】図２は、本発明による装置のさらなる実施
形態を示している。ここでは、光学素子は、さらに別の
照射ビーム経路４における個別の素子として配置される
変形可能なミラー９として具体化される。変形可能なミ
ラー９は、ピエゾアクチュエータ１０によって調整され
ることができる。

【００１２】図３は、図２の別報として、本発明による
装置の実施形態を示している。光源５からの光は、ビー
ムスプリッタキューブ１１に当り、概略的に示されてい
る発散光学系１２の方向に反射される。ＬＣＤ素子とし
て具体化された光学素子７を通過した後、さらに別の照
射ビーム経路４の光はミラー１３に当る。ミラー１３
は、光学素子７、発散光学系１２およびビームスプリッ
タキューブ１１を通過した光をビームスプリッタ６に反
射する。ビームスプリッタ６で、さらに別の照射ビーム
経路４は、光源３の照射ビーム経路２と結合される。

【００１３】この実施形態において、素子７の光学特性
の変性は、定義可能な事象と同期されることができる。
光学素子７は、同期手段１４（点線で示す）を介して、
パルスレーザ光源５およびレーザ光源３に接続される。
パルスレーザ５のパルス列の関数として、光学素子７を
作動することができる。光学素子７は、同期手段１５
（点線で示す）を介して走査装置１６に接続される。こ
れにより、走査装置１６を光学素子７と同期することが
できる。光学素子７は、同期手段１７（点線で示す）を
介して検出器１８に同様の方法で接続される。

【００１４】図１〜図３において、光学素子７は、さら
に別の照射ビーム経路４全体に作用する。図１〜図３に
おいて照射ビーム経路２の励起用ピンホール１９および
検出ビーム経路２１の検出用ピンホール２０を示す。照
射ビーム経路２，４は、ビームスプリッタ２２によって
検出ビーム経路２１から分離される。

【００１５】最後に、上述した例示の実施形態は、特許
請求された教示を示すために過ぎず、それら例示の実施
形態に限定するものではないことを特に留意されたい。

【００１６】本発明によって第一に認識されることは、
光学素子がその光学特性の点において影響を及ぼすこと
ができるまたは変性することができるという事実によっ
て、光学素子の調整を簡素化することができる。素子の
光学特性が変性されると、素子は対応する照射ビーム経
路および試料領域の照射パターンの光を変性する。その
結果、その照射ビーム経路の照射パターンは、その形状
および／またはその３次元位置に関して、もう１つの照
射ビーム経路の照射パターンに対して変性させることが
できるため、互いに照射ビーム経路を調整することがで
きる。

【００１７】好都合なことに、調整に匹敵する方式で、
素子の光学特性の変性によって、装置の温度ドリフトを
補償することができるため、明確に定義された最適な照
射および検出状態が常に存在する。理想的には、光学特
性を変性することができる素子を使用することによっ
て、物理的に複雑な調整およびドリフト補償装置の必要
がないようにすることができ、それによって（特に好都
合な方式で）光ビーム経路を簡素にし、さらに製作コス
トを削減する。

【００１８】光学特性を変性することができる光学素子
はまた、ビームに対応する影響または変性を与えること
によって、複数の個別の光学素子と同様の効果を実現す
ることができるため、光学素子の数を削減することがで
きる。

【００１９】光学素子は、さらに別の照射ビーム経路に
配置されることが好ましい。したがって、光学素子はさ
らに別の照射ビーム経路にのみ作用するため、それによ
って、試料領域においてさらに別の照射ビーム経路の照
射パターンの形状が変性される。これに関連して、さら
に別の照射ビーム経路は、誘導光ビームとして使用され
てもよい。

【００２０】光学素子はまた、照射ビーム経路および／
または検出ビーム経路に配置されてもよい。それによっ
て、試料領域における照射ビーム経路の照射パターンの
形状および検出器によって検出可能な試料領域の検出パ
ターンの形状が変形される。照射ビーム経路および検出
ビーム経路における複数の光学素子を結合した配置も考
えられる。これは、たとえば試料領域におけるさらに別
の照射ビーム経路の照射パターン用にさらに別の照射ビ
ーム経路に配置される光学素子を用いて、非対称な形状
を形成することができ、試料領域における照射ビーム経
路の照射パターン用に照射ビーム経路にさらに別の光学
素子を配置する結果、さらに別の照射パターンを鏡像対
称に形成することができる。この方法は、異方性または
六角形のピクセルパターンを用いて試料を走査するため
に使用されてもよい。

【００２１】特に好ましい実施形態において、光学素子
は、対物レンズの焦点面と共役なフーリエ平面に配置さ
れる。その結果、フーリエ光学の原理に基づき、光学素
子の対応する構成に関して、すべての空間周波数は、同
一または異なるように作用されることができる。

【００２２】光学素子は、それに関連するビーム経路に
おいて光通過素子または反射素子として具体化されても
よい。

【００２３】素子の光学特性の変性のために、素子は、
適応性のある光学構成要素として具体化される。同様の
方法または局所的に異なる方法で、光ビーム全体に作用
させることができる。

【００２４】具体的には、光学素子は液晶表示装置（Ｌ
ＣＤ）として具体化されてもよい。ＬＣＤ素子の適切な
作動によって、ピクセル単位で、入射光の位相の遅延お
よび／または入射光の振幅の縮小を実現することができ
る。ＬＣＤ素子におけるそれぞれの個別ピクセルを直接
制御することができるため、特に好都合な方式におい
て、この配置はきわめて柔軟性に富み、使用中に素子の
光学特性を変性することもできる。

【００２５】さらなる実施形態において、光学素子はカ
ラーＬＣＤとして具体化される。これは、特に、異なる
波長の光が進行しているビーム経路にカラーＬＣＤ素子
を配置する場合に、きわめて好都合である。カラーＬＣ
Ｄ素子を適切に設置することによって、カラーLCD 素子
はピクセルごとの色選択方式において、複数の波長のう
ちの１つの光に作用することができる。

【００２６】きわめて一般的に言えば、光学素子は、マ
イクロメカニカルシステムとして具体化されてもよい。
特に、光学素子は、ディジタルマイクロミラー（ＤＭ
Ｄ）またはグレーティングライトバルブ（ＧＬＶ）とし
て具体化されてもよい。このような光学素子はまた、ピ
クセルごとに作動させることもできるため、対応するビ
ーム経路の個別の領域から反射させたり個別の領域に影
響を及ぼすことができる。別法として、変形可能なミラ
ーを光学素子として使用してもよい。変形可能なミラー
の個別の領域をその面形状に関して変形することができ
るため、対応するビーム経路の照射パターンまたは検出
パターンはその形状を変形する。

【００２７】特に好都合な方式において、光学素子の光
学特性の変性は、定義可能な事象と同期させることがで
きる。たとえば、光学素子は、光源の強度変調またはパ
ルス列と同期させてもよい。好都合なことに、走査型顕
微鏡の走査装置を光学素子と同期させることは、特定の
照射点において横方向または軸方向の依存を示しうる走
査型顕微鏡において使用される光学系の横方向または長
手方向の色の誤差を補償するために作用する。信号発生
を最適化するために、素子の光学特性の変性と検出器素
子との同期も行われることができる。

【００２８】光学素子は、ビーム経路の全体または一部
に作用することができる。光学素子が相互に作用するビ
ーム経路の断面より大きくなるような寸法に形成される
ことが好ましいため、光学素子は照射ビーム経路全体に
作用する。しかし、別法として、逆の場合、言い換えれ
ば、ビーム経路の断面が光学素子の寸法より大きい場合
も考えられる。

【００２９】光学素子によって、照射ビーム経路および
／またはさらに別の照射ビーム経路の照射パターンは、
定義された方式で形成されることもできる。特に、トー
ラスが対物レンズの焦点面に位置し、照射ビーム経路の
照射パターンに対して対称に配置される場合には、さら
に別の照射ビーム経路の環状照射パターンは、横解像度
を増大させるため、非常に好都合であると思われる。２
つの照射パターンの重なり領域において励起される蛍光
分子による誘導放出は、それに励起されるため、適切な
検出の場合には、照射パターンの領域からオーバーラッ
プ領域を除いた蛍光のみを検出することができる。さら
に、照射ビーム経路に配置される光学素子は、実質的
に、樽、平行六面体、立方体または球の形状であるよう
な照射パターンを形成してもよい。最後に、特定の照射
パターンの形状は、たとえば最大ＳＮ比を備えた最大解
像度を目的とする場合など用途の境界条件に適応させる
必要がある。

【００３０】特に好都合な方式において、さらに別の照
射ビーム経路の照射パターンは、照射ビーム経路の照射
パターンに対する構成と相補性があるため、すべての空
間的な方向において、解像度の向上が可能となる。

【００３１】すべての空間的な方向において等方性であ
る照射パターンは、この方式で得られた試料の像が、す
べての空間的な方向において同一の解像度および等距離
のピクセルサイズであるため、特に定量分析の場合にき
わめて好都合である。

【００３２】ＳＮ比を最大にするため、照射パターンが
少なくとも大部分は一様な強度分布に構成されるように
準備がされる。その結果、同一の強度を備えた蛍光発光
するために、照射パターンの光によって作用される蛍光
分子が励起され、その誘導放出がさらに別の照射パター
ンによって励起される蛍光分子は、同一の遷移確率を備
えた基底状態に達する。このため、照射パターンの強度
分布が、エッジで急に減少するように準備され、測定さ
れる領域と誘導される領域との間に最も著しい可能な遷
移を生じる。

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明の試料照
射装置では、少なくとも１つの光学素子が照射ビーム経
路の少なくとも一方に配置され光を変性することと、試
料領域における照射ビーム経路の照射パターンが形状を
変形するように前記素子の光学特性が影響を受けるまた
は変性されることとを特徴としているから、光学素子の
調整を簡素化することができる。すなわち、素子の光学
特性が変性されると、素子は対応する照射ビーム経路お
よび試料領域の照射パターンの光を変性する。その結
果、その照射ビーム経路の照射パターンは、その形状お
よび／またはその３次元位置に関して、もう１つの照射
ビーム経路の照射パターンに対して変性させることがで
きるため、互いに照射ビーム経路を調整することができ
る。

【００３４】好都合なことに、調整に匹敵する方式で、
素子の光学特性の変性によって、装置の温度ドリフトを
補償することができるため、明確に定義された最適な照
射および検出状態が常に存在する。理想的には、光学特
性を変性することができる素子を使用することによっ
て、物理的に複雑な調整およびドリフト補償装置の必要
がないようにすることができ、それによって（特に好都
合な方式で）光ビーム経路を簡素にし、さらに製作コス
トを削減することができる。

【００３５】光学特性を変性することができる光学素子
はまた、ビームに対応する影響または変性を与えること
によって、複数の個別の光学素子と同様の効果を実現す
ることができるため、光学素子の数を削減することがで
きる。

【００３６】したがってこの発明により、その配置が簡
素であり、各誘導ビーム経路用の光学素子の数を削減す
ることができるような試料照射装置を提供することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明による第１の実施態様を概略的
に示している。

【図２】図２は、さらなる実施態様を概略的に示してい
る。

【図３】図３は、さらなる実施態様を概略的に示してい
る。

【符号の説明】

１ 試料、 ２ 照射ビーム経路、 ３ 光源、 ４
照射ビーム経路、 ５光源、 ６ ビームスプリッタ、
７ 光学素子、 ８ 対物レンズ、 ９ 変形可能な
ミラー、 １０ ピエゾアクチュエータ、 １１ ビー
ムスプリッタキューブ、 １２ 発散光学系、 １３
ミラー、 １４ 同期手段、 １５ 同期手段、 １６
走査装置、 １７ 同期手段、 １８ 検出器、 １
９ 励起用ピンホール、 ２０ 検出用ピンホール、
２１ 検出ビーム経路、 ２２ビームスプリッタ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好ましくは共焦点蛍光走査型顕微鏡法に
   おいて、１つの光源（３）の１つの照射ビーム経路
   （２）およびさらに別の光源（５）の少なくとも１つの
   さらに別の照射ビーム経路（４）を有し、前記照射ビー
   ム経路（２，４）が互いに少なくとも部分的に重なり合
   うことができるような試料（１）を照射する装置であっ
   て、 少なくとも１つの光学素子（７）が前記照射ビーム経路
   （２，４）の少なくとも一方に配置され、光を変性する
   ことと、試料領域における前記照射ビーム経路（２，
   ４）の照射パターンが形状を変形するように、前記素子
   （７）の光学特性が影響を受けるまたは変性されること
   と、を特徴とする装置。
2. 【請求項２】 光学素子（７）が検出ビーム経路中に配
   置されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 【請求項３】 前記光学素子（７）が対物レンズ（８）
   の焦点面と共役なフーリエ平面に配置されることを特徴
   とする請求項１または２に記載の装置。
4. 【請求項４】 前記光学素子（７）が光の位相を変化さ
   せることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に
   記載の装置。
5. 【請求項５】 前記光学素子（７）の光学特性の変性が
   定義可能な事象と同期することを特徴とする請求項１乃
   至４のいずれか１項に記載の装置。